•15/03/2010
KLONOVÁNÍ a GENOVÉ INŽENÝRSTVÍ
KLONOVÁNÍ a GENOVÉ INŽENÝRSTVÍ 1) úvodní přednáška 2) PCR techniky 3) mutageneze in vitro 4) cDNA a genomové knihovny 5) sekvencování genomů 6) transgenoze rostlin 7) genové čipy 8) transgenoze živočichů 9) genová terapie 10) klonovací strategie a expresní systémy 11) seminář – nástroje molekulární biologie v praxi
•1
•15/03/2010
Získávání bioinformací (dobrovolný seminář)
• • • • • •
NCBI (National Center for Biological Information) TIGR (The Institute for Genomic Research) SignalP, TargetP (predikce buněčné lokalizace proteinů) BIOEDIT (freeware pro manipulaci s DNA a proteiny) BLAST (basic local alighment and search tool) GENEVESTIGATOR (sledování exprese genů na úrovni celých genomů in silico)
LITERATURA Glick R a Pasternak JJ
Molecular Biotechnology 3th edition, ASM Press Ltd, Washington, USA, 2003
Sambrook J a kol.
Molecular Cloning 1,2,3
3th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA 2001
Rosypal S
Úvod do Molekulární Biologie díl čtvrtý třetí vydání, Prof.RNDr. Stanislav Rosypal, DrSc, Brno 2002
Brown TA; překlad Fellner M a kol.
Klonování genů a analýza DNA 1 české vydání, Olomouc UP 2007
http://biologie.upol.cz/metody/
•2
•15/03/2010
Centralní Central ní dogma DNA
RNA
Protein
Fenotyp
DNA do DNA Æ REPLI REPLIKACE KACE DNA do RNA Æ TRANS TRANSKRIPCE KRIPCE RNA do Protein Æ TRANSLAC TRANSLACE E
RNA do DNA
Æ
REVERZNÍ REVER ZNÍ TRANS TRANSKRIPCE KRIPCE
Jeden gen jeden enzym (protein/polypeptid)
Centralní Central ní dogma Gen 9,200 bp
5’
3’
AAGCTCGACTAGCGCTAGCCTACCTAGCTCTCCCCTTCC
5’
zralá RNA 1,870 bp
AAA 3’ (kodující sekvence ORF (open reading frame) a nepřekládané regiony – 5´-UTR, 3´-UTR)
Protein 386 aa
N
C
CDS 1158 bp (coding sequence)
•3
•15/03/2010
Struktura Struktur a genu
• • • • • •
Introny a Exony Promotor Enhancer a Silencer Počátek transkripce Transkripční faktory Signální sekvence
Introny a Exon Introny Exony y: Kodující sekvence (ORF) mnoha eukaryotických genů je přerušená sekvencí známou jako introny. Introny jsou úseky DNA jejichž transkripty nejsou přítomný ve zralé mRNA. Exony jsou části sekvence přítomné ve zralé mRNA a kodují produkt eukaryotického genu.
Místo počátku transkripce: místo kde začíná syntéza mRNA (pozice 0, 30bp od TATA boxu) . Promotor: Oblast genu (5’-konec) upstream od místa počátku transkripce sloužící jako templát pro navázání transkripční jednotky a iniciaci transkripce. Inducibilní promotor – je závislý na přítomnosti induktoru (nízkomolekulární látka). Konstitutivní promotor – nezávislý (provozní „house h k keeping“ i “ geny). ) Enhancer: Část sekvence genu která interaguje s transkripčními faktory a tak zvyšuje účinnost transkripce. Je umístěna upstream nebo downstream od kódující sekvence a může být stovky bází daleko od kódující sekvence kterou kontroluje. Silencer: Opak enhanceru. p faktory: y Proteinyy interagující g j se specifickou p sekvenci DNA,, Transkripční většinou ovlivňující terciální strukturu DNA a tak regulují transkripční jednotku. Jsou buď aktivátory nebo represory viz výše. Koaktivátory: Proteiny interagující s transkripčními faktory (ale ne s DNA) regulující transkripci. Signální sekvence: kóduje signální peptid, který předurčuje zacílení proteinu na buněčné úrovni a následně se odštěpuje.
•4
•15/03/2010
DNA Æ DNA DNA polymerasy blíže přednáška techniky PCR
DNA Æ RNA Transkripce (RNA syntéza): přenos informace z DNA do RNA (nestabilní) prostřednictvím enzymu RNA Polymerasy (DNA-dependentní RNA Polymerasa).
