8
1 ÚVOD
Obilniny patří k nejdůležitějším plodinám z hlediska ekonomického, agronomického rovněž spotřebitelského. Jsou tedy hlavními plodinami pěstovanými po celém světě. Z celosvětového hlediska má význam rýže setá (Oryza sativa L.) a kukuřice (Zea mays L.). V České republice je nejvíce zastoupena pšenice obecná (Triticum aestivum L.), která se používá především v potravinářském průmyslu. Její pěstební plocha v ČR kolísá v rozmezí 700 - 900 tis. ha. Bakalářská práce se zabývá problematikou studia genetické diverzity tritikale (XTriticosecale Wittmack.) pomocí molekulárních markerů. Tritikale je považováno za první uměle vytvořenou obilovinu. Jde o amfiploida, vzniklého křížením mezi pšenicí a žitem. Je znám více než sto let. V roce 1777 byla popsána první sterilní forma Wilsonem ve Skotsku a prvního fertilního amfiploida získal v roce 1888 Rimpau. I přes krátké období intenzivního šlechtění, našlo tritikale uplatnění v zemědělské praxi. Existuje již velké množství odrůd, které splňují požadavky pěstitelů, dochází tedy k postupnému nárůstu jeho osevních ploch. V současné době se hlavně pěstují hexaploidní formy (2n = 6x = 42, genom AABBRR). V České republice můžeme sledovat nárůst ploch tritikale (2003 - 46 tis. ha, 2004 - 63 tis. ha, 2005 - 65 tis. ha). Podobný trend je možno pozorovat i v Polsku (2003 - 986 tis. ha, 2004 - 1058 tis. ha, 2005 - 1158 tis. ha) a Německu (2003 - 585 tis. ha, 2004 - 507 tis. ha, 2005 - 482 tis. ha). Zároveň s rozšiřujícími se plochami tritikale lze předpokládat, že dojde ke zvýšení šlechtitelské činnosti zaměřené na tohoto amfiploida. Jeví se tedy jako výhodné mapovat genetickou variabilitu tritikale, protože s rozvojem šlechtění docházelo paradoxně k ochuzování genetické diverzity, což mělo neblahý vliv především na vitalitu rostlin, které ztrácely především odolnost vůči patogenním vlivům, neboť šlechtitelská činnost člověka je především směřována ke zvyšování výnosovosti a kvality bez ohledu na to, jak tyto preferované znaky působí na rezistenci apod. Je tedy zřejmé, že jakákoliv další šlechtitelská činnost není možná bez znalosti genetické struktury požadovaných znaků a vlastností. Zde se budou velkou měrnou uplatňovat molekulární a biochemické markery.
9
2 CÍLE BAKALÁŘSKÉ PRÁCE
1. Seznámit se formou vypracování literární rešerše s problematikou genetické diverzity, jejím významem a uchováním pomocí metod ex-situ a in-situ. 2. Obeznámit se s formou vypracování literární rešerše s problematikou využití molekulárních a biochemických markerů při studiu genetické diverzity u obilovin, zejména při studiu genetické variability tritikale. 3. Teoretické a praktické zvládnutí základních kroků metod molekulární biologie založených na principu PCR u tritikale.
10
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 Tritikale
3.1.1 Biologická charakteristika tritikale Tritikale (XTriticosecale Wittmark.) (obr. 1) je mezirodový hybrid, který vznikl vzdálenou hybridizací pšenice (Triticum spp.) a žita (Secale cereale). Název je zkombinován ze jmen jeho rodičů (Triticum a Secale = Tritikale). Český název tohoto hybrida je žitovec. Pojmenování není ovšem dostatečně zažito, a proto se nepoužívá. Tritikale řadíme mezi jednoleté ozimé nebo jarní trsnaté byliny z čeledi lipnicovitých (Poaceae). Kořenová soustava je svazčitá. Kořeny zasahují až do hlouby 100 - 200 cm, odnožování střední, ale slabší než u žita. Trsy jsou převážně polorozkladité, stéblo je po celé své délce hladké, z větší části lysé nebo jen slabě oděné (3 - 4 cm pod květenstvím ochlupacené). Listy jsou čárkovité, střídavé, středně dlouhé až dlouhé (18 - 21 cm i více), lysé až chlupaté, vyznačující se světle zelenou barvou, která má podobný odstín jako u pšenice. Pochva listu se vyznačuje malým jazýčkem a světle zelenými až slabě fialovými oušky. Květenství se nazývá lichoklas, který dorůstá do délky 9 - 25 cm. Lichoklas tritikale tvoří 24 - 29 klásků. Klásky se skládají ještě ze tří až pěti květů. Květy bývají zpravidla samosprašné se třemi tyčinkami a chlupatými přisedlými bliznami. Obilka je středně velká (HTS 30 - 40 g), tvarem podobná obilce žita, žlutohnědá s výraznou rýhou na spodní straně. Na vrcholku obilky nalezneme chomáček chlupů (Kudrna et al., 1987).
3.1.2 Vznik tritikale Tritikale bylo získáváno několika cestami. Nejprve se při vzniku tritikale experimentovalo s různými kulturními i divokými druhy rodu Triticum a Secale, které se používaly jako mateřské nebo otcovské komponenty. Hybridizace mezi pšenicí a žitem je řízena geneticky major geny Kr1 a Kr2, které se nachází na chromozomech 5B (Kr1) a 5A (Kr2) (Krolow, 1970). V dominantním stavu potlačují tvorbu hybridních semen. Geny křížitelnosti pšenice s žitem (Kr1, Kr2) působí jen tehdy, je-li pšenice použita jako mateřská forma. Slouží-li jako mateřská rostlina žito, nebyl účinek těchto genů zjištěn (Macháň, 1989).
11
V závislosti na genomu použitého výchozího materiálu bylo získáno tritikale tetraploidní (2n = 28), hexaploidní (2n = 42) a oktoploidní (2n = 56) (Bednář, 2000). Při vzniku tritikale hraje významnou roli také řada dalších faktorů, jako je například rozdílná doba kvetení pšenice a žita a nezanedbatelný je také vliv cytoplazmy. Oktoploidní tritikale Vývoj tritikale začal na oktoploidní úrovni. Toto tritikale je křížencem hexaploidní pšenice (genom AABBDD) a diploidního žita (genom RR) (obr. 2). Oktoploidní tritikale obsahuje 42 chromozomů pšeničných a 14 chromozomů žitných. Při křížení můžeme využít
různé druhy hexaploidních pšenic a kulturní a divoké druhy diploidního žita
(Hraška et al., 1989). Lepších výsledků lze dosáhnout, když se jako mateřské rostliny použijí Triticum aestivum a Triticum compactum. Z otcovských komponent se lepší křížitelnosti dosáhlo u Secale cereale, Secale ancestrale a Secale vavilovii a Vyhnánek, 2004). Křížením
(Bednář
mateřských rostlin Triticum macha, či Triticum spelta
a otcovských komponentů víceletých druhů Secale africanum, Secale montanum nebo Secale kuprijanovii nebylo dosaženo tak dobrých výsledků. Hexaploidní tritikale Hexaploidní tritikale se vyskytuje jako primární a sekundární hexaploidní forma. Způsoby jejich tvoření jsou různé. Hexaploidní tritikale primární je kříženec tetraploidní pšenice (2n = 28) s diploidní žitem (2n = 14), fertilita jedinců dosažena pomocí polypolidizace (obr. 2a). Dále se mohou křížit rodičovské komponenty mající zdvojnásobený počet chromozomů (např. oktoploidní pšenice Triticum durum a tetraploidní žito). Může být také využito předcházející křížení východiskových forem (např. Triticum durum × Triticum timopheevi). Takto vytvoření jedinci mají vyšší násadu zrn než kříženci mezi tetraploidní pšenicí a diploidním žitem (Hraška et al., 1989). Značným pokrokem ve zlepšování znaků a vlastností hexaploidního tritikale byla metoda hybridizace oktoploidního a hexaploidního tritikale, kterou jako první použili Pisarev (1966) a Kiss (1966) za vzniku sekundárního hexaploidního tritikale (obr. 2b). Lepší vlastnosti sekundárních tritikale lze vysvětlit genetickou rekombinací genů A a B obecné a tvrdé pšenice. Pro tritikale je příznivější cytoplazma hexaploidní pšenice (méně výhodná je cytoplazma tetraploidní pšenice).
12
Tetraploidní tritikale Práce s tetraploidním tritikale má zatím jen teoretický význam. Primární syntéza Triticum monococcum a diploidního žita a následná polyploidizace F1 generace byly neúspěšné. Křížení hexaploidního tritikale a diploidním žitem (AABBRR × RR) je úspěšnější.
