Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha – Ruzyně

METODIKA VYUŽITÍ ELEKTROFORÉZY HLÍZOVÝCH PROTEINŮ PRO IDENTIFIKACI ODRŮD BRAMBOR (SOLANUM TUBEROSUM) Vypracovaná jako výstup projektu NAZV QF 3050: „Vývoj metod objektivní identifikace odrůd zemědělských plodin“

Autoři: Mgr. Světlana Sýkorová, CSc., Ing. Jana Bradová, Ing. Josef Fér,CSc. Říjen 2005

METODIKA VYUŽITÍ ELEKTROFORÉZY HLÍZOVÝCH PROTEINŮ PRO IDENTIFIKACI ODRŮD BRAMBOR (SOLANUM TUBEROSUM) Vypracovaná jako výstup projektu NAZV QF 3050: „Vývoj metod objektivní identifikace odrůd zemědělských plodin“

Světlana Sýkorová a kol. [email protected]

Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha 2005 http://www.vurv.cz

Text: ©2005 S. Sýkorová, J. Bradová, J. Fér Foto: ©2005 S. Sýkorová, J. Bradová Grafická úprava: ©2005 M. Sýkora, L. Štočková Vydáno bez jazykové úpravy ISBN: 80-86555-74-7

S. Sýkorová & kol. – Metodika využití elektroforézy hlízových proteinů pro identifikaci odrůd brambor

Obsah: I.

Úvod ………………………………………………………………................ 4

II.

Schéma postupu při určení odrůdy brambor pomocí hlízových proteinů …… 5

III.

Metodika elektroforézy proteinů a enzymů hlíz brambor podle Bundessortenamt (1996) – postup používaný v SRN a přijatý UPOV (přeloženo z německého originálu a modifikováno podle podmínek laboratoře VÚRV) ……………… 6

IV.

Polyakrylamidová gelová elektroforéza pro analýzu esteráz, peroxidáz a patatinů v bramborách podle Bundessortenamt (2002) – postup používaný v SRN a přijatý UPOV (přeloženo z německého originálu a modifikováno podle podmínek laboratoře VÚRV) – zahrnuje i modifikaci metody UPOV (1996) …………. 10

V.

Příklady získaných elektroforetických spekter hlízových proteinů …………. 26

VI.

Příklad postupu při odrůdové identifikaci odrůdy ze vzorků konzumních brambor ………………………………………………………………………………... 29

VII.

Použitá literatura ……………………………………………………………... 31


I. Úvod Odrůdy rostlin jsou jedním z nejvýznamnějších faktorů rozvoje zemědělství. Stále zvyšovanou výnosovou schopností, odolností k chorobám a škůdcům a zvyšovanou hodnotou pro pěstování i zpracování umožňují zemědělcům i zpracovatelům dosahovat lepších hospodářských výsledků. Ochrana práv šlechtitelů k odrůdám je v České republice zajišťována podle zákona č.132/1989 Sb., o ochraně práv k novým odrůdám rostlin a plemenům zvířat, který upravuje práva a povinnosti vznikající z vytvoření nových odrůd a z jejich obchodního využívání. Systém ochrany odrůd formulovaný tímto zákonem odpovídá principům Mezinárodní úmluvy na ochranu nových odrůd rostlin z roku 1961 podle UPOV (Union Internationale pour la Protection des Obtentios Vegetales), ve znění jejích revizí z roku 1972 a 1978 (Souček, 1997). Brambory jsou velmi důležitou a v lidské výživě nenahraditelnou plodinou a potravinou, kde význam odrůdy jako nositele kvality je nesporný. Brambory se stávají potravinou v okamžiku, kdy jsou uváděny do oběhu k přímému prodeji spotřebiteli a vztahuje se na ně ustanovení Zákona o potravinách ( Zákon č.110/97 Sb.). U konzumních brambor pozdních musí být uveden varný typ, odrůda, a při dovozu země původu. U konzumních brambor raných též barva dužniny, tvar hlíz a popř. označení “drobné” (Pivoňková, 1997). Ve světle těchto skutečností je zcela jasná nutnost identifikace, verifikace a možnosti kontroly pravosti odrůdy u brambor. Metoda identifikace odrůd založená na morfologických znacích rostlin a hlíz není příliš objektivní pro jejich závislost na podmínkách prostředí. Za nejvhodnější pro identifikaci odrůdy jsou pokládány stabilní znaky hlíz, z nichž byly již v 60.letech úspěšně využity jako genetické markery rozpustné proteiny, enzymy, případně jejich kombinace. Elektroforéza v polyakrylamidovém nebo škrobovém gelu v alkalickém i kyselém prostředí je vhodnou a účinnou metodou pro separaci těchto proteinů. Elektroforetické spektrum proteinů se neměnilo v hlízách skladovaných po několik měsíců v chladu ani v bramborách pěstovaných na různých lokalitách a v různých ročnících (Desborough,1983). V 60. a 70.letech byly intenzivně studovány možnosti identifikace odrůd brambor pomocí elektroforetických spekter proteinů a enzymů, např. Šašek (1974a,b) charakterizoval řadu československých i zahraničních odrůd brambor na základě polymorfismu proteinů po elektroforéze ve škrobovém gelu postupem (Paulik,1957). Mezi odrůdami byly zjištěny charakteristické rozdíly, avšak teplota skladování ani různé dávky gama záření neměly na bílkovinný komplex brambor podstatnější vliv. Katalog evropských odrůd brambor založený na variabilitě elektroforetických spekter proteinů a esteráz vypracovali Stegemann a Loeschcke (1977). Důležitost hlízových proteinů pro objektivní identifikaci odrůd brambor je nesporná, elektroforetická spektra těchto proteinů a enzymů jsou značně odrůdově specifická a geneticky podmíněná, nezávislá na ročníku ani lokalitě pěstování a nemění se ani po několik měsíců v dormantních hlízách skladovaných v chladu. Metody identifikace a verifikace odrůd brambor se mohou velmi vhodně uplatnit jak ve šlechtění, tak i v kontrole odrůdové pravosti ,např. při obchodování s konzumními bramborami (Sýkorová, 1999). Předkládaná metodika identifikace odrůd brambor vychází z postupů používaných k tomuto účelu v SRN a přijatých jako oficiální metody UPOV. Jedná se o dva postupy (UPOV 1996 a UPOV 2002). V řadě případů jsme ověřili a částečně modifikovali oba postupy a získané poznatky uvádíme v předkládané metodice.