Syntéza RNA je komplementární k templátovému DNA duplexu a je identická s netemplátovým vláknem duplexu (5´-3´). Netemplátový řetězec je proto nazýván kódující řetězec a je identický s mRNA s výjimkou záměny U za T. Typy RNA: RNA: messenger RNA (mRNA, polyA+ RNA). RNA která je přepisována do polypeptidů (1-5%). ribozomální RNA (rRNA). strukturní složka ribozómů. (90 90% %) transferová RNA (tRNA). přenašeč aminokyselin do místa syntézy proteinu. (5-10 10% %) málá jaderná, jadérková, cytoplazmatická RNA (snRNA/sno/scRNA). sestřih mRNA
•5
•15/03/2010
Postranskripční úpravy mRNA • Čepička (capping). modifikovaný guanozin (m7G) je přidáván na 5'-konec většiny mRNA. Stabilita mRNA a podílí se na vazbě k ribozomu. • P Polyadenylace. l d l 100 200 100-200 b bp dl há dlouhá sekvence k polyadenozinu je přidávána na 3'-konec většiny eukaryotické pre-mRNA. PolyA konec není kodován v DNA. • Sestřih intronů a exonů. introny jsou vyštěpeny a exony spojeny dohromady ve struktuře zvané spliceozom.
Y pyrimidinová báze
Postranskripční úpravy mRNA
•6
•15/03/2010
RNA Æ protein • Translace (syntéza proteinů): Translace je proces přeměny informace z RNA do aminokyselinového řetězce (polypeptidu) probíhající v cytoplasmě. Zralá mRNA je transportována do cytoplasmy k ribozomům (mnohdy vázané na endoplasmatickou retikulární síť). proteinů které tvoří • Ribozóm se skládá ze strukturní rRNA a 80 různých proteinů, malou a velkou podjednotku. • Iniciace: Zachycení mRNA a nalezení start kodonu AUG, který koduje methionin. (M je odštěpen během postranslačních úprav nebo společně se signálním peptidem) • Elongace: Přidávání různých AK v aktivované formě vázané na tRNA a vytváření peptidové vazby mezi amino a karboxylovou skupinou. • Terminace: STOP kodón (UAA, UAG nebo UGA) Posttranslační úpravy: • Fosforylace, glykosylace, organelové cílení a odštěpení signálního peptidu, složení do aktivního stavu (vytvoření terciální a kvartérní struktury).
RNA Æ DNA Reverzní transkripce: Proces vytvoření DNA z RNA templátu za pomocí RNA-dependentní DNA polymerasy – Rever Reverzní zní trans ransk kriptasa riptasa (RT). RT je přítomná pouze v RNA virech avian myeloblastosis virus (AMV AMV), Moloney murine leukemia virus (MMLV MMLV), nebo human immunodeficiency virus (HIV).
Aplikace Apli kace:: tvorba cDNA (komplementární DNA): přesná DNA kopie mRNA. mRNA DNA sekvence proteinu bez přerušení introny. • cDNA knihovny • RT PCR
•7
•15/03/2010
PG2
Hybridizace • Dva řetězce DNA mohou být k sobě komplementární. • mRNA syntetizována z genu je identická k jednomu vláknu svého genu a komplementární k druhému vláknu. • Komplementární p řetězce mohou být ý oddělenyy ((denaturace)) a znovu spojeny (renaturace – hybridizace) na různém stupni specifity, mohou vznikat hybridní formace DNA-DNA, DNA-RNA, nebo RNARNA. Methody využívající těchto vlastnosti: Methody vlastnosti: • Southern blot: Hybridizace DNA na DNA (v pevné fázi) • Northern blot: Hybridizace DNA na RNA (v pevné fázi) • RNAse protection assay: Hybridizace RNA na RNA (v roztoku) • In situ hybridizace DNA-DNA nebo DNA-RNA (ve tkání, či v buňce, např. FISH) • izolace mRNA: vazba polyA konce na polyT sekvenci navázanou na pevný matrix. Stringence: podmínky zaručující stupeň specifity (komplementarity)
PG1
Strigence hybridizace teplota ▲ koncentrace soli ▼ Denaturační činidla (formamid) za snížené teploty udržují vysokou strigenci
•8
Snímek 15 PG2
