Využití stanovení volných lehkých řetězců v diagnostice a monitorování léčby mnohočetného myelomu
DOPORUČENÍ CMG a SMG 4. reedice
Roman Hájek předseda CMG
Zdenka Štefaníková předsedkyně SMG
Freelite TM Metoda kvantitativního stanovení volných (a to pouze volných) lehkých řetězců imunoglobulinů, vyhodnocení výpočtem poměru
κ:λ
Struktura imunoglobulinů
Těžké řetězce (g,
Lehký řetězec
(k, l)
a, m, d, e)
Lehký řetězec
(k, l)
Imunoglobuliny jsou produkovány plasmatickými buňkami
2 :1 Kappa
Lambda
Syntéza lehkých řetězců je vůči těžkým řetězcům ve 40% nadbytku » 0,5 g/den Koncentrace immunoglobulinů v séru je úměrná počtu plasmatických buněk a rychlosti syntézy
nefron
FLC - monomer 25 kDa dimer 50 kDa Důsledek: sérové hodnoty volných lambda jsou cca 2 x vyšší
Glomerulus póry 40 - 60 kDa
Zpětná absorpce 10 - 30 g/den 3 - 5 mg/den VLŘ odchází močí moč
Vliv zpětné renální tubulární absorbce na hladinu FLC v moči 100000 50,000
Močový FLC (mg/L)
Sérový FLC (mg/L)
5,000 10000
500 1000
250 100
100 10 NR serum NR moč
1
0
6
12 Čas (měsíce)
18
24
Biologický poločas volných k,l a Ig • Volný kappa • Volný lambda • • • • • • • • •
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM IgA1 IgA2 IgE IgD
• 2 - 3 hodiny • 4,5 – 6 hodin • • • • • • • • •
21 dní 20 dní 7 dní 21 dní 10 dní 6 dní 6 dní 2 dny 3 dny
Exponovaný povrch Exponovaný povrch
Kappa
skrytý povrch
Původně
oblast pantu
skrytý povrch
těžký řetězec
je vazebným místem pro protilátku
karbohydrát Lambda lehký řetězec
1000,00
8
7
6
5
4
KAPPA
3
2
1
0
LAMBDA
poměr volného kappa / volnému lambda
poměr celkového kappa / celkovému lambda
9
100,00
KAPPA 10,00
1,00
0,10
0,01
0,00
LAMBDA
Porovnání citlivosti stanovení celkových lehkých řeztězců a volných lehkých řetězců v séru pacientů s MM
Citlivost testů na stanovení lehkých řetězců koncentrace (mg/L)
1000 SPEP Total 100 k&l 10
CZE sIFE UPEP
rozsah normálních hodnot v séru
uIFE
1 rozsah normálních hodnot v moči sFLC
Vzorek
VZOREK SÉRA
séra VZOREK SÉRA SPE
SPE
&
FREELITE (k:l)
Automatizované kvantitativní stanovení
SPE
FREELITE abnormální
FREELITE abnormální
FREELITE normální
FREELITE normální
SPE normální
SPE abnormální
SPE abnormální
SPE normální
závěr:
závěr:
závěr:
závěr:
MP přítomen = =FLC
MP přítomen
MP přítomen
MP negativní
Přesnost různých metodických přístupů v diagnostice monoklonálních proteinů Protokol SPE samotná SPE, IFE sérum SPE and UPE SPE, UPE, sérum a moč IFE FLC samotný SPE a FLC SPE, FLC a sérum IFE
% zjištěných případů Myelom AL amyl MGUS 90 95 95 97
50 70 75 90
45 98 70 98
96 99 99
98 98 98
65 85 100
Polyklonální proliferace plasmatických buněk
Monoklonální proliferace plasmatických buněk
Infekce Autoimmunita
Tumory plasmatických buněk
Zvýšená produkce obou FLC
Zvýšená produkce jednoho FLC
Normální poměr k/l zůstává zachován
Poměr k/l je abnormální
Normal sera
volné lehké lambda (mg/L)
100000 10000
Normal sera
1000 100 10 1 0,1 0,1
1
10 100 1000 volné lehké kapa (mg/L)
10000
100000
100000 Kappa BJM
volné lehké lambda (mg/L)
10000
Normal sera
1000 100 10 1 0,1 0,1
1
10 100 1000 volné lehké kapa (mg/L)
