-aspiraten. apr. Dries Coenen 12 december 2006

CAT: Flowcytometrische immunofenotypering op lymfeklierbiopsies/-aspiraten

apr. Dries Coenen 12 december 2006

Het lymfatisch systeem „

= systeem van lymfevaten, lymfeklieren en extranodaal lymfatisch weefsel

„

lymfeklieren „ = boonvormige orgaantjes (+/- 2 cm³) gelegen langs het verloop van de lymfevaten „ filteren van de lymfe „ opname van antigenen (bacteriën, virussen, …) door macrofagen „ macrofagen presenteren de antigenen aan lymfocyten = activatie van het immuunsysteem

Lymfeklieren

Lymfoproliferatieve aandoeningen „

= grote groep van neoplastische aandoeningen van het lymfatisch systeem (klonale proliferatie van lymfoïde cellen)

„

lymfadenopathie = zwelling van een lymfeklier „ oorzaken „ meestal reactief (inflammatoire reactie) „ soms lymfoproliferatieve aandoening

Lymfoproliferatieve aandoeningen „

„

„

lymfoom = neoplastisch proces gelokaliseerd in de lymfeklieren of in extanodaal lymfatisch weefsel (vb. MALT) lymfoom ↔ leukemie „ dezelfde ziekte met verschillende klinische presentatie (SLL / B-CLL) Hodgkin lymfomen ↔ non-Hodgkin lymfomen (NHL) „ op basis van de aanwezigheid van Reed-Sternbergcellen

Classificatiesystemen „

„

verleden: „ Rappaport classification „ Kiel classification „ Working Formulation „ REAL classification heden: „ WHO classification (2001)

WHO-classificatie van lymfoproliferatieve aandoeningen „

klinisch-pathologische entiteiten gedefinieerd op basis van: „ kliniek „ morfologie „ immunofenotype „ cytogenetische en moleculaire data → multidisciplinaire aanpak vereist

„

classificatie „ B-cell neoplasms „ T- and NK-cell neoplasms „ Hodgkin’s lymphoma

Proposed WHO Classification of Lymphoid Neoplasms (2001)

B-NHL „

vallen onder de mature B-cell neoplasms

„

85% van de NHL

„

meest voorkomende types zijn: diffuus grootcellig B-cel lymfoom folliculair lymfoom MALT lymfoom CLL/SLL mantelcellymfoom

30.6% 22.1% 7.6% 6.7% 6.0%

T-NHL „

vallen onder mature T-cell neoplasms

„

12% van de NHL

„

meest voorkomende types: perifeer T-cel lymfoom (niet gespecifieerd) anaplastisch grootcellig lymfoom

„

meer frequent in Azië (virus HTLV-1)

7.0% 2.4%

Lymfeklieronderzoek ikv lymfoproliferatieve aandoeningen „

staalname van een lymfeklier of extranodaal lymfatisch weefsel „ via chirurgische biopsie „ via punctie (vb. fijne naald aspiratie (FNA))

„

FNA versus chirurgische biopsie „ voordeel: minder invasieve procedure „ nadeel: verlies van weefselarchitectuur → geen informatie over patroon van tumorgroei

„

onderzoeken „ histologie / cytologie „ immunofenotypering „ cytogenetica / moleculaire diagnostiek

Wat is immunofenotypering? „

= aantonen van expressie van cellulaire antigenen (CD-antigenen)

„

hoe? „ met behulp van monoklonale antilichamen gelabeld met een enzym of fluorochroom

„

2 technieken: „ immunohistochemie (IHC) „ simultane beoordeling celmorfologie en antigenexpressie met een lichtmicroscoop „ uitgevoerd door de anatomopatholoog „ flowcytometrische immunofenotypering (FCI) „ meting van fluorescentie-intensiteit op een celpopulatie met een flowcytometer

Immunofenotypering bij lymfoproliferatieve aandoeningen „

bepalen van de cellijn van een abnormale lymfoïde populatie (B of T) „ CD19 - CD20 - CD22 → B-cel „ CD2 - CD3 - CD5 - CD7 → T-cel

„

aantonen van monoklonaliteit „ B-cel: IgKappa of IgLambda lichte ketenrestrictie „ T-cel: overexpressie van bepaalde V-beta familie

„

bepalen of monoklonale celpopulatie een specifiek immunofenotype heeft geassocieerd met een bepaald type lymfoproliferatieve aandoening (classificatie)