RNAse protection assay multi Northern blot ve zkumavce: pripravi se in vitro transcrpipcí proby proti cilové mRNA, necha se probehnout hybridizace, vsechny ssRNA se pak rozstipou, reakce se hodí na gel a sleduje se intenzita (pomocí značení sondy) a velikost získaných bandu. galuszka; 18/02/2008
Snímek 16 PG1
foramid narušuje vodíkové vazby mezi bázemi a tím snižuje melting temperature, muze byt nahrazen mene toxickou močovinou galuszka; 18/02/2008
•15/03/2010
PG3
Princip Southern a Northern blotu
Hybridizační sondy jsou značené: • • • • • • • • •
chemiluminiscenčně BIOTIN detekce AVIDIN-HRP, DIGOXYGENIN fluorescenčně FLUORESCEIN, RHODAMIN radioaktivně dAT32P, 3H Příprava sond: 5´ a 3´koncové značení – nízká citlivost pomocí RANDOM HEXAMERů a DNA polymerasy (Klenowův fragment) PCR nick translace – DNasa I a DNA polymerasa FISH fluorescent in situ hybridization in vitro transkripce (RNA próby)
příklad nukleotidu značeného digoxygeninem
•9
Snímek 17 PG3
rozdělit typy sond RNA a DNA galuszka; 18/02/2008
•15/03/2010
PG1
PG4
Příprava hybridizačních sond značení pomocí náhodných hexameru
značení pomocí nick translation (posun jednořetězcového zlomu)
RESTRIKČNÍ ENDONUKLEASY (restrikční enzymy II třídy) •
rozpoznávají specifické sekvence dsDNA a štípou jí ve stejném místě
•
rozpoznávací místo je 4-8 bp dlouhé
•
štípou dlouhé fragmenty dsDNA na kratší
•
štípou vždy znovu opakovatelným způsobem
•
pocházejí především z bakterií
•
ochrana před cizorodou DNA především bakteriofágovou
•
modifikačně-restrikční enzymový y ý systém (RE + specifická modifikační metylasa)
•
Přes 120 rozpoznávacích míst
•
dodnes popsaných více než 800 RE
•10
Snímek 19 PG4
Klenowuv fragment: postráda 5-3 exonukleasovou aktivitu, polymerasa nedegraduje jiz nasedly primer a zastavuje se polymerizace galuszka; 18/02/2008
PG1
Labeling principle The nick translation method (1) is based on the ability of DNase I to introduce randomly distributed nicks into DNA at low enzyme concentrations in the presence of Mg2+. E. coli DNA polymerase I synthesizes DNA complementary to the intact strand in a 5' → 3' direction using the 3'-OH termini of the nick as a primer (2). The 5' → 3' exonucleolytic activity of DNA polymerase I simultaneously removes nucleotides in the direction of synthesis (3). The polymerase activity sequentially replaces the removed nucleotides with isotope-labeled or haptenlabeled deoxyribonucleoside triphosphates (1). At low temperature (15°C), the unlabeled DNA in the reaction is thus replaced by newly synthesized labeled DNA. DNA The DNA must be in low-salt concentration solution. Radioactive dNTP for labeling [α-32P] dCTP is preferentially used due to its greater stability in comparison to other labeled deoxyribonucleoside triphosphates. [α-32P] deoxyribonucleoside triphosphates with a specific activity of 3000 Ci/mmol give better incorporation and higher levels of labeling than those with a specific activity of 400 Ci/mmol under identical reaction conditions. Specific activity The level of specific labeling and the incorporation rate are dependent on the ratio of substrate DNA to labeled Petr Galuszka; 11/02/2006
•15/03/2010
RESTRIKČNÍ MíSTA MAJÍ BOD SYMETRIE • RE mohou na DNA vytvářet TUPÉ nebo LEPIVÉ konce • restrikční sekvence jsou většinou y symetrické. • nukleotidy vytvářejí PALINDROM • Palindrom: sekvence se čte stejně v obou směrech jak ve 5’ → 3’ tak ve směru 5’ → 3’ na komplementárním řetězci. EcoRI TUPÉ KONCE – nespecifické spojení
LEPiVÉ KONCE –
