VYUŽITÍ PROTEOMIKY PRO MONITOROVÁNÍ POTENCIÁLNÍCH BIOMARKERŮ RAKOVINY PRSU

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY

VYUŽITÍ PROTEOMIKY PRO MONITOROVÁNÍ POTENCIÁLNÍCH BIOMARKERŮ RAKOVINY PRSU USING PROTEOMICS FOR SCREENING OF POTENTIAL BREAST CANCER BIOMARKERS

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR'S THESIS

AUTOR PRÁCE

FELICITA GARCIA N DUA

AUTHOR

VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR

BRNO 2014

Ing. DANA FLODROVÁ, Ph.D.

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12

Zadání bakalářské práce Číslo bakalářské práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:

FCH-BAK0822/2013 Akademický rok: 2013/2014 Ústav chemie potravin a biotechnologií Felicita Garcia N Dua Chemie a technologie potravin (B2901) Biotechnologie (2810R001) Ing. Dana Flodrová, Ph.D. doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc.

Název bakalářské práce: Využití proteomiky pro monitorování potenciálních biomarkerů rakoviny prsu

Zadání bakalářské práce: 1. Vypracujte literární přehled k dané problematice 2. Popište použité metody hodnocení 3. Zpracujte naměřené výsledky z experimentů 4. Zhodnoťte získané výsledky formou diskuze

Termín odevzdání bakalářské práce: 23.5.2014 Bakalářská práce se odevzdává v děkanem stanoveném počtu exemplářů na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu bakalářské práce. Toto zadání je přílohou bakalářské práce.

----------------------Felicita Garcia N Dua Student(ka)

V Brně, dne 31.1.2014

----------------------Ing. Dana Flodrová, Ph.D. Vedoucí práce

----------------------doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty

ABSTRAKT Nádor prsu je jedním z nejčastějších maligních karcinomů u ţen a prognóza úzce souvisí s tím, v jakém stádiu kancerogeneze je proces zachycen. V posledních letech je pozornost soustřeďována na hledání nových látek, jeţ by sníţily negativní dopady, které s sebou nese chemoterapie. Bylo zjištěno, ţe jednou z efektivních látek v boji s karcinomem jsou retinoidy, které mají schopnost inhibovat nádory prsní ţlázy v časných stádiích nemoci. Tato práce se zabývá proteomickými studiemi buněk karcinomu prsu a porovnáváním obsahu bílkovin obsaţených v karcinomových buňkách, které byly podrobeny retinoidové léčbě. Úspěšně bylo vyuţito několika separačních metod jako 1D a 2D elektroforéza, chromatografie na reverzní fázi a gelová permeační chromatografie. K tomu byly vzorky ještě podrobeny enzymatickému štěpení vybraných proteinů a jejich identifikaci pomocí MALDI-TOF MS. 2D gelová elektroforéza odhalila výskyt skupiny proteinů řadících se mezi molekulární chaperony, které jsou dnes povaţovány za významné specifické biomarkery nejen karcinomu prsu.

KLÍČOVÁ SLOVA Karcinom prsu, MCF-7 buňky, retinoidy, biomarkery, proteomika

3

ABSTRACT Breast cancer is one of the most common malignant cancers and the prognosis is closely related to the stage of carcinogenesis process in which it was captured. Lately, attention was focused on the research of new compounds that would reduce the negative impacts of chemotherapy. It was found that retinoids are effective compounds in the fight against cancer. Retinoids have the ability to inhibit tumors of the mammary gland in an early stage of disease. This work deals with the proteomic studies of breast cancer cells and comparing the proteins contained in the cancer cells which were subjected to retinoid therapy. The differences in protein composition were investigated using gel electrophoresis, reversed phase and size exclusion liquid chromatography. The identification and characterization of selected proteins was carried out by MALDI-TOF MS. The use of two-dimensional gel electrophoresis led to the identification of molecular chaperons, which are considered to be important biomarkers not only of breast cancer.

KEYWORDS Breast cancer, MCF-7, retinoids, biomarkers, proteomics

4

GARCIA N DUA, F. Využití proteomiky pro monitorování potenciálních biomarkerů rakoviny prsu. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2014. 48 s. Vedoucí bakalářské práce Ing. Dana Flodrová, Ph.D.

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně a ţe všechny pouţité literární zdroje byly správně a úplně citovány. Bakalářská práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a můţe být vyuţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana FCH VUT.

