2008, I. Literák

B5, 2007/2008, I. Literák

NOBELOVY CENY V R. 2004 LÉKAŘSTVÍ A FYZIOLOGIE R. AXEL (USA) a L. BUCK (USA): funkce čichového systému u myší cca 1000 genů (u člověka něco méně) pro vznik stejného počtu čichových receptorů tj. cca 3 % genů člověka je odpovědných za dekódování čichových vjemů čichové receptory patří do skup. RECEPTORŮ SPOJENÝCH S G-PROTEINY aktivace čichového receptoru → čichová buňka vyšle el. signál do mozku CHEMIE A. CIECHNOVER (Izrael), A HERŠKO (Izrael) a I. ROSE (USA): odbourávání proteinů v buňce (objevy z 80. let) na nepotřebný protein se umístí UBIKVITIN – molekulární značka (polibek smrti) označený protein je zlikvidován v PROTEASOMECH (molekulární jatka) proteasomy hrají klíčovou roli v regulaci buň. dějů – nefungují-li správně→ nekontrolované dělení buňky – rakovina v typické buňce až 30 tis. proteasomů

NOBELOVY CENY V R. 2005 LÉKAŘSTVÍ A FYZIOLOGIE Barry MARSHALL a Robin WARREN (Austrálie) za výzkum bakterie Helicobacter pylori, která má vliv na onemocnění žaludku (gastritis) a vznik žaludečních vředů.

NOBELOVY CENY V R. 2006 LÉKAŘSTVÍ A FYZIOLOGIE Craig MELLO a Andrew FIRE (USA) při pokusech s Caenorhabditis elegans objevili jev interference RNA siRNA (RNAi)

– objev z r. 1998 CHEMIE

Roger D. KORNBERG (USA): objasnil trojrozměrnou strukturu RNA-polymerázy z kvasinek (Pol II) „RNA polymeráza II (Pol II) je velký (550 kDa) komplex z 12 podjednotek, který je klíčový pro transkripci“

NOBELOVY CENY V R. 2007 LÉKAŘSTVÍ A FYZIOLOGIE za vývoj postupů vyvolání genetických změn v myších za použití kmenových buněk z časných embryí Mario CAPECCHI - narodil se v Itálii, dnes občan USA Martin EVANS - UK Oliver SMITHIES - narodil se v Británii, dnes občan USA cílené modifikace genů (GENE TARGETING) - Vyjmou se kmenové (nediferencované) buňky z myších zárodků. - Do získaných buněk se vloží nový gen nebo se některý gen vyřadí z činnosti. - Pak buňky přenesou do dalšího myšího zárodku. Myš, která se narodí, má genetickou změnu v některých tkáních, včetně pohlavních buněk. Díky tomu ji pak může předat svým potomkům. Další generace myší KNOCKAOUTOVANÉ MYŠI - mají genetickou změnu ve všech svých buňkách. - Vědci tak získávají linie laboratorních myší, na nichž mohou sledovat, co zásah do genů způsobil ve srovnání s běžnými hlodavci.

PAMĚŤOVÝ SYSTÉM BUŇKY BUNĚČNÁ PAMĚŤ Paměť - zaznamenání, uchování a předání informace (kniha, disketa, DNA, lidský mozek) Dědičnost = schopnost předávat soubor informací ve sledu po sobě jdoucích generací (buněk, mnohobuněčných organismů) Buněčná paměť (vnitřní paměť buňky) - zpracovává informaci pro - udržování buňky (struktura a funkce) - reprodukci - u jednobuněčných - u mnohobuněčných + informace o vývoji, funkci a chování celého jedince

NUTNÉ VLASTNOSTI BUNĚČNÉ PAMĚTI 1. velká kapacita 2. dlouhodobost 3. stabilita 4. snadná dostupnost a transformovatelnost do konkrétní vlastnosti buňky 5. zdvojitelnost (pro 2 dceřiné buňky) 6. schopnost doplňování (evoluce) TYPY - informace genová (genetická) nesená genofory hlavní médium ... NK exprese genetické informace = kódování, vyzvedávání a vyjadřování (exprimace) do konkrétních vlastností - informace negenová (epigenetická) - část vnitřní informace buňky zprostředkovaná jinak – ovlivňuje vyjádření genů (metylace DNA, modifikace histonů, sbalování chromatinu) UNIVERZÁLNOST GENETICKÉ INFORMACE každá genetická informace je zapsána v primární struktuře NK - DNA (většinou), RNA (RNA viry)

