PEPTIDY A BÍLKOVINY
• •
Obsah Peptidová vazba Peptidy
• Terminologie peptidů • Charakteristikapeptidů • Přírodní peptidy
• Proteiny
• Klasifikace proteinů • Struktury proteinů
• Stanovení sekvence aminokyselin • Syntéza peptidů
Vznik peptidů • Peptidová vazba – vazba mezi karboxylem jedné aminokyseliny a a aminoskupinou další aminokyseliny
1. aminokyselina
2. aminokyselina
peptidová vazba
Peptidová vazba • kovalentní chemická vazba
• obsahuje seskupení atomů –CO–NH–
• typická např. pro proteiny a polypeptidy
• vzniká kondenzací jednotlivých aminokyselin
• kondenzace hydroxylové a primární aminové skupiny
Vlastnosti peptidové vazby • Délka vazby cca 1,32 Å – kratší než typická jednoduchá vazba (1,49 Å); delší než dvojná vazba (1,27 Å) (ze 40 % charakter dvojné vazby) (Hodnota jednoho Ångströmu je rovna 0,1 nm neboli 10-10 m.)
• N částečně pozitivní; O částečně negativní • 6 atomů ve vazbě – planární charakter • Obvykle trans konformace
Dvojná vazba mezi C a O umožňuje volnou rotaci okolo C-N vazby
• Peptidové vazby leží v rovině. • Vedlejší řetězce R (zelené) směřují nad nebo pod roviny peptidových vazeb.
Není možná rotace okolo C-N vazby, příliš velký náboj na O a N O
N
Správná elektronová hustota, udržuje amidovou skupinu planární
H
R
H
Ca
N C
C Ca H R
O
Stereochemie peptidové vazby
Trans
Cis O
• Ca sousedících aminoacylů v poloze trans , ta vysoce převažuje nad cis • Forma cis je stericky nevýhodná
H
H R
1.00 A
Ca N
1. 51 A
2A 1.3
O
1.4 5
C
A
Ca
C 1.24 A
H
N
R
• Prolin v peptidové vazbě může existovat v obou formách – cis i trans.
• Obě jsou prostorově shodně nevýhodné
Trans
Cis
Rotační (torzní, dihedrální = úhly mezi rovinami) úhly kolem vazeb v polypeptidu H N H
R C
C O
H
O
N
C
C H
R
H N H
R C
C O
(fí) je torzní úhel kolem vazby mez dusíkem a a-uhlíkem (psí) je torzní úhel mezi a-uhlíkem a uhlíkem karbonyl
Hodnoty dihedrálních úhlů jsou omezeny sterickými poměry v okolí.
Terminologie peptidů – dle počtu AK • Oligopeptidy jsou peptidy s molekulou složenou ze dvou až 10 molekul aminokyselin
dipeptidy → tripeptidy → tetrapeptidy…
• Polypeptidy – 11 – 100 AK • Proteiny – tvořeny 1 nebo více polypeptidickými řetězci • homoprotein – stejné polypeptidické řetězce • heteroprotein – různé polypeptidické řetězce hranice polypeptid / protein není ostrá (~ 50 AMK)
•
dříve platilo: do počtu 50 aminokyselin se jedná o peptid, při vyšším počtu pak o bílkovinu.
•
v současnosti je posuzována poměrná molekulová hmotnost (Mr), kdy do hodnoty Mr=10 000 jde o peptid, nad tuto hodnotu bílkovinu. To odpovídá zhruba 100 aminokyselinám.
Charakterizace peptidů • Molekulová hmotnost Mr se v biochemii udává se v jednotkách označených jako dalton = zkratka Da (zkratka jména Dalton - po Johnu Daltonovi)
• Jednotka molekulové hmotnosti, jedna dvanáctina atomové hmotnosti uhlíku 12C, 1 Da = 1,66.10-27 kg
• Voda tedy má molekulovou hmotnost 18 Da (molární hmotnost 18 g/mol a relativní molekulovou hmotnost 18)
• Jednotka Da (často se užívají násobky kDa, kilodalton); nezapadá do systému jednotek SI, ale je běžně používána pro vyjádření molekulové hmotnosti biomakromolekul
• peptidy do Mr = 10 000 (resp 10 kDa) • proteiny 1 000 až 220 000 daltonů (resp. 10 kDa až 220 kDa)
Charakteristika peptidů Počet a druh AK • určuje základní vlastnosti: velikost, polaritu, náboje - pI Pořadí aminoacylů • určuje sekvenci, primární strukturu • determinuje finální vlastnosti Směr sekvence • od N k C konci • koncová skupina může být derivatizována (N-acyl, amid, ester) Názvosloví peptidů • acylační – od N konce AGK = alanylglycyllysin Amino – • triviální – např. insulin terminální reziduum
Karboxyl – terminální reziduum
Přírodní peptidy Zvláštnosti struktury přírodních peptidů:
•
V peptidech mohou být i neproteinogenní aminokyseliny, AK s konfigurací D
•
Peptidy mohou být lineární nebo cyklické (cyklopeptidy - laktamy, disulfidové vazby)
•
Isopetidové vazby (např. g-karboxyl Glu)
•
Větvené struktury
•
Blokování koncových aminokyselin (pyroglutamát, glycinamid)
Přírodní peptidy Dipeptidy
• Karnosin:
b-Ala-His (běžně se vyskytuje v lidském těle a to zejména v kosterních svalech, srdci, mozečku a velkém mozku největší koncentrace), antioxidant?