……………………………. podpis studenta

PODĚKOVÁNÍ Mé poděkování patří Ing. Daně Flodrové, Ph.D. za odborné vedení, cenné připomínky, trpělivost a ochotu, které mi v průběhu zpracování bakalářské práce poskytla. 5

OBSAH 1

ÚVOD..............................................................................................................................8

2

CÍL PRÁCE .....................................................................................................................8

3

TEORETICKÁ ČÁST ......................................................................................................9 3.1

3.1.1

Úvod .................................................................................................................9

3.1.2

Rozdělení retinoidů a jejich charakteristika ........................................................9

3.1.3

Přirozené retinoidy ..........................................................................................10

3.1.4

Metabolismus retinoidů ...................................................................................11

3.1.5

Vyuţití retinoidů v praxi ...................................................................................12

3.2

Úvod ...............................................................................................................13

3.2.2

Metody analýzy v proteomice ..........................................................................13

3.2.3

Základní úkony v laboratoři proteomiky ...........................................................17

3.2.4

Proteinové profilování......................................................................................23

Vyuţití proteomiky ve výzkumu karcinomu prsu .....................................................24

3.3.1

Úvod ...............................................................................................................24

3.3.2

Analýza tkáňových biopsií ...............................................................................24

3.3.3

Nádorové onemocnění prsu ............................................................................24

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................26 4.1

Analyzovaný buněčný materiál ...............................................................................26

4.2

Buněčné kultury .....................................................................................................26

4.3

Separační metody ..................................................................................................26

4.3.1

1D elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (1D PAGE) ..................................26

4.3.2

2D elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (2D PAGE) ..................................27

4.3.3

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) ...........................................28

4.4

Zpracování proteinů ...............................................................................................28

4.4.1

Separace proteinů z gelu ................................................................................29

4.4.2

Promývaní kousků gelu: ..................................................................................29

4.4.3

Redukce a alkylace .........................................................................................29

4.4.4

Enzymatické štěpení v gelu .............................................................................29

4.4.5

Extrakce peptidů hydrogenuhličitanem amonným ...........................................29

4.4.6

Extrakce peptidů acetonitrilem ........................................................................29

4.5 6

Proteomika .............................................................................................................13

3.2.1

3.3

4

Retinoidy ..................................................................................................................9

Identifikace proteinů ...............................................................................................30

5

VÝSLEDKY DISKUZE ..................................................................................................31 5.1

Vyhodnocení 1D gelové elektroforézy ....................................................................31

5.1.1 5.2

Charakteristika 1D gelů ...................................................................................31

Vyhodnocení HPLC ................................................................................................33

5.2.1

C18 RCP .........................................................................................................33

5.2.2

SEC HPLC ......................................................................................................34

5.3 ....................................................................................................................................34 5.4

Vyhodnocení 2D gelové elektroforézy ....................................................................35

5.4.1

Charakteristika 2D gelů ...................................................................................35

6

ZÁVĚR ..........................................................................................................................40

7

ZDROJE .......................................................................................................................41

8

ZKRATKY .....................................................................................................................47

7

1

ÚVOD

Chemoprevence je snaha zablokovat, zvrátit či oddálit vznik nádorů za vyuţití farmakologických prostředků nebo přirozených látek. Jelikoţ je kancerogeneze zdlouhavý několikastupňový proces, můţe být velmi obtíţné zachytit počáteční stádia změn. V praxi se chemopreventivní léčba doposud soustřeďovala na pacienty s jiţ odstraněným nebo vyléčeným tumorem. Nejnovější studie však poukazují na význam chemoprevence v širším slova smyslu. Byla zkoumána účinnost většího mnoţství látek, nicméně pouze několik z nich je vhodných pro klinické účely. Nenádorové buňky jsou řízeny vnějšími podněty a reakcemi či interakcemi, které probíhají v samotné buňce. Naproti tomu nádorová buňka se nekontrolovatelně dělí a přestává být citlivá na obranné podněty z okolí. Toto nadměrné dělení můţe vyvolat destrukci okolní tkáně nebo uvolnění samotné buňky a její metastázi. Ukázalo se, ţe jednou z účinných látek v boji s rakovinou jsou retinoidy, které jsou schopné inhibovat nádor prsní ţlázy v raných stádiích nemoci. Pokusy jsou však prozatím na úrovni klinického bádání.

