ITTO-GMU/ER-04/20001022B
. '.,
··i
........
:
ITTO Project PO 16/96 Rev.4(F)
.....
....:. i
EX SITU CONSERVATION OF SHOREA LEPROSULA AND LOPHOPETALUM MULTlNERVIUM AND THEIR USE FOR FUTURE BREEDING AND BIOTECHNOLOGY
.. ' . ".1'
'. ·i
. . ....
SHORT COURSE ON INTRODUCTION TO MOLECULAR GENETICS AND BIOTECHNOLOGY OF FOREST TREES
..
..
-
"
..
. .. ..
. 1
YOGYAKARTA, 5-9 SEPTEMBER 2000 PART 11
.
. ..
FACULTY OF FORESTRY GADJAH MADA UNIVERSITY YOGYAKARTA
2000
Table of Contents
Part 11. Handouts
1. Introduction to Molecular Genetics and Biotechnology of Forest Trees Prof. Steven H. Strauss, Ph.O 2. Analisis Isozim dan Pemanfaatannya di Bidang Kehutanan Dr. Mohammad Na'iem 3. Aplikasi Penanda Molekuler dalam Program Pemuliaan Or. Anto Rimbawanto
~
.-
- . .. .
Introduction to molecular genetic and biotechnology of forest trees ~
'-----------~ .
.
r;. :if~~j·;,,:::{,:,
.. ":
:-
Prof. Steven H. Strauss, Ph.D Oregon State OniVersity
.. : ,,::.
.
INTRODUCTION TO MOLECULAR GENETICS AND BIOTECHNOLOGY OF FOREST TREES Short Course, Yogyakarta, Indonesia, 5-9 September 2000
Lecture Notes from Steve Strauss, Professor Department of Forest Science, Oregon State University Corvallis, Oregon 97331-5752
[email protected] http://www.fsl.orst.edultgerc 15417376578 phone, 1 541 7371393 fax
Goals for the class + Better understanding of what biotechnology is ~
Basic s~cE;...Jlilw concepts, new language. important terms you should understand and remember are often underlined }> Human biotechnology can change your lives - new knowledge of inheritance of traits, cures for diseases ~ Food modified by biotechnology will become commonplace -need to separate fact from fiction ~ Potential for the future is great - advances and potential uses will not slow as knowledge of genomes and molecular biology increase rapidly
+Current uses, limitations, and practicalities in forestry worldwide
Course introduction· Biotechnology defined +Biotechnology: Manipulating the physiology or genetics of organisms toward some purpose ~
~
Not just molecular in scope Silviculture is a kind of biotechnology
+ Usually focused toward genetics and breeding, but not exclusively ~
For example, inducing flowering or rooting of a difficult species for reforestation
Main kinds of forest biotechnology +In vitro (i.e., tissue culture based) propagation to aid cloning of elite genotypes +Biochemical and molecular markers to aid management of germ plasm diversity during breeding and silviculture +Identification of markers, or genes, associated with desirable traits, and their direct use in breeding and improvement programs (marker aided breeding) +Isolation of genes, and their modification and insertion using genetic engineering techniques (widely called "GM" around the world = genetic modification)
Introduction to molecular genetics Cells and genomes
I--~-";:;""'---'~"'~'''''''''""
+Higher organisms are composed of populations of many millions differentiated cells + All of the cells contain essentially the same genes + Differences in the expression of genes results in the great diversity of tissue types and functions ~
Flowers have many genes distinct from those of leaves and roots and seeds ~ Many genes are expressed only under heat stress, cold stress, anaerobiosis (Iow oxygen due to flooding) ~ Gene expression often varies quantitatively among tissues and environments
+Gene expression changes with age - important for
.
Some key terms +Gene • an inherited factor that affects a trait ~
A stretch of DNA that has a precise sequence of bases
+~.
all ofthe DNA in a cell or cellular compartment +DNA· the chemical that the information content of genes and genomes are composed of +Breeding - genetic improvement by any means +Genetic engineering· breeding using precisely defined, and often newly synthesized, genes via asexual gene transfer
.
Similarities among genes is great t-----:--""""':""~-'~-,~,~~w,
+ The number and kinds of genes are very similar among diverse organisms, and is readily recognized at the DNA sequence level ~
Genbank: compare your gene to others via internet Pine: about 'I. of the genes sequenced can be precisely and functionally associated with genes from other organisms such as yeast, bacteria, human, maize ~ About 'I. of genes have no known function, but can be shown to be the same as genes from other organisms ~ About 'I. have an unclear association with other genes ~
+Species differ mainly because of the distinct coevolutionary of its genes, not gene content ~ ~
Soybeans and trees nearly Identical in gene content Its what it does not source that matters
1
Nuclear genomes and their chromosomes +Most DNA is found in the cell's nucleus in separate "islands" called chromosomes +Nuclear DNA iStlghtly wound, embedded in a complex matrix of proteins + Higher organisms have about 20,000 to 100,000 genes in nuclear genomes +Most nuclear genes are part of "gene families"
» Gene families originate by successive duplication of genes and diversification to carry out different functions
» Many genes are also Inactivated by mutation over time (pseudogenes-ie. "fossil genes)
Highly variable, repetitive loci +Repetitive patterns of DNA are common in genomes at micro (several base pair) to macro (thousands of base pair) levels +Such loci are of particular use for genetic studies because they contain abundant allelic diversity, a result of the repetitive structure making them prone to errors (mutations) during replication and meiosis +"Microsatellite" loci contain short repeats (e.g. ATC ATC ATC ATC) and are widely used as genetic markers and DNA fingerprints In plants and animals + Often extremely polymorphic, suitable for paternity analysis, DNA fingerprinting
» Frequency of heterozygotes often 90%, 10-30 allelesllocus
Microsatellites (Simple Sequence Repeats)
Jumping genes and non-coding DNA }>
+Most DNA does not encode genes, and this noncoding DNA can vary widely In content among species (>100-fold) of higher organisms
Structure
:--
Uniquen.nking,cgion,
\~"RC~II(I'.g.• 8')
""",,,,,,,,,,,,,,' _ _-~;!".;!'.;!'.;!";!;.!::;!'.;t-~.;!'---""""''''''''''''.
» Number of repeats is highly variable among individuals
...""."'''".".
----"""""
» Conifers such as pines have among the largest and most repetitive genomes known
+Transposons ("jumping genes") comprise a large proportion of non-coding, "junk" DNA + They are mostly inactive (non-expressed), but can be stimulated to move by genomic stress + Their movements In the genome often create new gene functions and expression patterns
» Only known benefit to organism-evolutionary innovator?
Chromosome variation I-------,~,,~"""
+Most plants contain two copies of every kind of chromosome (diploid), like humans +Sut It Is not uncommon for plants to have multiple sets (polyploidy) or incomplete sets (aneuploidy) + Plants with unusual ploidy levels often are partly sterile but may still propagate vegetatively + The different forms of the same gene In each chromosome set are called alleles + Allelic differences are the source of most genetic diversity +Mutation is the ultimate source of genetic diversity, and can be due to changes in structure (e.g.,
Design primers (
~mplementary
to flanking regions
.....................-==t ______ . . . . . . . ________................... •••••••••••••• M •••••• _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
: ; : = -......................
Amplify repeat region by polymerase chain reaction ~-;::.-;::.z.-::-:.=-::~~
:=t;:.-;::.-;::.-;::.-:.=;::.;::::::.:+=
=::!.-;::.-:.:;.==;:.-::::::.:+= ~-z.-:.-:.-::;:.=;:.=~
AnaJyze peR products by polyacl)·Jarnide gel el«trophoresis Marker is codominant and hi hi" encticallv infonnative
Organelle genomes
Organelle genomes
Organelle genomes as evolutionary markers
+Plants contain two other genomes in their cells +The chloroplast genome is about 1/10,000 the size of the nU
+ The slow rate of evolution of organelle genomes, and their inheritance from a single parent, make them very useful for studying evolutionary history and extent of population differentiation +For example, they have been used to determine the phylogenetic history (who is most closely related to who) and extent of population differentiation and migration (are populations distinct or just separated in space or genetically separated; where did the populations originate from) of pines, oaks, and many other tree species
~
Paternal inheritance of chloroplasts in many conifers, mitochondrion in Cuppressaceae (cvpress redwood etc\
3
Plant cell
Levels of DNA structure O'..~rview of Chrom;atin l'.1Cking
(Figur~
16.':1)
Transposable elements in a repetitive portion of the maize nuclear genome
Fluorescent Labeling of Microsatellites Enables Multiplexing
• Acrylamide gel with 5 microsatellite loci and internal size standard
• Four or more colors can be distinguished on many fluorimagers; coupled with size discrimination allows simultaneous analysis of nine or more loci
Genes - structure and function
Gene structure
+Genes are defined as distinct functional units, based on either Mendelian inheritance of a trait, or a direct DN~se~nce determination +Most genes encode the sequence of amino acids in proteins based on a triplet code of bases. The code is nearly universal among organisms. +Genes Include nearby regions required for their expression (transcription into messenger RNA, which is then translated into a protein). These regions, when near to the start of transcription ("upstream") are often called promoters + Promoters and other DNA that affect expression can be a Iona distance from aenes (-1 kb to 10 kbl
+Genes contain regions within them that do not encode amino acid sequences + These regions are called introns and are spliced out of mRNA before it leaves the nucleus for the cytoplasm, where translation into protein occurs +Introns can also affect gene expression much like promoters +A large number of proteins often bind to promoters of genes and interact themselves in complex manner-enabling gene expression to vary in response to a great variety of environmental and cellular signals ("transcription complex")
Methylation and gene expression
Methylation and gene expression
+Many, but not a~drga';;i~ms modify the basic chemistry of DNA to protect it, prevent enzyme degradation, and to help control expression +Bacteria do it selectively, plants do it extensively +When plants are prevented from maintaining their normal methylation pattern via use of methylase mutants, they develop extensive abormalities over generations, showing methylation is critical + The most extensive kind of methylation in plants is the addition of a methyl group to the 5' ring position of the base cytosine - it is associated inactive genes + The methyl group is thought to i~pe~~ ?ccess of
+Transposons in plant genomes are extensively methylated, as are other non-coding parts of genomes +Methylation is known to be used for sensing environmental changes to control flowering, and is suspected to be associated with changes in totipotency (competence to redifferentiate) of tissues as trees age
>Demethylation of FLC flowering gene known to be means by which vernalizatlon (cold treatment of seeds) accelerates flowering In Arabidopsis
+ Methylation states can sometimes be inherited, accounting for imprinting of alleles from maternal vs. paternal sources in plants and animals
Cloning gene!;)
Cloning expressed genes - cDNA libraries
+For study and manipulation, large amounts of DNA from genes are needed +This is usually accomplished by inserting the gene into a bacterial plasmid, from which large amounts of DNA can be isolated from bacterial cultures + The enzymes used to cut genes in specific places are called "restriction enzymes" and the genes that join DNA together are called "ligases" + An entire genome can be cut with restriction enzymes and then each piece placed into a different plasmid in a different bacterium. The entire collection is referred to as a "gene library"
+ Because most of the DNA in genomes does not encode genes, and much of genes are introns that do not encode protein sequences, it is usually more efficient to clone from transcribed genes (m RNA) rather than from genomic DNA +This is done by extracting RNA rather than DNA from cells, using reverse transcriptase enzyme to make a DNA copy of the mRNA component of the RNA (most RNA is ribosomal RNA), then cloning it as is done for genomic DNA +This kind of library is called a cDNA (complementary DNA) library, and only contains those oenes exoressed in the tissue used for RNA
"
"
,
M
~
~
'
Mlcroarray analysis "
H
cDNA libraries I_Sequencing ____ __ __
+Mostgenomlcs projects focus on high Intensity sequenclng of cDNA rather than genomic libraries +Large proJJu:tsJo.cus on cDNA libraries collected from diverse tissues, environmental stresses, etc +Most cDNA clones do not contain complete mRNAs, and most sequencing efforts only seek to generate a partial gene tag (300 - 600 bp) - these sequences are called ESTs (expressed sequence tags), and usually have a sufficient region of homology to other genes to recognize its function/identity + In forestry, large EST projects «10,000 sequences) are underway In pine (2), eucalyptus, and poplar ~
One of the pine and the eucalvpt proiect are proprietary
+EST and genomic sequenclng projects provide thousands of genes for study +Genes, amplified by PCR, can be arrayed at high density on glass slides using robotics " +These arrays can be hybridized simultaneously with fluorescently labeled RNA extracted from tissues In different developmental states to Identify genes whose expression changes in relation to those states +New paradigm: high throughput analysis of populations of genes rather than single genes, enabling a molecular profile of plant development and response to environment
Cloning genes via PCR
Analysis of genes
+If the DNA sequence of the gene for study is known, at least partly, it can be Isolated in high concentration without the use of bacteria + This makes use of PCR, polymerase chain reaction, which was first discovered in 1983 and resulted in a Nobel Prize + PCR makes use of short DNA sequences of 10-30 base pairs called primers, that target the gene of Interest. The primers are artificially synthesized in the laboratory. + Each primer targets one of the complementary strands of the DNA double helix
+Nearly all analyses of gene similarity, structure, and sequence makes use of gel electrophoresis + DNA that has been cut with restriction enzymes, or synthesized by PCR, is put In an electric field and oriented so its negative charge allows it to migrate Into the gel +Small fragments move most rapidly through the gel matrix, providing fragment separation +When the separated fragments are denatured into single DNA strands, transferred to a membrane, and hybridized to a single, labelled gene, it is called a Southern blot-a widely used method In
Colony hybridjzation
Other blot "directions"
+Bacterlal colonies can be hybridized with labeled DNA just like Southern blots +Colonles are spread on agar plates densely and evenly, then their membranes are chemically lysed (broken), their DNA denatured to single-strand form, and the DNA fixed to membranes pressed onto the agar plates +Speclfic genes can then be located if you have some Idea of the DNA sequences expected +When the library expresses their genes normally using a special kind of plasmid, colonies can be screened for specific proteins using antibodies
+ Ed Southern of Oxford University Invented the Southern blot (note capital "S") + A very similar kind of blot can be made with extracted RNA, which was humorously labeled a "northern" blot (note small "n") ~ The
RNA is blotted then hybridized with a DNA probe
+ Then the protein version of the blot was called a "western" blot ~
It is hybridized with an antibody after transfer to a membrane
1
Double helix provides the template for DNA replication
DNR REPLI CRT! NG ITSElF
NEW
Double helix and complementary nucleotides (base pairs, bp)
How DNA encodes amino acid sequences of proteins
Transcription control region of genes
!' -.
.,
, .. "",
-,-_ .. ' ....
Direction of transcription and translation - ".~." ..--"-"- ........ ~~.-~.,.~ --.---..--.- ........-----.---..~. --}-, ,';/
~-.-.--"--""'---'.-.-~--'"
Promoter ,,
I
I Operator
Coding region
a:::J
"
I
~~~~~~1!t~~l::~~~~ First nucleotide of messenger RNA!
.'
,
Leader
,
first amino acid of protein
Promoters and control of transcription - example of control of gene expression in bacteria - tryptophan.
Introns spliced from genes ~ce5 1
2
DNA
3 .
::
~RNA processing RNA
=------= 1
2
3
4
mRNA='
FlgUre·9.4. ArtQhgemfinf of sequences In Cs Gene from A Higher Orga-
nism;
ID
Function of restriction enzymes
Ligation of genes into a plasmid I creating a library
i
~lQa~I',)&11)tnblJ)pn
~-.---- - -.----~----------~.--.------,..--.-.--.--.- "-1
q:n
\
o-~~~ ....... u(.ot..t"'r~o(v.YA.
"--------------------------
JI
Microarray analysis of EST libraries
Overview of peR
/.2
Gel resolution of DNA based on fragment length
Numbcrof nUCitottdes
_
... --257
:Flgui.,~4•. Oisplay 0,', ReslrleUonFlo91!l&nh,ofOW. by Gel EI..'ropho,.'
.u..
'
.
Hybridization with a radioactively labeled gene
/.3
T-DNA Genomic DNA
InuI6
Restricting the DNA
DNA fragments separated electrophoretically
The nylon membrane is probed
DNA transferred from a gel to a nylon membrane
DNA the probe is visualized (X-ray film)
Agenda - Genetic engineering - Lecture 3
Why genetic modification
+Why genetic modification +Some voc.Qulary: +Isolation and manipulation of genes to create modified traits +Methods of cellular regeneration and gene transfer
+Organisms did not evolve to make products for humans, nor did they evolve in the environments (farms/plantations) in which we grow them + By modifying them using genetics so they are better adapted to farm/plantation systems, we can improve productivity, produce more desirable produ-cts, and thus increase productivity per acre and per dollar invested (domestication)
~
Focus on Agrobacterium
+Analysis of GM plants +Forestry biotechnology goals & progress ~
Examples from TGERC Cooperative work on poplar
+ Controversy over GM crops
~
Biotech crops in the USA, Argentina, and elsewhere have already proven this to be true (herbicide, insect, viral resistance) ? We can do it better, and in novel ways, knowing genes, and having a very wide gene pool to choose from, rather than iust usina natural variation and trait selection
Why genetic modification of trees
Some vocabulary
+Same reasons as for crops, plus •.•• +Stresses on trees will continue to grow (e.g., pests) and we can only breed trees, and they can evolve, slowly due to their long life cycle and delayed reproduction
+Regeneration: Inducing cells or organs to differentiate into a new plant + Transformation: insertion of new gene and regeneration of !lQ!l-chimeric (all cells with same genotype), transgenic plant +Gene silencinQ: Insertion of a modified copy of a gene so that it suppresses its own expression and that of the wild type gene
;.. Many cases of pests wiping out or seriously damaging wild and planted species of trees because they had little or no genetic resistance
+Gene transfer may become increasingly important for saving threatened tree species ;.. "Restoration biotechnology" ;.. The capability to do this is in the future, and depends on
Avenues for isolation of genes +Genetic mapping of induced or wild mutants that affect traits of interest (very hard unless working with a model species, or mutant is DNA ~ ~
T-DNA from Agrobacterium is a major kind of gene tag Gene knock-outs via insertion into genes ~ Gene over-activation by random insertion of a strong enhancer or promoter ~ Promoter tagging by insertion of a promoter-less reporter gene
~
+Genomic or EST sequencing projects get "lots of stuff' from specific tissues, then compare to Genbank to see if anything looks interesting, or do transformation to make knock-out (gene silencing)
Avenues for isolation of genes + Biochemical features (start with isolated protein, such as high abundance proteins from developing xylem for lignin biosynthetic genes, then seek gene) +Isolation of a major, natural Ql1 (quantitative trait locus) that has a small, statistical effect on an important trait (only done once so far for a plant I) + Based on similarity to genes from other species ~
Using PCR with primers designed to anneal to highly conserved region ofa target gene ~ Colony hybridization to genetic library with the conserved part of a heterologous gene (from another species) ~ Both done at low stringency so imperfect DNA-DNA hybrids are stable - lower temperature, lower salt, higher maanesium [PCR)
I~
Manipulation of parts of genes
Examples of newly composed genes
+Genes have several distinct kinds of parts ••• +Promoter: controls when and where and how strong the gene is expressed (examples: flower-specific promoter,i1eatinduced promoter) +Coding region: specifies amino acid sequence of protein, subcellular compartment where the protein must go +Termlnator: Indicates where gene ends, stops transcription +Untranslated leader (RNA not protein): affects level of expression + These parts, especially first two, are often swapped to create new kinds of functions
+ Flowering promoter combined with cell toxin to give plant sterility +Wood gene used in self-complementary configuration to promote gene silencing, thus modifying lignin content of wood +Portion of a bacterial pathogen gene that encodes an anti genic protein expressed at high levels in plant using a strong, seed specific plant promoter to make a vaccine in seeds +Insect toxin gene is expressed under very strong promoter from plant virus to give high level of insect resistance
Genes can be transferred Into cells by biological or physical means
Agrobacterium is the method of choice for plant transformation
+Physical - force DNA into cells by treatments that..