I. Úvod

4


II. Schéma postupu při určení odrůdy brambor pomocí hlízových proteinů Pro konkrétní uplatnění metody elektroforézy hlízových proteinů brambor k identifikaci odrůdy, případně ke kontrole odrůdové deklarace v obchodní síti je možno použít již v praxi ověřený metodický postup (byl vypracován SZPI pro konkrétní kontrolní akci v roce 2001 a 2002). Metodický pokyn obsahoval následující části: cíl kontrolní akce, objekt kontrolní akce, termín (kdy bude uskutečněna), rozsah (počet kontrolovaných vzorků a jejich zajištění), velikost vzorku a metoda odběru, pověření laboratoře, která provede elektroforetické analýzy, postup při předávání vzorku do pověřené laboratoře, určení předpisu pro hodnocení (např. zjištění právní kvalifikace klamavého označení odrůdy, vzorec pro rozhodovací kriterium, zda vzorek vyhovuje nebo nevyhovuje, způsob předávání výsledku zadavateli (formulář protokolu o analýze), využití výsledků analýz (sankce, aj.). Dále uvádíme schéma konkrétního postupu. Do laboratoře byly denně inspektory SZPI dodány 4 vzorky po 15 hlízách s předávacími protokoly. Všechny vzorky měly odrůdovou deklaraci. Hlízy byly jednotlivě zváženy a jejich hmotnost zaznamenána. V tomto případě byla aplikována metoda elektroforézy hlízových proteinů podle UPOV (1996) – viz kapitola III. Laboratoř provedla následující den elektroforetické analýzy dodaných 60 hlíz (spolu s etalonovými vzorky příslušných odrůd) a po barvení gelů přes noc byla v následujícím dnu spektra vizuálně vyhodnocena porovnáním s etalonovým spektrem příslušné odrůdy, zjištěn počet vyhovujících a nevyhovujících hlíz (odpovídajících či neodpovídajících odrůdové deklaraci), vypočtena hodnota koeficientu Q podle vzorce Q = (n+1). mCO / (n+1). mCO + (99-n). mDO, kde n je počet hlíz cizí odrůdy, mCO - průměrná hmotnost hlíz cizí odrůdy, mDO - průměrná hmotnost hlíz deklarované odrůdy. Vzorek byl označen za nevyhovující, když Q > 0,02 a závěr zněl: „Ve vzorku byla zjištěna přítomnost cizích odrůd větší než 2% hmotnosti“ Současně byla uvedena hodnota koeficientu Q. V případě, kdy u vzorku, ve kterém byla určena směs odrůd, nebylo možné určit deklarovanou odrůdu, byla za deklarovanou odrůdu považována odrůda s nejvyšším % zastoupením. Vzorek byl označen za vyhovující, když Q ≤ 0,02 a závěr zněl: (v případě, že referenční odrůda byla k dispozici): „Ve vzorku byla zjištěna přítomnost cizích odrůd menší nebo rovna 2% hmotnosti“ a v případě že referenční odrůda nebyla k dispozici: „Byla zjištěna odrůdová jednotnost analyzovaného vzorku (množství cizích odrůd bylo menší nebo rovno 2% hmotnosti), majoritní odrůdu nebylo možno identifikovat vzhledem k chybějící referenční odrůdě.“ (Posledně uvedený případ nastával při kontrole odrůdové jednotnosti raných brambor z dovozu, kdy se velmi často jednalo o odrůdy, které nebyly v ČR registrovány.) Další návaznost využití výsledků (sankce, informace pro veřejnost, atd. ) kontrolní akce již byly zcela v kompetenci SZPI.

II. Schéma postupu

5


III. Metodika elektroforézy proteinů a enzymů hlíz brambor podle Bundessortenamt (1996) – postup používaný v SRN a přijatý UPOV (přeloženo z německého originálu a modifikováno podle podmínek laboratoře VÚRV) 1. Extrakce proteinů hlíz 1.1. Extrakční roztoky Roztok

Složky

Roztok K1 Roztok K2

Siřičitan sodný (Na 2SO3 Dvojsiřičitan sodný ( Na2S2O5) Sacharoza Amidočerň 10B extra

Navážka na 100 ml Poznámka vodného roztoku 5,00 g denně čerstvý 3,75 g 50,00 g denně čerstvý 0,03 g

1.2. Příprava extraktů proteinů Hlízy brambor necháme při –20°C dobře promrazit (minimálně 16 hod.) a při pokojové teplotě roztát. Do 6,5 ml centrifugačních zkumavek dáme 0,1 ml roztoku K1. Hlízy omyjeme pod tekoucí vodou, osušíme a rozkrojíme. Hlízovou vodu (4-5 ml) tlakem vymačkáme do centrifugačních zkumavek a promícháme skleněnou tyčinkou s roztokem K1. Centrifugujeme 15 minut při 3 000 ot. min. -1 při 10°C, odebereme 4 ml čirého supernatantu, který přeneseme do další zkumavky s 1,0 ml roztoku K2 a opět skleněnou tyčinkou promícháme. Extrakt potom rozdělíme do tří 1,5 ml kyvet se šroubovacím uzávěrem a zmrazíme. K elektroforéze použijeme buď čerstvý nebo rozmrazený extrakt, který pro snadnější nanášení napipetujeme do mikrotitrační destičky (vždy po 1 aliquotu - 150 µl do jamky). 2. Elektroforéza hlízových proteinů 2.1. Pufry Pufr

Složky

Pufr 1

TRIS Kys. boritá Pufr 1 Pufr 1

Pufr 2 Pufr 3

Podíl na 1 l vodného Poznámka roztoku 30,26 g skladovatelný 36,60 g 125,00 ml denně čerstvý 158,00 ml denně čerstvý

III. Metodika elektroforézy (1996)

6


2.2. Gelové roztoky Zásobní roztoky Zásobní roztok 40% AA 2 %BIS 2 % Pers.

Složky

Množství

Akrylamid Destilovaná voda Methylen BIS Akrylamid Destilovaná voda Persíran amonný (Ammonium Persulfate) Destilovaná voda

Poznámka

400 g do 1000 ml 20,0 g do 1000 ml

velmi toxický!! velmi toxický!!

