18th INTERNATIONAL BIOLOGY OLYMPIAD JULY 15 - 22, 2007
PRAKTICKÉ CVIČENIE 3 Bunková biológia / Biochémia Úloha A.
Analýza tiokyanátov v karfiole
27 bodov
Úloha B.
Určenie množstva karfiolu, potrebného aby po konzumácii bol toxický
5 bodov
Regulácia génovej expresie
18 bodov
Úloha C.
Čas: 90 minút Píšte odpovede do týchto hárkov
Napíšte kód do tabuľky a na každý vrch strany týchto hárkov
Kód študenta:
Cell Biology/Biotechnology Lab Exam
STUDENT CODE: _______________
2
Úvod Čeľaď kapustovité obsahuje skupinu obsahových látok známych pod menom glukozinoláty. Niektoré glukozinoláty ako glukorafanín majú žiadané medicínske vlastnosti pri prevencii rakoviny, ale z niektorých ako glukozinalbín sa vytvárajú toxické metabolity. Jedným z produktov toxického glukozinolátu je tiokyanátový ión (SCN-). SCN vplýva na metabolizmus jódu a spôsobuje nedostatok tyroidného hormónu. Konzumácia kapustovitých rastlín ako je karfiol môže viesť k produkcii limitovaného množstva tiokyanátu z glukozinolátov ako napríklad glukozinalbín. Glukozinalbinát glukorafanín je metabolizovaný na sulforafán. Sulforafán indukuje 2 fázu proteínov. Dôsledkom indukcie 2 fázy proteínov je zvyšujúca sa schopnosť buniek viazať voľné radikály a iné oxidanty. Dôsledok klesajúcej oxidácie je nižšia možnosť aktivácie nebezpečných zápalových procesov v bunke. Jeden taký spôsob je cez aktiváciu proteínového komplexu ako NFkappaB.
ÚLOHA A. Určiť množstvo tiokyanátového iónu získaného z karfiolu použitím spektrofotometrickej analýzy (27 bodov) CIEĽ: Použiť spektrofotometer na určenie aké množstvo iónu tiokyanátu sa uvoľnilo z karfiolu. Táto analýza je založená na tom, že tiokyanát v kyslom prostredí reaguje s iónmi Fe3+ a tvorí potom stabilný červeno-sfarbený complex tiokyanatan železnatý Fe(SCN)2, ktorého maximálna absorbcia pri vlnovej dĺžke je 447 nm. Materiál automatická pipeta jedna 20-200 mikrolitrová špičky na pipety Spektrofotometrické kyvety obsahujúce 900 mikrolitrov reagentu dusičnanu železitého UPOZORNENIE: Reagent dusičnanu železitého použijete rozpustený v 1,0 M kyseliny octovej. Natiahnite si rukavice a použite ochranné okuliare! Tiokyanátové štandardy v skúmavkách s nasledovnými koncentráciami: 0 mikromólov/ml (blank), 0,5 mikromólov/ml, 1,0 mikromólov/ml, 2,0 mikromólov/ml a 4,0 mikromólov/ml. Jedna skúmavka filtrovaného karfiolového homogenátu. 1,0 g karfiolu bolo homogenizovaného a homogenát bol rozpustený v 4,0 ml vody. Toto je vaša neznáma vzorka a vy potrebujete zistiť koľko mikromólov tiokyanátu obsahuje jeden mililiter (ml) homogenátu. Použi označovacie pero na označenie kyviet. Označte ich na nepriehľadnú stranu kyvety – pamätajte, že 447 nm svetla zo spektrofotometra potrebuje prejsť čírimi stenami kyviet. Použite rukavice a ochranné okuliare
Cell Biology/Biotechnology Lab Exam
STUDENT CODE: _______________
3
Na vašom pracovnom stole je spektrofotometrická súprava s absorbanciou 447 nm. POZNÁMKA: Pred začatím tejto úlohy sa uistite, či máte všetok materiál zo zoznamu. Ak nie, upozornite na to asistenta zdvihnutím ruky Postup 1. Natiahnite si rukavice a ochranné okuliare 2. Do každej kyvety obsahujúcej reagent dusičnanu železitého pridajte 100 mikrolitrov tiokyanátových štandardov. Štandardy sú: 0; 0,5; 1,0; 2,0 a 4,0 mikromólov tiokyanátu/ml. Farebná reakcia by mala byť viditeľná okrem 0 mikromolovej tiokyanátovej štandardy, ktorá slúži ako váš blank. Uistite sa, že etikety sú na nepriehľadných stranách kyvety. 3. Do všetkých zvyšných 3 kyviet pridajte 100 mikrolitrov karfiolového homogenátu. 4. Opatrne noste kyvety do spektrofotometra, ktorý je nastavený na vlnovú dĺžku 447 nm. Otvorte kryt na svetelnej trajektórii v spektrofotometre a vložte 0 mikromólovú štandard (blank) kyvetu (tiokyanát/ml). Šípka naznačuje dráhu svetla. Uistite sa, že steny kadiaľ prechádza svetlo sú transparentné. Pamätajte si, že číre steny kyvety majú byť v línii so šípkou kontrolky v spektrofotometrickej komôrke. Uzavrite kryt a stlačte “set reference” tlačidlo hore vpravo na spektrofotometri – pozri diagram nižšie. Netlačte iné tlačidlo