• Anserin: N-metylkarnosin (N-methylovaná forma karnosinu, látka obsažená ve svalových buňkách ptáků a ryb, lat. anser husa)
• Aspartam: dipeptid složený ze dvou aminokyselin (L-asparagové a L-fenylalaninu); nejznámější z umělých náhradních sladidel, asi 200krát sladší než sacharóza Tripeptidy
• Glutathion (GSH): g-Glu-CysGly (kofaktor oxidoreduktas a transferas)
Peptidové hormóny • Oxytocin - hormon produkovaný hypotalamem a skladovaný v neurohypofýze, vyvolává stahy děložní svaloviny
• Vasopresin - antidiuretický peptidický hormon o délce 9 AK. V nejběžnější formě má sekvenci Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-ArgGly-amid (ale vyskytuje se i forma s lysinem na pozici 8 místo argininu)
Peptidové hormóny • Inzulin - hormon produkovaný B buňkami Langerhansových ostrůvků slinivky břišní, který snižuje hladinu cukru v krvi. Skládá se ze dvou polypeptidických řetězců (A, B), které jsou spojeny disulfidickými můstky a které dohromady mají 51 aminokyselin – řetězec A obsahuje 21 aminokyselin a řetězec B 30 aminokyselin.
• Glukagon - je polypeptidický hormon produkovaný alfa buňkami slinivky břišní. Lineární polypeptid tvořený řetězcem 29 AK.
Peptidové neuromodulátory • Enkefaliny – pentapeptidy, patří mezi opioidy (látky schopné vázat se na opioidní receptor nacházející se zejména v centrálním nervovém systému a v menší míře i v trávicí soustavě), přirozeně se vyskytují v nervové soustavě obratlovců
• Endorfiny - opioidní polypeptidy, obsahující obvykle 16–31 AK. Vznikají štěpením prekurzorové bílkoviny v mozku, pankreatu, placentě
Peptidová antibiotika • Penicilin – patří mezi beta-laktamová antibiotika, bicyklická organická kyselina, v podstatě se skládá ze dvou spojených aminokyselin, cysteinu a valinu. • Gramicidin – cyklický dekapeptid izolovaný z půdní bakterie Bacillus brevis, popř. připravený synteticky; působí proti tyfu, paratyfu, úplavici a preventivně proti zánětům • Valinomicin – peptidové antibiotikum s cyklickou strukturou, se dvěma jednotkami mléčné kyseliny, dvěma jednotkami D-alfa-hydroxyisovalerové kyseliny a dvěma valinovými zbytky
Peptidové fyto- a zootoxiny • β-amanitin - jedním z toxinů obsažených v muchomůrce zelené a příbuzné muchomůrce bílé, bicyklický oktapeptid, obsahující několik netypických aminokyselin • Falloidin - hepatotoxický cyklický heptapeptidický alkaloid, patřící do skupiny falotoxinů, obsažen v některých jedovatých druzích hub rodu muchomůrka (Amanita)
• Mikrocystiny - toxiny sinic (součást vodního květu) jsou toxické pro jaterní tkáň, cyklické heptapeptidy, hepatotoxiny, identifikováno přibližně 60 různých mikrocystinů • Neurotoxiny hadů štírů a včel
Proteiny • Proteiny z řeckého proteos (prvotní, nejpodstatnější), bílkoviny • Proteiny jsou univerzální makromolekuly živých systémů mající klíčové funkce v téměř všech biologických procesech.
Klíčové vlastnosti proteinů: • Proteiny jsou lineární polymery sestavené z monomerních jednotek – aminokyselin. • Proteiny obsahují řadu funkčních skupin. • Proteiny mohou reagovat spolu vzájemně nebo s jinými biologickými makromolekulami za tvorby vyšších komplexních celků. • Některé proteiny jsou silně rigidní, zatímco jiné vykazují omezenou flexibilitu.
