Wrbanct. en Uaccinia-virus bij experimenteel. De groeibeuorderende werking yan Ectromelia- opgewekte huidtumoren uan de muis. R. A. d

Wrbanct De groeibeuorderende werking yan Ectro-

melia- en Uaccinia-virus bij experimenteel opgewekte huidtumoren uan de muis R.

A.

d.e

Haas

NEOERIANDS IHSTnUUT VOOR rtAEVEMTIEVE GENEESKUNDE . LBBEH

DE GROEIBEVORDERENDE WERKING VAN ECTROMELIA- EN VACCINIA-VIRUS BU EXPERIMENTEEL OPGEWEKTE HUIDTUMOREN VAN DE MUIS (WITH A SUMMARY IN ENGLISH)

Uit de afdeling voor Medische Microbiologie van het Nederlands Instituut voor Praeventieve Geneeskunde te Leiden

ff VERHANDELING VAN HET NEDERLANDS INSTITUUT VOOR PRAEVENTIEVE GENEESKUNDE XXXVI

DE GROEIBEVORDERENDE WERKING VAN ECTROMELIA- EN VACCINIA-VIRUS BIJ EXPERIMENTEEL OPGEWEKTE HUIDTUMOREN VAN DE MUIS DOOR

R. A. DE HAAS

HWERLANbS INSIHUUT V O O « «tAiVEHTtEVE GENEESKUNpE - l » W

1958

INHOUD Hoofdstuk I Inleiding Hoofdstuk II Literatuuroverzicht van de virusinvloeden bij het ontstaan en de ontwikkeling van tumoren . . . . Hoofdstuk III Proefopzet Hoofdstuk IV Proeven met het ectromeUa virus Hoofdstuk V Proeven met het dermovaccinia en het neurovacciniavirus Hoofdstuk VI Bespreking van de resultaten Samenvatting Summary Literatuur

1 13 28 36 55 71 78 79 80

VII

HOOFDSTUK I Inleiding Het ontstaan van gezwellen, met name bij de mens, is een phenomeen, dat voor zover de gegevens uit de literatuur het mogelijk maken dit na te gaan, al eeuwen voor het begin van onze jaartelling de menselijke geest heeft beziggehouden. Dit verwondert ons niet, het is een phenomeen dat in het psychische leven van de mens sterke affecten oproept, vaak veroorzaakt het een duidelijke angst, nimmer laat het de mens onberoerd. Gezwellen waren reeds aan de oude Egyptenaren bekend. De Egyptische priesters kenden ook reeds de gezwellen bij dieren, doordat het obduceren van offerdieren, ten einde zich over toekomstige gebeurtenissen een oordeel te kunnen vormen, paste in het magisch denken van die tijd. Pas in de laatste tijden leest men opnieuw over gezwellen bij dieren, zowel spontane gezwellen als experimenteel opgewekte. Ook nu zit hier de drang achter om kennis te vergaren welke voor de mens van nut kan zijn. Nu echter worden de problemen op een rationele wijze benaderd. Hoe belangwekkend de geschiedenis der medicijnen en in het bijzonder de geschiedenis van één ziekteproces voor het inzicht in de moderne opvattingen over het kankerprobleem ook moge zijn, we zullen hieraan voorbijgaan. Een uitvoerig overzicht kan men hierover vinden in het boek van Wolff, Die Lehre von der Krebskrankheit. Vele theorieën en opvattingen worden hierin besproken en men ontkomt niet aan een zeker gevoel van eerbied voor vele van deze onderzoekers als men ziet, hoe zij bepaalde vigerende opvattingen met de toen bestaande mogelijkheden van onderzoek hebben verworpen en nieuwe inzichten hebben doen postvatten. Deze inzichten zijn weliswaar niet meer de onze, maar zij hebben de weg gebaand voor de opvattingen welke men zich momenteel over het probleem van de gezwelgroei aan het vormen is. Tot de belangrijkste theorieën die zich momenteel met het probleem van de gezwelgroei bezighouden behoren wel de mutatie theorie, de hormonale theorie en de virus theorie. Kanker is inmiddels niet meer alleen een medisch probleem, het is een biologisch verschijnsel en een verheldering van dit vraagstuk houdt nauw verband met de vooruitgang in een aantal belangrijke gebieden van de hedendaagse biologie. Zoals bij de meeste biologische verschijnselen is het multicausaal, er is niet „één oorzaak van kanker". Men moet dus met een aantal aspecten als physiologische factoren, genetische constitutie, leeftijd van het proefdier en aard van het carcinogene agens rekening houden (HDXLEY 1956).

Belangrijk in dit verband is, dat men door de historische bijdragen weet wat neoplasmata niet zijn, dat ze niet veroorzaakt worden door een bacteriële infectie, behalve de „Crown-gall" bij planten waar de Achromobacter tumefaciens wel een etiologische betekenis heeft. Tumoren zijn ook niet het gevolg van embryonale resten (COHNHEIM), ze zijn niet het gevolg van een differentiatie in de zin van verkregen pluripotentie zoals door FISCHER WASEL geponeerd is en ook niet uitsluitend een ziekte van de oude leeftijd, van de beschaving of van de mens alleen. Tumoren zijn beschreven bij de vertebraten en wel bij alle 5 klassen er van, bij de avertebraten en bij de planten. Het aantal stoffen met een carcinogene werking, dat sedert 1930 bekend is geworden bedraagt nu al verscheidene honderden (HARTWELL 1951) en verwacht mag worden, dat in de volgende 25 jaar deze lijst nog wel met een paar honderd zal worden uitgebreid. In elk geval mag worden aangenomen, dat er veel meer carcinogeenwerkende stoffen bestaan dan tot nu toe bekend zijn. Onder de talloze chemische stoffen, die betrokken zijn bij de gecompliceerde biochemische omzettingen van het lichaam, kunnen zeer wel enige carcinogene stoffen verborgen zitten. Ten gunste van de gedachte, dat het lichaam zijn eigen ondergang bewerkt door de vorming van carcinogene stoffen blijkt bijvoorbeeld, dat het oestron onder bepaalde omstandigheden carcinogeen werkt. (HIEGER 1955, ZELDENRUST 1934.) Bovendien is gebleken, dat ook vetten, in het bijzonder cholesterol, onder bepaalde omstandigheden een carcinogene werking kunnen ontplooien. Dit theoretische intrinsieke carcinogene agens zou een van de normale bestanddelen van het lichaam zijn of mogelijk door een of andere afwijking in het stofwisselingsproces ontstaan. Een variatie van deze intrinsiek-chemische theorie is de onderstelling, dat het agens van buitenaf met het voedsel, de lucht, door bestraling enz. in het lichaam wordt gebracht. Sommige vormen van tumoren worden inderdfiad losgewoeld of vergemakkelijkt door uitwendige carcinogene invloeden als bijvoorbeeld: de huidkanker in zeer zonnige klimaten (STEWART 1955, BOYD 1958), de mondkanker bij betelbladkauwende gemeenschappen (HIEGER 1955), de longkanker bij zware sigarettenrokers of bij de bevolking van rokerige steden en de leverkanker bij slechtgevoede gekleurde volken. Men kan echter zeker niet alle vormen van kanker aan dergeUjke uitwendige factoren toeschrijven. Men kan zuivere muizestammen met door inteelt verkregen erfelijkvastgelegde vatbaarheid voor longkanker, voor spontane mammatumoren, voor leukaemie, in een zelfde laboratorium houden tezamen met niet-vatbare stammen en deze dieren hetzelfde dieet, kortom geheel dezelfde „input" geven zonder dat dit in enig opzicht hun typische eigenschappen beïnvloedt. Het is dus waarschijnlijk, dat sommige vormen door uitwen-

dige prikkels op gang worden gebracht en andere aan interne factoren verbonden zijn. Wat betreft de genetische constitutie vinden we opmerkelijke verschillen in type en voorkomen van tumoren bij verwante species en subspecies. Zo zijn caviae veel minder vatbaar voor tumoren dan muizen en eenden veel minder dan kippen. Deze verschillen moeten op een erfelijke basis berusten (HUXLEY 1956). De genetische constitutie van de gastheer bepaalt ook de mate van vatbaarheid voor infectie met een virus en dus de gevoeligheid voor door virus geïnduceerde tumoren (ANDERVONT 1957). Zo heeft WATERS in 1945 door inteelt kippestammen gekregen met een opmerkelijk onderling verschil in vatbaarheid voor de virussen van vogellymphomatosis en van het Rous Sarcoom. De tegen het Rous Sarcoom virus resistente kippen hebben nog aan betekenis gewonnen sedert men met celvrije filtraten van dit sarcoom tumoren heeft opgewekt bij fazanten (ANDREWES 1942) en eenden (DURAN-REYNALS 1942). De rol van erfelijke factoren bij de vatbaarheid voor tumoren is bij de muis nog het best bekend geworden, omdat men hier door inteelt over stammen kan beschikken met een bekend genetisch patroon. Het is de onderzoeker hierdoor mogelijk gemaakt om de invloed van een virus bij experimenteel verwekte tumoren nauwkeuriger te analyseren. Ook bij de mens vindt men verschillen in de kankerfrekwentie bij diverse rassen. De analyse hiervan bUjft een hachelijke zaak, omdat bij de mens geen zuivere lijnen te verkrijgen zijn en ook de omstandigheden veel meer gecompliceerd zijn dan in het dierexperiment. De familiestamboom is hier wehswaar van betekenis, maar ze moet worden geïnterpreteerd in het ücht van opvattingen en principes verkregen door het experimentele werk met grote aantallen dieren of planten welke gekenmerkt zijn door bekende genetische verschillen. Het feit, dat bij Japanse vrouwen het mamma carcinoom 6 maal minder voorkomt dan bij de vrouwen in West-Europa kan een genetische grondslag hebben, maar hangt zeker voor een groot deel af van niet-genetische factoren als zooggewoonten en onvruchtbaarheid; in Europa ziet men onder de welgestelden een hogere frekwentie van het mamma carcinoom dan in de lagere welstandsklassen. Het hoge percentage levercarcinoom onder de Bantoe negers en Javanen blijkt niet te berusten op een genetische grondslag, maar op een dieet factor (HIEGER 1955). Heel misleidend is wel het zeldzame optreden van het penis carcinoom bij Joden; dit berust niet op een genetische grondslag, maar bUjkt afhankelijk te zijn van vroegtijdige circumcisie (HUXLEY 1956). Het zeldzame optreden van het cervix carcinoom bij ongetrouwde vrouwen en bij alle Joodse vrouwen berust op dezelfde grondslag n.1. doordat het smegma een carcinogene werking heeft (HUXLEY 1956). Er zijn echter bij de mens 4 tumoren beschreven waarvan de erfehjke achtergrond vaststaat n.L het retinoblastoom, de neurofibrosis, de darmpolyposis en het xeroderma pig-

mentosum. Bij dit laatste voorbeeld wordt niet de kanker als zodanig geërfd, maar worden de mensen geboren met een verhoogde gevoeligheid voor het ultraviolette licht. Bij blootstellen aan zonlicht ziet men bij hen een hogere incidentie van huidcarcinomen (STEWART 1955, HUXLEY 1956), Kruising tussen verschillende species of subspecies die ver uit elkaar liggen heeft vaak een onevenwichtig genetisch patroon tengevolge, met het optreden van diverse abnormaliteiten als resultaat; men kan dus (HUXLEY 1956) het optreden van kanker verwachten op genetische grondslag door een verstoord evenwicht tussen groei en de controle van de groei. Een voorbeeld, dat aan de meeste aquarium liefhebbers bekend is heeft men bij kruising tussen bepaalde species van de subgenera Platypoecilus maculatus (rode, goude of zwarte plaatjes) en de Xiphorus helleri, (groene en rode zwaarddragers). De F^ generatie van deze kruising vertoont regelmatig melanomen welke vaak heel groot zijn en fataal voor het visje ^ A N E E L 1953 en GORDON 1954). Onder de zoogdieren wil ik in dit verband noemen het optreden van maligne melanomen bij grijze paarden. Ligt de totale kankerincidentie bij oude paarden (boven de 15 jaar) ongeveer bij 6%, bij de grijze paarden bedraagt deze 8 0 % . (LITTLE geciteerd naar HUXLEY 1956.) Ofschoon de mens niet aan een experimentele inteelt en experimentele proefomstandigheden kan worden onderworpen, heeft men uit het tweelingonderzoek toch wel aanwijzingen, die sterk op een genetische predispositie voor kanker wijzen. De gezwellen bij monozygotische tweelingen zijn als regel van hetzelfde type en komen vaak op dezelfde plaats en op dezelfde leeftijd tot uiting. (STEWART 1955, HUXLEY 1956, VON V E R SCHUER en KOBE 1956). De aanwijzingen van de genetische analyse van kanker zijn duideUjk. AUe grote kruisende populaties, waaronder de mens, zullen grote aantallen genen bevatten, die de vatbaarheid voor kanker beïnvloeden zowel in positieve als in negatieve zin. Het lijkt soms of de erfelijkheid voor de kanker bij de mens geen rol speelt, dit komt door het grote aantal typen van kanker en de genetische heterogeniteit van de natuurlijke populatie (STEWART 1955 en HUXLEY 1956). De sterke variatie in gevoeligheid van de menselijke populatie voor kanker wijst er ook op, dat een grote incidentie van kanker bij bepaalde beroepen, in bepaalde omgeving of door bepaalde gewoonten, alleen kan optreden als deze factoren lang en intens als carcinogene prikkel kunnen inwerken. Een geringe mate van inwerking zal slechts een matige verhoging van de incidentie tengevolge hebben welke echter causaal significant kan blijken, zoals te zien is aan de toename van longkanker bij sigarettenrokers (HIEGER 1955). Men kan dit niet ontwijken door te zeggen, dat sommige mensen die veel roken, geen kanker krijgen en dus het roken niet „de"

oorzaak kan zijn. Bij dit probleem mag men niet spreken van „de" oorzaak, maar moet men denken in termen van multiple correlaties (STEWART 1955 en HUXLEY 1957). Overal waar inteelt wordt toegepast ziet men stammen ontstaan met een bijzondere mate van genetische vatbaarheid voor of resistentie tegen bepaalde vormen van tumoren en de conclusie die men uit het werk met muizen kan trekken is eenvoudig en vérstrekkend, n.1. dat alle vormen van muizecarcinomen onderzocht volgens geschikte methoden een genetische grondslag hebben. Wil men nauwkeurig de invloed van een virus, een carcinogeen agens, een hormoon enz. op de ontwikkeling van een gezwel nagaan, dan is het van enorm voordeel als men weet welke stammen voor de betreffende proef het meest geschikt zijn. Het is bekend, dat het virus alleen in die muizestammen kan blijven leven, die een ^schikte genetische constitutie hebben (ANDERVONT 1945a, HESTON, DERINGER en DUNN). Men kan dus van inteeltstammen gebruik maken om de virusetiologie van een tumor vast te stellen, als men weet welke stam geschikt is als proefdier voor de aanwezigheid van virus. Zo büjkt de aanwezigheid van virus essentieel voor het optreden van het mamma carcinoom bij de muis (BITTNER factor); echter bUjken deze tumoren ook op te wekken te zijn door chemische carcinogene stoffen bij inteeltstammen die geen virus herbergen. Een virusetiologie voor een gezwel bewijst dus nog niet een gelijke etiologie voor alle andere tumoren van hetzelfde type (ANDERVONT 1957). Ook wat betreft de invloed van hormonen wil ik hier kort zijn. Het is waarschijnlijk de onderlinge afhankelijkheid van de voortplantingsorganen, die het uitgangspunt is geweest voor de gedachte ruim 100 jaar geleden, dat verwijdering van de ovaria een gezwelgroei van de mammae zou kunnen tegenhouden. De ovariectomie bleek echter als behandeling van het mammacarcinoom niet succesvol. Toen muizestammen beschikbaar kwamen met een hoge frekwentie van het spontane mammacarcinoom heeft LOEB bij muizen op jonge leeftijd de ovarien verwijderd en gezien, dat het optreden van het mammacarcinoom daarmee voor een groot deel voorkomen kon worden, doordat de mammae in een infantiele toestand bleven. In 1936 heeft LACASSAGNE aan deze gecastreerde vrouweHjke muizen en aan mannelijke muizen uit deze stam follikkelhormoon toegediend en hij zag, dat de mammae zich ontwikkelden en dat deze dieren experimenteel mammacarcinomen kregen in een percentage dat voor de gebruikte stam erfelijk was vastgelegd (DANEEL 1953 en HUXLEY 1956). Op muizen uit erfeUjk onbelaste stammen hebben deze stoffen geen invloed. Het follikkelhormoon behoort dus niet tot de carcinogene stoffen in eigenlijke zin, het is slechts onder bepaalde omstandigheden kankerverwekkend. Tegenwoordig is de meest succesvolle toepassing van hormonale therapie het geven van oestronpreparaten (Stilboestrol) bij prostaatcarcinoom. Hor-

moon therapie voor de behandeling van andere organen is niet bevredigend gebleken; de reden is mogeUjk, dat wanneer een kher die een bepaald hormoon produceert wordt verwijderd, een andere klier als b.v. de bijnier of de hypophyse de functie van de ontbrekende kher kan overnemen. De reeds eerder genoemde vatbaarheid van Bantoe negers voor het levercarcinoom heeft eveneens een hormonaal aspect. Als gevolg van de inadequate voeding ziet men hier vaak op jeugdige leeftijd al een vettige degeneratie van de lever, die daardoor niet meer in staat is om de overmaat aan circulerend vrouwelijk geslachtshormoon af te breken. Beschreven is hoe als gevolg van deze overmaat van circulerend oestron onder de Bantoe negers een hoog percentage van uteruscarcinomen wordt waargenomen (HIEGER 1955). Recente onderzoekingen met Cortison hebben aangetoond, dat dit hormoon een sterke invloed heeft op gevoeUgheid voor virusinfecties (SHWARTZMAN 1950, SABIN 1952, HAREL 1956 en ANDERVONT 1957). Het meest opvallende resultaat van cortisontoediening is misschien wel de verandering van gevoeUgheid van muizen voor coxsackievirussen; normaliter resistente volwassen muizen worden even gevoelig als babymuizen. Deze hormonale stimulatie bUjkt ook van belang bij vele vormen van kanker waaronder sommige door virus opgewekte gezweUen. Spontane leukaemieën bij inteeltstammen werden door LAW (1957) meer waargenomen bij vrouwelijke muizen en door toevoegmg van oestrogeen hormoon kon het optreden van leukaemie nog worden verhoogd; bovendien blijkt, dat de invloed van hormonen (oestrogeen hormoon en Cortison) bij de ene inteeltstam anders is dan bij een andere (STERN en DAVIDSOHN 1955). Ook hier bUjkt dus weer, dat men alle factoren in onderlinge betrekking moet brengen met de activiteit van een virus, wil men de virusetiologie van deze ziekte begrijpen (ANDERVONT 1957). Dat dit geen onmogeUjke taak is kan men leren uit het onderzoek van jaren over het mammacarcinoom bij muizen. Voor de ontdekking van het mammatumorvirus was het al bekend, dat oestrogène stimulatie noodzakeUjk is voor het optreden van mammatumoren. Indien men bij inteeltstammen met een hoge incidentie van spontane mammacarcinomen de vrouwelijke muizen op jeugdige leeftijd castreert, kan men het optreden van tumoren, zoals reeds gezegd, belangrijk drukken. Het samenspel van erfeUjke factoren, hormonale factoren en virusinvloed bij het opwekken van deze tumoren is een fascinerend probleem. Een interessante waarneming hierbij is het vermogen van oestrogeen hormoon om tumoren op te wekken bij afwezigheid van virus (ANDERVONT 1945b). Ditzelfde lukt ook met chemische carcinogeenwerkende stoffen bij virusvrije inteeltstammen. Hieruit bUjkt dus wel, dat dit virus niet essentieel is voor alle mammacarcinomen en dat dus een virusetiologie voor een mammacarcinoom nog niet een gelijke etiologie voor aUe andere tumoren van hetzelfde type betekent (ANDERVONT 1957).

Een theorie die men veel tegenkomt in de Uteratuur over de genese van tumoren is de mutatietheorie waar we in verband met dit overzicht het volgende van zuUen vermelden: Kleine variaties of mutaties bij plant of dier kunnen worden in stand gehouden door selectieve inteelt. Deze mutaties stelt men zich voor als het zichtbare resultaat van afwijkingen gemaakt bij het copiëren van het genenpatroon door de voortplantingsceUen. Evolutie wordt nu gezien als de uitdrukking van opgehoopte mutaties in de loop van de tijd, waardoor het karakter van een soort geheel kan veranderen en nieuwe biologische vormen ontstaan (HIEGER 1955). Behalve het optreden van mutaties in de voorplantingscellen meent men, dat ook mutaties in de ceUen van het volledig ontwikkelde individu kunnen optreden (somatische mutaties). In 1927 deed MÜLLER de ontdekking, dat door röntgenbestraling de mutatiefrekwentie bij Drosophila sterk kan worden verhoogd. Ook de bekende carcinogeen werkende stoffen bleken de mutatiefrekwentie bij het vruchtenvüegje te verhogen. Aangezien tumorcellen radikaal veranderde normale cellen zijn en aangezien deze verandering zowel door mutageen als carcinogeen werkende stoffen teweeggebracht kan worden, is het te begrijpen, waarom deze somatische mutatietheorie zoveel aanhangers telt. (BAUER 1949). Mutaties zouden te begrijpen zijn uit de „treffertheorie", ze zouden het gevolg zijn van de normale moleculaire botsingen, die in verband met de bewegingbevorderende invloeden als temperatuur, röntgenstralen, mosterdgas of andere vormen van energie, zouden opteeden (SCHMIDT 1953 en NORDLING 1953).

Indien een voldoende groot aantal cellen gedurende een voldoende lange tijd aan deze, de moleculake beweging bevorderende, invloeden blootgesteld staan, treden onvermijdeUjk in enkele van hen genmutaties op. Bij de celdeüng, dus bij het herstel, of bij de verdere groei van het weefsel is het mogelijk, dat de gemuteerde ceUen zich sneUer vermenigvuldigen dan de andere cellen en nogmaals muteren. Door meerdere mutaties van eenzelfde gen aan te nemen, meent men de relatie tussen het optreden van kanker met de leeftijd te kunnen verklaren. Indien kanker door één genmutatie veroorzaakt zou worden heeft men een gehjke distributie over alle leeftijden te verwachten na een met de leeftijd corresponderende latentieperiode. Indien hiervoor twee mutaties nodig zijn, zou de kankerfrekwentie toenemen evenredig met de leeftijd, omdat de cellen die reeds eenmaal gemuteerd zijn zich vermenigvuldigen in aantal met een snelheid, die evenredig is met de leeftijd. Bij drie mutaties zou de frekwentie toenemen met de tweede macht van de leeftijd. De lange latentietijd is moeiUjk met de mutatiehypothese in overeenstemming te brengen. Zo ontstaat het röntgencarcinoom vaak pas lang nadat de mutatieve prikkelwerking is opgehouden, zodat er geen aanleiding tot mutatie meer bestaat (SCHMIDT 1953). Volgens deze theorie heeft de carcinogenese een

unicellulaire oorsprong. De lange latentietijd van het teercarcinoom zou zonder meer verklaard zijn als men de oorsprong van een teerwrat in een enkele cel ziet (MOTTRAM 1935). De lange latentietijd zou nodig zijn om die ene cel tot een zichtbare wrat te doen uitgroeien en er zou een rekenktmdig verband zijn tussen de groeitijd en de latentietijd. Het teercarcinoom, als plaveiselceUencarcinoom, groeit relatief langzaam. Deze wetmatige latentietijd vinden wij echter ook bij teersarcomen en in nog duideUjker mate bij de menseUjke tumoren, of het nu gaat om een röntgenkanker of anilinekanker of welk ander gezwel dan ook. Als men zich voor ogen houdt hoe gering het aantal celdelingen behoeft te zijn om het aantal tumorceUen tot in het ongelooflijke te doen toenemen, dan is het wel duideUjk, dat dfeze lange latentietijd voor het overgrote deel der boosaardige gezweUen geen rekenkundige overeenstemming kan bieden (SCHMIDT 1953). Het feit van het uniceUulaire ontstaan van carcinomen is ook niet bewezen. Niemand heeft deze eerste tumorcel ooit onder het microscoop gezien. Daarentegen heeft reeds DEELMAN in 1922 voor het teercarcinoom een multicentrische en multiceUulaire genese aangetoond. De opvatting, dat meer dan één kankercel nodig is voordat maUgne groei kan optreden is later een belangrijk argument bij deze theorie geworden (FISHER en HOLLOMON 1951). De idee van een kritische grootte voor de groei van celkolonies is niet nieuw. Een enkele bacterie zal in een min of meer ongunstige omgeving niet uitgroeien, maar begint men met een aantal bacteriën dan lukt dit wel. Hetzelfde vindt men bij tumortransplantaten; ook deze slaan pas aan wanneer voldaan wordt aan een kritische grootte. Men kan dit, aldus FISHER en HOLLOMON, begrijpen door aan te nemen, dat een bacterie (cel) een in water oplosbare substantie vormt welke het later weer voor zijn stofwisseling nodig heeft. Wordt deze cel in een medium gebracht, dat deze substantie niet bevat, dan zal de door de cel gevormde substantie in het medium diffunderen net zo snel als de cel het aanmaakt en voor de cel bUjft een verdunde oplossing bescliikbaar met als gevolg dat ze dood gaat of niet verder groeit. BUjken er voldoende ceUen in het medium te zijn welke de benodigde substantb vormen, dan zal wat van de ene cel wegvloeit vanuit een naburige cel aan substantie toevloeien. Het totaal verUes aan substantie is bovendien voor een celkolonie kleiner, omdat de omgeving van een celkolonie kleiner is in verhouding tot de omgeving van een enkele cel. Hier kunnen de ceUen dus wel uitgroeien. Voor een mathematische berekening van deze kritische grootte wordt verwezen naar het artikel van FISHER en HOLLOMON. Een kankerfocus zal, aldus deze opvatting een kritisch grote kolonie van kankerceUen zijn. KankerceUen in een subkritisch aantal zullen niet uitsterven maar in een rustende staat blijven, (RUSH en KLINE 1946) zich wat hun groei betreft blijven gedragen als normale ceUen zolang de kolonie 8