Principe FCI „

incubatie met monoklonale antilichamen gelabeld met een fluorochroom

„

cel per cel hydrodynamisch gefocusseerd doorheen één of meer laserstralen

„

meten van lichtverstrooiing en fluorescentie-intensiteit per cel „ forward scatter ~ celgrootte „ side scatter ~ granulariteit „ fluorescentieintensiteit ~ antigenexpressie

„

meerdere antigenen aantoonbaar per cel „ gebruik van verschillende antilichamen met verschillende fluorochromen met andere fluorescentie-emissie golflengte

„

cellen weergegeven als puntenwolk in histogrammen

Principe FCI „

celdifferentiatie op basis van ligging op: CD45-SCC histogram

SCC-FSC histogram

R2

R1

R3

R4

100

„

101

102 SSC-Height

103

104

0

200

400 600 FSC-Height

800

1000

‘gating’ van relevante celcluster en onderzoeken op expressie van antigenen

Flowcytometrie in LAG „ „

„

4-kleuren flowcytometrie in het kader van diagnose/classificatie/MRD van een lymfoproliferatieve aandoening uitgevoerd op: „ perifeer bloed „ beenmergaspiraat niet op lymfeklierweefsel

Critically Appraised Topic „

Wat is de waarde van FCI op lymfeklierweefsel bij de diagnose en classificatie van lymfomen volgens de literatuur?

„

Wat zijn de voordelen/nadelen van FCI in vergelijking met IHC?

Vereisten voor flowcytometrie op lymfeklierweefsel „

suspensie van afzonderlijke intacte cellen „

celsuspensie „ perifeer bloed / beenmergaspiraat / FNA „ reeds celsuspensies „ lymfeklierweefsel bekomen via chirurgische biopsie „ eerst celsuspensie bereiden door mechanische of enzymatische desaggregatie en filtratie

„

intacte cellen „ vers staal binnen < 24h analyseren

Referentiewaarden in lymfeklieren „

omwille van ethische redenen weinig gegevens beschikbaar

„

primaire follikels → secundaire follikels oiv antigenstimulus B-lymfocyten in het germinaal centrum van secundaire follikels → exprimeren zwak CD10 B-lymfocyten in mantelzone (1/3) van de follikel → exprimeren CD5

„

„

Lymfeklier

Referentiewaarden in lymfeklieren „

Bagglatia et al. „ vergelijking lymfocytenpopulaties in lymfeklieren en perifeer bloed bij 22 patiënten (4 patiënten met een goedaardige aandoening en 18 vrouwen met gynaecologische tumor in vroeg stadium)

T-cellen B-cellen

NK-cellen

Analytische performantie van FCI „

geen gegevens beschikbaar voor FCI op lymfeklierweefsel

„

analytische sensitiviteit „ Sánchez et al. „ studie op PB en BM stalen met 4-kleuren flowcytometer „ 1 aberrante cel op 104 à 105 cellen

Diagnostische performantie van FCI op lymfeklierbiopsies „

3 grotere relevante studies „

Ravoet C, Demartin S, Gerard R, Dehon M, Peny MO, Petit B, Delannoy A, Husson B. Contribution of flow cytometry to the diagnosis of malignant and non malignant conditions in lymph node biopsies. Leuk Lymphoma. 2004 Aug;45(8):1587-93.

„

Martinez A, Aymerich M, Castillo M, Colomer D, Bellosillo B, Campo E, Villamor N. Routine use of immunophenotype by flow cytometry in tissues with suspected hematological malignancies. Cytometry B Clin Cytom. 2003 Nov;56(1):8-15.

„

Dunphy CH. Contribution of flow cytometric immunophenotyping to the evaluation of tissues with suspected lymphoma? Cytometry. 2000 Oct 15;42(5):296-306.

Ravoet et al. Hospital of Jolimont, Haine-Saint-Paul, Belgium „ retrospectieve studie van 118 consecutieve lymfeklierbiopsies „ 4-kleuren FCI „ 116 geschikte stalen „ panels voor detectie van B-, T-, RS-, en epitheliale cellen „

Ravoet et al.

