1 ÚVOD Pšenice (Triticum L.) je jedna z nejstarších kulturních plodin na světě. Byla pěstována již 8000 let př. n. l. V dnešní době patří spolu s rýží a kukuřicí mezi hlavní druhy zajišťující výživu na celém světě. Její zrno má bohaté využití. Největší využití nachází zrno pšenice v průmyslu mlýnskopekárenském, a proto jsou největší požadavky kladeny právě na pekárenskou a pečivárenskou kvalitu. Technologická jakost zrna pšenice je podmíněna zejména složením bílkovinných frakcí zrna a jejich kvalitou. Nejdůležitějšími proteiny, co se týče technologické kvality, jsou zásobní bílkoviny zrna gliadiny a gluteniny, které ovlivňují vlastnosti lepku. Ten má u pšenice, v porovnání s jinými obilninami, výjimečné vlastnosti a to tažnost, pružnost a bobtnavost. Díky tomu, že odrůdy pšenice jsou reprezentovány různými variantami bílkovin, lze tyto bílkoviny využít jako biochemické markery. Nejvýhodnější je využít evolučně nejmladší bílkoviny a to jsou právě zásobní bílkoviny pšenice. Elektroforetickou analýzou gliadinových a gluteninových bílkovin lze odhadnout fenotypové projevy jednotlivých alel gliadinových a gluteninových genů. Pomocí elektroforézy lze tedy odhadnout pekařskou jakost pšenice. Další využití nachází elektroforetická separace bílkovin ve šlechtění, odrůdovém zkušebnictví, v semenářství a v mnoha dalších oborech. Předmětem bakalářské práce bylo zpracování literárního přehledu na téma využití zásobních bílkovin obilky pšenice pro predikci technologické kvality pšenice.
7
2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Pšenice Pšenice obecná je jednou z nejrozšířenějších plodin na světě, ale i u nás. V našich podmínkách je nejvýznamnější a nejrozšířenější obilninou. Zaujímá téměř čtvrtinu orné půdy a polovinu ploch obilnin. Od počátku padesátých let se začala významněji rozšiřovat i do vyšších poloh, kde nahrazuje stále snižované plochy ovsa a žita. Jako nejdůležitější chlebová plodina představuje základní zdroj lidské výživy. Zrno je využíváno k výrobě chleba, pečiva, těstovin, krup a v cukrářství. Pšeničné šroty a otruby jsou významným krmivem pro všechny druhy hospodářských zvířat. Zvyšuje se i význam průmyslového zpracování zrna na škrob a líh.
2.1.1 Charakteristika plodiny Pšenice je jednou z nejstarších kulturních plodin. Začátky jejího pěstování jsou spojeny se vznikem zemědělství. Archeologické nálezy dokládají pěstování pšenice již od 8. tisíciletí př. n. l., a to v oblasti tzv. úrodného půlměsíce. Nejstarší nálezy pšenic jednozrnky (Triticum monococcum) a dvouzrnky (Triticum dicoccum) byly zjištěny na lokalitě Jericho 8000 př. n. l. Doklady o pěstování pšenice obecné (Triticum aestivum L.) pochází z doby kolem 6000 př. n. l. ( Foltýn et al., 1970).
Pšenici lze dělit podle počtu chromozomů do tří skupin: 1. diploidní pšenice se 14 chromozomy (2n=14), 2. tetraploidní pšenice s 28 chromozomy (2n=28), 3. hexaploidní pšenice se 42 chromozomy (2n=42).
Z hospodářského hlediska má největší význam Triticum aestivum a Triticum durum. Triticum aestivum má asi 270 poddruhů s velkým množstvím geneticky odlišných kultivarů.
8
2.1.2 Vývoj rodu Triticum L. Ve vývoji druhů hraje významnou roli polyploidie. Tímto pojmem se rozumí zvýšení počtu chromozomů v somatických buňkách nad diploidní počet, což je u mnohých kulturních rostlin jeden z nejdůležitějších zdrojů genetické proměnlivosti v evolučním procesu a je hojně využíván také při šlechtění. Ke vzniku polyploidů lze dojít indukovaně v laboratoři pomocí nízkých a vysokých teplot, mechanického poškození pletiva, chemických látek nebo různých typů záření, ale i samovolně v přírodě. Dle Bednáře (1998), se právě spontání polyploidi ve zvýšené míře nacházejí ve velkých nadmořských výškách, v severnějších zeměpisných šířkách a ve vzdálenějších oblastech od základního centra vývoje druhu. Základní chromozomové číslo „x“, které udává haploidní počet chromozomů, je u pšenice 7 (Bednář a Vyhnánek, 2004). Diploidní kulturní druh pšenice jednozrnka T. monococcum s pluchatými obilkami se vyvinula z planého druhu T. boeoticum od něhož se odvozuje genom A. Genom B vychází ze samovolného křížení jedinců příbuzného rodu Aegilops (2n=14). Pravděpodobně to byly druhy Aegilops speltoides a Aegilops bicornis. Následným zdvojením počtu chromozomů vznikla alotetraploidní planá dvouzrnka T. dicoccoides (2n=28, genom AABB) (Hraška et al., 1989). Dalším vývojem se postupně z plané formy vyvinula forma kulturní T. dicoccum, od níž se odvozují dnešní tetraploidní pšenice (T. durum , T. turgidum, T. polonicum). Vývoj se však nezastavil u tetraploidních forem a vyvinuly se i formy hexaploidní. Ty vznikly pravděpodobně zkřížením dvouzrnky s druhem Aegilops squarrosa (syn. Aegilops tauschii) , ten byl donorem geonomu D. Tím vzniklo alohexaploidní
Triticum aestivum ssp. spelta
a ssp. macha (2=42, genom
AABBDD). Dalším vývojem potom vznikla i dnešní měkká pšenice T.
aestivum, ssp.
vulgare. Goncharov (2002) uvádí odlišný původ geonomu A hexaploidních pšenic.
9
Schéma vývoje hexaploidních druhů pšenice (Hraška et al., 1989) je uvedeno níže.
Triticum boeoticum Triticum monococcum genom AA 2n = 14
Aegilops bicornis Aegilops speltoides genom BB 2n = 14
X
Triticum dicoccoides genom AABB 2n = 28
Triticum dicoccum genom AABB 2n = 28
T. durum T. turgidum T. polonicum T. persicum
X
Aegilops squarrosa genom DD 2n = 14
T. aestivum, ssp. spelta T. aestivum, ssp. macha genom AABBDD 2n = 42
mutace přírodní výběr
Triticum aestivum, ssp. vulgare genom AABBDD 2n = 42
Ke vzniku pšenice obecné (T. aestivum, ssp. vulgare ) došlo spojením geonomů A, B a D. Existuje i jiný stupeň příbuznosti mezi chromozomy jednotlivých genomů, který se projevuje určitou mírou homologie mezi chromozomy. Tyto se označují jako homeologní. U pšenice obecné se tedy nachází 7 homeologních skupin, z nichž každá má jeden pár chromozomů genomu A, jeden pár genomu B a jeden genomu C (Bednář, 1998):
10
1.homologická skupina – I., XIV., XVII. 2.homologická skupina – II., XIII., XX. 3.homologická skupina – III., XII., XVI. 4.homologická skupina – IV., VIII., XV. 5.homologická skupina – V., IX., XVIII. 6.homologická skupina – VI., X., XIX. 7.homologická skupina – VII., XI., XXI.
Druhy rodu Triticum se mohou křížit s rody: Secale, Aegilops, Agropyron, Haynaldia a Hordeum. Všech 6 rodů má základní počet chromozomů n=7 (Hraška et al., 1989). Rozdělení pšenic podle počtu chromozomů ukazuje tabulka 1.