niet de kritische grootte heeft bereikt en de mogelijkheid tot het uitgroeien tot een kritische grootte is, naar mathematisch berekend wordt, recht evenredig met de leeftijd (FISHER en HOLLOMON 1951). Aldus geeft de hypothese, dat een kritisch aantal ceUen nodig is voor de ontwikkeling van een gezwel een nieuwe steun aan de mutatietheorie, want hiermee verklaart men kwantitatief de afhankeUjkheid van de leeftijd voor het optreden van gezweUen. Tot de carcinogeenwerkende stoften die in verband met de mutatietheorie van belang zijn, behoort het botergeel (paradiamino azo benzol), een azo kleurstof die bij perorale toediening gezweUen van de inwendige organen oproept (DANEEL 1953). Een kwantitatieve analyse heeft hier geleerd, dat de carcinogene werking aUeen afhangt van de totaal toegediende hoeveelheid botergeel, niet van de grootte der afzonderlijke doses óf de tijd waarover de toediening is verdeeld. Daar zich dus de afzonderlijke doses summeren is de conclusie onvermijdelijk, dat ten eerste de celbeschadiging bij de celdeling wordt doorgegeven en ten tweede, dat de beschadiging wordt teweeggebracht aan celbestanddelen die zich bij de celdeling vermenigvuldigen; anders zou immers bij elke volgende celdeling een verzwakking van het effect moeten optreden. Zulke celbestanddelen, die zich evenals genen en virussen kunnen vermeerderen, worden in navolging van NOHTDURFT (1948) dupUcanten genoemd. Een kwantitatieve analyse leert ook hier weer dat het om meerdere dupUcanten gaat die gemuteerd worden en dat dit zodanige dupUcanten zijn die in elke cel in grote getale voorkomen. DupUcanten bUjken tot het celplasma te behoren en uit nucleoproteïden te bestaan. Tot dergeUjke dupUcanten (repUcating units) zijn te rekenen de plastiden uit het plantenrijk, eenheden als kiUerpartikel in het Paramecium, plasmagenen, virussen en zelfs vreemde stukjes desoxyribonucleïnezuur kunnen kunstmatig worden ingepast in de zichzelf herhalende organisatie van sommige bacteriën (HUXLEY 1957). Tegen de mutatietheorie zijn echter wel enige bezwaren aan te voeren; het bUjkt, dat carcinogeen werkende stoffen en mutageen werkende stoffen elkaar niet voUedig dekken; sommige mutagene stoften werken niet carcinogeen en omgekeerd. Mutatie is een zeldzaam gebeuren; dat kan ook niet anders, immers er zou bij frekwente mutatie geen constantheid van de soort voor een redelijk lange tijd mogeUjk zijn (HIEGR 1955); bovendien is het waarschijnUjk, dat cancéreuse veranderingen plaatsvinden in een aantal ceUen (FISHER en HOLLOMON 1951) en niet in één enkele cel, zoals eerst werd gedacht. Men zou dus moeten aannemen, dat een zelfde afwijking van het genenpatroon geUjktijdig in een aantal ceUen optreedt. Daar het aantal genen in elke cel al in de duizenden loopt, is de waarschijnlijkheid dat eenzelfde afwijking in een aantal ceUen op een identieke

plaats zou optreden, al heel gering en wordt er meer vaü de theorie gevraagd dan ze op kan leveren, vooral als men bedenkt dat ongeveer 1/3 van onze species vatbaar is voor carcinomateuse veranderingen ergens in het Uchaam. Als WHITEMANN, geciteerd naar SCHMIDT, tot de conclusie komt dat mutaties bij rasmenging vooral veel voorkomen dan mag dit waar zijn. Er zijn echter geen aanwijzingen, dat carcinomen bij halfbloeden vaker voorkomen dan bij anderen. Er bestaat ook geen reden om de grotere zeldzaamheid van spontane tumoren bij sommige inteelt stammen toe te schrijven aan een grotere genetische uniformiteit. Een ander belangrijk argument tegen de mutatietheorie, een argument, dat in toenemende mate aan erkenning wint, is de met zekerheid vastgestelde rol van een subceUulair agens bij het Roussarcoom en bij meerdere muizetiimoren. Immers hierdoor wordt voor een deel der gezweUen, die zich in velerlei opzicht als alle andere boosaardige gezweUen gedragen, de grondgedachte van een mutatie als primaire ontstaansreden doorbroken. Geheel anders Ugt de situatie bij de somatische mutatie van de cytogenen en ofschoon de gegevens hierover nog slechts afkomstig zijn van onderzoekingen met imceUulaire organismen als gist en Paramecium, is het toch waarschijnUjk, dat bij het kankeronderzoek van de cel de cytoplasmatische overerving het land van belofte zal kunnen bUjken te zijn (HIEGER 1955). Reeds enkele malen is in dit overzicht gewezen op de invloed van de leeftijd van het proefdier. Het is allang bekend dat met de leeftijd ook de reactie van de gastheer op een infectie met vele virussoorten verandert. Jonge dieren bUjken hetzij meer gevoeUg te zijn, hetzij andere symptomen te tonen (SABIN 1952 en ANDERVONT 1957). De leeftijd is vooral van belang als men het virus brengt in een ander species dan zijn natuurUjke gastheer (DURAN-REYNALS).

Het meest kenmerkende voorbeeld is misschien wel de vatbaarheid van babymuizen voor coxsackievirussen terwijl de volwassen muizen vrijwel voUedig resistent zijn. De meeste succesvoUe pogingen om de soortweerstand te overwinnen bij heterologe overdracht van tumorvirussen bUjken afhankeUjk van het gebruik van jonge proefdieren. DURAN-REYNALS heeft uitgebreide proeven gedaan (1942—1943) om het Roussarcoom op andere species over te dragen en hij vond, dat aUeen 1 à 2 dagen oude eendekuikens vatbaar waren voor gefiltreerde tumorextracten, terwijl dit bij parelhoenders aUeen lukte als ze jonger waren dan 14 dagen. Bovendien bleek (DURAN-REYNALS 1940), dat kuikens niet aUeen veel gevoeUger waren voor het virus van het Roussarcoom dan volwassen kippen, maar dat zij ook met andere laesies reageerden. De invloed van de leeftijd op de gevoeUgheid van virussen weerspiegelt waarschijnUjk het onvermogen van pasgeboren en zeer jonge dieren om antiUchamen te vormen (ANDERVONT 1957).

Weerstand van zeer jonge dieren voor virusinfecties bUjkt vaak gebonden 10

aan een passieve immuniteit verkregen van de moeder (ANDERVONT 1929). De specificiteit van tumorvirussen is nog een van de grootste hindernissen bij de pogingen om een virus aan te tonen in menseUjke tumoren. Het onderzoek van pasgeboren dieren op infectie met tumorvirussen, eventueel gecombineerd met cortison-behandeling of een andere de vatbaarheid bevorderende invloed, zal mogeUjk leiden tot de ontdekking van tumorvirussen door gebruik van heterologe diersoorten (ANDERVONT 1957). In 1952 heeft DURAN-REYNALS een onderzoek beschreven over het gecombineerde effect van methylcholanthreen en vogelpokkevirus bij kippen, waarbij ook weer de tweeledige werking van het vhrus, n.1. hetzij als cel-stimulerend agens bij volwassen kippen of als celvemietigend agens bij de zeer jonge kippen, werd bestudeerd in verband met de toediening van een carcinogeen werkende stof. De vraag die zich voordeed was of virussen behalve destructief ook stimulerend kunnen werken in een daarvoor geschikt miUeu, zoals dit bekend is van virussen bij tumoren van volwassen vogels. Dit geschikt maken van het miUeu, heeft DURAN-REYNALS bewerkt door gebruik te maken van methylcholanthreen als carcinogeen werkende stof. Het bleek hem daarbij dat door de methylcholantiireenbehandeling (periodieke appUcatie met een penseeltje op de kaalgeplukte huid) de jonge kippen van 3 en 30 dagen op dezelfde vräjze reageren als de volwassen kippen, ag hij in de controlegroepen welke wel werden geplukt, doch geen methylcholanthreenbehandeling ondergingen slechts bij 1 van de 73 kippen als gevolg van het latent bij de vogels aanwezige pokkevirus een floride poklaesie optreden, bij de behandelde groepen zad hij dat het latent aanwezige virus geregeld vroegtijdig werd geactiveerd (bij 70% van de vogels). Deze vroegtijdige poklaesies verschenen vanaf de derde week na het begin van de penselingen; sommige hiervan gingen terug, andere gingen blijkbaar over in de meer proUferatieve laesies welke later optraden. Het aantal gezweUen dat ontstond bleek van meerdere factoren af te hangen waarbij het aantal penselingen en de duur der behandeling het belangrijkste leken. Bij de gebruikte kippen zag DURAN-REYNALS zowel papiUomen als angiomen en carcinomen ontstaan, bij duiven aUeen papiUomen en carcinomen. Het is DURAN-REYNALS gelukt het pokkevirus over lange perioden, zich uitstrekkend van de 3e tot 15e maand uit een zelfde vogel te isoleren. Soms echter lukte het in het geheel niet om een virus aan te tonen. In dit verband kunnen drie overwegingen worden genoemd die hier een rol zouden kunnen spelen, n.1. de intensiteit en tijdsduur van de behandeUng, de tijd waarna opnieuw bij hetzelfde dier naar het virus werd gezocht en het type laesie waarbij men naar het virus zocht. Als onder bepaalde omstandigheden vrij virus herhaaldeUjk en met lange intervaUen kan worden geïsoleerd, uit laesies van dezelfde gastheer, lijkt het logisch om aan te nemen, dat er een onvoldoende immunologische 11

reactie van de gastheer ten opzichte van het virus bestaat. BUjkt anderzijds dat het virus onder dezelfde omstandigheden niet uit de laesies geïsoleerd kan worden, dan kan men vermoeden, dat het zich daar in gemaskeerde toestand bevindt. Indien een virus, dat latent in een gastheer aanwezig is, door een carcinogeen werkende stof wordt geactiveerd en als datzelfde virus onder bepaalde omstandigheden later uit de neoplastische laesies, weUce onder invloed van deze carcinogeen werkende stof ontstaan, kan worden geïsoleerd, is het gerechtvaardigd te vermoeden, dat dit virus op de een of andere wijze bij het ontstaan van enkele of van al deze laesies betrokken is geweest. Dit vermoeden kan nog toenemen als bUjkt, dat het virus is begiftigd met een sterk, ofschoon voorbijgaand, vermogen om de celgroei te stimuleren en als men ziet, dat er een geleidelijke overgang bestaat van de vroegtijdige poklaesie opgewekt door het virus naar de latere neoplastische laesies. Deze bevindingen van DURAN-REYNALS zijn de aanleiding geweest om het gecombineerde effect van een virus en een carcinogeen agens op zoogdieren na te gaan. In de experimenten beschreven in de hoofdstukken 3 tot en met 5, is gewerkt met albinomuizen, die met horizontaal retortenteer als carcinogeen agens werden behandeld en met ectromeUa-virus, dermovaccinia-virus en neuro-vaccinia-virus werden besmet. Nadat in dit hoofdstuk werd getracht de invloed van een virus op tumoren te plaatsen in de grote scala van invloeden, die bij het ontstaan van tumoren een rol spelen, zal in het volgende hoofdstuk een Uteratuuroverzicht worden gegeven, dat zich uitsluitend tot deze virusinvloed beperkt.

12

HOOFDSTUK H Literatuuroverzicht van de virusinvloeden bij het ontstaan en de ontwikkeling van tumoren Het samensteUen van een overzicht, dat een beeld wil geven van de invloeden weUce van virussen zijn beschreven bij het ontstaan en het beloop van tumoren, is geen eenvoudige zaak gezien de grote hoeveelheid Uteratuur die hierover is verschenen en de vele experimenten die hierin zijn vervat. Toen BORREL in 1903 voor de eerste maal de virus theorie voor kanker verkondigde, werd hij geïnspireerd door de overigens zeer kortstondige proUferatieve laesies die men in het beginstadium van vele vbrusziekten als pokken en herpes kan waarnemen. In de aangetaste ceUen woekert het virus voort en bij duizenden of nog veel meer bevmden zich de elementair Uchaampjes in eUc van de ceUen. Het leek voor de hand te Uggen, om voor tumorceUen analoge omstandigheden aan te nemen. Het virus zou zich in de ceUen vermenigvuldigen en deze in een bewegingstoestand van versterkte deUng houden. Het enige verschü tussen een pokkenvirus en een carcinogeen vhrus leek te zitten in het cel-oplossend karakter van de een en het cel-stimulerend karakter van de ander. (BORREL, 1903). Pogingen om de virus hypothese te bewijzen hebben zich vooral gericht op de celvrije overdracht van gefiltreerde substraten en ook nu nog geldt de celvrije overdracht als een sluitend bewijsstuk voor een sub-ceUulair etiologisch agens (SCHMIDT 1953). De wemige meldmgeu van succesvoUe pogingen (Rous 1912, GYE 1925) naast de aanvankelijk taUoze mislukkingen werden niet algemeen erkend, deels omdat aan de celvrije overdracht werd getwijfeld, deels omdat de resultaten niet reproduceerbaar waren, maar vooral echter omdat het begrip virusinfectie niet paste in de voorsteUingen welke men toen over de carcinogenese had (OBERLING 1954 en HUXLEY 1956). Met een zeker celvrij filtraat heeft Rous 1911 zijn transplantatie-experimenten met het hoendersarcoom verricht (SCHMIDT 1953). Hierbij lukte de overdracht aanvankeUjk aUeen op kuUcens en dan nog maar in een gering percentage. Bovendien ontwikkelde de door middel van celvrij materiaal overgedragen tumor zich veel langzamer dan bij het celhoudend transplantaat. Aan de aanwezigheid van een subcellulair agens kan, ook als de entingen bij volwassen kippen aanvankeUjk zonder succes zijn, niet meer getwijfeld worden. Mc INTOSH en SELBIE hebben door teerinjecties bij hoenders boosaardige tumoren verwekt. Bij 13

9 van de 11 aldus opgewekte gezweUen lukte het hen de tumoren verder te transplanteren, deels met celvrij materiaal sommige tumoren slechts met celhoudend materiaal. Ofschoon deze tumoren zich dus wat betreft hun celvrije overdracht verschiUend gedroegen is het toch aannemeUjk, dat ze niet alleen door dezelfde carcinogeen werkende stof in casu de teer werden opgewekt, maar dat ook bij aUe hetzelfde subceUulaire agens bij de verdere overdracht werkzaam is geweest, dat zich hier als niet filtreerbaar vertoonde. Dit is later bevestigd geworden (FOULDS 1937, FOULDS en DMOCHOWSKI 1939, OBERLING 1950). FOULDS en DMOCHOWSKI hebben met exteacten van door benzanthraceen opgewekte tumoren, bij hoenders en konijnen antiUchamen kunnen opwekken. Deze antiUchamen reageerden met de filtraten van deze tumoren als antigeen, maar niet met normaal hoenderweefsel. OBERLING en GUEREN hebben over een door methylcholantreen opgewekt hoendersarcoom bericht, dat na vijf passages verder celvrij was over te dragen en waarbij ook het ontstaan van antiUchamen was aan te tonen. HAREL heeft een duideUjke samenhang aangetoond tussen de ontwikkeling van maUgne tumoren bij konijnen opgewekt door het virus van SHOPE en de aanwezigheid van antiUchamen (HAREL 1956). Toen ROUS in 1912 mededeelde dat het bloed van vogels, die geïnfecteerd waren met het overdraagbare en filtreerbare hoendersarcoom, ingespoten in de musculus pectoraUs van normale dieren daar een tumor veroorzaakte, werd dit eenvoudig verklaard door aan te nemen, dat met het bloed ook de daarin circulerende tumorceUen werden overgedragen en dat deze laatste voor het ontstaan van de nieuwe tumor verantwoordeUjk waren. Rous heeft echter ook aangetoond, dat het plasma van de sarcoomkippen infectieus was; dit moest toch voldoende zijn om aan te tonen, dat men de overdracht niet persé in circulerende kankerceUen hoeft te zoeken (Rous 1912). Uit latere onderzoekingen bleek, dat het agens ongetwijfeld in het gezwel zelf aanwezig is en vandaar met de bloedstroom wordt afgevoerd. De verdeling van het agens over het bloedplasma en de vormelementen van het bloed wisselt, soms vindt men meer in het plasma soms meer in de ceUen (PENTIMALLI 1934). Dat bepaalde tumoren door infectie kunnen worden opgewekt is nu wel gebleken. Door onderzoekingen aan het East Lansing Experiment Station in Michigan is dit nog eens duidelijk naar voren gekomen. Er is hier voor de eerste maal enig Ucht geworpen op de epidemiologie van virustumoren, met name bij de lymphomatose van de kip. De lymphomatose onder de kippen is in Europa betrekkeUjk zeldzaam, maar in de grote fokkerijen van de Verenigde Staten komt ze algemeen voor en is tot een ware ramp geworden voor de fokkers, die hierdoor verhezen te dragen krijgen welke vele mUjoenen doUars belopen. Deze alarmerende toestand heeft tot de 14

oprichting van proefstations geleid, waarvan het bovengenoemde door de verkregen resultaten vooral bekend is geworden. De lymphomatose is een aandoening, die oorspronkeUjk aUeen sporadisch voorkwam en refractair was tegen elke vorm van overdracht. In 1941 gelukte het PENTIMALLI in Italië voor het eerst om een overdracht te bewerksteUigen. In het bovengenoemde proefstation heeft men om de natuurUjke overdracht te kunnen bestuderen, de dieren die in observatie waren in absolute isolatie gehouden. Indien men de kuikens direct na het uitkomen gedurende 30 tot 90 dagen isoleert, kunnen ze zonder gevaar bij de geïnfecteerde kippen worden gelaten omdat ze relatief immuun zijn geworden. Worden ze echter kort na het uitkomen in een besmette gemeenschap geplaatst, dan zuUen vele (tot 70%) in verloop van enkele maanden aan lymphomatose sterven en bij de overlevenden ontwikkelen zich endothehomen waaraan ook deze ten gronde gaan (DURAN-REYNALS 1956). Dit kippekankervirus kan zijn gastheer dus aUeen in de eerste weken na het uitkomen infecteren. Het effect van de infectie wordt pas op latere leeftijd manifest door de ontwikkeling van hetzij hetzelfde type tumoren (lymphoblastomen) of andere tumoren, als endothehomen, door variatie van het virus. Het is nu achteraf mogelijk te begrijpen hoe deze lymphomatose, welke voor 1916 praktisch onbekend was in Amerika, snel het karakter heeft aangenomen van een ware epizoötische ziekte, die aUe eigenschappen van een banale infectie vertoont. In Europa is deze aandoening zeldzaam, omdat hier door de wijze van fokken de uitbreiding in de hand wordt gehouden, immers volgens de fokmethoden hier werkt men meestal met een aantal resistente dieren van onzuiver ras. In de Verenigde Staten is de fokmethode uitgelopen tot het in het groot" opfokken van kippen van zuiver ras, hetgeen betekent het bijeenhouden in één fokkerij van duizenden dieren van dezelfde inteelt-stam. Aldus heeft men de ideale voorwaarden geschapen voor het propageren van een virus, zozeer, dat de lymphomatose hier een ware plaag is geworden (OBERLING 1954). Celvrije overdracht door filtratie onderstelt een vrijmaken van het agens, meestal door mechanische beschadiging van de ceL NAKAHARA (geciteerd naar SCHMIDT) heeft in 1928 al aangetoond, dat gedroogd en verwreven hoendersarcoompoeder sterk in carcinogene werking achterstaat bij gedroogd, maar niet verwreven, materiaal. Aangezien de onvolkomenheid van de tot nu toe bekende methoden om een celvrij substeaat te krijgen nog steeds evident is komt de vraag op, of de celvrijheid bij de overdracht onder aUe omstandigheden als sluitend bewijsstuk verlangd moet worden, wanneer het er om gaat uit te sluiten, dat de tumor niet door de overgebrachte tumorceUen maar door een uit deze cellen afkomstig virus wordt opgewekt. Deze vraag is zeker op zijn plaats als de opgewekte tumor histologisch zo sterk van de uitgangstumor af15

wijkt, dat het ontstaan hiervan door uitgroei van getransplanteerde ceUen als onmogeUjk wordt beschouwd. Dergelijke gevallen zijn in de Uteratuur niet zeldzaam. Zo konden EHRLICH en APOLANT door herhaalde transplantatie van muis op muis een carcinoom in drie gevaUen zien overgaan in een carcino-sarcoom, terwijl bij verdere transplantatie de carcinomateuse component geheel verdween en een sarcoom ontstond ( W O L F F ) . Het zelfde is beschreven door RÜSSEL 1910 en FÜJINAGA 1935. De kritiek, dat men hier met spontane tumoren te maken heeft zonder enige etiologische samenhang met de uitgangstumor, is niet zwaar te nemen; samenhang met de eerste tumor is nauweUjks bestreden. Een andere vraag is, of men hieruit een specifieke samenhang met een virus mag afleiden en een prikkelwerking van niet-specifieke aard, zoals APOLANT meent, die door de carcinoomceUen op het bindweefsel wordt uitgeoefend, gevolgd door een tumorvorming, mag uitsluiten. Ten gunste van een specifiek agens pleit hier de korte latentietijd. Deze korte latentietijd is in de aangehaalde voorbeelden wel is waar niet met zoveel woorden genoemd, ze is echter zeker aan te nemen, want na het aanslaan van een transplantatietumor gaat het proefdier als regel tameUjk snel ten gronde en in dit tijdsinterval tussen transplantatie en dood van het proefdier komt het nieuwe carcinoom of sarcoom tot ontwikkeling, dit is sneUer dan met carcinogeenwerkende stoffen aUeen mogeUjk zou zijn (SCHMIDT 1953). De vraag bUjft waarom bij zoogdierexperimenten de pogingen tot celvrije overdracht veel moeüijker zijn dan bij het hoendersarcoom. FOULDS neemt aan, dat het agens bij de hoendertumoren een vast „Virus protoplasma celcomplex" vormt ^ O U L D S 1937). De celvrije overdracht hangt er nu van af of het mogeUjk is dit complex te verbreken zonder het virus te beschadigen. Deze gedachtengang is zonder meer op zoogdiertumoren over te brengen. Men kan hier een nog vastere binding aannemen en ook een binding aan andere celbestanddelen waardoor het complex van een andere grootte orde wordt en de filtieerbaarheid niet meer mogeUjk is, althans niet met de fijnere filters. Het kriterium van de celvrije overdracht, hetgeen toch al een arbtrair kriterium is, zou daardoor komen te vervaUen. Sommige onderzoekers (OBERLING 1952) gaan zo ver, dat naar hun mening elke tumor door een vicus wordt veroorzaakt en het feit, dat in de meeste gevaUen geen afzonderlijk overdraagbaar agens kan worden aangetoond, wordt door hen toegeschreven aan de latente of gemaskeerde toestand waarin het virus verkeert en waardoor het bij de huidige mogelijkheden van onderzoek nog niet aangetoond kan worden (OBERLING 1954). Deze état masqué of latente fase is inderdaad een van de grote moeiUjkheden welke men ontmoet bij de experimentele studie van tumoren verwekt door virussen. Een tumor weUce zeker door een virus wordt veroorzaakt is het SHOPE papUloom bij het cotton tail konijn (Genus Sylvilagus) in Amerika. Hier veroorzaakt het virus grote papillomateuse woe16

keringen welke soms geresorbeerd worden, soms bUjven bestaan en in de minderheid der gevaUen kwaadaardig worden (HUXLEY 1956). De dieren die deze tumoren met zich dragen ontwikkelen ten opzichte van het virus antiUchamen waarvan de titer stijgt al naarmate de tumor zich ontwikkelt (Rous, KIDD en SMITH). Deze wratten kunnen door celvrije fütraten bij andere konijnen van het geslacht Sylvilagus worden opgewekt en ook lukte dit bij het gedomesticeerde konijn (Genus Oryctolagus). De virus partikeltjes zijn morphologisch niet te onderscheiden van die uit goedaardige menseUjke wratten. Bij het gedomesticeerde konijn echter groeien de wratten veel sneUer, ze worden als regel maUgne, maar men kan er geen virus meer uit isoleren (KOCH 1953, OBERLING 1954 en HUXLEY 1956). Deze tumoren zijn dan ook niet door middel van een celvrij filtiaat over te dragen (OBERLING 1954). Het tumorweefsel bevat wel virus, echter niet meer in zijn oorspronkeUjke corpusculaire vorm maar in de vorm van een vreemd eiwit, dat aUeen nog door zijn serologische reacties van zijn bestaan bUjk geeft en dat niet door middel van een celvrij filtraat is over te dragen (OBERLING 1954). Maar zelfs bij tumoren welke wel door filtraat overdraagbaar zijn zoals het sarcoom van Rous, dat altijd vrij virus in grote hoeveelheden bevat, is het aantal ceUen waarin de aanwezigheid van corpusculair virus onder het electronenmicroscoop aangetoond kan worden, verbazingwekkend klein. Het bUjkt, dat de korrels slechts te vinden zijn in ceUen vlak voor hun lysis en dat het aantal aangetaste ceUen zeer klein is vgl CARR 1 op 3000 ceUen. In dit verband moet gewezen worden op een onderzoek van CONSTANTIN en FEBVRE 1956. Neemt men aan, dat insluitsels van virale afkomst FEULGEN-positief moeten zijn omdat ze desoxyeribonucleinezuur bevatten, dan kan men bedrogen uitkomen. Uit het onderzoek van CONSTANTIN en FEBVRE bUjkt namenUjk, dat virale insluitsels bij jonge tumoren steeds FEULGEN-positief zijn en dat bij volwassen dieren, waarbij de tumoren een zekere tijd, die nooit precies is aan te geven, hebben gegroeid, de insluitsels FEULGEN-negatief kunnen worden, doordat de virusdeeltjes hun desoxyribonucleïnezuur verhezen en zich in tegenstelling daarmee beladen met muco-polysacchariden gekoppeld aan eiwitten. Ook WOLMAN beschrijft hoe de hoeveelheid desoxyribonucleïnezuur eerst in de insluitsels stijgt, tot een bepaalde hoogte bereikt wordt, waarna het kan verdwijnen, zodat het insluiüichaampje FEÜLGENnegatief wordt (WOLMAN 1955). Dit is voUedig in overeenstemming met de waarneming van WOODRUFF en GOODPASTURE omtrent het infectieuze vermogen van jonge insluitUchaampjes in tegensteUing tot de oude insluitlichaampjes. De bevindingen van CONSTANTIN en FEBVRE zijn doorBAUER en CONSTANTIN in 1956 17