10000
100000
100000 Kappa BJM
volné lehké lambda (mg/L)
10000 Lambda BJM
1000
Normal sera
100
10
1
0,1 0,1
1
10 100 1000 volné lehké kapa (mg/L)
10000
100000
100000 Kappa BJM
volné lehké lambda (mg/L)
10000
Lambda BJM
NSM
1000
Normal sera
100
10
1
0,1 0,1
1
10
100
1000
volné lehké kapa (mg/L)
10000
100000
100000 Kappa BJM Lambda BJM
volné lehké lambda (mg/L)
10000
NSM AL Amyloidosis
1000
Normal sera
100
10
1
0,1 0,1
1
10
100
1000
volné lehké kapa (mg/L)
10000
100000
100000 Kappa BJM Lambda BJM
volné lehké lambda (mg/L)
10000
NSM AL Amyloidosis Normal sera
1000
Renal impaired
100
10
1
0,1 0,1
1
10
100
1000
volné lehké kapa (mg/L)
10000
100000
Otázka vztahu snížené funkce ledvin na hladiny FLC • •
Studie 688 pacientů s renální nedostatečností jiného původu než MM Rozděleni podle závažnosti poškození ledvin CKD 1 - 5
Collin Hutchinson et al, Clin J Am Soc Nephrol. 2008
Vztah nárůstu sFLC a poklesu rychlosti glomerulární filtrace
Vztah nárůstu hodnot poměru k:l a stádia chronické choroby ledvin
Sérové hladiny FLC u pacientů s chronickou chorobou ledvin 5. stupně
Poměr k/l
“Normální rozsah” 0,26 - 1,65 navrhovaný “Renální rozsah” 0,37 - 3,1
KOMPLIKACE způsobené FLC •
1) Při zjištění choroby trpí až 40 % pacientů poškozením ledvin.
•
2) U 12-20 % pacientů s MM se choroba poprvé projeví akutním selháním ledvin. ( Ze 142 pacientů nově závislých na hemodialýze mělo 41 MM – Výsledky studie Hutchinson et al BMC Nephrology 2008)
• •
3) 10 % pacientů zůstává dlouhodobě závislých na hemodialýze.
•
4) Vysoká mortalita.
•
5) Chemoterapie a transplantace ledvin bývají u pacientů s MM komplikované a rizikové.
Nefron glomerulus proximální vinutý kanálek
kůra
toxické poškození, nekróza distální kanálek
filtrace FLC absorbce 10 - 30 g/den
zevní dřeň
poškození voskovým válcem silné vzestupné raménko
vnitřní dřeň
FLC + Tamm-Horsfallovy proteiny vytvářejí komplexy
Figure 3.8. Waxy cast from the urine of a patient with multiple myeloma. (Courtesy of R Johnson and J Feehally ). 11
Figure 3.9. Monoclonal FLCs stained by immunoperoxidase anti antibodies in the distal tubules of a patient with myeloma kidney. (Courtesy of R Johnson and J Feehally ). 11
DIALYZAČNÍ KOLONA GAMBRO
• Freelite pro sledování účinnosti léčebného postupu i dlouhodobého účinku hemodialýzy • Rutinní hemodialytické zařízení – málo účinné pro odstranění proteinů • Výměna plasmy – nesplnila očekávání – zůstává vysoký obsah extravaskulárních FLC – extravaskulárních FLC může být až 80 % • Možnost odstranění volných lehkých řetězců ze séra pacientů s mnohočetným myelomem pomocí dialytických membrán fy Gambro • Zotavení ledvin je pro přežití pacienta klíčové
Gambro HC1100
Volný FLC lambda v séru (mg/L)
10000
800 Serum free lambda
9000
Dialysate free lambda
700
8000 600 7000 500
6000 5000
400
4000
300
3000 200 2000 100
1000 0
0 0
30
60
90
120
150
180
210
čas (min)
240
270
300
330
Volný FLC lambda v dialyzátu (mg/L)
Výsledky 6 hodinové dialýzy