2.1.3 Základní popis druhů Jednotlivé druhy rodu Triticum se výrazně liší, např. morfotypem klasu, pluchatostí obilky apod. Charakteristiku jednotlivých druhů uvádí Petr et al. (1997):
Skupina diploidní 1. Pšenice planá jednozrnka Triticum boeoticum: Klas je úzký, plochý a ve zralosti je rozpadavý. Klásky jsou dvoukvěté, ale pouze spodní je plodný, horní zřídka. 2. Pšenice kulturní jednozrnka Triticum monococcum: Klas je poměrně úzký a ve zralosti je rozpadavý. Klásky jsou dvoukvěté, ale obvykle dozrává jedna obilka, která je úzká a sklovitá. Pravděpodobně vznikla jako mutace z plané jednozrnky.
Skupina tetraploidní 3. Pšenice planá dvouzrnka Triticum dicoccoides: Klas je dlouze osinatý. Ve zralosti je rozpadavý a lámavý. Klásky jsou 2-3 květé. Dozrávají pouze dvě okoralé, pluchaté obilky. Existuje ozimá i jarní forma. 4. Pšenice dvouzrnka Triticum dicoccum: Klasy jsou husté a při mlácení rozpadavé. Klásky jsou dvoukvěté, osinaté i bezosinné. Obilky jsou úzké a pluchaté. Většinou se jedná o jarní formu.
11
5. Pšenice tvrdá Triticum durum: Klas je již nelámavý a dlouze osinatý. Každá osina je většinou delší než klas. Plevy jsou téměř stejně dlouhé jako pluchy. Obilky jsou sklovité, neoblé ale trojhranné s vpadlým klíčkem. Vyznačuje se lepkem vhodným pro výrobu těstovin. 6. Pšenice polská Triticum polonium: Klas je nelámavý a velmi dlouhý až 15 cm. Je krátce osinatý. Plevy jsou dlouhé a stejně dlouhé jako pluchy. Obilka je nahá a velmi dlouhá.
Skupina hexaploidní 7. Pšenice špalda Triticum spelta L. : Klas je při výmlatu lámavý, dlouhý a velmi řídký. Klásky jsou spojeny s články klasového vřetene. Mají čtyři kvítky, ale jen dvě obilky, které jsou pevně uzavřeny v pluchách. 8. Pšenice setá Triticum aestivum L., syn. T. sativum, T. vulgare: Klas je nelámavý, osinatý i bezosinný a různě hustý. Plevy a pluchy jsou vejčité, nebo podlouhle vejčitý kýl. Obilky jsou nahé, buclaté a na průřezu oblé. Jedná se o nejvíce pěstovaný druh ve světě (přes 90%).
Morfotypy jednotlivých druhů pšenic jsou zobrazeny na obrázku 1.
2.1.4 Jakost pšenice Vyjádření jakosti odrůd jednotlivých plodin vychází z obecně akceptovaných ukazatelů, které jsou geneticky podmíněny. Jakost konkrétní odrůdy však může být významně ovlivněna ročníkem, lokalitou, úrovní hnojení dusíkem, výskytem chorob a poléháním (www.ukzuz.cz). Pšenice vhodné pro pekařské zpracování (převážně pro výrobu kynutých těst) jsou členěny dle jakosti na skupiny: - Elitní pšenice (E) – dříve označované jako velmi dobré, zlepšující. - Kvalitní pšenice (A) – dříve označované jako dobré, samostatně zpracovatelné. - Chlebová pšenice (B) – dříve označované jako doplňkové, zpracovatelné ve směsi. - Nevhodné pšenice (C) – odrůdy nevhodné pro výrobu kynutých těst.
12
Systém pro hodnocení pekařské kvality zahrnuje přímá i nepřímá hodnocení, které jsou dle významu rozdělena na hlavní (mající vliv na zařazení odrůdy do jakostní kategorie) a doplňková (sloužící k další specifikaci jakosti odrůdy): Hlavní kritéria: 1. Rapid Mix Test (objemová výtěžnost) 2. Obsah hrubých bílkovin (N x 5,7) 3. Sedimentační test (Zelenyho test) 4. Číslo poklesu 5. Objemová hmotnost 6. Vaznost mouky
Doplňková kritéria: 1. Obsah mokrého lepku, koreluje s bobtnáním lepku 2. Farinografické údaje (vývin, stabilita a stupeň změknutí těsta) 3. Obsah popele v zrně pšenice 4. Tvrdost zrna 5. Hmotnost tisíce zrn 6. Výtěžnost mouky T-550
Dle dalšího způsobu využití lze začlenit odrůdy pšenice do těchto čtyř kategorií: – pšenice pečivárenské (pro výrobu oplatků, sušenek a krakerů) – pšenice pro výrobu těstovin (pšenice tvrdá) – pšenice pro speciální použití (výroba škrobu a líhu) – krmné pšenice
Požadavky pro jakost, dodávání a kontrolu pšenice stanovují normy: ČSN 46 1200 – 2, ČSN 46 1100 – 2.
13
2.2 Bílkoviny pšenice
2.2.1 Polymorfizmus bílkovin a jeho využití k markerování Organismy jsou reprezentovány různými variantami bílkovin. Dle Bednáře (1998) je polymorfizmus bílkovin označení pro výskyt dvou nebo více typů bílkovinné molekuly u různých jedinců téhož druhu, v různých orgánech téhož jedince nebo v různých částech stejné buňky se stejnou funkcí. Tento jev bílkovinného polymorfizmu je předpokladem využití bílkovin jako genetických markerů. Genetické mechanismy vzniku tohoto polymorfizmu jsou genové mutace, zejména pak duplikace bílkovinných genů a nerovnoměrný crossingover těchto genů. V genomové analýze je důležitý výběr bílkoviny. Pro genetické markerování jsou výhodné evolučně mladší bílkoviny, specifické pro nižší taxon než je druh. Přednosti geneticky polymorfních bílkovin definoval Bednář (1998): •
Představují prvotní genové produkty a vyznačují se nižší fenotypovou, epigenetickou variabilitou.
•
Vyjadřují specifičnost genotypu v důsledku vazby bílkovinných a dalších genů, podmiňující celkový genotyp.
•
Vyznačují se kodominantní dědičností, v případě enzymů někdy i tvorbou hybridních bílkovin, což obojí umožňuje rozlišení homozygotů a heterozygotů.
•
Bílkovinné geny se často dědí vázány do bloků bílkovinných genů (klasterů), ve kterých prakticky nedochází ke crossing-overům a rekombinacím.
•
Vysoký alelomorfizmus klasterů umožňuje markerovat variabilitu hospodářsky významných vlastností.
•
Klastery jsou polymorfní v důsledku odlišné struktury jednotlivých cistronů a v důsledku odlišného počtu alel. Spolupůsobením odlišného počtu alel a odlišné alelické proměnlivosti je podmíněna vysoká úroveň polymorfizmu klasterů.
2.2.2 Rozdělení bílkovin pšenice Osborn (1907) bílkoviny pšeničné obilky dělí do čtyř tříd podle rozpustnosti: •
albuminy – rozpustné ve vodě
•
globuliny – rozpustné v solích neutrálních kyselin
•
gliadiny – rozpustné v 60 – 80 % etanolu
•
gluteniny – rozpustné v roztocích slabých kyselin a zásad 14
Dále můžeme rozdělit bílkoviny endospermu z funkčního hlediska (Bednář a Vyhnánek, 2004): •
metabolické – enzymatické bílkoviny účastnící se metabolických procesů
•
zásobní – bílkoviny tvořící pool aminokyselin pro syntézu nových bílkovin v procesu klíčení
•
strukturní – bílkoviny, které spolu s polysacharidy a lipidy vytvářejí buněčné membrány endospermu.