Klasifikace proteinů 1. podle lokalizace v organismu • intracelulární • extracelulární 2. podle funkce • strukturní • biologicky aktivní 3. podle tvaru molekuly • globulární • fibrilární 4. podle chemického složení • jednoduché • složené
Klasifikace proteinů podle funkce • Obecné funkce proteinů: zdroj energie a dusíku, účinné ústoje (krev, cytosol), významný příspěvek k udržení osmotického tlaku vně i uvnitř buněk. • Specifické funkce proteinů Typ proteinu
Příklad
Výskyt a funkce
Katalytické (enzymy)
Trypsin
Hydrolýza peptidové vazby
Regulační (hormony)
Insulin
Stimulace metabolismu glukosy
Ochranné
Protilátky
Vazba na cizorodé látky
Skladovací
Kasein
Mléčný protein
Transportní
Hemoglobin
Transport O2 a CO2 krví (Polární prostředí – přenos nepolárních látek – Hb Nepolární prostředí – membrány – přenos polárních látek)
Strukturní
Kolagen
Vláknité pojivové tkáně, zejména fibrilární, ale i globulární
Kontraktilní
Myosin, aktin
Svalová vlákna
Genetické funkční
Histony
Asociace s DNA (chromosomy), organisace sbalování DNA,řídí transkripci
Toxické
Ricin
Toxický protein z Ricinus communis (skočec obecný)
Klasifikace proteinů podle chemické složení
• Jednoduché – pouze polypeptidový řetězec • Složené - polypeptidová část + neproteinová část • Apoprotein - bílkovinná součást – základ • Prostetická skupina – nebílkovinná součást – pevně (většinou kovalentně) vázaná Název
Charakteristika
Metaloproteiny
obsahující kovový iont (patří sem i hemoproteiny)
Fosfoproteiny Glykoproteiny
obsahující fosfáty obsahující sacharidovou složku
Lipoproteiny
obsahující lipidovou složku
Nukleoproteiny
obsahující nukleové kyseliny
Postranslační modifikace proteinů
• Glykosylace – především extracelulární proteiny, nezbytné pro správné sbalení bílkovin v endoplasmatickém retikulu, g
• g-karboxylace (glu)– modifikace glutamátových zbytků, př. faktory krevního srážení
• Fosforylace (ser, tyr, asp, his)– ústřední
mechanismus řízení látkové
výměny
• Acetylace (lys) - mechanismus řízení genové aktivity, koenzymy, kofaktory (biotin, kyselina listová)
• Hydroxylace (lys, pro), stabilitafibril • Prenylace – vazba –SH skupiny s isoprenoidy fanesol, gernylgereranol zakotvení proteinů v membráně
Postranslační modifikace proteinů
Klasifikace proteinů podle tvaru • Globulární – tvar koule, obvykle ve vodě rozpustné • Fibrilární – ve tvaru vláken, ve vodě nerozpustné • Membránové – součást biologických membrán
Kolagen (fibrilární)
Myoglobin (globulární)
Bakteriorhodopsin (membránový)
Hierarchie struktur Primární • Sekvence aminoacylů – kolik a jak seřazeny (čte se od N konce) • Homologie bílkovin Sekundární • Uspořádání – vztah sousedních monomerů
Terciární • Tvar molekuly v prostoru, uspořádání řetězce jako tělesa Kvarterní • Agregační stav funkční jednotky, nadmolekulární úroveň
Primární struktura • Primární strukturou peptidů rozumíme pořadí aminokyselin v peptidovém řetězci.
• Čteme od N – konce
•
Typ AK
•
Počet AK
•
Sekvence AK
Sekundární struktura • Úseky polypeptidového řetězce s definovanou konformací stabilizované vodíkovými můstky
• Řetězec není lineární
• Atomy C a N peptidové vazby – sp2 – planární • C2 (Ca) – sp3 - tetraedr
Sekundární struktura •
Znázornění vzájemného vztahu rovin dvou sousedních peptidických vazeb v tripeptidu
•
Roviny peptidových vazeb otočné kolem vazeb Ca–NH a Ca - CO
Sekundární struktura - formy Pravidelné (typické hodnoty a )
• helikální struktury – pravotočivá a-šroubovice – helix (-56, -47) • b-skládaný list – paralelní (-139, +135) – antiparalelní (-119, +113) Ohybové
• b-ohyb Nepravidelné
a-helix
• Struktura popsaná jako první, proto označení a • Pauling Linus (Kalifornie) a Corey Robert (UK) postulovali v roce
1951 dvě periodické struktury a-helix a b-skládaný list. • Je kompaktnější než b-skládaný list - Ca-Ca je 1,5 Å, u b-listu je 3,5 Å - 3,6 AK/závit, výška závitu 0,54 mm - 13 atomů na jeden závit (a-helix 3,613) - Zbytky R vně helixu ‐ Vodíkové vazby mezi C=O a NH o 4 AK vzdálené ‐ Souběžné s osou helixu, ne rovnoběžné ‐ = - 57o; v rozmezí – 45o až - 50o ‐ Při pohledu shora na šroubovici je směr vinutí shodný se směrem chodu hodinových ručiček – a-helix pravotočivá • Existence jiných typů helikální struktury
Existence jiných typů helikální struktury
• a-helix (3,613) • 310 helix (vyskytuje se jako spoj o jedné otáčce mezi koncem ahelixu a další částí polypeptidového řetězce
Modely a-helix struktury A) Stužkové znázornění s a-uhlíky a vedlejšími skupinami AK. B) Boční kuličkový model znázorňuje vodíkové vazby. C) Pohled shora. D) Kalotový model.