+A common soil pathogen that infects an extremely large and taxonomically diverse range of plants +A natura/ genetiC engineer--gene transfer is essential to its pathogenic life style +It transfers DNA into plant cells to cause gall formation, which provides a home and special nutrition for it +Pathogenesis depends on presence of a very large plasmid, called the TI (tumor inducing) plasmid, the source of its transferred genes (T-DNA) +For biotechnology, the pathogenic genes are removed reDlaced bv useful Genes
__
I......:-:..-----~"_~'~ ~_"'
____
~_'~_"_'"c'_
~
Weaken cell membrane (chemical, such as polyethylene glycol) ~ Form pores In membrane (electrical pulses, electroporation) ~ Pass through it at high momentum ("gene gun," or "blolistics") +Siollstlcs uses DNA preCipitated onto metallic dust and then
accelerated deep into tissues via gun charge, water explosion, or high pressure gas burst
+These methods more harmful to DNA, cells, than the biological vector Agrobacterium that has evolved to be efficient at gene transfer
Key aspects of Agrobacterium transformation
Key aspects of Agrobacterium transformation
+ Agrobacterium has numerous strains in the wild
+Comparison of vir gene sequences demonstrate clearly that the Agro plant transformation system evolved from genes used for bacterial conjugation +T-DNA encodes genes for plant hormones and other substances that induce gall or hairy root formatlonideal habitats for bacterial proliferation
~
Hypervirulent strains can infect any plant species ~ Conifers, monocots now routinely transformed; even yeast
+Agrobacterlum bacteria moves toward wounded plant tissues In soil solution by chemotaxis +Wound chemicals from plant (phenolics such as acetosyringone) stimUlate expression of vir genes-they guide mobilization of T-DNA into plant cell Vir genes play diverse roles in gene transfer, including production of single-stranded T-DNA, pore/pilli structure for DNA transfer, proteins that bind & protect T-DNA, and nuclear targeting proteins
+
~
Galls (A. tumefaciens), root (A. rhlzogenes)
+T-DNA also contain genes for production of unusual amino acids called opines, that only it can utilize as a carbon and nitrogen source +Successful infection and proliferation stimulates conjugal transfer of Ti plasmid to other Agrobacteria in oall/root environment
1(.
Cells with new DNA must be regenerated into plants, requiring tissue culture based regeneration
I-~-----·-~·~-·~~·-·'·-
+Most regeneration systems for plants cells are organogenic (new organs initiated one at a time) or embryogm\c (mltire embryos produced) + Plant hormones are used to induce transformed cells (those with new DNA) to form new organs and plants that are genetically uniform (non·chimeric) +A means for selection is required so that transformed cells and organs can be separated from non-transformed ones ~ Antibiotics,
herbicides Growth modifiers ~ Reporter genes (color or fluorescence) ~
Examples of transgenic traits in commercial use, or near to commercial use, in a~!!~~~••_.•
Analyses of transf~!~~~~'!;"'K +Are the genes present? ~
PCR (presence/absence, total number), Southern blots (how many loci, structure)
+Are the genes expressed? ~
Northern blots (for mRNA) or PCR method applied to RNA of new protein (immunology: westem blot) ~ New plant phenotype (e.g., herbicide resistance)
~ Analysis
+00 the plants behave normally? ~
Unintended mutations from transformation or tissue culture: somaclonal variation ~ Stability of gene expression: sometimes changes occur over time (gene silencing) ~ In commercial programs, select from 10's to 100's of transgenic "events" over years, propagation cycles
Examples of transgenic traits in research or early demonstration phase
+Herbicide resistance (common) ~ Mostly
broad spectrum, environmentally soft, herbicides
+Insect resistance (common) ~
Bacillus thuringiensis toxin genes main one
+Viral resistance ~
Induced gene silencing of viral genes (papaya, squash)
+Male sterility to facilitate hybrid seed production + Delayed ripening fruits to facilitate shipping (ethylene suppression) +Modified oil quality +Novel proteins in plants, animals (vaccines, medicines)
+Enrlched vitamin content (e.g., rice) + Health·modifled oil content +New forms of Insect and disease resistance +Sol/ aluminum/acidlty tolerance +Bioremediation of heavy metals +Numerous vaccines, medicines +Enhanced flavors/spices +Superlor nutritional value of proteins
Examples of transgenic traits of interest In forestry
Modifiying lignin content of wood - goal is to reduce or change content, !!!:!:~::~!!~ductivity
+Herbicide resistance + Pest resistance +Modified wood chemistry, lignin content +Suppression of flowering (containment, enhanced growth)
+Isolate genes from developing wood via study of RNA or protein, or based on knowledge of genes and biochemical pathways from model organisms +Suppress or overexpress genes by changing promoter and gene structure
+Male sterility for hybrid production +Faster stem growth + Induction of flowering to speed breeding
~
Produce more/new enzyme to change lignin content (e.g., favor dicot-predominant syringyl over coniferpredominant coniferyllignin) ~ Reduce/modify cross-linking of lignin to make easier to extract via gene suppression
17 I
Herbicide resistant trees
Insect resistant trees
+Goal Is to reduce costs, environmental impacts, of weed control
+ Uses Bacillus thuringiensis toxin genes from a bacterium widely used for pest control
Broad-spef:trum,low toxicity, low cost herbicides Less hand weeding, tillage }> More no- or low-tillage systems, reduces soil erosion
}>
}>
+Use of genes from ag biotechnology (companies) Can come from plants (uncommon) or microbes selected for tolerance of herbicide on agar plates and genes Isolated }> Genes can encode modified target enzyme for lower herbicide affinity or herbicide degradation }>
}>
Numerous BT strains in nature with diverse toxins
+Controls major tree pests +Reduces environmental impacts from pesticide use, cost of pest control + Provided by ag biotechnology companies
What Is TGERC
TGERC Members I 2000-2001
+ Tree Genetic Engineering Research Cooperative Regular Members
Potlatch Westvaco Weyerhaeuser Oept. of Energy NSF -IIUCRC
Associate Members Broadacres Nursery Mt. Jefferson Farms Oregon Oept. of Agric.
Poplars as a biological and commercial model for transgenic trees }> Transformation system, stability, somaclonal variation }> Demonstration of gene efficacy in field tests with companies }> Ecological studies, risk assessment, regulatory science }> Partnership with industries for commercial demonstration }>
Alberta Pacific Aracruz Celulose Bolse Cascade Champion International Georgia Pacific I TTC International Paper
PMGC-Univ. Washington Washington State Univ. U.S. Forest Service
+ Reproduction control }>
Sterility, floral Induction, vegetative propagation
The controversy over GM crops - a complex mix of real and distorted issues
The controversy over GM crops - a complex mix of real and distorted Issues
+ Environmental vs. humanistic values
+ Myth that GM crops are not tested - regulatory procedures are far more rigorous than for any conventionally bred crop - though genes for toxins and that change nutritive value, and allergenicity, of crops are used by conventional breeders routinely +Myth that source of gene and means for insertion are more important than the trait imparted contrary to prevalent scientific opinion +Myth that GM can produce super-weeds, when actual goal is domestication, which reduces weediness
Environmental activists are key generators of resistance }> High standard of living by activists In developed world }>
+Economic concerns, distrust, over global corporations, and their Influence on economies, cultures, and food safety }>
Patent Intensive nature of biotechnology
+Concerns over environmental, health effects, and sustainability of Intensive agriculture }>
Blotech as next dangerous step, prolonging pesticide use
+Poor understanding of genetics, crop domestication & agriculture by urban population }>
Frankenfoods super-weeds, easilv fri!)htenlng
}>
Herbicide resistance only a problem in fields, and will be avoided In many crops where could be problematic
18
The controversy ove~~!L
Developing world and the poor are main victims, with man food affordabili nutrition and disease roblems
Genetic engineerinjl~.~~E!r"<;.!se~, +Form three small groups each with a range of expertise, designate a leader/recorded who will report back a summary to the main group + Formulate a 5-year research program to genetically engineer teak so that it does not produce flowers +Conslder ~ What
basic genes, and knowledge of function, you will need? genetic engineering methods will be needed, how will they be demonstrated to be effective? ~ Include an alternative method if possible, in case your method fails, or you are unsure of its chances of success ~ If you are successful, what are the possible ecological concerns of broad use of these GM trees, and how would you analyze them, or possibly reduce negative effects? ~ What
Population marker !~:rc~~"v,_ + Vou are appointed to develop a plan for In situ conservation of a poorly known, threatened tree species in Indonesia +Vou are asked to choose 5 populations for preservation by the government, and are told to use genetic markers to help choose the areas to protect +Consider ~
What markers would you choose? How would you decide? ~ What kinds of research may be needed to develop an effective marker system for this new species? ~ Given that you can generate information on allele frequencies and heterozygosity for 20 candidate populations, how would you use this information to help choose the 5 areas to recommend for preservation?
TISSUE CULTURE Mineral Ekmtnh "hcroxMmenb:
C.. Mg.N.P.K,ar.dS
00(6I;IOf. cell "",-.11 synlhni. «>factOf. chlorophyll. cation Imino ",id,. ,",deie a<:ids nudeickids
Caleium(Ca) Magnesil,lm(Mg) Nilrogen(N) Pbospborus(P) Potusium{l()
~r~~~~J~rtnts:
ulion.b.I~e.anionl
B. Co, Cu. I. ~~5!fn~lr~~~ lA
Boron (B)
lis.nin bi<:H;ynlhui.l, mellboliun of phenolic.dds ? rofaclOf (c)"tochrome oddue) inpron:dgro"",u,iQcullure chloropllytl.ynlhcsi.l,tl.1.idaliOlY reduction I~ions CO{~Of (respiration. photo-
Cobilt(Co) ~t(Cu)
Iodine (I) Iron (fe) M.ng.nese(Mn)
J)~thesil)
eorKtor (n;lr.1e trnuform.tion) eo(loI;tor. chlorpl~ de,"elopmcnt
Molybdenum (Mo) li~(Zn)
TISSUE CULTURE
TISSUE CULTURE Pltnt Groll'1h Relul.ION
Orunk CompoundJ SUI"'" • enersY 5O\IfU for non'lutotropllil; pll.nlc:ultufu •
Au:tilU EfT«ls
eell el()fl~lion. apiul dominance. idvcntiliouJroot {orlMlion
lllCrosc (@:luwIC + (nKlose) lUually used
• ~r 'lu!l.u: .Iuoo.sc. frvctoSl;' (orchid). sorbitol (apple) \'Ihmlru euenlillfOfurbohydn1e Thiamine{B,) fIle-taboli'lm. amino ""kJ biosynthesis NiwtlnlC Ac:sJ (ni.cin) Ap)ridm;ine(B.} indudcd by MUflLShi,e &; Skoo8
Myo.. inositoJ
wBaralcohoJ,mcmbfIlM.nd cell\\... lIdc\~lopmcnl
SUP[lort Snltm,
Natural Auxin.
S)~thcttc
Auxin.
(.nlphthllrne aedic add CNAA). acid (2,4.0) eell division. Intll!onills to luxin in Ipiul oomilWleC:. anl;sene5Cenec
2.4-dichlofl)phe:no:~y.cctie
Cytoklnlns EfT«t.
NllunlC)10kinins
z.calin.isopenl)ia.dcnine
Synlhclic Cytokinin. benzylalknillC (BA). kiltelin
",xi"
m~
common gelling 11Ienl. polyu...:huhkt from ~d .ISlc.
')"lokinin
~is11l#11IOpllJll.ndNC:leri.1
enzymes nlt.,;l (rom agat w/OUI _guope<:lin
indoJe·) ..oetic acid (lAA). indok·J·bul)Tic loI;id (IBA)
shoot (Ofmllion
>I
5E:1
root (Ofmltion
/3
Summary of steps in plant genetic engineering
Gene oentification
.
~
~
P IOrootor
Genomic - ) - ~
sequence
cONA - ) -
.<"' "
Ptoein Ceding region
Reo:>nfiguIe DNA .,,;quenoes
kzt@@4}7:"lb'7·"
Prorro"r oOHA Transfer into plant oells
yla
~
8bliStbS
0'
.Ag"''''O,.,ium
~e~
Irx:orporation Into genome ~
Agrobacterium life cycle
..2C\
Agrobacterium gall on Kalanchoe plant
T-DNA
LB
RB
opine 'I
vir genes
ori Ti plasmid
opine catabolism
Agrobacterium
I I·
11,·
Infected Plant Cell
Crown gall formation
G[LB
vir genes
RB
Binary vector Agrobacterillm
Plant Cell
Transformation
Antibiotic selection
,T.··. ~ .....•............
Callus formation
Shoot generation
Root generation
Summary of steps in plant genetic engineering
Gone klendfiCdtion
~
RElIXInfigute DNA ,sequences ~4i?f;:.;~1
Prorro'er ODHA
Transfer inID plant cells
vt:t
~
9blistks
or AglObaeb!rium
~eny Ircorporation into geoome ~
Gene expression
Summary of steps in poplar transformation
Step-by-step view of poplar transformation
Transgenic Pinus radiata C. Waiter laboratory Forest Research, New Zealand
Modified lignin, "easy" pulping poplars W. Boerjan Laboratory University of Gent, Belgium
Transgenic field trials, UK
Down-regulation of CAD enzyme gives slightly less lignin, altered lignin chemistry, & easier lignin removal less chemical cost, less pollution
=
CAD-antisense eucalypts South America
26
Low lignin, fast growing poplars V. Chiang Laboratory Michigan Technological University la:::w_ _ _ _ _ _
S&5_-_ _<,*'?t;,~~~~@?,J"~~iS,;s3t.",\.;:i:GfA.:~>.::d';",,~~0,;;:';~:;:5~~.:·--':1
3 Weeks of growth
Suppression of 4CL (4 coumarate ligase) enzyme activity decreases lignin content of wood, and increases growth rate and cellulose content
Roundup®-tolerant Eucalyptus South America
Reducing gene flow via engineered flowerin Tree Genetic Engineering Research Oregon State University
Lonael
isolation, analysis, and plant engineering
Genes Regulating Floral Development
Arabidopsis Gene
Function in Arabidopsis
Poplar Homolog(s)
'AGAMOUS (AG)
Stamen & carpel identity
PTAG1 PTAG2
'APE;TALA3 (AP3)
Petal & stamen identity
PTD
'APETALA1 (AP1)
Flower initiation; perianth identity
PTAP1-1 PTAP1-2
LEAFY (LFY)
Flower initiation
PTLF
'MADS-box gene, member of a large plant gene family
Similar to AP1, the Poplar Homologs are Strongly Expressed in Developing Inflorescences - northern blot Late May "C :l
E Cl
....C1l
+'
Cl
Cl)
...J
Late February "C :l
~
~
t;:
t;:
t;:
0
t;:
C,
u.:
::E
u.:
::E
~
~
C,
~
- 11 ~
.0
0
0
0
I
.0
PTAP1-1
PTAP1-2
18S
PTAP1·1 & PTAP1·2
Developing male inflorescence
+Like AP1, expressed throughout floral meristems as they begin to form
-'
1 ()
...../
Example of GUS reporter gene driven by poplar floral promoter, transformed into Arabidopsis
Roundup®-tolerant poplars TGERC - Oregon State University
t Trahsgenics
t
Insect-resistant poplars R. Meilan, K. Han, C. Ma - Oregon State University
Trans enic
Non-trans enic
Field trial - transgenic poplars R. Meilan - Oregon State University
BCCINSECT RESISTANCE TRIALS
OP-367 Study
Color IR Image Taken July 2000
2000 Study
BCC OP-367 INSECT RESISTANCE TRIAL Nurse row on left, transgenic row on right
into
a neW,pacterla:1 ho?!. where, It replicalesalong with host DNA and forms P--'---' its Qwn pro
FIGUHE 8.2 Usill~ hacteria to make lllllluulhormones. The pl!l.~mids are first separated out from mphll'l~d baderia {lilt! Sill>· jedt"d to a restriction enzyme that breaks the circle at spe-<:ifle points. The~e opelwd loops are then mixed with a setluence of source DNA. ~lIy. tlw gene seqttenL'C that tl),ilkes ,11 hurnunhoilnone.'Thel()reigll sequllllccis inserted'ut the broken UlJ(b,
refill'ming the circular phwnid, llut now with :new htlIl}On.:g~ilt~s jnse'l'ted. As the hadetiiilgencs dire<;t the rormalioll of ba(:terhi) subsrances, the human genes direct the r0I111~ltio\1 ofl!limttnh,ill'1ll0neS, The·hacterin cOriliimcto l"j:!pro'dll(~ ill grl'at nUIll' hers until tlnally they !If(~, chemically mptmed and qU~lIltities ofl1uman hortnQue C'.,.1.U b
Repeat steps
Heafio separate
5'
3'
~trands.cool;adcl
piimeis\~hiChsiart
the replication
seq\lence
Add DNA polymerase,
nuiileotipes (DNA bases)
Repeat step.s·
Repeat steps ~jJ
tII"l!'{liJtlItUll1itil ~ '-----y----' Cycle I yields 2 DNA molecules
'-----y----' Cycle 11 yields 4 DNA molecules
1"IGURE8.3 DNA, ohtained jn minute ~lrn()Unt$ from the (!lime scene. amI Mlplified (in('rt~u,oi;(:d) throllgh the m~w()rPCH proc(~dllre, plti)lcd.a ~er role.ill the trjalofQ.]. Shl1psQn, perllilpsthe most publi~iz.t'dl.lse of DNA evidence in hist(jfy.Ess(;Hltilllly. the pen. pro(;{~ thlt(:'involves ,bn~aking DN A
lJ
/1
.~
~j.