2.2.3 Zásobní bílkoviny Velkou skupinou bílkovin využívaných jako genetické markery jsou zásobní proteiny. U pšenice se nejvíce využívají dvě frakce: gliadiny a gluteniny (Černý a Šašek, 1998). Právě tyto dvě frakce jsou základní stavební jednotkou lepku, který je ukazatelem vhodnosti pšenice k pekařskému zpracování.
2.2.3.1 Gliadiny Gliadinové proteiny mají relativní molekulovou hmotnost 30 až více než 100 kDa, ale obvykle se pohybuje mezi 60 – 80 kDa. Obsahují velké množství glutaminu (36 – 45 %), prolinu (14 – 30 %) a poněkud méně kyseliny asparagové a glutamové. Dále obsahují neobvykle málo bazických aminokyselin argininu, lyzinu a histidinu. To souvisí s malou rozpustností gliadinů (Velíšek, 1999). Gliadinovou molekulu tvoří jeden polypeptidický řetězec, kde se střídají relativně přímé úseky o vysokém obsahu obsahu aminokyselin prolinu (15 – 30 %) a kyseliny glutamové (38 – 45 %) s krátkými spirálami (α- helix), které tvoří přibližně 20 % celkové struktury a do jejichž vnitřní strany jsou obráceny hydrofobní zbytky. Woychik et al. (1961) pomocí škrobové analýzy gliadinů v pufru mléčnanu hlinitého odlišily 4 podjednotky – α-, β-, γ- a ω- gliadiny. Pro ω- gliadiny je charakteristický vysoký obsah fenylalaninu. Všechny gliadiny mají velmi nízký obsah lyzinu, který je limitující esenciální aminokyselinou z nutričního hlediska. Také mají nízký obsah histidinu a argininu a spolu s nízkými hladinami volných karboxylových kyselin řadí gliadiny mezi nejméně elektricky nabité známé bílkoviny (Černý a Šašek, 1996). Gliadinové bílkoviny lze použít pro rychlou identifikaci odrůd pšenice ve vzorku semen, a to pomocí elektroforetické analýzy.
15
Genetická determinace gliadinů Významným poznatkem studia zásobních bílkovin zrna bylo zjištění že gliadiny, mohou být vhodnými markery hospodářsky významných vlastností pšenice. K dělení gliadinů se využívá elektrického náboje gliadinových molekul. Bílkovinné molekuly jsou v elektrickém poli různě pohyblivé a jednorozměrnou elektroforézou lze zjistit 30 i více gliadinových složek. Wrigley (1972) pomocí dvourozměrné elektroforetické separace odhadl počet gliadinových složek na 40 až 50. Žádná pšenice neobsahuje úplný soubor všech gliadinových složek. Kromě polymorfizmu gliadinů uvnitř druhu pšenice obecné existuje i vnitroodrůdový polymorfizmus . Dle vnitroodrůdového polymorfizmu se odrůdy pšenice dělí na homogenní odrůdy typu linie a heterogenní odrůdy, které mají charakter populací. Pomocí monosomatické analýzy bylo zjištěno, že poměrně vysoký počet gliadinových genů řídících biosyntézu gliadinů, je lokalizováno v chromozomech 1A, 1B, 1D, 6A, 6B a 6D (Sozinov a Poperelja, 1979). Bylo zjištěno kodominantní dědění několika gliadinových složek. Skupina společně vázaných a děděných složek se označuje jako gliadinový blok (klaster). Mezi složkami obvykle nedochází k rekombinacím a proto klaster vystupuje jako fenotypová mendelistická jednotka. Vzhledem ke kodominantnímu způsobu dědičnosti klasterů je možné rozlišit, zda jednotlivé rostliny v generaci F2 či jednotlivá potomstva následujících
generací
jsou
ve zmíněných
gliadinových
blocích
homozygotní
či
heterozygotní. Jednotlivé gliadinové bloky označujeme symbolem Gld (syn. Gli), potom následuje číslice a písmeno, které určují chromozom obsahující geny podmiňující syntézu gliadinových složek bloku. Konečná číslice uvedená za genovým znakem A, B a D představuje pořadové číslo alelického gliadinového bloku v rámci alelické série daného bloku. Klasifikace gliadinových bloků umožňuje zapsat elektroforeogram gliadinového spektra v podobě genotypového vzorce (Černý a Šašek, 1996). Nejvýznamnější vlastností gliadinových bloků je, že se nacházejí ve vazbě s některými geny podmiňující hospodářsky významné vlastnosti, jako je např. jakost mouky.
2.2.3.2 Gluteniny Gluteniny, které tvoří až 40 % z celkového obsahu bílkovin zrna pšenice, jsou vysokomolekulární zásobní bílkoviny. Jsou rozpustné jen ve slabých roztocích kyselin a zásad. Obrovské molekuly gluteninových agregátů mohou být štěpeny na podjednotky účinkem činidel štěpících disulfidické vazby, jako např. 2-merkaptoethanol, za současného
16
působení aniontového detergentu dodecylsulfátu sodného (SDS), a tyto podjednotky mohou být děleny pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS (Hamauzu et al., 1972). Tímto způsobem získáme dvanáct podjednotek gluteninů, které jsou podle konvence rozděleny do tří skupin (Payne et al., 1982): A – molekulová hmotnost 130 000, 127 000, 106 000 a 95 000Da, B – molekulová hmotnost 51 000, 46 800, 43 900, 42 000Da, C – molekulová hmotnost 35 000, 34 500, 33 000, 31 500Da.
Velká molekulová hmotnost podjednotek skupiny A zapříčiňuje ,že jejich elektroforetická pohyblivost je menší než pohyblivost ostatních endospermálních proteinů. Proto jsou mnohem lépe prostudovány než podjednotky skupin B a C. Získání čistých gluteninových preparátů, neobsahující svou elektroforetickou mobilitou interferující proteiny, je gelovou filtrací velice náročné. Z toho důvodu nebyly provedeny rozsáhlé screeningové studie lehčích podjednotek gluteninů. Při chemickém rozboru nalézáme v gluteninech velké množství kyseliny glutamové. Obsah gluteninu v povrchových částech zrna činí 0,96 % sušiny nebo 27,1 % z celkového obsahu. Obsah dusíku v pšeničném gluteninu je 17,89 % a je blízký obsahu dusíku v gliadinu (Hampl et al., 1965).
Genetická determinace gluteninů Geny, které řídí syntézu gluteninů s vysokou molekulovou hmotností se nacházejí na chromozomech 1A, 1B a 1D. Ty rozdělil Černý a Šašek (1996) do tří vazbových skupin. Chromozom 1B řídí syntézu celkem 12 odlišných podjednotek, zón spektra A gluteninů. Zóny B1 až B6 se vyznačují pomalou mobilitou a molekulovou hmotností v rozpětí 102 až 92kDa, naopak B7 až B12 jsou rychle migrující a mají molekulovou hmotnost v rozpětí 91 až 84 kDa. Chromozom 1D podmiňuje celkem šest různých zón gluteninového spektra. D1 až D3 jsou pomalá spektra a jejich molekulová hmotnost kolísá od 108 do 106 kDa. Zóny D4 až D6 jsou opět rychle migrující s molekulovou hmotností od 84 do 78 kDa. Geny chromozomu 1A je determinován vznik celkem pěti zón. Dvou slabších s molekulovou hmotností od 103 do 100 kDa a A1 až A3 s molekulovou hmotností kolísající mezi 114 a 105,5 kDa. Společná
manifestace
gluteninových
alelických
podskupin
v podobě
bloků
gluteninových zón, podmíněná vazbou odpovídajících gluteninových genů, je analogická jevu gliadinových bloků (Sozinov a Poperejla, 1979).