2

CÍL PRÁCE

Cílem této bakalářské práce bylo pomocí laboratorních metod pouţívaných v proteomice přinést poznatky o změnách, které probíhají v zastoupení proteinů v karcinomových buňkách. Zájem byl především směřován na to, jakým způsobem mohou retinoidy zvýšit či sníţit mnoţství vybraných proteinů či skupiny proteinů.

8

3

TEORETICKÁ ČÁST

3.1 3.1.1

Retinoidy Úvod

Mezi látky schopné modifikovat odpověď hostitele na kancerogenezi patří rovněţ vitamin A, který se řadí do třídy biologicky aktivních sloučenin známých jako retinoidy [1]. V roce 1982 Mezinárodní unie pro čistou a uţitou chemii (IUPAC) zařadila retinoidy do kategorie látek sloţených ze čtyř isoprenových jednotek, které jsou navzájem spojené způsobem „hlava-pata“ [2]. Od té doby se značně rozšířily naše poznatky o jejich výskytu, metabolismu a funkci. Retinoidy jsou zapojeny do sloţitých fyziologických procesů a vývojových reakcí v mnoha tkáních vyšších obratlovců. Tvoří součást embryonálního vývoje, procesu vidění, rozmnoţování, tvorbu kostí a krvetvorby. Do značné míry také ovlivňují metabolismus, růst a diferenciaci různých typů buněk, apoptózu a proces kancerogeneze. [3,4]. Z hlediska chemopreventivních účinků jsou retinoidy nejvíce prostudovanou skupinou látek. Některé retinoidy byly také připraveny synteticky. Cílem bylo získat účinnější přípravky, které by byly zároveň méně toxické. Je známo více neţ 100 různých derivátů, avšak význam byl prokázán jen u několika z nich. [5,6]. 3.1.2

Rozdělení retinoidů a jejich charakteristika

V dnešní době jsou retinoidy rozdělovány do tří skupin. První generace zahrnuje především tretinoin (kyselina retinová) a isotretinoin (kyselina 13-cis-retinová), coţ jsou nearomatické sloučeniny. V druhé generaci nalezneme monoaromatické retinoidy jako například etretinát či acitretin, které se dnes vyuţívají hlavně k léčbě těţkých forem psoriázy. Třetí generace zahrnuje nově syntetizované polyaromatické retinoidy často označované jako arotenoidy. Zde můţeme zařadit adapalen nebo tazaroten. Je známo, ţe biologická dostupnost většiny retinoidů můţe být zvýšena v případě, ţe jsou přijímaný současně s tučnou potravou. Retinoidy prochází placentou a jsou také vylučovány v mateřském mléce, jak ukázaly experimenty na zvířatech. Klinické vyuţití je doposud limitováno skutečností, ţe tyto látky mohou ve vyšším mnoţství působit jako teratogeny [6].

9

Obr. 1: Významné retinoidy [7]

3.1.3

Přirozené retinoidy

Základní stavební jednotkou přirozených retinoidů je vitamin A sloţený z nearomatické cyklické struktury a bočního polyprenoidního řetězce, který je zakončen karbonylovou funkční skupinou. Tato struktura způsobuje jednak náchylnost retinolu k metabolickým přeměnám a proteinovým interakcím, jednak ovlivňuje jeho vlastnosti detergentu a zvyšuje citlivost k oxidaci a UV záření [8]. Kulinárními úpravami dochází k jeho ztrátám [9]. Retinol se v tkáních nejčastěji vyskytuje v esterifikované formě, která chrání hydroxylové skupiny před oxidaci a má zásadní vliv na fyzikální vlastnosti molekuly [10]. Přirozené retinolové metabolity obsahují all-trans –, 9-cis – a 13-cis retinové kyseliny, z nich největší biologickou aktivitu a stabilitu má all-trans konfigurace. V buňkách dochází k oxidaci all-trans retinolu na all-trans retinaldehyd a následně k jeho nevratné oxidací na all-trans retinovou kyselinu enzymy, které jsou přítomné převáţně ve střevech, játrech a ledvinách. Je také známo, ţe retinoidy mohou působit jako teratogeny a nejsou doporučovány především v těhotenství [3]. Obrázek 2 znázorňuje vzorce několika hlavních přirozených retinoidů. 10

Obr. 2: Přirozené retinoidy [11]