specifické spojení
Existují RE se stejnou restrikční sekvencí lišící se pouze typem vzniklých konců (5´- či 3´- lepivé) KpnI vs. Asp718 - izoschizomery Lepivé konce: konce: každý DNA fragment (jakéhokoli původu) tvoří štěpením stejnou RE dvě jednovláknové identické sekvence (čtené ve směru 5’ - 3’). Kompatibilní konce konce::
BamHI
GˇGATCC
BglII
AˇGATCT
•11
•15/03/2010
• dvě odlišné DNA mající stejné rozpoznávací místo pro danou RE se mohou vzájemně spojit v rekombinantní DNA molekulu • rek rekombinant ombinantní ní DNA molekula molekula:: je nová kombinace nukleotidů v DNA která se nevyskytuje volně v přírodě
Počet nukleotidů v restrikčním místě dané RE determinuje průměrnou délku fragmentů DNA získaných naštípaním danou RE Pravděpodobnost že dané restrikční místo bude nalezeno v genomu: 1) 44 = 256 bp 2) 46 = 4096 bp 3)) 48 = 64 000 bp p
průměrná vzdálenost mezi restrikčními sekvencemi v DNA = 4n n = # bází v restrikčním místě
GTAC
Působení RE jje velmi citlivé na iontovou sílu roztoku a charakter přítomných solí. Pokud nejsou zachovány specifické podmínky pro danou RE ta může mít tzv. star aktivitu STAR AKTIVITA – nespecifické náhodné štěpení
•12
•15/03/2010
T4 DNA ligasa •
• •
•
•
enzym izolovaný z T4 bakteriofága infikujícího E.coli, katalyzuje tvorbu fosfodiesterové vazby mezi 5´fosfátovou skupinou jednoho a 3´OH skupinou sousedního nukleotidu. reakce vyžaduje energii jednoho ATP používá se ke spojování lepivých i tupých konců dvou restrikčních fragmentů DNA, připojování různých adaptorových sekvencí k DNA a cirkulizaci DNA Reakce se provádí většinou za snížené teploty (1516°C) aby se snížila kinetická energie molekul a zabránilo se tak nekomplementárnímu spárování lepivých konců. zápor: nízká aktivita enzymu – dlouhý reakční čas.
Další enzymy používané v molekulární biologii:
Alkalická fosfatasa Mung Bean nukleasa
KLONOVÁNÍ Molekulární klonování: klonování: • multi-krokový proces který vytvoří kolekci definovaných fragmentů dané DNA pomocí restrikčních endonukleas • spojení j í vybraných b ý h DNA ffragmentů tů ((většinou ětši jjednoho d h genu)) se speciálním iál í nosičem – vektor pomocí T4 DNA ligasy • přenos vzniklého konstruktu do živých buněk (často baktérie) • mnohonásobné namnožení vložených DNA fragmentů replikaci v živé buňce – DNA KLONY
Buněčné klonování: klonování: • vytváření geneticky identických buněk (organismů) • v živé přírodě přirozené: kolonie baktérii řízkování rostlin jednovaječná dvojčata umělé ►
•13
•15/03/2010
KLONOVACÍ VEKTORY A)
Bakteriální a kvasinkové – PLASMIDY
-
přirozené součástí bakteriálních buněk nesoucí vlastní genetickou informaci ve formě dsDNA (rezistence k antibiotikům, metabolismus nezvyklých substrátů…) 1-100kb replikují se nezávisle na baktérii vlastní plasmidové vektory vznikly úpravou přirozených „high copy“ plasmidy
-
1970 - pBR (Bolivar a Rodriguez) - 4.36 kb menší než je přirozeně se vyskytující v E.coli - ori vlastní počátek replikace - rezistence k Amp a Tc - unikátní restrikční místa - kapacita pro inzertovou DNA 1-5 kb
100-1000 kopií v buńce
MCS multiple cloning site
ori
(polylinker)
KLONOVACÍ VEKTORY B)
Virové - BAKTERIOFÁGY
-
bakteriální viry s dvouřetězcovou lineární DNA klonovací kapacita 2-25kb inzertu
-
mnohonásobné množení v závislosti na hostitelské bakterii cos cos
BAKTERIOFÁG lambda
49kb
•
Střední část genomu není důležitá pro lytický růst a lze ji nahradit inzertovou DNA
•
snadná manipulace díky cos místům (lepivé konce) na koncích λ DNA, které umožňují její cirkulaci