nog door een onderzoek met het electronenmicroscoop bevestigd. Het is dus begrijpelijk dat een zelfde insluiüichaampje door de ene auteur als FEULGEN-positief kan worden beschreven en dus een aggregaat van elementair Uchaampjes vertegenwoordigt, terwijl de volgende auteur op grond van het FEULGEN-negatief zijn het virale karakter ontkent. Het aanwezig zijn van FEULGEN-positieve insluitUchaampjes is dus een sterke aanwijzing voor de virale aard van een proces, het FEULGEN-negatief zijn sluit de virale aard nog niet uit, het is pas uitgesloten als ook in een jong stadium van ontwikkeling de insluitUchaampjes FEULGEN-negatief zijn (WOLMAN 1955). HAREL heeft op duizenden endotheUoomceUen geen corpusculairvirus gevonden, ofschoon dit gezwel gemakkeUjk celvrij overdraagbaar is. Men moet dus wel concluderen, dat zelfs bij de filtreerbare vogelsarcomen, prototype van tumoren veroorzaakt door een virus, het grootste deel van het agens zich niet bevindt in corpusculaire maar in gemaskeerde staat. Het is bekend, dat het virus na het binnendringen in een cel uiteenvalt in genetische eenheden en dat deze de synthese van de verschiUende bestanddelen van het toekomstig virus in gang zetten. In een laatste fase verenigen zich al deze bestanddelen om het corpusculaire virus te vormen, een proces dat meestal gepaard gaat met de dood van de cel. Het is dus te begrijpen, dat de korrels slechts te vinden zijn vlak voor de lysis van de cel. Het kan nu gebeuren, dat deze laatste fase van de reproductie cyclus zich niet voltrekt en het virus dus in een incomplete vorm als gemaskeerd virus bUjft Uggen, waarbij geen insluitUchaampjes aantoonbaar zijn. Deze vorming van incompleet virus ziet men vaak als een virusstam wordt geënt in een miUeu waaraan het nog niet geheel is aangepast (SCHLESINGER 1950). Ook bij een eng cytotropisme zoals bij het SHOPE virus, zal het virus vaak in gemaskeerde toestand bUjven. Om evenwel het recht te hebben van een infectie met gemaskeerd virus te spreken, moet men de aanwezigheid van een vreemd eiwit in de neoplastische weefsels aantonen. (OBERLING 1954). Een andere moeiUjkheid is een gevolg van het feit, dat de infectie van virustumoren sterk aan bepaalde voorwaarden is gebonden. Het virus is sterk specifiek, zowel voor de diersoort als voor het weefsel. Het geval van bepaalde sarcomen of leukaemiën bij vogels, welke men zonder moeite van het ene dier op het andere kan overbrengen, is in feite een uitzondering. In het merendeel der gevaUen zijn het slechts de zeer jonge dieren welke ontvankeüjk zijn (DURAN-REYNALS 1942). Het SHOPE virus toont uitsluitend een affiniteit voor de epitheelceUen van het wüde en tamme konijn. Pogingen om het op andere dieren over te enten (Ratten, Muizen, Caviae en Katten) zijn zonder resultaat gebleven (Rous). Het Rous sarcoom meende men strikt specifiek te zijn voor de kip als 18

species en voor het bindweefsel als weefsel. In 1942 bleek dat het virus aangepast kon worden aan andere vogelsoorten als de eend (DURAN-REYNALS 1942) en aan parelhoenders en fazanten (DURAN-REYNALS 1943). Het lukte echter aUeen als de infectie plaats had bij pas uitgekomen kuikens van één dag oud of Uever nog jonger. De resulterende laesies konden worden onderscheiden in vroege laesies, welke optraden na enkele weken, of late laesies, welke pas na enkele maanden optraden. De vroeg optredende laesies waren of destructief, namelijk haemorrhagische aandoeningen der ingewanden, of sarcomateus, waarbij het optredend sarcoom identiek bleek met de oorspronkeUjke kippetumor. Deze sarcomen konden niet worden gepasseerd op oudere eenden, maar ze bleven infectieus voor kippen van aUe leeftijden. Bij de leasies die na enkele maanden optraden, zag men tumoren van verschiUend type, die in het algemeen niet meer op de volwassen kip waren terug te voeren, maar waarmee men wel zonder moeite volwassen eenden kon infecteren. Het virus was dus veranderd, het was aangepast aan de eend. Zelfs daar waar de tumor morfologisch op de originele kippetumor leek, bleek er toch nog een biologisch verschil met het oorspronkeUjke virus, onder meer door een verschü in affiniteit tot andere gastheren. In sommige gevaUen bleek het mogeUjk met dit eendevirus andere vogels te infecteren en daar tumoren op te wekken. Al deze eende tumor-varianten, onafhankeUjk van hun gastheerspectrum, bleken opnieuw aan de kip aangepast te kunnen worden, de kip wordt dan niet geïnfecteerd door het oorspronkeUjke kippevirus, maar door een aan de kip aangepast eendevirus. De laesies die na enkele maanden optreden bUjken ook niet identiek te zijn met het oorspronkeUjk Roussarcooom. Dit proces van variatie van kankervirussen bUjkt dus voUedig afhankeUjk te zijn van de leeftijd van de ontvangende gastbeer. Maar ook de leeftijd van de gastheer die het virus levert bUjkt van belang, want de aanpassing aan de eend lukt aUeen bij kippen van de juiste leeftijd. Bij te jonge of te oude kippen zijn de resultaten voUedig negatief. De strenge specificiteit van carcinogene virussen bUjkt dus relatief te zijn. Voorbeelden van het doorbreken van de specificiteit kan men ook elders vinden. Bekend is het adenocarcinoom bij de Rana pipiens verwekt door het virus van LUCKÉ. Ook hier meende men, dat het virus streng specifiek was voor de kikker en voor het nierweefsel, want inociüatie langs welke route ook resulteerde aUeen in niertiimoren. Later bleek dat bij enting in de oogkamer, naast de renale groei, een lokale groei in het oog kon optreden. Door enting in de oogkamer kon men ook bij resistente kikkerrassen een groei doen optreden, ofschoon geen renale tumor optrad. Tumorgroei in de oogkamer neigt aanvankelijk tot regressie om dan na enkele maanden opnieuw te verschijnen, zowel bij de vatbare als bij de resistente kikkerrassen (geciteerd naar DURAN-REYNALS 1956). Door verdere passages lukt 19

het om bij resistente kikkers tenslotte ook weer renale tumoren te verwekken. Tenslotte is het gelukt, om uitgaande van deze renale tumoren bij kikkers door implantatie in jonge water-salamanders (Trituras viridescens) ook hier een tumorgroei te verwekken. Dit bUjkt dan geen carcinoom van de nier te zijn, maar een osteochondrosarcoom. Indien dit osteochondrosarcoom van de water-salamander wordt terag geïmplanteerd in de oogikamer van een kikker wekt het zowel renale carcinomen als sarcomen op en bij verdere transplantaties in kikkers komt ook een affiniteit voor bindweefsel, spieren, lever en nog andere weefsels voor de dag (DURANREYNALS 1956). Hier is dus een voorbeeld van een kankerviras, waarvan de specificiteit naar aUe richtingen doorbroken is, zowel wat gastheersoort als wat de weefsel-affiniteit betreft. Dit zijn bevindingen die de hoop rechtvaardigen, dat ook bij het onderzoek van menseUjke tumoren mogelijk een virus kan worden aangetoond door gebraik te maken van heterologe diersoorten (DURAN-REYNALS 1956 en ANDERVONT 1957). Deze dieren zouden dan, hetzij een vroegtijdige haemorrhagische afwijking tonen, of anders later de ontwikkeUng van tumoren, die niet identiek behoeven te zijn aan de uitgangstumor. Men zou deze resultaten nog kunnen verbeteren door de dieren vooraf te behandelen met Cortison (ANDERVONT 1957). Deze oncotrope invloeden van virassen worden niet door iedereen aangenomen, ze blijken althans niet algemeen geldend te zijn. Er zijn de laatste tijd ook meldingen verschenen van virassen die vernietigend werken op tumoren. Bij proeven in vitro, in weefselcultures van celUjnen van bepaalde tumorstammen, gaven sommige virassen een duideUjk oncolytisch effect, andere bUjken geen invloed te hebben op de tumorgroei en sommige werken bevorderend op de tumorgroei (MOORE 1952). Dit lukte aUeen met actief virus en er was een zekere tijd nodig, afhankelijk van de hoeveelheid geënt viras, om het effect te doen optreden. Deze tijd kan men beïnvloeden door het medium te veranderen of door de gastheerceUen te behandelen met chemicaUën of door toevoeging van immuunserum (MOORE 1957). De grootte of de leeftijd van de tumor bleek hierbij niet van invloed op de vatbaarheid voor deze oncolytische werking. De virussen die men in dit opzicht heeft bewerkt zijn aUe neurotrope virassen, merendeels behorend tot de zogenaamde exotische virussen. Deze virassen werden vooral voor dit doel uitgekozen, omdat onze bevolking tegen deze virussen geen anti-Uchamen heeft en bij velen van hen bovendien niet bekend is, dat ze tot ernstige ziekten aanleiding geven en tenslotte, omdat deze virussen enig oncolytisch effect ten opzichte van muizetumoren hebben getoond (MOORE 1957). Het is een hele reeks virassen geworden waartoe o.a. behoren het West-NUe, Ilhéus, Bunyamwera, Dengue, Semliki Forest, St. Louis encephaUtis, Western Equme EncephalomyeUtis, Rabies, Gele koorts 17D, Neurotrope influenza A, Bof, en het Neurotrope vaccinia-viras. 20

Het neurotrope vaccinia-viras bleek bij een onderzoek van MOORE tegen 3 van de 13 onderzochte tumoren effectief te zijn (MOORE 1952). Indien men een oncolytisch viras aan experimenteel verwekte tumoren toedient dan bUjkt, dat de vatbaarheid voor de virasinfectie wehswaar toeneemt m het verloop van het neoplastische proces, maar dat deze infectie bij de kankerdragende muizen geheel asymptomatisch verloopt en in genendele het verloop van het maligne proces op enig tijdstip beïnvloedt (KOPROWSKA en KOPROWSKI 1957). Het oncolytische effect, dat sommige hiervan in vitro tonen, lijkt specifiek te zijn; dat wü zeggen, dat een bepaald viras sommige tumoren wel en andere weer niet aantast (POLLARD, BUSSEL en SNYDER 1954). Het verdient om deze reden dus aanbeveling, om indien men bij een patiënt met een tumor met therapeutische oogmerken een van de onderzochte neurotrope vkussen wü toedienen, eerst in vitro het gevoeUgheidsspectrum te bepalen. De weefselkweek methode waarbij dus het virus op geëxplanteerd tumorweefsel afkomstig van de patiënt wordt toegediend, kan hierbij als gids dienen. Dergelijke proeven zijn bij ongeneesUjke patiënten met toestemming van de patiënt meerdere msüsa gedaan, echter steeds zonder succes (POLLARD, SNYDER 1954). Hiervoor zijn verschülende redenen aan te geven. Het is niet altijd mogeUjk, dat het viras de tumor bereikt, alleen bij de toegankelijke tumoren kan men een virassuspensie direct in de tumor spuiten. Een andere reden is het vormen van anti-Uchamen bij de gastheer. Het is teleursteUend, dat als een vkus oncolytisch werkt en een gat maakt m een tumor, dat dan de hnmuniteitsreacties bij de gastheer zo snel optreden, dat aan de verdere vermenigvuldigmg van het vhrus paal en perk wordt gesteld. Het effect istijdeUjken de tumor hervat zijn groei. Dit is een probleem, dat men in vitro niet heeft en waardoor een ontbrekende correlatie tussen de in vitro en m vivo bevindingen zou zijn te verklaren. Ook de beïnvloeding van de immuniteit door röntgenbestraUng of door toediening van Cortison heeft geen effect gehad. Pogingen om door verschiUende achtereenvolgende virasinfecties met oncolytische virassen, voor dat optredende immuniteitsreacties het effect afbreken, een voortgaande oncolyse in vivo te bewerken zijn nog in gang (MOORE 1957). Voorlopig bUjkt dus, dat sommige virassen wel iets doen in de zin van een oncolyse, maar dat hun mogelijkheid als genezend agens voor patiënten nog nihü is. Er zijn aanwijzingen, dat vkussen ook op een andere wijze dan door oncolyse, invloed op de ontwikkeling van tumoren kunnen uitoefenen. Het is juist de combmatie van carcinogeen agens plus viras welke een grote stoot heeft gegeven tot de ontwikkeling van nieuwere opvattingen omtrent de tumor-genese. Deze opvattmgen zijn voortgekomen uit de waarnemingen gedaan bij geconditioneerde tumoren m 1941 (BERENBLUM 1941, MCKEBZIE en Rous 21

1941, Rous en KIDD 1941), dat de carcinogenese — het proces dat leidt tot het eerste verschijnen van een tumor — is opgebouwd uit twee afzonderUjke fasen met afzonderlijke mechanismen. Vroeger zag men de carcinogenese als een langdurend continu proces, doordat bij de experimenten het carcinogene agens gedurende lange tijd zonder onderbrekingen regelmatig werd toegediend. Hierdoor kon geen verandering aan het Ucht treden in de latentieperiode, welke aan het optreden van de papiUomen voorafgaat. De eerste sleutel hiertoe verkreeg men pas, toen de carcinogenese onder sub-optimale omstandigheden werd bestudeerd (BERENBLUM 1944), Na een sub-optimale behandeling — een te korte of slechts eenmaUge appUcatie van het carcinogeen agens op de huid — ziet men gewoonUjk slechts een enkele tumor tevoorschijn treden. Toch kan men op deze huid een aanzienUjk aantal tumoren laten opkomen door deze voorbehandelde huid te onderwerpen aan bepaalde prikkels, die zelf nog niet carcinogeen behoeven te werken (BERENBLUM 1941, MCKENZIE en Rous 1941, Rous en KIDD 1941, FRIEDEWALD en Rous 1944, en MOTTRAM 1944). Men heeft dit verklaard door aan te nemen, dat in deze eerste fase enkele normale epitheelceUen omgevormd worden tot latente tumorceUen, tumorceUen die in een „slapende" toestand bUjven totdat ze door een verdere prikkel tot progressief groeiende tumorceUen worden. Deze overgang van normale ceUen tot slapende tumorceUen wordt in navolging van Rous de „initiating action", op-gang-brengende werking genoemd, terwijl de overgang van rustende tot een actief groeiende tumorcel de „promoting action", groeibevorderende werking wordt genoemd. De tumor-op-gang-brengende werking verloopt snel (MOTTRAM 1944, BERENBLUM en SHUBIK 1947), ze is irreversibel en bUjft gedurende lange tijd bestaan. De groeibevorderende werking daarentegen verloopt langzaam en is toe zekere mate reversibel. Als de groei-bevorderende prikkel ophoudt kunnen de opgewekte tumoren weer teraglopen. De tumoren, die op deze wijze worden opgewekt, ontstaan als de groeibevorderende prikkel volgt op een kortdurende op-gang-brengende prikkel, maar niet als men deze procedure omkeert (BERENBLUM 1941). Het is van essentieel belang een onderscheid te maken tussen de op-gang-brengende en de groeibevorderende elementen, niet aUeen voor de waardering der afzonderlijke carcinogeen werkende stoffen, maar vooral ook, omdat invloeden die de celvermenigvuldiging stimiüeren soms van kritische betekenis zijn voor de ontwikkeling van een kanker. Als voorbeeld moge hier op de betekenis van de wondgenezmg voor de ontwikkeling van tumoren worden gewezen. De mogeUjkheid van een secundaire tumor, als men een röntgencarcinoom chirurgisch verwijdert, op de plaats waar de pathologische huid geneest, is een reëel risico (FRIEDEWALD en Rous 1943). 22

Op de betekenis van het trauma als groeibevorderende factor bij experimentele teergezweUen is reeds door DEELMAN in 1924 gewezen. Hij zag bij zijn teermuizen zowel papiUomen als carcinomen optreden bij de wondgenezing. Rous en KIDD hebben door herhaalde tering van de huid bij konijnen tumoren opgewekt. De wratten ontwikkelden zich al vroeg en sommigen toonden reeds gedurende de periode van de tering een regressie. Toen met het teren werd opgehouden Uepen alle wratten in grootte terag, slechts enkele papiUomen ontwikkelden zich tot carcinomen. maar pas na lange tijd (6 à 7 carcmomen bij ± 200 geteerde konijnen). (Rous en KIDD 1931 en 1941, FRIEDEWALD en Rous 1944, FOULDS 1954.) De meeste papülomen komen niet verder dan de „subthreshold neoplastic state", van waaruit door de groeibevorderende prikel geconditioneerde tumoren kunnen worden opgeroepen. Bij muizen loopt het proces iets anders (BERENBLUM en SHUBIK 1947). De papiUomen ontstaan iets later dan bij de konijnen, sommigen lopen in grootte terag (LEITCH 1922, Rous en KIDD 1941, MCKENZIE en Rous 1941, FRIEDEWALD en Rous 1944 en FOULDS 1954). Sommigen groeien enige tijd als papiUoom verder en bUjven dan stationair, sommigen bUjven als papiUoom verder groeien en sommige papiUomen tenslotte gaan over in carcinomen (GLÜCKSMANN 1945). Bij de muis zijn enkele gezweUen van de beginne af al kwaadaardig en wanneer met de teerappUcaties regelmatig wordt doorgegaan, ziet men bij bijna elke muis carcmomen ontstaan (LEITCH 1942, MOTTRAM 1934, GLÜCKSMANN 1945,

en RITCHIE 1953). Indien het teren wordt gestaakt, ziet men papiUomen en carcinomen zich ontwikkelen net als bij voortdurend geteerde muizen, aUeen wat trager en sommige papiUomen lopen in grootte terag. De grootte van de vertraging en het aantal wratten, dat teragloopt in grootte hangt af van het tijdstip waarop met het teren is gestaakt (LEITCH 1922 en FOULDS 1954). Teer en andere carcinogeenwerkende stoffen hebben zowel een tumor-op-gang-brengende als een groeibevorderende werking. Deze groeibevorderende werking kan ook door niet-carcinogene stoffen of andere factoren, zoals wondgenezing, trauma (MCKENZIE en Rous 1941 en FOULDS 1954), verbranding, dieet, worden uitgeoefend. Een van de sterkste groeibevorderende stoffen is crotonoUe. Door crotonolie of een ander niet specifieke prikkel aan een carcinogeen werkende stof toe te voegen, kan men de werking daarvan accentueren. Indien men een carcinogeen agens toedient tot kort voor het uitbreken van de tumoren en dan de toediening door crotonoUe vervangt, ziet men dezelfde hoeveelheid tumoren opkomen op dezelfde plaats en van hetzelfde karakter als bij appUcatie van het carcinogene agens aUeen (KLINE en RUSCH 1944). De tumoren opgeroepen door de crotonoUe zijn dezelfde als die welke opkomen door het toedienen van het carcinogene agens aUeen. De op-gang-brenSHUBIK, BASERGA

23

gende werking van het carcinogene agens bepaalt dus de bijzondere aard van het gezwel en het aantal dat zal opkomen, door de crotonolie wordt aUeen beïnvloed wanneer ze zullen komen. De tumoren welke door de crotonoUe worden opgeroepen bUjven verder bestaan als de sthnulus wegvalt; het zijn dus geen geconditioneerde tumoren zoals de papiUomen bij het konijn of de muis. Te oordelen naar deze gegevens verschüt de werking van crotonoUe essentieel van de groeibevorderende werking zoals door Rous beschreven; beter past hier de term „developing agent" zoals voorgesteld door MOTTRAM. Promoting and developing agents zijn op zich zelf niet carcinogeen, zij roepen slechts tumoren op, waarvan de eigenschappen al bepaald zijn door de voorafgegane op-gang-brengende werking van het carcinogene agens. In andere opzichten zijn ze verschiUend. De developing agents versneUen slechts een proces, dat langzaam verloopt zonder hun aanwezigheid, en de tijd hiervoor nodig is veel groter dan bij de promoting agents. Het belangrijkste verschü is echter gelegen in de resultaten, want terwijl groeibevorderende stoffen geconditioneerde tumoren oproepen en in stand houden, zullen developing agents na lange tijd tumoren oproepen welke dan verder bUjven voortgroeien zonder deze agentia. De observaties bij konijnen en muizen vuUen elkaar aan, promoting action ziet men meer bij konijnen, developing action meer bij muizen. Hoe ook de verandering van papiUoom tot carcinoom plaatsvindt, plotseUng of geleidelijk, ze is een nieuwe stap in de ontwikkeling van de tumor (GLÜCKSMANN 1945, FOULDS 1954). De frekwentie van carcinomen die rechtstreeks als zodanig ontstaan of via omvormmg uit papiUomen, hangt volgens SHUBIK meer af van de tijdsduur dan van de intensiteit van de carcinogene werking. Algemeen ziet men, dat hoe minder het aantal appUcaties van het carcinogene agens is, des te kleiner ook het aantal rechtstreeks maUgne gezweUen is. De ontwikkeUng van goedaardige tot kwaadaardige gezwellen kan langzaam verlopen, ze kan tot stüstand komen en zelfs teraggaan, zoals reeds is beschreven. Indien bij een muis de ontwikkeling van dit proces niet is voltooid, dat wU zeggen als er geen maUgne gezweUen zijn opgetreden, dan kan men door serie-transplantaties op normale muizen deze ontwikkeUng verder doen gaan. Hierait bUjkt, dat deze progressie niet afhankeUjk is van de aanhoudende inwerking van het carcinogene agens dat de tumor op gang heeft gebracht. De progressie bij de tumor-transplantaten verloopt ongeveer als een voUedige progressie bij een en dezelfde gastheer. Transplantatie geeft extoa tijd voor de werking van etiologische agentia en vergroot de gelegenheid voor nieuwe veranderingen om op te treden. Het is niet aangetoond of transplantatie een progressie opwekt of sti24

muleert. De snelheid en mate van deze progressie wordt waarschijnUjk bepaald door de werkingsduur van de tumor-op-gang-brengende invloed. Is de tumor hierdoor voldoende ver ontwikkeld, dan wordt de progressie verder onafhankelijk van specifiek carcinogene prikkels. Worden muizen maar korte tijd aan carcinogeen werkende stoffen blootgesteld, dan komen de huidtumoren als regel niet voorbij het papiUoomstadium (FOULDS 1954). Vermeldenswaard in dit verband is, dat chemotherapeutica vaak een opmerkeUjk lange periode van remissie der symptomen geven, met een in de hand houden van de groei van het gezwel, zonder dat echter het leven van de patiënt er noemenswaard door wordt verlengd. De snelheid van de terminale fase vormt hier een tegenwicht ten opzichte van de remissie, welke een gevolg was van de behandeling. De progressie gaat bUjkbaar door, onafhankeUjk van de behandeling of groei van de tumor, ze is dus te oordelen naar deze gegevens onafhankelijk van de grootte of klinische duur van het gezwel. Een tumor kan nog jong zijn, te oordelen naar zijn grootte en leeftijd, maar ver voortgeschreden wat betreft de progressie van agressieve eigenschappen, en omgekeerd kan een grote tumor, die al lang bestaat, zich nog in een vroeg stadium van progressie bevinden. Het vermogen tot progressie is, aldus FOULDS, waarschijnUjk inherent aan de aard van de tumor. Een gevolg van deze opvatting voor de kliniek is, dat aUe vormen van therapie welke geen totale uitroeiing van het gezwel betekenen, tot mislukking zijn gedoemd omdat door de progressie de tumor zich ontwikkelt naar een toestand waarbij ze niet meer reageert op prikkels welke aanvankelijk de groei konden bedwingen (SHUBIK, BASERGA en RITCHIE 1953). Heeft men zich over de op-gang-brengende werking van een carcinogeen agens geen duideUjk omschreven beeld gevormd, over de groeibevorderende werking heeft men dit nog evenmin. BERENBLUM meent een verklaring te moeten zoeken in de uitgestelde rijping van cellen gepaard met de vorming van een kritisch aantal slapende tumorceUen (BERENBLUM 1954). Het aantal stamceUen, ceUen in de germinatieve laag van het huidepitheel, is normaUter manifest constant. Bij deUng schuift de helft der ceUen naar boven, het rijpingsproces tegemoet, de andere helft bUjft als stamcel achter. Bij een regeneratie-hyperplasie ziet men een verhoogde celdeling, vergezeld echter van een even sterk verhoogd aantal dode ceUen aan de oppervlakte, zodat een nieuw evenwicht bereikt wordt met meer rijpende en afstervende ceUen, maar met niet meer stamceUen. De groeibevorderende werking daarentegen vooronderstelt een verhoogd aantal neoplastische stamcellen, dus van cellen die door een voorafgaande tumor-op-gang-brengende werking tot slapende tumorceUen zijn geworden. Aangezien het ophopen van stamceUen normaliter door het rijpmgspro25

ces wordt verhinderd, betekent dit dat de groeibevorderende werking een proces van uitgestelde rijping inhoudt. Uitgestelde rijping aUeen is niet voldoende om de groeibevorderende werking te verldaren, aangezien het geen verklaring kan geven voor de mogelijkheid, dat de resulterende tumor op een gegeven moment door bUjft groeien zonder dat daarvoor nog enige groeibevorderende werking nodig is. De sleutel hiertoe zoekt BERENBLUM in de reeds vaker geopperde conceptie van een kritisch aantal tumorceUen naar analogie van het kritische aantal ceUen dat nodig is, om fibroblasten en monocyten in een weefselcultuur te doen groeien of kleine transplantaten in vivo te doen aanslaan. Ofschoon er histologisch zeker aanwijzmgen zijn welke voor een uitgestelde rijping bij tumoren spreken, is de onrijpheid van de ceUen eerder het gevolg van de sneUe groei van de tumor dan dat ze de oorzaak zou zijn van de ontwikkeling ervan. Een kwantitatieve benadering van dit probleem is afkomstig van GLÜCKSMANN 1945, die de verhouding nagmg tussen de StamceUen, rijpende en dode ceUen in het epitheel van de huid bij muizen behandeld met carcinogene en niet-carcinogene agentia. Hij zag een relatieve en absolute toename van het aantal stamceUen na carcinogene behandeling en hij komt tot de conclusie, dat de hyperplasie als gevolg van de carcinogene ibehandeling een uitgestelde rijping van het epitbeel met zich meebrengt, niettegenstaande de tegengesteld gerichte aanwijzingen van een duideUjker differentiatie van het epitheel dan in de normale muishuid wordt gezien. Meende GLÜCKSMANN nog, dat het gehele gebied waar een „pre-neoplastische" hyperplasie waarneembaar was bij het carcinogene proces betrokken zou zijn, hiertegen kwam al spoedig wantrouwen doordat men de tumoren vaak haardsgewijs zag optreden. De diffuse hyperplasie in de vroege stadia bij het bestrijken van de huid met een carcinogene stof moet men volgens latere opvattingen zien als een neveneffect, niet gebonden aan het carcinogene proces, behalve in zoverre het de enkele slapende tumorceUen beïnvloedt. Elke stamcel, die tengevolge van de voorafgaande tumor-op-gang-brengende werking tot slapende tumorcel is geworden, zal onder deze omstandigheden tot een kleine kolonie van levensvatbare neoplastische ceUen uitgroeien en dit zou bij een voldoende groot aantal het begin van een onafhankeUjke tumor betekenen. Deze korte opsomming van neoplastische processen van viraal karakter is in vele opzichten onvoUedig en bij de voorbeelden is stüzwijgend voorbijgegaan aan de verschiUende papiUomen bij honden en paarden en virastumoren bij vissen en planten. Het is niet zo, dat deze tumoren slechts een kleine minderheid vertegenwoordigen; het zijn juist frekwent voorkomende processen waaraan jaarUjks vele dieren ten offer vallen. Hetgeen bovendien nog onderstreept mag worden is het opmerkeUjk divergente karakter van deze gezwellen waarbij onder de benigne en maUg26

ne tumoren, papiUomen, carcinomen, sarcomen, leukaemieën en granulomen vallen, die zich in geen enkel opzicht onderscheiden van andere tumoren, waarbij de tussenkomst van een vürus tot op heden nog niet is vastgesteld. Bij de nu volgende beschrijving der experimenten zal de groeibevorderende werking van sommige virussen op experimenteel verwekte tumoren worden nagegaan door registratie van de tumorgroei.