GEN MENDEL (1865) - „diskrétní elementy“ odpovědné za vytvoření znaků JOHANSSEN (1909) - gen = jednotka dědičnosti MORGAN (1911) - geny jsou lokalizovány na lokusech chromozomů BEAGLE, TATUM (1941) - jeden gen - jeden enzym WATSON, CRICK (1953) - gen je část molekuly DNA kódující jeden enzym GEN = úsek polynukleotidového řetězce obsahující genetickou informaci pro strukturu polypeptidu jako translačního produktu (gen strukturní) nebo informaci pro strukturu RNA, která nepodléhá translaci (geny pro rRNA a tRNA) GENY STRUKTURNÍ: informace o primární struktuře polypeptidu (bílkovině strukturní, enzymové, signální) - složené: z exonů (kódující sekvence genů) z intronů (nekódující sekvence genů) primární transkript podléhá posttranskripčnímu sestřihu →mRNA, která se na ribosomu „překládá“ do molekuly polypeptidu (eukaryota) -jednoduché: „přepisují“ se celé bez sestřihu (prokaryota) GENY PRO RNA: (rRNA, tRNA)

NEGENOVÁ DNA: REGULAČNÍ OBLASTI (regulační sekvence) - úseky molekuly NK, které nesou informaci pro navázání specifických proteinů např. signalizace zahájení nebo ukončení transkripce (na DNA) TRANSPOZONY, RETROELEMENTY (endogenní retroviry, SINE, LINE, u člověka 42 % DNA), REPETITIVNÍ DNA (mikrosatelity, minisatelity) prokaryonta - jen malá část DNA je negenová eukaryonta - větší část DNA je negenová (u savců 90 %)

GENOM - soubor všech molekul DNA v buňce (genová i negenová DNA) - soubor všech genů strukturních a genů pro RNA

GENOFORY: CHROMOZOMY PLAZMIDY

Ně ěkteré známé kompletní GENOMY ORGANISMUS

POČET BAZÍ (Mb)

bakteriofág ΦX174 (1977)

5386 b

POČET GENŮ

ssDNA

10

FPV (fowlpoxvirus) (2000)

0.288 dsDNA

min. 65

Haemophilus influenzae (1995)

4.6

Mycoplasma genitalium

0.58

Escherichia coli

4.6

1 743 516 2 350

13

6 420

Arabidopsis thaliana

100

25 498

Caenorhabdis elegans

100

19 099

Drosophila melanogaster

180

13 601

3 000

39 114

Saccharomyces cerevisiae

Homo sapiens

Jaké další? Myš, potkan, kur, včela, pes, kráva… (odhad NHGRI Washington)

EXPRESE GENETICKÉ INFORMACE F. CRICK:

DNA → RNA → PROTEIN

CENTRÁLNÍ DOGMA MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE 1. stupeň DNA → RNA TRANSKRIPCE - na základě komplementarity bazí vznikají RNA kopie (transkripty) - postranskripční úprava 2. stupeň RNA → PROTEIN TRANSLACE - nukleotidy → AK - postranslační úprava přesná regulace (!): kvalitativní kvantitativní časová

Od DNA k proteinu

© Espero Publishing, s.r.o.

TRANSKRIPCE transkripční jednotka = definovaný úsek DNA pro transkripci složení: - promotor - sekvence DNA (40 bp) pro navázání RNA-polymerázy (prostřednictvím proteinu sigma faktor) - sekvence strukturního genu (strukturních genů) - terminátor

1. INICIACE - po navázání RNA-polymerázy na promotor se rozvinou oba řetězce DNA - od místa startu (1. přístupného nukleotidu) na matricovém vláknu se přiřazují RNA nukleotidy, začíná syntéza RNA - po dosažení délky 9 nukleotidů se odštěpuje sigma faktor prokaryota

eukaryota

RNA-polymeráza

Bacteria - 1 typ Archea - mnoho typů

3 typy (I, II, III)

vazby RNA-polymerázy na promotor

prostá

vyžaduje transkripční faktory (regulační proteiny)

2. ELONGACE - RNA-polymeráza se posunuje podél molekuly DNA - vzniká vlákno RNA v orientaci 5´→ →3´

3. TERMINACE terminátor - sekvence DNA, po jejíž transkripci se RNA zdvojí (zdvojení je signál pro oddělení RNA polymerázy od DNA) jiná možnost terminace - vazba rho faktoru (specifický protein) na molekulu RNA REVERZNÍ TRANSKRIPCE ... RNA → DNA pomocí reverzní transkriptázy (RNA- závislé DNA-polymerázy) u retrovirů