Vodíkové vazby v a-helixu.
•
Skupina CO n-té aminokyseliny tvoří vodíkovou vazbu s NH skupinou aminokyseliny n + 4. Vodíkový můstek s optimální vzdáleností 0,28 nm.
•
Ri
N H
• •
H C
C O
H N
O C
C
Ri+1
H
Ri+2
N H
H C
C O
H N
O C
C
Ri+3
H
Ri+4
N H
H C
C O
H N Ri+5
O C
C H
Průměrná délka 11 AK zbytků = 3 obrátky helixu, délka 1,7 nm Existence i delších – např. 53 AK
b-skládaný list
• Vodíkové vazby mezi (anti)paralelními úseky nebo sousedními peptidy
• Volnější struktura než a-helix • Vzdálenost mezi sousedními aminokyselinami je 3,5 Å, zatímco u helixu jen 1,5Å.
• Vedlejší řetězce sousedních aminokyselin směřují na opačné strany.
b-skládaný list Beta list je tvořen spojením dvou nebo více beta řetězců vodíkovými vazbami. Sousední řetězce mohou jít proti sobě – antiparalelní, nebo souběžně – paralelní. Antiparalelní: jsou NH a CO skupiny každé aminokyseliny spojeny vodíkovou vazbou s CO a NH skupinami partnerského řetězce přímo. Jsou stabilnější.
Paralelní: vazba NH skupiny aminokyseliny jednoho řetězce na CO skupinu aminokyseliny sousedního řetězce je posunuta. Paralelní skládané listy s méně než 5 vlákny jsou vzácné, méně stabilní
b-skládaný list
V globulárních proteinech • 2-15 polypeptidových vláken (průměrně 6) šířka – 2,5 nm
• polypeptid ve struktuře maximálně 15 AK (průměr 6 AK, tj. délka 2,1 nm
b-ohyb, vlásenka • Tvoří 4 AK • Stabilizace vodíkovou vazbou: CO skupina i-té aminokyseliny vázána vodíkovou vazbou s aminokyselinou i + 3. • Zdeformovaný 310 helix • Nazývají se také omega smyčka. • Výhodný u glycinu a prolinu • Proteiny s více než 60AK obsahují 1více smyček s 6-16 AK (tzv. omega smyčky • Umístněny na povrchu proteinu • Možná rozpoznávací funkce proteinu
Schematický model a-helix a b-listu
• Pravotočivý zkrut skládaného listu • Důležité stavební rysy globulárních proteinů, často tvoří jejich centrální část
Homopolypeptidy Polyprolin
• netvoří běžnou sekundární strukturu – sterické zábrany cyklických pyrrolidinových zbytků
• precipituje ve formě helixu 3 AK na otáčku výška závitu 0,94 nm (protáhlá struktura) Polyglycin
• precipituje ve formě helixu (podoba polyprolinu • šroubovice může být pravo i levotočivá Polyprolin i polyglycin jsou základním strukturním motivem kolagenu
Predikce sekundární struktury
• •
Primární struktura ovlivňuje sekundární Preference struktur v úsecích s převahou aminoacylů
Srovnání zjištěných struktur s předpovězenými
Terciární struktura • Popisuje uspořádání jednotlivých sekundárních struktur a neuspořádaných úseků v prostoru Vodíková
• Stabilizace struktury tvorbou ‐ Kovalentní vazby (disulfidické můstky) ‐ Iontové interakce ‐ Dipolové interakce ‐ Vodíkové můstky ‐ Hydrofobní interakce •
Strukturní motivy – domény – moduly
•
Flexibilita struktury – vývojově preferovaná
Iontové interakce
Disulfidická Hydrofóbní Hydrofobní interakce
Uspořádání úseků sekundárních struktur Strukturní motivy
• b-a-b motiv (TIM – 8x) • řecký klíč • b-meandr • další struktury • domény – funkční jednotky
Stabilizace terciární struktury Účast kovalentních disulfidových vazeb na formování terciární struktury - RNasa
ribonukleasa
Typy terciární struktury • fibrilární (vláknitý tvar) - „skleroproteiny“ převládá jedna sekundární struktura; př. a-keratin, b-keratin • globulární (kulovitý tvar) - „sferoproteiny“ rovnoměrné zastoupení obou sekundárních struktur • membránové
Orientace zbytků AK
• Vodné prostředí - polární ven – hydrofobní dovnitř
• Orientace zbytků AK u membránových proteinů je opačná
Myoglobin pouze a-helix propojené neuspořádanými úseky
Konkavalin - pouze b-struktury
Karbonátdehydratasa 27 % a-helix, 23 % b-struktury
Terciární struktura – strukturní domény
• Relativně samostatné kompaktní globulární oblasti • Odděleny obvykle neuspořádaným úsekem • Flexibilita struktury • Často charakteristické supersekundární struktury • Často nositeli specifických vlastností – funkcí v rámci proteinu • Domény lehkých a těžkých řetězců imunoglobulinů