0,2 g

denně čerstvý

do 10 ml

Rozpis složek pro různé objemy gelu

Složky pufr 3 AA 40% BIS 2% siřičitan sodný DMAPN* pers. 2%

40 ml 30,32 ml 4,68 ml 4,96 ml

80 ml 60,64 ml 9,36 ml 9,92 ml

0,0165 g

0,033 g

0,2 ml 0,76 ml

0,4 ml 1,52 ml

Objem gelu 100 ml 75,8 ml 11,7 ml 12,4 ml 0,042 g 0,5 ml 1,9 ml

120 ml 90,96 ml 14,04 ml 14,88 ml

150 ml 113,7 ml 17,55 ml 18,6 ml

200 ml 151,6 ml 23,4 ml 24,8 ml

0,05 g

0,063 g

0,084 g

0,6 ml 2,28 ml

0,75 ml 2,85 ml

1,0 ml 3,8 ml

* 3 – (Dimethylamino) propionitril

2.3. Barvicí roztoky Barvicí roztoky Barvicí roztok 1

Barvicí roztok 2

Barvicí roztok 3 Barvicí roztok 4

Složky Coomassie Blue G 250 Coomassie Blue R 250 Dest. voda Kyselina trichloroctová Kyselina octová Dest. voda Methanol Barvicí roztok 1 Na2HPO4 x 12 H2O Dest. voda Na H2PO4 x 1 H2O Dest. voda


Množství 250 mg 750 mg 100 ml 120 g 140 ml 1600 ml 300 ml 50 ml 53,7 g do 1 l 20,7 g do 1 l

7


2.4. PAGE hlízových proteinů 2.4.1.Přístroje Vertikální elektroforetický přístroj (např. OWL Scientific, USA) pro 2 gely nebo jiný přístroj na vertikální elektroforézu v polyakrylamidovém gelu. Zdroj stejnosměrného proudu nejméně na 400 V a 150 mA Kryostat (chladicí termostat ) Kývací třepačka Chlazená odstředivka Mraznička Analytické váhy

2.4.2.Příprava gelu - 2 plotny (60x110x1 mm) Připravit 80 ml gelu podle rozpisu v kapitole 2.2. (složky přidávat v pořadí uvedeném v tabulce). Roztok ihned plynule nalít do kyvet a gely opatřit vzorkovými hřebeny. Polymerace trvá 3-4 minuty. Gely před použitím necháme ještě nejméně 30 minut dále polymerovat. 2.4.3. Nanášení vzorků Nanášíme pomocí dávkovače Hamilton (50 µl) 6 µl extraktu (viz 1.2.) do každé kapsy v gelu. 2.4.4.

Podmínky dělení pro 2 paralelní gely

Elektrodový pufr: Pufr 2 Teplota: 7-10°C v elfo prostoru (zajistí se pomocí kryostatu) Proud: zpočátku 78 mA (10 minut), potom nastavit 140 mA, ustaví se podmínky cca 90 mA a 400 V (30 minut) Napětí: ohraničit na max.400 V Výkon: ohraničit na max. 100 W Směr dělení: od katody (-) k anodě (+) Označení čela: pruh amidočerni Doba dělení: cca 10 + 30 min., po těchto 40 minutách ukončit dělení 2.4.5.

Barvení proteinů

Na 2 gely: 350 ml barvicího roztoku 2; 2 hodiny kývat a potom nechat stát přes noc. K odbarvení promýt 2 x 30 minut ve vodě a 1x 30 minut v 2% glycerinu. Gely vysušit na vzduchu mezi 2 vrstvami celofánu (zvlhčeném 2% glycerinem). 2.5. Hodnocení výsledku elektroforézy 2.5.1. Vizuální Získaná elektroforetická spektra hlízových proteinů lze již v nevysušeném stavu vyhodnotit vizuálně porovnáním s etalonovým spektrem deklarované odrůdy. Při tomto způsobu hodnocení můžeme rozhodnout, které hlízy odpovídají a které neodpovídají odrůdové III. Metodika elektroforézy (1996)

8


deklaraci. U neodpovídajících hlíz však nemůžeme určit, které odrůdě náležejí. Uschované usušené gely lze archivovat pro případnou kontrolu správnosti vizuálního vyhodnocení, případně je vyhodnotit pomocí softwaru Sortbest. 2.5.2. Hodnocení pomocí počítačového programu Sortbest V rámci výzkumného projektu je postupně vytvářen registr denzitogramů registrovaných odrůd brambor. Po vložení denzitogramu neznámé odrůdy program porovnáváním s již uloženými údaji vybírá nejpodobnější denzitogram, podle hodnoty koeficientu podobnosti lze potom s určitou pravděpodobností přiřadit neznámému vzorku odrůdovou deklaraci.

Příklady identifikace neznámé odrůdy pomocí záznamů uložených v počítačové knihovně programu Sortbes.