DNA je transkribována enzymem RNA-polymerázou


Směry transkripce genů v krátkém úseku bakteriálního chromosomu


POSTTRANSKRIPČNÍ ÚPRAVA RNA (RNA processing) mRNA prokaryonti - přímo translace eukaryonti pre-mRNA (hnRNA heterologní nukleární RNA) → mRNA 1. navázání 7-metylguanozinu na 5´konec (vznik tzv. čepičky) 2. polyadenylace (připojení 100-200 adenosinnukleotidů) na 3´konec (vznik tzv. polyA přívěsku) 3. splicing ponechání exonů (kódujících sekvencí k exprimování) průměrný gen má asi 1000 nukleotidů vystřižení intronů (často delších než exony) [– ribozym endonukleáza P] důvody 1. a 2.: - ochrana před účinkem nukleáz - nutné pro rozpoznání ribozomem - umožňuje přechod z jádra do cytoplazmy

rRNA syntéza v jadérku 70-80 % RNA pre-rRNA → rRNA prokaryonta - 3 druhy rRNA (pro ribosomální podjednotky) eukaryonta - 4 druhy rRNA (pro ribosomální podjednotky)

tRNA syntéza v jadérku pre-tRNA → tRNA 1. odstranění zaváděcí sekvence 2. chemické modifikace (metylace) bazí 3. vystřižení intronů 4. přidání trojice nukleotidů CCA (u všech funkčních molekul tRNA)

TRANSLACE (proteosyntéza) = překlad z jazyka nukleotidů (4-písmenná abeceda) do jazyka AK (21-písmenná abeceda) - v cytoplazmě, - na ribosomech GENETICKÝ KÓD 1966 - Nirenberg, Khoran, Ochoa (1968 - Nobelova cena) kombinace tří nukleotidů kóduje 1 AK 64 variant (61 je využito pro AK) tripletový kód triplet nukleotidů v mRNA ... kodon (5´→ →3´) genetický kód je univerzální (stejný u všech organismů) je nepřekryvný (5´→ → 3´)

Degenerovaný genetický kód Genetický kód je degenerovaný, resp. redundantní, což znamená, že dva či více kodónů může kódovat jednu a tutéž aminokyselinu. Degenerované kodóny se obvykle liší ve své třetí pozici, viz kodóny GAA a GAG, které oba kódují glutamin. Tato degenerace genetického kódu umožňuje existenci tzv. tichých mutací. Degenerovanost genetického kódu a z ní plynoucí existence tichých mutací značně zvyšuje toleranci substitučních mutací v degenerovaných kodónech. Např. kodóny kódující alanin (GCG, GCA, GCU, GCC) mohou po libosti mutovat na své třetí pozici, aniž by došlo k záměně aminokyseliny, kterou kódují. Naproti tomu aminokyselina histidin je kódována pouze dvěma kodóny, takže bez změny aminokyseliny je pouze jedna z možných tří mutací na třetí pozici.

PROTEOSYNTETICKÝ APARÁT mRNA ribosomy - místa syntézy proteinů tRNA - řadí AK podle tripletů volné AK ATP, GTP (zdroje energie) řada enzymů a tzv. pomocných faktorů

mRNA prokaryontní - nese informaci pro několik polypeptidů (polycistronická RNA) operon = skupina genů přepisovaných do 1 molekuly RNA eukaryontní - nese informaci 1 genu

RIBOSOMY tělíska z rRNA a bílkoviny (1:1) v cytoplazmě prokaryontů i eukaryontů v matrix mitochondrií a stromatu chloroplastů - volné - vázané na membrány (ER, vnější membrána jaderného obalu) v buňce 104 - 105 ribosomů velikost ribozomů v Svedbergových sedimentačních jednotkách prokaryonta (+ mitochondrie a chloroplasty)

eukaryonta

Celý ribosom

70

80

Větší podjednotka

50

60

Menší podjednotka

30

40

4 specifická vazebná místa: - místo pro vazbu mRNA - A (aminoacyl) místo vazba tRNA s AK (aminoacyl-tRNA) - P (peptidyl) místo (vazba peptidyl-tRNA) - E (exit) místo (místo, kde t-RNA opouští ribosom) polysom - řetízek ribosomů, na nichž probíhá translace proteinů (prokaryonta i eukaryonta)