Ravoet et al. „ „

„

overeenkomst FCI – histologie in 88% (102/116) classificatie B-NHL „ 77% (23/30) correct geclassificeerd Hodgkin lymfoom „

diagnose op basis van aanwezigheid van cellen met Reed-Sternberg fenotype (CD45-/CD15+/CD30+) „ „

„

6/15 diagnose zeer waarschijnlijk (> 1 op 104 cellen) 6/15 diagnose waarschijnlijk (> 1 op 105 cellen)

echter niet specifiek criterium

Martinez et al. „ „ „

Hospital Clinic, University of Barcelona, Spain 422 consecutieve biopsies 3-kleuren FCI „ 377 geschikte stalen

Martinez et al. „

„

„

voor NHL „ sensitiviteit = 90% „ specificiteit = 100% „ ppv = 79% „ npv = 100% voor Hodgkin lymfoom „ sensitiviteit = 0% goede overeenkomst morfologie/IHC en FCI behalve voor Hodgkin lymfomen

Martinez et al. „

Ig-lichte ketenexpressie analyse „ 91 gevallen zowel IHC als FCI „ interpretatie mogelijk „ IHC: 42% (38/91) „ FCI: 100% (91/91) „ wel goede overeenkomst tussen IHC en FCI

Martinez et al. „

classificatie B-NHL „ CLL en MCL: goed „ FL: matig

Dunphy „ „

St. Louis University Health Sciences Center, Missouri, USA retrospectieve studie van 373 biopsiestalen met data van histologie/IHC en 2-kleuren FCI

Dunphy 198 =

#

histology/IHC

FCI

161

B-cell lymphoma

monoclonal or aberrant B-cell population

16

T-cell lymphoma

aberrant or common thymocytic Tcell population

21

B-/T-NHL

negative for lymphoma

26

Hodgkin lymphoma

negative for lymphoma

128

benign

negative for lymphoma

13

nonhematopoietic malignancy

negative for lymphoma

4

nonlymphomatous hematopoietic malignancy

negative for lymphoma and nonlymphomatous hematopoietic malignancy by other flow markers

2

composite lymphoma or composite malignancy

aberrant T-cell or monoclonal Bcell population

2

posttransplantation lymphoproliferative disorder

negative

Dunphy „

„

voor NHL „ sensitiviteit = 89% „ specificiteit = 100% voor Hodgkin lymfoom „ sensitiviteit = 0%

Diagnostische performantie van FCI op fijne naald aspiraten „

talrijke studies onderzochten de bijdrage van FCI voor de diagnose en classificatie van lymfomen op fijne naald aspiraten „ combinatie cytologie/FCI op FNA meestal vergeleken met histologie „ meeste studies concentreren zich op mogelijkheid van FCI om NHL te diagnosticeren en te classificeren

„

diagnose van NHL in +/- 75-95% mogelijk met combinatie cytologie/FCI

„

classificatie in +/- 70-80% van de positieve gevallen mogelijk

Oorzaken van vals negatieve FCI „ „ „ „ „ „ „

sampling error: onvoldoende of niet representatieve staalname partiële lymfoominvasie weefselsclerose fragiliteit van sommige lymfoomcellen afwezigheid van sIgκ of sIgλ geen CD45 expressie lage aantallen maligne cellen op een reactieve achtergrond

FCI en diffuus grootcellige B-cel lymfomen „ „ „

30% van de NHL heterogene groep zonder specifiek immunofenotype vaker vals negatieve FCI (+/- 25%) „ vaker weefselsclerose „ fragiele natuur van deze lymfoomcellen „ vaker afwezigheid van Ig-lichte ketenrestrictie

FCI en Hodgkin lymfomen „ „

15% van alle lymfomen Reed-Sternbergcellen „ omgeven door vele inflammatoire lymfocyten (CD4/CD8verhouding ↑, echter weinig specifiek) „ fragiele natuur „ fibreus weefsel → moeilijke cellulaire dispersie „ geen consensus over antigenprofiel (CD15+/CD30+?)

→ detecteren/diagnosticeren van een Hodgkin lymfoom is onmogelijk met FCI

Besluit diagnostische performantie „

indien monoklonale populatie aantoonbaar met FCI → lymfoproliferatieve aandoening aanwezig

„

indien negatief FCI resultaat → maligniteit kan niet uitgesloten worden

„

histologie/cytologie blijft zeker nodig!