27

HOOFDSTUK IH Proefopzet De proeven welke gedurende verschillende tijdsperioden van juU 1955 tot december 1957 hebben plaatsgevonden zijn als volgt opgebouwd: A. Proeven met het ectromeUa-viras in de jaren 1955 en 1956. B. Proeven met dermovaccina en neurovaccinia viras in de jaren 1956 en 1957. In de A-reeks werd met de volgende 4 groepen gewerkt: I en III TH Groepen van 2 X 20 vrouweUjke muizen van 10 à 12 gram, welke naast de periodieke teerappUcaties ook een aantal intramuscidaire injecties met 0,1 cc gestyl kregen. II en IV THE Groepen van 2 X 20 vrouweUjke muizen van 10 à 12 gram, welke voorafgaand aan de periodieke teerappUcaties en gestyUnjecties aan een natuurUjke besmetting met ectromelia-viras werden blootgesteld. V T Grroep van 20 vrouweUjke muizen van 10 à 12 gram, welke alleen periodiek met teer werden behandeld (controle-groep). VI TE Groep van 20 vrouwelijke muizen van 10 à 12 gram, welke voorafgaand aan de periodieke teerappUcaties aan een natuurUjke besmetting met ectromelia-viras werden blootgesteld. In de B-reeks werd met de volgende 3 groepen gewerkt. I T Controle-groep van 50 matmeUjke muizen van 18 à 22 gram, welke uitsluitend een periodieke teerappUcatie kregen. II TD Groep van 50 manneUjke muizen van 18 à 22 gram, welke voorafgaand aan de periodieke teerappUcaties met een van het kalf afkomstige, doch op de chorioaUantois van bevruchte kippeëieren gekweekte dermovacciniastam werden gevaccineerd. Hl TN Groep van 50 manneUjke muizen van 18 à 22 gram, welke voorafgaand aan de periodieke teerappUcaties met neurovaccinia (HAAGEN) werden gevaccineerd. 28

Voordat de ontvangen muizen in de proef kwamen, werden ze eerst gedurende 14 dagen in quarantaine geplaatst. Hiervoor kon van een apart kamertje in een dierstal gebruik worden gemaakt. Indien gedurende deze periode in een bak geen sterfte optrad en geen zieke muizen werden aangetroffen, werd de bak overgebracht naar een andere dierstal. Indien er wel muizen doodgingen, werden deze geobduceerd waarbij in het bijzonder op de voor ectromeUa karakteristieke afwijkingen werd gelet. Bovendien werd bacteriologisch onderzoek van de milt en de lever verricht (enting op bloedagar en Endo-agar). Op Endoagar werd gekweekt met het oog op het nog al eens voorkomen van salmoneUose bij muizen. Viel dit onderzoek negatief uit, dan werd de quarantaineperiode nog met 14 dagen verlengd. Viel het postmortemonderzoek positief uit, dan werden de muizen van de betreffende bak gedood. Als muizen werden gebruikt jonge albino-muizen, welke bij de Areeksen van diverse fokkerijen werden betrokken, maar die voor de B-reeks uit de eigen fokkerij afkomstig waren. Het betrekken van muizen uit een eigen fokkerij is van groot voordeel gebleken. In de A-reeksen is het telkens weer voorgekomen, dat bij de nieuw aangekomen muizen latente infecties voorkwamen, welke tijdens een quarantaineperiode niet tot uiting kwamen, maar wel in de voor de muis veel zwaardere proefomstandigheden, tengevolge waarvan het hele muizebestand tot 2 X toe moest worden opgeruimd. Dergelijke tegenslagen hebben zich in de B-reeks niet meer voorgedaan. In de A-reeks zijn jonge vrouwelijke muizen van 10 à 12 gram gebruikt, omdat gemeend werd, dat mannelijke muizen zouden gaan vechten, als deze in groepjes van 5 in één bakje werden gedaan. Een andere reden was, dat om de invloed van gestyl in de proeven te betrekken, het gewenst leek, met vrouweUjke muizen te werken. In de B-reeks zijn manneUjke muizen gebruikt van 18 à 22 gram. Er zijn hier grotere muizen genomen, omdat bij de A-reeks gebleken was, dat de proefomstandigheden voor de kleine muisjes van 10 à 12 gram zeer zwaar waren en verwacht werd, dat de sterfte tengevolge van de manipulaties in de B-reeks daardoor lager zou zijn. Het was inmiddels gebleken, dat mannetjes, die van jonge leeftijd af voortdurend bij eU^aar zitten, zozeer aan elkaar wennen, dat van vechten vrijwel geen sprake is, zeker niet meer dan het geval is bij vrouweUjke muizen. Een andere reden, waarom mannetjes de voorkeur genieten, is het verUes bij een vergissing in de bepaling van het geslacht. Heeft men de muizen bij het begin van de proef niet goed gesexed, dan verliest men bij één vrouwtje tussen 4 mannen slechts één mms, welke men op een gegeven dag zwanger of met een nest jongen in de bak vindt. Heeft men echter één mannetje tussen 4 vrouweUjke muizen, dan heeft men het risico, dat deze 29

aUe 4 zwanger worden en daarmee door hun verhoogde hotmoonproduktie voor de proef ongeschikt worden. In de A-reeks zijn gedurende de eerste twee proefmaanden vele muizen verloren gegaan. Hiervoor zijn verschiUende factoren aan te wijzen. In de eerste plaats treedt onvermijdeUjk een verUes van muizen op ten gevolge van de besmetting met het ectromeUa-virus. Dit is juist in de eerste periode van belang, omdat bij langer durend verbUjf in de bakken de weerstand ten aanzien van ectromeUa-infectie door de optredende immimiteitsverhoudingen sterk toeneemt, waardoor de sterfte onder de besmette muizen tenslotte niet veel groter is dan onder de onbesmette muizen (GREENWOOD 1936). Deze factor is volgens GREENWOOD ook groter dan de selectie van de minst sterke onder de groep. Bij de eigen experimenten bUjkt de selectie van de minst sterke muizen een belangrijke factor te zijn, gezien het aantal dode muizen in de eerste maand, ook in de controlebakken. Verder moet erop gewezen worden, dat in de A-reeks de muizen niet waren geselecteerd op scheerbaarheid. De muizen met een haarpatroon, dat bij het scheren moeüijkheden geeft, zijn er in de B-reeks vooraf uitgeUcht, omdat in de A-reeks al was gebleken, dat deze muizen ook bij veelvuldig scheren niet kaal te houden waren (hetgeen ook door BORÜM 1954a is beschreven); men krijgt aldus een verhoogde sterfte door omstandigheden, die met de proef niets uitstaande hebben. Het aantal muizen, dat in de B-reeks in quarantaine gehouden werd (65 per groep), moest dus groter zijn dan voor de proef gewenst was (50). Het voordeel van deze werkwijze is, dat de muizegroepen meer homogeen van samenstelling zijn en dat in de B-reeks aUe muizen met dezelfde tijdsintervaUen konden worden geschoren. De sterfte ten gevolge van kannibaUsme onder de muizen is een steeds wisselende factor gebleken. KannibaUsme is in aUe groepen voorgekomen, soms meer, soms minder. Het scheren is een eenvoudig, doch wel tijdrovend werk, waarbij de volgende werkwijze, naar uit ervaring is gebleken, goed voldoet. Eerst moeten de muizen worden geknipt. AanvankeUjk is hiervoor een fijne tondeuze (No, 5) gebraikt. Dit heeft echter meer na- dan voordelen. WeUswaar heeft men de rag in zeer korte tijd goed kaal, maar men heeft voortdurend de kans, dat de tandjes in een huidplooi grijpen en dan een stuk huid meenemen. Bovendien is de tondeuze niet meer te gebruiken, als zich al blaasjes of wratten op de huid ontwikkeld hebben. Door gebruik te maken van een kromme en kleinere rechte schaar kan men na enige oefening de huid net zo kaal krijgen met minder kans op laesies. Deze methode is ook later in de proef te gebruiken. Ze duurt aUeen wat langer, gemiddeld 4 à 5 minuten per muis. Door de scheerintervaUen niet te groot te nemen, kan men het knippen of bijknippen vrijwel geheel overbodig maken. De kaalgeknipte muizen worden vervolgens met een scheerpapje be30

handeld. Hiervoor werd gebruik gemaakt van het depüatorium volgens BEYERSDORF.

sulfidum baryticum oxydum zmcicum amylum tritici aa Deze drie poedervormige bestanddelen worden in gelijke verhouding gemengd en dan in een pot bewaard. Vlak voor het gebrmk wordt de nodig gedachte hoeveelheid scheerpoeder in een mortier met wat water tot een papje aangelengd. De sterkte van het scheerpapje kan men regelen door de hoeveelheid sulfidum baryticum te veranderen. Met een spatel wordt nu dit papje op de raghuid van met lauwwarm water bevochtigde muizen uitgestreken en ingewreven. Na twee à drie minuten heeft de scheerpap voldoende ingewerkt, om aUe baarresten te verwijderen. De muis wordt nu onder een lauwwarme kraan afgespoeld en afgedroogd, waarmee het scheerproces is voltooid. Door de sterkte van het scheerpoeder juist te kiezen, bleek het mogeUjk om telkens 5 muizen (dat wü zeggen één bak) tegeUjkertijd te scheren. Deze werden achtereenvolgens ingewreven en apart gezet op het aanrecht van de stal. Als de vijfde mms ingewreven was, had het scheerpoeder voldoende inwerktijd gehad om van de eerste muis aUe haren te verwijderen. In dezelfde volgorde van het scheren werden dan de muizen afgespoeld en op een op de verwarming uitgespreide, speciaal daarvoor bestemde handdoek, afgedroogd. Op deze wijze bleek het mogeUjk in één uur gemiddeld 3 à 4 bakjes te verwerken, afhankelijk van het aantal wratten, waaromheen geschoren moet worden. Dit is dus gemiddeld 3 à 4 minuten per muis, hetgeen voor een groep van 50 muizen op ongeveer 2V2 à 3V2 uur neerkomt. Om deze hoeveelheid tijd te besparen is de mogeUjkheid van een eenmaUge epUatie overwogen, hetzij door röntgenbestraUng, hetzij door middel van thaUium. Het bezwaar, dat hiermee onbekende factoren zouden worden ingevoerd, welke moeiUjk zijn te waarderen, heeft er toe geleid de pogingen in deze richting te staken. Als carcinogeen agens is in aUe proeven gebruik gemaakt van horizontaal retortenteer. Uit de proeven van ZELDENRUST (1934) was reeds gebleken, dat deze stof als carcinogeen agens goed voldoet. Het heeft bovendien het voordeel, dat de teer gemakkeUjk is te verkrijgen. Tenslotte is de carcinogene werking van de teer minder sterk dan van methylcholanthreen en daarmee ook minder gevaarUjk voor degenen, welke de kans lopen het op hun handen te krijgen bij het schoonmaken van de bakken. De teerapplicatie geschiedt door een penseeltje (No. 4 of No. 5) in een flesje retortenteer te dopen en dan daarmee de raghuid van de muis te bestrijken. Om nu te zorgen, dat bij eUce muis het geteerde oppervlak even groot is, werd een maUetje geconstraeerd, dat als volgt is samen^steld. Op een langwerpig houten blokje van 3*72 X SVa cm werden op de vier 31

hoekpunten rechtopstaande staafjes van gjad metaal gemonteerd. Aan het eind van de staafjes was een schroefdraad geslepen, waarin een stelschroef paste. Om de staafjes werd een klein spiraalveertje geschoven. Als malletjes werd een aantal koperen plaatjes gebraikt, die passend om de muisromp waren omgebogen. In verband met de te verwachten toenemende grootte der muizen werden meerdere van deze maUetjes met toenemende diameter van het gekromde deel gemaakt. In deze koperen maUetjes waren in de hoeken gaten geboord, waardoor men ze over de metalen staafjes van het houten steunplankje kon schuiven. Hierboven werden dan de spiraalveertjes gedaan en deze werden door de stelschroef tegengehouden. Deze spiraalveertjes drukken het maUetje omlaag. Met de stelschroeven is de grootte van de druk te regelen. De muis werd nu onder het maUetje geschoven en door nu over de opening van 3y2 X 25 mm te strijken werd een constant groot deel op de rag met teer bestreken. Op deze wijze is in de eerste proeven getracht een te teren oppervlak van constante afmetingen te handhaven. Later is hiervan afgestapt, omdat het eenvoudiger is het oppervlak te bepalen via enkele vaste punten, nameUjk vanaf de vetbult tussen de scapulae tot halverhoogte het sacrum. Deze werkwijze bleek ook nog beter te voldoen, omdat de teer vaak aan de onderrand van de opening in het maUetje terecht kwam, waardoor de zijranden omegelmatig verbreed werden. Tenslotte proberen de muizen steeds langs de zijkanten of naar achteren weg te kruipen en vegen ze tijdens het losmaken gemakkeUjk de teer uit. Probeert men de muizen zo te fixeren, dat geen beweging mogeUjk is, dan drukt men ze gemakkeUjk dood, doordat eenvoudig tijdens de fixatie elke ademhaUngsbeweging wordt belemmerd. Ondanks de genoemde bezwaren is aanvankelijk deze methode met succes gebruikt. Besmetting met ectromeUa-viras heeft plaatsgevonden langs natuurUjke weg. Hiertoe werden in een bak met 20 muizen (aanvankeUjk werd met grote bakken gewerkt) 4 met ectromeUa besmette muizen geplaatst. Later werd in elke bak met 5 muizen één besmette muis geplaatst. De muizen die de infectie moesten overbrengen waren zelf ingespoten met een suspensie van de lever van aan ectromeUe gestorven muizen (bereid volgens MELNICK), intradermaal 0,1 cc in de Imker achtervoet. Bij een infectie op deze wijze ziet men als regel de chronische vorm van ectromeUe optreden (MARCHAL 1930). Laat men op deze wijze geïnfecteerde muizen gedurende 2 weken rondlopen tussen een groep normale muizen, dan mag men aannemen, dat ook deze aUe de infectie krijgen (Mc GAUGHEY en WHITEHEAD 1933, VERLINDE en WINSSER 1949, SHOPE 1954). Deze ziekte is namelijk zeer infectieus. Een bevestiging, dat inderdaad infectie is opgetreden, wordt achteraf verkregen als Ie. de muizen duidelijk verschijnselen en pathologisch-anatomische veranderingen van ectromeUe krijgen; 2e. als in de organen postmortem het ectromeUa-viras kan worden aangetoond, hetzij door enting 32

op het chorioaUantois membraan van bebroede kippeëieren (11 dagen oud), waarbij na enkele dagen op het vlies de typische ectromeUa laesies te zien zijn, of door intraperitoneale enting van verwreven suspensie van de lever of longen bij een groepje van 3 muizen welke dan de acute vorin van ectromeUa moeten krijgen, dat wü zeggen na gemiddeld 4—7 dagen doodgaan met typische leverafwijkingen of 3e. het aantreffen van celinsluitsels in de histologische preparaten. Deze methoden zijn niet aUe steeds naast elkaar en bij elke muis toegepast. Ter controle, dat bij de ectromeUa-vrije groepen inderdaad geen ectromeUa aanwezig is Qietgeen bij een latente infectie niet kan worden gezien) werden ook hier van de muizen, die doodgingen leversuspensies geent op het chorioaUantois membraan van bebroede kippeëieren. Ter voorkoming van infectie van de ectromeUa-vrije groepen werd er voor gezorgd, dat voor beide groepen een apart kamertje aanwezig was, welke zodanig ten opzichte van elkaar gelegen waren, dat bij het voeren, schoonmaken van de bakken en eventuele andere manipulaties steeds de èctromeUa-vrije groepen het eerst aan de beurt waren. • Besmetting met dermovaccinia en neurovaccinia viras geschiedde experimenteel. Bij de voorbereidende experimenten was gebleken, dat de muizen gemakkeUjk konden worden gevaccineerd door de pokstof te wrijven in een aantal scarificaties op de kaalgeschoren huid. Het ziektebeloop is zeer Ucht, na drie dagen beginnen de blaasjes op de scarificatieUjnen op te komen. De volgende dag al tonen ze een centrale inzinking en na ruim een week zijn nog slechts nauweUjke zichtbare korstjes waar te nemen. Ter controle op het aanslaan werden bij de dermovacciniagroep enkele blaasjes aangeprikt en van het opgezogen vocht een uitstrijkpreparaat gemaakt en gekleurd volgens MOROSOW-GISPEN. In deze preparaten bleken inderdaad virusdeeltjes te zien te zijn. Bij de met neurovaccinia gevaccineerde muizen bleek deze werkwijze niet mogeUjk, omdat daarbij de pokpuistjes véél kleiner, maar vooral ook veel droger waren, zodat het niet mogeUjk was om hieruit vocht op te zuigen. Het typische aspect, het gelijk opkomen en verdwijnen en de typische localisatie, nameUjk aUeen in rijtjes precies op de scarificatieUjnen, maken het wel zeer onwaarschijiüijk, dat hier van artefacten sprake zou zijn. Bij deze groep is dus op het kUnische aspect aangenomen, dat de vaccinatie aangeslagen is, in de hoop, dit achteraf te kunnen verifiëren door het aantonen van virasdeeltjes in de opgekomen tumoren. Wat betreft de registratie der muizen zijn verschiUende methoden op hun merites beproefd. Deze registratie is onontbeerUjk, wil men in het verloop van het experiment de dieren muis voor muis en zelfs tumor voor tumor kunnen vervolgen. Het meest eenvoudige leek om van kleine nummerplaatjês gebruik te maken. Deze zijn bij vogelhandelaren te betrekken en bestaan uit een 33

klein stukje week metaal, waarin een nummer wordt geslagen. Deze plaatjes, die gemakkelijk te buigen zijn, werden om de achterpoten boven het kniegewricht aangebracht. Deze methode bleek echter geheel niet te voldoen. De muizen beten de plaatjes los, zodat na enkele dagen de meeste nummers in het zaagsel terag te vinden waren, terwijl de rest door de beetafdrukjes onleesbaar geworden was. Beter voldeed de methode met plastic kanarieringetjes in diverse kleuren. Deze werden in warm water uitgebogen, zodat ze ruim over de hals van de muis pasten. Om deze ringetjes werden nu de nummerplaa^es geklemd en wel zodanig, dat de benen van de ringspiraal nog wel uit konden schuiven, maar niet gemakkeUjk uit de plaatjes konden losschieten. De meeste ringen zaten na een maand nog op hun plaats. Sommige muizen bleken in staat met hun achterpoten de ring over de kop af te schuiven. Een groter bezwaar was echter, dat de nummerplaatjês, die aan de dorsale zijde waren aangebracht aUe naar de ventrale zijde afgleden. Bij het opnemen van de muis buigt deze als regel de kop naar voren, vooral als men hem op de rag houdt. Het aflezen van de nummers wordt hierdoor bemoeiUjkt en gaat meer tijd in beslag nemen dan wel wenseUjk is. Beproefd is toen de registratie door middel van een tatouage in de oren. Een stukje koperen buis werd in stukjes gezaagd. Hierin werden op een weke onderlaag metalen pennetjes geprikt in de vorm van letters of cijfers (spiegelbeeld). Vervolgens werden deze pennetjes door middel van gesmolten lood stevig gefixeerd, waarbij het stempeltje meteen wat meer gewicht kreeg. Door de combinatie van een letter in het ene oor en een cijfer in het andere oor kunnen met kleine tatouages op eenvoudige wijze een groot aantal muizen worden gemerkt. Het oor wordt uitgespreid over een speciaal hiervoor uit hout gesneden vormpje, dat op oorshoogte boven de tafel uitsteekt en waar het uitwendige oor zich gemakkeUjk over laat schuiven zonder dat plooitjes opteeden. Vervolgens wordt met een penseeltje een drappel Oostindische inkt over het gespreide oor uitgesteeken en dan wordt het stempel er in gedrakt. De nummers bUjken de volgende dag al gemakkeUjk afleesbaar te zijn en in de oren trad geen reactie op. Het is een methode die goed voldoet, men heeft echter bij de tatouage hulp nodig van iemand, die zorgt, dat de muis rustig Ugt en niet zijn oor van het vormpje afschuift. Tenslotte werd een ponstang geconstrueerd waarmee een gaatje van twee mm 0 in het muizeoor geponst kan worden. Deze methode is in de praktijk verreweg het eenvoudigste. Zonder verdere hulp kan men gemakkelijk een groot aantal muizen op sneUe wijze merken en ook zonder dat men daarvoor enige andere apparatuur nodig heeft dan deze ene ponstang. Aanbeveling verdient het de gaatjes niet te veel aan het achterwaarts gekeerde gedeelte van het oor te ponsen, omdat men dan de kans loopt, dat de muis als hij zich krabt met een nageltje in een ponsgaatje bUjft hangen waar het diertje zichzelf niet altijd gemakkeUjk uit 34

bevrijdt en tengevolge waarvan het gaatje kan uitscheuren. Van elke muis wordt nu een kaart aangelegd, waarop vermeld staan de datum van het in proef gaan, de datum van de eerste tering, alsmede het oormerk van de muis, de bak en de groep, waartoe hij behoort. Op deze kaarten wordt het eerste tijdstip van tumorontwikkeling en de toename in grootte geregeld aangetekend en indien de muis niet zo goed is, de toestand van de betreffende muis en voorts de datum van overUjden, met zo mogeUjk de doodsoorzaak. Op de achterzijde worden opgeschreven het postmortaal onderzoek, te weten: de obductie-bevindingen, de uitslag van de eienting uit de tumor en de uitslag van het histologisch onderzoek.

35

HOOFDSTUK IV Proeven met ectromeUa-virus Een overzicht van deze proeven is gegeven in de tabeUen 1 t/m 7 weUce als volgt zijn samengesteld. Tabel 1 (groep I-T.H.) 20 vrouweUjke muizen van 10 à 12 gram werden om de 4 dagen geteerd (met een spreiding van 2—6 dagen, gemiddeld 4,1 dag) gedurende 279 dagen met in totaal 68 teringen. Ze werden tevens ingespoten met 0,1 cc gestyl intramuscidair in de dijspier om de 5—7 dagen en na de 14e injectie om de 2 weken, in totaal 20 maal, echter met dien verstande, dat de teringen en de gestyUnjecties niet op dezelfde dag geschiedden. TABEL 1

1 Muis No.

1

— — 13 16 18 22 23 27 30 31 47 55 61 66

— 86 87 88 89

Totaal aantal teringen

Totaal aantal gestylinjecties

6 8 8 8 10 11 13 15 15 17 18 46 54 59 60 61 68 68 68 68

2 3 3 4 5 5 9 10 10 12 12 20 20 20 20 20 20 20 20 20

Aantal OverAantal Begin van levingstijd de tumor- teringen bij gestylgroei in begin van injecties bij in dagen na dagen na de tumor- begin van de Ie tering de tumorgroei de Ie tering groei

157

41

18

205 133 206 157 206 198 206

52 37 52 41 52 51 52

20 17 20 18 20 20 20

16 30 30 33 40 44 58 61 64 69 72 177 217 234 245 252 279 279 279 279

De drie muizen waar geen nummer bij vermeld staat zijn niet verder onderzochte muizen, omdat zij dood werden aangetroffen. 36

Tabel 2 (groep II-T.H.E.) 20 VrouweUjke muizen van 10 à 12 gram werden, nadat ze aan een natuurUjke besmetting met ectromeUa-viras waren blootgesteld, om de 4 dagen geteerd (met een spreiding van 2—6 dagen, gemiddeld 4,1 dag) gedurende 267 dagen met m totaal 65 teringen. Ze werden bovendien ingespoten met 0,1 cc gestyl intramusculair in de dijspier om de 5—1 dagen en na de 14e maal om de 14 dagen, m totaal 20 maal, met dien verstande echter, dat de termgen en gestyl-injecties niet op dezelfde dag geschiedden. TABEL 2

Muis No.

Totaal aantal teringen

0 2 3 4 6 7 14 — 24 25 28 —

2 6 6 6 7 7 9 11 15 15 15 20 44 47 47 52 52 62 62 65

1 46 48 49 51 52 77 78 81

Totaal aantal gestylinjecties

2 2 3 3 3 4 5 10 10 10 12 19 20 20 20 20 20 20 20

Aantal OverBeginvan Aantal de tumor- teringen bij gestyllevingstijd groei in begin van injecties bij in dagen na dagen na de tumor- begin van de Ie tering de tumorde Ie tering groei groei

116 116 116 116 157 116 147 157

33 33 33 33 41 33 40 41

16 16 16 16 18 16 18 18

16 16 16 21 25 25 35 . 44 62 62 64 79 170 178 179 208 208 254 254 267

De beide muizen welke in de Ie kolom geen nummer dragen betreffen een dood aangetroffen en een zoekgeraakte muis.