funkce vychází z prostorové struktury a
ZÁVISÍ NA AMINOKYSELINOVÉM SLOŽENÍ funkční domény
Kvartérní struktura Tvoří 2 nebo více asociovaných samostatných polypetidových řetězců (podjednotek) Agregát z více samostatných řetězců
• Podjednotky stejné – homo • Různé – hetero Smysl agregace
• Organizační – multienzymové systémy
• Regulační - kooperativita • Stabilizační
Kvartérní struktura Podjednotky vázány
• kovalentně – Ig • nekovalentně – Hb
Chování bílkovin in vitro Bílkovina v roztoku
• •
Solvatační obal, interakce s prostředím (voda, ionty - pH)
Ovlivnění rozpustnosti – srážecí metody
Denaturace
• • •
Změna (terciární) struktury, rušení nativních interakcí Reverzibilní – denaturace není vhodné označení
Ireverzibilní – denaturace v pravém slova smyslu
‐ fyzikální faktory - T, záření, tlak – mechanické vlivy ‐ chemické faktory - pH, organická rozpouštědla, detergenty, těžké kovy, močovina,
Reverzibilní děj Ireverzibilní děj – drastičtější působení (T, kyseliny apod.)
Metody studia bílkovin - izolace Izolace – metody více či méně komplikované podle účelu
• čisté nativní bílkoviny pro studium vlastností event. farmakologii,
• hrubé isolace pro průmysl apod Podle potřeby a účelu
• isolace do potřebné čistoty • studium in situ Studium
• struktury – molekulární vlastnosti • funkce – (katalytické aj. vlastnosti) Isolační postupy – separační metody
Obecné kroky při izolaci bílkovin bílkovin Izolace – přehled metod
• desintegrace materiálu • preparativní centrifugace • srážecí metody, jsou založeny na změně rozpustnosti
• membránové separace • chromatografie • (preparativní elektromigrační metody – elektroforéza)
• krystalisace
Analytické postupy – včetně metod separačních
• elektroforéza a chromatografie v analytickém měřítku,
• spektrální metody -absorpční -NMR -rentgenostrukturní analýza,
• MS – moderní metoda umožňující i štěpení řetězce
• další speciální metody
Určení primární struktury Analýza aminokyselinového složení.
• Bílkovina se hydrolyzuje totálně (silně kyselé či zásadité prostředí, zatavená ampule, autokláv)
• Směs aminokyselin se analyzuje standartními metodami iontoměničovou chromatografií (analytické provedení) nověji hydrofobní chromatografie nebo kapilární zonová elektroforéza.
• Kvantitativní analýza • Derivatizace činidlem poskytujícím barevný či fluoreskující • Téměř univerzální – ninhydrinová reakce – modrofialové zbarvení se všemi aminokyselinami s výjimkou Pro (a Hypro), kdy vzniká žluté zbarvení.
• Další způsoby derivatizace (dansylace, fluorescamin aj.)
Ninhydrinová reakce
Schéma ninhydrinové reakce obecně
Ninhydrinová reakce
* Ninhydrinová reakce s prolinem, λ = 440 nm
Iontoměničová chromatografie aminokyselin
Eluční profil aminokyselin Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení
Stanovení primární struktury – sekvence peptidů (sekvencování) Frederick Sanger
• britský biochemik • dvojnásobný nositele Nobelovy ceny – z roku 1958 za určení struktury inzulínu a z roku 1980 za metodu zjišťování struktury bílkovin, nukleových kyselin a virů
• jako první v roce 1953 osekvenoval dva řetězce inzulinu
Dvě cesty sekvencování
• •
Reálná AK sekvence Sekvence odpovídající genové DNA
Proč sekvencujeme peptidy a proteiny ? 1. Sekvence se porovnává se známými sekvencemi. Z analogie je možné usoudit např. na katalytický mechanismus enzymu nebo příslušnost nově získaného peptidu do určité rodiny peptidů. 2. Srovnávají se sekvence stejného polypeptidu z různých zdrojů a sleduje se evoluční mapa. 3. Sekvenční data se využívají jako podklad k syntéze protilátek a peptidů nebo proteinů s významným účinkem. 4. Aminokyselinová sekvence je podstatná pro tvorbu DNA sond specifických pro geny kódující odpovídající proteiny. 5. Mnohé proteiny obsahují signální aminokyselinové sekvence sloužící k ke kontrole určitého procesu. Sekvence mohou např. obsahovat signál pro umístění proteinu.