1=============
.1I •.
CATCIUNG CHOOKS WITH A MOl
CtilOimils now hav.(,·1O worry nb()ut llwir mm \'t'\y.1II1ique.DNA. AJiy cdJ~\\in.(){J.wh!'thi'r
from blliPd.semen. teeth. hairfil\lide, 0" s,ruivii. Snroples iu'e collc:.'<-1ed riulOthe ,'dow '. $.L'I"116 and $USj'(:cl. 111e DNAis extracted, ,'c{)!)c(mtr.alt~l, ll(td suIJj<>eted .to' n;~d~lion el1~1n~\~, wlliehcilopthe DNAinto Il'lJg-
11J(1nts; tlli,dragll1e!)t~ :u'(\ thon separ;ltcd by gel cledr()phore~is'; '111CrtHtre far too many
different Jmgll1cnts ih the gt~Lt(J be ,or IIse •.S(I. theilf.'.xtsteP isentk~il. l1le is trimsrettl#lt~utslj~~t
liiLro· st~nds,up. Then
is fi,cl(le<j,J'hb prolw ~tralltl~, pf radio-
""·"A,,"'.(!<'>:)'" $!!fj11encc wi1llm~lch allt! knO\~ll hlllTlanI)NA se,Ciiic~Il(~s.··sdlne'\\'h()re·in
the fm,,"l'Oelits. 'fhe f(lOn th~ifingerpiillt. ;lO,m~lJ>(l,·l1J(~:SCtle~:[(l.a radio,\dive'frugr,ients l.1tt(Qc("lhikil;c sheet is 1.1Ii(!()\~er
LUtlC(l'tlOIHl;We heen. cl;till1l1led. OllC in It mU!ion .arid one in 70 hillion.
Analisis Isozim dan pemanfaatannga dl bldang Kehutanan ~
'------------~
.'
".
Dr. Mohammad Na'iem Puslitbang BiotBknologi &Pemuliaan Tanaman Huwn
;
...
'
.".
ANALlSIS ISOZIM OAN PEMANFAATANNYA 01 BIOANG KEHUT ANAN Oleh: Or. Ir. Mohammad Na'iem
PENDAHULUAN Prinsip-prinsip genetik tanaman, pada dasarnya adalah pengembangan terhadap hukum Mendel dan genetika populasi. Oi bidang Pertanian dan Holtikultura pongembangan terhadap prinsip ini, seperti estimasi besarnya variasi genetik, studi tentang aliran gen (gene flow), efektifitas penyilangan, efesiansi gen dalam kebun benih, identifikasi klon dan kultivar, konservasi gen, telah lama dilakukaN. Sehingga hasilnya saat ini telah banyak dirasakan oleh masyarakat. Hasil tersebut diantaranya adalah telah banyak ditemukan galur-galur murni (terutama tanamansemusim), yang arahnya menuju kepada pemanfaatan variasi genetik yang sempit dan terbatas. Oidalam melakukan studi genetika tanaman baik di bidang Pertanian maupun Holtikultura, diperlukan adanya penanda genetik (marker gene). Penanda genetik ini berupa suatu sifat yang sifat-sifat tersebut biasanya terekspresi dalam fenotipe individu yang bersangkutan. Penanda genetik ini dikenal dengan penanda morfologis (morphological marker). Tetapi karena sifat morfologis tersebut sangat terpengaruh oleh kondisi lingkungan, maka hasil yang diperoleh ada kalanya kurang cermat. Sejak dekade terakhir diperkenalkan adanya penanda biokimia (biochemical marker) yang dikenal dengan isoenzyme atau isozim. Analisis isoenzim (isozim) telah digunakan secara luas sejak beberapa dekade yang lalu, untuk melakukan investigasi genetik bagi sejumlah besar organisms, mulai dari lalat buah, tanaman liar, tanaman budidaya hingga manusia. Kendala yang dihadapi untuk mengaplikasikan teknik ini biasanya terbantur pada bahan kimia yang relatif mahal, peralatan laboratorium yang khusus dan juga tersedianya sumberdaya manusia yang memadai. Namun demikian mengingat teknik ini memiliki manfaat yang cukup banyak untuk keperluan investigasi genetik, maka ada baiknya teknik ini diperkenalkan.
BEBERAPA PERGERTIAN a. Apakah Enzim ? Protein adalah molekul-molekul organik yang memainkan peranan penting dalam berbagai proses biologi. Peranan ini meliputi pengangkutan dan penyiapanan molekul lainnya, menyediakan dukungan mekanis, dan mengendalikan hampir semua reaksi kimia dalam organ tubuh. Protein yang memiliki fungsi dalam pengendalian seluruh reaksi kimia ini disebut enzim. Enzim ini juga mempunyai sifat mampu meningkatkan kecepatan suatu reaksi kimia, tanpa ikut tereaksi. Protein disusun oleh sub-unit sub-unit yang disebut asam amino. Asam amino adalah molekul organik yang memiliki satu basa amino (NH2) grup dan satu asam karboksil (COOH) grup. Beberapa asam amino memiliki grup-grup ion yang lain sebagai tambahan grup-grup amino dan karboksil yang membentuk ikatan peptide. Apabila grupgrup tersebut terletak pada permukaan luar dari molekul protein, ion-ion ini akan memiliki suatu jaringan aliran listrik (net electric charge) dan karenanya akan bergerak dalam suatu medan listrik. Dasar pewarisan genetik terletak didalam molekul DNA yang ada dalam chromosom yang terdapat pada inti sel semua sel hidup. Molekul DNA terdiri dari 2 rantai molekul gula terikat oleh ikatan hidrogen antara molekul molekul basa organik. Ada 4 basa organik (Adenine, Cytosine, Guanine dan Thymine). Basa ini karena ukuran dan strukturnya hanya dapat membentuk ikatan hidrogen dalam 2 cara, yaitu Adenine hanya dapat terikat dengan Thymine dan Guanine dengan Cytosine. Rangkaian tertentu dari basa ini dalam molekul DNA ternyata membawa kode genetik vang mengandung informasi untuk diteruskan pad a generasi berikutnya. Rangkaian basa yang membentuk bagian molekul DNA tersebut, juga mengendalikan spesifik as am amino. Oleh karena itu suatu segmen rangkaian molekul DNA juga mengendalikan molekul protein mengingat protein merupakan asam-asam amino yang secara bersama membentuk ikatan. Oleh karena protein secara langsung merupakan produk dari translasi DNA, maka hasil analisis protein mestinya akan mirip dengan hasil yang diperoleh dari analisis DNA itu sendiri.
2
b. Mengapa electroforesis ? Electroforesis adalah suatu proses dimana molekul enzyme yang telah teraliri Iistrik bergerak melalui suatu medan Iistrik. Keeepatan bergerak molekul enzimtersebut tergantung pada besarnya muatan Iistrik. Pemisahan molekul enzim oleh proses elektroforesis teriadi karena 2 proses, yaitu Besar kecilnya muatan listrik Besar kecilnya ukuran dan bentuk dari partikel c. Mengapa enzim electroforesis ? Ada beribu enzim yang berbeda, yang masing-masing memiliki fungsi yang spesifik pada reaksi kimia tertentu dalam organ tubuh. Beberapa dari enzim ini ada yang memiliki fungsi yang identik, berbedanya hanya pada lokasi dan aktifitasnya. Enzim yang memiliki bentuk berbeda tetapi memiliki fungsi identik disebut Isoenzim. Variasi genetik muncul karena terjadinya mutasi. Mutasi mungkin juga dapat menyebabkan terjadinya perubahan dalam rangkaian molekul DNA. Berhubung rangkaian molekul DNA ini mengendalikan asam amino tertentu, maka perubahan ini juga akan menyebabkan perubahan pada rangkaian asam amino pad a rantai polypeptide.
Different form of gene (-allele)
Segment 01 chromosome
(Dgene) ~ AG A G
~
/ I ICO
'0
MutatiOn!
TA
..
~
(change In base
d! T C,
........,
sequence)..::::::1(~
codes for
specKle en:!:yme
Ohalnol
mlno acids linked by ·tlde bonds
Vfol.. •••
/ PHE
@
VAL ••• AmIno acid substitution
.
LEU " " " /' ••• A1lozymes
Gambar 1.
/
Enzyme now
PHE
1- G~; I EU.
negatively charged ••
Diagram representatif suatu enzim dan asal adanya variasi genetiKyang menyebabkan munculnya allozim 3
Perbedaan bentuk dari suatu gen yang memproduksi protein dimana strukturnya sedikit berubah diistilahkan dengan Aiel. Adapun enzim yang secara struktur berbeda yang dihasilkan oleh aiel berbedaadalah tipe khusus daru isoenzim yang disebut Alozim. Alozim ini memiliki muatan listrik yang berbeda yang disebabkan oleh adanya substansi asam amino pada permukaan molekul enzim. Alozim ini akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda pada medan listrik. Oleh karena itu elektroforesis pada enzim dapat menunjukkan perbedaan genetik yang berasal dari mutasi gen. Dengan cara ini perbedaan genetik antara individu atau populasi dapat diteliti dengan mudah dan cepat.
PENGGUNAAN PENANDA GERETIK (GENETIC MARKER) Langkah awal sebelum melakukan analisis genetik suatu populasi diperlukan adanya penanda genetik. Dua macam penanda genetik yang dapat dipergunakan yaitu penanda morfologi dan penanda biokimia. 1. Penanda morfologi Penanda morfologi menggunakan sifat-sifat, yang biasanya terekspresi dalam fenotipe suatu jenis untuk penanda genstik. Misalnya bentuk, letak, ukuran dan warna dari bagian vegetatif maupun generatif tanaman. Di samping itu produk sampingan seperti f1avopoid dan terpenoid. Juga dapat digunakan sebagai marker untuk studi genetik. Namun sulit untuk mencari hubungan antara genotip dan fenotip dengan marker morfologi. Hal ini disebabkan sifat-sifat morfologi pad a umumnya dikontrol oleh gen majemuk dan faktor lingkungan yang kompleks. Di samping itu gen resesif pada individu yang heterozigot tidak diekspresikan. Penentuan pola pewarisan memerlukan penyilangan terkendali dan analisis individu hasil uji keturunan yang biasanya memerlukan waktu yang cukup lama. Fenotip yang diperoleh biasanya dipengaruhi dominasi, sehingga menyulitkan interpretasi genetik.
4
2. Penanda biokimia Penanda biokimia menggunakan hasil analisis biokimia pada bagian tanaman untuk penanda genetik, misalnya melalui analisis isozim. Istilah isozim diperkenalkan pertama kali oleh Markert dan Moller tahun 1959 dalam Na'iem dan Soeseno (1993). Isozim (isozyme) atau isoenzim (isoenzyme) disebutkan sebagai variasi yang terdapat pada enzim yang sama, yang memiliki kemiripan fungsi dan terdapat pad a individu yang sama. Hartl (1980) menyebutkan bahwa apabila variasi enzim tersebut dikontrol oleh aiel atau gen yang berbeda pada suatu lokus dan dapat dideteksi dengan elektroforesis maka disebut alozim (al/ozyme). Menurut Bailey (1983) dalam Na'iem dan Soeseno (1993), Jika komposisi asam amino di atas berbeda akan menyebabkan perbedaan pula dalam muatan ion, ukuran molekul dan konfigurasinya. Perbedaan isozim Juga akan menghasilkan kecepatan gerak yang tidak sama bila dikondisikan dalam medan listrik dan medium gel yang semi porus, sehingga setiap enzim yang berbeda akan menyebabkan pola berkas (banding pattern) yang berbeda pula. Na'iem dan Soeseno (1993) menguraikan keunggulan penggunaan isozim sebagai penanda genetik sebagai berikut: 1. Di alam, aiel pada kebanyakan lokus isozim adalah kodominan, sehingga mempermudah
pemisahan antara heterozigot dan homozigot.
2. Isozim tidak terpengaruh oleh lingkungan. 3. Isozim tidak terpengaruh oleh resesifitas suatu sifat seperti yang terjadi pada fenotip tanaman. 4. Dengan analisis isozim dapat dilakukan pengujian banyak sampel, sehingga dapat diteliti banyak lokus dalam waktu yang relatif sing kat. 5. Isozim dapat diidentifikasi dengan materi dari berbagai bagian jaringan tanaman.
PROSEOUR KERJA 01 LABORATORIUM Terdapat sejumlah prosedur kerja untuk analisis isozim, yang pada umumnya tergantung pada macam gel yang dipergunakan (starch gel atau polyacrylamide gel) dan bahan penelitian yang digunakan (daun, akar, kambium, tepungsari, jaringan megagametofit dll). Namunseeara
5
garis besar urutan kerja yang dilakukan hampir sama. Kalaupun berbeda biasanya hanya pada komposisi ekstrak bufer, terutama untuk bahan penelitian yang berasal dari bagian vegetatif tanaman. Bahan vegetatif tanaman biasanya mengandung banyak tanin dan phenol, sehingga untuk dapat menghasilkan gambaran pola bercak (banding pattern) yang jelas, pada ekstraksi bufer perlu ditambahkan kemikalia tertentu. Untuk memberikan gambaran yang lebih jelas, pada kesempatan ini diberikan contoh prosedur kerja untuk penelitian analisis isozim pada Pinus merkusii, dengan menggunakan 8 sistim enzim. Delapan sistim enzim yang dimaksud adalah ACP (Acid Phosphate; E.C. 3.13.2), DIA (Diaphorase; E.C. 2.6.4.3), EST (Esterase; H.C. 3.1;1 .1), GDH (Glutamate Dehydrogenase: E.C. 1.4.1.2), G2DH (Glycerate Dehydrogenase; E.C. 1.1.1.29), GOT (Glutamate Oxaloacetate Transaminase; E.C.2.6.1.1.), LAP (Leucine Amino Peptidase; E.C. 3.4.11.1) dan SHD (Shikimate Dehydrogenase; E.C.1.1.1.25). Secara terperinci prosedur kerja dapat dipelajari pada uraian berikut: 1. Persiapan bahan (materi yang akan diuji) Bahan yang digunakan adalah jaringan megagametofit dari benih P. merkusii dari kebun benih Pinus Jember. Untuk masing-masing nomor pohon diambil 20 benih. Jumlah sampel int dianggap cukup valid dalam menentukan genotip suatu individu, karena kebenaran genotip akan mendekati 100 % Jika jumlah benih yang digunakan adalah 8 benih, sesuai dengan rum us yang dikemukakan oleh Cheliak dan Pitel (1984) yaitu: Persentase kebenaran genotip =1 - (Y2}n-l dengan n = jumlah megagametofit
'
Gambar 3. Perendaman benih dalam Hidrogen Peroksida (H202)
6
Benih diperlakukan dengan perendanian pada larutan Hidrogen Peroksida (H202) selama 24 jam (Gambar 2). Tujuannya adalah untuk skarifikasi dan sterilisasi benih sehingga dapat membantu melunakan kulit benih dan menghilangkan jamur, Agar tidak tercampur maka benih untuk masing-masing nomor pohon induk dipisahkan dengan membungkus dalam kain kassa. Untuk membantu proses respirasi maka udara dipompa ke dalam larutan dengan aerator. Selanjutnya benih dikecambahkan dengan media kertas dalam cawan petri dan diberi label sesuai dengan nomor masing-masing. Kelembaban media kertas selalu dijaga. Pengecambahan dilakukan selama 2 minggu dan diletakkan dalam almari es dengan tujuan agar kecepatan berkecambah dapat diperlambat. 2. Ekstraksi sampel Kulit dan embrio benih dibuang, sehingga yang digunakan hanya berupa jaringan megagametofit yang bersifat haploid (n). Selanjutnya megagametofit ini dihancurkan dengan menggunakan mortar dan pestle dengan diberi larutan extract buffer 0,5 ml. Adapun cara pembuatan extract buffer dapat dilihat dalam tabel berikut: Tabel1. Extract buffer yang dipergunakan dalam penelitian Nama Bahan 1.EXT
1 M Tris - He!. pH 7,5
Air 8ullng 2.EXT
Jumlah
Penggunaan
8,45 g 50 ml
2 g
Glycerol Air 8uling
75,6 40
3.EXT
Tween 80 Air 8ul1ns
7,85 g 42,5 ml
1 g
4.EXT
Ditiothreito1 Air 8uling
mg ml
1 g
Po 1yvi 12.V i-po i YPYl'O 11 done
330 10,5 1,2
g
6,67 g
ml
g
1,2 g
Setelah hancur dan homogen maka dimasukkan dalam tabung ependorf. Centrifuge. disiapkan dan apabila centrifuge telah dingin (suhu 0 oC), maka tabung ependorf dapat dimasukkan untuk diputar dengan kecepatan 15.000 rpm selama 20 menit. Setelah proses centrifuge selesai maka larutan sampel akan terpisah menjadi 2 bagian. Bagian atas berwarna bening (supernatant) yang akan digunakan dalam proses elektroforesis,
7
sedang bagian bawah berupa bahan padat (pellet) dibuang. Proses ekstraksi sampel dapat dilihat dalam Gambar 3 berikut:
Gambar 3. Proses ekstraksi sampel megagametofit 3. Persiapan pembuatan gel polyacrylamide Gel polyacrylamide terdiri dari 2 bagian, yaitu running gel yang terletak dibagian bawah dengan konsentrasi 7,5 % dan spacer gel yang terletak dibagian atas running gel dengan kepekatan 3,75 %. Bahan dan komposisi yang digunakan untuk pembuatan gel adalah: Tabel 2. Larutan utama untuk menyiapkan gel polyacrylamide Larutan A. (pH
Bahan
Trisma base 91,5 g 8,9) IN HCl 120 ml TEHED 0,575 ml Dilarutken dalam 500 ml
Laruten D.
150 g 4 g Dilarutkan dalam 500 ml
ACl'ylamlde BIS
E.
air sul1ng
c.
A.moniul11 pel'slllfate 140 mg F. Dllarutkan dalam 100 ml air suling
Tl'isma base
14,95 g 120 ml TEI:1ED 1, 15 ml Dilarutken dalam 500 ml air 8uling
(pH 6,7) 1N HCl
air 8ul1ng
B.