37

Tabel 3 (groep III-T.H.) 20 vrouweUjke muizen van 10 à 12 gram werden om de 4 dagen geteerd (met een spreiding van 2—6 dagen, gemiddeld 3,9 dag) gedurende 202 dagen, met in totaal 50 teringen. Ze werden bovendien ingespoten met 0,1 cc gestyl inteamusculair in de dijspier om de 5—1 dagen en na de 14e maal om de 14 dagen, in totaal 20 maal, met dien verstande echter, dat de teringen en gestyl-injecties niet op dezelfde dag geschiedden. Met het teren is reeds na 202 dagen opgehouden in verband met de besmetting met het ecteomeUa-viras die in deze groep is opgetreden. TABEL 3

Muis No.

Totaal aantal teringen

Totaal aantal gestylinjecties

5

4 4 4 4 4 4 5 6 7 8 8 12 50 50 50 50 50 50 50 50

3 3 3 3 3 3 4 4 5 5 5 10 20 20 20 20 20 20 20 20

— — — 9 10 11 12 15 17 19 26 53 54 67 68 69 70 71 72

OverAantal Aantal Begin van de tumor- teringen bij gestyllevingstijd groei in begin van injecties bij in dagen na dagen na de tumor- begin van de Ie tering de tumorde Ie tering groei groei

150 165 120 120 140 165 192 192

38 41 32 32 37 41 49 49

18 20 17 17 18 20 20 20

15 16 17 19 20 20 23 26 33 34 37 55 201 201 238 238 238 238 238 238

De drie muizen zonder nummer werden opgegeten of dood aangeeffen . teoffen.

38

Tabel 4 (groep IV-T.H.E.) 20 vrouwelijke muizen van 10 à 12 gram werden, nadat ze aan een natuurUjke besmetting met het ecteomelia-vhrus waren blootgesteld om de 4 dagen geteerd (met een spreiding van 2—6 dagen, gemiddeld 3,9 dag) gedurende 202 dagen met in totaal 50 teringen. Ze werden bovendien ingespoten met 0.1 cc gestyl inteamusculair in de dijspier om de 5—7 dagen en na de 14e maal om de 14 dagen. In totaal 20 maal, met dien verstande echter, dat de teringen en gestyl-injecties niet op dezelfde dag geschiedden. Met het teren is na 202 dagen opgehouden in verband met de besmetting met het ecteomeUa-vürus in groep III — (T.H.). TABEL 4

Muis No.

, 8 20 21 29 — 32 36 50 57 58 62 64 65 73 — 76 — 83 84

Totaal aantal teringen

Totaal aantal gestylinjecties

3 4 8 8 13 15 16 24 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

2 3 5 6 11 12 12 15 20' 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

OverBegin van Aantal Aantal de tumor- teringen bij gestyllevingstijd groei in begin van injecties bij in dagen na dagen na de tumor- begin van de Ie tering de tumorde Ie tering groei groei

110 120 181 120 150 165 120 150 137 192 127 150

30 32 47 32 38 41 32 38 40 49 34 38

16 17 20 17 18 20 17 18 19 20 17 18

9 18 37 40 60 67 69 91 199 219 219 227 234 234 242 247 247 259 264 264

Van de vier muizen zonder nummer is er één opgegeten, één werd vermist en twee werden dood aangetroffen.

39

Tabel 5 (groep V-T.) 20 vrouweUjke muizen van 10 à 12 gram werden om de 4 dagen geteerd (variërend van 2—6 dagen, gemiddeld om de 3,9 dagen) gedurende 228 dagen met in totaal 59 teringen. TABEL 5

Muis No.

Totaal aantal teringen

33 34 35 37 38 — 39 40 _ 42 63 75 90 — 91 — — 94 95 96

7 8 8 9 9 9 11 12 13 19 46 49 56 57 58 59 59 59 59 59

Begin van de tumorgroei in dagen na de Ie tering

125 165 133 133 151 151 151 133 138 151

Aantal teringen bij het begin van de tumorgroei

Overlevingstijd in dagen na de Ie tering

36 46 38 38 42 42 42 38 38 42

18 24 24 27 27 29 32 35 37 55 165 179 215 221 223 228 228 228 228 228

•

De vijf niet genummerde muizen gaan over twee opgegeten en drie dood gevonden muizen welke niet verder zijn bewerkt.

40

Tabel 6 (groep VI-T.E.) 20 vrouweUjke muizen van 10 à 12 gram werden, nadat ze aan een natuurUjke infectie met het ectromeUa-viras waren blootgesteld om de 4 dagen geteerd (variërend van 2—6 dagen gemiddeld 3,9 dag) gedurende 228 dagen met in totaal 59 teringen. TABEL 6

Muis

Totaal

No.

anntnl

teringen

^_ 41 43 44 45 56 59 60 79 80 82 85 92 93 97 98 99

—. 100 LOI

7 16 19 19 26 42 43 43 50 50 51 54 58 58 59 59 59 59 59 59

Begin van de tumorgroei in dagen na de I e tering

125 114 151 114 133 133 125 48 125 133 125 125 151 98 133

Overleving»tijd in dagen na de Ie tering

Aantal teringen bij het begin van de tumorgroei

36 35 42 35 38 38 37 30 37 38 37 37 42 30 38

20 43 55 55 79 149 153 153 191 191 195 •

203 ?,?,3

223 228 228 228 228 228 228

Beziet men de overzichten aangegeven in de tabeUen 1 t/m 6 dan bUjkt, dat er een scheiding te teekken is tussen een beginperiode met hoge sterfte onder de muizen, vrij scherp gescheiden van een verder verloop, waarbij de levensduur der muizen veel langer is. Bij de verschülende tabeUen is deze scheiding als volgt te teekken:

41

Eerste periode in dagen Tabel

1 2 3 4 5 6

72 79 55 91 55 79

Aantal gestor- Tweede periode Aantal gestorven muizen in dagen ven muisren 11 12 12 8 10 5 58

207 188 183 173 173 149

9 8 8 12 10 15 62

In de tabeUen 1 tot en met 6 is ook af te lezen, dat in de eerste periode van tumorvorming nog niets te merken valt. Slechts de 62 muizen welke de eerste periode die op 90 dagen te steUen is, hebben overleefd, komen dus voor een analyse van de tumorontwikkeUng in aanmerking. Hieraan vooraf gaat een analyse van de sterfte om na te gaan, of de conteole-muizen inderdaad ecteomeUa-vrij zijn, en of bij de met het ecteomeUa-virus besmette groepen, de infectie is aangeslagen Hiertoe is in tabel 7 in een aantal opvolgende observatieperioden de specifieke doodsoorzaak nagegaan in verhouding tot de totale sterfte. Gezien het beteekkeUjk geringe aantal muizen moesten de perioden vrij ruim gekozen worden, waarbij de grens van de eerste periode door het optreden van ecteomeUa in groep III (T.H.) gesteld moest worden op 30 dagen. Onder de observatieperioden in tabel 7 staan in de linker kolom de nummers van de geobduceerde muizen en in de rechter kolom de met f teken aangegeven opgegeten of doodgevonden en niet geobduceerde muizen. In de totaal-kolom staan voor het plusteken het aantal bij de groep behorende geobduceerde muizen en achter het plusteken het totaal aantal niet-geobduceerde, doodgevonden of opgegeten muizen. De resultaten van deze analyse zijn in de tabeUen 8 en 9 af te lezen.

42

7

8

IV

VI

0 2 3 4 6 7

11

33 34 35 37 38

5 9 10 11 12

1

No. van de geobduceerde muizen

41 43 44

t 11

20 21 29 32

14 24 25 28

15

t

2

6

15 17 19 26

t t t 39 40 42

13 16 18 22 23 27 30 31

t t

t

No. van de geobduceerde muizen

t

t

t

2

1

12

45 56 59 60 79 80 82

36 50

46 48 49

3

63 75

47

No. van de geobduceerde muizen

t

1

Aantal opgegeten muizen

76—200 dagen

Observatie-periode

Aantal opgegeten muizen

31—75 dagen

Aantal opgegeten muizen

0—30 dagen

II

V

ra

I

No. van de groep

TABEL 7

66 89

86

78 62 64 76 83

77

95

22

85 92 93 97 98 99 100 101

57 58 65 73 84

51 52 81

20

90 91 94 96

53 54 67 68 69 70 71 72

55 61 87 88

No. van de geobduceerde muizen

60

18-1-2

t 3

16 -f 4

18-1-2

60

15-1-5

17 + 3

17 + 3

Totaal

t t

4

t t t

t

Aantal opgegeten muizen

>200 dagen

TABEL 8

Controle-groepen: 0-30 dg. muis

1 5 9 10 11 12 33 34 35 37 38

Obd.

M.P.

—

, — — —

—

Ei-ent.

31-75 dg.

Obd.

M.P.

Ei-enL

—

muis 13 16 18 22 23 27 30 31 39 40 42

—

—

—

, —

, ,

, ,„

, ,

—

—

—

— —

6xt

muis

47 63 75 3

Obd. M.P. Ei-ent t

= = = =

, —

__ — —

^_

t 12

100% —

17

76-200 dg.

__ —

Obd.

M.P.

E

—

Ei-ent.

>200 dg. muis

,

100% —

obductie bevinding. resultaat van de muisproef. resultaat van de ei-enting. opgegeten of doodgevonden muis, niet nader geanalyseerd.

55 61 66 86 87 88 89 90 91 94 95 96

tttt

16

100% —

Obd.

M.P.

Ei-ent. —

— —

—

— :

—

—

—

100% —

De muizen ouder dan 30 dagen uit groep III (T.H.) zijn hier niet bij beteokken, omdat bij muis 15 de muisproef positief bleek te zijn en later ook macroscopisch zichtbare aanwijzingen voor het opteeden van een ecteomelia-infectie in groep IH voor de dag kwamen. Zo werd na 127 dagen bij muis 67 de voor ectromeUa-infectie typische afwijking aan de staart waargenomen, nameUjk een oedemateuze zwelling met proximaal er van een insnoering. Bij obductie bleek deze muis inderdaad besmet te zijn. In deze bak werd verder bij muis 53 een gangraen van de linker achterpoot gezien. 44

TABEL 9

Met ectromelia-virus besmette muizen. 0-30 dg. muis

Obd.

0

—.

2 3 4 6 7 g

+ + — + +

tt

—

9

4

M.P.

Ei-enL

31-75 dg.

Obd,

M.P.

,

muis 14

+ + + + —

+ + -f+ + + +

—

+ -1+ —

24 25 28 20

+

—

—

—

21 29 32 41 43 44

+ + —

3

3

-H

-f-1-

-f-

.

Ei-ent.

+ —

+ + + + +

—

.^

tt 13

76-100 dg. muis 46

48 49 36 50 45 56 59 60 79 80 82

Obd.

6

Ei-ent.

Ei-enL

> 2 0 0 dg.

Obd.

M.P.

+

muis 51

-1-i-

+

+ + -1+ —

, .

52 77 78 81 57 58

— — — — — —

— — — — — ^^

— .— — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — —

+

+

—

—

+ + + + — +

+ -1+ -1-

—

—

— — —

— —

+

62 64 65

—

—

73 76 83 84 85 92 93 97 98 99 100 101

7

8

M.P.

-1-

t 13

7

5

3

-1-1— .._ — _

+ +

— —

-1-

+ teken bij obductie = de muis toont — bij obductie de voor ectromelia typische afwijkingen; ._ -f- teken bq M.P. = de muis gaat na — intraperitoneaal te zijn ingespoten ttt met verwreven lever-suspensie van de geobduceerde muis in 4—7 dagen 2 1 8 25 dood met de voor ectromelia typische leverafwijkingen; -f- teken bij Ei-ent. = op het chorioallantois-vlies zijn na 3 dagen de voor ectromelia typerende kleine poklaesies waar te nemen; t = opgegeten of dood aangetroffen muis, niet nader geanalyseerd.

45

Bij de waardering van deze uitkomsten hebben we rekening te houden met de volgende mogeUjkheden: Obductie

Viruskweek door middel van muisproef of ei-enting

Geregistreerd als

karakteristieke laesies

positief

positief

karakteristieke laesies

negatief

positief

geen karakteristieke laesies

positief

positief

geen karakteristieke laesies

negatief

negatief

Voor de muizen uit de eerste periode (O—30 dagen) is bij 7 geobduceerde muizen 5 X een infectie vastgesteld, dit is 7 1 % . In de tweede periode wordt bij 8 van de 11 geobduceerde muizen de infectie aangetoond, dit is 73%. In de derde periode wordt bij 7 van de 12 geobduceerde muizen infectie vastgesteld, dit is 58%. Bij de muizen die langer dan 200 dagen hebben geleefd, is nog slechts bij 8 van de 22 muizen door obductie het aanslaan van de infectie vastgesteld, dit is 36%. De beide kweekmethoden vaUen hier vrijwel geheel negatief uit, nog slechts 2 X positief bij de muisproef en slechts 1 X bij de chorioallantoisenting. Wanneer men deze cijfers onderling vergeUjkt, Ujkt het alsof er in het begin een goede correlatie bestaat tussen de obductiebevindingen en de bevestiging hiervan door de beide kweekmethoden en, dat met het voortschrijden van de tijd deze correlatie steeds minder wordt. Als verklaring voor deze verminderende correlatie kunnen de twee volgende overwegingen naar voren worden gebracht: 1. Men moet bedenken, dat bij de kweekmethoden op de wijze waarop ze hier zijn uitgevoerd (zie hoofdstuk III) behalve virasdeeltjes ook gastheer-elementen worden ingespoten. Wanneer het dier na verloop van tijd anti-Uchamen gaat vormen, worden deze mede bij de muis of in het ei geënt, hetgeen de positieve uitkomst van deze entingen zal drukken. Het opteeden van anti-Uchamen is niet serologisch bevestigd geworden, omdat de muizen ten tijde van him obductie te mager en uitgeteerd waren om nog voldoende serum te kunnen leveren. 2. Dat bij de oudere muizen de kweekproef vaak negatief uitvalt, heeft mogeUjk nog een andere reden. Bij muizen, welke een ecteomelia-infectie doorstaan hebben, ziet men op de duur de laesies teruglopen en de muis geraakt in een toestand van een symptoomloze latente ecteomeUa (SHOPE), welke haast onmogelijk als zodanig is te 46

herkennen en welke aUeen door een overmatige „steess" weer kan opvlammen. De geringe afwijkingen welke men dan soms nog aan de rand van de leverkwabjes of in de müt vindt, vertegenwoordigen nietactieve (genezen?) haaiden, welke bij de muisproef op ei-enting geen infectie meer teweegbrengen. Gaat men de verhouding na tussen de positieve obductie-bevindingen enerzijds en de positieve muisproef en ei-kweek anderzijds, dan kan deze voor de opvolgende periode in de in tabel 10 genoemde getaUen worden uitgedrukt. TABEL 10

Verhouding muisproefobductie in % (tabel 9) eerste tweede derde vierde

periode periode periode periode

75 114 71 25

Verhouding ei-enting obductie in % (tabel 9) 75 85 43 12%

We zien hier na de tweede periode een sterke daUng opteeden, die mogelijk al in de tweede periode begint, als aanwijzing voor het opteeden van anti-Uchamen bij de muis. Gaan we na deze analyse van de besmetting over tot de bespreking van de tumorontwikkeUng, zoals deze is weergegeven in de grafieken I tot en met III. Deze grafieken zijn op de volgende wijze ontstaan. Van eUce muis die voor registeatie van de tumorontwikkeling in aanmerking komt, die dus de eerste golf van sterfte heeft overleefd, is periodiek het tumor-oppervlak op de rag gemeten. Het totale tumor-oppervlak van alle muizen, die tot dezelfde groep behoren, gedeeld door het op dat moment aanwezige aantal muizen in die groep, geeft het gemiddelde tumor-oppervlak op dat moment weer. Dit gemiddelde tumor-oppervlak is voor elke groep periodiek berekend. Zet men deze uitkomsten af tegen de tijd, welke de muizen in de proef hebben gezeten, dan krijgt men de gemiddelde tumorgroei over deze periode, hetgeen in de grafieken is weergegeven, In deze grafieken staan steeds de besmette groep met de bijbehorende conteolegroep naast elkaar, In grafiek I de groepen 1 (T,H.) en 2 (T.H.E) In grafiek n de groepen 3 (T.H.) en 4 (T.H.E.) In grafiek Hl de groepen 5 (T.) en 6 (T.E.) 47

GRAFIEK I

36 32 28 24

/

*

20

- 16 12

100

120

140

160

aantal dagen In da

180

200

220

240

260

280

pro«f

Gemiddelde tumorgroei electromeliaproeven. Bak I • controle muizen. Bak II A met electromelia besmette muizen. GRAFIEK / /

-d20 l « r m ges ta

16

12

1

"1 yy' ^

I

/

1

3r N


t^

I

O 100

^ 120

^ 140

oontot dogwi In d t

Y 160

ISO

200

220

240

260

proof

Gemiddelde tumorgroei electromeliaproeven. Bak III • controle muizen. Bak IV A met electromelia besmette muizen. In bak III is electromelia-infectie binnengeslopen, één maand nadat de groep in proef was. Beide curven lopen evenwijdig, teren na 200 dagen gestaakt. Na liet staken tonen de tumoren een regressie.

48

GRAFIEK / / / 32 28 24 20 4

16 l /

12

/

8

t s E

•

4

& 80

100

120

140

160

180

200

220

240

oontot dagan In di proef

Gemiddelde tumorgroei electromeliaproeven. Bak V • controle muizen. Bak VI A met electromelia besmette muizen.

Gaat men het tijdstip na, waarop de tumor-ontwikkeling 'begint en het aantal op dat moment toegediende teer-appUcaties, dan resulteert het in tabel 11 aangegeven beeld, We zien hier in aUe drie de combinaties een voorsprong ten gunste van de met ecteomeUa-viras besmette groepen. Dat het verschü in tijd, en dus ook in het aantal teer-appUcaties, tussen de groepen III en IV beduidend kleiner is dan bij de andere combinaties is te verklaren door het opteeden van ecteomeUa-infectie in groep III nadat deze ongeveer een maand in de proef is geweest. Dit tijdstip van de besmetting is pas achteraf gebleken, toen de enting met leversuspensie van muis 15 die na 33 dagen dood ging, positief uitviel. Het obductie-materiaal van muis 15 heeft enige maanden in de diepvrieskast gelegen, eer dit onderzoek kon plaatshebben. Het opteeden van de infectie werd daardoor niet direct herkend en het teren van de beide groepen is ook gewoon doorgegaan. De besmetting werd pas ontdekt, toen bij muis 67 na 126 dagen de voor ectromeUa typerende afwijkingen aan de staart opteaden. AanvankeUjk werd nog met het teren doorgegaan, maar nadat bij muis 53 na 201 dagen bij de obductie duideUjke aanwijzingen voor ecteomeUa te zien waren, is het teren gestaakt, omdat deze combinatie voor een vergeUjk van de tumorontwikkeling verder als waardeloos werd beschouwd. 49

TABEL 11

Controle- Tijdsinter- Aantal groepen val tussen teringen begin van de proef en begin van de tumorgroei I (T.H.) III (TH.) V (T.)

130 120 125

38 33 34

Besmette groepen

n (T.H.E.) IV (T.H.E.) VI (T.E.)

Tijdsinter- Aantal val tussen teringen begin van de proef en begin van de tumorgroei 105 110 105

28 30 27

Tijdsvoorsprong in dagen

Geringer aantal teringen

25 10 20

10 3 7

De teringen zijn dus gestaakt nadat de groepen III (T.H.) en IV (T.H.E.) 200 dagen in de proef zijn geweest. Het is evenwel interssant, de gevolgen van deze besmetting in de grafiek te volgen en wel om twee redenen. OpvaUend is in de eerste plaats, dat de grafiek van de controle-groep (groep III) 10 dagen later gaat oplopen met dezelfde helling als de grafiek van groep IV. Na de ongewüde besmetting geeft dus de conteole-groep hetzelfde beeld als de besmette groep, zij het dan tien dagen later. Het tweede belangwekkende dat deze grafiek te zien geeft is, dat na het ophouden van de teer-applicaties de tumorgroei een regressie gaat tonen. Hieruit bUjkt dus de belangrijke invloed van de teringen bij deze tumorgenese; bij de nabeschouwingen zal hierop nog worden teraggekomen. Bekijkt men de helling der grafieken, dan bUjken ze in het begm minder steü op te lopen dan later. Indien men na 40 en na meer dan 100 dagen vanaf het begin van de tumor-ontwikkeling deze helling meet, dan vindt men de in tabel 12 vermelde gegevens. Hierait bUjkt, dat de helling der conteole-groepen onderling vrijwel geUjk is. Hetzelfde geldt voor de helling onder de besmette groepen II en VI. Tussen de conteole-groepen en besmette groepen bUjkt een verschü in heUing van ca. 30°. De helling van groep IV Ujkt op het eerste gezicht minder steil dan van de groepen II en VI, maar 40 dagen na het begin van de tumor-ontwückeling is de helling van groep IV zelfs nog iets hoger dan bij de groepen U en VI, aan de sterke stijging na 100 dagen is deze groep echter door afbreken van het experiment niet toegekomen. Naast een voorsprong in tijd zien we bij de besmette groepen dus ook een duideUjk snellere groei van de tumoren. Bij de obductie-bevindingen is geteacht deze zodanig in tijd te rangschikken, dat uit het overzicht naar voren komt, hoe de ontwikkeling bij de diverse groepen heeft plaatsgehad. De bevindingen bij de ecteomelia-vrije muizen kunnen als volgt worden 50

TABEL 12

Controle Groep I Groep m Groep V

40 dg.

100 dg.

37° 44° 37°

37° ? 37°

Besmet Groep II Groep IV Groep VI

40 dg.

100 dg.

40° 43° 41°

57° ? 61°

samengevat: Aan de huid valt bij de muizen die vroegtijdig zijn gestorven nog niets waar te nemen, behoudens enige roodheid, korstvorming en exsudaat, welke het gevolg zijn van een ontstekingsreactie. Na ruim een maand wordt de huid dikker, hetgeen te zien is doordat de huid dof en meer grijsachtig van tint wordt en grove plooien gaat tonen op de plaats waar de teer geregeld geappUceerd wordt. Deze dikte neemt verder steeds toe en eventuele huideffecten (ten gevolge van het scheren) tonen een slechte neiging tot genezen. Na ongeveer 3 maanden beginnen de eerste papiUomen op te komen, wiUekeurig over het verdikte epitheel verspreid. Sommige beginnen als gladde vlakke schijfjes, roodachtig van kleur en dooraderd, andere meteen als kleine wratjes. De gladde min of meer half-bolvormige knobbeltjes gaan als ze enige tijd gegroeid zijn ook plooien en zijn dan niet meer van de andere wratten te onderscheiden. Bij een iets groter aantal wratten komt duideUjk een haardsgevnjs ontspringen der woekeringen naar voren. De wratten worden hoger, de plooivorming wordt meer uitgesproken en na enige tijd kan men enkele er van als grote bloemkoolvormige gezweUen op een dun steeltje op de rag van de muis zien zitten. Niet aUe wratten bUjven groeien. Sommige gaan in regressie en kunnen zelfs verdwijnen. Gesteelde vnratten kunnen gemakkeUjk afvaUen, met het scheren kan de steel inscheuren, de muis kan langs de deksel van de bak schuren, ze kunnen ook stukgebeten worden als de muis de teer wegvreet. Er bUjft dan een krater achter, waarvan de randen veelal zijn opgeworpen. Vaak teeedt er bij dergeUjke laesies ook een infiltraat op, dat snel in grootte kan toenemen en als gevolg waarvan de muist sterk vermagert. Bij obductie van de ecteomeUa-vrije muizen valt in de eerste perioden niets bijzonders op, na ongeveer 5 à 6 maanden wordt de lever geleideUjk groter. Tenslotte kan men een enkele maal een lever aanteeffen van haast de dubbele grootte, geelbleek van kleur met een raw oppervlak en van een harde constistentie. Bij het doorknippen ervan hoort men de schaar knisperen. Behalve deze harde lever hebben deze muizen soms een exsudaat in het abdomen. Dit is uitwendig al te merken doordat deze muizen een groot plat en in de breedte opgezet abdomen hebben. Bij palpatie kan men dan naast de harde lever een fluctuatie van vocht voelen. Zuigt men bij de obductie het ascitesvocht op, dan bUjkt dit donkergeel van kleur te zijn. Het is opalescent en bij staan stolt het binnen enkele minuten. 51

Tenslotte kan men in dit stadium bij de conteole-muizen een vergrote milt vinden, grauwgrijs van kleur met afgeronde randen en stevig van constistentie. De ingewanden kunnen enige stuwing tonen. Bij de met ecteomeUa geïnfecteerde muizen ziet men dezelfde huidveranderingen ontstaan, aUeen iets eerder. Bovendien zijn bij vele van deze muizen nog de Uttekens van een doorgemaakte infectie terag te vinden in de vorm van insnoeringen aan de staart, een geamputeerde staart, soms kale plekken bij de neus of rondom de ogen en scheefstaande nageltjes aan de poten. Bij obductie valt meteen de lever op. Deze is veelal rood van kleur en bezaaid met kleine witte vlekjes, die over het gehele oppervlak verspreid kunhen Uggen, soms echter slechts tot de randen der kwabjes beperkt bUjven. Verderop in het proces kan de lever een normale kleur hebben, of aUeen wat witte plekjes langs de rand van de kwabben tonen. Dit beeld echter kan door de aUengs opteedende vergroting en kleurverandering, die samen gaat met een verharding van de lever, geheel overschaduwd worden. In de eerste maanden kan men een weinig peritoneaalvocht vinden, echter lang niet zoveel als bij de later soms opteedende harde levers. De milt is in het algemeen iets vergroot, rood van kleur en speciaal in de chronische gevaUen kan men er witte plekken in zien doorschemeren. Ook hier kan dit beeld later een enkele maal verdrongen worden door een vergrote milt met afgeronde randen en grauwgrijze verkleuring. Aan de beschrijving van de microscopische preparaten kan waarschijnUjk het beste een korte beschrijving van de huid bij normale muizen voorafgaan. De epidermis is bij de muis bij die huidgedeelten, waar een goedontwikkelde haarvacht de huid beschermt, zeer dun. Zij bestaat slechts uit 2 à 3 lagen en er is nauweUjks enige differentiatie in te bespeuren. De ceUen van het steatum germinativum (basale laag) zijn cuboid of veelhoekig van vorm en beslaan één hoogstens twee lagen. Het steatum granulosum ontbreekt en het steatum comeum bestaat uit één, hoogstens twee, lagen platte verhoomde ceUen. Er is een zeer matige hoeveelheid kératine aan de oppervlakte van de huid. Het corium is opgebouwd uit fibreus bindweefsel en vetceUen. Het heeft een rijke bloedvoorziening en vanuit het corium kunnen verheffingen in de bovenUggende epidermis uitsteken (papiUen). Deze ziet men vooral ter plaatse waar de epidermis beter is ontwikkeld, dus in gebieden met een wat schaarse beharing. De haar foUücels zijn samengesteld uit zowel de epidermale als dermale gedeelten van de huid. De onder deze lagen gelegen sub-cutis wordt gevormd door losmazigbindweefsel en vetceUen. Als er een steatum carnosum is, vormt deze dwarsgesteeepte spierweefseUaag de scheiding van de subcutis en het corium. Bij het bekijken der coupes ziet men bij de controle-muizen, aanvanke52