3.1.3 Odrůdy registrované v České republice V roce 2002 bylo tritikale pěstováno na 53 tis. ha, po ozimé pšenici a ječmeni bylo tedy nejrozšířenější obilovinou. Již v roce 2004 byl zaznamenán další nárůst ploch a to sice na 62,8 tis. ha. K roku 2003 u nás bylo registrováno 11 odrůd ozimých (Kolor, Modus, Sekundo, Disko, Presto, Lameto, Tricolor, Marko, Kitaro, Lupus a Ticino) a jedna odrůda jarní Gabo. Do roku 2005 přibyly další tři ozimé odrůdy Triamant, Tornado, Gutek a dvě jarní odrůdy Legalo a Kargo (tab.1) (www.ukzuz.cz).
3.1.4 Význam a využití tritikale K hlavním faktorům stále rostoucí obliby tritikale patří: vysoká nutriční hodnota, adaptace k horším agroklimatickým podmínkám (např. vyšší zimovzdornost) a půdním podmínkám, snášenlivost k horším předplodinám, vyšší odolnost k chorobám, vyšší odolnost k zasolení a poléhání oproti pšenici (Zimolka et al., 2000). Nutriční hodnota je ve velké míře podmíněna geneticky. Jedná se tedy o odrůdovou vlastnost jen částečně ovlivnitelnou agrotechnikou a podmínkami pěstování. Tyto vlastnosti předurčují tritikale pro pěstování v marginálních oblastech, kde je možnost dosažení větších výnosů než u pšenice. Další předností tritikale je také jeho větší výnosová plasticita. Současné formy tritikale produkují větší množství biomasy na jednotku plochy porostu než u pšenice. Jeví se tedy jako výhodné selektovat na vyšší sklizňový index, což by mělo vést u tritikale k rychlejšímu pokroku ve zvyšování výnosového potenciálu. V poslední době se daří zkracovat délku stébla, a to pomocí vnášení některých Rht genů krátkostébelnosti (Petr et al., 1991). Výhody tritikale lze spatřovat i ve využití zbytkové biomasy po sklizni k výrobě biopaliv. Jako perspektivní se jeví také výroba etanolu z tritikale vzhledem k vysoké aktivitě amyláz. Farmaceutický průmysl se zajímá o tritikale jako o vhodnou hostitelskou rostlinu pro pěstování speciálních kmenů námele (Štolcová, 1994). Nevýhody můžeme spatřovat v nevhodnosti k pekárenskému využití a náchylnosti k porůstání (Burešová a Martinek, 2005).
13
3.2 Genetická diverzita Na světě se vyskytuje asi 250 tisíc druhů cévnatých rostlin, z nichž lze jen asi 30 tisíc označit jako jedlé, ale pouze 7 tisíc patří mezi kulturní rostliny, označované jako plodiny. Potravinová bezpečnost lidstva je přitom více než z 95% závislá na 30 hlavních plodinách (Dotlačil, 1998). To svědčí o malé rozmanitosti (diverzitě) lidské výživy. V průvodci k Úmluvě o biodiverzitě je biodiverzita popsána jako rozmanitost života ve všech jeho formách, úrovních a kombinacích. Proto je biodiverzita v tomto pojetí považována za vlastnost života (Härtel, 2003). Rozlišujeme 3 hierarchické úrovně biodiverzity: 1. Genetická diverzita se vztahuje k rozmanitosti genů v rámci druhů. Zahrnuje odlišné populace téhož druhu nebo geneticky rozdílné jedince v rámci určité populace. Ztráty na úrovni genetické diverzity jsou nejméně nápadné, avšak mohou být z hlediska budoucnosti významnější než ztráta druhové různorodosti. 2. Druhová diverzita souvisí s rozmanitostí druhů v rámci určité oblasti. 3. Ekosystémová diverzita se určuje obtížněji než druhová nebo genetická diverzita, protože hranice společenstev a ekosystémů jsou obvykle jen těžko rozpoznatelné. Všechny tři úrovně diverzity spolu vzájemně souvisejí. Genetickou rozmanitostí rozumíme rozmanitost genů v rámci populací a druhů. Tento pojem zahrnuje: •
odlišné populace v rámci téhož druhu,
•
rozdílné jedince v rámci určité populace. Výsledkem genetické variability je individuální identita jedinců jednotlivých druhů,
tedy genetická různorodost, jinak řečeno genetická diverzita. Vznik genetické různorodosti byl výhodným evolučním mechanizmem a podílela se na něm celá řada faktorů, z nichž nejpodstatnější můžeme schematicky rozdělit následovně (Adámková, 2006):
14
Genetická různorodost vznikala pomocí procesů spojených hlavně s mutacemi, rekombinacemi a genetickým driftem. Jedná se o procesy dynamické, lze konstatovat, že neustále dochází k vytváření nové genetické diverzity. Oproti tomu enviromentální adaptace (přizpůsobení klimatickým podmínkám) a náhodný genetický drift formuje rozložení genetické diverzity v čase a prostoru. Veškerá flora má schopnost reagovat na pomalé přírodní transformace, tj. produkuje v každé generaci individua s geny v nové sestavě, a tudíž s různou ekologickou preferencí pro nové prvky prostředí.
3.2.1 Původ a ochuzování genetické diverzity S rozvojem lidské společnosti ovšem dochází k velmi rychlým změnám přírodního prostředí. Některé druhy se na ně bohužel nestačí adaptovat a vyhynou. Kulturní plodiny se vyvíjely současně s rozvojem zemědělství a na rozšíření jejich ploch má zásluhu hlavně člověk. Tyto pochody měly vliv především na morfologii (zvětšení některých zásobních orgánů, zesílením pletiv) a fyziologii (hromadné klíčení semen, zráním rostlin, nadměrným zvýšením zásobních látek - cukrů a tuků v semenech atd.) planých druhů. Některé tyto změny zapříčinily závislost rostlin na člověku (např. některé druhy ztratily schopnost generativního rozmnožování). Původní druhy a variety plodin se podle Vavilova vyskytují v centrech původu plodin (Chloupek, 2000). Mezi tyto oblasti patří zejména podhůří, např. Himaláje, Hindúkuše, Blízkého východu, Balkánu, Apenin a And. Vyznačují se silně nesourodými podmínkami prostředí, které se často mění, takže neumožňují jednostranný výběr na určité znaky. Horská pásma lze chápat jako bariéru, která vede k lokální separaci a tím umožňuje tvorbu odlišných forem v jednotlivých údolích. Horské polohy se vyznačovaly velkým kolísáním teplot a výrazným ultrafialovým zářením, což umožnilo vznik mutací a hybridů i u autogamních druhů. Centry původu (genová centra) rostlin rozumíme zeměpisná území, odkud druhy pocházejí (Bednář, 2000). Teritorium, kde se kulturní druh oddělil od planých forem označujeme termínem primární centrum původu. Pod pojem sekundární (druhotné) centrum původu rozumíme území, ve kterém proběhl nebo probíhá proces vzniku nových forem. Vavilov (1935) se domníval, že stupeň mnohotvárnosti je také ukazatelem toho, jak dlouho se která rostlina v určité oblasti pěstuje - čím déle se pěstuje tím je mnohotvárnější. V každém centru se vyvinuly nejen obiloviny, ale i další plodiny (Bednář a Vyhnánek, 2004).
15
Oblasti s maximální variabilitou uvnitř druhů se označují jako centra diverzity. Centra diverzity mohou, ale nemusí být shodná s genovými centry. Například v Etiopii se nacházejí geneticky nejrůznorodější druhy a formy rodu Triticum (pšenice), ale nebyl zde nalezen žádný z primitivních předků, a proto je pravděpodobné, že byl do Etiopie introdukován. V tomto teritoriu totiž vykazuje velkou rozmanitost celá řada plodin z Blízkého východu, jako ječmen, len, oves, hrách i pšenice (Chloupek, 2000). Genetická variabilita v rostlinných populacích nemá rovnoměrné rozložení, genotypy mají tendenci se shlukovat a vytvářet významné genetické odlišnosti na relativně krátkou vzdálenost. Tato záměrná,
avšak nepravidelná distribuce se označuje jako genetická
struktura populace. Míra variability mezi populacemi je druhově závislá. Mezi druhy existuje významná heterogenita hodnocení mezipopulační variability. Významný vliv na tuto variabilitu má evoluční historie a ekologické charakteristiky daného druhu (Čurn et al., 2002).