• 1. Odstranění FLC hemodialýzou pomocí membrány HCO 1100 fy Gambro je vysoce účinné. • 2. Prodlouženou hemodialýzou lze odstranit i extravaskulární zásoby FLC. • 3. Pacienti mohou zůstat nezávislí na dialýze v případě zotavení ledvin. • 4. Účinná chemoterapie je nezbytná. • 5. Mezinárodní klinická studie EULITE pokračuje. • 6. VZP přiřadila pro membrány kódy • 7. Možnost pro HCO ve specializovaných centrech
Význam pro laboratorní pracovníky 1) SCREENING VZORKŮ S PODEZŘENÍM NA MM • • • • • • • •
přesné, kvantitativní výsledky pouze ze vzorku séra možnost opustit močové vzorky ověřený a doporučovaný protokol: kombinace Freelite + elfo sér. proteinů citlivost stanovení NSMM – záchyt 82 % pacientů AL amyloidóza – záchyt 98 % pacientů LCMM – záchyt 100% pacientů IIgMM – záchyt 96 % pacientů
SLEDOVÁNÍ • • •
NSMM, AL amyloidu, LCMM, IIgMM prověřeno použítí Freelite jako indikátoru účinnosti léčby možnost rozdělení pacientů s MGUS podle rizika progrese
Význam pro laboratorní pracovníky 2) VÝHODY AUTOMATICKÉHO STANOVENÍ • • • • •
přesnost, kvalita, snížení pracnosti, rychlé dosažení výsledku testu jednoduchá forma výsledků - konkrétní číslo
Význam pro hematoonkology 1) NESEKREČNÍ MM (NSMM) • •
první možnost snadného stanovení a sledování pacientů stanovitelných 82 % pacientů
AL AMYLOIDÓZA • • •
snadné stanovení prověřeno použítí Freelite jako indikátoru účinnosti léčby stanovitelných 98 % pacientů
MM Z LEHKÝCH ŘETĚZCŮ (LCMM) • •
stanovení a sledování v séru Þ Þ možnost opustit močové vzorky stanovitelných 100 % pacientů
Význam pro hematoonkology 2) MG NEJASNÉHO (NEURČENÉHO) VÝZNAMU (MGUS) • •
prognostický znak progrese choroby možnost rozdělení pacientů podle rizika progrese Þ Þřežim sledování
MM Z INTAKTNÍCH IMUNOGLOBULINŮ (IIgMM) (IIMM) •
použitelnost stanovení FLC pro sledování choroby
Význam pro nefrology FLC JSOU NEFROTOXICKÉ MOLEKULY SLEDOVÁNÍ • • • •
NSMM, AL amyloidu, LCMM, IIgMM prověřeno použítí Freelite jako indikátoru účinnosti léčby možnost rozdělení pacientů s MGUS podle rizika progrese Vysoce perspektivní – možnost sledování průběhu specifické hemodialýzy a jejího dlouhodobého účinku
VÝHODY AUTOMATICKÉHO STANOVENÍ • • • •
kvalita rychlost jednoduchá forma výsledků - konkrétní číslo snížení pracnosti
FLC při MM - závěr • 1. FLCs a immunoglobuliny jsou nezávislé markery onemocnění • 2. FLC pomáhají sledovat pacienty s MGUS • 3. FLCs mohou v časném stadiu indikovat relaps • 4. FLCs mohou určit residuální chorobu • 5. FLCs mají vztah ke stadiu choroby • 6. FLCs mohou být nefrotoxické • 7. FLCs reagují rychle na léčbu
Děkuji vám za pozornost
Běla Říčařová
[email protected]
TM •HEVYLITE
Hevylite je specificky zacílen vůči jedinečným úsekům spojů mezi lehkými a těžkými řetězci v konstantní části Ig
Určuje tedy současně typ těžkého i lehkého řetězce v molekule Ig
• Kombinace různých lehkých a těžkých řetězců v molekulách imunoglobulinů
1. Jasná identifikace, kvantifikace a typizace myelomových proteinů 2. Poměr H-kappa : H-lambda je citlivým ukazatelem choroby 3. Koriguje variabilitu způsobenou objemem plasmy a hematokritem 4. Metabolismus IgG je variabilní
IgA M-proteins difficult to identify by SPE Normal