Bahen
ACl'yl,~ide
BIS
37.5 6,25
g g
Dllarutkan dalam 500 ml air 8uling
Riboflavin 20 mg Dllarutkan dalam 1000 ml air suling
8
Running gel Untuk membuat running gel diperlukan larutan A, B, C dengan perbandingan 1 : 1 : 2. Untuk mengisi 6 plat kaca diperlukan larutan A dan B masing-masing 25 ml dan 50 ml larutan C. Ketiga larutan tersebut dicampur dengan menggunakan magnetic stirrer dan divakum selama 20 men it. Setelah homogen campuran ini dapat dimasukkan dalam glass electrophoresis, yaitu alat berupa sepasang kaca setebal 5 mm yang khusus dirancang untuk elektroforesis. Pada bagian tepi kiri, kanan, dan bawah dipasang sekat (shield tube). Sekat ini harus dipasang dengan cermat sehingga dapat membentuk rongga antar lapisan lapisan kaca dengan tebal ± 1 mm dan harus dijaga agar jangan sampai larutannya merembes keluar. Untuk satu buah plat kaca memerlukan ± 15 ml larutan. Selanjutnya untuk membuat permukaan gel menjadi rata dapat ditambahkan alkohol atau air dengan ketinggian ± 1 mm. Agar-gel menjadi pad at diperlukan waktu ± 1 jam dengan menggunakan lampu untuk mempercepat proses pemadatan. Spacer Gel Spacer gel dibuat dengan mencampur larutan D, E, F dengan perbandingan 1 : 2 : 1. Untuk mengisi 6 plat kaca diperlukan 10 mllarutan D, 20 mllarutan E, dan 10 mllarutan F. Ketiga larutan ini dicampur dengan menggunakan magnetic stirrer dan divakum selama 20 men it. Setelah homogen, campuran ini dimasukkan dalam glass electrophoresis tepat di atas running gel. Sample comb kemudian dipasang pada spacer gel dan dilepas setelah spacer gel memadat. Biasanya untuk memadatkan spacer gel diperlukan waktu selama ± 30 menit dengan menggunakan lampu untuk mempercepat proses pemadatan. Berikut adalah gambar proses pemadatan gel dengan bantuan lampu
Gambar 4. Proses pemadatan gel 9
Sample comb merupakan alat yang menyerupai sisir yang dirancang sedemikian rupa sehingga saat dilepas meninggalkan lubang sedalam 2 cm dan antar lubang berjarak 5 mm. Dalam penelitian Ini jumlah lubang yang digunakan adalah 20 buah. Sebelum lubang diisi dengan larutan supernatant, lebih dulu dibilas denganlarutan Bromophenol Blue (20 mg Bromophenol Blue dilarutkan 1 I air suling) sampai 3 kali dengan cara menuang dan mengisapnya kembali. Pada bilasan terakhir larutan ditinggalkan setengahnya karena akan digunakan sebagai indicator. Lubang-Iubang ini selanjutnya digunakan sebagal tempat sampel. Cara pencucian gel dengan larutan Bromophenol Blue dapat dilihat pad a Gambar 5:
Gambar 5. Pencucian gel dengan Bronioplietiol Blue 4. Proses elektroforesis. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan alat elektroforesis, lengkap dengan power stipplynya. Karena alat ini menggunakan 6 set gel, maka seliap unit dapat digunakan maksimal untuk 6 macam enzim yang dapat dipelajari setiap kali proses elektroforesis selesai. Setiap satu gel dapat digunakan untuk 20 sampel. Cara pengisian larutan supernatant dalam lubang sampel disajikan dalam Gambar 6 berikut:
Gambar 6. Cara pengisian larutan supernatant 10
Sebelum pemasangan plat kaca pada bak elektroforesis dipastikan dulu sirkulator menunjukkan suhu tidak lebih dari 4 aC. Penutup bak elektroforesis dibuka dan bak diisi larutan elektroda running buffer yang telah dipersiapkan sebelumnya hingga setinggi 2 cm. Selanjutnya klip penjepit dan shield tube dari plat kaca dilepas dan selanjutnya plat kaca dipasang pada bak elektroforesis secara berhadap-hadapan, dengan plat kaca yang bertakik berada di sebelah dalam. Pada saat pemasangan tidak boleh ada gelembung udara di antara plat kaca, kemudian palang holder dikencangkan. Selanjutnva ditambahkan larutan-running buffer (T abel 3) ke bagian dalam plat kaca yang telah dipasang berhadapan tersebut hingga tepat di bawah takik. Tabel 7. Running buffer
No.
Larutan
Pembuatan
1.
Stock buffer
Trizmd base 60 g Glycine 288 g Air suling hingga larutan 5.000 ml
2.
Running buffer
Stock buffer 250 ml Air 5uling hingga larutan 5.000 ml
Setelah gel dipasang pada alat elektroforesis, larutan supernatant diisikan ke dalam lubang sampel sebanyak 10 microliter dengan menggunakan alat injeksi yang disebut stepper. Selanjutnya running buffer diisikan lagi hingga penuh dan bak penutup dipasang kembali. Power suply dihidupkan untuk menjalankan proses elektroforesis dengan arus listrik sebesar 100 mili Ampere. Proses ini dihentikan setelah kedudukan Bromophenol Blue 0,5 - 1 cm di atas dari dasar running gel dan biasanya memerlukan waktu ± 180 200 men it. Berikut disajikan gambar proses elektroforesis : I
Gambar 7. Proses elektroforesis
11
5. Proses staining Staining adalah proses pewarnaan gel yang telah melalui proses elektroforesis dengan sistem enzim. Pewarnaan dilakukan dengan meletakkan gel yang telah dikeluarkan darl glass electroporesis ke dalam baki plastik berukuran 20 cm x 15 cm, kemudian dituang larutan staining yang telah dipersiapkan sebelumnya. Selanjutnya dibiarkan selama beberapa saat dalam keadaan gelap dengan digoyang-goyang. Lama perendaman ini tergantung pada larutan staining yang digunakan. Pembuatan staining dilakukan ± 30 men it sebelum proses elektroforesis berakhir. Nama bahan kimia dan komposisi pembuatan larutan staining dapat dilihat pada Tabel4, 5, 6 dan 7. Tabel4. Komposisi larutan staining Enz1m
St
ACP
ACP.BUF
DrA
50 ml
C.BUF 50 ml
Substrat, Koenz1m dan Komponen Lain
MG
0,5 ml 25 mg
a-Naphtyl Acid PJJosphate>
100 mg
Fast Garnet GBG salt
S.DIA NADH l1'IT
EST
EST BUF 50 ml
EST BUF
A. O,IM a-Naphtyle propionate
a-Naphtyle propionate [ EtcUlol 0, 1M a-Napll ty1 aoe ta te a-Naplltyle acetate [ Etct1101 B. Fast Blue HR salt
1 ml 0,2 ml 2 ml 1 ml 200 mg 10 ml 2 ml
190 mg
10 ml 100 mg
50 ml GDH
A.BUF 50 ml
1 1
L-Glutamic acid
Pt1S
G2DH
A.BUF 50 ml
4 ml 1 ml 1 ml 1 ml
S.G2DH
NAD
NBT
rus
GOT
GOT
BUF
50 ml
L-Aspartic acid 10 % a-Ketoglutaric acid
(7-Ketogllltaric acid [ Air sul1ng 0.33 % Piridoxall-S'-piJosplulte Piridoxall-S'-plmsphate [ Air suIing Fast Bllle BB salt LAP
SHD
LAP.BUF
1 % L-Lellcyl-lJ-naphtylaJ]/ide
50 ml
L-Lellcyl-IJ-JlaphtyldIJlide [ Air suIing Fast Black K sal t
C.BUF 50 ml
S.SHD HG
NADP
t1TI
rus
g
ml 1 ml 1 ml
NAD NBT
100 mg 1 ml 500 mg 5 ml 5 ml 33,3 mg
10 ml 100 mg 1 ml 100 mg 10 ml 30 mg
ml ml ml 1 ml 0.2 ml 1
1 1
12
Tabel 5. Komposisi staining buffer Buffer
pH
Larutan
A.BUF
7,0
g Tl'is01a pH 7,0 cl'ystal 3.88 Air auling sampai larutan 500 ml
ACP.BUF
5,0
g 5.74 1,8 ml Air auling sampai larutan 500 ml
C.BUF
8.0
g 2,22 1,33 IS Air auling aampai larutan 500 ml
EST.BUF
5,6
g 7,80 NaH2P04·2H20 g 1,42 NaH2POt Air au ing sampai larutan 500 ml;
GOT.BUF
7,0
g NaOH 1.18 Air auling sampai larutan 200 ml g 6,80 KH2P04·2H20 Air auling aampai larutan 500 ml
LAP.BUF
6,0
g 9,80 g 12,10 Air auling aampai larutan 300 ml 0,6 g NaOH Air suling sampai larutan 500 ml
Na acetate (anhydride) Acetic acid (glacidl) Tl'iznla HC1 Tl'lsnla Base
Hal e i c allhydl'a te Trlsma Base
Tabel 6. Komposisi substrat Substrat
Kompoaiai
S.DIA
2.6 Dichlol'ophenol-IlldopheJlol 2.6 DichloropheJ101-Indophenol sodiunJ salt 25 mg Air sullng 25 ml
S.G2DH
0,2 M DL-G1Ycel'ic acid Air suling
S.SHD
2% Shikimic acid Shikimic acid Air suling
25 mg 1 ml 500 mg 25 ml
13
Tabel7. Komposisi Koenzim dan Bahan lain
Komposisi
Koenzim dan Bahan La.in
10,165 g 100 ml
MG
MgC12·6H20 Air 8uling
MTT
HTT Air 8ul1ng
125 25
mg ml
NAD
NAD Air 8uling
500 20
mg ml
NADH
NADH Air 8uling
500 5
mg ml
NADP
NADP Air 8uling
133 20
mg ml
NBT
NBT Air 8ul1ng
200 20
mg ml
PMS
PMS Air 8uling
125 25
mg ml
Staining dilakukan setelah proses elektroforesis berakhir. Gel dari bak elektroforesis diambil dengan cara mematikan power supply, membuang larutan elektroda melalui saluran pembuangan sampai habis, membuka bak penutup dan mengendorkan plane holder, sehingga plat kaca dapat diambil. Pelepasan gel dari plat kaca dilakukan dengan menggunakan send ok pipih dan pisau cutter. Setiap plat kaca diletakkan di atas meja yang telah dlberi alas kain dengan posisi kaca yang bertakik di sebelah atas. Pemisahan kaca bertakik dari kaca bersekat dengan mencongkel tepi kaca dengan hati-hati dengan menggunakan send ok pipih. Lembar gel akan tertinggal pada kaca bersekat. Gel yang akan direndam hanya bagian running gel, sehingga antara bagian spacer gel dan running gel dipotong dengan pisau cutter. Sisi-sisi gel disayat dengan pisau cutter dan perlahan-Iahan gel diangkat. Gel diletakkan pada baki plastik dan larutan staining dituang. Selanjutnya baki plastik tersebut ditutup. Temperatur perendaman adalah 37 oC, sedangkan lama perendaman untuk masing-masing enzim dapat dilihat pad a Tabel 8 berikut :
14
Tabel 8. Waktu perendaman masing-masing system enzim
Enzim
Waktu
ACP DIA EST A. B. GDH
20 - 180 menit 30 - 60 menit 10 menit 60 menit 30 - 60 menit
Waktu
Enzim
G2DH GOT LAP SHD
30 15 15 15 -
60 menit 30 menit 30 menit 30 menit
Adapun cara melepas gel dan proses staining dapat dilihat pada Gambar 8 dan 9 berikut:
Gambar 8. Proses pelepasan gel
Gambar 9. Proses staining
6. Pengamatan gel Pengamatan pola berkas (banding pattern) pada gel harus dilakukan segera setelah proses staining berlangsung karena apabila pengamatan dilakukan setelah gel dalam kondisi over staining interpretasi terhadap pola berkas sulit dilakukan.
15
Pola berkas harus disalin dengan benar dalam blangko data. Posisi berkas pada gel ditetapkan berdasarkan masing masing nilai Rf. Rf ialah perbandingan jarak antara permukaan gel dengan posisi suatu berkas dan permukaan gel dengan penanda Bromophenol Blue. Untuk menetapkan posisi aiel, suatu famili yang genotipnya telah dicek perlu diikutkan pad a elektroforesis sebagai kontrol.
7. Fiksasi gel Gel yang telah diwarnai segera difiksasi. Larutan staining dibuang, dan larutan fiksasi dituangkan pada gel sebanyak 50 ml. Larutan fiksasi yang dipakai tergantung sistem enzim yang digunakan dan dapat dilihat pada Tabel 9. Selanjutnya gel disimpan dalam suhu dingin (4 QC) selama 24 Jam, dan ditutup agar larutan tidak menguap. Table 9. Larutan fiksasi untuk masing-masing system enzim
Enzim ACP DIA EST GDH
Larutan Fiksasi Fiksasi Fiksasi Fiksasi Fiksasi
Enzim
A
G2DH GOT
B
LAP
A
SHD
B
Larutan Fiksasi Fiksasi Fiksasi Fiksasi Fiksasi
A B
B
A
8. Pengeringan gel Supaya gel dapat disimpan, maka perlu dikeringkan dengan menggunakan kertas kaca setelah proses fiksasi selesal. Pengeringan dilakukan dengan cara sebagai berikut : kertas kaca yang telah direndam dalam air suling dibentangkan di atas kaca yang sebelumnya juga telah dibasahi air. Ukuran kertas kaca lebih besar 2 cm dari masingmasing tepi kaca. Kertas kaca diratakan dengan menggunakan penyapu gelembung hingga kertas kaca melekat merata pada kaca. Gel diletakkan di atasnya, kemudian disiram air suling dan perlahan-Iahan ditutup kembali dengan kertas kaca basah. Air disapu kembali dengan penyapu gelembung hingga kertas kaca merata dan tidak bergelembung. Masing-masing tepi kertas kaca dilipat dan dijepit dengan klip penjepit. Gel dibiarkan kering secara alami dengan diletakkan pada rak selama 24 Jam. Setiap gel diberi label aesuai dengan sistem enzim, nomor famill dan tanggal dilakukan proses elektroforesis. Cara pengeringan dapat dilihat pada Gambar 10 dan 11 berikut :
16
Gambar 10. Pelapisan gel dengan kertas kaca
Gambar 11. Pengeringan dengan dianginkan 9. Penyimpanan gel Gel yang telah kering diambil. 8erbagai keterangan mengenai. tanggal pengamatan, nama famili dan nama enzim yang digunakan perlu dicatat sebelum diletakkan dalam album foto untuk penyimpanan. Gel kering ini tahan untuk disimpan, sehingga masih dapat dimanfaatkan untuk diamati pad a waktu-waktu mendatang. Analisis Hasil Pengamatan dilakukan terhadap seluruh nomor famili. Pengamatan untuk setiap sistem enzim pada masing-masing sampel gel kering dilakukan dengan perhitungan aiel dan nilai Rf (Relative value from the Bromophenol Blue front). Parameter yang dihitung berdasarkan data yang diperoleh dari hasil interpretasi pola berkas ialah:
17
1. Jumlah lokus dan jumlah aiel masing-masing seedlot untuk mengetahui pewarisan pola berkas (inheritance banding pattern) dari enzim polimorfik (frekuensi aiel umum yang muncul < 99 %) 2. Perhitungan Chi-kuadrat/Chi-square (X2) aiel-aiel dalam setiap genotip.
Keterangan
X2 = Chi-kuadrat
o
= Frekuensi aiel yang muncul
E
=Prekuensi aiel yang diharapkan
3. Frekuensi aiel, yaitu rata-rata jumlah aiel setiap lokus (A) dan Heterozigositas / Heterzigosity (H), untuk mengetahui besarnya variasi genetik dalam populasi.
Keterangan : H
=Heterosigositas
Pi
= Frekuensi aiel ke-i
KEGUNAAN ANALlSIS ISOZIM UNTUK BUDIDAYA TANAMAN Apabila materi atau enzim yang cocok tersedia, analisis isozim dapat dimanfaatkan untuk membantu memecahkan beberapa masalah yang erat kaitannya dengan identifikasi variasi genetik atau menentukan level variasi genetik. 8eberapa contoh pemanfaatan analisis isozim diantaranya adalah : a.
Identifikasi pohon induk dengan klon, digunakan pada kebun benih klon (clonal seed orchard), serta identifikasi seedlot dengan pohon induk baik pada pengujian keturunan maupun pengujian provenans.
18
Misalnya dilakukan oleh Hamrick et al. (1981) dalam Adams (1983) dengan 25 klon pohon plus Jenis Pseudotstiga menziesii, ternyata dari 9 blok yang digunakan terdapat kesalahan pelabelan genetik 2-13 % pad a 6 blok, sehingga perlu segera dideteksi dan dikoreksi. b.
Studi efisiensi kebun benih semai (seedling seed orchard), untuk mencegah penggunaan produksi benih hasil silang dalam (inbreeding) dan kontaminasi serbuk sari dari luar kebun benih. Misalnya dilakukan Adams (1983) dengan kebun benih klon P. merkusii berumur 20 tahun, diperoleh 8 % produksi benih merupakan hasil penyerbukan sendiri (selfing).
c.
Identifikasi jenis-jenis bastar, baik untuk bastar alam maupun pembastaran buatan. Sebagaimana yang dilakukan Adam (1983), diketahui bahwa dari pembastaran terkendali pada P. menziesii sebanyak 43 pasang, diperoleh hasil bahwa diduga 39 % benih hasil persilangan terkena kontaminasi/tidak berasal dari kedua induk yang ingin disilangkan. Kenyataan di atas secara mudah dapat dijelaskan dengan bagan berikut: _ _ _ _ .. _ _ _
4
Genotipe induk betina
2
Keturunan 4 3
5
Locus 1
AA
AA
AA
~
AA
AA
Locus 2
Bb
BB
bb
Bb
BB
Bb
Locus 3
CC
CC
~
cc
CC
Locus 4
dd
dd
dd
Dd
};]
dd
Amb
OutX
OutX
OutX
Amb
Tipe keturunan Catatan
d.
1
ffi1
Amb : penyerbukan sendiri OutX: penyerbukan silang
Studi taxonomi jenis-jenis yang sulit dideteksi dengan karakter morphologi Crawford (1989) membedakan 2 species dari genus Salicornia yang berhabitat rawa. Kedua species ini secara morphologis sulit dibedakan. Dari analisis isozim diperoleh hasil bahwa antara keduanya tidak terdapat variasi. Keduanya menghasilkan pola bercak yang manomorfik, serta tidak menunjukkan gejala persilangan antar jenis. Dengan demikian tidak terdapat bukti untuk membedakan species yang dimaksud meniadi 2 jenis yang berbeda.
e.