9


IV. Polyakrylamidová gelová elektroforéza pro analýzu esteráz, peroxidáz a patatinů v bramborách podle Bundessortenamt (2002) – postup používaný v SRN a přijatý UPOV (přeloženo z německého originálu a modifikováno podle podmínek laboratoře VÚRV) – zahrnuje i modifikaci metody UPOV (1996) 1. Počet hlíz na test: - pro DUS ( odlišnost, uniformitu a stálost) : 10 hlíz - pro kontrolu identity: 4 hlízy Hlízy musí být zralé, sklizené ihned po zaschnutí listů, při skladování v rozmezí teplot 4 až 10°C mohou být použity nezávisle na sezóně, dokud nezačnou klíčit.

2. Přístroje a zařízení: mrazák (minimálně na -20°C) chlazená centrifuga kryostat třepačka (kývačka) na ploché gely vertikální elektroforetický přístroj pro 2 gely* zdroj stejnosměrného proudu alespoň na 400 V a 150 mA** běžné laboratorní vybavení (analytické váhy, lednice, automatické pipety, dávkovače Hamilton), aj. *Může být použit jakýkoli vhodný přístroj pro elfo, jestliže umožňuje udržování konstantní teploty gelů. Tloušťka gelu by neměla být vyšší než 1,5 mm. ** Zdroj proudu by měl umožnit nastavení konstantního proudu nebo konstantního napětí.

3. Chemikálie: Všechny chemikálie stupně „analytical reagent“ (p.a.) nebo lepší 3.1. Chemikálie pro extrakci proteinů Amidočerň 10 B Siřičitan sodný Na2 SO3 Disiřičitan sodný Na2 S2 O5 Sacharóza 3.2. Chemikálie pro elektroforézu 40% Akrylamid roztok (AA) (velmi toxický!!) (AA) Persíran amonný (APS) 2% Methylen – Bis - akrylamid roztok (BIS) (velmi toxický!!) Kyselina boritá Bromfenolová modř (BPB) 3- (Dimethylamino) propionitril (DMAPN) Ethanol IV. Metodika elektroforézy (2002)

10


Glycin Kyselina chlorovodíková Sacharóza N,N,N´N´ - Tetramethylethylenediamine (TEMED) Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)

3.3. Chemikálie pro barvení proteinů Aceton Coomassie Blue G 250 Coomassie Blue R 250 Dianisidin-2HCl (extrémně toxický !!) Hydrogenfosforečnan dvojsodný dodekahydrát (Na2 HPO4 . 12 H2O) Fast Blue RR Salt Ledová kyselina octová Glycerol 30% Peroxid vodíku Methanol 1-Naftylacetát Dihydrogenfosforečnan sodný – monohydrát (NaH 2PO4 . 1 H2O) Kyselina trichloroctová (TCA)

4. Roztoky 4.1.Extrakční roztoky č.

Roztok

Složky Siřičitan sodný Na2 SO3 4.1.1 Extrakční roztok A Disiřičitan sodný Na2 S2 O5 Deionizovaná voda Sacharóza 4.1.2. Extrakční roztok B Amidočerň 10B Deionizovaná voda Extrakční roztok A 4.1.3 Extrakční roztok C Extrakční roztok B

Množství 5,00 g 3,75 g do 100 ml 500 g 0,3 g do 1000 ml 10 ml 100 ml

IV. Metodika elektroforézy (2002)

Poznámka lze skladovat při 6°C lze skladovat při 6°C denně čerstvý

11


4.2. Pufry a gelové roztoky č. 4.2.1.1

4.2.1.2

Roztok Gelový pufr zásobní

40% roztok AA

4.2.1.3

2 % roztok BIS

4.2.1.4

2 % roztok APS

4.2.1.5

Elektrodový pufr

Složky TRIS Kys.boritá Deionizovaná voda

Množství 30,26 g 36,6 g do 1000 ml

AA Deionizovaná voda

40 g do 100 ml

BIS Deionizovaná voda

2g do 100 ml

APS Deionizovaná voda Pufr 4.2.1.1 Deionizovaná voda

1g do 50 ml 125 ml 875 ml

Poznámka

Pro bezpečnost by měl být používán komerční roztok Pro bezpečnost by měl být používán komerční roztok Denně čerstvý Denně čerstvý

4.2.2. Pufry a roztoky pro PAGE pH 8,9 pro patatiny a (peroxidázy) č.

Roztok

4.2.2.1

Pufr na dělicí (spodní) gel

4.2.2.2

Pufr na zaostřovací (horní) gel

4.2.2.3

Zaostřovací gel

4.2.2.4. 40 % AA 4.2.2.5 2 % BIS 4.2.2.6 2 % APS 4.2.2.7

10 % ethanol

4.2.2.8

Zásobní el. pufr

4.2.2.9

Elektrodový pufr

Složky TRIS Deionizovaná voda

Množství 75,4 g do 1000 ml

TRIS Bromfenolová modř Deionizovaná voda Pufr 4.2.2.2 40% AA 2 % BIS Deionizovaná voda Sacharóza viz 4.2.1.2 viz 4.2.1.3 viz 4.2.1.4 ethanol Deionizovaná voda TRIS Glycin Deionizovaná voda Pufr 4.2.2.8 Deionizovaná voda

16 g 100 mg do 1000 ml 280 ml 45 ml 73 ml 150 ml 80 g

Poznámka Upravit pH na 8,9 přidáním HCl Upravit pH na 6,7 přidáním HCl

komerční rozt. komerční rozt. denně čerstvý 10 ml do 100 ml 5,2 g 3,5 g do 1000 ml 50 ml do 1000 ml


denně čerstvý

12


4.3. Barvicí roztoky pro patatiny, peroxidázy a esterázy č.

4.3.1

4.3.2

4.3.3.

4.3.4.

Roztok

Zásobní roztok

Barvicí roztok pro patatiny Barvicí pufr A pro esterázy Barvicí pufr B pro esterázy Barvicí pufr pro peroxidázy

4.3.5.

Dianisidinový roztok

4.3.6.