3.2.2 Význam a ochrana genetické diverzity Význam genetické diverzity je spatřován především v její nezastupitelné funkci při udržování ekologické stability. Je nesporné, že pěstování plodin v monokulturách (tedy v plodinách geneticky zcela uniformních) zavedené v době „zelené revoluce“ nepříznivě ovlivnilo genetickou diverzitu a kvalitu výživy po celém světě. Tímto docházelo a stále dochází ke genetické erozi, tedy ke snižování genetické diverzity zemědělských plodin. Vlivem genetické eroze dochází k vývoji a rozšiřování různých druhů a ras patogenů. Je tedy nutné si uvědomit, že intenzivní zemědělství vytváří samo o sobě podmínky pro vznik nových ras patogenů (Ho, 1998). Monokultury mají vliv nejen na vznik genetické eroze a rozšiřování patogenů, ale také takto pěstované plodiny vyžadují vysoké dávky hnojiv, vody, pesticidů a používaní těžké mechanizace, což má neblahý vliv na kvalitu životního prostředí. Dobře dokumentovaným příkladem
nedostatečné genetické variability plodin je
hladomor v Irsku, kde v roce 1846 zničila plíseň bramborová Phytophthora infestans polovinu úrody brambor, poněvadž se pěstovalo jen několik klonů (odrůd) bramboru. To vedlo ke smrti hladem jednoho až dvou milionů lidí a stejný počet se musel vystěhovat do Ameriky. Proti tomu v jihoamerických Andách, kde byl brambor domestikován nejméně před osmi tisíci lety v mnoha krajových odrůdách, taková pohroma vypuknout nemohla (Chloupek, 2000).
16
Denně z naší planety mizí asi jedno sto druhů (nejen rostlin), což je více než za poslední doby ledové (Pim et al., 1995). Tato skutečnost vede k tomu, že se ztrácejí i druhy, které by umožnily pochopit evoluci druhů a přirozeného systému rostlin, neboť vymizí také druhy, které by mohly sloužit jako „spojovací“ články. Genetická diverzita je největším a nejméně doceňovaným bohatstvím. Možnosti, které nám nabízí nejlépe ukazuje příklad divokého druhu kukuřice Zea diploperennis (Wilson, 1992). Byla objevena ve státu Jalisco. Tento planý druh odolává různým nemocem a jedná se o vytrvalou bylinu. Kdyby se podařilo přenést její geny do Zea mays, výnosy by se zřetelně u zvýšily. Proto byl také vznesen požadavek na ochranu genetické diverzity. Schopnost adaptace populace určitého druhu k environmentálním vlivům je totiž umožněna akumulací genetické proměnlivosti. Ztráta genetické diverzity se považuje za největší problém ze součastných nejzávažnějších ekologických problémů (ukládání toxických látek, znečišťování vzduchu, kyselé deště, eroze půdy, zvyšování obsahu CO2 ve vzduchu), protože je nenahraditelná (Ehrlich a Ehrlich, 1983). Genetická diverzita může být posuzována na úrovni genů (gene-pool), populace, individua, lokusu nebo sekvence bazí DNA (Kresovich a McFerson, 1992). Druhy
rostlin
byly
z hlediska
potenciálního
využití
rozděleny
(Harlan
a de Wet, 1971) na: 1. Primární gene-pool, který zahrnuje pěstované druhy a druhy příbuzné, z nichž je možné získat užitečné geny pro šlechtění. Druhy zde zařazené se dají s příbuznými kulturními druhy křížit, je možné získat generaci F1 a F2, a segregace genů po tomto křížení je převážně normální. 2. Sekundární
gene-pool,
zahrnující
druhy,
ze
kterých
lze
přenést
geny
do pěstovaných druhů, ale ne bez určitých potíží. Při křížení s pěstovanými rostlinami se sice získají semena, ale je obtížné dopěstovat rostliny F1, které často bývají sterilní, potomstvo bývá podobné jednomu z rodičů. 3. Terciární gene-pool, který zahrnuje druhy, z nichž přenos genů do pěstovaných druhů vyžaduje speciální postupy, nebo není možný. Genetické zdroje rostlin jsou reprezentovány zejména tradičními (krajovými) odrůdami, šlechtěnými odrůdami (moderní i starší, již restringované), experimentálními liniemi a i planými druhy příbuzné kulturním druhům. Uvedené genetické zdroje rostlin jsou shromažďovány v kolekcích a vytvářejí genofond zemědělských plodin. Plané druhy
17
znamenají
velmi cenný zdroj genů zejména pro rezistenci k chorobám a škůdcům
i pro snášenlivost k nepříznivým růstovým podmínkám a taktéž jiných znaků významných při šlechtění a výzkumu, poněvadž byly ve svém vývoji jejich tlaku neustále vystaveny. Ochrana genetické diverzity je uskutečňována buď v podmínkách in situ (přirozených společenstvech,
nejčastěji
v centrech
původu
rostlin
či
centrech
diverzity,
např. v národních parcích, chráněných územích), nebo ex situ (Briggs a Walter, 2001). Konzervace ex situ je uchování genetických zdrojů mimo území jejich primárního výskytu (semenná genová banka, polní genová banka, kryobanka). Podle statistik FAO je nyní takto ve světě uchováváno kolem 6 milionů položek genetických zdrojů. Je třeba poznamenat, že určitý podíl položek konzervovaný v genových bankách představují duplicity (stejné genetické zdroje v několika genových bankách), přesto je shromážděná genetická rozmanitost zemědělských plodin obrovská a neustále se doplňuje (Dotlačil, 2002). Metoda in situ vyžaduje konzervaci celého ekosystému. Jako neobvyklý způsob se používá tzv. on farm konzervace (při hospodaření na farmě), využívající krajových a tradičních odrůd, jmenované odrůdy jsou totiž výsledkem dlouhodobé vzájemné interakce prostředí i výběru. Zmíněný postup má toto působení zachovat a dát tak možnost dalšímu dynamickému vývoji jejich diverzity. Tato podoba konzervace in situ se používá u hospodářsky významných druhů, a často i odrůd ohrožených vymizením, z hlediska šlechtitelského se uplatňuje hlavně u pícnin a léčivých rostlin. V roce 1992 byla vypracována Úmluva o biologické rozmanitosti - CBD (Convention on Biological Diversity) (Rio de Janerio), kterou podepsala Česká republika v roce 1994. Ministerstvo zemědělství ČR (Mze ČR) zajišťuje v souladu s touto úmluvou domácí potřeby i mezinárodní úmluvy při uchování a využívání biodiverzity v zemědělství v rámci Národního programu konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin, zvířat a mikroorganizmů významných pro výživu, zemědělství a lesní hospodářství, který se sestává ze tří samostatných částí: •
Národní program konzervace a využívání genetických zdrojů lesních dřevin,
•
Národní
program
konzervace
a
využívání
genetických
zdrojů
rostlin
a mikroorganizmů významných pro výživu a zemědělství (se dvěma podprogramy pro genetické zdroje rostlin, agrobiodiverzitu a genetické zdroje mikroorganizmů), •
Národní program ochrany
a využití genetických zdrojů hospodářských
a užitkových zvířat, ryb a včel (Bednář a Vyhnánek, 2004).
18
Národní
program
konzervace
a
využívání
genetických
zdrojů
rostlin
agrobiodiverzity má zabezpečit uchování a soustavné využívání genetických pramenů rostlin, které se nalézají na území celé České republiky. Program koordinuje Genová banka Výzkumného ústavu rostlinné výroby Praha. Česká rada genetických zdrojů kulturních rostlin je konzultačním a konferenčním orgánem. Jejími členy jsou delegáti MZe ČR, genové banky, kurátoři kolekcí, šlechtitelé a i jiní specialisté. Genová banka Výzkumného ústavu rostlinné výroby v Praze-Ruzyni má kapacitu 100 - 120 tisíc vzorků, celkem 300 m3, jsou zde uskladněny vzorky i jiných pracovišť. Je zde uloženo 23 tisíc vzorků semen (Stehno et al., 1998), popsaných informačním systémem EVIGEZ (evidence genových zdrojů). Další genové banky v ČR: CHI Žatec - chmel, VŠÚO Holovousy ovocné stromy, Agritec Šumperk - luskoviny a technické plodiny, VÚB Havlíčkův Brod brambory, ZVÚ Kroměříž, VÚP Troubsko, atd.). V České republice je shromážděno asi 46 tisíc vzorků rostlin. Metodami genetické konzervace uskladnění jsou (Dotlačil, 1998): •
Vysušená semena na 3 - 7% vlhkosti, při nízké teplotě (až -18 °C), vhodné
pro ortodoxní semena, je to nejrozšířenější metoda. •
Ultrasuchá semena pod 3% vlhkosti, buď při pokojové teplotě, nebo nízké
teplotě, vhodné pro ortodoxní semena, metoda se teprve zkoumá. •
Kultivace rostlin v polních genových bankách, vhodná pro vegetativně
množené druhy nebo druhy s neortodoxními semeny. •
Zpomalený růst in vitro, pro vegetativně množené druhy nebo druhy
s neortodoxními semeny, často se kombinuje s jinými metodami. •
Kryoprezervace semen, pylu, pletiv, buněk, embryí aj. při -196 °C
v kapalném dusíku. •
Vysušená a zmrazená semena a pletiva.