Pendugaan tingkat variasi genetik dalam populasi alami. Tabel berikut merangkum beberapa hasil penelitian tentang besarnya variasi genetii< untuk beberapa sp~ies.
19
Jenis
f.
Heterozigositas
P. densiflora P. kesiya P. ptmgens
0,314 0,169 0,204
P. thunbergii C. obtusa P. glauca
0,279 0,305 0,290
Jenis konifer Jenis claun lebar
0,207 0,211
Semua jenis tanaman
0,141
Sumber
Na'iem (1991) Boyle et.al (1991) Gibson dan Hamrick (1990) Shiraishi (1988) Shiraishi et. al. (1987) Furnier dan Clyde(19S0)
Hamrick et.al.(lS81) Ha~rick clan Loveless (198S) Hamrick (1979)
Menyediakan informasi untuk konservasi genetic Strategi konservasi suatu biodiversitas in situ memerlukan data informasi tentang besarnya variasi genetik baik dalam maupun antar populasi species yang akan dilindungi (Adam, 1983).
20
Dogma Sentral Genetika Molecular I
Tran.s'kripsi
DNA--
...
U
Replikasi
RNA--~--~
Nukleus
I
Translasi RNA --------.. Protein Sitoplusma
Replikasi DNA ....
Replikasi DNA sell1ikonservatif
.• . ...."" "". ". .. «
----~
DNA induk
...
. " ."
11
~
·.•• "".
....
DNAanakan-
Transkripsi DNA A ... T G ... C
C ... G T ... A T ... A A ... T C ... G G ... C
DNA induk Keterangan:
DNA
A ...... 'I'· ." -
"
G ... C: C ... G: T ... A: T ... A: +
A ... T: • C ... G: " G ...
C:
:A ... T :G . ... C
:C ... G :T ... A " ?T ... A :"" A ... . 'I'
;C ... d .:0 ... C
DN A ananakart
DNA induk yang direplikasi ....... ".... DNA anakan hasil replikasi ~
untai konlplelllenter 5' - A G A A A C G G C A G T G T A - 3' ~ untai sandi
3' - T C T T T GCe G T C A CAT - 5'
\
T
RNA 3' - U C U U U GC C G U CA eAU - 5' Catatan: Thyimine (T) pada DNA digantikan oleh Uracil (U) pad a RNA
Translasi RNA aa
.---------c----
mRNA
---.-
Arah gerakan ribosom
mRN A 5' - U A CA C UGC C G U U U C U - 3'
i
'f tyrosine threonine alanine valine serine
Tabel sandi genetik VUU Phe UUC Phe UUA Leu UUG Leu CUU Leu CUC Leu CUA Leu CUG Leu AUU lie AUC lIe AUA Ile AVG Met GUUVal GUCVal GUA Val GUGVal
UCU Ser UCC Ser UCA Ser UCG Ser CCU Pro cce Pro CCA Pro CCG Pro ACUThr ACC TIlr AeA Thr ACGThr GCUAla Gce Ala GCA Ala GCG Ala
UAU Tyr UAC Tyr UAA Stop UAG Stop CAU His CACHis CAA Gin CAGGln AAU Asn AACAsn 'AAA Lys AAG Lys GAU Asp GACAsp GAAGlu GAGGlu
UGUCys UGCCys UGA Stop UGG Trp CGU Arg CGCArg CGAArg CGG Arg AGU Ser AGCSer AGA Arg AGG Arg GGUGly GGCGly GGA Gly GGG Gly
Process Electrophoresis BIl((C(
soiction
Dit«
~ ..
.. -';:.::~/ ".\ -. . - . "
aIel A aiel B aIel C
Genotipe: AB heteosigot
Kcterangan:
AA
BB
BC
homosigot
homosigot
hClerosigat
'bunding pattern" pada gel electrophoresis
CARA PERH 1TUN GAN VARIA SI GENE TIK 1. .Jumla h allcle cfckti f I) er lokus == 1/ Lp/
!Lt
Keteru..ngan :
Pi
::::: fi'ekuensi alel ke-i
2. Obser ved dan Expec ted Hetcro zigosi ty
Ho = proporsi SelLUl.l.h genotipe yaIlg hetero zigot dan dinyatakan per lokus / rata-rata loci
He= : (J -
z.. p/)
KeterangaTI : Pi
== frekuensi ale! ke-i
=> CONT OH: Tabel data Freku ensi Allele IAlCllS /
Allele I Lap~l
a
1 0.36
b c
0,02
1: sampl e Lap-2 a b c
,
Id
0.62
50 0.03 0.17 0.68 0.12 50
2 0.23 0.73 0.04 70 0.07 0.19 0.69 0.06 70 0;01 0.05 0.01
\1: sampl e Est-l a b
0:14
c
0.02
d e
0.84 0.72
-
0.21
J - -- - ,.------
,1: sampl e Acp-l a b ) j
I
i
\1: sample
c d (
J g
50
-
70
I 0.01
0.02\ 0.01 0.98 I 0.95 - 0.01 0.0) I -
-
-
50
69
Freku ensi Allele 5 6 7 8 0.22 0.06 0.12 0,04 0.10 0.74 0.84 0.79 0.87 0.79 0.04 0.10 0.09 0.09 0.11 79 51 58 69 66 0,01 0.12 0.13 0.10 0.05 0.27 0.19 0.11 0.12 0.18 0.70 0.68 0.72 0.73 0.74 0.03 0.02 0.04 0.05 0.03 79 51 58 68 66 - 0.02 0.01 0.04 0.10 0.07 0.05 0.11 0.12 O.Ol 0.05 0.1 0 0.09 0.06 0.82 0.75 0.82 0.72 0.73 0.06 0.14 0.02 0.07 0.06 . 0.01 72 60 51 60 69 26 - \0.01 0.04 0.02 0.03 0.03 0.02 iO.04 0.04 I 0.90 0.93 i 0.90 0.87 0.69 0.73 0.01 0.01; 0.02 0.04 0.01 0.03 0.01 : 0.03 0.06 0.13 0.14 0.03 0.03 1 0.01 0.07 0.09 - 0.01 0.02 72 72 150 68 51 68 --'--.
3 0.19 0.75 0.07 93 0.03 0.30 0.63 0.04 73 0.01 0.11 0.06 0.79 0.04
4
-
L
-
-
10
9 0.13 0.83 0.04 35 0.06 0.16 0.77 0.01 35 0.01 0.14 0.06 0.69 0.10
0.09 0.83 0.07 55 0.08 0.18 0.71 0.03 55 0.01 0.04 0.08 0.78 0.09
-
-
35
35
-
-
0.89 0.03 0.04 0.03 0.01 65
l
11 0.01 0.95 0.04
60 0.03 0.15 0.79 0.03 58
0.03 0.08 0;62 0.20 0.01
~ 0.03 I
I I
0.01 0.1.5 0.85 0.63 I 0.01 0.01 0.03 rO. IO 0.09 0.70 i 0.01 0.01 51 36 J
-
I
I
He ==(l-h.p/) Lap-J (1) = 1 - (0,36 2 + 0,62 2 + 0,022 )
= 1 - 0,5144 = 0,486 (7) = 1 - (0,04 2 + 0,892 + 0,042. ) = 1 - 0,766
= 0,233, ....
dst
2
Lap-2 (5) = 1 - (0,12 + 0,19 2 + 0;68 2 + 0,02 2 ) = 0,489
Est-l (4)
= =:::
2
1 - (0 +0,10 2 + 0,022 -I- 0,82 2 +- 0,82 2 ) 0,313
. Tabe! Rckapituiasi Hetcro~igositas Harapan (He) Semna Populasi !I No Tcgal<:an Asal Lap-l Lap-2 Esl-l Acp-J I Swedish 0.493 0.274 1 0.486 0.039 Swedish \ 2 OA13 0.479 0.435 0.097 I 3 Swedish 0.397 0.510 0.359 0.187 4 Swedish 0.436 0.313 0.134 00402 Swedish 0;281 0.487 00410 5 0.187 Swedish 0.314 0.237 6 0.353 0.451 Baltic 7 0.440 \ 0.233 0.456 0.499 Baltic 0.444 8 0354 0.417 0.438 9 Swedish 0.293 0.378 00491 0.204 Swedish 0.298 0.456 0.375 0.268 10 Gennan 0.096 0.352 0.530 0.565 11
l
Rcrata 0.323 0.356 0.363 0.321 0.341 0.239 0.407 0.413 0.341
0.350 0.386
Genetic Distance (D) = -Ioge J J == .1.91 f (Is. I)) Ix == L x/ 4 rata-ra ta frekucnsi alle.le seluruh loci pada pOpU\(L qj x J)' == It :'1/ 4 rata-ra ta frekuensi allele scluru h loci pada popula si y J.'C)' == It XiYi 4 rata-ra ta frekuensi allele selum h loci pada populasi x clan y D
::::::>
.:1;:
= frekuensi allele ke-i untuk popu\asi x
)'i
== frekueusi allele kc-i untuk populasi y
CONT OH: 1 DAN 2 Jx (1) = L, Xi2 :: (0,36 2 + 0,622 + .... -1-0,98 2 ) = 2,7074 Jxy
Ldl? = (0,23 2 + 0,732 + .... + 0,01 2 ) = 2,5762 = Li XiYi= (0,36 2 X 0,23 2 + 0;62 2 X 0,73 2 +.... + O,9S2 X 0,952 ) =
D
=-logd .Ts.yIY (Js.J,)
J y (2):=
:: - loge [ 2,590 2/
2,5902
-J (2,7074 x 2,5761) ]
= - 10& { 2,590 2/2,64 09) == - loge 0,9808 0 = 0,019
=> Tube! Rekapltulasi Genetic Distan ce CD) antar populasi (tegak an) !:;:~0}~~lf%i~frJJJ:t~:~~~t?/f~ . :~;')f::::;;~::i;;'1::::~:::;::I':;"~:·:::~.::~:!r'J:;:::::*:J.?~;:~;:::::i:;:;:::f:~:::~~:~;~:: 1~~i~.
H 1;
-
i+~t' 0.039 ::~;;g~: 0.028
0.012 0.018
0,013
.
0.014
0.014
0.030
0.032 0;018
0.008 O.Olll
O.Q13
.
0;013
0.011
0.005
.
0.011 0;007 0.011 OJ;04 0.063 0.034
0.010
0.013 0.010 0.020
0.009
.
0.008
0.006
.
0.031
0.035
0.033
0;018 :~:~. 0.031
;.t.fJ;
0;035
0.011 0.014
it
0.111
0.054
-
0.002 0.012
0;013
0.010 0.06-1
.
Q.005
0.050
.
moth er tree (2n)
/
~ .. . . . . ... ~ strat ified
~ - ... ... .. ~
see~s
~; . . .
strat ified seeds
\ (1)I .... @
(n)
I
I
T
/
t
~xtract bUff tr -
•
"
1111
•
! t.
"
•
seed corts
\~
~m):)ryos
(n)
HOTo gentz e
d
t
.
.-t
'..r;:
d)
centr lJ.. uge \
supe rnata nt
.1 tI
~
megagametoPhyte~
supe rnata nt ctroP hlres is
'\'
.@)
mega game tophy tes /
\
/
\
\
• "
I
•
•
•
~
t
I
I I I
I
polya cryla mide vert ical slab gel I I
I
ng proce ss
I I
I I I
band ing patte rns I
-
I I
.........,
-
....-......--.
.......
----
~
I
........ '.-.....
'-
~---
2.2. A schem atic of isozy me analy sis proce dure in this study
Different form of gene (",allele)
Segment of chromosomo (- gene) A G C
/d / G
C
T
..Mutation."
A
.
A G
1/'0---I I T
T C
~~ (change In base sequence) .
I I TI
G
I
G
T
codos for
sJWcillc onzymo
Chain of nmlno acids
IInkod by poptldo bonds
/
V.AL ••
o
VAL et
/'
®. ~ I-G~~ I LEU~./ PHE
.
·0.
Allozymes
0-
~HE
LEU
et
AmIno acid substItution Enzyme r'\ow . negatlvoly charged
0.
Rf 30
20
=
Got-<31 /
~
~
8
b
a
b
c
a
b
c
~ ~Got-21 zone-3
zone-2
zOne-1
d
-
.·gure 3.18. Banding patterns of GOT isozyme and their genotypes
l
Got-3
]
Got-2
1
Got-I
3.19. Phenotypes showing segregation of allozymes ;n r::nr-1
r::nr-7. ;:)nn
{:;nf"-.':? lnr.i
-:"..-:
-----... ~ Shd-2
----
.~
ZOne-2
- 11shd~1
=-----:
Zone-1
I-
- - - - - - a
8
-
b
c
b
C
d
d
e
f
0
I
0
Bandin~ patterns of ShDH isozyme and their genotypes
] Shd-2 ] Shd-1 Adh
shoH'ing segregation of allozymes and Shd-21oci
Hf
~L
30
~]
Sod
l- - I a
b
o
.• 36. Banding patterns of SoDH isozyme and their genotypes
-.Sod
]
Adh
Plienotypes.::;howing segregation of allozymes
in Sod locus
.
a--. 15' III •
III
>C C p~
c.:t
=1 1. en = ,. 1:1: = .... z i = " .... en cc _·e n c:.:t = .-' '·'U ·· i
III
a. C C ;" I
-a. z
:11.
·CC CC en
j -,-
_c_
•
"'.'-
..
,ilntroduction Isoenzvme or isozyme is electrophoresis separates variant forms of enzyme based on diHerences in their size·and net electrical charge. . ;.~. Isozvme as genetic marker has been used widelv used over the past several decades to conduct investigations of the genetic of a large number of organism, from fruit flies and wild herbs to humans. Onlv alew of those studies have been IropiGall~ee ;' species. f
4ffi: ...
,~
.,~ However, due"IO:
Increasi'ng'gl'obal concern over the fate of tropical forest Resultant improvement in funding of utilization and conservation eRons Isozvme analvsis will be apowerful technique for the study of population genetic as abasis for genetic management of tropical forest resources
-.
,
"~
""
..
.
Jeveral advantages using . zvmes as marker genes f\· _ . , " • • • ~>
~
-i-
Some advantages: No environmental enects ... Enzvme expression is unaHected bv differences in environment
Co-dominant expression - Heterozvgotes homozvuotes
;~<
can be distinguished from both
Because each individual contains thousand of 4·'" ,nzvmes, many loci can be studied simultaneOUSlv ,~ .,~. . : liSOIYMES are therefore very valuable in SIUdVi:llU g:eneliC varialion
.A ~1:~ '
.. ~\...
'. Some problems or disadvantages: Not all gene mutations will result in changes in the. surface charge of enzyme produced; ,_ therefore not all such mutation are detectable f.:: Enzvmes represent onlv one class of genes, which may not representative .of the whole g~nome. Thus, estimates of genetic variation arising from isozyme studies may diner. "'; The relationship between enzymes and impORa"t ¥.~ ch·araeters likegroWlh rate is'unclear :;;..
.
~-'
, , .._.
*'
,
~~~
J
';'-
4 '. " ..''10~.
~-
.. ",' f""."'-
~.-.-.
. .......
.._~
.. _
...... '
l~-
-,
•
•
•
_
•
• ,--
hat are enzvmes;J *!brotein are relativelv large organic molecules that
. Plav a varietv· of·essential roles in many· biological·· ocesses .,'* ••• ese· including transpon and storage of other olecules, providing mechanical. suppon and ntrolling almost all·chemical reactions imponant class of protein that control chemical * ctions in plant cells are called .ENZYME. Thev act to hance the rate of chemical reactions wilhoiUI '_FlVes being consumed * 'Ie:in are olDl:posed of ohains oil amino' ao;i:dS linked .
peptide boads
~:'
..~
.
...
,.~"
~.".,',
....
~
...."~-.,,
.. ".
.
.
'""d • '1"""1 ()
~ I
/0
o~ 0
0 ~ • '1"""1
S
~
4-i
0
0
<J)
H
~
+J
()
+
Z
~
H
+J (j) ~
.Qj H <J)
~
<J)
0
,/
H
H
;//
//
/ //
.N+
-C
/ ' // H I
I
I
/
I
H
H,'
.
I
,
/
/
/
H
o C
0-
/
H
R
r--------------------------I
H
H
H
1
I
I
1
:
I
0
C
/ /
l, __ ~/// H 2 0
R
1 1
I
.' / N+
/
\/ 0- u:;:i I
\
,/1
/
jO ,/,/' H
~-,
,/
1
H
11
1
1
C
N:
C
N+·-
c
I
I
I
I
H
R
H
R
-c:O ""'0-
~ Peptide bond
Structure of Protein
hV electrophoresis of enzyme ere are many thousands of diHerent enzYmes, each aving a specificfunctio,n in panicular chemical actions. •i~ome enzYmes have identical functions, diHering . onlv in the location of their activities. . •~uiHerent. forms of functionallv identical enzYmes are termed ISOZVIES. Ie···:--··C :varialion is the result of dineren·ces in DiNA -4. as-I sequence-s, and cause changes ilJ Ihie enlVmes ":
\
,.
ro:lluGod.
~! ~J
.'~'"
~~?
, ,~,
.
"
','.-'
Because· some amino aCi.ds carry ionic side che'ins, nzvme may have anet electric charge HA is the organic molecules that forms· the hromosomes and carries genetic information NA molecules consist of two chains of sugar molecules linked bv hydrogen bonds between rganie base molecules to the sugar molecules. There are four organic base molecules [a'd;enine. ·1I:1I'~i:ne, gdanine and thymine]
v.....-...-_ _ _-.. . .
.M
."~'_ ..• ~ ............... ,...:.~" ....:...;........ ,
..
. let.
':;;.0 ...'"':~ t i ,
. . .'
.... A ...M qs
"~;*'.::W
*>
,.;
ft.
j,
.~-"""".''''-.=,., ... ,..~.....,.,.....,..
"'
~..;:....,•.';jl;;......~,~~..r~~.)'.\..~,.,..,;st~~,:;,.:..:;~~"'.... ;.:.l;.. '-".-:..r~,.,~...!.i~............~.......,Q~ ...• ~
••,
..",,{'At....,·.··._.
'~.
".'
;~•.•,:.:~.~~~;.~.· .......
_,.;>,../I .....
...
," ..