17
Symbolika užívaná k označení gluteninových lokusů, genů a jejich alelických forem není dosud ustálená. Vejl (1998) používá k označení lokusu Glu, po kterém následuje označení chromozomu a arabskou číslicí označení daného lokusu. Dále je využíváno označení Glt, za ním název příslušného chromozomu, po kterém následuje římská číslice, která označuje daný lokus. Pro šlechtění odrůd pšenice s vysokou pekařskou jakostí jsou významné poznatky o využití specifických gluteninových podjednotek jako selekčních kritérií pekařské jakosti. Výskyt určitých gluteninových genů a jim odpovídajících gluteninových podjednotek s VMH na elektroforetickém spektru je korelován s vyšší či nižší pekařskou jakostí (Černý et al., 1992).
2.2.4 Lepek Tvorba lepku je nejvýznamnější vlastností pšeničných bílkovin a jeho význam pro pekařskou technologii spočívá v tom, že napomáhá vytvářet z těsta tenké blanky, které zadržují kvasný plyn, umožňují nakynutí těsta, jeho propečení a pórovitou strukturu pekařského výrobku. Říkáme, že lepek tvoří kostru těsta a pečiva (Dudáš a Pelikán, 1987). Podstatnou část lepku tvoří zásobní bílkoviny, proto se gliadin a glutenin označují jako lepkové bílkoviny, přičemž gliadin je považován za nositele tažnosti, kdežto glutenin pružnosti a bobtnavosti lepku. Vzájemný poměr gliadinu a gluteninu (zhruba 3 : 2) není však jediným faktorem rozhodující o jakosti. Velmi důležitý je chemický charakter stavby lepkové makromolekuly, prostorové uspořádání řetězců a jejich vzájemné propojení vodíkovými a disulfidickými vazbami (Ingr et al., 1993). Dědivost objemu lepku se odhaduje na 60 – 90 %, dědivost pružnosti lepku na 70 – 74 %, dědivost množství lepku na pouhých 24 – 44 %, avšak dědivost celkové jakosti lepku na 66 – 72 % (Lelley, 1976).
2.2.4 Metody elektroforetické separace bílkovin Nejrozšířenější a běžně používanými technikami separace bílkovin a izoenzymů jsou elektroforetické metody, které jsou založeny na principu různě rychlého pohybu nabitých makromolekul v elektrickém poli. Náboj makromolekuly určuje pH prostředí, ve kterém dělení probíhá. Obecně mohou nabývat bílkoviny, jejichž stavebními jednotkami jsou aminokyseliny obsahující disociovatelné funkční skupiny COO- a NH3+, v závislosti od pH
18
prostředí různě velký kladný či záporný náboj a podle něj se poté v elektrickém poli různě rychle pohybovat (Bednář, 1998). Elektromigrační techniky se dají rozdělit podle různých kritérií (účel, experimentální uspořádání, prostředí apod.). Běžně se rozlišují na tři základní typy (Vyhnánek, 2001): 1. metody pohyblivého rozhraní – provádí se v prostředí volného elektrolytu. Roztok vzorku je umístěn v trubici (kapiláře) mezi elektrodové pufry. V elektrickém poli složky začnou migrovat k příslušným elektrodám, avšak dokonalé separace není dosaženo. V čistém stavu je získán pouze nejpohyblivější kation a anion, proto je tato technika používána jen zřídka, a to pro měření pohyblivosti.
2. Zónová elektroforéza – zde je vzorek nadávkován jako úzká zóna, ze které se po aplikaci elektrického pole vydělí zóny jednotlivých komponent. Pro zajištění stability takto vzniklých zón existuje několik způsobů, nejčastěji práce ve stabilním prostředí (gelu), kde se rovněž může uplatňovat síťový efekt (Gaál et al., 1980).
3. Metoda ustáleného stavu – po jehož dosažení se šířka zón již nemění. Patří sem dvě techniky, a to izoelektrická fokusace a izotachoforéza. Ustálený stav u izoelektrické fokusace znamená zaostření do oblasti s určitou hodnotou pH. U izotachoforézy to znamená migraci všech zón stejnou rychlostí mezi vedoucím a koncovým elektrolytem.
Dále můžeme elektroforézy rozdělit podle (Bednář et al., 2002): a) dimenzí – jednorozměrná (1D), dvourozměrná (2D); b) uspořádání aparatury – vertikální, horizontální, disková, desková; c) použitého nosiče – nosičem může být papír, acetylcelulóza, škrobový gel, agar, agaroza, polyakrylamid. Nosič musí splňovat několik základních požadavků: inertnost, reprodukovatelnost přípravy, stabilitu během elektroforézy, barvení a fixace, mechanickou odolnost; d) prostředí – kontinuální – stejná koncentrace nosiče v gelu, diskontinuální – gel je rozdělen na zaostřovací gel o nižší koncentraci a vlastní dělící gel o vyšší koncentraci nosiče.
19
K manifestaci signálních gliadinových genů se většinou používají dva postupy elektroforetické separace gliadinů, a to oficiální metodika ISTA (1984) dělení gliadinů na polyakrylamidovém gelu (PAGE) a postup separace gliadinů ve škrobovém gelu (SGE) (Šašek et al., 1989).
2.2.5.1 Porovnání elektroforetické metody PAGE podle ISTA s metodou SGE Metodika ISTA, tj. PAGE má oficiální charakter a je respektována členskými zeměmi této mezinárodní organizace semenářské kontroly. Její výhodou je používání polyakrylamidu jako nosného média, které svou homogenitou zaručuje vysokou opakovatelnost výsledků separace. Nevýhodou této metody je dosud absence genetické interpretace získaných gliadinových elektroforetických spekter. Postup podle ISTA neumožňuje zatím detekci gliadinových genů, alel, markerujících jak jednotlivé vázané znaky, vlastnosti, tak celkovou strukturu odrůdy, či nového šlechtění. Naopak genetická interpretace gliadinových spekter je předností separace gliadinů na škrobovém gelu. Určitým nedostatkem metody škrobové elektroforézy gliadinů je nižší homogenita jednotlivých šarží škrobu, používaného k separaci (Černý a Šašek, 1998). Šašek a Černý (1995) posuzovali citlivost obou porovnávaných postupů separace gliadinů podle stupně gliadinového polymorfizmu u identického souboru odrůd pšenice obecné. Došli k závěru, že obě metody vykazují stejnou citlivost postižení gliadinového polymorfizmu. Zásadní rozdíl mezi oběma postupy elektroforézy gliadinů nespočívá v jejich citlivosti, schopnosti rozpoznávat vnitrodruhový gliadinový polymorfizmus, ale v možnosti genetické interpretace získaných elektroforetických spekter gliadinů.
2.2.5.2 Vyhodnocování elektroforeogramů Vyhodnocení elektroforeogramu provádíme na úrovni kvalitativní a kvantitativní. Kvalitativní hodnocení zahrnuje vyjádření pohyblivosti jednotlivých složek bílkovinného systému. Ukázkový elektroforeogram je na obrázku 2. Kvantitativní hodnocení představuje vyhodnocení intenzity zabarvení jednotlivých složek bílkovinného systému. Používá se bodová stupnice od 1 do 5, kde 1 představuje nejnižší intenzitu a 5 nejvyšší intenzitu (Bednář et al., 2002).