•
Konzervace pylu.
•
Knihovny DNA, kdy se eviduje sekvence DNA, avšak takto uchovávaná
genetická diverzita, neuchovává materiální základ genetické diverzity, nýbrž jen její popis. Obecné zásady konzervace genetické diverzity spatřují Mooney a Fowler (1991) v tom, že: − zemědělská různorodost může být zajištěna pouze jen různorodými strategiemi, − genetická konzervace musí být záležitostí obecnou, nejen záležitostí odborníků,
19
− zemědělskou různorodost nelze uchovat, pakliže se nebude využívat, poněvadž hodnota různorodosti spočívá v jejím používání, − zemědělská různorodost se nedá zachránit, pokud nebudou zachráněna vesnická společenství, − potřeba různorodosti je trvalá, vždyť vyhubením každého druhu je definitivní (nedá se změnit). Následky nedostatečné genetické diverzity se projevují pouze v delším časovém horizontu. Nebezpečí omezené genetické diverzity je především spatřováno zejména ve ztrátě druhu a genetické zranitelnosti, to znamená, že nenadálý problém bude s to způsobit značné ztráty u všech odrůd určité plodiny. Dalším faktorem je omezení genetického pokroku u kvantitativních znaků při šlechtění, což je ale obtížně prokazatelné a ještě více překonatelné. Nelze zjistit, zda-li bylo u určité plodiny dosaženo výnosového maxima. Často není dosaženo vůbec žádného pokroku, ale posléze může dojít k rychlým změnám. Genetickou zranitelnost lze také zmírnit a to sice: •
Šlechtěním odrůd s větší genetickou variabilitou, tj. nepříbuzných odrůd, které pak budou méně ohroženy potenciálním problémem. Genetickou variabilitu rostlin lze rozšiřovat například křížením, mutagenezí, polyploidizací, biotechnologickými metodami (fúze buněk, selekce v buněčných kulturách). Existují mechanizmy vzniku nové genetické variability, např. transpozony. Genové interakce a epistáze, vzniklé nejen z originální, ale i de novo vzniklé diverzity, jsou patrně důležitější, než bylo možné očekávat (Rasmusson a Phillip, 1997).
•
Monitorováním chorob, škůdců i jiných možných stresů, které mohou ohrozit produktivitu rostlin a vhodným šlechtěním. Pro detekci genetické variability (diverzity) je v současné době k dispozici mnoho
metod, např. morfologická charakteristika, analýza rodokmenů, biochemické markery především bílkoviny a jejich různé izoenzymové varianty, molekulární (DNA) markery atd. Studium genetické variability pomocí morfologických znaků je dosti obtížné, důvodem je značný vliv prostředí na projev fenotypu. Z toho hlediska se jako výhodnější jeví biochemické a molekulární markery. DNA markery se také využívají v genových bankách, slouží při doplňování popisných údajů, či při odstraňování duplicit, při přemnožení genotypu (položky), při zjišťování metylací bazí, polohy a variability transpozonů.
20
3.3 Genetické markery Genetický marker (signální gen) je vysoce polymorfní znak, který vykazuje mendelistickou kodominantní dědičnost, je snadno a jednoznačně detekovatelný. Genetické markery mají buď přímý vztah k určitému znaku či vlastnosti (kvalitativní eventuálně kvantitativní), nebo jsou v genové vazbě s významným znakem či vlastností, jsou tedy lokalizovány na stejném chromozomu v takové vzdálenosti od genu, aby docházelo ke crossing-overu jen výjimečně (Vejl et al., 2002). V minulosti se jako markery pro nepřímou selekci používaly morfologické znaky, barva, charakteristiky výnosu atd. Vědecký pokrok v oblasti molekulární biologie a biochemie umožnil používání biochemických (bílkovinných nebo izoenzymových) a molekulárních (DNA) markerů, či sekvencování (tedy pořadí nukleotidů v řetězci DNA kodojucí gen) (Urban, 2006). Dříve byly v hojné míře používány genetické biochemické markery (isoenzymy byly objeveny na konci 50. let dvacátého století). Proteinové markery jsou produkty určitého lokusu, k jejich vizualizaci se používají gelové matrice po specifickém zbarvení. V součastné době se jeví jako perspektivnější DNA markery. DNA markery lze definovat specifickou strukturou určitých úseků a jsou založeny na polymorfizmu DNA, tj. variabilitě v sekvencích DNA nebo RNA (Ovesná et al., 2002). Molekulární a biochemické markery nejsou do jisté míry ovlivňovány podmínkami vnějšího prostředí a epistatickým působením. Oproti morfologickým markerům mají tyto signální geny výhody v tom, že je lze použít například poměrně velký počet alel, umožňují rozlišení homozygotů a heterozygotů, tvoří poměrně hustý rastr lokusů, rovnoměrně rozložený v genomu. Další pozitivum spočívá v eventualitě rychlého testování rozsáhlého materiálu, tento proces je nedestruktivní (pro analýzu se používá jen malá část rostlinného pletiva). Markery vypovídají o genetické podobnosti (příbuznosti) jedinců a populací. V součastné době se jeví jako perspektivnější DNA markery, které se hodnotí molekulárně genetickými metodami.
3.3.1 Bílkovinné a izoenzymové markery Proteiny či enzymy jsou primárními produkty genů a všechny z jejich aminokyselin jsou v podstatě reflexem svého genu (markerem). Různé organizmy se liší různými variantami bílkovin a tyto polymorfní proteiny se využívají pro genetické markerování.