-$
1i&#J~,T.\k",¥.!!\f~",,:?~'~':":"~':';';":''''~:'~':'"'(''-
~~~·.1,.:,!.;~.l~·I.ifa~~,;If~nj~:~b;:·.~d:~
f
,
,
l t
{~::
The imponance of these four bases is that their ~
nicular sequence in aDNA molecule codes for p-~'.""speCifirf8minl~Q8tidS:·'Therefore asection"Of DN-'~'''''"'''' .molecules will code for asequence of amino acids which, when bonded together form a .. ' panicular protein. For this reason, because protein are the direct product of DNA translation, they are termed "PRIMARY GENE PRODUCT'. T"""'~
_',
-
1....•...
"
,:(5''''
:"!I• • •; :
~
W •. "--' """ • . i
,.'
. . __
.~>,.
' . , . - - - •..• -.'""'.~
~"
.. --"',,-,-.-
,-.
>
••"
••
J
.
,
I
1'
", j,." '.
it'
~•
., . .-
'~',""'-"--.~~
.,.
,.~.I)Nt:).,\£""'!.i~~~r.::--~I.,,:,,,~··;··"'.:·:~"'.-.~
,,'.-.,
·
,
1'ln.III'oOe form·s of genes are term,ed alllles, and [the 1F1I1I'1I'~1I111I1ft1IIV ditlerent,enzvmes pro'duced
bvdiiHoFent
le:l:eSr8'8 special tYpe of isozvmes, termedALLO~ME~S 1 '
'-
&~~MBuenetic change causing an alteration in the amino ,~r
18cid seque.nce of an' enzyme may alter the surface 7~arge and cause the change in the rate of movement
liD an electric field. Therefore, electrophoresis of ~zvme can indicate genetic differences originating lfrom gene mutations :_this wav, basic genetic differences among . ':~~i Jindividuals or populations can be Investigated simplv '~d qUICkIV. ~I
<:;.
"'~.
'!~~
- -
~laZYME ANALYSIS INVOLVE A:\li1.t
AF:,IIIIII!n.-
~:r~
.,.':-:t'".
PPROCEDURE
.,,~,',_, _: .... .-...~:,_"
.""~:
'~~'''',I''......... ",;:,,-''
";:_'~-.~'A~'. ,~"~,.""".u;,a.)b<~M>,''''1'''''''''''''''I."
Tissue preparation ~:~:: Gel running [electrophoresis] ~:!:: Enlvme staining . ~:!:: Scoring~and interpretation of isozyme b.and panerns ~:~:~
.
~:
;~
.
J
" ,· liON I-P'I'EPA _lr
·ii
._,:
[~E
e analvsis of tropical species face many rO:bl1ems associate .with seed collection and .
.
.
~,
rage. ~~'it~! ~~~. ':i:./
econdarv plant product, such as phenols which elude tauDios, quinones [the oxidation product of henols] terpens, iJectins, and resin acids. Thev can hibit enzyme activitv so that they will aneet the hilitv to identifV isozvmes •. urowlJing' of tissue sample is onen caused, bv uinones which, must be neutralized bv the addition protective agents. '~,
~'
Some polvmers such as polvvinvlpvrrolidine 121'], polv-ethvline-glvcol [PEG], 0. . . "'-diiihenoloxidase, thvols, cysteine, ~
~-
mercaPloelhanol, bovine serum albumine have been found 10 bind 10 phenols, Ihus inactivating them. * leaf tissue is usuallv readilv available, but it has high concentration on secondary plant product • Other tissues, such as roots and buds, may also be used.
~'J'>./f
....~~.
"1:~::
~1Il!b.
·
~
'
,
'
.,'
,.'
."unlnUHnu In Il;nr-nt I R IIUln u:r
IS,IZYME BAND PAnERNS ~%,
<\~~~~l
• Isozvme are revealed as individual bands on the gel~ •.
~ "
,~ .';"
l' ';
r"'tl l c.
;~'t
,
,
!
'.,t
".:::J.
,\,~~
• Isozvme bands controlled bv an individual gene are called allozvme • Allozvme are useful as genetic markers both in practical tree improvement and research
I',
SWEDEN
(4)
(3) .0
•
• (11 ) POLAND
GERMANY FRANCE .
CEKOSLOV AKIA
':
~;. ~-
ApllkaSl penanda molecular dalam program pemullaan ~----------------------~~~~
.
;,
:
Dr. Anto Rtrnbawanto Puslttbang BtotBkno]ogi &Pernultaan Tanarnan Huwn .
'.
'
.
. : . ":.
APLIKASI PENANDA MOLEKULER DALAM PROGRAM PEMULIAAN ITTO Project PD 16/96 Rev.4 (F) Short Course on Introduction to Molecular Genetics and Biotechnology in Forest Trees Yogyakarta, 5 - 9 September 2000
disusun oleh ANTO RlMBAWANTO
Pusat Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Pemuliaan Tanaman Hutan Yogyakarta
DAF'I'AR ISI I.
It
UNSUR KETURUNAN LGen
4-
2. Ekspresi Gen
5
DNA (d~ioonuclcic acid) L Komponen DNA
8
2. Struktur DNA
8
3. Alur Informasi dalam DNA
10
\:""
Ut
PENANDA ISOZVMES L Pwdahuluan
10
2. Prosedur
12
3. Aplikasi Analisis l~es
15
K~an
15
a.
IV.
genetik
b. Susunan genetik populasi
18
c. Sistem perkawinan
18
PENANDADNA L RFLP (restriction frngment length polymorphism)
21
2.Pwanda~basisPCR
24-
a.:ru\PD
(random amplifioo polymorphic DNA)
21
b. AFLP
30
c. Microsatellites
33
3. Aplikasi Pwanda DNA a. Analisis ~man genetik
36
b. Pemetaan genetik
31
c. Seleksi d~ penanda DNA
38
Aplikasi Genetika Molekuler
2
VI.
40
RINOKASAN BAHAN BACAAN
Aplikasi Genetika Molekuler
3
I,
UNSUR KETURUNAN 1.
Gen
Seeara molekuler gen dapat didefinisikan se bagai uru tan (sequence) nucleotides yang berisi kode untuk protein. Suatu urutan nucleotides (DNA) yang merupakan eetak biru asam amino (struktur utama protein) yang menentukan aktivitas biologis dari protein. Ukuran dan panjangnya sebuah gen tergantung pada besarnya informasi yang disimpannya. Protein yang berukuran besar mempunyai lebih banyak asam amino daripada molekul keeil. Oleh karenanya protein yang besar membutuhkan lebih banyak nucleotides dalam DNAnya untuk dapat menyimpan informasi genetik yang dibawanya. Yang utama dalam hal ini adalah
uru tan
dari
nucleotides
dalam
gen
terse bu t
yang
menentukan jenis asam amino. Sekalipun hanya ada empat maeam basa nucleotides, tetapi jumlah kombinasi yang dapat terbentuk bertambah seeara eksponensial sebanding dengan pertambahan panjang molekul DNA. Dan karena kombinasi nucleotides yang berbeda membentuk kombinasi asam amino yang berbeda pula, maka jumlah protein yang adajuga sangat besar. Sekalipun demikian tidak semuajenis protein itu berguna bagi sel. Proses evolusi menentukan protein mana yang bermanfaat dan dengan demikian uru tan nucleotides mana yang akan terus disimpan sebagai informasi
Aplikasi Genetika Molekuler
4
geneti~
Kemungkinan kombinasi nucleotides dapat diilustrasikan sebagai berikut. Jumlah kombinasi yang dapat terbentuk disebut sebagai 4 n , dimana 4 adalah jumlah nucleotide (A/adenine, T /thymine, G/ guanine, dan C/ cytosine) dan n
nucleotide dalam molekul; dengan kata lain n
adalah jumlah adalah panjang
molekul. Jadi untuk molekul yang terdiri dari 3 nucleotide ada 64 kemungkinan kombinasi (4 3 = 64). Molekul dengan 10 nucleotide dapat terdiri dari ju taan kombinasi. Unsur genetik ini mempunyai dua fungsi pokok, yaitu: •
Fungsi
genotipa
atau
replikasi.
Gen
harus
dapat
menyimpan informasi genetik dan meneruskan informasi tersebut dengan baik dari induk kepada keturunannya, dari generasi ke generasi. •
Fungsi phenotipa atau ekspresi gen. Gen harus dapat mengendalikan perkembangan / pertumbuhan phenotipa suatu
organisme.
mengarahkan
Dengan
kata
pertumbuhan
lain dan
gen
harus
peru bahan
(differentiation) dari sel tunggal berupa zygote menjadi individ u dewasa. 2.
Ekspresi Gen
Konsep ten tang mekanisme pewujudan sifat yang dibawa oleh gen pertama kali dikemukan oleh Francis Crick tahun 1958. Informasi
biologis
yang
disimpan
didalam
DNA
pertama
ditransformasikan kedalam RNA (ribonucleic acid) dan kemudian kedalam protein. Alur informasi tersebut bersifat satu-atah atau
unidirectional, artinya protein sendiri tidak dapat mengarahkan RNA dan RNA tidak dapat mengarahkan sintesa DNA. Sekalipun
Aplikasi Genetika Molekuler
5
ada pengecualian pada virus, konsep Crick yang dikenal sebagai Central Dogma hingga kini masih menjadi konsep dasar genetika
molekuler. Proses ekspresi gen ini diawali dengan transcription, yaitu DNA berubah menjadi RNA,
suatu
molekul rantai tunggal
menyerupai DNA. Salah satu perbedaannya dengan DNA adalah basa thymine pada DNA diganti oleh uracil (U). Transkripsi ini dibantu oleh ensim RNA polymerase. Dari proses transcription ini dihasilkan suatu rantai baru RNA yang disebut messen1ger RNA yang membawa informasi dari DNA yang berisi kode urutan asam amino untuk suatu protein. Kemudian diikuti oleh translation, yaitu informasi yang dibawa oleh messenger RNA diterjemahkan oleh ribosome. Kode kode dalam messenger RNA itu diubah dari bahasa nucleotide (4 huruf nucleotide) kedalam bahasa protein (20 huruf asam amino) oleh molekul RNA yang disebut transfer RNA. Mekanisme ekspresi gen diuraikan pada Gambar 1 berikut ini.
Aplikasi Genetika Molekuler
6
Gambar 1. Skema perubahan DNA menjadi RNA dalam proses transcription.
Aplikasi Genetika Molekuler
7
1.
Komponen DNA
DNA adalah suatu molekul, yaitu kumpulan atom yang bersatu membentuk unsur baru yang berbeda dari unsur pembentuknya. phosphate,
DNA
gula,
dan
mempunyai basa
tiga
unsur
nitrogenous.
dasar,
Unsur
yaitu:
phosphate
menyebabkan DNA bersifat asam dan bermuatan listrik negatif. Unsur gula dalam DNA adalah 2'deoxyribose, sedangkah unsur basa nitrogenous adalah adenine, guanine (purine), cytosine, dan thymine (pyrimidine). 2.
Struktur DNA
Molekul DNA mempunyai bentuk seperti sebuah tangga yang melintir. Kedua bagian rantainya (double strands) diikat oleh dua macam ikatan kimia, yaitu: ikatan phosphodiester yang mengikat basa nitrogenous, dan ikatan hidrogen yang mengikat ked ua ran tai (strand). Ikatan kimia ini berperan pen ting dalam pembentukan molekul DNA. Ikatan phosphodiester termasuk ikatan kuat yang mempertahankan unsur yang diikat dalam molekul tersebut, sedangkan ikatan hidrogen adalah ikatan yang lemah
yang
dapat
dipisahkan.
Ikatan
yang
lemah
ini
memungkinkan molekul biologis mengenali satu sama lainnya, untuk menyatu atau memisahkan diri bila kondisi berubah. Gambaran skematik ten tang struktur DNA dan basa nucleotide nya ditampilkan pada Gambar 2 dan Gambar 3
Aplikasi Genetika Molekuler
berikut-ini~
Gambar 2. Skema DNA rantai ganda menurut model Watson-Crick
Gambar 2. Struktur molekul DNA
Aplikasi Genetika Molekuler
9
3.
Alur informasi dalam DNA
Sebagaimana dikemukakan sebelumnya nucleotides adalah dasar kimiawi penyimpanan informasi genetik dalam DNA. Keempat nucleotides yang disingkat A, T, G, dan C merupakan abjad genetik dalam urutan tertentu yang menentukan informasi yang disimpannya. DNA memiliki tiga sifat yang menentukan strukturnya. Pertama, sebuah rantai DNA tidak mempunyai percabangan. Jadi informasi disimpan dalam suatu garis lurus yang sederhana. Kedua, ujung dari rantai DNA mempunyai unsur kimia yang berbeda, dan karenanya mempunyai arah gerak. Ketiga, ketika dua rantai DNA berhubungan membentuk tangga (double helix) basa
basa
dari
kedua
rantai
tersebut
harus
menyatu
(complementary base pairing). Ketika basa A ada di rantai satu
maka basa T harus ada dirantai lainnya. Demikian juga dengan G dan C. Jika basa basa tersebut bertemu dengan pasangannya maka kedua rantai tersebut dapat menyatu.
rn,
PENANDA lSOZVMES
1.
Pendahuluan
Penggunaan isozymes sebagai penanda genetik muncul pada awal tahun 1970, dan membuka lembaran baru penelitian genetika populasi tanaman hutan. Dengan tersedianya sistem enzymes membuka kemungkinan untuk mempelajari -keragaman genetik dan sistem perkawinan. Hingga kini isozymes masih merupakan
alat yang
handal
konservasi genetik tanaman hutan. Aplikasi Genetika Molekuler
10
bagi
berbagai
studi
tentang
Isozymes adalah protein yang mempunyai peran sangat penting dalam berbagai proses biologi. Diantara berbagai macam fungsi protein ada yang fungsi sebagai pengatur semua reaksi kimia. Protein yang demikian ini disebut sebagai enzymes, yang fungsi pokoknya adalah mempercepat proses rekasi kimia tanpa ikut terlibat dalam proses tersebut. Terdapat ribuan macam enzymes yang masing-masing mempunyai fungsi dan peran dalam setiap reaksi kimia. Beberapa dari enzymes tersebut kemungkinan mempunyai fungsi yang sama tetapi berbeda dalam hal tempat terjadinya reaksi. Enzymes yang mempunyai fungsi yang sama tetapi bentuknya berbeda inilah yang disebut dengan isozymes. Keragaman genetik merupakan hasil mutasi, yang dapat terjadi karena perubahan pada urutan basa dari molekul DNA. Sebagaimana diketahui urutan basa tersebut merupakan cetak biru kode asam amino yang pada gilirannya membentuk protein. Oleh karena perubahan pada urutan basa akan mengakibatkan perubahan urutan asam aminonya. Akibatnya protein atau enzyme yang terbentuk dari proses translation akan berbeda dengan yang semestinya (sebelum terjadinya mutasi). Perubahan tersebut
dapat
bersifat
fatal
yang
mengakibatkan
enzyme
kehilangan fungsinya. Pada umumnya mutasi hanya bersifat berubah
struktur
enzyme
tanpa
mempengaruhi
fungsinya.
Ilustrasi sintesa enzyme yang menimbulkan perbedaan genetik diuraikan pada Gambar 4 berikut ini.
Aplikasi Genetika Molekuler
Il
Gambar 4. Ilustrasi diagram sintesa enzyme dan sumber keragaman genetik.
Different form of gone
Sogmoot Of chromosome
~
rr?~ ~1 i
r ~
(=allele)
~
(.. gene)
~! j /' I~
Mutatfon
lo""'g'"
M'. ''''"''''I~
codes for spedfic enzyme
!
Chain of
amino acids linkedbl'
peptide bonds
AL ••
-
~
~ LEU
..
AL •
.-
~PHE
Amil'tO acid substirution
Enzymanow n~tivell' charge
GW
~
-..
2.
)
/'
Allo~
u
•••
Prosedur
Tahapan dalam analisis isozymes dijelaskan dalam Gambar 5. Secara ringkas prosedur isozymes terdiri dari dua hal: pertama ekstraksi enzyme dilakukan dengan menghaluskan jaringan tanaman dalam larutan buffer, dan kedua memindahkan larutan terse bu t
kedalam
gel
(dari
bahan
dasar
starch/ pati
atau
acrylamide) untuk menjalani proses electrophoresis. Jaringan tanaman untuk ekstraksi enzyme dapat berupa daun, tunas, kecambah,
biji atau
kulit.
Larutan
buffer
untuk~
ekstraksi
bergantung pada jenis tanaman dan jaringan tanaman (Cheliak and Pitel 1984, Moran et al1989).
Aplikasi Genetika Molekuler
12
Isozymes dipisahkan dalam suatu medan listrik. Visualisasi enzyme dilakukan dengan merendam gel dalam laru tan yang menghasilkan warna tertentu saat berreaksi dengan enzyme. Pada starch gel electrophoresis dari satu gel dapat diiris menjadi beberapa dan direndam dalam larutan yang berbeda sesuai dengan jenis enzyme yang diinginkan. Gambar
5.
Tahapan analisis lsozymes .
genetik
....... l'eediio9 tissue
.t~~l:g,~"!i~:;kk ·•••
Aplikasi Genetika Molekuler
~pap.,'"'ic,
13
dengan
teknik
Dalam laru tan
perendam
enzyme
akan
bereaksi
dan
menghasilkan pita isozyme (locus), dan selanjutnya dievaluasi secara genetik. Locus isozymes bersifat codominant , artinya bahwa setiap allele dapat diiGcntifikasi sebagai pita pada gel. Untuk lebih jelasnya diuraikan pada Gambar 6 berikut ini. Gambar 6. Skema keadaan allele codominant dan dominant
.Codotniriant: .tn$nYCillele$·pO$sible($<:tlle1e$shown)
allele A alleleB alleleC Genotype: A/B
BIB
AlA
heterozygote homozygote
~'-"-'-"~===
BIC
homozygote heterozygote
. two.?H§les.onIY(pr-esenQe:::-f-;9bsence.= --.) +1+.g~riotypeihdistingUI$hC3.~I~ff8m· +/:-
.
Genolxp,,:I,,-,:~+__.• •~{__ ~+=l~. +__••• __••••__•.. =.,.
......
.
:'.:."
h()moiygot~
.-,
..
:-',.,.,.'....,.,. __ .. .,.,....7••••__-.,.,..1.",.-7 •• •.=•••"-,,Jl
:
......
-
heterozygote
........................ .
"alterr.ah{
h()il1O:zygote
Resep tentang larutan perendam tersedia dalam berbagai publikasi ilmiah seperti Shaw and Prasad (1970), Valkjos (1983) dan Wen del and Weeden (1989).
Aplikasi Genetika Molekuler
14
Ekspresi isozymes bervariasi tergantung pada jenis jaringan tanaman yang digunakan.