IgA Multiple Myeloma sera 1
2
3
4
5
6
7
8
1
9
10
11 12
13 14
Myelomové proteiny IgA mohou být skryty pro denzitometrii Normální séra M-protein skrytý v b oblasti
MM pacient IgAk = 5000 mg/L IgAl = 20 mg/L Typ = IgAk
1. Jasná identifikace, kvantifikace a typizace myelomových proteinů 2. Poměr H-kappa : H-lambda je citlivým ukazatelem choroby 3. Koriguje variabilitu způsobenou objemem plasmy a hematokritem 4. Jednoduchý a rychlý test na automatickém analyzátoru 5. Metabolismus IgG je variabilní
Stanovení myelomových proteinů třídy IgA
Citlivé sledování monoklonálních proteinů ASCT
1000
IgA M-protein (g/L)
100 SPE and sIFE Negativní
100
10
10 1 IgAk / IgAl Normální rozsah
0.1 0
400
800
1200
1
1600 0.1
HEVYLITE - poměr IgAk / IgAl
IgA M-protein Celkový IgA Poměr IgAk/IgA Hevylite
CVAMP
Co vlastně znamená parciální remise? Cyclophosphamide CVAMP
IFE / SPE Negative
2nd Response IgG normal range
IgG relapse
HLC SPE Greater HLC ratio fall
Monoclonal protein absent by densitometry
SPE
Greater HLC ratio increase
No change in HLC ratio indicating no selective tumour killing
IgGλ / IgGκ normal range remission
Bradwell et al. Clin Chem 2009
1. Jasná identifikace, kvantifikace a typizace myelomových proteinů 2. Poměr H-kappa : H-lambda je citlivým ukazatelem choroby 3. Koriguje variabilitu způsobenou objemem plasmy a hematokritem 4. Metabolismus IgG je variabilní
Poměr koriguje rozdíly v hodnotách koncentrace Ig způsobené změnami objemu plasmy a hodnot hematokritu Ig’k/Ig’l = 3/1 Ig’k/Ig’l Ig’k/Ig’l = 3/1 = 3/1
1. Jasná identifikace, kvantifikace a typizace myelomových proteinů 2. Poměr H-kappa : H-lambda je citlivým ukazatelem choroby 3. Koriguje variabilitu způsobenou objemem plasmy a hematokritem 4. Metabolismus IgG je variabilní
Neonatální Fc receptor (FcRn) ovlivňuje rychlost metabolismu IgG
Neonatální Fc receptor (FcRn) neboli Brambellův receptor • Struktura podobná MHC I. třídy. • Váže albumin a IgG • Poprvé byl popsán u hlodavců jakožto jedinečný receptor schopný transportovat IgG z mateřského mléka přes střevní endotel. F.W Brambell, The transmission of immunity from mother to young and the catabolism of immunoglobulins, Lancet 2 (1966), pp. 1087–1093.
• Další studie objevily existenci podobného receptoru u člověka, kde jeho přítomnost v placentě usnadňuje transport mateřského IgG rostoucímu plodu. • Byla prokázána úloha neonatálního Fc receptoru v recirkulaci IgG.
Recyklace IgG nespecifická absorpce
endoteliální buňka
vazba IgG na FcRn IgG vázaný na FcRn je recyklován degradace
Vztah mezi koncentrací sérových imunoglobulinů a biologickým poločasem
Automatická metoda Hevylite • Dvojice testů pro oba izotypy imunoglobulinů IgG, IgA, IgM: • IgA/kappa, IgA/lambda • IgG/kappa, IgG/lambda • IgM/kappa, IgM/lambda
•
Ještě jednou děkuji za pozornost
[email protected]
100000
10000
Serum Lambda FLC (mg/L)
Normals Kappa Light Chain Myeloma
1000
Lambda Light Chain Myeloma Non Secretory Myeloma Intact Immunoglobulin Myeloma
100
AL Amyloidosis CKD1 CKD2
10
CKD3 CKD4
1
CKD5
0,1 0,1
1
Serum Kappa FLC (mg/L)
10
100
1000
10000
100000