Stanovení primární struktury – sekvence peptidů (sekvencování) Taktika sekvencování (lineární peptidy):
• Určení počtu podjednotek • Oddělení řetězců – např. odstranění disulfidových vazeb
• Stanovení N- a C- terminálních residuí • Štěpení peptidů chemickými a enzymovými metodami na kratší řetězce a jejich rozdělení
• Vlastní sekvencování • Rekonstrukce peptidu z přesahujících fragmentů • Lokalizace pozice disulfidových vazeb
Protein
S S
(dva různé polypeptidové řetězce spojené disulfidovými vazbami)
+
Redukce disulfidové vazby a následné oddělení řetězců
Chemickými a enzymovými metodami se štěpí každý polypeptid na kratší peptidy
Jinými chemickými a enzymovými metodami se štěpí každý polypeptid na jiné kratší peptidy
Určí se sekvence každého peptidového fragmentu
Určí se sekvence každého peptidového fragmentu
TDI
SGE
CY
CF
FCYK
HNYCFR
KTDI
HNY
GVAGRF
RSGE
GVAGR K rekonstrukci každého polypeptidu se použijí soubory překrývajících se peptidových sekvencí GVAGRFCYKTDI
HNYCFRSGE
Opakuje se fragmentace při zachování disulfidových vazeb za účelem identifikace Cys sekvencí disulfidové vazby GVAGRFCYKTDI
S S HNYCFRSGE
Redukce disulfidové vazby mezi polypeptidovými řetězci nebo uvnitř řetězce 2-merkaptoethanolem NH NH
CH
C
H2C
CH2 O
+
S O C
2
C O
CH2 CH2
+
+
CH2 CH2
HS
SH
NH
disulfidová vazba
2-Merkaptoethanol
O
CH2
C
CH
S S CH2 CH2
CH2 CH
OH
SH
OH
S
CH
OH NH
volné SH skupiny Cysteinu
Reakcí jodacetátu s volnou SH skupinou na polypetidovém řetězci se zabrání její reoxidaci
Cys CH2 SH Cystein
+
-
I CH2 COO Jodacetamid
-
Cys CH2 S CH2 COO
S-Karboxymethylcystein (CM-Cys)
+
HI
Pro stanovení přesné pozice disulfidové vazby se používá „diagonální elektroforéza“ při které se oxiduje disulfidová vazba permravenčí kyselinou
NH NH
CH
H2C
C
S
H
CH2
C
CH
Cystin
C
O
NH
C O
SO 3
OH
+
Permravenčí kyselina
S O
H2C
O
O
CH
SO 3 O
CH2
C
CH
NH
Cysteová kyselina
ELFO po působení permravenčí kyseliny
Diagonální elektroforéza (ELFO). Po oxidaci peptidů se v druhém směru elektroforézy původní peptidy zastaví na diagonále, kdežto peptidy obsahující disulfidové vazby (jsou kyselejší) se objeví mimo diagonálu.
R CH2 SO 3
R´ CH2 SO 3
Směr první ELFO
Identifikace N- a C-terminalních residuí N-terminální analýza
• Původní Sangerova metoda – 2,4-dinitrofluorbenzenem (DNP) nebo 1 dimethylaminonaftalen-5-sulfonylchlorid (dansylchlorid) → DNP polypeptidy nebo dansylované polypeptidy, kyselou hydrolýzou se uvolní dansylovaná kyselina (rozpad peptidu)
• Edmanovy reagencie – fenylisothiokyanat
→ fenylthiohydantiony nebo PTH deriváty (možnost postupného stanovení N-koncových AK!)