Jumlah
locus isozymes terbesar
diperoleh dari keeambah muda. Pada jaringan tanaman yang sudah lanjut banya dari locus yang tidak dapat te:;:ckspresikan. Misalnya locus ADH hanya dapat terlihat pada biji dan anakan dan tidak ditemukan pada daun dewasa. Keragaman seperti ini disebut epigenetic variation. Salah satu kelebihan teknik isozymes adalah relatif mudah dan murah dibanding dengan teknik DNA. Kekuranganny~ adalah terbatasnya jumlah locus yang dapat dianalisa (20 - 30 locus) dan hanya melihat pada sebagian keeil dari genome, yaitu locus yang ensimatik. Karena jumlah penanda yang dihasilkan relatif sedikit,
isozymes tidak eoeok untuk studi yang membutuhkan resolusi keragaman yang tinggi. Sekalipun demikian isozymes masih dapat digunakan
untuk
beberapa studi genetika populasi
seperti
diuraikan dalam bab berikut. 3.
Aplikasi Analisis Isozymes
a.
Keragaman genetik suatu jenis Mengetahui tingkat keragaman suatu jenis dalam
suatu populasi merupakan suatu langkah yang penting dalam rangka upaya konservasi sumber daya genetik. Karena sebab sebab evolusioner banyak jenis tanaman hutan mempunyai keragaman genetik yang tinggi. Tingkat keragaman ini akan menen tukan model konservasi yang akan diterapkan bagi jenis yang bersangkutan.
Aplikasi Genetika Molekuler
15
Dalam mengukur tingkat keragaman ada beberapa variabel yang dapat digunakan, diantaranya: •
Proporsi dari locus polymorphic
Proporsi dari locus heterozygote didalam semua locus banyak digunakan sebagai ukuran keragaman. Sayangnya besarnya
proporsl
pengambilan
variabel
sampel
locus.
ini
dipengaruhi
Pemilihan
locus
oleh yang
berpeluang menunjukkan keragaman seringkali dapat memberikan
informasi
yang
keliru
tentang' tingkat
keragaman yang sesungguhnya. Ukuran sampel juga dapat
mempengaruhi,
terutama
yang
berhubungan
dengan locus yang langka. Locus dapat diklasifikasikan sebagai locus beragam apabila frekwensi allele yang paling umum dibawah 0.99. Kelemahan
lain
dari
penggunaan
proporsi
locus
polymorphic sebagai ukuran keragaman adalah tidak diperhatikannya frekwensi allele. Sebuah locus dengan empat allele, yang semuanya mempunyai frekwensi yang sama adalah lebih beragam dibanding sebuah locus dengan dua allele, yang satu diantaranya termasuk allele langka. •
Jumlah rata-rata allele per locus
Variabel
ini
polymorphic,
hampir dengan
sama
dengan
kelebihan
proporsi
locus
memperhitungkan
keragaman jumlah allele dalam setiap locus. -SUtttu jenis atau populasi dengan sedikit lokous beragam akan memiliki jumlah rata-rata allele per locus yang rendah.
Aplikasl Genetika Molekuler
16
Demikian sebaliknya, suatu populasi yang mempunyai lebih banyak allele pada satu atau lebih locus, akan mempunyai lebih banyak allele per locus dibandingkan dengan populasi lain meskipnn keduanya mempunyai proporsi locus heterosigos (heterozygous) yang sama.
•
Heterosigositas pengamatan dan harapan
Heterosigositas pengamatan (Ho) adalah proporsi dari seluruh
genotipa
yang
heterosigot.
Sedangkan
heterosigositas harapan diuraikan dalam rumus berikut He = (1 - I pi2 ) Dimana Pi adalah frekwensi dari allele ke i . Keragaman genetik jenis dapat dipengaruhi oleh sejarah perkembangannya dan faktor lingkungan. Hamrick et
al.
(1979)
menyimpulkan
hal
itu
sebagaimana
dicantumkan pada Tabel 1 berikut ini. Tabel 1. Hubungan antara sejarah hidup dan keragaman genetik (Hamrick et al. 1975).
Kera am an rendah
i
Dicotyledons Distribusi regional
Endemic
Tanaman tahunan
Tanaman setahun
Outcrossed
Selfed
Penyerbukan oleh angin
Penyerbukan sendiri
Jumlah chromosome tinggi
Jumlah chromosome ren<1an
Tanaman climax
Tanaman pioneer atau semak
Aplikasi Genetika Molekuler
17
Beberapa
hasil
penelitian
yang
menggunakan
penanda isozymes untuk mengetahui keragaman genetik populasi antara lain adalah Wickneswari and Norwati (1993) pada Acacia aunculiformis, Moran et al. (1989) pada A. ma ngiu m, Kertadikara and Prat (1995) pada Tectona grandis, dan Seido et al (1993) pada Parasenanthes falcatana. b.
Susunan genetik dalam populasi Strategi
pengambilan
sampel
untuk
tujuan
pengelolaan genetik perlu memperhatikan tidak hanya berapa banyak dan populasi mana yang akan diambil sampel dan berapa individu dari setiap populasi yang akan dijadikan sampel, tetapi juga pola dan metoda seleksi didalam populasi. Sampel yang diambil dari wilayah yang terlalu luas dapat menyebabkan dimasukkannya individuindividu dari sub-populasi yang mempunyai frekwensi allele yang
berbeda
akan
menyebabkan
ketidakseimbangan
jumlah homosigot yang diambil. Sebaliknya wilayah sampel yang terlalu sempit akan menyebabkan terjadi penumpukan individu-individu yang
berkerabat dalam
sampel,
dan
karenanya bias dalam pemilihan gen dan genotipa. c.
Sistem perkawinan Sistem
perkawinan
menggambarkan
adalah
bagaimana
gamet
terminologi
untuk
bersatu
untuk
menghasilkan generasi berikutnya. Yang menjadi pokok perhatiannya
adalah
menduga
tingkat
selfing
atau
ou tcrossing, Sistem perkawinan bukanlah sesuatu yang
t.pld(dSI
Genetika Molekuler
18
tetap tetapi berubah menurut waktu, ruang, iklim, letak geographis dan faktor genetik. Informasi
ten tang
sistem
perkawinan
sangat
dibutuhkan baik untuk populasi alam ataupun hutan tanaman. Untuk populasi alam, informasi ten tang pola dan tingkat keragaman genetik diperlukan untuk membuat rancangan pengambilan sampel untuk tujuan konservasi dan pemuliaan genetik. Bagi hutan tan am an , informasi tersebut sangat dibutuhkan dalam pengelolaarl. kebun benih, khususnya untuk menduga perbaikan sifat dari hasil pemuliaan, dan menduga tingkat kontaminasi serbuk sari dari luar. Pendugaan sistem perkawinan melibatkan keturunan dari induk betina yang diketahui asalnya (umumnya dalam bentuk biji) dan pembagian keturunan kedalam kategori selfed dan outcrossesd, berdasarkan pada perbandingan
genotipanya dengan genotipa induk betina. Keturunan yang mempunyai satu atau lebih allele yang tidak ada pada induk betina termasuk kategori outcrossed. Sedang mereka yang mempunyai
genotipa
identik
dengan
induk
jantan
perkawinan
dengan
kemungkinan hasH selfing atau outcross. Ilustrasi
pendugaan
sistem
membandingkan genotipa keturunan dan induk betinanya. (genotipa dalam kotak gelap termasuk outcrossed).
Aplikasi Genetika Molekuler
19
Tabel 2. Ilustrasi pendugaan sistem perkawinan (breeding system)
Locus 1
Genotipa betina AA
AA
AA
Locus 2
Bb
BB
Bb
Locus 3
CC
CC
CC
Locus 4
dd
dd
Dd
Amb
Amb
Genotipa keturunan
Keterangan: Amb = meragukan; OutX = outcross
Beberapa model statistik telah dikembangkan untuk menduga
parameter
sistem
perkawinan.
Model
yang
berdasarkan locus tunggal telah diajukan diantaranya oleh Brown et al. (1975), dan Clegg et al. (1978). Model semacam ini dapat menghasilkan pend ugaan yang keliru karena beberapa asumsi yang digunakan tidak berlaku (Shaw et al. 1981). Misalnya bahwa semua inbreeding adalah hasil dari selfing. Asumsi ini tidak selalu benar misalnya dalam situasi dimana terjadi pengelompokkan famili dan perkawinan antara individu yang berkerabat tetapi bukan identik mungkin terjadi. Untuk jenis jenis pohon tropis, menurut Hamrick dan Murawski (1990) tingkat outcrossing berkisar antara 0.35 1.08. Tingkat outcrossing
dari jenis Acacia auriculiformis
dan A. aulacocarpa dilaporkan sebesar 0.80 - LDL (Moran et al. 1989).
Aplikasi Genetika Molekuler
20
IV..
PENANDA DNA
1.
RFLP (restriction fragment length polymorphism)
RFLP adalah penanda DNA yang pertama kali dikembangkan menjelang akhir tahun 1970an. 8alah satu hal yang mendorong dikembangkannya penanda ini adalah diketemukannya ensim restriksi atau lebih dikenal dengan restriction enzyme. Ensim ini berfungsi sebagai gunting yang memotong DNA pada sekuense tertentu (recognition sequence). 8ebagai contoh ensim 'restriksi yang disebut EcoRI memotong DNA pada setiap sekeunse yang berbasa "GAATTC". Potongan DNA hasil pemotongan ini disebut sebagai fragmen restriksi (restriction fragments). Ensim
restriksi
diperoleh
dari
bakteri,
yang
fungsi
sesungguhnya adalah untuk melindungi bakteri dari serangan virus. Mekanisme pertahanan diri dari bakteri ini dilakukan dengan cara memotong-motong DNA virus yang menyerangnya. Ratusan jenis ensim kini banyak digunakan dalam genetika molekuler, umumnya yang mempunyai panjang basa 4 atau 6 pasangan basa. Perbedaan genetik antara chromosome dapat menyebabkan perbedaan
panjang
fragmen
restriksi
atau
disebut
length
polymorphism. Proses RFLP memungkinkan dilakukan deteksi
terhadap polymorphism fragmen DNA, sehingga adanya perbedaan genetik antara individu dapat diketahui. Metodoiogi RFLP dijelaskan pada Gambar 7. Tahap pertama adalah ekstraksi DNA dari jaringan tanaman seperti daun, biji, atau bagian tanaman lainnya (daun adalah yang umum dipakai), Aplikasi Genetika Molekuler
21
kemudian dilakukan reaksi dengan ensim restriksi. HasH restriksi yang berupa fragmen dipisahkan
melalui
Electrophoresis
fragmen
proses
adalah
(potongan)
DNA
selanjutnya
electrophoresis pada jel agarose.
teknik
pemisahan
molekul
dengan
mengalirkan medan listrik pada suatu media (dalam hal teknik isozymes dan teknik DNA media itu adalah jell. DNA mengandung muatan negatif dan karena akan bergerak dengan keeepatan yang berbanding lurus dengan ukuran molekulnya. Fragmen DNA yang berukuran besar akan bergerak lebih lamb at dibanding yang berukuran keeil. Fragmen-fragmen tersebut selanjutnya cUrendam dalam laru tan ethidium bromide dan divisualisasikan dengan sinar UV (ultra violet). Berikutnya fragmen DNA tersebut dipindahkan ke dalam nylon membrane dengan proses yang dikenal sebagai Southern blotting. Proses ini diuraikan dalam Gambar 8. Membrane ini
selanjutnya direndam dalam larutan yang mengandung probe radioaktif yang akan melekat pada fragmen DNA yang eoeok dengan susunan probe tersebut. Proses ini disebut sebagai proses hybridization.
Membrane hasil hibridisasi selanjutnya difoto
dengan film X-ray dan fragmen DNA yang telah diberi label radioaktif akan tervisualisasi sebagai pita-pita pendek. Ukuran panjang pita dalam unit pasangan basa dapat dihitung dengan membandingkannya
terhadap
standard.
Probe
radioaktif
selanjutnya dibersihkan dari membrane dan membrane dapat digunakan ulang beberapa kali dengan jenis probe yang lain. Polymorphism yang dihasilkan oleh penanda RFL?- bersifat codominant. Oleh sebab itu penanda RFLP banyak digunakan
Aplikasi Genetika Molekuler
22
untuk studi genetika populasi, pemetaan gen, keragaman genetik, dan kloning gen. Gambar 7. Tahapan laboratoris teknik RFLP.
Aplikasi Genetika Molekuler
23
Gan1bar 8. Prosedur Southern blotting dalam RFLP.
2.
Penanda berbasis peR
peR atau polymerase chain reaction merupakan suatu teknik yang dikembangkan oleh Kary Mullis tahun 1987, dan memenangkan
hadiah
memungkinkan
dihasilkannya
Aplikasi Genetika Molekuler
Nobel
bidang
Kimia.
berjuta-juta
copy
Teknik dari
ini
suatu
fragmen DNA tertentu. Dengan tersedianya jutaan copy membuka peluang untuk melakukan berbagai analisis genetik. Prinsip proses PCR adalah suatu siklus berjangka pendek (30-60 detik) dengan tiga perubahan suhu yang berubah secara
cepat. Ketiga tahapan suhu dan fungsinya adalah sebagai berikut:
•
denaturation (terbentuk rantai tunggal) suhu 95 QC.
•
primer annealing (penggabungan primer] suhu 55 QC
•
primer extension (pemanjangan primer] suhu' 72 QC.
Proses awal PCR adalah pemisahan rantai ganda DNA (denaturation) pada suhu 95 QC. Kemudian dilanjutkan dengan penempelan primer pada sequence yang sesuai (annealing) pada suhu 55 QC. Primer adalah molekul pendek DNA rantai tunggal sintetis yang berfungsi sebagai titik pemula terjadinya reaksi. Sepasang primer yang sequencenya telah ditentukan untuk dapat menemukan target sequence pada DNA digunakan dalam PCR. Segmen DNA diantara kedua titik pertemuan primer akan diamplifikasi dalam reaksi PCR. Primer berfungsi sebagai titik awal sintesis oleh ensim yang disebut DNA polymerase yang diperoleh dari bakteri Themus aquaticus . Ensim ini juga biasa disebut Taq DNA polymerase. Ensim ini sesuai untuk proses amplifikasi
karena dapat bertahan pada suhu tinggi hingga 95 QC, meskipun suhu optimum bagi aktivitas ensim adalah 72 QC. Setelah terjadi annealing selanjutnya dilakukan perbanyakan fragmen
DNA
melalui proses extension pada suhu 72 QC. Ilustrasi reaksi PCR sebagaimana diuraikan diatas disajikan pada Gambar-9-berikut ini.
Aplikasi Genetika Molekuler
25
Gambar 9. Ilustrasi diagramatik proses peR.
~
r.:jJ1?
Target DNA
""'ti! . ill!
!
"" il'
j
it!!
"Ill
D,"ot".'. 95'C
~~-------Ij? Single-stranded DNA
!
Denature, 95°C Primer Binding, 55 °C
\--.----=-----,,-
1~'"
Cycle 2
Extension, 72°C
\--.__-=,,bl'="""4'(l""'"
~"
1 !
Denature, 95·C Primer Binding, 55 ·C
,
Cycle 3
Extension, 72°C
" ) ",
<' '
peR products ~
)
,,,. 27 more cycles
Aplikasi Genetika Molekuler
26
Produk PCR dari individu pohon yang berbeda akan menghasilkan panjang sequence yang berbeda pula. Perbedaan ini akan dapat dideteksi dengan electrophoresis.
Untuk ukuran
panjang yang kedl (antara 1 hingga 10 bp) diperlukan media yang menghasilkan resolusi tinggi,
seperti polyacrylamide,
sedang
ukuran yang lebih besar dapat dipisahkan dengan agarose. Perlu dicatat bahwa fragmen yang mempunyai panjang basa yang sama tetapi berbeda urutannya tidak dapat dideteksi tanpa perlakuan lanjut. Cara yang dilakukan untuk mengetahui perbedaan urutan basa adalah dengan proses sequencing. Penanda berbasis PCR yang diuraikan dalam bab beriktu ini adalah RAPD, AFLP dan microsatellites.
a.
RAPD (random amplified polymorhic DNA)
RAPD adalah modifikasi dari PCR yang dikembangkan pada tahun 1990 oleh J. Williams (Williams et al. 1990). Perbedaan pokok dari PCR adalah digunakannya satu
pnmer
pendek
berukuran
panjang
10
basa
(PCR
menggunakan primer ganda berukuran panjang 20 basa). Urutan-urutan basa yang cocok dengan primer ini akan muncul disepanjang genome. Secara grafis proses RAPD ini diuraikan pada Gambar 10 berikut. Teknik RAPD akan mendeteksi DNA polymorphisme yang diakibatkan oleh tidak munculnya amplifikasi pada suatu locus. Hal ini dapat disebabkan oleh-perbedaan urutan pada titik pertemuan primer. Ini berakibat primer tidak dapat menempel pada bagian tersebut sehingga tidak
Aplikasi Genetika Molekuler
27
terjadi
amplifikasi.
Oleh
karenanya
hanya
ada
dua
kemungkinan allele pada penanda RAPD, yaitu timbulnya pita pendek sebagai hasil amplifikasi (presence), dan tidak adanya pita (absence). Penanda yang demikian ini disebut sebagai dominant marker. Pita yang berbeda ukurannya dari satu primer RAPD diasumsikan se bagai berasal dari locus RAPD yang berbeda. Secara teoritis jumlah fragmen yang diamplifikasi tergantung pada panjang primer dan ukuran dafi target genome. Pada kebanyakan tanaman primers dengan panjang antara 9-10 nucleotides dapat menghasilkan antara 2-10 produk amplifikasi.
Primer yang digunakan
umumnya
mempunyai sequence acak, terdiri dari sedikitnya 50% G dan C dan tidak mempunyai internal inverted repeats. Produk amplifikasi dapat dengan mudah dipisahkan dengan electrophoresis dan diamati dengan iluminasi UV. Polymorphism terjadi sebagai akibat dari perubahan pada titik ikatan primer/primer binding site (misalnya point mutations), atau karena perubahan pada ukuran rtarget
DNA (seperti yang terjadi pada insertions, deletions, atau invertions). RAPD mendeteksi genetic polymorphism yang
diturunkan sebagai dominant Mendelian makers. Adanya polymorphism ditunjukkan oleh munculnya band specific yang diakibatkan oleh adanya dua titik yahg bersebelahan yang merupakan inverted repeat yang mempunyai target sequence yang
cocok
dengan
sequence
oligonucleotide
primers. Apabila tidak terjadi pertemuan titik sequence
Aplikasi Genetika Molekuler
2X
seperti tersebut diatas maka band dimaksud tidak akan muneul. Teknik RAPD
tidak membutuhkan informasi awal
tentang urutan basa suatu jenis. Yang diperlukan hanyalah DNA yang relatif murni dan dalam jumlah yang relatif keeil dibandingkan RFLP. Oleh karenanya RAPD dapat diterapkan pada hampir semua jenis tanaman. Jumlah locus RAPD yang dapat dihasilkan juga tidak terbatas. Hingga kini ada lebih dari 2000 jenis primer yang tersedia seeara komersial. Teknik
ini
juga
relatif
mudah.
