16 II. FÉLÉV

KÉSZÍTETTE: BA LOGH V ERONIKA

ELTE IDEGTUDOMÁNY ÉS HUMÁNBIOL ÓGIA SZAKIRÁNY MSC 2 0 1 5 / 1 6 II. F ÉL ÉV

TÉNYEK, CÉLOK, KÉRDÉSEK Kísérlet központja

• • •

Neuronok és réskapcsolatokkal összekötött asztrocita hálózatok közötti GABAerg transzmisszió Elektrofiziológiai tulajdonságai Funkcionális szerepe

Hipotézis • GABA indukált Cl- mozgás (a [Cl-]EC modulálása által) befolyásolja (fenntartja) a GABAerg transzmisszió hatását • Az asztro GABAAR-ok ellensúlyozzák a posztszinaptikus GABAAR-ok, valamint a preszinaptikus és asztrocita GABA transzporterek általi [Cl-]EC regulációját • A réskapcsolatok kiegyenlítik az asztro hálózaton belüli ion koncentrációkat Cél •

A pre- és posztszinaptikus neuronok és asztrociták interakciójának feltárása az asztrociták szinaptikus Cl- viszonyaiban való részvételének becslésére

ANYAG ÉS MÓDSZER • GAD67-GFP knock-in (GAD67+/GFP) egerek • 350µm vastag hippokampális agyszeletek • GABABR-blokkoló (CGP55845, 3µM) az ACSF-ben • CA1 asztrociták SR101 fluoreszcens festékkel megjelölve • Whole cell patch clamp mérések • GABA applikáció (1mM vagy 50µM) • Cl- imaging • Farmakológia

EREDMÉNYEK

GABA APPLIKÁCIÓVAL KIVÁLTOTT ÁRAMOK GABAAR ÉS MGAT4 ÁLTAL MEDIÁLTAK

Kísérleti felállás • a GABA-indukált és Cl- áramok komponenseinek meghatározására • GABA applikáció

• Whole cell voltage clamp mérés CA1 asztrocitákból • GABAAR-blokkolók (picrotoxin és bicucculine) • Specifikus GAT-inhibitorok (SNAP5114 [mGAT4] és SKF89976a, NO711 [GAT1])

GABA APPLIKÁCIÓVAL KIVÁLTOTT ÁRAMOK GABAAR ÉS MGAT4 ÁLTAL MEDIÁLTAK

GABA APPLIKÁCIÓ KÉTIRÁNYÚ CL- ÁRAMOT INDUKÁL GABAAR-ON ÉS MGAT4-EN KERESZTÜL CA1 ASZTROCITÁKBAN

Kísérleti felállás • a GABA-indukált [Cl-]IC változások vizsgálata • GABA applikáció • Whole cell voltage clamp mérés CA1 asztrocitákból • Cl- imaging MEQ fluoreszcens indikátorral

GABA APPLIKÁCIÓ KÉTIRÁNYÚ CL- ÁRAMOT INDUKÁL GABAAR-ON ÉS MGAT4-EN KERESZTÜL CA1 ASZTROCITÁKBAN

• MEQ fluoreszcencia növekedése → [Cl-]IC csökkenése • MEQ fluoreszcencia csökkenése → [Cl-]IC növekedése

INTERNEURON TÜZELÉSSOROZAT GABAAR-MEDIÁLT ÁRAMOKAT INDUKÁL SZOMSZÉDOS ASZTROCITÁBAN

Kísérleti felállás • Az asztrocita GABAAR a GABA spillover hatására aktiválódnak, ezért a tényleges szinaptikus átvitelre való aktiválódásuk különbözhet a korábbi GABA applikáció hatásaitól • Periszinaptikus asztrociták vizsgálata

• Kettős whole cell voltage clamp mérés CA1 interneuron-asztrocita párokból • Stratum lacunosum-moleculare-ban vagy annak stratum radiatummal közös határán • Stimulus: 500pA 50Hz 2s → egyedi interneuron tüzelése által kiváltott áramok a szomszédos asztrocitából