21
Polymorfizmus je dán jednak genovými mutacemi, jedná se především o duplikace a nerovnoměrný crosing-over těchto genů (Čurn et al., 2002). V genomové analýze je důležitá volba proteinu. Pro genetické markerování na úrovni druhu a níže jsou výhodné evolučně mladší bílkoviny, hlavně zásobní bílkoviny a některé enzymové systémy (Bednář a Vyhnánek, 2004). Různé organizmy se liší rozdílnými variantami bílkovin. Jednu z kategorií bílkovin používaných jako genetické markery tvoří zásobní bílkoviny. Zde se nejvíce uplatňují proteiny endospermu. Zásobní bílkoviny endospermu se dělí podle rozpustnosti (Osborne, 1907): a) Albuminy - voda b) Globuliny - solné roztoky c) Prolaminy – 60 - 80% vodný roztok alkoholu Terminologie je většinou odvozena od latinského názvu př. hordeiny (ječmen), zeiny (kukuřice), výjimkou jsou např. gliadiny (pšenice). d) Gluteliny - zředěné kyseliny a zásady Prolaminy a gluteliny, základní stavební částice lepku, jsou skupiny bohaté na aminokyselinu prolin a kyselinu glutamovou, ovšem mají nízký obsah lyzinu a ostatních esenciálních aminokyselin. Při rozpouštění glutelinů v redukčním prostředí dochází k rozpadu S-S vazeb a vznikají stavební podjednotky dvojího typu - jednak vysokomolekulární (HMW - hight molecular weight) s molekulovou hmotností okolo 100 tisíc Daltonů a nízkomolekulární (LMW - low molecular weight) s molekulovou hmotností cca 40 tisíc Daltonů. Gluteninové bílkoviny se vyznačují nižším stupněm polymorfizmu v porovnání s prolaminovými bílkovinami, což je dáno nižším počtem determinujících lokusů (Šašekl et al, 1998). Z funkčního hlediska se proteiny endospermu dělí na (Bednář a Vyhnánek, 2004): a) metabolické - enzymatické bílkoviny účastnící se metabolických procesů, b) zásobní - bílkoviny tvořící pool (zdroj) aminokyselin pro syntézu nových bílkovin pro klíčení, c) strukturní (protoplazmatické) - bílkoviny které spolu s polysacharidy a lipidy vytvářejí buněčné membrány endospermu. Druhou skupinou
genetických biochemických markerů jsou izoenzymy. Tyto
markery se diferencují svým izoelektrickým bodem, čehož se využívá k jejich identifikaci. Jejich výskyt je někdy ovlivňován vývojovým stádiem rostliny. Molekulární
příčiny
polymorfizmu enzymů jsou viděny hlavně v genetické nezávislosti proteinů, které jsou
22
kódovány samostatnými geny (např. izoenzymy malátdehydrogenázy - jedna forma se nachází v cytosolu, druhá v mitochondriích), dále v polymerických izoenzymových systémech (laktátdehydrogenáza), ve kterých jsou podjednotky kódovány více než jedním lokusem i v izoenzymech kódovaných alelickými geny, posttranslačních kombinacích proteinu s jinými molekulami nebo v částečné proteolýze původního polypeptidu, eventuálně v různých konformačních úpravách stejného proteinu (Bednář, 2000). Výhodnost
geneticky
polymorfních
bílkovin
Sozinov
a
Poperelja
(1979)
charakterizovali: 1. Představují
primární
genové
produkty,
vyznačují
se
nižší
fenotypovou
a epigenetickou proměnlivostí, vyšší dědivostí. 2. Jsou unikátním produktem odpovídajících genových soustav, vyjadřují specifičnost genotypu v důsledku vazby bílkovinných a dalších genů, podmiňující celkový genotyp. 3. Vyznačují se kodominantní dědičností. 4. Často se bílkovinné geny dědí vázány na sebe do bílkovinných genů (klasterů), uvnitř prakticky nedochází ke crossing-overu, k rekombinacím.V těchto případech nevystupuje jako genetický marker jeden gen, ale skupina, blok bílkovinných komponentů, které se však chovají jako monogenně podmíněné mendelistické jednotky. 5. Příbuzné bílkovinné geny tvořící klaster jsou polymorfní v důsledku nejen odlišné genetické struktury jednotlivých cistronů, tedy vytváření různých alelických variant, ale i v důsledku odlišného počtu alel, alelických variací. Výsledkem spolupůsobení je výjimečně vysoká úroveň polymorfizmu bílkovinných genů a jim odpovídajících bílkovin. 6. Vysoký alelomorfizmus bílkovinných klasterů umožňuje markerovat, vyjadřovat proměnlivost vázaných hospodářských vlastností. Při detekci proteinových markerů se nejdříve rozpustí bílkoviny ve vhodném pufru při určitém pH a oddělí se od sebe na gelové matrici elektrickým proudem - jedná se tedy o elektroforézu, která je založena pohyblivosti makromolekul v elektrické poli. Jako elektroforetický nosič se používá škrobový (starch gel electrophoresis, SGE) nebo polyakrylamidový gel (polyacrylamide gel elektrophoresis, PAGE), který působí také jako filtr pro určitou velikost molekul, menší molekuly prostupují gelem rychleji než větší.
23
Vzhledem k odlišnému elektrickému náboji se pohybují různé proteiny různě rychle, což směřuje k jejich dělení, po určité době dospějí k specifické poloze v gelu. Proteinové markery se používají zejména k (Čurn et al., 2002): •
Hodnocení genetické variability.
•
Charakteristice odrůd při registračním řízení, což zvyšuje přesnost odlišitelnosti a homogenity.
•
Identifikaci izolátů patogena.
•
Stanovení podílu cizoopylení.
•
Výběru podle markerovacích genů, např. na rezistenci k virozám.
•
Přezkoumání introgrese genů příbuzných planých druhů nebo primitivních forem.
3.3.2 DNA markery V současnosti se hojně využívají DNA markery, které jsou oproti bílkovinným markerům více variabilní a mohou charakterizovat celý genom. DNA markery jsou molekuly, které označují existenci určitého genu a jim podmíněného znaku ve studovaném genotypu. Molekulární markery podávají informace o organizmu získané na základě analýzy jeho molekul DNA, pro takovéto rozbory se vybírají náhodně anebo cíleně. Genetická informace může být uložena v jádře, mitochondriích i chloroplastech. DNA markery jsou založeny na polymorfizmu, tedy variabilitě v sekvencích DNA eventuálně RNA. Kolektivním znakem molekulárních markerů je bezprostřední schopnost detekce alelických variant v sekvenci nukleotidů. Jako DNA markery mohou být použity jen ty sekvence, které mají následující vlastnosti (Řepková a Relichová, 2001): •
vysoký polymorfizmus,
•
nejlépe kodominantní charakter dědičnosti,
•
častý výskyt v genomu,
•
nezávislost na podmínkách prostředí,
•
snadné a rychlé testování,
•
vysoká reprodukovatelnost. Tanksley (1983) charakterizuje DNA markery následovně:
1. Jsou aplikovatelné u všech organizmů, kde je ovládnuta technika izolace DNA.
24
2. Jsou nezávislé na podmínkách prostředí. 3. Jejich počet je téměř bezmezný. 4. DNA markery lze používat i při minimálním kvantu biologického materiálu a jsou nedestruktivní. 5. DNA markery se používají k charakterizaci velmi raných ontogenetických stadií rostlin. Nedostatky jsou spatřovány v tom, že není možné najít marker, který by splňoval všechna tato kriteria. Z této skutečnosti plyne, že je nutné zvolit takový typ markeru, který bude nejlépe vyhovovat předmětu studia.
3.3.3 Rozdělení DNA markerů Molekulární markery lze dělit z několika hledisek. Řepková a Relichová (2001) dělí DNA markery z hlediska použité metody na markery založené na hybridizaci DNA a na markery založené na polymerázové řetězové reakci. V první skupině markerů se DNA profily vizualizují prostřednictvím hybridizace fragmentů DNA, štěpené restrikčním enzymem, se značenou sondou. DNA sonda je fragment DNA známého původu a sekvence. Markery založené na polymerázové řetězové reakci - PCR (Polymerase Chain Reaction) jsou založené na in vitro amplifikaci určitých sekvencí DNA nebo lokusů prostřednictvím specifických i nespecifických primerů (nukleotidových sekvencí) za účasti termostabilního enzymu DNA polymerázy. Amplifikované fragmenty se separují elektroforeticky. Princip elektroforetické separace spočívá v pohyblivosti negativně nabitých nukleových kyselin v elektrickém poli v neutrálním pH. Elektroforetická mobilita DNA fragmentů je závislá na velikosti oligonukleotidů (bp) a nezávislá na sekvenci bazí. DNA fragmenty lze separovat pomocí agarozové gelové elektroforézy, polyakrylamidové gelové elektroforézy a agarózo-akrylamidové elektroforézy (Saeley a Southern, 1990). Kvalitu a rychlost elektroforézy ovlivňuje vzdálenost obou elektroforetických elektrod, tloušťka gelu, množství a iontová síla používaného elektroforetického prostředí (pufru). DNA spektra jsou detekována po obarvení (např. ethidiumbromidem) nebo autoradiograficky. Ethidiumbromid je vázán do řetězce DNA a je aplikován v gelu v elektroforetickém pufru v barvicím roztoku (Vejl, 1998).
25
Metody založené na hybridizaci DNA Mezi tyto metody patří RFLP (Restricition Fragment Lenght Polymorphism). Metoda je založena na změnách v sekvencích DNA, ke kterým docházelo během evoluce. Transformace způsobují bodové mutace v místech štěpení restrikčními enzymy, inzerce nebo delece, mohou být důsledkem nerovnoměrného crossing-overu v rámci určitého chromozomu. Při analýze je DNA specificky štěpena na fragmenty restrikčním enzymem. Získané fragmenty elektroforeticky rozdělí (délkové rozdělení), následuje přenos na membránu a vizualizace hybridizací značenou sondou (Southern blotting). Variabilita v inzercích, delecích popřípadě mutacích se projevuje v restrikčním místě. Metody založené na PCR Polymerázová řetězová reakce - PCR (Polymerase Chain Reaction) (obr. 3) byla patentována v roce 1987 Müllisem v USA (Vyhnánek, 2005). Způsobila naprostou revoluci ve světě molekulární biologie. Jedná se o metodu syntézy nukleových kyselin v podmínkách in vitro. Replikují se určité segmenty původní templátové DNA. Standardní PCR se provádí za použití dvou primerů o známých sekvencích určujících délku a sekvenci amplifikovaných fragmentů. Primery hybridizují pouze s komplementárními místy, dochází tedy pouze k množení těch sekvencí, které se nalézají mezi těmito dvěma komplementárními místy. Růst nových řetězců se děje prostřednictvím prodlužování primerů účinkem termostabilní DNA polymerázy. Namnožení fragmentů o konkrétní délce je rozděleno do tří základních kroků: 1. Denaturace - dochází k zahřátí roztoku na teplotu 94 – 95 °C , což způsobí denaturaci molekul DNA. Rozštěpí se vodíkové můstky a vznikají jednořetězcové DNA (ssDNA), v buňkách rozplétají dvoušroubovici speciální enzymy (heliázy, topoizomerázy). 2. Annealing (nasedání primerů) - annealační teplota se pohybuje v dosti širokém intervalu (55 – 75 °C), respektive 37 °C podle modifikace metody (Vejl et al., 2002) což umožní vytvoření krátkého dvouřetězcového úseku s volnou 3´hydroxylovou skupinu, v této fázi dochází k nasednutí primerů. Primer je krátký úsek DNA, fragment, o kterém se předpokládá, že je komplementární k určitým oblastem templátové DNA (Vejl, 1997). 3. Elongace (prodlužování řetězce) - zahřátím templátové DNA s navázanými primery na optimální teplotu pro průběh enzymatické reakce termostabilní DNA
26
polymerázy.