20
Nejpoužívanější metodou je vyhodnocení relativní pohyblivosti Rp. Také se v literatuře můžeme setkat s názvem REM (relativní elektroforetická mobilita). Tu vypočteme podle vzorce:
vzdálenost středu pruhu od startu elektroforézy (mm) REM =
---------------------------------------------------------------------------- X 100 vzdálenost start až cíl elektroforézy (mm)
Takto vypočtená pohyblivost se dá znázornit graficky, buďto ručně, nebo s použitím programu. Takovým programem je např. ŽIŽALA, jehož použití prezentují Vyhnánek a Nesvadba (1998). Pro výpočet podobnosti spekter lze využít index identity – ii (Vyhnánek et al., 1998), nebo Jaccardův koeficient (Hadačová et al., 1980).
100 x C ii = ----------------A+B–C
A – počet pruhů genotypu A, B - počet pruhů genotypu B, C – počet pruhů genotypu C. Nově se využívá počítačových programů analýzy obrazu. Programy mohou být různé např. GelManager for Windows (Čurn et al., 1995) nebo BIO-1D software (Vilber Lourmat), ale vlastní postup analýzy je podobný.
2.2.5.3 Genetická interpretace elektroforeogramů Při genetické interpretaci elektroforeogramů se u gliadinů využívá grafického znázornění jednotlivých gliadinových bloků dle Metakovskeho (1991) (obr. 3). U gluteninů se využívá grafické znázornění podle Payne a Lawrence (1983) (obr. 4).
2.3 Predikce technologické jakosti pšenic Předpokladem využití gliadinových a gluteninových genů jako markerů pekařské jakosti v konstrukci odrůd pšenic s vyšší pekařskou jakostí je prokázání významných korelací
21
mezi zastoupením gliadinových a gluteninových genů a skutečnou jakostí, vyjádřenou výsledkem Rapid Mix Testu, případně Zelenyho testem (Černý a Šašek, 1996).
2.3.1 Technologická jakost pšenice Pšenice
se
jako
průmyslová
surovina
hodnotí
podle
chování
v průběhu
technologického procesu a podle jakostí finálních výrobků. Pojem jakost je dosti široký a rozumíme jím souhrn komplexních znaků a vlastností, které by měly uspokojovat stanovené nebo předpokládané potřeby spotřebitelů. Je tedy souhrnem všech charakteristik produktu, ale v praxi se užívá pouze některých charakteristik důležitých jen pro dané použití. Podle způsobu použití pšenice se liší i parametry hodnocení kvality: 1. Pro pekárenské zpracování, tj. převážně pro výrobu kynutých těst. 2. Pro pečivárenské účely – zvláštní jakostní požadavky k výrobě keksů, sušenek, oplatek, pizzy a dalšího jemného pečiva. 3. Pro výrobu těstovin – převážně odrůdy pšenice tvrdé (Triticum durum L.) k výrobě makaronů, špaget a dalších těstovin, speciálně mleté na mouku semolinu. Požaduje se vysoký obsah tažného, ale tuhého lepku. 4. Pro výrobu škrobu a lihu – obilky by měly obsahovat vyšší podíl zkvasitelných cukrů, vznikajících ze škrobu, kterého by mělo být více než 65 % v sušině. 5. Pro krmení – tvoří největší podíl využití pšenice. Tyto nepotravinářské odrůdy by měly obsahovat hodně bílkovin (zejména albuminu a globulinu, protože gliadiny a gluteniny jsou ve vodě nerozpustné a monogastrická zvířata je nevyužívají), vyšší obsah esenciálních aminokyselin (lyzinu, kterého obsahují více albuminy a globuliny), vitaminů a minerálních látek (Chloupek, 2000). Nejdůležitější požadavky u pšenice jsou z hlediska pekárenského průmyslu a proto pod pojmem jakost rozumíme především její pekařskou hodnotu.
2.3.2 Pekařská jakost pšenice Pod pekařskou jakostí pšeničného zrna, či jeho mouky se rozumí schopnost poskytnout pečivo s požadovanou jakostí. Jakostní pečivo se má vyznačovat maximálním objemem, kyprou, pružnou a jemně pórovitou střídkou, vybavenou dostatečně tlustou kůrkou a příjemnou chutí a vůní. Pro dosažení vysoké technologické jakosti je důležitá souhra mnoha faktorů. Nejdůležitější je obsah bílkovin v pšeničném zrně. Z těch se v procesu hnětení vytváří, jako u jediné obiloviny, tzv. lepkový komplex. Ten díky svým viskoelastickým
22
vlastnostem má schopnost zadržovat oxid uhličitý, vzniklý v procesu fermentace těsta pekařskými kvasnicemi, z kvasitelných cukrů, z části přítomných, ale především uvolněných amylotickými enzymy, a tak umožnit získání maximálního objemu pečiva (Ingr et al., 1993). Na celkové množství lepkových bílkovin a jejich viskoelastické vlastnosti má vliv jak faktor genotypu, tak i vnější agroekologické podmínky. Pro konstrukci odrůd s vyšší pekařskou jakostí jsou důležité poznatky o významu jednotlivých genetických a negenetických faktorů, podílejících se na vytváření pekařské jakosti. Požadavky na pekárenskou a pečivárenskou pšenici jsou uvedeny v tabulce 2. Geny determinující pekařskou jakost byly zjištěny v chromozomech 2A, 3A, 4A, 5A, 2B, 3B, 4B, 6B, 1D, 2D, 3D a 4D. Geny ovlivňující jakost lepku jsou uloženy v chromozomech 1B, 4B, 7B, 5D a 7D. Množství lepku je geneticky podmiňováno geny uložených v chromozomech 1D a 5D (Lelley, 1976).
Zjišťování pekařské jakosti Ke stanovení pekařské jakosti pšenice se používá řada metod. Systém pro hodnocení zahrnuje přímá i nepřímá hodnocení, která jsou podle významu rozdělena na hlavní a doplňková. Hlavní kritéria mají vliv na zařazení odrůdy do jakostní kategorie: •
Rapid Mix Test (objemová výtěžnost) – je to objem pečiva po upečení, podle standardní metodiky a z určeného množství mouky, vyjádřený v cm3 (Petr, 2001). Z hodnocených znaků je nejdůležitější a ve velké míře odpovídá za zařazení odrůd pšenice do kvalitativních skupin.
•
Obsah hrubých bílkovin (N x 5,7) – stanovuje se klasickými metodami (Klejdahl), ale také pomocí analytické techniky, která je přesnější.
•
Sedimentační test (Zelenyho test) – vyjadřuje množství i kvalitu bílkovinného komplexu. Pomocí tohoto testu lze vyřadit nevhodné odrůdy či partie zrna s nekvalitním lepkem.
•
Číslo poklesu – slouží k posouzení stavu sacharido-amylázového komplexu zrna, který je ovlivňován aktivitou amylotických enzymů, syntetizovaných v zrně v důsledku startu procesu klíčení. Nízké číslo poklesu snižuje pekařskou kvalitu zeslabením pružnosti střídy pečiva. Pečivo má obvykle malý objem, nevhodnou vyvázanost, těsto je lepivé a těžko zpracovatelné (Jurečka a Beneš, 2002).
•
Objemová hmotnost – stanovuje se jako hmotnost jednoho litru zrna.
23
•
Vaznost mouky – je měřítkem výtěžnosti a stability těsta.