Komponenty eukaryontního ribosomu


RIBOZOMY – VELIKOST V SVEDBERGOVÝCH SEDIMENTAČNÍCH JEDNOTKÁCH S celý ribozom

LSU

rDNA

SSU

rDNA

EUKARYOTA

80

60

28

5.8

40

18

PROKARYOTA

70

50

23

5

30

16

CHLOROPLASTY

70

50

23

5

4.5 30

16

MITOCHONDRIE

60

45

16

35

12

5

Vazebná místa pro RNA na ribosomu


Polyribosom


tRNA rameno antikodonové rameno aminokyselinové vazbu tRNA a AK zajištuje specifická aminoacyl-tRNA-syntetáza 20 syntetáz pro 20 AK (21. AK selenocystein vzniká kotranslační modifikací až po navázání AK na tRNA) energie uvolněná rozštěpením této vazby se použije k tvorbě peptidové vazby nového polypeptidu Izoakceptorové t-RNA - stejná AK/jiný antikodon

PRŮBĚH TRANSLACE 1. INICIACE - připojení iniciačních faktorů na menší podjednotku ribosomu - vazba iniciační tRNA (tRNAf-met – formylmethionin -eubakterie, tRNAmet – methionin –archea, eukaryota) na menší podjednotku ribosomu - vazba mRNA na menší podjednotku ribosomu - připojení větší podjednotky ribosomu ⇒ tj. vznik translačního komplexu energie z GTP (GTP → GDP) 2. ELONGACE - na startovací kodon mRNA se váže antikodon tRNA a další tRNA (A místo → P místo → E místo, tzv. translokace) nutné elongační faktory (EF-Tu, EF-Ts, EF-G) + energie z GTP spojování AK je katalyzováno peptidyltransferázovou aktivitou 23S rRNA (RNA s enzymovou aktivitou, ribozym)

3. TERMINACE - elongace končí dosažením stop kodonu: UAA, UAG, UGA stop kodony - nejsou rozeznávány tRNA - jsou rozeznávány proteiny (uvolňovací faktory, terminační faktory), které se na tyto stop kodony váží - oddělení polypeptidu - rozpad translačního komplexu

POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE PROTEINŮ k zajištění biologické funkčnosti polypeptidů postranslační modifikace kotranslační (začínající již během translace) modifikace - deformylace (odstranění formylové skupiny z methioninu) - odštěpení AK - vyštěpení peptidů - chemické modifikace AK (metylace, fosforylace) - tvorba disulfidových můstků - připojení cukerných zbytků (glykoproteiny) - odstranění signálních sekvencí řada postranslačních modifikací se uskutečňuje specifickými enzymy (peptidázy, deformylázy, ...) tj. produkty jiných strukturních genů vznik SEK., TERC. a KVART. STRUKTURY - spontánně - asistovanou autoagregací pomocí chaperonových proteinů (chaperonů), které se vážou na některé funkční skupiny vznikajících proteinů a nedovolí vznik nežádoucích vazeb (např. Hsp heat shock protiens)

REGULACE GENOVÉ EXPRESE důvody pro regulaci genové exprese genové produkty - proteiny - jsou pro buňku potřebné: - v určité koncentraci - v určitém čase - na určitém místě A. PROKARYOTA GENY KONSTITUTIVNÍ - produkce konstitutivních (trvale potřebných) proteinů - bez regulace GENY ADAPTIVNÍ - produkce adaptivních proteinů regulace na úrovni transkripce (geny zapínány a vypínány) katabolické enzymy - indukce substrátem anabolické enzymy - represe konečným produktem operonové geny - skupina genů řízených promotorem a operátorem operátor je sekvence nukleotidů, na kterou se váže represor (protein kódovaný regulačním genem) tj. alosterický protein represor zastavuje transkripci genu, po jeho uvolnění transkripce probíhá

B. EUKARYOTA mnohem složitější regulační mechanismy na více úrovních 1. regulace na úrovni genomu - dekondenzace a kondenzace chromozomů - acetylace a deacetylace histonů - metylace a demetylace DNA (geny s metylovanými nukleotidy nejsou transkribovány) - přestavba genomu pomocí transpozonů (zkopírování určitých sekvencí a jejich včlenění do určitých lokusů, např. spuštění odlišných diferenciačních programů u kvasinek) - amplifikace určitých úseků genomu - genově specifické regulátory diferencující mezi transkripcí a replikací 2. regulace na úrovni transkripce - působení transkripčních faktorů: sekvence inr, TATA box, TFIID, TFIIB, zesilovače transkripce - enhancery tlumiče transkripce - silencery