Tato
enzymatická
reakce
umožní
zabudování
volných
nukleozidtrifosfátů na bázi templátu do nově vznikajícího řetězce DNA. Amplifikace specifických lokusů - SPLAT (Specific Polymorphic Locus Amplification Test), synonymum pro tento postup je STS marker (Single Tagged Site). Jedná se o standardní PCR, kdy prostřednictvím páru specifických primerů je amplifikován specifický fragment - lokus. Výhody metody spočívají v poměrně velké rychlosti analýz, v nepoužívaní
radioizotopů.
Nevýhoda
spočívá
v obtížném
získávání
správných
sekvencích primerů (Gale a Witcomb, 1992). Při detekci variability DNA metodou SSR (Simple Sequence Repeats) jsou jako molekulární markery použity sekvence mikrosatelitů. Při markerování nejsou detekovány konkrétní strukturní geny, ale opakující se motivy, které vykazují těsnou vazbu s určitými geny. Mikrosatelity jsou tvořeny mnohokrát se opakujícími tandemovými jednotkami, tvořenými 1 až 10 páry bazí jako je např. (TG)n nebo (AAT)n (Bruford a Wayne, 1993). Metoda SSR využívá buď značený pár primerů, nebo jeden z primerů označený radioaktivně nebo flourescenčně (Ovesná et al., 2002). Pro detekci minisatelitů při „fingerprintingu“ je běžně využívána digesce (rozpouštění za vyšší teploty) genomové DNA a hybridizace se značenou sondou. Obvykle se polymorfní místa nalézají v nekódujících oblastech, protože by zasahovala do čtecího rámce odpovídajícího bílkovinného produktu. SSR markery jsou hojně využívány pro jejich množství, kodominatní charakter, vysoký polymorfizmus a pro jednoduchost analýz prostřednictvím PCR (Kuleug et al., 2004). Pro analýzu SSR markerů lze využít metodu multiplex PCR, která umožňuje amplifikaci dvou a více markerů v jedné reakci. Délkový polymorfizmus amplifikovaných fragmentů AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) se zakládá na selekci restrikčních fragmentů genomové DNA pomocí PCR amplifikace. Metoda skýtá velké množství polymorfních markerů vykazujících kodominanci. AFLP je metoda využívající jeden pár primerů. Metoda RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) je založena na cyklické amplifikaci DNA fragmentů při použití jednoho oligonukleotidu (8 - 10 nukleotidů) s náhodně vybranou sekvencí bazí. Pro průběh reakce je důležitá přítomnost genomové DNA, směsi nukleotidů dNTP, reakčního pufru a termostabilní DNA polymerázy. Celá reakce se odehrává v programovatelném termocykleru (obr. 4), tak jako u jiných metod založených na PCR. Polymorfizmus vzniká na základě mutací nebo přeskupení buď přímo
27
ve vazebných místech primerů nebo mezi nimi a nejčastěji jsou detekovány jako prezence nebo absence amplifikačního produktu. To znamená, že produkty RAPD se obecně chovají jako dominantní markery (Gale a Witcomb, 1992). Metoda se často používá pro tzv. „fingerprinting“ - genomový otisk. Modifikace techniky RAPD markerů představuje metodu RAMPO (Random Amplified Microsatellite Polymorphism) a DAF (DNA Amplification Fingerprinting), kdy genomová DNA je amplifikována pomocí jednoho nebo dvou náhodných primerů (cca 5 nukleotidů), při jejichž použití získáme mnohem větší polymorfizmus. Principem markerů CAPS (Cleaved Amplified Polymorphism Sequnces) je restrikční štěpení endonukleázami (Řepková a Relichová, 2001). Prvním stádiem je provedení polymerázové řetězové rakce specifické pro určité sekvence. Produkt amplifikace má stejnou délku fragmentů u různých ekopypů, z toho plyne, že polymorfizmus se může projevit po štěpení enzymem restriktázou , pakliže markery ohraničují polymorfní restrikční místo. SCAR (Sequence Characterised Amplified Regions) používá polymorfní RAPD marker, který je klonován a sekvencován. K determinaci nových primerů se používá 22 – 24 nukleotidů pro amplifikaci určitého lokusu. Tyto markery jsou lépe reprodukovatelné nežli markery RAPD.
3.4
Uplatnění biochemických markerů při studiu genetické diverzity u obilovin Bílkovinné a izoenzymové markery poskytují řadu markerů ke studiu genetické
variability. Izoenzymy jsou především používány k odhadu úrovně variability mezi populacemi. Jako měřítko variability mezi populacemi se nejčastěji používá procento polymorfních lokusů, počet alel na lokus, efektivní počet alel na lokus, průměrný podíl lokusů jedince. Genetická diverzita se také posuzuje na základě polymorfizmu zásobních bílkovin obilky.
Velmi vhodné je použití prolaminových bílkovin. Tyto jsou charakteristické
rozpustností v alkoholu a vysokou molekulovou hmotností. Byly stanoveny například u pšenice (T. monococcum, T. spelta a T. aestivum), ječmene (H. vulgare) a tritikale (Metakovsky, 1991). Oproti izoenzymům se vyznačují menší závislostí na podmínkách vnějšího prostředí a nezávislostí na ontogenetickém stadiu rostliny (Koch, 1998). Ponejvíce
je
využívána
metodika
pro
elektroforetickou
analýzu
vertikální
28
polyakrylamidové elektroforézy PAGE ISTA, která byla doporučena
mezinárodní
organizací ISTA (International Seed Testing Association) a která probíhá analogicky jako A-PAGE v kyselém prostředí. Obdobnou možností je SDS-PAGE probíhající za přítomnosti dodelcylsíranu sodného pro detekci podjednotek gluteinů s vysokou molekulovou hmotností u pšenice (Černý a Šašek, 1996). Carvalho et al. (1996) zjistili neaditivní efekt alkalické fosfatázy a glukoso-6-fosfo isomerázy u tritikale. Nativní-PAGE
detekovali Singh a Singh (2001) u tritikale
analogickou aktivitu systému Rubisco jako je u pšenice. Izoenzymy jsou pro analýzy méně výhodné z důvodů již výše uvedených. Proto se zde ponejvíce uplatňují metody A-PAGE a SDS-PAGE pro separaci prolaminových (gliadiny, sekaliny) bílkovin a gluteninových podjednotek s vysokou molekulovou hmotnosti (VMH). Byly již publikovány některé práce, které se specializují na využití zásobních bílkovin pro studium genetické diverzity genotypů tritikale (Gonzales et al., 1996; Seo a Hong, 1998; Yang et al., 2000). Igrejas et al. (1999) provedli u tritikale lokalizaci genů pomocí SDS-PAGE pro prolaminové bílkoviny a gluteninové podjednotky s VMH v lokusech Gli A1, Gli B1, Gli R2, Glu A1, Glu B1, Glu R1, Glu A3, Glu B3 a Glu B2.