•
Zacirkuluje se pouze bakteriofág, který má vzdálenost mezi cos místy 37-52kb
•
tvorba cDNA a genomových knihoven
•14
•15/03/2010
PG5
KLONOVACÍ VEKTORY C) bakteriálně-virové - KOSMIDY • • • •
odvozené z plasmidu do kterého byly naklonovány cos místa bakteriofága λ Inzertová DNA je naklonována do lineárního kosmidu a sbalena in vitro virovým mechanismem a infikována do bakterie v bakterii je pak cirkulována a replikuje se dál jako plasmid malá velikost cca 5kb – není potřeba infekčních lytických λ proteinů, pouze selekční marker k antibiotiku, velikost inzertové DNA se může pohybovat až k 47 47kb kb
D) bakteriálně-virové - FASMIDY (phagemid) • • •
odvozené od bakteriofága M13 s malou ssDNA (6.4kb), který se po infekci do bakterie replikuje jako kruhovitá dsDNA (plasmid, snadná manipulace, restrikce) infekční fágové částice však opět obsahují pouze ssDNA (vhodný zdroj pro izolaci ssDNA např. pro hybridizaci) do infekčních částic mohou být sbaleny částice až dvakrát větší než je fágová DNA
•15
Snímek 29 PG5
KOSMIDY nemají lytické geny, replikují se jako bakteriofág ale nelýzují bakterii, s prazdnýma se manipuluje jako s plasmidy. Replikuji se pomaleji než plasmidy KONKATEMERY - cirkularní kosmid se naštípe jedním lepivým a jedním tupym aby nedochazelo k cirkulaci galuszka; 18/02/2008
•15/03/2010
KLONOVACÍ VEKTORY
E) kvasinkové - YAC umělé kvasinkové chromosomy (yeast artificial chromosomes) •patří mezi kyvadlové vektory (shuttle vector) •v bakterii jako kruhová dsDNA (plasmid) •vedle sekvencí bakteriálního plasmidu obsahují části kvasinkového chromozomu ((centromera,, počátek p replikace,dvě telomery) •linearizací se chromozom aktivuje (oddělení telomer od sebe) •obrovská klonovací kapacita až 2000kb •nestabilita a složitá manipulace (protoplasty)
KYVADLOVÉ VEKTORY umožňující existenci a replikaci ve dvou rozdílných organismech: pYES bakterie – kvasinka - počátek replikace z přirozeného kvasinkového vektoru 2μ Ti-plazmid bakterie – rostlina viz přednáška transgenoze rostlin
KLONOVACÍ VEKTORY
F) bakteriální - BAC umělé bakteriální chromosomy (bacterial artificial chromosomes) Odvozené od E.coli F-plasmidu (fertility plasmid), „low copy“ 1-2 kopie na buńku
VÝHODY oproti ti YAC: YAC - stabilita (cirkulární) - snadná manipulace - potlačení rekombinace
Vhodné fragmenty genomické DNA pro ligaci jsou získány pulsní gelovou elektroforesou
INVITROGEN
VELKÝ VÝZNAM PŔI MANIPULACI S CELÝMI GENOMY
•16
•15/03/2010
Obecný princip molekulárního klonování klonovací vector + DNA obsahující požadovaný gen (izolace) restrikce t ik
ligace
transformace selekce pomocí selekčních markerů
reprodukce a syntéza cílového proteinu izolace
Využití molekulárního klonování • uchovávání, zmnožení a manipulace s genetickou informací (cDNA a genomové knihovny) • produkce proteinů pro různorodé využití • vnášení nových či pozměněných genů do organismů (GMO, genová terapie)
farmaceutika
zemědělství
základní výzkum průmysl
medicína
•17
•15/03/2010
SELEKČNÍ MARKERY geny nesené na klonovacím vektoru, exprimované současně s transgenem, na jejichž fenotypovém projevu lze transformované buňky snadno selektovat
1) geny kódující degradaci ANTIBIOTIKA •
INHIBITORY SYNTÉZY BAKTERIÁLNÍ BUNĚČNÉ STĚNY
AMPICILIN gen Amp koduje β-laktamasu která štěpí β-laktámový kruh penicilinových antibiotik CEFOTAXIM • INHIBITORY SYNTÉZY PROTEINů CHLORAMFENIKOL,, KANAMYCIN CHLORAMFENIKOL (vážou se na ribozomální podjednotky) gen Cml kóduje g j chloramfenikol acyltransferasu y gen Kan kóduje aminoglykosid fosfotransferasu