5. Vložte každú štandardu a odčítajte hodnotu. Potom vložte všetky kyvety obsahujúce neznáme množstvo a odčítajte hodnoty. Nechajte kyvety pri spektrofotometri a asistent sa o ne postará. Spektrofotometrické odčítané hodnoty absorbancie pre každú štandardu: 0.5 mikromólov/ml tiokyanátu:
___________
1.0 mikromólov/ml tiokyanátu:
___________
2.0 mikromólov/ml tiokyanátu:
___________
4.0 mikromólov/ml tiokyanátu:
___________
Cell Biology/Biotechnology Lab Exam
4
STUDENT CODE: _______________
Spektrofotometrické odčítanie absorbancie pre neznámu vzorku: 1)________,
2)_________,
3)__________
3 body
6. Narysujte graf a vyneste do grafu (ďalšia strana) merania absorbancie pre vaše tiokyanátové štandardy oproti koncentráciám (mikromóly/ml) štandardov. 6 bodov 7. Vezmite priemernú absorbanciu Vášho karfiolového homogenátu a určite koncentráciu tiokyanátového iónu vynesením hodnoty na urobený graf. 5 bodov 8. Aká je koncentrácia tiokyanátu v karfiole ? Presvedčte sa, že máte správne jednotky. 3 body 9. Vypočítajte smerodajnú odchýlku Vášho merania neznámej vzorky
2 body
ODPOVEĎ: ________________________________________
Cell Biology/Biotechnology Lab Exam
STUDENT CODE: _______________
5
ÚLOHA B. Určite množstvo karfiolu, ktoré by bolo nutné skonzumovať, aby mal toxický efekt kvôli obsahu tiokyanátu (5 bodov) Úvod LD50 je toxikologický termín, ktorý opisuje dávku látky (t.j. milimóly toxínu na kg zvieraťa), ktorá zabije 50 % testovaných zvierat. V potkanoch je LD50 pri konzumácii tiokyanátu udávané 9 milimólov na kg. Ak použijete údaje, ktoré ste zistili v experimente, vypočítajte koľko karfiolu má potkan, ktorý má 500 g zjesť v krátkom čase, aby dosiahol LD50.
Postup Zakrúžkuj rozsah, do ktorého najlepšie zapadá tvoj výpočet. Ukáž výpočty na tejto strane. Ak máš málo miesta pokračuj na zadnej strane. (a)
1 g do 5 g
(b)
50 g do 250 g
(c)
500 g do 1 kg
(d)
1.5 kg do 14 kg
(e)
15 kg do 25 kg
Úloha C. Vysvetlite reguláciu génovej expresie.
(10 bodov)
Úvod NF kappaB je complex transkripčného faktora obsahujúci dva proteíny (p50 a p65) viazané na tretí protein známy ako IkappaB, ktorý je normálne prítomný v cytoplazme. Typický NFkappaB complex sa skladá z p50 a p65 proteínu, ktorý je viazaný na IkappaB. Aktivácia NFkappaB zahŕňa degradáciu IkappaB, výsledkom čoho je translokácia p50 / p65 a vznik heterodiméru, ktorý sa väzbou na kappa B elementy zvyšuje transkripciu zápalových génov ako je napr. inducibilná syntetáza oxidu dusičného (iNOS). Indikátor aktivácie NFkappaB je, že sa zvýši pomer p65 oproti IkappaB proteínu.Jedným z dôsledkov zvýšenej iNOS aktivity je vysoká produkcia voľných radikálov oxidu dusičného (NO). Oxid dusičný reaguje so superoxidovým aniónom O2- a vytvára peroxynitrátovú kyselinu. Táto je veľmi silný oxidant. Zvýšená hladina oxidantov spôsobí aktiváciu NFkappaB pričom zníženie hladiny oxidantov často spôsobí zníženie aktivácie NFkappaB a zníženú úroveň expresie zápalových génov. Oxid dusičný je vylučovaný z endotelových buniek a difunduje do hladkých svalov. Spôsobuje uvoľnenie a zníženie krvného tlaku. Preto je hlavným regulátorom krvného tlaku.