2% glycerin

Složky Coomassie Br. Blue G 250 Coomassie Br. Blue R 250 deionizovaná voda

Množství 0,25 g 0,75 g do 100 ml

TCA Ledová kys. octová vodovodní voda methanol roztok 4.3.1 Na2 HPO4 x 12 H2O deionizovaná voda

240g 280 ml 3 300 ml 600 ml 100 ml 53,7 g do 1000 ml

NaH2 PO4 x 1 H2O deionizovaná voda

Poznámka míchat alespoň 1 hodinu důkladně; protřepat před použitím

20,7 g do 1000 ml

Dianisidin-2HCl deionizovaná voda

1g do 100 ml

Glycerol deionizovaná voda

20 g do 1000 ml

může být skladován při 6°C 1 týden

5. Pracovní postup 5.1.Příprava vzorků Hlízy zmrazit na -20°C ( minimálně 16 hod.) a pak nechat rozmrazit při pokojové teplotě. Pro analýzu každé hlízy je potřebná 2 ml centrifugační kyveta obsahující 0,4 ml extrakčního roztoku C (4.1.3). Rozmrzlé hlízy se rozříznou a vymáčknou. 1,5 ml šťávy se zachytí do výše uvedené kyvety a promíchá s extrakčním roztokem C (míchání). Dále se centrifuguje 15 minut při 3 000 ot.min-1 a 10°C. Supernatanty se přenesou do nové prázdné centrifugační kyvety a zmrazí se pro pozdější provedení elfo. Před začátkem elfo se extrakty rozmrazí a alikvoty (150 µl) se přenesou do jamek mikrotitrační destičky.


13


5.2. Příprava gelů 5.2.1. Příprava gelů pro PAGE pH 7,9 pro esterázy (patatiny – rychleji) Rozpis složek pro různé objemy gelu Složky pufr 3 AA 40% BIS 2% siřičitan sodný DMAPN* pers. 2% -

40 ml 30,32 ml 4,68 ml 4,96 ml

Objem gelu 80 ml 100 ml 120 ml 60,64 ml 75,8 ml 90,96 ml 9,36 ml 11,7 ml 14,04 ml 9,92 ml 12,4 ml 14,88 ml

150 ml 113,7 ml 17,55 ml 18,6 ml

200 ml 151,6 ml 23,4 ml 24,8 ml

0,0165 g

0,033 g

0,042 g

0,05 g

0,063 g

0,084 g

0,2 ml 0,76 ml

0,4 ml 1,52 ml

0,5 ml 1,9 ml

0,6 ml 2,28 ml

0,75 ml 2,85 ml

1,0 ml 3,8 ml

Sestavit suché a čisté gelové kazety Připravit cca 100 ml gel. roztoku (T: 4,9%; C: 4,7%): Po pečlivém rozpuštění a rozmíchání 108 mg siřičitanu sodného v 55 ml deionizované vody se přidají následující roztoky: 30 ml 4.2.1.1. (zásobní gel. pufr) 30 ml 4.2.1.2 ( 40% AA) 30 ml 4.2.1.3 (2% BIS) Polymerace se nastartuje přidáním: 1,2 ml DMAPN 4,5 ml 4.2.1.4 (2% APS)

-

Po zamíchání se gely pečlivě nalijí, aby se zabránilo tvorbě bublinek vzduchu. Hřebeny pro vytvoření kapes v gelu se vloží do kapalného gelu a polymerace probíhá při pokojové teplotě alespoň 15 minut. Hřebeny se potom vyjmou. Vzniklé kapsy se promyjí a naplní elektrodovým pufrem (4.2.1.5).

5.2.2. Příprava gelů pro PAGE pH 8,9 pro peroxidázy a patatiny -

Sestavit suché a čisté gelové kazety Každý gel se skládá z dělicího a zaostřovacího gelu Příprava cca 100 ml dělicího gelu (T: 5,5%; C: 4,4%)

-

Následující jednotlivé složky jsou přidávány za pomalého míchání: 60 ml gel. pufru 4.2.2.1 14 ml deionizované vody 14 ml 4.2.2.4. (40 % AA) 13 ml 4.2.2.5 (2% BIS) Polymerace se nastartuje přidáním: 100 μl TEMED 6 ml 4.2.2.6 (2% APS)


14


-

-

Gely se pečlivě nalijí tak, aby se netvořily bublinky vzduchu a polymerace probíhá alespoň 15 minut při pokojové teplotě. Gelové kazety by neměly být zcela naplněny, aby byl prostor pro 14 mm vrstvu zaostřovacího gelu. Povrch gelu se pečlivě opatrně převrství 10% ethanolem (4.2.2.7) pomocí injekční stříkačky. Po skončení polymerace (po cca 30 minutách) se povrch gelu omyje deionizovanou vodou a osuší filtračním papírem. Příprava zaostřovacího gelu: Přidávat a pomalu míchat: 15 ml roztoku 4.2.2.3 (obsahuje 4.2.2.2, 40% AA, 2% BIS,. deion. voda, sacharoza) 60 μl TEMED 375 μl 4.2.2.6 (2% APS)

-

Gely se pečlivě nalijí tak, aby se nevytvořily vzduchové bublinky, vloží se hřebeny pro tvorbu jamek a polymerace probíhá alespoň 15 minut. Potom se hřebeny opatrně vyjmou a jamky v gelu se promyjí a naplní elektrodovým pufrem 4.2.2.9

5.3. Nanášení vzorků -

Pro elektroforézu esteráz a peroxidáz je nanášeno do každé jamky 6 – 12 μl extraktu z mikrotitrační destičky ( v závislosti na velikosti jamek). Pro elektroforézu patatinů je nanášeno do každé jamky 3 - 6 μl extraktu z mikrotitrační destičky ( v závislosti na velikosti jamek).