C-terminální analýza
• Analýza využívající karboxypeptidasy Karboxypeptidasa A – neodštěpuje Pro, Arg, a Lys Karboxypeptidasa B - neodštěpuje Arg a Lys
Původní Sangerova metoda založená na sekvenaci polypeptidu (insulin) od N-konce 2,4-dinitrofluorbenzenem. Nevýhodou bylo, že se při stanovení jedné aminokyseliny se hydrolyzoval celý peptid. NO 2
NO 2
NO 2 NH2
+ NO 2 F
2,4-Dinitrofluorobenzen (DNFB)
R1
NH
C
H
C
O
R1 HF
C
H
C
O
DNP Polypeptid
Při použití dansyl chloridu (fluorescence) došlo k výraznému zvýšení citlivosti Sangerovy metody. Stanovuje se 1 nM.L-1 aminokyseliny. N(CH 3)2 O
R2 O
R3 O
CH C
NH CH C
NH CH C
R1
+ O
S
H2N
O
Cl
5-Dimethylamino-1-naftalensulfonylchlorid (Dansylchlorid) N(CH 3)2
HN
-
HCl
O
R2 O
R3 O
CH C
NH CH C
NH CH C
R1
O 2S
HO
Polypeptid
Dansylpolypeptid N(CH 3)2
O 2S HN
R1
H2O
+
H
R2
O
CH C
OH
+
Dansylaminokyselina (fluorescentní)
H3N
+
R3
O
CH C
OH
+
H3N
+
O
CH C
Volné aminokyseliny
OH
+
H3N
+
Edmanova metoda sekvenace peptidu od N-konce: O
R2 O
R3 O
CH C
NH CH C
NH CH C
R1 N
C
+
S
Fenylisothiokyanát (PITC)
HO
H2N
O
R2 O
R3 O
NH CH C
NH CH C
NH CH C
R1 NH
C
Polypeptid
-
S
PTC Polypeptid Bezvodá
• Polypeptid je navázán C-koncem na polymerní nosič.
F3C R1
COOH
O
HC
C
R2
HN
S CH
• Postupně se oddělují fenylthiohydantoinové (PTH) deriváty aminokyselin. • Činidlem je fenylisothiokyanát (PITC).
Derivát thiazolonu +
H R1
O C
HN
H3N
+
R3 O
CH C
NH CH C
Původní polypeptid bez N-koncové aminokyseliny
HN
HC
+
O
N C S
PTH-aminokyselina
Enzymové štěpení polypeptidů endopeptidasami • Endopeptidasy, proteinasy, jsou hydrolytické enzymy štěpící specificky určité peptidové vazby.
Trypsin štěpí na místě karboxylu Arg a Lys. Chymotrypsin štěpí na místě karboxylu hydrofobních aminokyselin Phe, Tyr a Trp.
Elastasa štěpí na místě karboxylu malých neutrálních aminokyselin Ala, Gly, Ser a Val.
• Ve všech případech se vazba neštěpí, pokud je následující aminokyselinou Pro.
• Uvedené enzymy pochází z hovězího pankreatu. • Štěpením polypeptidu různými enzymy získáme řadu peptidových fragmentů
Enzymové štěpení polypeptidového řetězce trypsinem na místě karboxylu Arg nebo Lys
Lysin
+
NH3
nebo
CH2
CH2
Arginin
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2 O NH
+
NH3
CH
C
NH
R
O
CH
C
Kterákoliv aminokyselina kromě Prolinu
H2O
Trypsin
CH2 O NH
CH
C
O
-
+
+
H3N
R
O
CH
C
Příklad chemického štěpení peptidové vazby. Bromkyan štěpí specificky na místě karboxylu Met.
H2C NH
CH
CH3
C
S
Br
CH3
N
Bromkyan
+
S
CH2
C NH
H2C NH
O
CH
-
Br CH
C
R
O
C
N
CH2 O
C NH
CH
C
R
O
CH3 S
+
H2 C
NH
C H
C N
C
N H2 C
CH2
NH
O
H2O
CH
C
R
O
C H
C
CH2 O
Peptidyl homoserinlakton
O
+ H2N
CH
C
R
O
Identifikace AK 1. Hmotnostní spektrometrie 2. Retenční časy HPLC
Vznik různých fragmentů z polypeptidu enzymovým a chemickým štěpením peptidových vazeb. V tomto příkladu (chemické štěpení peptidové vazby metodou s bromkyanem) se získalo šest překrývajících se fragmentů Fragmenty CNBr
CNBr
Phe
Trp
Met
Gly
CNBr
Ala
Lys
Leu
Trypsin
Trypsinové fragmenty
Pro
Met
Asp
Gly
Arg
Cys
Trypsin
Ala
Gln
Sestavení původního polypeptidu z fragmentů získaných enzymovou hydrolýzou Původní polypeptid Enzymová hydrolýza Trypsinové peptidy
Leu
Leu
Val
Val
Gly
His
Met
Arg
Ser
Phe
Thr
Lys
Cys
Pro
Ala
Trp
Lys
Glu
Tyr
Gly
Ile
Arg
Leu
Val
Phe
Asp
Lys
Gly
Ile
Arg
Gly
Ile
Arg
Glu
Asp
Lys
Asp
Lys
Glu
Tyr
Chymotrypsin
Chymotrypsinové peptidy Gly
Trp
Phe
Phe
Trypsin
Thr Ser
Val
Phe
Asp
Lys
Glu
Tyr
Lys
His
Met
Arg
Trp
Gly
Ile
Arg
Ser
Phe
Lys
Cys
Pro
Ala
Trp
Phe
Trp
Thr
Lys
Tyr
Ser
Leu
Phe
Thr
Lys
Cys
Pro
Cys
Pro
Ala
Ala
Trp
Trp
His
Met
Arg
Lys
Lys
Gly
Gly
His
Met
Arg
Trp
N-Leu-Val-Phe-Asp-Lys-Glu-Tyr-Gly-Ile-Arg-Ser-Phe-Thr-Lys-Cys-Pro-Ala-Trp-Lys-His-Met-Arg-Trp-Gly-C
• Využití technologie rekombinantní DNA k sekvenaci velkých proteinů. • Řetězce DNA jsou klonovány a poté sekvencovány. • Sekvence nukleotidů udávají sekvenci aminokyselin v proteinu. • Nevýhodou je, že nepostihuje posttranslační úpravy polypeptidů.