Doplňková kritéria slouží k další specifikaci jakosti odrůdy: • Obsah mokrého lepku – koreluje s bobtnáním lepku. Stanovuje se buď ručním vypíráním, nebo na přístroji Glutomatic. • Farinografické údaje (vývin, stabilita a stupeň změknutí těsta) – princip hodnocení je založen na měření změn odporu těsta při hnětení. • Obsah popele v zrně pšenice. • Tvrdost zrna – má vztah k výtěžnosti krupic a je nepřímým ukazatelem mlynářské jakosti. • Hmotnost tisíce zrn – je ovlivňována odrůdou, podmínkami ročníku a čištěním. • Výtěžnost mouky T-550 – stanovuje se mlecím pokusem a je významným mlynářským kritériem.
2.3.3 Korelační vztahy mezi markery pekařské jakosti a vlastní pekařskou jakostí Šašek et al. (1987) hodnotili, podle dříve uskutečněných elektroforetických analýz gliadinů odrůd pšenice obecné, dvě skupiny odrůd: 1. odrůdy gliadinově jednoliniové či se zastoupením hlavní gliadinové linie vyšším než 90 %, 2. odrůdy gliadinově víceliniové.
U souboru odrůd linií první skupiny byla pekařská jakost stanovena na základě komplexního hodnocení, zahrnujícího sedimentační test, stanovení obsahu bílkovin, stanovení mokrého lepku a jeho bobtnavosti a tažnosti, farinografického a extenzografického testu a pekařské zkoušky u vzorků sklizených v letech 1981 až 1984 na šesti odrůdových zkušebnách ÚKZÚZ. Gliadinové linie druhé skupiny odrůd byly v roce 1983 vysety do polní školky ve VÚRV Praha – Ruzyně. Markerovací bodovací hodnoty alelických bloků zón, resp. jednotlivých podjednotek gluteninů s VMH, byly stanoveny podle publikovaných poznatků.
24
Celkové bodové hodnoty gliadinových a gluteninových markerů pekařské jakosti hodnocených gliadinových linií odrůd byly korelovány s bodovými hodnotami pekařské jakosti a významnost získaných korelačních vztahů byla hodnocena t-testem. V souboru odrůd první skupiny byla zjištěna vysoce významná korelace (r = 0,88**) mezi bodovou hodnotou tříd pekařské jakosti, vyjádřenou stupnicí 1 – 9, a sedimentační hodnotou těchto tříd, což potvrzuje oprávněnost použití komplexního bodového hodnocení tříd pekařské jakosti sledovaných odrůd pšenice. U stejného souboru byla zjištěna vysoce významná korelace mezi bodovou hodnotou tříd pekařské jakosti a markerovací hodnotou alelických gliadinových bloků (r = 0,71**), nevýznamná kladná korelace s markerovací hodnotou gluteninových alelických bloků těsně pod hranicí významnosti P = 0,05 ( r = 0,50) a vysoce významná kladná korelace se součtem markerovacích hodnot gliadinových a gluteninových markerů ( r = 0,86**). Získaná maximální hodnota korelačního vztahu mezi hodnotou tříd pekařské jakosti a aditivní hodnotou gliadinových a gluteninových markerů pekařské jakosti svědčí o výhodnosti současného použití obou markerovacích kriterií. Zjištěné poznatky umožňují usuzovat o převážně aditivním působení gliadinových a gluteninových genů. Na druhé straně hodnocení gliadinových a gluteninových markerů odrůd zařazených do nižších tříd pekařské jakosti poukazuje na projev silného potlačení markerovací hodnoty gluteninových markerů vyšší pekařské jakosti 1A1, 1B7+9, 1D5+10, právě tak jako gliadinového markeru vyšší pekařské jakosti 1A7 v přítomnosti gliadinového alelického bloku 1B3 – markeru velmi nízké pekařské jakosti. V těchto případech pak neodpovídá očekávaná celková markerovací hodnota skutečně zjištěné nízké pekařské jakosti. Zjištěný vnitroodrůdový polymorfizmus v gliadinech a v podjednotkách gluteninů s VMH umožňuje volbu optimálních genetických zdrojů pekařské jakosti, tedy rodičovských forem pro hybridní programy konstrukce odrůd pšenice s vyšší pekařskou jakostí. Získané výsledky současně prokázaly, že znalost vnitrodruhového polymorfizmu gliadinů a podjednotek gluteninů s VMH mohou napomoci racionalizaci hybridizačních programů, zaměřených na vyšlechtění odrůd pšenice pro pekařské účely, neboť umožňuje výběr vhodných gliadinových a gluteninových linií jako rodičovských forem, poskytující transgresi v pekařské jakosti (Černý a Šašek, 1996).
2.3.4 Katalog alelických elektroforetických spekter odrůd pšenice seté Předpokladem účelného využívání registrovaných odrůd pšenice obecné ve šlechtění, semenářství, semenářské kontrole a zejména stanovení odrůdové pravosti a čistoty dávek
25
merkantilní pšenice pro potřeby obchodu a zpracovatelského průmyslu je používání vzorových elektroforetických spekter gliadinů a VMH podjednotek gluteninů. K elektroforetickým analýzám gliadinů a VMH podjednotek gluteninů bylo použito referenčních vzorků osiva registrovaných odrůd, poskytnutých ÚKZÚZ v Brně. Ke stanovení elektroforetické skladby gliadinů bylo analyzováno z každého ramšového vzorku jednotlivě po 50 zrnech. Elektroforetická skladba VMH podjednotek gluteninů byla orientačně zjišťována hodnocením po 5 náhodně odebraných zrnech z každého ramšového vzorku (Šašek et al., 2000). Elektroforetická spektra gliadinů byla stanovena modifikovaným způsobem vertikální elektroforézy ve sloupcích škrobového gelu v Al-laktátovém pufru při pH 3,1 se 2 moly močoviny na 1l (Šašek a Sýkorová, 1989). Elektroforetická spektra VMH podjednotek gluteninů byla stanovena modifikovaným postupem vertikální diskontinuální elektroforézy v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného. Alelické bloky zón či jednotlivé alelické zóny elektroforetického spektra byly zjišťovány podle publikovaného katalogu (Payne et al., 1981). Tento katalog lze najít např. v publikaci Šašek et al. (2000). Tento katalog obsahuje rovněž predikční bodové hodnoty pekařské jakosti jednotlivých alelických gliadinových bloků. Predikční bodové hodnoty pekařské jakosti gluteninů s VMH jsou obsaženy v tabulce 3.
2.3.5 Konstrukce genotypů pšenice s vyšší pekařskou jakostí V konstrukci nových genotypů byly dosaženy slibné výsledky spojením elektroforézy bílkovin s klasickou metodou hybridizace. Šašek
et
al.
(1989)
ověřovali
možnosti
záměrné
konstrukce
genotypů
s rekombinovanou sestavou gliadinových a gluteninových genů, podmiňující vyšší pekařskou jakost. V generaci F3 a opakovaně v F4 byl uskutečněn výběr homozygotních a homogenních genotypů. Rovněž byla zjišťována sedimentační hodnota jednotlivých genotypů, linií homozygotních a homogenních ve skladbě analyzovaných bílkovin. Mezi průměrnou sedimentační hodnotou sloučených variant genotypů generace F4 a jejich průměrnou predikční markerovací bodovou hodnotou byl zjištěn statisticky významný kladný korelační vztah (r = 0,98**), potvrzující účinnost konstruování transgresních rekombinantních genotypů pomocí elektroforézy zásobních bílkovin (Černý a Šašek, 1996).