INTERNEURON TÜZELÉSSOROZAT GABAAR-MEDIÁLT ÁRAMOKAT INDUKÁL SZOMSZÉDOS ASZTROCITÁBAN

Iinh-astro = inhibitory synapsedriven astrocytic currents

A GABAAR-OK A SZINAPTIKUS RÉSHEZ KÖZELEBB LOKALIZÁLTAK, MINT AZ MGAT4 TRANSZPORTEREK

Kísérleti felállás • A GABAAR-ok és mGAT4 transzporeterek különböző lokalizációja? • Iinh-astro vizsgálata 20-40µM NO711-ben előinkubált szeletekben → gátlódik a neuronális GABA-uptake (GAT1)

A GABAAR-OK A SZINAPTIKUS RÉSHEZ KÖZELEBB LOKALIZÁLTAK, MINT AZ MGAT4 TRANSZPORTEREK

A RÉSKAPCSOLATOK KONDUKTANCIÁJA SEGÍT AZ IINH-ASTRO FENNTARTÁSÁBAN

Kísérleti felállás_1

• Iinh-astro közeli (10-20µm) interneuron-asztrocita párok 89%-ában • Iinh-astro távolabbi (40-60µm) interneuron-asztrocita párok 40%-ában szignifikánsan kisebb amplitúdóval

• Lehet, hogy a GABA-mediált szignál réskapcsolatokon keresztüli terjedése miatt? • Réskapcsolatokon keresztüli kommunikáció vizsgálata • Réskapcsolat blokkolók (carbenoxolone [500µM] és octanol [1mM])




• Az asztrocita GABAAR-mediált áramokhoz tartozó réskapcsolat konduktancia vizsgálata/tisztázása • Lokális GABA applikáció UV laser photo-uncging módszerrel

• Whole cell voltage clamp mérés egy SLM asztrocitából • 0.2% Lucifer sárga festék a belső oldatban az elektromos szinapszisokkal összekötött asztrociták vizualizációjára

• Réskapcsolat inhibitorok jelenléte nélkül 1-3 jelölt asztrocita




• Ezen GABA-indukált áramok/depolarizáció réskapcsolatokon keresztüli terjedésének oka lehet különböző ionok (pl. K+) elektrokémiai grádiense • Technikai probléma: a GABA uncaging és MEQ gerjesztési tartománya átfed → Climaging nem használható • Páros whole cell mérések kapcsolt asztrocitákból • Egyenlő holding potenciál, K+-csatorna szuppresszió (EC Ba2+ és IC Cs+)

• SR-ben 50µm távolságban


GAP JUNCTION-BLOKKOLÓK NÖVELIK AZ EIPSC–K AKTIVITÁS-FÜGGŐ DEPOLARIZÁCIÓS ELTOLÓDÁSAIT

Kísérleti felállás

• A Cl- mozgása az asztrocita hálózaton belül létfontosságú lehet a GABAerg szinapszisok [Cl-]EC szabályozásában a GABAAR-okon keresztüli Cl- efflux által • Gap junction blokkolók hatásának vizsgálata az EIPSC-re

• Whole cell voltage clamp mérések CA1 asztrocitákból • Farmakológia: CNQX (20µm); D-AP5 (50µm); CGP55845 (3µm) • IPSC-k kiváltása tetanizálással (50Hz, 2s, 100x 200-400pA) • Különböző holding potenciálok (-30 és -80mV között) • Octanol (1mM)

GAP JUNCTIONBLOKKOLÓK NÖVELIK AZ EIPSC–K AKTIVITÁS-FÜGGŐ DEPOLARIZÁCIÓS ELTOLÓDÁSAIT • ΔEIPSC = a 90. és 2. stimulus EIPSC –je közötti különbség (szignifikáns) → depolarizációs shift • Oka: a Cl- gradiens változása a GABAAR-ok általi Cl- intracelluláris akkumuláció miatt

MEGVITATÁS

1) Fiziológiásan magas [Cl-]IC mellett a GABA applikáció kétirányú Cl- áramot indukál GABAAR-on és mGAT4-en keresztül CA1 asztrocitákban (előbbin efflux, utóbbin influx GABA felvételével párhuzamosan). 2) A GABA spillover az asztrocita GABAAR-ok aktiválásával elsődlegesen Cl- effluxot indukál a szinaptikus réshez való közelebbi lokalizációjuknak köszönhetően. 3) Asztrociták közötti réskapcsolatok GABAAR-mediált áramokat is továbbítanak → a GABAerg transzmisszió által mediált Cl- effluxot (így az [Cl-]EC) homeosztatikusan szabályozott a réskapcsolatokkal összekötött asztrocita hálózat által

16 II. FÉLÉV

Recommend Documents