Sekalipun
demikian
konsistensi hasil teknik ini relatif rendah. Hal ini antara lain disebabkan karena kepekaan pola pita RAPD terhadap kondisi
rekasi,
khususnya
suhu
alat
peR
thermocycler.
Gambar 10. Proses RAPD.
. :r*-9'b~A p.~iY~~~'~
·---Prlin.e:r molekat :
.. ~ ~~J~~~~~;;~~~~1rtp.~~o~
pid:a:QNA;$"tn.mij·s,··:.;- ." .. _. ___ .~.Jl.rig,~~I. ..
Aplikasi Genetika Molekuler
29
atau
h.
AFLPs (amplified fragment length polymorphism)
Penanda DNA yang tergolong paling mutakhir adalah AFLP, yang pada dasarnya merupakan gabungan dari teknik RFLP dan teknik PCR, dikembangkan pada tahun 1995 oleh Vos et al. Teknik ini sedikit rumit karena melibatkan ensim restriksi dan amplifikasi. Gambaran teknik ini diuraikan pada Gambar 11. Tahapan prosedur AFLP secara ringkas adalah sebagai berikut:
•
reaksi dengan ensim restriksi
•
ligasi adaptor
•
amplifikasi PCR
•
electroplwresis dan analisis
Aplikasi Genetika M o l e k u l e r , ()
Gambar 11. Prosedur laboratoris teknik AFLP.
.~ i.·.· . . . . . i . . .
,"
..,
.
".
r~st.ri,C.tiO. neh~,m.,e$ (e;g., EcciRlaridMseL)
,,·t·.·Digest with 2
••••. '.,
}
-
Ligateadaptors
-
.......,...,.......
•
~ Add peR primers .;-" _ _ _ _":!'<--"!!!I
.~ ~->. _ _ _":!'<--"!!!
'-"
Aplikasi Genetika Molekuler
31
Gambar 12. Reaksi molekuler pada teknik AFLP .
.
",
..... :: .... ,".::.:;
,";.
'.. r.e~tii~ti()11 Jr~grT\el1t. ;'-'SiU'UilUllIiIiiUIiiUilliillilililliilJ«,\ t d" . b
.i . ·. . ·.i .
I . ft . •• .••••...... ................ protrudihgbases left> < '\/afte{cuibYMs6l>
p~~:~ ~~~bya~~~~
.. .
.
..... . . ....
......
........... . ., ...... . . .-.... . ............ .
-. ...
- -
:C.:" .
TGCC.TGACCGATT.'TGGCAAT:T.·dHIiI.i~ii~;~!i!dd/iidij!.i~~Oi!{(IOij:T.·.·TT.·~•A~.GTACT. . ·GG~dC.T.·CGT. \1 ;) 0 0 'l;) .LOO;).L'l'l'l;);) O.L.LV"\{ 0 '. • .' .. ... .... ........ .. .'i'l,t;);)\i .L 0 \1;);:) ;10 0 'l f);) \1 0
TGCCTGACCGATTTGGCAATTC:---""""'---=:::
.
..
"... . ..... . - . ., . .. -~. . . . .. ............... ..... ... .. ....... .
•
•••••••••••••• •••••
peR
Aplikasi Genetika Molekuler
32
Seperti
halnya
dengan
RAPD,
penanda
AFLP
menghasilkan penanda dominant. Karena sifatnya ada atau tidak
ada,
maka
semen tara
kalangan
menganggap
pemakaian kepanjangan AFLP sebagai amplified fragment length polymo1phism adalah kurang tepat. Kesamaan dengan RFLP hanyalah pada penggunaan ensim restriksi. Dibandingkan dengan RAPD, AFLP mempunyai tingkat konsistensi hasil yang jauh lebih tinggi. Hal ini antara lain diakibatkan oleh
penggunaan primer peR Yarlg lebih
panjang sehingga memungkinkan dilakukannya reaksi pada suhu lebih tinggi. c.
Microsatellites
Penanda DNA lainnya yang tergo long sangat efektif adalah microsatellites yang juga merupakan penanda berbasis peR. Penanda microsatellites juga disebut Simple Sequence Repeats (SSR) , yaitu segmen DNA yang berisi tandem repeats dari urutan basa yang sederhana, dengan
panjang basa 1 hingga 5. Segmen DNA semacam ini banyak terdapat dalam genome tanaman. Metoda ini meliputi tahap pengembangan yang terdiri dari pembuatan clone library (kumpulan klon fragmen DNA), deteksi dan isolasi klon microsatellites, sequencing klon microsatellites, dan merancang dan membuat primer microsatellites. Kemudian dilanjutkan dengan analisis peR dari individu yang akan dianalisa dengan menggunakan primer microsatellites yang telah dikembangkan. Ilustrasi
Aplikasi Genetika Molekuler
33
penanda microsatellite diuraikan dalam Gambar 13 berikut ini. Dibandingkan dengan teknik teknik lainnya, teknik ini adalah yang paling sulit dan memerlukan waktu lama dan biaya pengembangan yang cukup tinggi. Ringkasan dari kelebihan dan kekurangan penanda penanda yang telah diuraikan diatas dirangkum pada Tabel berikut ini.
Aplikasi Genetika Molekuler
34
Gambar
13.
Internal simple microsatellite.
sequence
repeats
dari
1 peR
Gambar 14. Penanda microsatelite mempunyai keragaman yang tinggi.
Tree 1
Tree 2
~GAGAGA,GAGAGA~ ~GAGAGA,GAGAGAGAGAGAGA,GA-1 ~GAGAGAGAGAGAGAGAOAOA-i '=-GAGAGAGAGAGAGAGA-1
1) peR 2) Separation by size
1 Tree 1
Tree 2
,
L..- _ _
Aplikasi Genetika Molekuler
on gel
*~._._.
___ _
Tabe13. Ringkasan karakteristik penanda-penanda genetik yang banyak digunakan dalam studi genetika.
Aolikasi Genetika Molekuler
rendah - sedang
sedang - tinggi
sedang - tinggi
sedang - tinggi
sangat tinggi
co dominant
dominant
dominant
dominant
codominant
sangat tinggi
sangattinggi
rendah - sedang
sedang - tinggi
tinggi
5 - 10 Ilg
5 - 10 ng
25ng
25 - 50 ng
sulit
mudah
agak sulit
agak sulit
sulit
mudah
mudah
mudah
1{;
Kemajuan perkembangan teknik yang dicapai dalam bidang genetika molekuler mempunyai potensi yang sangat besar dalam memajukan upaya konservasi genetik dan pemuliaan pohon. Beberapa contoh aplikasi teknik DNA akan diuraikan berikut ini. a.
Analisis keragaman genetik Memahami
keragaman
genetik
suatu
i
populasi
merupakan landasan penting dalam rangka pengelolaan sumber genetik baik untuk tujuan konservasi maupun manipulasi guna peningkatan mutu genetik. Oleh karenanya tidak mengherankan bila bidang ini meru pakan salah satu yang paling banyak memanfaatkan teknik DNA. Disamping relatif mudah, informasi yang dihasilkan dapat langsung dimanfaatkan. Penelitian mangzum
ten tang
keragaman
jenis
A.
dengan menggunakan penanda RFLP misalnya
telah dilaporkan oleh Butcher et al. bertujuan
genetik
untuk
( 1996). Penelitian ini
membandingkan
genetik populasi tegakan
benih
tingkat
Subanjeriji,
keragaman Sumatera
Selatan dengan populasi alam di Maluku, lrian Jaya, PNG dan Queensland. Hasilnya menunjukkan bahwa 56% dari tingkat keragaman yang ada di populasi alam ditemukan di populasi Subanjeriji. Sumber asal populasi Subanjeriji, yaitu populasi
Daintree
(Queensland
bagian
mempunyai keragaman genetik yang rendah.
Aplikasi Genetika Molekuler
37
selatan)
juga
Penggunaan
penanda
RAPD
untuk
penelitian
keragaman genetik empat jenis akasia, yaitu A. aulacocarpa, A. auriculiformis, A. crassicarpa, dan A. mangium juga telah
dilaporkan oleh Rimbawanto et al. (1996). Seperti halnya dengan penelitian serupa yang menggunakan penanda lain seperti isozymes (Moran et al. 1989), penanda RAPD juga menemukan bahwa tingkat keragaman genetik A. mangium adalah yang terendah dibandingkan jenis akasia lainnya. 2.
Pemetaan genetik Peta genetik dapat disamakan fungsinya dengan peta
petunjuk jalan, yaitu memberikan arah untuk menentukan penanda genetik suatu sifat pada suatu titik di sepanjang chromosome. Agar dapat dipakai sebagai penanda genetik, suatu sifat harus memenuhi dua kriteria, yaitu: i). sifat tersebut berdiferensiasi diantara induknya, dan ii). sifat tersebut secara utuh diturunkan pada keturunannya. Konsep dasar dari pemetaan genetik adalah bahwa gen gen pada suatu chromosome tidak menyusun diri secara bebas, akan tetapi saling berhubungan (linked). Sekalipun demikian pasangan allele dapat bertukar posisi. Pertukaran ini atau disebut crossing-over terjadi pada saat meiosis ketika homologous chromosome saling berpasangan, dan setelah memperbanyak diri chromatids bertukar tempat. Proses crossing over ini menghasilkan gen rekombinan (recombination of genes).
Aplikasi Genetika Molekuler
38
Tempat terjadinya crossmg-over adalah acak dan frekwensinya berhubungan langsung dengan letaknya pada chromosome.
Makin
dekat
letak
gen
makin
kedl
kemungkinan terjadinya crossing-over yang mengakibatkan terjadinya
rekombinasi
diantara
Sebaliknya
makin jauh jarak gen
gen gen
gen
tersebut.
makin
besar
kemungkinan terjadinya crossing-over. Secara diagramatis proses crossing-over ini digambarkan pada Gambar 9 beriku t ini. Frekwensi
cross-over
itu
digunakan
untuk
menentukan posisi relatif gen sepanjang chromosome. Jarak gen dalam chromosome dinyatakan sebagai map unit, dimana satu map unit setara dengan frekwensi rekombinasi sebesar 1% atau biasa disebut 1 centimorgan. Peta genetik beberapa jenis tanaman hutan dengan menggunakan
penanda
RFLP,
RAPD,
AFLP
dan
microsatellites telah dihasilkan, diantaranya jenis Pinus radiata (Devey et al. 1996), Eucalyptus globulus
(Jones et
al. 1996), dan E. grandis , E. urophylla (Grattapaglia and Sederoff 1994). 3.
Seleksi dengan penanda DNA Seleksi sifat berdasarkan phenotipa merupakan sistem
seleksi yang hingga kini masih dipraktekkan dengan hasil yang memuaskan. Kemajuan yang pesat dalam bidang genetika molekuler telah membuka peluang baru yang akan dapat
Aplikasi Genetika Molekuler
memacu
kemajuan
39
praktek
pemuliaan
pohon.
Sekalipun
demikian
ada
beberapa
alas an
yang
menyebabkan bahwa teknik molekuler tidak akan dapat menggantikan metoda konvensional tersebut, diantaranya: •
sebagian besar sifat-sifat yang bernilai ekonomi adalah sifat kuantitatif yang dipengaruhi oleh banyak locus didalam genome yang seringkali mempunyai efek yang keeil.
•
gen
tunggal
dengan
pengaruh
besar
yang
dapat
dimanipulasi seringkali mempunyai efek yang me~ugikan. Salah
satu
eara
untuk
memadukan
genetika
molekuler dengan seleksi phenotipa adalah dengan eara seleksi penanda DNA atau biasa disebut marker-assisted selection (MAS). Dasar dari MAS adalah menarik hubungan
antara
locus
tertentu
dengan
karakter
kuan titatif
berdasarkan hubungan statistik yang disebut linkage disequilibria. Salah satu kelemahan dari hubungan ini
adalah
bahwa
rekombinasi
akan
mengurangi
linkage
disequilibria dan menghilangkan efektifitas seleksi dengan locus
penanda, keeuali bila penanda tersebut terkait erat
dengan QTL (quantitative trait loci), yaitu locus yang berhubungan dengan locus kuantitatif. MAS merupakan salah satu bentuk aplikasi genetika molekuler yang paling aktif dilakukan di berbagai negara. Selain bermanfaat untuk sifat sifat kuantitatif, MAS juga sangat berguna untuk sifat kualitatif seperti resistensi terhadap hama dan penyakit dan sifat lain yang monogenic. Beberapa hasil yang telah dipublikasikan antara lain adalah:
Aplikasi Genetika Molekuler
40
QTL untuk biomas pada E. nitens (Byrne et al. 1997), QTL untuk pertumbuhan, bentuk batang dan phenologi pada poplar (Bradshaw and Stettler 1995), dan QTL untuk sifat pembiakan
vegetatif pada E. grandis
dan E. urophylla
(Grattapaglia et al. 1995). V..
RlNGKASAN
Penerapan penanda molekuler untuk mengetahui secara cepat keragaman genetik baik di dalam maupun diantara populasi telah terbukti sangat bermanfaat, khususnya dalam dua hal: •
Kegiatan konservasi gen, yang tujuannya adalah untuk menjaga keragaman plasma nutfah baik untuk sifat yang diketahui ataupun yang tidak diketahui.
•
Pengembangan populasi breeding, yang tujuan utamanya adalah menetapkan populasi dengan keragaman genetik yang luas atas sifat sifat yang bernilai ekonomis tinggi.
Untuk kedua hal diatas penggunaan penanda molekuler akan dapat mengatasi komplikasi masalah penentuan keragaman karena pengaruh lingkungan, waktu, sifat kuantitatif dU. Aplikasi
penanda
penanda
molekuler
bagi
program
konservasi genetik antara lain adalah: •
Manajemen keragaman genetik, untuk populasi alam, populasi breeding dan populasi tanaman.
•
Sistem perkawinan (mating system)
•
Gene flow/ migration
• Analisis induk (parentage analysis) •
Taxo no my/ Phylogeny
Aplikasi Genetika Molekuler
41
•
Pemetaan
genetik
(genetic
linkage
mapping/
QTL
analysis). Sedangkan jenis penanda molekuler yang dapat digunakan sesuai dengan tingkat ketelitian yang diperlukan, dapat dibagi menjadi: •
Aplikasi
yang
membutuhkan
jumlah
locus
banyak
(keragaman genetik, gene flow, QTL analysis); penanda yang paling sesuai adalah AFLP atau RFLP. •
Aplikasi yang membutuhkan tingkat pemisahan yang tinggi (analisis sistem perkawinan, analisis induk, DNA fingerprinting);
penanda yang
paling
sesual
adalah
microsatellites.
•
Aplikasi yang membutuhkan informasi sequence DNA (taxonomy/phylogeny);
penanda
adalah peR dan sequencing.
Aplikasi Genetika Molekuler
42
yang
paling
sesuai
BAHAN BACAAN Brown, A.H.D., Matheson, A.C. and Eldridge, K.C. 1975. Estimation of the mating system of Eucalyptus obliqua L'Herit by using allozyme polymorphisms. Austral.J. Bot. 23: 931-949. Brown, A.H.D., Matheson, A.C. and Eldridge, K.G. 1975. Estimation of the mating system of Eucalyptus obliqua L'Herit using allozyme polymorphisms. Aust. J. Bot. 23: 931-949. Butcher, P.A., Moran, G.F. and Perkins, H.D. 1996. Genetic resources and domestication of Acacia mangium. In. Dieters, M.J., Matheson, A.C., Nikles, D.G., Harwood, C.E. and Walker, S.M. (eds.). Tree Improvement for Sustainable Tropical Forestry. pp: 467-471. Proc. QFRI - IUFRO Conf. Caloundra, Queensland, Australia. 27 October - 1 November 1996 (Queensland Forestry Research Institute, Gympie). Cheliak, W.M. and Pitel, J. 1984. Genetic control of allozyme variants in mature tissues of white spruce trees. J. Hered. 75: 34-40. Clegg, M.T., Kahler, A.L. and Allard, R.W. 1978. Estimation of life cycle components of selection in an experimental plant population. Genetics 89: 765-792. Devey, M.E., Bell, J.C., Smith, D.N., Neale, D.B. and Moran, G.F. 1996. A genetic linlage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD, and micro satellite markers. Theor. Appl. Genet. 92: 673-679. Drlica, K. 1992. "Understanding DNA and Gene Cloning". A guide for the curious. John WHey and Sons. USA. 240p. Grattapaglia, D. and Sederoff, R. 1994. Genetic linkage maps of Eucalyptus grandis and Eucalyptus urophylla using a pseudo-testcross mapping strategy and RAPD markers. Genetics 137: 1121-1137 Hamrick , J.L. and Murawski D.A. 1990. The breeding structure of tropical tree populations. Evolution 25: 276-280. Hamrick , J.L., Linhart, Y.B. and Mitton, J.B. 1979. Relationship between life history characteristics and electrophoretically-detectable genetic variation in plants. Ann. Rev. Ecol. Syst. 10: 173-200.
Aplikasi Genetika Molekuler
43
Vallejos, E. 1983. Enzyme activity staining. In S.D. Tanksley and T.J. Orton (eds.). Isozymes in Plant Genetics and Breeding. Part A: 469-516. Vos, P., Hogers, R., Hleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Friters, A., Pot, J., Peleman, J. Kuiper, M. and Zabeau, M. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucl.Acid Res. 23: 44074414. Wendel, J.F. and Weeden, N.F. 1989. Vizualization and interpretation of plant isozymes. In D.E. Soltis and P.S. Soltis (eds.) Isozymes in Plant Biology. Disocorides Press, Portland Oregon. Pp: 5-45. Williams, J.G.K., Hanafey, M.K. and Rafalski, J. 1993. Genetic analysis using random amplified polymorphic DNA. Theor. Appl. Genet. 218: 704-742. Wickneswari, R. and Norwati, M. 1993. Genetic diversity of natural populations of Acacia auriculiformis in Australia and Papua New Guinea. Austr. J. Bot. 41: 65-77.
Aplikasi Genetika Molekuler
44