5.4. Elektroforéza 5.4.1. Podmínky PAGE pH 7,9 pro esterázy Elektrodový pufr Proud /2 gely (11 cm šířka, 1 mm tloušťka) Napětí Teplota Směr migrace Migrační vzdálenost

4.2.1.5 10 minut 78 mA, 30 minut 100 mA* max. 400 V 5 – 15 °C do katody (-) k anodě (+) dráha za 40 minut

* hodnoty 100 mA není dosaženo, protože napětí je limitováno na 400 V

5.4.2 Podmínky pro PAGE pH 8,9 pro patatiny (a peroxidázy) Elektrodový pufr Proud /2 gely (11 cm šířka, 1 mm tloušťka) Napětí Teplota Směr migrace Migrační vzdálenost

4.2.2.9. 80 mA (průchod horním gelem), potom 160 mA** max. 300 V 5 – 15 °C do katody (-) k anodě (+) 6 cm bromfenolová modř (čelo) od rozhraní gelů

** hodnoty 160 mA není dosaženo, protože napětí je limitováno na 300 V


15


5.5. Barvení: 5.5.1. Barvení esteráz: Gely z PAGE pH 7,9 se označí, např. odříznutím růžku gelu. Potom se gely přenesou do barvicí misky se směsí 120 ml barvicího pufru A (4.3.3.) a 80 ml barvicího pufru B (4.3.4.) a inkubují se na kývací třepačce.50 mg 1-naftylacetátu se rozpustí ve 3 kapkách acetonu a ředí se deionizovanou vodou, dokud se roztok nezakalí. Roztok se přidá k pufrům a gelu. 100 mg Fast Blue RR se suspenduje v 5 ml acetonu a zředí 5 ml deionizované vody. Tento roztok se přidá ihned k pufrovým roztokům a gelu. Doba barvení se pohybuje mezi 15 a 40 minutami. Potom jsou gely inkubovány na třepačce 2 x 30 minut s deionizovanou vodou a dále se gely inkubují na třepačce v 2% roztoku glycerolu (4.3.6.) po dobu 30 minut. Po této inkubaci se gely usuší mezi dvěma vrstvami celofánu, namočeného v 2% glycerolu. 5.5.2. Barvení peroxidáz: Gely z PAGE pH 8,9 se označí, např. odříznutím růžku gelu. Potom se gely přenesou do barvicí misky naplněné 200 ml barvicího pufru (4.3.4.) a inkubují se na kývací třepačce. Přidá se 10 ml roztoku dianisidinu (4.3.5.). Po 30 sec se reakce nastartuje přidáním 260 μl 30% H 2O2. Doba barvení se pohybuje mezi 10 a 20 minutami. Pro odbarvení se gely inkubují na třepačce 2 x 30 minut s deionizovanou vodou a dále se inkubují na třepačce v 2% roztoku glycerolu (4.3.6.) po dobu 30 minut. Po této inkubaci se gely usuší mezi dvěma vrstvami celofánu, namočeného v 2% glycerolu.

5.5.3. Barvení patatinů: Gely z PAGE pH 8,9 se označí, např. odříznutím růžku gelu. Potom se gely přenesou do barvicí misky naplněné 300 ml barvicího pufru (4.3.2.) a inkubují se na kývací třepačce 3 hodiny. Gely se ponechají v barvicí lázni přes noc bez třepání. Pro odbarvení se gely inkubují na třepačce 2 x 30 minut s vodovodní vodou a dále se inkubují na třepačce v 2% roztoku glycerolu (4.3.6.) po dobu 30 minut. Po této inkubaci se gely usuší mezi dvěma vrstvami celofánu, namočeného v 2% glycerolu.

6. Identifikace proteinových alel. 6.1. Identifikace alel esterázových isoenzymů Pozice jednotlivých esterázových isoenzymů jsou kalibrovány odrůdou Sieglinde. Odrůda Sieglinde vykazuje 3 pruhy s vysokou enzymatickou aktivitou v následujících pozicích: 75 + 77 + 88. Esterázové ieoenzymy bramborových hlíz jsou vysoce polymorfní. Pro jasnou interpretaci byly zymogramy rozděleny do čtyř bloků pruhů. Bloky pruhů Est 1 a Est 4 mají jen nízkou enzymatickou aktivitu. Bloky pruhů Est 2 a Est 3 mají naopak vysokou enzymatickou aktivitu. Pro stanovení odlišnosti, jednotnosti a stálosti (DUS) jsou používány pouze bloky Est 2 a Est 3.


16


Obrázek IV.1.: Esterázy odrůdy Sieglinde a přehled bloků Est 1, Est 2, Est 3 a Est 4

Brambory jsou vegetativně množený tetraploidní druh. Proto je třeba očekávat mnoho heterozygotních genotypů. Jednotlivé genotypy mohou být rozlišeny pouze podle genové dávky. Takové genotypy se často nacházejí v Est 2 a Est 3. Kombinace mezi nullalelou a aktivními alelami a genotypy majícími plnou dávku genu vykazují identické pruhy. Proto jsou vyhodnoceny jako identické. Est 2 a b c d e f

Est 3 o o o o o o

Př. odrůdy Desirée Cleopatra Obelix Achat Sibu Wali

Zn.

h i j k l o

o o o o o o

Jetta Renate Hansa Belita Roxy Ulla

6 8 1 13 16 11

4 18 22 5 20 12

Es t2

Est 3

Př. odrůdy

Zn.

Est 2

Est 3

Př. odrůdy

Zn.

d

b

Vital

23

d

c

Krometa

19

g

b

Premiere

26

i j

b b

Selma Ute

7 9

i j k l

c c d c

Karakter Karolin Junior Sieglinde

15 3 17 2


17


6.1.1. Schemata genotypů v rámci lokusu Est 2

Obrázek IV.2.: Schematické znázornění alel v rámci lokusu Est 2

V Est 2 vykazuje většina genotypů 2 pruhy (označené a-1). Byly detekovány genotypy s více než 2 pruhy. Tyto typy mohou být interpretovány jako kombinace dvou genotypů obsahujících dva pruhy. Genotyp Genotyp Est 2 Est 3 dl o

Př. odrůdy

Pozn.

