Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron 2010
ISSN : 2087-9652
=======================================================================================================
01 SINTESA ATP BERTANDA P-32 SEBAGAI PERUNUT BIOLOGI MOLEKUL Wira Y Rahman*, Endang Sarmini*, Herlina*, Triyanto*, Hambali*, A.Mutalib* Santi Nurbaiti** *Pusat Radioiaotop dan Radiofarmaka **Kelompok Keahlian Biokimia, Fakultas Matematika & Ilmu Pengetahuan Alam, ITB ABSTRAK Kebutuhan perunut DNA/RNA dalam perkembangan biolologi molekul di Indonesia saat ini sangat dirasakan. Salah satunya adalah nukleotida bertanda [γ32P]-ATP yang banyak digunakan dalam penelitian bioteknologi. Penguasaan teknik sintesa nukleotida bertanda ini akan sangat mendukung peningkatan kemampuan dalam bidang biologi molekul. Sintesa ini dilakukan dengan reaksi enzimatis yang merupakan bagian dari proses glikolisis, dimulai dari fruktosa 1,6diphosphat, nukleotida ADP dan radioisotop P-32 dengan menggunakan enzim aldolase, gliseraldehid 3-fosfat, 3-fosfogliseratkinase dan laktat dehidrogenase. Pemurniannya dengan menggunakan kolom kromatografi DEAE Sephadex. ATP bertanda yang dihasilkan berada pada Rf 0, dan P-32 dengan Rf 0,6. Dengan dihasilkannya nukleotida bertanda [γ32P]-ATP ini yang juga merupakan dasar untuk sintesa nukleotida bertanda lainnya, diharapkan kebutuhan akan nukleotida bertanda di Indonesia dapat terpenuhi. Kata Kunci : Perunut DNA/RNA, Proses glikolisis, Enzimatis, Radioisotop P-32, Nukleotida bertanda [γ32P]-ATP
ABSTRACT DNA / RNA tracer requirement in the development of molecular biology in Indonesia is currently strongly felt. One of them is labeled nucleotide [γ32P]-ATP which is widely used in biotechnology research. Authorizing nucleotide synthesis techniques will support increasing ability in molecular biology field. This synthesis was done by enzymatic reactions which part of the glycolysis process, starting from fructose 1,6-diphosphat, ADP nucleotide and P-32 radioisotope by using aldolase enzyme, glyceraldehyde 3-phosphate, 3-phosphoglycerate kinase and lactate dehydrogenase. Purification by using DEAE Sephadex column chromatography. ATP labeled which is produced marked at Rf 0 and P-32 at Rf 0,6. Labeled nucleotide [γ32P]-ATP which is resulted as basis for other labeled nucleotide synthesis so labeled nucleotides demand in Indonesia is expected to be fulfilled. Key words : DNA/RNA tracer, glycolysis process, enzymatic, P-32 radioisotope, nucleotide labeled [γ32P]-ATP
7
Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron 2010
ISSN : 2087-9652
=======================================================================================================
PENDAHULUAN Biologi molekul telah mengalami perkembangan yang sangat pesat semenjak tiga dasawarsa yang lalu dan telah memberikan banyak manfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan maupun bagi kehidupan manusia sehari-hari. Beberapa jenis obat-obatan, vaksin, bahan pangan, bahan pakaian dan lainnya, telah diproduksi dengan memanfaatkan teknologi biologi molekul. Untuk mendapatkan kombinasi sifat-sifat baru suatu makhluk hidup dilakukan perubahan langsung pada DNA dan genomnya. Usaha untuk mengubah DNA genom secara langsung ini disebut dengan istilah rekayasa genetika. Dan untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar digunakan perunut (pelacak/probe) DNA/RNA [1,2,3]. Edwin M Southern (1975) telah mempublikasikan prosedur untuk mendeteksi fragmen DNA yang spesifik. Prosedur ini dikenal dengan nama teknik Southern Blotting. Perunut yang digunakan untuk mendeteksi fragmen DNA yang spesifik tersebut merupakan asam nukleat pendek, beruntai tunggal (RNA atau DNA beuntai tunggal) dan diberi label radioaktif [3,4]. Selama dekade terakhir ini aplikasi radioisotop telah berkembang dengan cepat tidak hanya digunakan dalam pencitraan untuk memperoleh informasi fungsional suatu zat senyawa, juga untuk mendalami berbagai macam proses fisiologi dan patologi. Pemanfaatan teknologi nuklir dalam bidang kesehatan dengan teknik molekul saat ini di Indonesia semakin berkembang seperti yang telah dilakukan di PATIR – BATAN dalam mendeteksi HPV (human papilloma virus) penyebab kanker serviks, yaitu dengan mendeteksi DNA virus tersebut. Melalui DNA virus bisa diketahui apakah virus tersebut menjadi penyebab kanker atau bukan. Sedikitnya ada 100 tipe HPV, namun hanya beberapa yang menyebabkan kanker serviks, yakni HPV 16 dan 18. Dalam penelitian untuk tuberkulosis (TB) di Indonesia (Indonesia termasuk negara dengan penderita TB terbanyak ke-3 setelah India dan China), radioisotop telah digunakan untuk mendeteksi orang yang terkena penyakit dan juga mendeteksi kuman yang sifatnya resistan [4,5,6,7]. Berbagai hasil penelitian menunjukkan bahwa metode radioaktif ternyata relatif lebih sensitif daripada metode non radioaktif. Seiring dengan perkembangan biologi molekul di Indonesia maka kebutuhan akan senyawa nukleotida bertanda untuk perunut sangat dirasakan. Untuk itu penguasaan teknik sintesa nukleotida bertanda akan sangat mendukung peningkatan kemampuan di bidang biologi molekul. Proses sintesa ini dapat diterapkan sebagai tahap pertama dari suatu proses berkelanjutan untuk memproduksi nukleotida bertanda [32P] lainnya.