AMPICILIN
SELEKČNÍ MARKERY
1) geny kódující degradaci ANTIBIOTIKA •
INHIBITORY SYNTÉZY PROTEINů
TETRACYKLIN (zabraňuje vazbě aminoacyl tRNA k ribozomu) gen Tet kóduje membránový protein, který aktivně transportuje TC ven z buňky HYGROMYCIN B (interferuje s velkou ribozomální podjednotkou a zabraňuje elongaci syntetizovaného peptidu) gen způsobující rezistenci hgh kóduje fosforylasu inaktivující toto antibiotikum. PůSOBÍ I NA EUKARYOTICKÉ BUŇKY!!! (selekce transgenních rostlin)
1 •
INHIBITORY TRANSKRIPCE A REPLIKACE
ACTINOMYCIN D (inhibuje transkripci tím, že se váže na specifické úseky DNA) RIFAMPICIN (inhibuje prokaryotní RNA polymerasu, ale i chloroplastovou a mitochondriální, proto je toxicky i pro člověka) ZEOCIN – glykopeptid izolovaný ze Streptomyces, který štěpí po vstupu do buňky jakoukoliv DNA. Rezistentní gen Sh ble kóduje inhibiční protein (13.6 kDa) tohoto glykopeptidu. koncentrace účinné pro selekci: Baktérie 25-50 μg/mL Kvasinky 50-300 μg/mL Savčí buňky 50-1000 μg/mL
1 ZEOCIN
•18
•15/03/2010
SELEKČNÍ MARKERY
2) geny kódující enzymy narušující NUTRIČNÍ NEDOSTATEČNOST (ztráta autotrofie) - používají se především pro selekci transgenních kvasinek •
Gen URA3 kóduje enzym orotidin 5´-fosfát dekarboxylasu, enzym metabolické dráhy uracilu
•
LYS2 kóduje aminoadipát reduktasu (bisyntéza lyzinu)
•
ADE2 (C1-tetrahydrofolát syntasa), LEU2 (β- izopropylmalát dehydrogenasa), TRP1 (fosforibozylanthranilát izomerasa)
Princip selekce: pro transformaci daného plasmidu se použijí specifické kmeny kvasinek deficientní pro daný gen, selekce se pak provádí na minimálním médiu (bez živin). Příklad: kmen Saccharomyces cerevisiae INVSc1 genotyp: MATa his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52 /MATλ his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52 fenotyp: His-, Leu-, Trp-, Uratzn. že tento kmen je autotrofní na histidin, leucin, tryptofan a uracil a na médiu bez těchto živin neporoste kyvadlový vektor pro transformaci kvasinek →
SELEKČNÍ MARKERY
3) blue/white screening test -
pomocný test pro selekci transformovaných bakterií či bakteriofágu klonovací vektor nese gen lacZ+ který kóduje enzym β-galaktosidasu (štěpí laktosu na galaktosu a glukosu) MCS je umístěn uvnitř tohoto genu, a po vložení inzertu se tento gen stává neaktivní
X-GAL
HOCH2
O
HO H O
Cl
O
Br
OH galaktosa
N H
modré barvivo
Ampicilin (zabije netransformované bakterie) X-GAL (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl b-D-galactopyranoside) umělý substrát IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galaktopyranoside)
→ → →
induktor exprese lacZ genu
•19
•15/03/2010
lytický a lysogenní cyklus virů
struktura lambda bakteriofága
•20
•15/03/2010
SELEKČNÍ MARKERY
4) lysogenní selekce bakteriofágových vektoru LAMBDA FIX II VEKTOR (λ bakteriofágový vektor) -
selekce se provádí na speciálním kmeni E.coli E coli (lysogenní pro P2 bakteriofága, bakteriofága tzn. tzn že hostitelská buňka je již napadená jiným bakteriofágem)
-
Pokud má λ vektor genotyp red/gam+ na daném kmeni neroste je tzv. Sensitivní k P2 interferenci (Spi+ fenotyp)
-
red a gam geny se nacházejí ve střední části (stuffer) a jsou nahrazeny inzertem. Bakteriofág g s inzertem jje tudiž Spip a může být vyselektován na P2 lysogenním kmeni
red/gam+
J
12 kb
I
red/gam-
příliš malý nesbalí se do kapsidy inzert (genomová knihovna)
•21