Leyla

dl

c

Aiko

nerozlišitelný od genotypu Est 2:d + Est 3: o nerozlišitelný od genotypu Est 2:d + Est 3: c

jf

o

Protea

Existuje překrytí genových produktů 75 a 77 náležejícím genotypu „Est 2: l“ s genovým produktem náležejícím genotypu Est 1. Proto není možné získat jasnou separaci mezi hybridy typu „Est2: l x d“ a genotypy „Est 2:d“. Proto genotyp dl a genotyp l nebudou vyhodnoceny jako rozdílné. 6.1.2. Schemata genotypů v rámci lokusu Est 3

Obrázek IV.3.: Schematické znázornění alel v rámci lokusu Est 3


18


(6.2. Identifikace alel peroxidázových isoenzymů) – je zde uvedena jen pro úplnost (viz text) Elektroforéza a identifikace peroxidázových isoenzymů nebyla prováděna vzhledem k vysoké toxicitě substrátu pro identifikaci – o –dianisidinu , který je klasifikován např. podle Katalogu Sigma 2004-2005 „Biochemikálie a Reagencie“ na str. 628 jako „probably carcinogenic“. Peroxidázové isoenzymy hlíz brambor jsou monomerické enzymy. Pozice jednotlivých isoenzymů jsou kalibrovány odrůdou Amigo. Odrůda Amigo vykazuje dva pruhy 59 + 68.

Obrázek IV.4.: Isoenzymy peroxidáz odrůdy Amigo

Genotyp a b c d e

Příklad Hansa Corine Tomensa Amigo Jetta

Znač. 1 2 3 4 5

Genotyp f g h j

Příklad Diana Thomana Kanjer

Znač. 7 6 8 1

Obrázek IV.5.: Schematické znázornění alel v rámci peroxidázového lokusu

Genotypy označené hvězdičkou vykazují snižující se genovou dávku v jednotlivých peroxidázách. Mohou být interpretovány jako kombinace mezi aktivními alelami a nullalelou. Takové genotypy jsou považovány za genotypy s plnou genovou dávkou. Genotyp j IV. Metodika elektroforézy (2002)

19


dává zymogramy blízké ke genotypu a; takže genotypy a a j nejsou označeny jako rozdílné. Oba genotypy mají tutéž značku :1

6.3.Identifikace alel patatinů Patatiny jsou monomerické peptidové řetězce Tabulka alel patatinů a označení s příklady odrůd Genotyp 1.01 2.01 2.02 2.03 2.04 3.01 3.02 3.03 3.04 3.05 3.06 3.07 3.08 3.09 4.01 4.02 4.03 4.04 4.05 4.06 4.07

Příklad odrůdy Secura Erntestolz Desiree Pompadur Delia Quarta Irmgard Ulla Fasan Karolin Gloria Junior Danva Combi Indira Christa Pia Rubin Cleopatra Felsina Cinja

Genotyp 4.08 4.09 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 4.17 5.01 5.02 6.01 6.02 7.01 7.02 7.03 7.04 7.05 7.06 7.07

Příklad odrůdy Sommergold Wali Juliver Pepo Saturna Aiko Amigo Oktan Belita Solina Artana Quinta Fausta Pallina Grata Atica Karnico Franca


Genotyp 7.08 7.09 8.01 8.02 8.03 8.04 8.05 8.06 8.07 8.08 8.09 8.10 8.11 8.12 8.13 8.14 8.15 8.16 9.01 10.01 10.02

Příklad odrůdy Adletta Ukama Berolina Escort Darwina Shepody Kardal Padea Elles Solara Thomana Karida Vebeca Arnika Krometa Sirius Alba Feska Calla Liu Kranich

20


6.3.1.Grupování elfo spekter Patatiny jsou definovány jejich elektroforetickou mobilitou (REM – hodnota). Pozice jednotlivých patatinů jsou ilustrovány na příkladu odrůdy Hansa.

Obrázek IV.6.: Patatiny odrůdy Hansa

Patatiny jsou extrémně polymorfní proteiny. Počet alelických kombinací je vyšší než 80. Proto je grupování patatinových spekter nutné. Patatiny s vysokou mobilitou (REM mezi 33 a 60) jsou použity pro grupování. Tyto patatiny jsou identické s A-, B-, C- a D pruhy podle Stegemanna a Löschke (1976). Tvoří 8 skupin: skupinu 1 – skupinu 8. Navíc existují dvě speciální skupiny: skupina 10 je definována přítomností pruhu 36 a skupina 9 je definována absencí B-pruhu.

Obrázek IV.7: Schémata jednotlivých skupinových spekter patatinů


21


Tabulka: Hodnoty REM v jednotlivých skupinách Hansa 15 21 26 33 A 43 B 50 C 59 D

1 15

3 15

26

2 15 21 26

43

43

43 50

59

26

Skupina patatinů 4 5 6 7 15 15 15 15 21 21 26 26 26 26 33 33 33

8 15 21 26 33

43 50 59

43 50 50 59 59

43

43 43 50

59

9 21 26 33

10 15 21 26 36 43 50 59

6.3.2.Analýza intenzit pruhů Rozdíly v intenzitách pruhů mohou být způsobeny rozdílnou genovou dávkou. Jsou pozorovány v pozicích 15, 21, 26, 31, 33 a 34. Vyskytují se např. v typu 5.01.

Obrázek IV.8.: Příklady rozdílů v intezitách pruhů v rámci podskupiny patatinů 5.01

Spektra se liší pouze v intenzitách pruhů hodnocených jako identické.


22


6.3.3.Schemata skupin a podskupin spekter

Obrázek IV.9.a: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupin 1 – 3

Obrázek IV.9.b: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupiny 4

Obrázek IV.9.c: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupin 5 – 7


23


Obrázek IV.9.d: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupiny 8

Obrázek IV.9.e: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupin 9,10

Poznámka ke skupinám 5 – 8 Pruh 33 je mimořádně intenzivní a překrývá pruh 31; proto pruh 31 není v přítomnosti pruhu 33 vůbec patrný. Platí to i v případě snížené intenzity pruhu 33.