Sekvence DNA
GGG
TTC
TTG
GGA
GCA
GCA
GGA
AGC
ACT
ATG
GGC
GCA
Sekvence aminokyselin
Gly
Phe
Leu
Gly
Ala
Ala
Gly
Ser
Thr
Met
Gly
Ala
Proč syntetizovat peptidy ? 1. Syntetické peptidy slouží jako antigeny stimulující tvorbu specifických protilátek. 2. Syntetické peptidy mohou být využity k izolaci receptorů hormonů a jiných signálních molekul. Také jako afinanty při afinitní chromatografii.
3. Syntetické peptidy mohou být využity jako léky. Např. analog vasopresinu, hormonu stimulujícícm reabsorpci vody, 1-desamino8-D-argininvasopresin se odbourává pomaleji a slouží jako náhrada vasopresinu. 4. Peptidy mohou sloužit jako pomocná strukturu při studiu složitějších proteinů (třírozměrná struktura).
Taktika peptidových syntéz 1. Aktivace karboxylu 2. Chránění skupin, které nevstupují do peptidové vazby O CH3 R H C 3 zautomatizovány.
• Syntézy peptidů jsou • První AK s chráněnou H C
C
C
H C
O
skupinou C-koncem na O N se naváže C 3 H makromolekulární pryskyřici a postupně seOpřidávají na N-konec další s chráněnými skupinami .
-
• Reakcí
t-Butyloxykarbonylaminokyselina karboxylu a(t-Boc aminoskupiny aminokyselina) s
‚N, N dicyklohexylkarbodiimidem (DCC) za odštěpení vody a uvolnění N, N ‚- dicyklohexylmočoviny, se tvoří peptidová vazba. N
C
N
Dicyklohexylkarbodiimid (DCC)
H3C
CH3
O
C
C
O
R
H C
N H
C
O
-
H3C
O
t-Butyloxykarbonylaminokyselina (t-Boc aminokyselina)
• Skupiny, které nemají vstoupit do peptidové vazby se chrání činidly N
C
N
jako např. t-butyloxykarbonyl, t-Boc nebo benzyloxakarbonyl (dříve karbobenzoxy nebo
Dicyklohexylkarbodiimid karbobenzyloxy) – symbol (DCC)
skupiny se po skončení syntézy lehce odštěpují.
Z nebo Cbz. Obě
Vstup chráněné aminokyseliny (t-Boc) do peptidové vazby za účasti DCC t-butyloxykarbonylaminokyselina
chránění
t-Boc aminokyselina n-1 DCC
N, N
‚-dicyklohexylkarbodiimidem
aktivace
(DCC) H N
t-Boc
O C
C
N O
C
NH
H
R
Aktivovaná aminokyselina R
H2N
t-Boc
H N
H
n
C
C
O Polymer
O Aminokyselina n vázaná na polymer R H O n C
C
N H
C
C
O Polymer
O R H Dipeptid vázaný na polymer
+
O N H
C
N H
Dicyklohexylmočovina
Celkový postup syntézy peptidu na polymerním nosiči. Syntéza peptidů v pevné fázi – Merrifieldova metoda (SPPS). n
t-Boc N H
Polymer
H C
C
O
+
-
R
Cl
O
Chráněná aminoskupina n
Reaktivní polymer
1
Ukotvení Polymer
R
n
t-Boc N H
H C
C O
O
Polymer R
n
t-Boc
H C
N H
C
O
O
2
Odstranění chránící skupiny pomocí F3C-COOH
Polymer R
n
H2N
H C
C O
O
Polymer R
n
H C
H2N
C
O
O
3
Tvorba peptidové vazby s chráněnou aminokyselinou n-1 + DCC Polymer
O
H N
C
t-Boc R
n-1
C H
R
n
N H
H C
C O
O
Polymer O
H N
C
t-Boc
C
R
n-1 H
R
n
H C
N H
C
O
O Další odstranění chránících skupin a syntetické cykly
Odštěpení peptidu pomocí HF
4
Polymer O H2N
C R1
C H
O
H N
C R
C
n-1 H
R
n
N H
H C
C O
O