26
2.2.5 Charakteristika odrůd pšenice registrovaných v letech 2000 - 2003 V letech 2000 až 2003 bylo v ČR nově registrováno 20 odrůd pšenice obecného ozimého typu a 6 odrůd pšenice obecné jarního typu. Z celkového počtu 20-ti odrůd ozimé pšenice představuje 13 odrůd homogenní odrůdy typu čistých linií. Heterogenní odrůdy s několika gliadinovými liniemi jsou většinou dimorfní. Výskytem tří linií označených A, B, C se vyznačuje odrůda Windsdor. Z šesti odrůd jarní pšenice pouze odrůda Corso je heterogenní ve skladbě gliadinů (Bradová et al., 2004). Charakteristiky jednotlivých odrůd pšenice, registrovaných v letech 2000 – 2003, jsou uvedeny v tabulce 4.
Pekařská jakost VMH gluteninové markery např. Glu 1A1, Glu 1B7+8, Glu 1B7+9 a zejména Glu 1D17+18 a Glu 1D5+10 spolu s gliadinovými markery např. Gli 1B1 a Gli 1B4 značkují lepší pekárenskou jakost (Šašek et al., 2000). Maximální kumulace těchto markerů tj. gliadinových a VMH gluteninových alelických bloků s vyšší predikční bodovou hodnotou byla zjištěna u odrůd Sulamit (TPJ E), Banquet (TPJ A), Batis (TPJ A), Ilias (TPJ A) a linie B odrůdy Karolinum (TPJ A). Analogicky u jarní pšenice byla pozorována kumulace markerů lepší pekárenské jakosti u odrůd Triso (TPJ A) a u hlavní linie A odrůdy Corso (TPJ A). Sekalinový blok Gli 1B3 je markerem špatné pekařské jakosti. Ve sledovaném souboru výskyt tohoto bloku u odrůd Windsdor (Gld linie B), Clarus a Rapsodia odpovídá zařazení zmíněných odrůd do třídy C. Výjimkou je odrůda Karolinum, u které vedlejší gliadinová linie nese blok Gli 1B1 tj. marker lepší pekárenské jakosti. Navíc obě gliadinové linie této odrůdy akumulují všechny tři VMH gluteninové alelické bloky markery lepší pekárenské jakosti. Odrůda proto může být zařazena do třídy pekárenské jakosti A (Bradová et al., 2004).
Zimovzdornost Některé gliadinové geny markerují zimovzdornost (Šašek et al., 2000). Přítomnost obou hlavních genů zimovzdornosti tj. Gli 1D5 a Gli 6A3, respektive jim odpovídajících alelických bloků, nebyla zjištěna u žádné z hodnocených odrůd. Alelický blok Gld 6A3 se vyskytl u odrůd ozimé pšenice Batis, Windsdor (linie A), Mladka (linie A, B, C), Trend (linie B), Clarus a Karolinum (linie A, B) (Bradová et al., 2004).
27
Odolnost ke rzím Translokace 1B/1R nese gen rezistence ke rzi travní a sekalinový gen Gli 1B3 marker špatné pekárenské jakosti. Černý et al. (1995) pomocí koeficientů asociace zjistil, že odolnost ke rzi travní mohou markerovat rovněž gliadinové geny Gli 1-1A5, 1A3, 1D5 a Gli 6B1. Lokalizace genů odolnosti Sr18 a Sr33 v chromozomu 1D je v souladu s funkcí gliadinového markeru Gli 1D5 jako markeru odolnosti ke rzi travní. Analogicky bylo zjištěno, že lokalizace genu Sr14 v chromozomu 1A a genu odolnosti Sr11 v chromozomu 6B odpovídá markerům odolnosti ke rzi travní. Pomocí koeficientů asociace zmínění autoři zjistili, že blok Gli 6A2 a blok 1D1 markerují odolnost ke rzi pšeničné a bloky 1B4 a 1D9 odolnost ke rzi žluté. Jako příklad lze uvést odrůdu Sulamit, u které gliadinový blok 1-1A3 markeruje odolnost ke rzi travní, blok 1B4 odolnost ke rzi žluté a blok 6A2 odolnost ke rzi pšeničné (Bradová et al., 2004).
28
3 ZÁVĚR Gliadiny a podjednotky gluteninů s VMH představují genetické markery, umožňující rychlou a objektivní genetickou identifikaci odrůdy, stanovení její genetické struktury a markerování některých hospodářsky významných hospodářských znaků a vlastností. Pomocí biochemických markerů pekařské jakosti je možno vybírat rodičovské formy do hybridizačních programů a odhadovat četnosti genotypů nesoucích geny žádané vlastnosti ve štěpících populacích F2 a F3. K předpovědi kladné transgrese v pekařské jakosti je nutné znát genetické determinace pekařské jakosti rodičovských odrůd, kterou zjistíme pomocí elektroforetické separace gliadinů a VMH podjednotek gluteninů. K jednotlivým alelickým gliadinovým a gluteninovým blokům je přiřazen bodová hodnota predikce pekařské jakosti. Zvýšení pekařské jakosti je možno dosáhnout vhodným křížením dvou rodičovských komponent, které se navzájem doplňují odlišnými gliadinovými a VMH gluteninovými geny lepší pekařské jakosti. Předpokladem účelného využívání registrovaných odrůd pšenice obecné ke šlechtění je znalost katalogů elektroforetických spekter gliadinů a VMH podjednotek gluteninů. Jako zdroje vyšší pekařské jakosti lze použít odrůdy, které obsahují alelické bloky podjednotek gluteninů s VMH Glu 1A1, Glu 1B7+8, Glu 1B7+9 a zejména Glu 1D17+18 a Glu 1D5+10 a bloky gliadinů Gli 1B1 a Gli 1B4. Naopak sekalinový blok Gli 1B3 je markerem špatné pekařské jakosti. V rámci zpracování bakalářské práce formou literární rešerše jsem si vytvořil základní teoretický přehled a v rámci studia získal první praktické zkušenosti o možnostech využití biochemických markerů technologické kvality pšenice. Tím jsem si vytvořil dobré předpoklady pro úspěšné řešení navazující diplomové práce, kde budu mít možnost prohloubit své znalosti a prezentovat výsledky vlastní experimentální práce.
29
4 SEZNAM CITOVANÉ A POUŽITÉ LITERATURY BEDNÁŘ, J.: Vybrané kapitoly z genetiky rostlin. MZLU Brno, 1998: 124 s.
BEDNÁŘ, J., VYHNÁNEK, T.: Genetika rostlin. MZLU Brno, 2004: 147 s.
BEDNÁŘ, J., VYHNÁNEK, T., JEDLIČKOVÁ, D.: Cvičení z genetiky rostlin. MZLU Brno, 1999, 2002: 140 s.
BRADOVÁ, J., ŠAŠEK, A., ČERNÝ, J.: Charakteristika odrůd pšenice registrovaných v letech 2000 – 2003, pomocí genetických bílkovinných markerů. Konference „Nové poznatky v pěstování, šlechtění a ochraně rostlin“, Brno, 2004: 69-72.
ČERNÝ, J., ŠAŠEK, A.: Bílkovinné signální geny pšenice obecné. ÚZPI Praha, 1996: 62 s.
ČERNÝ, J., ŠAŠEK, A.: Metodiky pro zemědělskou praxi. Stanovení odrůdové pravosti a čistoty pšenice a ječmene elektroforézou genetických markerů. ÚZPI Praha, 1998: 60 s.
ČERNÝ, J., ŠAŠEK , A., MALÝ, J.: Ověření metody bílkovinných markerů pekařské jakosti pšenice obecné pomocí nových genotypů zkoušených v SOZ v roce 1991. Genetika a šlechtění, 28, 1992, 4: 271 – 293.