24



25


V. Příklady získaných elektroforetických spekter hlízových proteinů Pro ilustraci uvádíme fotografie získaných elektroforetických spekter níže uvedených registrovaných odrůd brambor a některých etalonových odrůd používaných pro kalibraci spektra. Na první pohled je patrné, že mezi jednotlivými odrůdami jsou dobře rozlišitelné rozdíly.

S 112 – S 113 – S 114 – S 115 – S 116 – S 117 – S 118 – S 119 -

Sirius Symfonia Tábor Tara Ukama Van Gogh Vilma Vladan

Etalony:

Ha - Hansa Si - Sieglinde Ob - Obelix

V. Příklady získaných elektroforetických spekter hlízových proteinů

26


Získaná elektroforetická spektra jsou na gelech proměřena, vypočteny hodnoty REM, sestavena tabulka hodnot REM a jejich grafické znázornění (schemata). Tímto způsobem je vytvářen celý katalog elektroforetických spekter hlízových proteinů (patatinů) všech registrovaných odrůd brambor. Pro ilustraci uvádíme několik ukázek získaných schemat. S 112 - SIRIUS

1

6

11

16

21

26

31

36

41

46

51

56

61

66

71

76

81

86

91

96

61

66

71

76

81

86

91

96

61

66

71

76

81

86

91

96

61

66

71

76

81

86

91

96

61

66

71

76

81

86

91

96

REM

S 113 - SYMFONIA

1

6

11

16

21

26

31

36

41

46

51

56

REM

S 114 - TÁBOR

1

6

11

16

21

26

31

36

41

46

51

56

REM

S 115 - TARA

1

6

11

16

21

26

31

36

41

46

51

56

REM

S 116 - UKAMA

1

6

11

16

21

26

31

36

41

46

51

56

REM


27


S117 - VAN GOGH

1

6

11

16

21

26

31

36

41

46

51

56

61

66

71

76

81

86

91

96

61

66

71

76

81

86

91

96

66

71

76

81

86

91

96

REM

S 118 - VILMA

1

6

11

16

21

26

31

36

41

46

51

56

REM

S 119 - VLADAN

1

6

11

16

21

26

31

36

41

46

51

56

61

REM


28


VI. Příklad postupu při odrůdové identifikaci odrůdy ze vzorků konzumních brambor V srpnu 2005 byly v supermarketu Delvita zakoupeny balené konzumní brambory rané s odrůdovou deklarací (Marabel a Vivaldi) (obr. 1,2 – identifikační štítky na obalových siťkách). Z každé síťky bylo náhodně odebráno po 5 hlízách (metodika UPOV předepisuje analýzu 4 hlíz pro odrůdovou identifikaci). Postupem uvedeným v kapitole IV. byly připraveny extrakty hlízových proteinů a provedena elektroforéza patatinů. Na gel byly společně s testovanými extrakty naneseny i extrakty z etalonů odrůd Marabel a Vivaldi a provedeno vizuální porovnání s testovanými hlízami. Dále byly usušené gely vyhodnoceny pomocí programu Sortbest s cílem identifikovat odrůdu. Získaná elektroforetická spektra jsou zobrazena na obr. 3 a 4. Bylo zjištěno, že v obou případech byla získaná elektroforetická spektra testovaných hlíz zcela shodná s etalonovými spektry příslušných odrůd (Marabel, Vivaldi). Současně bylo zjištěno, že všech 5 testovaných hlíz od každé odrůdy vykázalo rovněž navzájem shodná elektroforetická spektra patatinů, že tedy vzorky byly odrůdově homogenní a odpovídaly odrůdové deklaraci.

VI. Příklad postupu při identifikaci odrůdy ze vzorku konzumních brambor

29


Obrázky VI.3 a VI. 4.: Elektroforetické spektrum vzorků zakoupených konzumních brambor s odrůdovou deklarací Vivaldi a Marabel a spektrum etalonových odrůd Vivaldi (S 42) a Marabel (S9)

VI. Příklad postupu při identifikaci odrůdy ze vzorku konzumních brambor

30


VII. Použitá literatura Desborough ,S.L.: Potato (Solanum Tuberosum L.). S.D.Tanksley,T.J.Orton(Eds.) Isozymes in Plant genetics and breeding, Part B. Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam: 1983, s. 167-188. Paulik,M.D.:. Starch gel electrophoresis in a discontinuous system of buffers. Nature. 180, 1957, s.1477. Pivoňková,V.: Změny v obchodování s konzumními bramborami v souvislosti s platností Zákona o potravinách a tabákových výrobcích. Bramborářství, 1997, 6. Souček, J.: Ochrana odrůd brambor v ČR a uplatňování licenčních poplatků při prodeji certifikované sadby brambor. Bramborářství, 1997, 6. Stegemann, H.- Loeschke,V.: Index of European Potato Varieties. Identification by electrophoretic spectra, National registers, Appraisal of Characteristics, Genetic Data. Mitt.Biol.Bundesanst. Berlin-Dahlem, Heft 168,1976 Stegemann, H.- Loeschke,V.: Das europäische Kartoffelsortiment und seine Indexierung. Potato Res.20, 1977, s.101-110. Sýkorová,S. : Identifikace odrůd brambor (Solanum tuberosum L.) pomocí elektroforézy proteinů a enzymů. Rostl. Výroba,45, 1999: 193-196. Šašek,A.: Elektroforetické rozdíly ve složení bílkovinných komplexů domácích a zahraničních odrůd brambor. Gen. a Šlecht. 10 (3), 1974 b , s 197-206. Šašek,A.: Vliv ozáření a teploty skladování na frakční složení bílkovin brambor. Gen. a Šlecht.10 (3), 1974 a, s.207-212. UPOV TWA 31/6 Bundessortenamt (Rio de Janeiro 2002) Draft test guedelines for potato UPOV, Bundessortenamt, 1996, Draft test guedelines for potato

VII. Použitá literatura

31

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně

Recommend Documents