Ujk een normale huid, behoudens dat hier en daar enkele kernen wat groter zijn en men enkele blazige ceUen kan aantreffen. Na ongeveer twee weken ziet men een beginnende verdikking van de huid opteeden. Het aantal ceUagen, aanvankeUjk twee à drie, wordt nu drie à vier lagen dik en de ceUen worden vaker blazig gedegenereerd. Als na ongeveer 1 maand de hyperplasie zover is voortgeschreden, dat het epitheel vier tot zes lagen dik is geworden, teeedt ook enige differentiatie voor de dag en kan men duidelijk een steatum granulosum waarnemen. Het aantal blazige cellen wordt hierbij ook groter en er is een begin van papüvorming waar te nemen. Microscopisch kan men onder het epitheel aanwijzingen vinden voor een acute of chronische ontsteking. Het is niet duidelijk in hoeverre deze op rekening van de teer of van accidentele laesies zijn toe te schrijven. Na ruim twee maanden is er een duidelijke papiUoomvorming, de wratten steken boven het huidoppervlak uit, het epitheel is verdikt, bevat blazige ceUen en toont een sterke plooiing. Erboven Ugt een grotere hoe^ veelheid kératine dan gewoon. Tussen de plooien is een schaars maar vaatrijk steoma aan te teeffen. De wratten worden groter, de plooivorming neemt toe en men ziet daardoor grote tumormassa's ontstaan, die met een dun steeltje aan de huid verbonden zijn. Er valt na drie maanden ook een binnendringen van het epitheel in de diepere huidlagen te zien. Verderop in de tijd, vanaf de vierde maand, worden vele papiUomen dikker, vleesachtiger, en men ziet dat bij deze tumoren de bindweefselkem dikker is geworden. Het naar beneden groeien van epitheelsteengen wordt frekwenter en de epitheelceUen kunnen een onrastig beeld tonen met een duidelijke polymorphic. Het epitheel is in deze zeven maanden een laag of tien dik geworden en ziet er uit als plaveiselepitheel. Men zou geneigd zijn van een plaveisel-ceUen-carcinoom te spreken ware het niet, dat vele gezweUen die er macroscopisch net zo uitzien bij de levende muizen nog steeds terag kunnen lopen. Er is hier dan ook van afgezien een gezwel als benigne of maUgne te benoemen. Wanneer echter de dwarsgesteeepte spierlaag van het steatum carnosum wordt gepenetreerd zoals bij muis 66 na 245 dagen, muis 67 na 238 dagen en muis 95 na 228 dagen, lijkt het echter verantwoord om van een carcinoom te spreken. Bij muis 95 zijn in het epitheel vele polygonale cellen met grote kernen, vele hoomparels en vele mitosen, waaronder ook pathologische, zoals een enkele triaster, waar te nemen. In de longen van deze muis werd een verhoomd carcinoom met vele mitosen aangeteoffen. InsluitUchaampjes zijn bij deze conteole-muizen nergens gevonden. Wel zag men zo nu en dan acidophiele lichaampjes in het cytoplasma van de epitheelceUen, zij waren echter te groot voor insluitUchaampjes en zijn 53

waarschijnlijk als een reactieprodukt op de toxische teerwerking te zien. Aan de organen bij de conteole-muizen werden aanvankeUjk geen afwijkingen gevonden. Pas als hier macroscopische veranderingen in de zin van een vergroting van de lever worden waargenomen, ziet men ook in het histologische beeld enige verandering optreden. Zo werd een enkele maal in de lever een beginnende proliferatie van bindweefsel gevonden soms gepaard met een proliferatie van de galgangen al dan niet met een periportale ophoping van ceUen. Bij de met ecteomeUa vhrusbesmette muizen geven de huidafwijkingen microscopisch hetzelfde beeld. Er waren microscopisch geen aanwijzingen die aan een grotere maUgniteit doen denken. Slechts bij zes muizen werden de voor ecteomeUa beschreven acidophiele, stractuurloze, insluitUchaampjes in het huidepitheel gevonden, bij drie muizen binnen de twee maanden bij de andere drie muizen aUe na zeven maanden. De levers van de muizen uit deze groepen toonden in de eerste maanden een diffuse necrobiose met slechts hier en daar gebieden waar de leverceUen zich nog goed kleuren. In deze gebieden zijn in de leverceUen vele vetvacuolen aan te treffen. In de latere stadia is de necrose meer plaatseUjk en kan men periportaal lymphocyten ophopingen waarnemen. Nog later is van een eigenUjke ecteomeUa infectie niets meer te merken, maar men kan dan een beginnende bindweefselproUferatie een enkele maal zien optreden. Ook bij de met ecteomeUa viras besmette muizen werd na zeven maanden bij muis 99 een longmetastase gevonden, dit was echter een niet-verhoomd carcinoom, dat een veel rustiger beeld toonde en waarbij ook geen mitosen werden aangeteoffen.

54

HOOFDSTUK V Proeven met dermovaccinia- en neurovacciniavirus Een overzicht van de uitkomsten van de proeven, welke de invloed van het dermovaccinia- en het neurovacciniaviras op de ontwikkeling van experimenteel door teer verwerkte tumoren wiUen nagaan, kan het best aan de hand van een aantal overzichtstabeUen en grafieken worden gegeven. Voor elke muis is in de eerste plaats vastgesteld, hoeveel dagen verlopen zijn tussen het begin van de proef (de eerste maal, dat werd geteerd) en de dag waarop de eerste tumorvorming plaatsvond. De frekwentieverdelingen van dit aantal dagen zijn voor de drie onderzoekgroepen (dermovaccinia-, neurovaccinia- en controlegroep) in tabel 13 gegeven. Hoewel de proef met drie a-select gekozen groepen van elk 50 muizen werd ingezet, werd zij slechts met 49 dieren in de dermovaccmiagroep en 47 dieren in de conteolegroep uitgevoerd, daar enkele muizen vroegtijdig zijn afgevaUen. Het totale aantal muizen van de dermovacciniagroep en de conteolegroep is daardoor iets klehier geworden dan bedoeld was. Bij het bekijken van deze tabel valt de grote spreiding op van het aantal dagen, waarna de tumorvorming begint. Deze loopt van 40 tot 142 dagen bij de dermovacciniagroep, van 41 tot 144 dagen bij de neurovacciniagroep en van 63 tot 147 dagen bij de conteolegroep. De beide proefgroepen hebben ten aanzien van het begin van de tumorvormmg een voorsprong van ongeveer 3 weken op de conteolegroep. Daar de waargenomenfrekwentieverdelingenvan het normale type (verdeling van Gauss) afwijken en uitbijters vertonen, is voor de waardering van de gevonden verschiUen afgeweken van de klassieke methode welk gebraik maakt van het rekenkundig gemiddelde der waarnemingen en de standaard deviatie. Hun gemiddelde is gekarakteriseerd door middel van de mediaan. Hierbij dient opgemerkt te worden, dat de mediaanwaarde van de neurovacciniagroep waarschijnlijk iets te hoog Ugt. Dit vindt zijn oorzaak in het feit, dat tussen de 86e en 101e dag geen tumormetingen zijn verricht ten gevolge van een genoten vakantie. Het gevolg is, dat de muizen die tussen de 86e en 101e dag met tumorvorming zijn begonnen eerst op de 101e dag zijn geregistreerd, zodat op deze dag een opeenhoping van 10 waarnemingen valt. Onderstaande waarden tonen aan, dat een aantal der 10 muizen reeds kort na de 86e dag met tumorvorming zal zijn begonnen, waardoor de 55

TABEL 13

Begin der tumorvorming.

Aantal dagen na Ie tering 40 41 44 45 49 52 53 59 63 65 66 69 73 74 75 77 78 80 85 86 91 93 95 100 101 103 104 107 108 109 112 113 115 119 121 122 124 129 131 133 136 138 142 144 147

Neurovaccinia groep

Controle groep

3 1 1 2

4 2 4

2 1

3

3 • 2

4

3

5 3 5 4 7 5 2 8 7

3

5 3 3 2

5 10

3 3 1 2 1 1 3 1 2 1 2 3 1 1 4 1 1 1 1 1

Totaal

49

50

47

Mediaan

74

101

91

H-toets

56

Dermovaccinia groep

X 0„

= 22,47 (P ^ 0 001)

juiste mediaanwaarde waarschijnUjk slechts weinig verschilt van die der conteolemuizen (zie tabel 14). TABEL 14

Muis

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Aantal tumoren op 101e dag

Aantal mm* tumoroppervlak op 101e dag

1 1 5 1 1 5 2 3 2 2

2% 1 12 2 1% 13 3% 5% 5% 5%

De hypothese, dat de verschiUen in niveau tussen de verdeUngen toevaUig zijn, is getoetst met een zogenaamde verdelingsvrijemethode, de H-toets van KRÜSKAL en WALLIS. (KRÜSKAL en WALLIS 1952; SIEGEL 1956; WALKER en LEV 1953.) In tegenstelling tot de gebnukeUjke methode der variantie-analyse behoeft bij het toepassen van deze methode niet te worden ondersteld, dat de drie groepen uit (ongeveer) normaal verdeelde populaties met dezelfde spreiding stammen, daar de H-toets wordt gebaseerd op de rangnummers van de naar hun grootte geordende waarnemingen. Toepassing van de H-toets op de verdelingen in tabel 13 levert op: Ho ö x^o (2 vrijheidsgraden) = 22,47, met een overschrijdingskans die aanzienlijk kleiner is dan 0,001. Hoewel deze kans iets geflatteerd zal zijn door de reeds genoemde opeenhoping van waarnemingen op de 101e dag in de neurovaccmiagroep, kan toch worden geconcludeerd, dat het begin der tumorvorming bij de dermovacciniagroep systematisch eerder Ugt dan bij de beide andere groepen welke slechts weinig onderUng verschiUen. Men kan het begin der tumorvorming ook grafisch uitzetten. Dit is gedaan in de Unkerhelft van grafiek IV. Op de X-as is hier het aantal dagen afgezet, dat verlopen is tussen het begin van de proef en het moment dat de eerste tumorontwückeUng werd geregisteeerd, op de Y-as het cumulatieve percentage van de muizen, dat tumorvorming te zien geeft. In deze grafiek valt duideUjk het uitspringen van de dermovacciniagroep te zien: de tumorontwückelüig begint eerder en bUjft steeds groter dan bij de twee andere groepen. De neurovacciniagroep heeft weliswaar een aantal muizen, waarbij de tumorvorming eerder begint dan bij de controlegroep, maar de verdere aanloop is teager waardoor de somfrekwentiepolygoom reeds spoedig ongeveer geUjk gaat lopen aan die van de conteolegroep. Hoewel de 57

o

50

70

90

' 110

130

150

170

190

2in

230

250

Cumulatieve procentuele veredeling van het aantal muizen naar begin en einde der tumorvorming.

voorsprong van 22 dagen in het begm dus imponeert blijkt, dat bij het overgrote deel der muizen uit de neurovacciniagroep de tumorvorming niet eerder begint, dan bij de conteolegroep. In de rechterhelft van grafiek IV is op overeenkomstige wijze het einde van de tumorvorming uitgezet. De einddatum is bepaald door de toestand van de muizen. Wanneer de muizen in een toestand geraakten waarbij ze snel in gewicht afnamen, waartoe veelal grote infüteaten hebben bijgedragen, of wanneer ze anderszins in slechte conditie geraakten werden ze afgemaakt. In de regel zijn de muizen dus niet de natuurUjke dood gestorven, ofschoon het tijdstip van afmaken niet ver van het natuurUjke einde gelegen zal zijn. In tabel 15 zijn defrekwentieverdeUngenvan de duur van de tumorvorming voor de drie groepen proefdieren in dagen weergegeven; dit is dus het verschü tussen de laatste registeatiedatum en de datum waarop voor het eerst een tumorontwikkeling werd geconstateerd. De mediaanwaarden in tabel 15 van deze duur der tumorvorming, respectieveUjk 110 voor de dermovacciniagroep, 112,5 voor de neurovacciniagroep en 105 voor de conteolegroep, Uggen dicht bijeen. Bij toepassing van de H-toets bUjkt, dat deze verschiUen nog zeer goed aan het toeval kunnen worden toegeschreven: HQ ^ x^o (2 vrijheidsgraden) = 1,05, met een overschrijdingskans tussen 0,5 en 0,7. Hoewel dus bij de dermovacciniagroep de tumorontwikkeling eerder begint en de muizen ook eerder doodgaan, is er geen verschü waar te 58

TABEL 15

Duur der tumorvorming. Duur der tumorvorming in dagen 5 27 34 38 48 50 53 56 61 62 67 68 69 70 71 72 73 74 75 77 78 79 80 82 83 84 87 89 90 91 92 93 96 97 98 99 100

Dermo- Neurovaccinia vaccinia groep groep

Controle groep

Duur der tumorvorming in dagen

1 1 1

101 103 105 106 108 109 110 111 114 115 116 117 118 120 122 124 126 127 128 129 130 131 132 136 137 138 139 140 141 144 145 147 149 151 154 156 159 162 173 191

1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1

1

3 1 1

1 1 1

1 2

2 1 1 1 1 2 2

1

1 1 1 1 3

2 1 1

1 1

1 1 1

1 1

1

Dermo- Neurovaccinia vaccinia groep groep

2

2

1 1

1 1 1 3 2

2 1 1 2 1 1 1

2

2 1

1 3 2 1

1 1 2

3 1 2 2

1 1

2 2 1 1 2 1 1 1

2 1 1 1 1

1 1

Totaal Mediaan

3 1

Controle groep

49 110

H-toets x'o (2 =

50 112%

47 105

1,50 (0,50 < P <0,70)

59

nemen in de tijd gedurende welke de dieren de tumoren met zich gedragen hebben. Van een sneUere ontwikkeling in die zin, dat het levenseinde eerder wordt bereuet, kan onder deze proefomstandigheden dus niet gesproken worden. Een maat voor de sneUere ontwikkeling van tumoren is behalve in de begindatum wanneer de tumor manifest wordt, ook te vinden in het aantal tumoren, dat zich in een bepaalde tijd ontwikkelt. Wanneer we de aantallen tumoren beschouwen, die de muizen op de laatste registeatiedatum met zich droegen, dan verkrijgen we de frekwentieverdelingen van tabel 16. OpvaUend is weer de grote spreiding van het aantal tumoren bij elk van de drie groepen. De mediaanwaarden verschiUen slechts weinig (zij bedragen respectieveUjk 13, 15 en 11 tumoren). Past men de H-toets toe, dan blijken deze verschiUen juist significant te zijn bij een 5% drempel. Men zou dus mogen concluderen, dat er een tendens is tot een sneUere ontwikkeling in het aantal tumoren bij de geinfecteerde groepen. Een duideUjker beeld hiervan geeft grafiek V, waarin per waamemmgs-r datum (op de X-as) het gemiddelde aantal tumoren per muis is uitgezet. GRAFIEK V

16

,-—

u • —

ontrfileoroeo neuro voccinlogroep dermo voeclnlagroep,

12

j

J

10

,

'A

f

/

<--

/ /

11 /

/s / ^ o

40

7 to

120

160

200

2«0

oontol dogen In de proef

Gemiddeld aantal tumoren per muis per waarnemingsdatum.

Uit deze grafiek is af te lezen, dat gedurende het gehele tijdsmterval de vacciniaviras besmette groepen een voorsprong tonen ten opzichte van de conteole groep. Na een trage aanloop komt de neurovacciniagroep sterk naar voren, om met het grootste gemiddelde aantal tumoren te eindigen. De afbuiging op het eind van de curven vindt zijn verklaring in het 60

TABEL 16

Aantal tumoren op de laatste registratiedatum. Aantal tumoren

Dermovaccinia groep

Neurovaccinia groep

Controle groep

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41

1

1

1 4 2 3 2 1 4 3 1 1 1 1 5 2 3 2 1 2 1 1 1 1 1

2 2 1 1 4 1 5 3 6 1 2 2 3 2 2 1 1 3 1

1 1 5 1 4 3 2 3 2 4 1 2 4 3 2 3 1 l

1 1 2 3

1 1 1

1 1

Totaal

49

50

47

Mediaan

13

15

11

H-toets

Xo*(2) = 7,7 P <0,05

61

feit, dat ook de dode muizen bij de berekening van het gemiddelde aantal tumoren werden meegecalculeerd. Voor elke dode muis werd constant het aantal tumoren aangehouden, dat bij de laatste registeatiedatum werd genoteerd. Het gevolg is, dat bij een toenemend aantal dode muizen de veranderingen van het totaal aantal tumoren door de nog enkele levende muizen steeds van geringer betekenis gaat worden en de curve dus tot een horizontale zal gaan naderen. Tot deze gedragsUjn werd besloten, omdat het uitvallen van muizen in het verloop van het proces steeds meer invloed gaat tonen op de helUng van de grafiek, vooral waimeer het op het eind muizen betreft met een zeer hoog of zeer laag aantal tumoren. De gekoesterde verwachting, dat de grafieken elkaar op het eind zuUen naderen komt dus niet in de waamemingsgegevens tot uitdrukking. Als indicatie voor de tumorgroei kan ook gebruik gemaakt worden van het totaal geregisteeerde aantal mm^ tumoroppervlak bij de muizen in de drie groepen. De gegevens hierover zijn in tabel 17 weergegeven. TABEL 17 \.

Groep

mm

\ \

Totaal aantal mm* tumoroppervlak per muis, gemeten op de laatste registratiedatum, in volgorde van toenemende grootte.

0,5 1 7 10,5 12 14 16 18,5 22 24,5 25,5 28,5 28.5 28.5 29 29 33

Controle groep

Neurovaccinia groep

Dermovaccinia groep 33,5 59,5 33,5 60.5 34 61 35.5 64 37,5 65 38 67 41 73.5 41,5 75 44,5 76,5 45,5 85 47.5 86,5 47.5 101 49 123,5 50.5 125 52.5 129 53.5 57

1 9 15 18 19,5 20 20.5 21.5 22 26 26.5 27 28,5 28,5 29 33 34

42 42 42,5 44 47 47 48,5 49.5 49,5 51,5 53 55 59 60 62 63,5 67

68 68,5 70 70.5 71.5 71,5 74 77.5 83 84 109,5 110 110 110 120 151

1,5 3 3 4 5.5 7 7,5 9,5 11 12 13 15 15 16,5 18 19 19.5

20 22 23 25 28,5 28,5 30 30,5 30,5 35 35 38.5 39 40,5 42,5 43,5 46

Totaal

49

50

47

Mediaan

41,5

49,5

30,0

H-toets

X 0

2) =

^10,77.

46.5 50 51 52 59 59,5 68,5 70 73,5 74 82 94 145

P <0.01

In het oog springend is ook hier weer de grote steooiing die opteeedt, wat echter ook opvalt, is de sterkere toeneming in grootte bij de geïnfecteerde groepen. Vinden we aan het eind van de eerste kolom bij de der62

movacciniagroep 33 mm2 en bij de neurovacciniagroep 34 mm^, bij de conteolegroep is dit pas 19V2 mm2. Ofschoon bij de conteolegroep één muis zit met een tumoroppervlak van 145 mm^ is er dus toch een duideUjke verschuiving naar de grotere oppervlakten te zien bij de geïnfecteerde groepen. De mediaan van de controlegroep (30 mm2) Ugt dan ook zeer significant lager dan die bij de geïnfecteerde groepen: H-toets, Ho ^ x^o = 10,77, P < 0,01. Ook hier bUjkt de neurovaccmiagroep het hoogste gemiddelde te bezitten. Men kan de toename van het tumoroppervlak behalve op de laatste registeatiedatum ook nagaan gedurende het gehele verloop van het proces, door bij elke waamemingsdatum het totale tumoroppervlak grafisch uit te zetten. Men krijgt dan een beeld zoals in grafiek VI wordt weergegeven. Op de X-as zijn weer de registeatiedata afgezet, gerekend naar het aantal dagen dat de dieren in proef waren, en als ordinaat telkens het bijbehorende gemiddelde tumoroppervlak in mm2 per muis. Ook hier werden om een onregelmatig verloop van de curven te voorkomen de dode muizen in de berekening opgenomen met het totale tumoroppervlak dat op hun laatste registeatiedatum werd genoteerd. Het gevolg is ook hier een terminale afbuiging van de curve die tot de horizontale nadert. GRAFIEK VI

o

«o

80

oantol dogen In de

120

160

200

240

proef

Gemiddeld tumoroppervlak (in mrr^ per muis per waarnemingsdatum.

In deze grafiek valt een sterkere toename van het tumoroppervlak bij de beide met vacciniaviras besmette groepen af te lezen. Dit geldt voor het gehele verloop van het proces en ook hier is bij de neurovacciniagroep de toename na een aanvankeUjk teaag begin het grootst. De curven in de grafieken V en VI tonen vrijwel dezelfde helling. De sterkere toeneming van het tumoroppervlak bij de gevaccineerde groepen 63

moet daarom voor een groot deel uit het grotere aantal tumoren bij deze groepen verklaard worden. Echter ook de gemiddelde grootte der tumoren bUjkt voor de gevaccineerde groepen groter te zijn zoals uit tabel 18 bUjkt. TABEL 18

Gemiddeld aantal mm* oppervlak per tumor. Gemiddeld oppervlak in mm*

Dermovaccinia groep

Neurovaccinia groep

0,5 1,0 1,5 1,8 1,9 2,0 2,0 2.2 2.3 2,4 2,5 2,6 2,7 2.8 2.9 3,0 3,1 3,2 3.3 3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 3,9 4.0 4,4 4.5 4.6 4,8 5,0

1 1

1

Totaal Mediaan H-toets

1 3 3 4 3 3 1 4 2 5 4 3 2 2 3 1 1 1

1 1 2 2 3 2 1 4 6 5 4 4 5 3 2 2 1

Controle groep

3 1 1 1 1 1 3 2 1 4 1 3 3 4 2 1 4 2 2 2 1 3

1 1

1 49 3,1

50 3.4

47 2,9

X*o(2, = 14,68, P <0.001

In tabel 18 is in de eerste kolom het gemiddelde tumoroppervlak weergegeven zoals dit op de laatste registratie kon worden berekend. De gevonden waarden zijn verkregen, door het totale tumoroppervlak per groep op die datum, te delen door het op die datum getelde totale aantal tumoren 64

per groep. In de daarnaast gelegen kolommen staat wederom voor elke groep het aantal muizen, dât op deze einddatum het betreffende gemiddelde tumoroppervlak toonde. Wanneer in deze tabel de mediaanwaarde voor de verschiUende groepen wordt afgelezen en aan de hand daarvan met de H-toets wordt nagegaan in hoeverre aan de gevonden verschiUen betekenis kan worden toegekend, dan komt er een duideUjk significant verschü tussen de groepen onderling tevoorschijn. Ook nu weer is dit verschü voor de neurovacciniagroep het grootst. lËeruit mag men afleiden, dat ook de individuele tumoren bij de geïnfecteerde groepen sneUer groeien dan bij de controlegroep. Tenslotte kan men nog het aantal infüteaten en het aantal kraters registreren zoals deze zich bij de verschiUende groepen hebben voorgedaan. De verdeling van het aantal infütraten is opgenomen in tabel 19a. TABEL

19a

Aantal Infiltraten. Aantal Infiltraten

Dermovaccinia groep

Neurovaccinia groep

Controle groep

0 1 2 3 4

18 26 4

7 22 17 4

15 20 7 4 1

50

47

1 49

Combineert men 2, 3 en 4 infüteaten tot een categorie dan ontstaat tabel 19b: TABEL

19b

Aantal infütraten 0 1 2 en meer Totaal

Dermovaccinia

Neurovaccinia

Controle

Totaal

18 26 5

7 22 21

15 20 12

40 68 38

50

47

146

Past n\en op de 3 aldus verkregen verdelingen de x^ toets toe, dan is de uitkomst: x^o (4) = 15,55, P < 0,01. Dit zeer sigcdficante verschü is vooraameUjk toe te schrijven aan het grotere aantal infüteaten bij de neurovacciniagroep. In verband met de tumorontwikkeling moet aan de infüteaten de volgende betekenis worden toegekend. 65