ČSN 46 11 00-2 „Obiloviny potravinářské – Část 2: Pšenice potravinářská“
ČURN, V., SÁKOVÁ, L., GRAMAN, J.: Elektroforéza isoenzymů a neenzymatických bílkovin. Metody a aplikace v genetice a šlechtění rostlin. Genetika a Šlechtění, 31, 1995, 3: 207-228.
DUDÁŠ, F., PELIKÁN, M.: Využití produktů rostlinné výroby (Návody do cvičení). VŠZ Brno, 1987: 177 s.
FOLTÝN, J. et al.: Pšenice. SZN Praha, 1970, 441 s.
30
GAÁL, Ö, MEDGYESI, G. A., VERECZKEY, L.: Electrophoresis in the Separation of Biological Macromolecules. Akadémiai Kiadó, Budapest, 1980: 156 s.
GONCHAROV, N. P.: Sravnitelnaja genetika pšenicy i ich roditelnej. Siberian University Press, Novosibirsk, 2002: 251 s.
HADAČOVÁ, V., TURKOVÁ, V., HADAČ, E., KLOZOVÁ, E.: Comparison of seed proteins of some representatives of the genus Pisum from the point of view of their relationship. Comparison by disc electrophoresis. Biologia Plantarum, 22, 1980, 1: 7-16.
HAMAZAU, Z., ARAKAWA, T., YONEZAWA, D.: Molecular weights of glutenin and gliadin polypeptides estimated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Agricological biology and chemistry, 36, 1972: 1829-1830.
HAMPL, J. et al.: Biochémia rastlín. VŠP Nitra, 1965: 315 s.
HRAŠKA, Š. et al.: Špeciálna genetika poľnohospodárskych rastlín. Príroda Bratislava, 1989: 211 s.
CHLOUPEK, O.: Genetická diverzita, šlechtění a semenářství. Academia Praha, 2000: 311 s.
INGR, I. a kolektiv: Zpracování zemědělských produktů. VŠZ Brno, 1993: 249 s.
JUREČKA, D., BENEŠ, F.: Přehled odrůd obilnin 2002. ÚKZÚZ Brno, 2002: 159 s.
LELLEY, J.: Wheat breeding. Theory and Practise. Akadémiai kiadó Budapest, 1976.
MARTINEK, P.: K současné situaci v odrůdové skladbě ozimé pšenice. Obilninářské listy, 10, 2002, 3: 8-12.
METAKOVSKY, E. V.: Gliadin Allene identification in common wheat. II. Catalogue of gliadin alleles in common wheat. Journal Genetics and Breeding, 45, 1991: 325-344.
31
OSBORNE, T. B.: The protein of the wheat kernels. Carnegie Institut Washington D. C., 1907.
PAYNE, P. I., HOLT, L. M., LAW, C. M.: Structural and genetical studie of the HMW subunits of wheat glutenin. I. Allelic variation in subunits amongst varieties of wheat (Triticum aestivum L.). Theoretical and Applied Genetics, 60, 1981: 229-236.
PAYNE, P. I.et al.: Cereal Research Communications, 10, 1982: 229. In: ČERNÝ, J., ŠAŠEK, A.: Bílkovinné signální geny pšenice obecné, ÚZPI Praha, 1996: 62 s.
PAYNE, P. I., LAWRENCE, G. J.: Cereal Research Communications, 11, 1983, 1: 29. In: ČERNÝ, J., ŠAŠEK, A.: Bílkovinné signální geny pšenice obecné, ÚZPI Praha, 1996: 62 s.
PETR., J.: Pěstování pšenice podle užitkových směrů. ÚZPI Praha, Zemědělské informace 2001, 20: 40 s.
PETR, J., HÚSKA, J. et al.: Speciální produkce rostlinná I. AF ČZU Praha, 1997: 293 s.
SOZINOV, A. A., POPERELJA, F. A.: Polymorfizm prolaminov i selekcija. Vestnik Selskochozjajstvennoj Nauki, 10, 1979: 21-34.
ŠAŠEK, A., ČERNÝ, J.: Vzorová elektroforetická spektra gliadinů a gluteninů s VMH odrůd pšenice obecné, pěstovaných v ČR v roce 1993. Rostlinná výroba, 41, 1995, 4: 163- 168.
ŠAŠEK, A., ČERNÝ, J., SÝKOROVÁ, S., BRADOVÁ, J.: Inovované katalogy bílkovinných genetických markerů pšenice seté a ječmene. ÚZPI Praha, 2000: 62 s.
ŠAŠEK, A., ČERNÝ, J., SÝKOROVÁ, S., KUBÁNEK, J.: Construction of wheat genotypes with higher baking duality by electrophoresis of gliadins and HMW subunits of glutenins. Scientia Agriculturae Bohemica, 21, 1989: 171-176.
32
ŠAŠEK, A., KUBÁNEK, J., ČERNÝ, J.: Gliadin and glutenin polymorphism of some cultivars populations of common wheat (Triticum aestivum L.). Scientia Agriculturae Bohemica, 1987, 2: 93-100.
ŠAŠEK, A., SÝKOROVÁ, S.: Standardization of vertical electrophoresis in starch gel columns and characterization of gliadin allelic blocks. Scientia Agriculturae Bohemica, 21, 1989: 99-108.
VEJL, P.: Využití genetických markerů pro tvorbu dihaploidní pšenice obecné (Triticum aestivum L.). Doktorská disertační práce, ČZU Praha, 1998: 334 s.
VELÍŠEK, J.: Chemie Potravin, 1. díl. Ossis, 1999: 50-53.
VYHNÁNEK, T., NESVADBA, Z., CARDOVÁ, M.: Utilization of protein signal genes in wheat (Triticum aestivum L.). MendelNet´98, Brno, 1998: 57-58.
VYHNÁNEK, T., NESVADBA, Z.: Některé výsledky z využití elektroforézy zásobních bílkovin při stanovení odrůdové čistoty u pšenice. 22. pracovní seminář „Problematika Nlátek v rostlinných produktech“, Kroměříž, 1998: 71-75.
VYHNÁNEK, T.: Využití bílkovinných signálních genů pro hodnocení účinnosti gametocidu GENESIS® u pšenice (Triticum aestivum L.). Doktorská disertační práce, MZLU Brno: 2001: 80 s.
WOYCHIK, J. H., BOUNDY, J. A., DIMLER, R. J.: Starch gel electrophoresis of wheat gluten proteins with concentrated urea. Arch. Biochem. and Biophys., 100, 1961: 51-55.
WRIGLEY, C. W.: Cereal Science Today, 17, 1972, 12, 370-373. In: ČERNÝ, J., ŠAŠEK, A.: Bílkovinné signální geny pšenice obecné, ÚZPI Praha, 1996: 62 s.
Internet www.ukzuz.cz
33
5 PŘÍLOHY Tabulky: Tab. 1: Druhy rodu pšenice (Triticum L.) podle počtu chromozomů Tab. 2: Požadavky na pekárenskou a pečivárenskou pšenici Tab. 3: Bodové hodnoty pekařské jakosti pšenic jednotlivých alelických bloků s HMW gluteninů Tab. 4: Charakteristika odrůd pšenice registrovaných v letech 2000 – 2003
Obrázky: Obr. 1: Botanické druhy pšenice Obr. 2: Elektroforeogram elektroforézy gliadinů pšenice Obr. 3: Genetická interpretace gliadinů pšenice Obr. 4: Katalog VMH gluteninových podjednotek pšenice
34