METODA Dalam proses sintesa nukleotida bertanda ini digunakan metoda yang dikembangkan oleh Sakamoto [6] dengan menggunakan sebagian metode glikolisis yang diharapkan lebih efisien. Diawali dari fruktosa 1,6-biphosphat yang dipecah oleh enzim aldolase membentuk dihidroksi aseton phosphat dan gliseraldehid 3-phosphat. Dihidroksi aseton fosfat kemudian menjadi 3fosfogliseral-dehida juga dengan pertolongan enzim glycerol-3-phosphate dehydrogenase. 8
ISSN : 2087-9652
Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron 2010
======================================================================================================= 32
H
3
32
PO + 5’-ADP 4
[γ- P]ATP
Selanjutnya fosfogliseraldehida bersenyawa dengan suatu asam fosfat radioaktif (H332PO4) dan berubah menjadi 1,3–disfosfogliseraldehida. 1,3–difosfogliseraldehida berubah menjadi asam 1,3–difosfogliserat dengan bantuan enzim dehidrogenase serta ion Mg2+, membantu proses ini, sehingga ADP akan berubah menjadi AT32P.
Gambar. 1. Bagian dari proses glikolisis dengan reaksi enzimatis pembentukan ADP menjadi ATP dengan penambahan P-32 radioaktiv
9
ISSN : 2087-9652
Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron 2010
=======================================================================================================
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil karakterisasi proses sintesa nukleotida bertanda [γ32P]-ATP dianalisa dengan menggunakan plat TLC PEI Celullosa dan Beta Counter Eberline sebagaimana terlihat pada Gambar 2. 700000 600000 500000
Cacahan
400000 300000 200000 100000 0 -2 -100000 -1 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Jarak (cm) P-32 pH7
Gambar 2. Radioanalisa plat TLC dari 32P pH 7 Gambar 2. menunjukkan bahwa radioanalisa 32P pH 7 memiliki Rf sebesar 0,53 sementara dari literatur diketahui bahwa 32P pH 7memiliki Rf 0,6. Hal ini mengindikasikan terjadinya sedikit pergeseran pada nilai Rf untuk 32P, sedangkan nilai Rf ATP adalah 0. Hasil analisa juga menunjukkan bahwa pada waktu inkubasi (t) 10 menit, ATP bertanda sudah terbentuk sedangkan pada waktu inkubasi t=30 menit, tidak terdeteksi adanya ATP bertanda yang terbentuk. Pada t=30 menit ATP bertanda yang telah terbentuk terlepas kembali 32P-nya sehingga yang terdeteksi hanya 32P, seperti terlihat pada Gambar 3. 100000 80000
Cacahan
60000 40000 20000
Rf ATP
0 -2
-1 0 -20000
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Jarak (cm) t=10 min
t=30 min
Gambar 3. Radioanalisa plat TLC untuk inkubasi selama (t) menit
10
ISSN : 2087-9652
Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron 2010
=======================================================================================================
Dari hasil radioanalisa ini menunjukkan bahwa aktivitas awal 32P sebelum direaksikan sangat tinggi, tetapi setelah direaksikan selama waktu inkubasi tertentu aktivitas yang terukur cukup kecil. Hal ini menyarankan bahwa proses sintesa nukleotida bertanda ini memerlukan aktivitas 32 P yang cukup besar, sebagaimana yang dilakukan oleh Sakamoto yang menggunakan aktivitas 32 P sebesar 10 mCi/ml. Dalam penelitian ini, aktivitas 32P yang digunakan sebesar 0,1055 mCi/ml. 7000 6000 5000 Cacahan
4000 3000 2000 1000 0 -2
-1 0 -1000
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Jarak (cm) Botol A
Botol B
Gambar 4. Radioanalisa plat TLC untuk botol A filtrat setelah loading ke kolom dan botol B hasil elusi dengan HCl 0,03 M
Cacahan
Setelah nukleotida bertanda berhasil disintesis, selanjutnya dilakukan permurnian menggunakan kolom kromatografi DEAE-Sephadex dan hasil fraksinasi yang didapatkan dianalisa kembali dengan menggunakan plat TLC dan Beta counter Eberline. Botol A merupakan filtrat hasil sintesis yang telah dimasukkan ke dalam kolom DEAE–Sephadex, diharapkan ATP bertanda tertahan di dalam kolom sedangkan pengotor-pengotornya akan terbawa keluar, terlihat tidak ada cacahan terukur (menandakan bahwa ATP bertanda tertahan di dalam kolom). Kemudian kolom dielusi dengan HCl 0,03 M untuk menghilangkan sisa-sisa fosfat anorganik, AMP dan ADP (ditandai dengan Botol B).