Bij een sneUe toeneming in grootte zijn meerdere malen tumoren in een infilteaat terecht gekomen en in deze weke massa gezonken. Het was in de regel niet goed mogeUjk van deze tumoren nauwkeurig de grootte te bepalen, sommige verdwenen geheel in het infilteaat, sommige leken ook kleiner te worden. Deze tumoren zijn arbiteair als van een constante grootte geregisteeerd. Dit is zeker een te lage waardering van het tumoroppervlak. Een gevolg is, dat het gevonden verschü tussen de neurovaccinia en de controlegroep, ten gevolge van het grotere aantal infüteaten bij de neurovacciniagroep, als te klein is aan te merken. Dit betekent, dat de neurovacciniagroep nog meer van de andere groepen afwijkt dan hier is weergegeven. Ten aanzien van het aantal kraters kon geen verschü tussen de groepen worden aangetoond. Bij de obductiebevindingen is ook hier geteacht deze zodanig in tijd te rangschikken, dat uit het overzicht naar voren komt, hoe de ontwikkeling bij de diverse groepen heeft plaatsgehad. De bevindingen bij de conteole-muizen kunnen als volgt worden samengevat. Aan de huid valt bij de muizen die vroegtijdig gestorven zijn nog niets waar te nemen, behalve enige roodheid, korstvorming en exsudaat, welke het gevolg zijn van een ontstekingsreactie. Na een maand wordt de huid dikker, hetgeen te zien is doordat de huid dof, meer grijsachtig van tint wordt en grove plooien gaat tonen op de plaats waar de teer geregeld geappUceerd wordt. De dikte neemt in het verdere verloop nog toe. Dit beeld is dus geheel gelijk aan de reeds bij de ecteomeUavrije groep beschreven bevindingen. De verdikking van de huid Ujkt hier iets meer uitgesproken. Het Ujkt waarschijnUjk, dat de ontstekingsreactie aan de teer mag worden toegeschreven; huiddefecten ten gevolge van het scheren of door andere ongelukken zijn hier nog niet voorgekomen. Na ongeveer 2 maanden beginnen de eerste papiUomen op te komen, ook hier wiUekeurig over het verdikte epitheel verspreid. Sommige beginnen als ronde gladde, half bolvormige schijfjes, roodachtig van kleur en dooraderd. Andere begmnen meteen als kleine wratjes. De gladde roserode schijfjes nemen als regel na ongeveer een week dezelfde grijs-witte kleur aan als de andere woekeringen, het oppervlak gaat rimpelen en na enkele weken zijn deze woekeringen in geen enkel opzicht meer van de andere papiUomen te onderscheiden. Ook bij deze controle-muizen valt de groepsgewijze lokaUsatie van de woekeringen in het oog, ook hier ziet men bloemkoolvormige gezweUen en ook hier is het weer opvaUend, dat niet aUe wratten door bUjven groeien. De gesteelde wratten welke afvaUen laten een krater na. De komvormige krater toont weinig neiging tot genezing en op de opgeworpen randen van een dergeUjke krater is meer dan eens het opkomen van nieuwe wratten waargenomen. Vaak ontwikkelt zich vanuit de krater een infilteaat; dit is echter minder 66

vaak gebeurd dan bij de muizen uit de A-reeks. Bij de obductie van de controle-muizen valt in de eerste maanden niets bijzonders op. Na 168 dagen werd een muis geobduceerd met een in de flanken sterk opgezet abdomen. Tussen het fluctuerende vocht kon men een harde lever palperen. Met de Pasteurse pipet kon ongeveer 3 cc teoebel geel ascitesvocht worden opgezogen, dat bij staan binnen enkele minuten tot stoUing overging. Inwendig werd een sterk vergrote lever aangeteoffen met een geelgrijs gekorreld oppervlak en van een harde consistentie. Bij het doorknippen voelde men de schaar knisperen. Ook de milt was sterk vergroot, DergeUjke vergrote geel-bleke levers met een raw oppervlak en gummiachtige tot harde consistentie werden in deze groep bij 8 muizen aangeteoffen, bijna aUe na meer dan 180 dagen. In de meeste gevaUen was deze harde lever vergezeld van een vergrote müt, iets te grijs van kleur en te stevig van consistentie. Bij drie muizen waren macroscopisch zichtbare, witte, schijfvormige, massieve, op het pleura-oppervlak zich verheffende, weefselwoekeringen te vinden, die een longmetastase deden vermoeden. Bij vier muizen werd een grote oranje-gele cyste in de lever aangeteoffen, waaruit bij openen een witte lintworm te drakken was. De eerste na 147 dagen, de overige na ongeveer 1V% maand. De bevindingen van de microscopische preparaten zijn als volgt samen te vatten. Bij de controlemuizen begint een verdikking van de huid na 2 à 3 weken op te komen. Na ongeveer 3 Va maand bUjkt de dikte der huid ter plaatse van de papiUomen te zijn toegenomen tot 6 à 10 lagen. Er is nu ook een duideUjke differentiatie tussen de verschiUende lagen van het epitheel. Van de epitheelceUen tonen vele een blazige degeneratie. Het epitheel toont een duideUjke plooivorming, tussen de epitheelplooien valt een schaars maar vaatrijk bindweefselsteoma op te merken. Aan de oppervlakte van het epitheel Ugt veelal een te grote hoeveelheid kératine. Een neiging tot het naar beneden groeien van epitheelsteengen werd voor het eerst na 5 maanden waargenomen. Het naar beneden groeien van epitheelsteengen gaat daarna frekwenter voorkomen en na 7 maanden ziet men, dat de epitheelceUen hier en daar een onrastig beeld tonen met een duidelijke polymorphic. De papiUomen zijn over het algemeen sterk vertakt en er is een flinke hyperkeratose. Een werkeUjk eclatante dieptegroei waarbij het steatum carnosum wordt geïnfiltreerd, is bij de conteolemuizen in de B-reeks echter niet gevonden. InsluitUchaampjes werden bij de conteole-muizen nergens waargenomen. Aan de organen werden aanvankeUjk geen afwijkingen gevonden. Vanaf ongeveer 4V2 maand zijn bij enkele levers veranderingen te vinden die op een celUg proUferatieve ontsteking wijzen zonder dat nog van een duideUjke cirrhose gesproken mag worden. Na 6 maanden zijn er echter al veel meer levers waarbij multiple periportale, veelal sub-miUaire celopho67 6*

pingen zijn te vinden. Deze bestaan voor een groot deel uit jonge bindweefselceUen en zo nu en dan een proliferatie van de galgangen. Verder werden vele reticulaire elementen gevonden; myeloide ceUen in verschiUende stadia van rijping, veel granulocyten plasma ceUen en lymphocyten. Veranderingen dus die mogelijk op een nog jonge levercirrhose en op een myeloide leucose zouden kunnen wijzen. In enkele exteeme gevaUen werden deze myeloide ceUen en plasmaceUen ook in de lymphekheren aangeteoffen. De wenseUjkheid van beenmerg preparaten bij deze muizen om de overweging van myeloide leucose beter te kunnen funderen is hierbij naar voren gekomen. De veranderingen die men bij de müt kan waamemen zijn een veelal verdwijnen van de normale foUikeltekening. Vaak worden megakaryocyten gezien; deze zijn echter bij een macroscopisch niet veranderde müt ook te vinden. De bevindingen bij de met dermovaccinia, respectieveUjk neurovaccinia gevaccineerde groepen zijn in vele opzichten geUjk aan de conteolegroep. De huidveranderingen zijn dezelfde als bij de conteolegroep, aUeen zijn de afwijkingen eerder waar te nemen en werd bij de neurovaccinia-groep na 235 dagen een tumor aangeteoffen, die zover in de subcutis was doorgegroeid, dat bij het losmaken van de huid de tumor doorgesneden moest worden. Bij de obductie van de met vacciniaviras besmette muizen viel in de eerste maanden niets bijzonders op te merken. Na 177 dagen werd bij de dermovacciniagroep een muis geobduceerd met sterk opgezette flanken. Ook deze muis had vrij vocht in het cavum peritonei', teoebel geel van kleur en snel tot stolling overgaande. Deze bevinding was weer vergezeld van een grote harde lever en een vergrote grijze müt. DergeUjke levers die aan een leucose doen denken werden hierna nog 6 maal bij de dermovacciniagroep aangeteoffen als regel tezamen met een vergrote müt. Een macroscopisch zichtbare longmetastase werd slechts eenmaal gevonden na 213 dagen. Bij 8 muizen werd in de lever, meestal in de leverkoepel, een grote oranje-geel gekleurde cyste aangeteoffen, waaruit bij openen een witte lintworm tevoorschijn kwam, de eerste na 144 dagen, de overige na 6 à 7 maanden. Bij de neurovacciniagroep werden 3 muizen met vrij vocht in het abdomen gevonden, alle na 6^2 maand, 2 hiervan hadden een grote harde lever, bij de andere muis was macroscopisch aan de lever niets op te merken, In deze groep werd eveneens 6 maal een grote harde lever aangetroffen en acht maal een vergrote müt welke stevig van constistentie was en te grijs van kleur. Longmetastasen werden macroscopisch 3 maal aangeteoffen. Bij 5 muizen werd een worm cyste gevonden. Bij de met vacciniaviras besmette groepen geven de huidafwijkingen microscopisch hetzelfde beeld als de controle groep. Nergens werden de voor viras beschreven insluitUchaampjes gevonden. Een beoordeling van het verloop door middel van de coupes van de afgevaUen wratten is helaas 68

niet mogeUjk gebleken, doordat de meeste afgevallen wratten tangentiaal zijn gesneden. Bij de dermovacciniagroep zijn de papiUomen meer vertakt, er is meer dieptegroei en er is meer Polymorphie dan bij de conteolegroep na hetzelfde tijdsinterval te zien. Reeds na 180 dagen is bij muis DVIi een infüteatie van het steatum carnosum te zien en na 200 dagen nog bij 2 andere muizen. Bij muis DIII 5 is na 213 dagen een duidelijke infüteatie van de spierlaag te zien met necrose, met een sterke polymorphic en met enkele pathologische mitosen. In totaal zijn hier 6 muizen waarbij het beeld een maUgne indruk maakt. De leverpreparaten geven bij de dermovacciniagroep hetzelfde te zien als bij de conteole-muizen. In de longpreparaten werden wel hier en daar ontstekingsinfütraten gevonden met gelobd-kernige leucocyten, maar een duideUjk metastisch proces werd nergens gevonden. De afwijkingen aan de müt geven hetzelfde beeld als bij de conteole-muizen. De papiUomen van de neurovacciniagroep zijn eveneens meer vertakt dan bij de conteolegroep en ook meer dan bij de dermovacciniagroep. Het voorkomen van dieptegroei, polymorphic en zichtbare mitosen werd bij de neurovacciniagroep vaker gezien dan bij de dermovaccinia- en de conteolegroep. Na 180 dagen is hier bij 2 muizen dieptegroei gezien van de huidtumoren; in totaal is bij 6 muizen dieptegroei waargenomen bij sommige tot in de spierlaag en bij 1 tot aan de onderste begrenzing van het preparaat. De leverpreparaten en de coupes van de müt geven hetzelfde beeld te zien als bij de conteolemuizen. In de longen werd microscopisch 8 maal epitheelweefsel aangeteoffen. De eerste maal na 180 dagen. Dit was een niet verhoomd plaveiselceUencarcinoom, dat een rastige indruk maakte, waarbij geen polymorphic en geen mitosen te vinden waren. Het onderzochte huidgezwel was eveneens rastig, er was weinig dieptegroei en weinig polymorphic. De volgende métastase, na 188 dagen gaf een veel meer maUgne beeld, er waren verscheidene pathologische mitosen. Hier was ook het beeld bij het onderzochte huidcarcinoom veel meer maUgne: er bleek een duideUjk infüteerende groei tot in de spierlaag, met sterke polymorphic en vele pathologische mitosen, er was echter geen verhooming. De overige metastasen zijn aUe na ruim 7 maanden waargenomen, hiervan waren 2 duidelijk maligne, de overige waren rastig. De overeenkomst met het beeld dat de onderzochte huidtumor te zien gaf was hierbij niet duideUjk. Gezien het grote aantal tumoren op de rag van de muis, kan ook niet worden gezegd dat de métastase in de long met de onderzochte huidtumor samenhangt. Hoewel uit de obductiebevindingen en de histologische preparaten op zich geen aanwijzing voor een snellere ontwikkeling bij een der met vacciniaviras besmette groepen geconcludeerd mag worden, zijn de bevindingen wel tot steun voor de waameming gedaan bij de macroscopische tu69

morregisteatie. De conclusie, dat de tumorontwikkeling bij de gevaccineerde groepen, vooral bij de neurovaccmiagroep, een sneUer beloop heeft wordt er door gesterkt. Een voor de vaccinia-infectie typerend beeld, is bij de obductie niet gemerkt. Ook microscopisch zijn geen aanwijzingen gevonden die als kriterium voor een vaccinia-infectie zouden kunnen gelden.

70

HOOFDSTUK VI Besprekingen van de resultaten Wanneer men de resiütaten van de experimenten zoals die m de voorgaande hoofdstukken zijn beschreven onderling gaat vergelijken, dan valt in de eerste plaats op, dat de tumorontwütkeUng bij de geïnfecteerde dieren ongeveer 3 weken eerder begmt dan bij de contix)le-dieren. Er blijkt echter telkenmale een zeer grote steooimg te bestaan bij de muizen die tot een zelfde groep behoren; deze is waarschijnUjk toe te schrijven aan de omstandigheid, dat niet met genetisch zuivere muizestammen is gewerkt. Een gevolg hiervan is, dat men aan de tijdsvoorsprong, welke men bij de met het ecteomeUa-viras besmette muizen kan waamemen, ten gevolge van het geringe aantal dieren slechts een beperkte betekenis zou moeten toekennen, ware het niet dat deze tijdwinst dezelfde is als bij de groepen die met het dermo- en neurovaccinia-viras werden besmet. Bij deze laatste groepen is door het veel grotere aantal muizen, niettegenstaande de grote strooiing, voor de dermovaccmiagroep toch een significant verschü aangetoond kunnen worden tussen het tijdstip waarop bij de geïnfecteerde muizen en bij de conteole muizen de eerste macroscopisch waarneembare tumorvorming optead. Als men het tijdstip nagaat waarop de tumorontwikkeling door teerapplicaties bij muizen begint, zoals dit in de Uteratuur te vinden is, dan wordt door LEITCH pas na 3 maanden een eerste tumorvormmg beschreven en door FRIEDEWALD en Rous na bijna 2 maanden, terwijl SEELIG en COOPER in hun overzicht melden, dat er een verbijsterend verschil bestaat in de opgave hierover bij de verschillende auteurs. Ook in de eigen experimenten Uep het tijdstip waarop de eerste tumorvorming werd gezien uiteen van ongeveer 4 maanden bij de A-reeks tot ongeveer l'/2 maand bij de B-reeks, Hier zijn verschiUende omstandigheden voor aan te wijzen. Behalve op de genetische constitutie van de muizen en de grootte van het geteerde oppervlak, hetgeen in beide proefreeksen hetzelfde was, moet vooral ook gewezen worden op de gezondheidstoestand van de dieren, In de beschreven experimenten is meermalen ervaren, dat na een korte onderbreking van het teren de tumoren sneUer in grootte toenamen dan anders het geval was. Dit was te zien als even gewacht werd totdat aUe teer was weggevreten om daarna de muizen bij te scheren; het was ook te zien als het teren werd uitgesteld omdat de muizen m slechtere conditie waren, BUjkbaar geeft hier de verbetering van de lichamelijke toestand meer dan compensatie voor het uitvaUen van de mvloed van de teer. Dit blijkt een algemene er71

varing, die ook in de Uteratuur is terag te vinden. Zo beschrijven MACen Rous het belang van de gezondheidstoestand van him konijnen voor het experimenteel opwekken van gezweUen. Ook uit de kliniek weet men, dat de gezondheidstoestand van de patiënt invloed heeft op het beloop van een gezwel. In deze omstandigheden moet waarschijnUjk het eerder ontstaan van de tumoren in de B-reeks voor een groot deel worden gezocht. De muizen waren iets groter toen de proef begon, ze waren vooraf geselecteerd op scheerbaarheid, zodat voor de muizen die het experiment ingingen het scheren een vrij onbeduidende ingreep werd. Hier komt nog bij, dàt door de opgedane routine het scheren van de muizen in de B-reeks een veel vlotter en vooral beter verzorgd verloop heeft gehad, met minder kans op kouvatten en huidlaesies. Het teren in de Brëeks werd ook minder frekwent gedaan. Dit heeft tot gevolg gehad, dat gedurende het gehele experiment de muizen er gezonder uitzagen en minder in gewicht afvielen dan in de A-reeks. Tenslotte kan het tijdstip van het eerste opteeden der tumoren in de A-reeks iets vroeger Uggen, omdat nog nooit eerder wratten waren waargenomen en de eerste nauweUjks zichtbare verhevenheden niet direct als zodanig werden geïnterpreteerd. Wanneer de papiUomen eenmaal macroscopisch zichtbaar zijn geworden, betekent dit nog niet dat nu een voortgaande ontwikkeling verwacht mag worden. Sommige papiUomen schieten als paddestoelen uit de grond, ze nemen snel in grootte toe, tonen macroscopisch een duideUjke plooivorming, waardoor hun oppervlak er als een bloemkooltje gaat uit zien, dat via een dun steeltje met de onderUggende huid verbonden is. Sommige papiUomen tonen van de aanvang af een geleideüjke groei met minder uitgesproken plooivorming en met een grotere, meer vleesachtige kem. Sommige papiUomen beginnen als een klein roodachtig dooraderd bolletje met een glad oppervlak. Bij het uitgroeien gaat de rode kleur geleideUjk in de grijs-witte kleur der papiUomen over en treedt ook enige plooivorming op, waardoor ze zich in geen enkel opzicht meer van de andere papiUomen onderscheiden. Tenslotte zijn er ook vrij veel papiUomen die, nadat ze macroscopisch zichtbaar zijn geweest, weer in grootte afnemen. Deze regressie van papülomen werd bij voortgaande periodieke teer-appUcatie geregeld waargenomen bij aUe groepen. Sommige tumoren werden geheel onzichtbaar, andere bleven stationair en enkele toonden na enige tijd van stüstand weer een toename van de grootte. Een uitgesproken regressie van bijna aUe tumoren werd bemerkt nadat bij de groepen III en IV uit de A-reeks het teren werd gestaakt, omdat bij de onbesmette conteole-groep een ecteomeUa-infectie was binnengeslopen. Ook dit is een ervaring die eveneens door anderen is opgedaan. Reeds in 1916 hebben YAMAGIWA en ICHIKAWA bij hun met teer besteeken konijnen bemerkt, dat enkele tumoren tijdens de behandeling in grootte afnamen. Hetzelfde is beschreven door LEITCH bij konijnen en muizen, door FRIEDEWALD en Rous, door FOULDS en door Rous en KIDD bij konijnen. KENZIE

72

BUjkbaar zijn de door het teren opgewekte papiUomen aanvankelijk geconditioneerde tumoren, dat wü zeggen tumoren, die voor him verdere groei en overleving afhankeUjk zijn van een aanhoudende stimulans. Slechts een enkele tumor gaat verder in zijn ontwikkeling als het teren wordt gestaakt, Bij konijnen pas na een langdurige voorafgaande periode van geregeld teren, bij muizen na een iets kortere voorafgaande periode van teerappUcaties. Bij het periodiek bijscheren van de muizen is niet voorkomen kunnen worden, dat zo nu en dan een wratje van de huid loslaat of bij de steel inscheurt. Het gevolg was een krater ter plaatse van de wrat. Een enkele maal nam deze krater snel in grootte af en genas het wondje per primam. Meestal echter bleef de krater langere tijd bestaan, met harde opgeworpen randen en veelal was ze het begm van een etterige ontsteking van de huid. De neiging tot genezing, ook als geen ontsteking het proces compUceerde, was gering en op de opgeworpen rand van verscheidene van deze kraters is het opkomen van wratten opgemerkt. Op de betekenis van een teauma bij de ontwikkeling van tumoren is in de Uteratuur herhaaldeUjk gewezen. Reeds in 1924 zag DEELMAN tumoren opkomen bij de wondranden, toen per ongeluk de scarificaties op de ra^uid bij muizen te diep werden aangebracht. Ook LIPSCHÜTZ beschrijft de lokaliserende invloed van een teauma en door MACKENZIE en Rous, en door FRIEDEWALD en Rous is zelfs van ponsgaatjes gebraik gemaakt, om door een niet-carcinogene prikkel neoplastisch veranderde ceUen tot groei te stimuleren, In 1957 heeft DURAN-REYNALS neurovaccinia-viras inteadermaal ingespoten bij Swiss-albinomuizen, die voorbehandeld waren met methylcholanthreenpenseUngen en cortisoninspuitingen. Hij zag toen na enige tijd een aantal tumoren ontstaan precies op de plaats waar het vaccmia-virus was ingespoten, hetgeen nog aan het Utteken van de doorgemaakte pokpuist was te zien. Tenslotte moet in dit verband nog gewezen worden op een door Helman in 1957 opgestelde verzameling van 5 gevaUen, waarbij men bij mensen enkele weken na een pokkenvaccinatie een lymphosarcoom zag ontwikkelen vanuit het Utteken van de vaccinatie. Behalve dat de tumoren bij de geïnfecteerde groepen eerder beginnen, is uit de registeatie ook af te lezen, dat het aantal tumoren, het totale tumoroppervlak en de groei der afzonderUjke tumoren bij de geïnfecteerde groepen groter is. Deze verschiUen zijn vóór de B-reeks significant gebleken. Tenslotte is nog opgevaUen, dat bij een matig aantal gezweUen een uitgesproken groepsgewijze lokaUsatie veelal kan worden waargenomen. Dit geldt zowel voor de geïnfecteerde als voor de conteolegroepen, bij een groter aantal tumoren gaat deze groepsgewijze lokaUsatie weer verloren. Er zijn voor de hier opgesomde verschijnselen bij de muizen enkele invloeden aan te wijzen die bij het ontstaan ervan beteokken zijn geweest. 73

De betekenis van de genetische constitutie mag hier buiten beschouwing bUjven, omdat bij aUe groepen is gewerkt met genetisch heterogene Swissalbino muizen ten gevolge waarvan in elke groep dezelfde steooiing bij het opkomen der papiUomen is bemerkt. In de A-reeks is gewerkt met vrouweUjke muizen, omdat aanvankeUjk geprobeerd werd de invloed van gestyl in de proeven te beteekken. In de B-reeks werd met mannelijke muizen gewerkt; deze waren op dat moment gemakkeUjker verkrijgbaar en bovendien had men minder kans op verUes van muizen wanneer er bij het „sexen" een vergissing werd begaan. Hoewel dus voor de beide reeksen de proefomstandigheden in dit opzicht verschiUend zijn geweest, Ujkt het toch waarschijnlijk, dat het geslacht der muizen geen invloed heeft gehad op de ontwikkeling der tumoren. Immers de verschiUen tussen de geïnfecteerde en de conteolegroepen tonen in beide reeksen hetzelfde beeld, terwijl de omstandigheid, dat in de B-reeks de tumorontwikkeling eerder is begonnen, gemakkeUjk op een andere manier is te verklaren. Er moet echter vermeld worden, dat oestron volgens DURAN-REYNALS (1957) in hoeveelheden van 100 gamma of minder, een duidelijk remmende invloed heeft op de ontwikkeUng van tumoren bij muizen die met methylcholanthreen werden behandeld en daarna met vacciniaviras inteadermaal ingespoten. Het gewicht van de muizen in de B-reeks (18—22 gram) was groter dan van de muizen uit de A-reeks (10—12 gram); dit komt overeen met een leeftijdsverschil van ongeveer 1 maand. Wanneer de gemiddelde leeftijd van een muis onder laboratorium-omstandigheden op ongeveer 2 jaar gesteld mag worden (HIEGER) dan mag men aan het leeftijdsverschil van 1 maand misschien enige invloed toekennen. Deze invloed zou zich dan uiten in een eerder opteeden van de tumoren in de B-reeks. AUe muizen in beide proefreeksen zijn behandeld met horizontaal retortenteer afkomstig van de lichtgasfabriek te Leiden. Toen YAMAGIWA en ICHIKAWA op grond van de prikkeltheorie van VIRCHOW bij konijnen periodiek de oren met teer hebben gepenseeld, wist men nog niet aan welk teer-bestanddeel de carcinogene werking toegeschreven moest worden. Door specteoscopische analyse is later een sterk fluorescerende substantie gevonden (kappa genoemd) die in hoge mate carcinogeen bleek te zijn. De voor de carcinogene werking verantwoordeUjke stof bleek te zijn opgebouwd uit koolstof en waterstof in de vorm van een gesloten ring, die men bij aUe teersoorten kan vinden en waarvan het anthraceen als typisch voorbeeld geldt. Onderzoek van een aantal anthraceenmonsters op hun carcinogene werking heeft tenslotte geleid tot de ontdekking van het 1 : 2 benzanthraceen als carcinogeen agens. Dit agens toonde hetzelfde fluorescentie spectrum als het kappa en moest hier dus nauw mee verwant zijn. Nader onderzoek heeft tot ontdekking van het 1 : 2 : 5 : 6 dibenzanthraceen geleid, dat een krachtige carcinogene werking bezit; deze stof heeft men inmiddels synthe74

tisch kunnen bevinden, het is dan een kristalUjn geel poeder dat de naam 3 : 4 benzpyreen draagt. Dit benzpyreen is het carcinogene agens waaraan men het effect van teer toeschrijft (FRIEDEWALD en Rous 1944). Sedertdien zijn nog vele andere carcinogeen werkende stoffen geïsoleerd. De verschiUende teerprodukten blijken te verschiUen in hun carcinogeen vermogen, de chemische samenstelling van de teer varieert enige mate met de temperatuur waarbij ze is bereid. De mogeUjkheid is dus niet uitgesloten, dat bij het gebruiken van verschülende monsters, deze in hun werking iets uiteen lopen, hetgeen het tijdstip kan beïnvloeden waarop de tumoren zichtbaar worden. Het benzpyreen is slechts in kleine hoeveelheden in teer aanwezig; toch ziet men bij periodieke teerapplicaties veel sneUer tumoren ontstaan dan bij appUcatie van benzpyreen aUeen. Dit paradoxale feit is aanleiding geweest tot velerlei opmerkingen. Sommige onderzoekers menen dit te verklaren doordat in de teer nog andere carcinogeen werkende substanties zitten (BERENBLUM 1944). Hoe dit ook zij, de vraag is gewettigd of het grotere effect van teer niet grotendeels is toe te schrijven aan een grotere groeibevorderende werking (FRIEDEWALD en Rous 1944). Volgens de huidige opvatting verloopt het proces van de tumorontwikkeling in verschiUende fasen, te weten: een tumor-op-gang-brengende fase en een tumor-groeibevorderende fase (hoofdstuk II). De teer bUjkt, zoals reeds eerder vermeld, op beide fasen invloed uit te oefenen. Door de teer worden aanvankeUjk geconditioneerde tumoren opgeroepen; hierbij valt vaak een groepsgewijze lokaUsatie op. Deze groepering, die reeds door DEELMAN werd waargenomen, pleit tegen de vroeger gehuldigde opvattingen dat het gehele gebied, dat door het teren een hyperplasie gaat tonen, bij de tumorontwikkeUng beteokken zou zijn. De meer modeme opvatting, dat enkele slapende tumorceUen in het hyperplastische weefsel verborgen Uggen, verwerpt deze opvatting. Elke stamcel die tot slapende tumorcel is geworden als gevolg van de tumor-op-gangbrengende werking, kan onder mvloed van de groeibevorderende werking uitgroeien tot een aantal latente tumorceUen (FOULDS 1954). Volgens GLÜCKSMANN 1940 en BERENBLUM 1954 verloopt dit proces via een verteaagderijpingvan de stamceUen, omdat bij een normalerijpingsdelinghet aantal ceUen manifest constant bUjft. Indien aldus een kritisch aantal levensvatbare tumorceUen is gevormd, heeft men het begin van een nieuwe tumor. Is de tumor eenmaal gevormd, dan ziet men in de onmiddeUijke omgeving ervan vaak enkele kleine „dochter" gezweUetjes opkomen, waardoor groepjes van tumoren gevormd worden. Als maatstaf voor de groeibevorderende werking van een agens kan men de tijd beschouwen, die nodig is voor de neoplastische manifestatie van de eerste omgevormde stamcel. Dit is onmogeUjk nauwkeurig na te gaan. Men heeft zich hierait geholpen door de latente tumorcel te dwingen zich te manifesteren. Dit kan men door gebruik te maken van een niet-carcino75