Postup 1. Pozri si obrázky poskytnuté ku každej časti. 2. Použi prezentované údaje a identifikuj, ktorá sada dát je odvodená z krmiva zvierat, ktoré je bohaté na glukorafanín a poskytuje informácie pre tvoju odpoved.
Cell Biology/Biotechnology Lab Exam
STUDENT CODE: _______________
6
Časť A (5 bodov) Dole je obrázok, ktorý poskytuje údaje o aktivácii NFkappaB pri spontánnej hypertenzii potkaních samcov, keď sú kŕmené dvoma druhmi krmiva, kontrolné krmivo alebo experimentálne obsahujúce glukorafanín. Pri experimentálnej diete zviera konzumuje 10 mikromólov glukorafanínu na kg váhy. Po niekoľkých mesiacoch na tejto diete boli zvieratá uspaté, jadrá boli izolované z obličiek a bola pripravená SDS polyakrylamidová elektroforéza. Po separácii proteínov pomocou elektroforézy preniesli proteíny na nitrocelulózovú membránu a hybridizovali s protilátkami, ktoré rozoznávajú NFkappaB p65 proteín. Príslušný western blot je naľavo a vpravo je graf, ktorý kvantifikuje western bloty z 5 rôznych zvierat na každej diete.
Odpovedzte na otázky: 1. Ktorá skupina zvierat bola na glukorafanínovej diete? A alebo B? Odpoveď ____________________ 2. Ktoré z nasledovných tvrdení dáva najlepšie vysvetlenie pre odpoveď? Zakrúžkujte správne písmeno (a) Menej oxidatívneho stresu spôsobí zníženie NFkappaB aktivácie a zníženie p65 v jadrách. (b) Menej oxidatívneho stresu spôsobí zníženie NFkappaB aktivácie a zvýšenie p65 v jadrách. (c) Viac oxidatívneho stresu spôsobí zníženie NFkappaB aktivácie a zníženie p65 v jadrách. (d) Viac oxidatívneho stresu spôsobí zníženie NFkappaB aktivácie a zvýšenie p65 v jadrách. (e) Viac oxidatívneho stresu spôsobí zvýšenie NFkappaB aktivácie a zvýšenie p65 v jadrách.
Cell Biology/Biotechnology Lab Exam
STUDENT CODE: _______________
7
Časť B. (5 bodov) Dole je obrázok s údajmi o 45 kDa nitrosylovanom proteíne (N- proteín) v obličkách samca potkanov, ktorý bol na jednej z troch odlišných diét: diéta s glukorafaninom a dve rôzne kontrolné diéty.
Vrchná časť obrázku reprezentuje Western blot a spodná časť je kvantifikácvia Western blotov z 5 rôznych zvierat na každú diétu. Odpovedz na otázky: 1. Ktorá skupina A, B alebo C reprezentuje zvieratá kŕmené diétou s glukorafaninom? Odpoveď: __________________________
2. Zakrúžkuj písmeno tvrdenia, ktoré podľa teba najlepšia vysvetľujú odpoved na pôsobenie glukoforamínu: 4 body (a) Viac oxidatívneho stresu spôsobí zvýšenie NFkappaB aktivácie a aj zvýšenie iNOS expresie, zvýšenie peroxynitritovej kyseliny a zvýšenie nitrozylácie proteínov. (b) Viac oxidatívneho stresu spôsobí zvýšenie NFkappaB aktivácie a zvýšenie iNOS expresie, zvýšenie peroxynitritovej kyseliny ale zníženie nitrozylácie proteínov. (c) Menej oxidatívneho stresu spôsobí zvýšenie NFkappaB aktivácie a zvýšenie iNOS expresie ale zníženie peroxynitritovej kyseliny a zníženie nitrozylácie proteínov. (d) Viac oxidatívneho stresu spôsobí zníženie NFkappaB aktivácie a zníženie iNOS expresie, zníženie peroxynitritovej kyseliny a zníženie nitrozylácie proteínov. (e) Menej oxidatívneho stresu spôsobí zníženie NFkappaB aktivácie a zníženie iNOS expresie, zníženie peroxynitritovej kyseliny a zníženie nitrozylácie proteínov.