-2
400 350 300 250 200 150 100 50 0 -1-50 0
1
2
3
4
5
Fraksi 3
6
7
Jarak tiap 1 cm Fraksi 4
8
9
10
11
12
13
14
15
Fraksi 5
Gambar 5. Radioanalisa dari fraksinasi setelah dielusi dengan HCl 0,25 M pada fraksi 3, 4 dan 5 11
ISSN : 2087-9652
Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron 2010
=======================================================================================================
Nukleotida bertanda [γ32P]-ATP kemudian dielusi dengan menggunakan larutan HCl 0,25 M. Setiap 1 ml fraksi dikumpulkan dalam mikrotube untuk dianalisa dengan menggunakan Beta counter Eberline. Hasilnya menunjukkan bahwa ATP bertanda 32P terdapat dalam 3 – 5 ml pertama dari 15 ml eluat yang dihasilkan sebagaimana terlihat pada Gambar 5. Hasil radioanalisa ini menunjukkan aktivitas nukleotida bertanda terdapat pada fraksi 3, 4 dan 5 meskipun aktivitasnya masih cukup rendah. Puncak-puncak yang lainnya kemungkinan besar adalah hasil samping dari reaksi enzimatis karena pemisahan baru dilakukan setelah menit ke 30, untuk hasil yang lebih optimal akan dilakukan pemisahan pada t=10 menit. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada reaksi enzimatis t=10 menit berikut :
Cacahan
60000 55000 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 -5000 -2 -1 0 -10000
t=10 min
Rf 32P
Rf ATP
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Jarak (cm) t=10 min
Gambar 6. Radioanalisa dari reaksi enziamtis pada t=10 menit Cacahan terukur cukup besar berkisar 55000, tetapi karena reaksi dibiarkan berlangsung sampai 30 menit ATP yang terbentuk terlepas kembali menjadi ADP dan 32P. Sehingga sangat mempengaruhi hasil akhir proses pemisahan.
KESIMPULAN Dari proses sintesis yang dilakukan didapatkan ATP bertanda 32P ([γ32P]-ATP) berada pada fraksi 3, 4 dan 5, meskipun aktivitas yang didapatkan masih cukup rendah. Hal ini dikarenakan aktivitas enzim yang digunakan cukup kecil dan rendahnya aktivitas 32P yang digunakan (0,1055 mCi). Sehingga untuk mendapatkan nukleotida bertanda dengan aktivitas yang diinginkan membutuhkan aktivitas dari 32P yang cukup tinggi. Dengan berhasil disintesisnya [γ32P]-ATP ini membuka peluang proses sintesis berkelanjutan untuk memproduksi nukleotida bertanda [32P] lainnya.
12
Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron 2010
ISSN : 2087-9652
=======================================================================================================
UCAPAN TERIMAKASIH Penulis mengucapkan terimakasih kepada sejawat dari PTNBR – BATAN Bandung, terutama Ibu Azmairit dkk, atas kerjasamanya yang baik dalam penyediaan P-32 (H332PO4).
DAFTAR PUSTAKA 1. Fatchiyah dan Estri Laras Arumningtyas, “Kromosom, Gen, DNA, Synthesis Protein dan Regulasi”, Laboratorium Biologi molekul dan Seluler Universitas Brawijaya Malang, 2006. 2. Nunuk Priyani, ”Sifat Fisik dan Kimia DNA”, Program Studi Biologi dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara, 2004. 3. Aris Tjahjoleksono, “Teknologi DNA Rekombinan”, Jurusan Biologi FMIPA, Institut Pertanian Bogor. 4. Budiawan, ”Pengembangan Teknik 32P-Postlabelling untuk Mendeteksi Dini Resiko Kanker”, Risalah Pertemuan Ilmiah Penelitian dan Pengembangan Teknologi Isotop dan Radiasi, 2000. 5. Ratnawati Kukuh, Muhayatun dan Natalia Adventini, ”Sintesa dan Pemurnian [y32P]ATP”, Procedings Seminar Sains dan Teknologi Nuklir, PPTN-BATAN Bandung, 19-20 Maret 1997. 6. F. Sakamoto, M. Izumo, K. Hashimoto, Y. Fuji,”Study of optimum condition for synthesis of [y-32P]ATP with high specific radioactivity”, Journal of Radioanalytycal and Nuclear Chemistry, Vol. 239, No.2 (1999) 423-427. 7. Mukh Syaifudin dan Devita Tetriana, “ANALISIS MUTASI GEN inhA UNTUK UJI RESISTENSI M. tuberculosis TERHADAP ISONIAZID DENGAN METODE SSCP RADIOAKTIF”, Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi, BATAN Jakarta
13