gene, maar wel groeibevorderende prikkel, zoals bijvoorbeeld het maken van ponsgaatjes. In de eigen experimenten is niet van een extea prikkel gebruik gemaakt om latente tumorceUen te dwingen zich te manifesteren. Algemeen zal daarom de tijd die hiervoor nodig is waarschijnUjk iets groter zijn. Waarschijnlijk wordt ook de steooiing van de begindata bij de verschiUende muizen hierdoor groter. Dit bezwaar is door het grote aantal muizen ondervangen. Zagen we, dat bij de dermovacciniagroep de tumorvorming significant eerder begint, bij de neurovacciniagroep kon in dit opzicht geen verschil worden aangetoond waar enige betekenis aan kan worden toegekend. Vergelijkt men het totale aantal gevormde wratten, dan bUjkt er een significant verschü te zijn tussen de beide geïnfecteerde groepen ten opzichte van de controlegroep. Hierbij is het verschü tussen de neurovacciniagroep en de conteolegroep het grootst. Kijkt men naar het totale aantal gevormde min2 wratoppervlak, dan staat ook hier weer de neurovacciniagroep bovenaan. Ook hier is een significant verschü tussen de beide geïnfecteerde groepen enerzijds en de controlegroep anderzijds. Indien tenslotte de gemiddelde grootte der wratten wordt vergeleken op de einddatum der registeatie en in samenhang met hun groeitijd, dan bUjkt dat de groeisnelheid der wratten gemiddeld bij de geïnfecteerde groepen groter is dan bij de conteolegroepen. Het viras heeft dus, zoals uit deze experimenten blijkt, een duideUjke groeibevorderende werking, waarbij het neurovacciniaviras een grotere invloed op de tumorgroei heeft getoond dan het dermovacciniaviras. Ook in de histologische preparaten welke van de tumoren zijn gemaakt, komt bij de neurovacciniagroep een verder voortgeschreden stadium van tumorontwikkeling naar voren, er zijn vaker mitosen te vinden, er is meer polymorphic te zien en men kan vaker dieptegroei vinden. De door MOORE beschreven waameming, dat het neurovacciniavirus (Levaditistam) een oncolytisch effect op verschiUende tumoren toont kan met het neurovacciniaviras (HAAGEN) bij experimenteel opgewekte teertumoren niet bevestigd worden. De hier weergegeven resultaten zijn in overeenstemming met die verkregen bij konijnen en kippen in de experimenten van ANDREWES, BERENBLUM, DURAN-REYNALS, FOULDS en Rous. De proefopstelUng, het gebruikte virus, het carcinogene agens en het proefdier waren wehswaar een andere, maar ook bij hen tonen de resultaten een groeibevorderende invloed van het viras aan. De voorstelling die men zich kan vormen over de wijze waarop de pokvirussen hun invloed op de groei der tumoren doen gelden, draagt een geheel speculatief karakter. Bij de experimenten op vogels bleek het viras bepalend te zijn voor het karakter van de resulterende tumor. Het gezwel was niet altijd celvrij over te dragen, wel echter konden in de gevaUen waarin dit niet lukte, viras76

anti-Uchamen worden aangetoond. Bij de zoogdier-experimenten zijn de omstandigheden anders; hier is veelal geen latent carcinogeen viras in de proefdieren aanwezig, zodat bij de experimenten de dieren vooraf of achteraf met het viras werden geïnfecteerd, waarvan men de invloed op de tumorontwikkeling wüde nagaan. Bij de zoogdieren bleek in vele gevaUen de aard van het viras niet bepalend te zijn voor het karakter der resulterende tumoren. De aard van de tumoren en het aantal tumoren, dat bij de teerexperimenten opkomt, büjken afhankelijk te zijn van de teer als carcinogeen agens. Het viras beïnvloedt echter wel de tijd waama de tumoren verschijnen en de snelheid waarmee ze zich verder ontwikkelen. Over een tumor-op-gang-brengende werking kunnen we bij deze experimenten niets zeggen, ze zijn er niet op gericht geweest. De enkele muizen die bij de voorproeven langs verschiUende wegen viras toegediend kregen, hebben geen van aUe gedurende de ruim 9 maanden dat ze geobserveerd werden, enig symptoom van wratvorming vertoond. Indien BERENBLUM, FOULDS, Rous en anderen gevolgd worden blijft de vraag waarom de tumoren, nadat door de op-gang-brengende-werking van het gebraikte teer enkele ceUen tot latent neoplastische ceUen zijn omgevormd, bij de geïnfecteerde groepen eerder verschijnen en een sterkere groei tonen. Indien er van uit gegaan mag worden, dat de tumorgroeibevorderende virassen evenals andere virussen noodzakelijk intea-ceUulair gelegen moeten zijn en met het celplasma een binding aangaan (FOULDS), dan mag men met FOULDS ook aannemen, dat het viras hierdoor een onderdeel van de cel wordt, met andere woorden, dat het in een gemaskeerde toestand geraakt. Hoe nauwer en stabieler deze binding van het viras met de cel-bestanddelen is, hoe moeiUjker het zal zijn het aan te tonen en hoe meer het viras de stofwisseling van de cel zal kunnen beïnvloeden. Het lijkt, dat het uitgroeien van een virastumor afhangt van de synthese van een inteaceUulair complex en dat door het teren de omstandigheden in het weefsel zodanig worden beïnvloed dat deze synthese kan plaatshebben. De grotere of minder grote betrekkingen tussen virasdeeltjes en het cytoplasma van de gastheerceUen variëren sterk. Het viras wordt uit langzaam groeiende goedaardige tumoren veel gemakkeUjker geïsoleerd. Verhoogde groeisnelheid en kwaadaardigheid verhogen haar maskering, de beteekking met het gastheerweefsel wordt nauwer en de vrijheid van het viras wordt minder. De aanwezigheid van viras in gemaskeerde staat geeft nu een bevredigende verklaringsmogeUjkheid voor het neoplastische proces, immers het is te begrijpen, dat de voortdurende synthese van eiwit, losgewoeld door elementen vreemd aan de cel, op zich al moet leiden tot een versterkte vermenigvuldiging, zonder dat in enig opzicht rekening wordt gehouden met de behoefte van het organisme. De virus-infectie, ook in gemaskeerde vorm, wordt oneindig op de dochterceUen overgedragen en de kenmerkende eigenschap van de neoplastische groei, te weten zijn autonomie en onbeperkte duur, worden aldus automatisch gereaUseerd. 77

SAMENVATTING De invloed van besmetting met ectromeUa-, dermovaccinia- en neurovacciniaviras op de ontwikkeling van experimentele teerepitheUomen bij SWISS Albinomuizen is onderzocht. De ecteomeUa-infectie geschiedde langs natuurUjke weg, door de muizen in contact te brengen met inteacutaan in een poot met ecteomeUaviras besmette muizen. Beide vacciniavirassen werden geënt in de gescarificeerde huid. Het aanslaan van de besmetting werd geconteoleerd door de klinische waameming van vaccinia laesies, het onderzoek van vaccinia-vesikels op de aanwezigheid van elementaire lichaampjes, enting van muizen met leversuspensie (ecteomeUa) en van de chorioaUantois van bebroede kippeëieren en door histologisch onderzoek naar de aanwezigheid van ceUnsluitsels. Zowel bij de met ecteomeUaviras als bij de met dermo- en neurovacciniaviras besmette muizen ontstonden de teer-epitheUomen vroeger, ontwikkelden zich sneUer en waren talrijker dan bij de niet-besmette dieren. Deze verschiUen waren voor de met vaccinia virus besmette muizen statistisch significant. In de vacciniagroep ontwikkelden de tumoren zich wat sneUer en toonden een meer maUgne beeld bij de met neurovaccinia dan bij de met dermovaccinia besmette muizen. Li de met ecteomeUaviras besmette muizen konden de voor deze infectie karakteristieke leververanderingen worden aangetoond. Bij muizen die het begin van de teer-appUcatie langer dan 6 maanden overleefden, ontwikkelde zich een myeloide leucose eventueel een chrhose van de lever. Myeloide leucose werd zowel bij de met vhus besmette als bij de (geteerde) conteolemuizen gevonden.

78

SUMMARY The influence of infection with ecteomeUa virus, dermovaccinia and neurovaccinia viras on the development of tar-induced epitheUoma in Swiss Albino mice has been investigated. Infection with ecteomelia viras was performed by natural exposure of the animals to experimentaUy infected mice. The vaccinia virases were inoculated into the scarified skin. The results of infection were checked by cUnical observation, examination of vesicles for the presence of elementary bodies, inoculation of mice with suspension of the Uver (ectromeUa) and of the chorio-aUentoic membrane of the chick embryo, and histological examination for the presence of inclusion bodies. In both ectromeUa-infected and vaccinia-infected mice the tarinduced tumors appeared earUer, developed more rapidly and were more numerous than in tiie non-infected animsds. These deferences were in the vaccinia group statisticaUy significant. Within the vaccinia group, the tumors developed somewhat more rapidly and showed a greater malignancy in mice inoculated with neurovaccinia than in those inoculated with dermovaccinia. Liver lesions characteristic for ecteomeUa developed in the ecteomeUainfected mice. Mice that surviver for more than 6 months after the beginning of the tar-appUcation, showed the development of leucosis of the Uver, This lesion was found in the vkus-infected groups as weU as in the non-infected groups.

79

LITERATUUR Andervont. H. B., The pathogenicity of two strains of herpetic virus for mice. J. mfect. Dis. (1929) 45; 366. Andervont. H. B., Fate of the CH3 milk influence in mice of strains C en C57 black. J. nat. Cancer Inst. (1945) 5; 383, Andervont, H, B., Relation of milk influence to mammary tumors of hybrid mice. J. nat Cancer Inst. (1945) 5; 391. Andervont, H. B.. Genetic hormonal and age factors in susceptibility and resistance to tumor inducing viruses. Tex. Rep. Biol. Med. (1957) 15; 462. Andrewes, C. H., Evidence for the presence of virus in a nonfUterable tar sarcoma of the fowl. J. Path. Bact. (1936) 43; 23. Andrewes. C. H., Ahlström. C. G. Foulds, L. and Gye, W. E., Reaction of tarred rabbits to the infectious fibroma virus. Lancet (1937) 233; 893. Andrewes, C. H.. Elford, W. J. and Niven, J. S. F.. Vaccinia and ectroinelia in the mouse. Brit. J. exp. Path. (1948) 29; 329. Bauer, A. en Constantin. Th., Multiplication du virus de Shope dans les cellules en culture étude au microscope électronique. C. R. Soc. Biol. (Paris) (1956) 150; 246. Berenblum. I. A study of the significance of cocarcinogenic action and related phenomena. Cancer. Res. (1941) 1; 807. Berenblum. I., Irritation and carcinogenesis. Arch. Path. (1944) 38; 233. Berenblum, I., A speculative review: The probable nature, of promoting action and its significance in the understanding of the mechanism of carcinogenesis. Cancer Res. (1954) 14; 471. Berenblum, I. and Shubik. P., A new quantitative approach in the study of the stages of chemical carcinogenesis in the mouse skin. Brit. J. Cancer (1947) 1; 383. Beveridge, W. I. B. and Burnet, F. M., The cultivation of viruses and rickettsiae in the chick embryo. Spec. Rep. Sen Med. Res. Counc. (Lond.) (1946) No. 256. Borrel, A., Epithélioses infectieuses et epitheliomas. Ann. Inst. Pasteur (1903) 17; 81. Borum. K.. Hair pattern and hair succession in the albino mouse. Acta Path, microbiol. Scand. (1954a) 34; 521. Borum. K.. The role of the mouse hair cycle in epidermal carcinogenesis. Acta. Path, microbiol. Scand. (1954b) 34; 542. Borum, K.. Influence of age on epidermal carcinogenesis in mice. Acta. Path. microbiol. Scand. (1957) 41; 287. Boyd. W., A text-book of Pathology. London Henry Kempton 1938. Buddingh. G. J.. Infection of the chorioaUantois of the chick embryo as a diagnostic test for variola. Amer. 3. Hyg. (1938) 28; 130. Burnet. F. M., Vaccinia haemag^utinin. Nature (Lond.) (1946) 158; 119. Burnet. F. M. and Lush, D.. The propagation of the virus of infectious ectromelia of mice in the developing egg. J. Path. Bact. (1936) 43; 105. Carr, J. G.. An unexplained discrepancy between the actual and expected yield of virus from avian tumors and its implications. Proc. roy. Soc. Edinb. B. (1948) 62; 243. Constantin. Th., et Febvre. H.. Les corps d'inclusion observés dans les cultiffes de tissus infectées par le virus du fibrome de Shope du Lapin. C.R. Soc. Biol. (Paris) (1956) 150; 114.

80

Constantin. Th., Febvré, H. et Harel, J., Cycle de multiplication du virus du fibrome de Shope in vitro (Souche O.A.). C.R. Soc. Biol. (Paris) (1956) 150; 347. Daldorf. D. and Gifford. R., Recognition of mouse ectromelia. Proc. Soc. exp. Biol. (N.Y.) (1955) 88; 290. Daneel. R., Grund problème der Krebsforschung. Z. Krebsforsch. (1953) 59; 167. Deelman, H. T., Die Entstehung des experimentellen Teerkrebses und die Bedeutung der ZeUen regeneration. Z. Krebsforsch. (1924) 21; 220. Dingle, J. H., Infectious diseases of mice Philadelphia Blakiston (1941) 434. Dosch, F. und Moritsch. H., Virologische Untersuchungen im Zusammenhang mit einer Laboratoriums Infektion durch Kuhpockenvirus. Z.bl. Bakt. (1956) 1 Abt. Orig. 166; 517. Downie, A. W. and Mc. Gau^ey, C. A., The cultivation of the virus of infectious ectromelia with observation on the formation of inclusion bodies in vitro. J. Path. Bact. (1935) 40; 147. Downie. A. W. and Dumbell, K. R.. The isolation and cultivation of variola virus on the chorioaUantois of chick embryos. J. Path. Bact. (1947) 59; 189. Downie, A. W. and Mc. Donald, A.. A study of the pox viruses by complement fixation and inhibition of complement fixation methods. J. Path. Bact. (1950) 62; 389. Duran-Reynals, F.. Studies on the combined effects of fowl pox virus and methylchoïanthrene in chickens. Ann. N.Y. Acad. Sei. (1952) 54; 977. Duran-Reynals, F.. Realities and hypothesis of viral infection as a cause of cancer. Rev. canad. Biol. (1956) 14; 411. Duran-Reynals, F., Studies on the combined effects of chemical carcinogens, hormones and virus infection. Tex. Rep. Biol. Med. (1957) 15; 754. Duran-Reynals. F., Preliminary studies on the development of neoplasia in the skin of mice, painted with metbylcholanthrene and injected with cortisone and vaccine virus. Ann. N.Y. Acad. Sei. (1957) 68; 430. Edlinger, E., Harel, J., Harel, L., Présence d'un antigene „soluble" dans les tumeurs malignes provoquées par le virus fibromateux de Shope chez le lapereau. CR. Soc. Biol. (Paris) (1956) 150; 252. Fenner, F.. The epizootic behaviour of mouse pox (infectious ectromelia). Brit. J. exp. Path. (1948) 29; 69. Fisher, J. C. and HoUomon, J. H.. A hypothesis for the origin of cancer foci. Cancer (1951) 4; 916. Fisher, W. O., A contribution to the virus theory of cancer. S. Afr. med. J. (1956) 30; 1058. Foulds, L., Observations on non-fUterable fowl tumours (The production of Neutralizing sera against fUtrates of Rous sarcome I by non-infective extracts of a sarcoma induced by 1 : 2 : 5 : 6 dibenzanthracene). Amer. J. Cancer (1937) 31; 404. Foulds, L., The histological analysis of tumours. A critical review. Amer. J. Cancer (1940) 39; 1. Foulds, L.. The experimental study of tumor progression: a review. Cancer Res. (1954) 14; 327. Friedewald, W. F. and Rous, P., The initiating and promoting elements in tumor production. An analysis of the effects of tar, benzpyrene and metbylcholanthrene on rabbit skin. J. exp. Med. (1944) 80; 101. Friedewald, W. F. and Rous, P., The determining influence of tar, benzpyrene and metbylcholanthrene on the character of benign tumour induced therewith in rabbit skin. J. exp. Med. (1944) 80; 126. Mc. Gaughey, C. A. and Whitehead, R.. Outbreaks of infectious ectromelia in laboratory and wUd mice. J. Path. Bact. (1933) 37; 253.

81

Gispen, R.. SUver impregnation of smallpox elementary bodies after treatment with xylol. Antonie Leeuwenhoek (1952) 18; 107. Glücksmann, A., The histogenesis of benzpyrene — induced epidermal tumors in the mouse. Cancer, Res. (1945) 5; 385. Greenwood. M.. Bradford HUl. A.. Topley W. W. C. and Wilson, J. A study of the experimental epidemiology of ectromelia infection. Spec. Rep. Ser. med. Res. Counc. (Lond.) (1936) No. 209. Gye, W. E., The aetiology of malignant new growth. Lancet (1925) 209; 109. Gye, W. E. and Andrewes, C. H.. A study of the Rous fowl sarcoma No. I. I filterability. Brit. J. exp. Path. (1926) 7; 81. Harel, J., Titration et étude du cycle de multîpUcation in vivo du virus fibromateux de Shope dans les tumeurs maUgnes du lapereau. C.R. Soc. Biol. (Paris) (1956) 150; 139. Harel, J., Rôle de la résistance natureUe dans l'évolution des tumeurs provoquées par le virus fibromateux de Shope (Souche O.A.) chez le lapereau. Action de la cortisone. Transmission à la progéniture de l'immunité acquise par la mère. C R . Soc. Biol. (Paris) (1956) 150; 351. HartweU. L L.. Survey of compounds which have been tested for carcinogenic activity 2nd ed. U.S. Public Health Service Publ. (1951) No. 149. Helman, J.. Vaccinia as a possible carcinogen. Lancet (1957) 1; 51. HerrUch. A., Probleme der Pocken und Pockenschutz impfung. Munch, med. Wschr. (1954) 96/118; 529. Hieger, I., One in six. An outline of the cancer problem. London. Allan Wingate (1955). Huxley, J., Cancer biology I: comparative and genetic. Biol. Rev. (1956) 31; 474. Huxley, I., Cancer biology II: viral and epigenetic. Biol. Rev. (1957) 32; 1. Koch. R., 1st der Krebs eine Viruskrankheit. Z.Geburtsh. Gyimk. (1953) 139/2; 129. Koprowska, I. and Koprowski. H.. Enhancement of susceptibility to virus infection in the course of a neoplastic process. Ann. N.Y., Acad. Sei. (1957) 68; 404. Krüskal, W. H. and WaUis. W. A.. Use of ranks in one-criterion variance analysis. J. Am. Stat Ass. (1952) 47; 584. Law, L. W.. Present status of non-viral factors in the etiology of reticular neoplasms of the mouse. Ann. N.Y.. Acad. Sei. (1957) 68; 616. Leitch, A., Observations on the effect of cessation of the irritant on the development of experimental tar cancer. Brit. med. J. (1922); 1101. Mackenzie. I., and Rous, P., The experimental disclosure of latent neoplastic changes in tarred skin. J. exp. Med. (1941) 73; 391. Marchal, J.. Infectious ectromelia. A hitherto undescribed virus disease of mice. J. Path. Bact. (1930) 33; 713. Melnick, J. L. and Gaylord, W. H. Jr.. Problems with spontaneous ectromelia (Mouse-pox) in a virus laboratory. Proc. Soc. exp. Biol. (N.Y.) (1953) 83; 315. Moore, A. E.. Viruses with oncolytic properties and their adaption to tumors. Ann. N.Y. Acad. Sei. (1952) 54; 945. Moore, A. E., Latency of Induced virus infections. Ann. N.Y. Acad. Sei. (1957) 68; 394. Moore. A. E., Oncolytic properties of viruses. Tex. Rep. Biol. Med. (1957) 15; 588. Moritsch, H., Experimentelle Untersuchungen über die Vermehrung des Vacciniaund des Kuhpokken virus in der Maus. Zbl. Bakt. (1956) 1 Abt. Orig. 166; 427. Mottram, J. C . On the origin of tar tumours in mice whether from single ceUs or many ceUs. J. Path. Bact. (1935) 40; 407. Nordling. C O., A new theory of the cancer-inducing mechanism. Brit. J. Cancer (1953) 7; 68. Oberling, Ch.. Cancer et virus. Rev. Prat. (1953) 3; 1675.

82

Oberling, Cb., Développement recent de la conception virusale du cancer, Oncologia (Basel) (1954) 7; 178. Paschen. E., Züchtung des Ektiomelievirus auf der chorionallantois-Membran von Hühner embryonen. Zbl. Bakt. (1935/36) 1 Abt. Orig. 135; 445. Peacock, P, R., Production of tumours in the fowl by carcino^nic agents. 1) tar, 2) 1 : 2 : 5 : 6 dibenzanthracene-lard. J. Path. Bact (1933) 63; 141. PentimaUi, F., Neue Untersuchungen über das Vorhanden sein des Sarkomagens im Blut von Hühnersarkom. Z. Krebsforsch. (1934) 40; 166. Pollard, M., Bussel. R.. and Snyder, C. C . The effect of viruses on human neoplasms in tissue cultures. Tex. Rep. Biol. Med. (1954) 12/2; 336. Pollard. M., and Snyder, C. C , Treatment of a human cancer case with viruses. Tex. Rep. Biol. Med. (1954) 12/2; 341. Rous, P., A sarcoma of the fowl, transmissible by an agent separable from the tumor cells. J. exp. Med. (1911) 13; 397. Rous. P. and Beard, J. W., The progression to carcinoma of virus-induced rabbit papUlomas (Shope). J. exp. Med. (1935) 62; 523. Rous. P. and Kidd, J. G.. A comparison of virus-induced rabbit tumors with the tumors of unknown cause elicited by tarring. J. exp. Med. (1938) 69; 399. Rous. P. and Kidd. J. G., Conditional neoplasms and subthreshold neoplastic states. A study of the tar tumors of rabbits. J. exp. Med. (1941) 73; 365. Rüssel. B. R. G.. Sarcoma development occuring during the propagation of a haemorrhagic adeno-carcinoma of the mamma of the mouse. J. Path. Bact. (1910) 14; 344. Russo. G. and Terranova, T.. Induction of tumours via intra venous inoculation and the effect of sex hormones. BoU. Soc. Nat. Pat. (Torino) (1953) 3 / ; 47. Schmidt. F„ XJber die Virus theorie. Induktions theorie der Krebsentstehung. Theodor Steinkopff Dresden und Leipzig. (1953). Seelig, M. G. and Cooper. Z. K., A review of the recent literature of tar cancer (1927—1931 inclusive). Amer. J. Cancer (1933) 17; 589. Shope, R. E.. Infectious ectromelia of mice (mouse-pox). J. Lab. Clin. Med. (1954) 44; 333. ShubUc. P., Baserga, R. and Ritchie, A. C , The life and progression of individual skin tumours in Mice. Brit J. Cancer (1953) 7; 342. Shwartzman, G., Enhancing effect of cortisone upon poliomyelitis infection (strain MEFl) in hamsters and mice. Proc. Soc. exp. Biol. (N.Y.) (1950) 75; 835. Shwartzman, G. and Fisher. A., Alternation of experimental poUomyelitis infection in the Syrien hamster with the aid of cortisone. J. exp. Med. (1952) 95; 347. Siegel. S. Nonparametric Statistics. 1956. Sigiura. K.. Experimental production of carcinoma in mice with cigarette smoke tar. Gann. (1956) 47; 243. Stern, K. and Davidsohn, I., Effects of estrogen and cortisone on immune hemo antibodies in mice of inbred strains. J. Immunol. (1955) 74; 479. Stewart, H. L., Multiple views on the causation of cancer. Bull, N.Y. Acad. Med. (1955) 31; 726. Sturm, E. and Murphy. J. B., Further observations on an experimentally produced sarcoma of the chicken. J. exp. Med. (1928). 47; 493. Tongeren, H. A. E., van. Spontane mutatie van koepokken virus door middel van eipassage. T. Diergeneesk. (1952) 77; 731. Tongeren. H. A. E.. van, Spontaneous mutation of cowpox by means of eggpassage. Archiv. Vmisforsch. (1954) 5; 35. Trentin, J. L, An outbreak of mouse-pox (infectious ectromelia) in the united states. I presumptive diagnosis. Science (1953) 117; 226.

83

Trentin, J. J. and Briody, B. A., An outbreak of mouse-pox (infectious-ectromelia) in the United States. II definitive diagnosis. Science (1953) 117; 227. Verlinde. J. D. and Winsser, J., Activation of inapparent infection with ectromelia and pneumonia virus in mice. Antonie v. Leeuwenhoek (1949) 15. Verschuer, O. von tmd Kobe. E., Die Frage der erblichen Disposition zum Krebs. Ergebnis einer Forschung durch 20 Jahre an eine auslese freien ZwUlingsserie. A. B. H. Math. N a t Klasse (1946) 4. Walker. H. M. and Lev. J.. Statistical Inference, 1953. Wolff, !.. Die Lehre von der Krebskrankheit von der Altesten Zeiten bis zur Gegenwart. Jena Verlag Gustav Fischer 1907. Wolman, M.. The nature of viral inclusion bodies and their differentiation from non viral inclusions. Experentia (Basel) (1955) 11; 22. Wijler, R. and Tongeren, H. A. E., van. Reaction of the chorioaUantois membrane of the developing chick embryo to inoculation with various sterile solutions, dispersion media suspensions and some antibiotics. J. Path. Bact (1957) 74; 275. Yamagiwa, U. und Ichikawa. K.. ExperimenteUe studie über die Pathogenese der EpitheUal geschwülste. Mitt. med. Fak. (Tokio) (1916) 15; 295. Zeldenrust, J., Hypophyse voorkwabhormonen en het ontstaan van het experimentele teercarcinoom. Proefschrift Groningen 1934. Zilber, L. A.. Aetiology and pathogenesis of cancer in the Ught of virological and immunological experiments. Klin. Med. (Wien) (1954) 32/3; 9.

DRUK: N . V . V.H. BATIBUEE & TERFSTRA — LEIDEM

84