RNA – SILENCING 90. léta shutting down genes (= SILENCERs) = tlumicí postranskripční geny (PTGS) houby, rostliny, živočichové 2001 siRNA - krátké interferující duplexy z 21-23 nukleotidů RNAi – krátký, interferující RNA duplex Princip: malé úseky RNA siRNA mohou umlčovat expresi genů (platí odhadem pro 1/3 lidských genů) = RNA interference, tj. proces sekvenčně specifického umlčování genů pomocí homologní dsRNA dsRNA vzniká přirozeně, např. při replikaci RNA virů

Funkce v buňce: evolučně starobylý obranný mechanismus proti virům a transpozonům

EFEKT: degradace mRNA, tj. ukončení genové aktivity „knockdown“ efekt obvykle: ds DNA → ss mRNA → translace

s siRNA: ds DNA → ss mRNA + komplementární siRNA s nukleázou (RISC komplex) → degradace mRNA → blokace translace

Výhledově velké terapeutické využití: ovlivnění genetických chorob, kontrola virových infekcí: Specifická dsRNA se dá se vyrobit in vitro a použít in vivo 2004 - poprvé využití v PRAXI: – spinocerebelární ataxie myší je vyvolávaná toxinem produkovaným mutovanou alelou genu SCA1, nemocná myš byla vyléčena umlčením mutovaného genu po podání specifické siRNA

RNA - SILENCING dsRNA

DICER = specifická RNA endonukleáza

siRNA

RISC (RNA induced silencing complex) = siRNA + endonukleáza RISC degraduje mRNA

3. regulace na úrovni postranskripčních modifikací - alternativní sestřih RNA (např. produkce IgM) 4. regulace na úrovni translokace - přechod mRNA z jádra do cytoplazmy

5. regulace na úrovni translace - působení iniciačních translačních faktorů 6. postranslační regulace - modulace chemické modifikace proteinů - modulace proteolýzy PROTEASOMY - komplexy proteáz, které degradují bílkoviny (s pomocí ATP jako zdroje energie) molekulární značka - rozeznávající komplex specifických enzymů připojí k bílkovině v místě lyzinu malý protein ubikvitin (terč pro proteasomy)

UBIKVITINACE proces degradace nepotřebných, nadbytečných, poškozených bílkovin v buňce princip: na bílkovinu, která má být zničena, je navázáno několik (min. 4 ) molekul UBIKVITINU a tím je cílová bílkovina předurčena k likvidaci v PROTEASOMU - probíhá aktivně (za spotřeby ATP), rychle, účinně a regulovaně UBIKVITIN je aktivován enzymem E1(UBA, ubikvitin aktivující) AKTIVOVANÝ UBIKVITIN je připojen enzymem E2 (UBC, ubikvitin konjugující) na cílovou bílkovinu enzym E3 (ubikvitin-ligáza) připojí min. další 3 ubikvitiny E1 – 1 typ ▼ ▼ E2 – 10 typů Degradace bílkoviny v PROTEAZOMU: E3 – stovky typů – - proteázy odštěpí ubikvitiny pro další použití zajišťují specifitu - proteázy štěpí bílkoviny na krátké úseky AK pro další použití

PROTEASOMY u všech organismů UBIKVITINACE jen u eukaryot

Existují další malé proteiny (např. SUMO proteiny) ovlivňující aktivitu cílových bílkovin (nezpůsobují ale degradaci), někdy soutěží o vazebná místa pro ubikvitin.

TRANSKRIPTOSOM – multienzymový komplex zajišťující transkripci

SPLICEOSOM – multienzymový komplex zajišťující posttranskripční sestřih snRNP small nuclear ribonucleoprotein particles – umožňují vystřižení intronu = ribozym - ribonukleáza P

PROCESOM – komplex v jádře zajišťující vyzrávání rRNA

Geny mohou být exprimovány s různou účinností


Bakteriální a eukaryontní gen


Struktura dvou lidských genů ukazující uspořádání exonů a intronů


Alternativní sestřih α-tropomyosinového genu u krys


Souhrn procesů vedoucích od genu k proteinu


2008, I. Literák

Recommend Documents