3.5 Využití molekulárních markerů obilovin pro studium genetické variability obilovin RFLP markery byly počátečním typem markerů, které byly použity pro studium genetické diverzity u rostlin. S úspěchem byly použity u ječmene, kukuřice a pšenice. Metoda se používá od počátku 80. let. Jde o techniku spolehlivou, reproducibilní. Její nevýhoda spočívá ve vysoké náročnosti na zkušenost pracovníků, kvalitu DNA, připravené z analyzovaného materiálu. Kato et al. (2000) pomocí RFLP provedli anylýzu u 118 jednoduchých rekombinantních linií pšenice odvozených z křížení Chinese Spring obsahující 5A chromozom Triticum aestivum a Triticum spelta. Na 5A chromozomu je lokalizováno mnoho genů důležitých pro adaptabilitu a produktivitu. Klady RAPD je možno vidět v jednoduchosti, cenové dostupnosti a rychlosti. Pomocí ní lze analyzovat jakýkoliv organizmus a není třeba mít předběžné znalosti o jeho genomu. Nevýhoda je nízká opakovatelnost mezi různými laboratořemi. Techniku RAPD k mapování genů rezistence u pšenice aplikovali např. Ban et al. (2000) u fuzarióz, Salman et al. (2000) u rzi pšeničné a Chen et al. (2003) při mapování variability genu Yr5. Zhong a Goodwin (2000) užili metodu RAPD k mapování rezistence u pšenice proti
29
Mycospharella graminicola. Pomocí RAPD markerů Guo et al. (2000) detekovali Rht geny ovlivňující výšku rostlin a tím náchylnost k poléhání. RAPD markery pro rozlišení genotypů tritikale pěstovaných v Polsku využil Masojć (1999). Dnes dochází ve větší míře k uplatnění především metod SSR a AFLP apod. Aplikace DNA markerů u tritikale není ještě rozšířena, tak jak u jiných plodin např. pšenice, ječmen, atd. Vzhledem k tomu, že tritikale je amfiploid vzniklý křížením pšenice s žitem, lze jeho genom analyzovat pomocí metod detekce polymorfizmu DNA využitelných u pšenice. Použitelností SSR markerů pšenice, žita u tritikale se zabývali např. Kuleug et al. (2004), kteří potvrdili přesnost 58% pšeničných a 39% žitných SSR markerů na tritikale. Mapováním genetické diverzity tritikale pomocí SSR markerů se věnovali Tams et al. (2004) a Garg et al. (2001). Garg et al. (2001) srovnávali využitelnost metod SSR, RAPD a AFLP pro detekci variability a diverzity. Metodu detekce variability mikrosatelitů vyhodnotili jako nejlepší před metodou RAPD a na třetím místě byla metoda AFLP.
30
4 ZÁVĚR
Tritikale (XTriticosecale Wittmack.) je amfiploid vzniklý z křížení mezi pšenicí (Triticum ssp.) a žitem (Secale cereale) a je znám více než 100 let. Současné pěstované odrůdy tritikale jsou sekundární hexaploidní formy (2n = 6x = 42, genom AABBRR). Přednostmi tritikale je srovnatelná výnosová schopnost, lepší zdravotní stav (odolnost ke rzi pšeničné, padlí, virózám a chorobám pat stébel), vyšší krmná kvalita, lepší adaptace na horší agroklimatické a půdní podmínky jako u pšenice v horších klimatických podmínkách. V posledních letech dochází k významnému nárůstu pěstebních ploch tritikale jak v České republice, tak i v okolních státech EU (jedná se především o Polsko a Německo). Tato skutečnost a některé nedostatky tritikale vedou k další šlechtitelské činnosti zaměřené především na zlepšení některých agronomicky a hospodářsky významných znaků a vlastností. Moderní šlechtitelské postupy se již neobejdou bez nových přístupů, mezi ně se řadí i metody molekulární genetiky. Genetické mapování a studium genetické diverzity má nejen teoretický, ale i praktický význam. Efektivním využitím genových zdrojů kulturních plodin, které jsou uchovávány předvším v genových bankách, ve šlechtitelském procesu (tedy
uplatněním genetické variability a diverzity) lze předejít značným výnosovým
ztrátám, které jsou způsobeny především rozvojem nových ras patogenních organizmů. Využívaní genetické variability zemědělských plodin ve větší míře omezuje používání pesticidů, hnojiv a regulátorů růstu, což má především značný význam pro zlepšování kvality životního prostředí. Dalšími možnostmi jak zvyšovat biologický potenciál rostlin jsou genové manipulace. Vzájemné propojení genových manipulací a především DNA markerů může v budoucnu vést k vývoji skutečně cenných genotypů. Z těchto důvodů můžeme tedy usuzovat, že studium genetické diverzity má značný význam především pro budoucnost. Významným nástrojem pro mapování genetické diverzity a variability jsou bílkovinné a DNA markery. Detekce polymorfizmu zásobních bílkovin zrna je méně náročná na materiálové a přístrojové vybavení, vzhledem k těmto aspektům je tato metoda výhodnější oproti molekulárním markerům. V současnosti se více uplatňují DNA markery a to hlavně proto, že mohou charakterizovat celý genom. V rámci zpracování bakalářské práce jsem si prakticky vyzkoušela elektroforetickou analýzu zásobních bílkovin obilky metodou PAGE ISTA a detekci polymorfizmu DNA pomocí SSR markerů (obr. 5)
31
Účelem bylo získání praktických zkušeností s metodami molekulární biologie založených na principu PCR. Tyto poznatky a zkušenosti hodlám využít v navazující diplomové práci.
32
5 SEZNAM POUŽITÝCH PRAMENŮ
ADÁMKOVÁ, V. Genetická variabilita – mutace [online]. c2006, [cit. 2006-12-04]. Dostupné z: <www.jcu.cz>.
BAN, T. Analysis of quantitative trait loci associated with resistance to Fusarium head flight cause by Fusarium graminearum and resistance mechanismus in wheat (Triticum aestivum L.). Breed. Sci., 2000, vol. 50, no. 2, p.131-137.
BEDNÁŘ, J., VYHNÁNEK, T. Genetika rostlin. Brno: MZLU Brno, 2004. 144 p.
BEDNÁŘ, J. Vybrané kapitoly z genetiky rostlin. Brno: MZLU Brno, 2000. 124 p.
BRIGGS, D., WALTERS, S. M. Proměnlivost a evoluce rostlin. Olomouc: Univerzita Palackého v Olomouci, 2001. 531 p.
BRUFORD, M.W., WAYNE, R.K. Microsatellites and their application to population genetic studies. Curr. Opin. Genet. Develop. 2003, no. 3, p. 939-943.
BUREŠOVÁ, I., MARTINEK, P., Pekařská kvalita tritikale s HMW podjednotkou GluD1 5+10. In Sborník Nové poznatky z genetiky a šĺachtenia polnohospodárský rostlin. Piešťany: VÚRV Piešťany, 2005, p. 105-109.
CARVAHLO, V., VIEGAS, W., GUEDES PINTO, H., DARVEY, N., CARDINE, V. P. Intergenomic interaction in wheat X rye hybrids non-additive expression of gliadin and isozymes. Proceeding Triticale: today and tomorrow, 1996, p. 149-154.
ČERNÝ, J., ŠAŠEK, A. Bílkovinné a signální geny pšenice obecné. Praha: ÚZPI. 1996. 62 p.
33
ČURN, V., DOLANSKÁ, L. a ENDRYCHOVÁ, V. Využití biochemických markerů v genetice a šlechtění rostlin – metody, aplikace. In Sborník přednášek Využití molekulárních markeru v biologii, šlechtění a uchování genových zdrojů rostlin. Šumperk: Agritec, a.s., 2002, p. 5 -14.
DOTLAČIL, L. Genetické zdroje a jejich význam pro šlechtění rostlin a setrvalý rozvoj zemědělství. In Sborník Genofond zemědělských plodin a jeho využití pro rozšíření agrobiodiverzity. Výzk. ústav rostl. výroby Praha – Ruzyně [online]. 4. června 2002, [cit. 2006-04-213]. Dostupné z:
.
DOTLAČIL, L. Metody konzervace genetických zdrojů rostlin a možnosti jejich využití. In Metody konzervace genofondu rostlin a možnosti využití jejich využití v ČR. Praha: Výzk. ústav rost. výroby Praha – Ruzyně. 1998, p. 22-32.
EHRICH, P., EHRLICH, A. Extinction: The causes and consequens of the dissapearance of species. Ballantine, New York, 1983.
GALE, M.D., WITCOMBE, J.R. DNA markers and marker mediated applications in plant breeding, with particular reference to pearl millet breeding.1992. In Moss, J.P. (ed.) Biotechnology and crop improvement in Asia, India, Patencheru, 1992, p. 323-332.
GARG, M., SINGH, S., SINGH, B., SINGH, K., DHALIWAL, H. S. Estimates of genetic similarities and DNA fingerpriting of wheats (Triticum species) and triticale cultivars using molecular markers. Indian J. Agric. Sci. 2001, no.71, p. 438-433.
GONZALES, J. M., FUERTES, A., JOUVE, N., BERNARD, S., GUEDES PINTO, H., DARVEY, N., CARDINE, V. P. Endosperm proteins of androgenic double haploid lines of 6x-triticale. Proceeding Trtiticale: today and tomorrow, 1996, p. 383-389.