Voordelen FCI tov IHC „ „ „ „ „ „ „

simultane detectie van meerdere antigenen (meerkleuren FCI) kortere TAT (analyseduur 3 uur, elke weekdag) kwantitatieve resultaten waardoor interpretatie minder subjectief detectie van lagere aantallen maligne cellen uitgebreider aanbod monoclonale antilichamen superieur voor aantonen sIgκ/sIgλ mogelijk op kleinere hoeveelheid staal

Nadelen FCI tov IHC „ „ „

geen visuele correlatie tussen morfologie en antigenexpressie verlies van patroon van tumorgroei ingeval van biopsiemateriaal vers staal nodig

Diagnostische impact „

WHO-diagnose nooit gesteld op basis van één type diagnostisch onderzoek „ integratie van deeldiagnoses tot een volledige diagnose (multidisciplinaire aanpak)

„

Aantonen van monoclonale populatie met FCI kan belangrijk argument zijn in de diagnosestelling

„

Indien definitieve diagnose reeds mogelijk met histologisch onderzoek is FCI slechts van beperkte waarde

Therapeutische impact „

Wat is de impact op behandeling? „ FCI kan bijdragen in diagnosestelling en classificatie en zo therapie initiëren „ therapiekeuze afhankelijk van type lymfoom en stadium

„

Kan behandeling optimaler toegediend worden? „ FCI bruikbaar voor aantonen targetantigen van sommige therapieën (CD20 – rituximab)

Health outcome „

indien definitieve diagnose mogelijk op een FNA kunnen meer invasieve investigaties vermeden worden „ vooral interessant ingeval van recidief

Werd test opgenomen in guidelines? „

British Committee for Standards in Haematology (BCSH) guideline “Diagnosis and therapy for nodal non-Hodgkin’s lymphoma” (2002) „ „ „

„

eerst PB (cytologie en FCI) om CLL of ALL uit te sluiten lymfeklierweefsel via excisiebiopsie, FNA afgeraden immunofenotypering met flowcytometrie of immunohistochemie

US-Canadian Consensus Recommendations on immunophenotypic analysis (1997) „ „ „ „

immunofenotypering op lymfeklierbiopsies met FCI of IHC FCI superieur omwille van lagere detectielimiet, objectiviteit en snelheid FCI niet geschikt voor Hodgkin lymfomen FNA afgeraden

Kost impact „

„

Reële productiekost „ consumables = 10.18 € x aantal gebruikte antilichamen „ task unit & labor = 6.14 € „ overhead = 1.77 € „ totale kost per FCI met 10 antilichamen = 109.71 € RIZIV-nomenclatuur „ klinische biologie „ nummer 555730-555741(B500) en nummer 556474-556485 (B400) voor identificatie van antigenen (max. 13) van hematopoïetische cellen in bloed „ APO „ nummer 588070-588081 voor immunohistochemische onderzoeken (max.4) voor het aantonen van antigenen in coupes „ geen RIZIV-nomenclatuur voor FCI op lymfeklierweefsel

Decision making „

impact van de FCI op lymfeklierweefsel op het beslissingsproces van de clinicus en patiëntenmanagement? „ aantonen van monoclonale populatie in lymfeklier kan doorslaggevend argument vormen in de definitieve diagnose

Is er voldoende interesse vanuit de kliniek? „

prof. G. Verhoef en dr. A. Janssens (hematologen) hebben interesse „ FNA als ‘eerste screening’ bij een nieuwe patiënt (niet voor definitieve diagnosestelling) „ in geval van recidief kan FNA wel

„

prof. C. Peeters (anatomopatholoog) is bereid om ons een deel van de lymfeklier ter beschikking te stellen indien voldoende materiaal

Wat doen andere centra? „ „ „ „ „

AZ Sint-Jan Brugge OLV Aalst Virga Jesse Hasselt UZ Gent Erasmus Rotterdam

voeren FCI uit op lymfeklierweefsel

FCI op lymfeklierweefsel invoeren? „

argumenten pro „ de voordelen van FCI tov IHC „ combinatie van verschillende testen kan leiden tot betere diagnostische accuraatheid: FCI op lymfeklierweefsel als bijkomend argument

„

argumenten contra „ de nadelen van FCI tov IHC „ relatief veel vals negatieve FCI „ geen RIZIV-terugbetaling voor FCI op klierweefsel „ mogelijk lage testfrequentie „ FNA geen algemeen aanvaarde diagnostische techniek

To Do / Actions „

Al dan niet invoeren van FCI op lymfeklierweefsel (FNA en/of biopsie) in overleg met hematologen / anatomopathologen

„

Indien we beslissen de test in te voeren „ valideren van de analyse „ opstellen van een SOP „ aanvragen RIZIV terugbetaling „ organiseren overleg tussen hematologen / klinisch biologen / anatomopathologen om elkaars bevindingen met elkaar te correleren