GUO, B. H., ZHANG, Y. M., LI, H. J., WANG, Z. N:, SHI, Y. S., GUO, S. T. Studies on RAPD marker linked to Rht gene in wheat (Triticum aestivum L.). Acta-AgcriculturalBoreali-Sinica, 2000, vol. 15, no. 1, p. 7-11.
34
HARLAN, J.R. Crops and man. American Societly of Agronomy. Madison, Wisconsin, 1975.
HÄRTEL, H. Biologické principy ochrany přírody - sylabus přednášek 2003 [online]. c2006, [cit. 2006-15-04]. Dostupné z: .
HO, M. W. Genetické inženýrství. Hrozba či naděje?. Praha: Alternativa,1998. 300 p.
HRAŠKA, Š. et al . Špeciálná genetika poľnohospodárských rastlín. Bratislava: Príroda. 1989. 210 p.
CHEN, X., SORIAN, M., YAN, G., SUN, J., PUBROVSKY, J. Development of sequencetagged site and amplifield polymorfism sequence markers of wheat stripe rust rezistance gene Yr5. Crop-Breeding-genetics-and-cytology, 2003, no. 43, p. 4-8.
CHLOUPEK, O. Genetická diverzita, šlechtění a semenářství. Praha: Academia, 2000. 311 p.
IGREJAS, G., GUEDES PINTO, H., CARDINE, V., BRANLARD, G. Seed storage protein diversity in triticale varietes commonly grown in Portugal. Plan. Bree., 1999, vol. 118, no. 4, p. 303-306.
KATO, K., MIURA, H., SAWADA, S. Mapping QTL controlling braun yield and its componennts of chromosome 5A of wheat. Theoretical-and-Appied-Genetics, 2000, vol. 101, no. 7, p. 1114-1121.
KISS, A. Neue Richtung in der Triticale – Züchtung. Z. Pflanzenzücht. 1966, no. 55, p.309-329.
KOCH, G. Proc. Symposium On The Utilisation of Genetic Redources. Gatersleben. 1998, vol. 1997, p. 49-54.
35
KRESOVICH, S., McFERSON, J.R. Assessment and mamagenent of plant genetic diversity – considerations of intraspecific and intrspecific variacion. Field crops Research.1992, no. 29, p. 185-204.
KROLOW, K. D. Untersuchungen über die Kreuzbarkeit zwischen Wienzen und Rogen. Z. Pflanzenzücht. 1970. no. 64, p. 44-72.
KUDRNA, K. et al. Naučný slovník zemědělský (t – n) sv. 11. Praha: ÚZPT Praha, 1987. 176 p.
KULEUG, C., BAENZINGER, P.S., DWEIKAT, I. Trasferability of SSR markers among wheat, rey and triticale. Theor. Appl. Genet. 2004, no. 108, p. 1147-1150.
MACHÁŇ, F. Genetika a šlechtění tritikale. Praha: ÚVTIZ. 1989. 80 p.
MASOJĆ, P. Identyfikacia odmian pszenzyta przy uzyciu markerów RAPD. Proceeding Hodowla, uprawy i wykorzystanie pszenzyta. Poland: Miedzyzdroje, 1999. 37 p.
METAKOVSKY, E.V. Gliadin allene identification in common wheat. II. Cataloque alleles in common wheat. Journal-Genetisc-and-Breeding. 1991, no. 45, p. 325-344.
MOONEY, P., FLOWER, C. Die Saat des Hungeres. Rowohlt. 1991, p. 293.
OSBORNE, T. B. The proteins of barley. J. Amer. Chem.Sci. 1985, no. 17, p. 539-567.
OVESNÁ, J., RULCOVÁ, J., POLÁKOVÁ, K., KUČERA, L., LEIŠOVÁ, L. DNA markery – součastnost a perspektiva. In Sborník přednášek Využití molekulárních markeru v biologii, šlechtění a uchování genových zdrojů rostlin. Šumperk: Agritec, a.s., 2002, p. 514.
PETR, I., et al. Tritikale. Praha: VŠZ Praha, 1991. 170 p.
36
PIM, S.L., RUSSEL, G.J., GITTELMAN J.L., BROOKS, T. M. The future of biodiversity. Science. 1995, no. 269, p. 347-349.
PISAREV, V. Different approaches in triticale breeding. Proc. Wheat Genet. Symp. 1963, Lund. Hereditas. 1966, no. 2, p. 279-290.
RASSMUSON, D.C., PHILLIPS, R.L. Plant breeding progress and genetic divesity from de novo variatoin and elevated epistasis. Cro. Sci. 1997, no. 37, p.303-310.
ŘEPKOVÁ, J., RELICHOVÁ, J. Genetika rostlin. Brno: MU Brno, 2001. 269 p.
SALMAN, S., OZQEN, M., SAYAR, M. T., BARNA, B., KIRALY, Z. Isolation disease (Puccinia ssp.) resistance markers from wheat near isogenic lines using RAPD and NBS/LRR primers. Acta-Phytophatologia-et-Entomologia-Hungarica, 2001, vol. 35, no. 4, p. 81-90.
SEALEY, P. G., SOUTHERN, E. M. Gel elektrophresis of DNA. In. Rickoword, D., Hames, B. D. (ed). Gel elektroforesis of nuclecs acid – a practical approach. Oxford University Press Oxford, New York, Tokyo, 1990, p. 51-59.
SEO, Y. W., HONG, B. H. Electrophoretic and immunological evalution of secalin in rye, triticale, and wheat-rye translocation wheat. Korean-Journal-of-Crop-Science, 1998, vol. 43, no 4, p. 228-233.
SOZINOV, A., POPERELJA, F.A. Polimorfizm prolaminov i selekcija. Vest. S.-ch. Nauki, 1979, no. 10. p. 21-34.
STEHNO, Z., BAREŠ, I., FABEROVÁ, I. Deset let činnosti Národní genové banky ve VÚRV Praha-Ruzyně. In Metody konzervace genofondu rostlin a možnosti jejich využití v ČR. Praha: Výzk. ústav rost. výroby Praha-Ruzyně.1998. p. 13-21.
ŠTOLCOVÁ, M. Základy pěstování tritikale. Praha: Institut výchovy a vzdělání, 1994. 39 p.
37
TAMS, S., BAUER, E., OETTLER, G., MELCHINGER, A. E. Genetic diversity in European winter triticale determined whit SSR markers and coancestry coeffient. Theor. Appl. Genet. 2004, no. 108, p. 1385-1391.
TANKSLEY, S. D. Molecular marker plant breeding. Plant-Molecular-Biology-Reporter, 1983, no. 1, p. 3-8.
ÚKZUZ - Databáze odrůd na internetu [online]. Brno: ÚKZUZ - odbor odrůdového zkušebnictví, c2003, poslední revize 28.2.2006 [cit. 2006-03-03]. Dostupné z: <www. ukzuz.cz>.
URBAN, T. Virtuální svět genetiky [online]. c2006, [cit. 2006-03-16]. Dostupné z: <www.old.mendelu.cz>.
VAVILOV, N.L. Botaniko-geografičeskej osnovy selekciji. In Teoretičeskije osnovy selekciji M-L. 1935, no. 2, p. 17-24.
VEJL, P. Polymerázová řetězová reakce. Praha: ČSU Praha, 1997. 64 p.
VEJL, P. Využití genetických markerů pro tvorbu dihaploidní pšenice obecné (Triticum aestivum L.). Doktorandská disertační práce, Praha: ČSU Praha, 1998. 334 p.
VEJL, P., SKUPINOVÁ, S., SEDLÁK, P., BARDOVÁ, M. Analýzy rostlinného genomu. Praha: ČSU Praha, 2002. 238 p.
VIERSTRAETE, A. Principle of the PCR [online]. 7. November 1999, 08-11-199 [cit. 2005-04-28]. Dostupné z: .
VYHNÁNEK, T. Molekulární markery. Přednáška. 2005. (in print).
38
WILSON, E.O. Rozmanitost života. Umožní poznání zákonů biodiverzity její záchranu?. Praha: Nakladatelství lidové noviny, 1992. 425 p.
YANG, Z. J., LI, G. R., REN, Z. L. Identification of amphiploid between Triticum durum cv. Ailanmai native to Sichuan, China and Secale africanum. Wheat-Information-Service, 2000, no. 91, p. 20-24.
ZHONG, G., GOODWIN, S. B. Enzyme polymorphism isolates of Mycospharella graminicola. Acta-of-Purdue-University, Lafacylte, 2000, no. 9, p. 9-11.
ZIMOLKA, J. et al. Speciální produkce rostlinná – rostlinná výroba (Polní a zahradní plodiny, základy pícninářství). Brno: MZLU Brno. 2000. 245 p.
39
6 PŘÍLOHY