3.1.4

Metabolismus retinoidů

V osmdesátých letech se v endokrinologii uplatnily molekulárněbiologické metody. Díky tomu bylo moţné porovnávat sekvence receptorů pro hormony štítné ţlázy a pro steroidní hormony – a zjistilo se, ţe jsou příbuzné. Vznikl pojem rodina receptorů steroidních a tyroidních hormonů [12]. Průlomovým okamţikem ve výzkumu metabolismu retinoidů bylo pochopení mechanismu účinku superrodiny jaderných receptorů, které ve finále zahrnují receptory pro retinoidy, steroidy, hormony štítné ţlázy, vitamin D a nespočet sirotčích receptorů (orphan receptors), jejichţ ligandy nejsou dosud známé [3, 13]. Obecně můţeme říct, ţe metabolismus vitaminu A je klíčový pro dva základní biologické procesy: syntézu kyseliny retinové, která je potřebná k udrţení genové exprese a diferenciace tkání, a produkci all-trans retinaldehydu, který hraje důleţitou roli v metabolismu rodopsinu (proces vidění), kdy dochází k isomeraci all-trans retinaldehyd na 11-cis retinaldehyd [3, 14, 15]. Retinoidy jsou krví transportovány k buňkám, kde jsou vychytávány retinol vázajícími proteiny (RBP). Po vazbě na proteiny jsou transportovány do buňky, kde se poté váţí na specifické jaderné receptory. Zde dochází k oxidaci působením enzymů retinoldehydrogenasy a retinaladehydasy, jejímţ výsledkem je kyselina retinová (RA), která je nejdůleţitější sloučeninou této signální kaskády. Kyselina retinová slouţí jako hlavní ligand retinoidních receptorů v jádře. RA je transportována proteinovým nosičem do jádra buňky, kde se naváţe na receptor RAR (receptor pro kyselinu retinovou) nebo RXR (receptor X pro kyselinu retinovou), kaţdý z nich má tři podjednotky alfa, beta a gamma [6, 16]. Samotné spuštění receptorů závisí od toho, v jaké formě se RA vyskytuje. Kupříkladu na RAR se váţe pouze kyselina all-trans retinová (ATRA); oproti tomu na RXR se váţe kyselina 9-cis-retinová a 13-cis-retinová. 11

Receptory mají schopnost dimerizovat, coţ vede k jejich efektivnějšímu navázání na molekulu DNA. RXR mohou dimerizovat i s receptory jiných signálních drah, příkladem mohou být LXR (buněčný receptor v játrech) či receptory pro thyroidní hormony a vitamin D. Tyto receptory se pak váţou na úseky DNA označované jako responzivní elementy (RARE nebo RXRE), které jsou lokalizované na promotoru cílových genů a transkribované [17]. Obrázek 3 schematicky znázorňuje procesy probíhající v jádře.

Obr. 3: Jaderné procesy receptorů [18]

3.1.5

Využití retinoidů v praxi

Studie dokazují, ţe retinoidy mají schopnost inhibovat kancerogenezi a potlačovat růst nádorů či invazi do různých tkání. Tyto poznatky byly úspěšně pouţity k léčbě akutní promyleocytární leukémie a vybraných koţních onemocnění [19]. V různých stádiích nádorových onemocnění hrají rakovinové biomarkery významnou roli v detekci metastáz a slouţí jako nástroj pro stanovení nejvhodnější léčby. Jelikoţ se většinou jedná o proteinové biomarkery, patří proteomika mezi expandující obory dnešní doby. Nové metody umoţňují vědcům i lékařům posoudit fyziologické vlastností proteinů a kvantitativní změny v průběhu nebo po ukončení léčby. Všechny tyto závěry vedou k přesnější diagnostice nemoci a následné léčbě [3]. Retinoidy však také působí teratogenně a embryotoxicky v zárodečném vývoji. Studie dokazují, ţe embryonální tkáně jsou citlivé k těmto látkám patrně pro vysoké hladiny proteinových nosičů. Z tohoto důvodu není v embryu syntéza a metabolizace RA ve všech tkáních stejná, ale probíhá v tzv. zónách, kde je RA vysoce syntetizována, coţ umoţňuje postupný vývoj plodu [17, 20].

12

3.2

Proteomika

3.2.1

Úvod

Genomová revoluce a vznik proteomiky vedly k rozšíření výzkumu rakoviny. Rakovina byla dlouhou dobu chápána jako nemoc způsobená genomovou nestabilitou a poruchou růstu [21]. Pro nádorová onemocnění jsou typické změny na buněčné úrovni a funkce tkáně. Stejně jako geny mají zakódovanou svou funkci, tak i genetická porucha způsobuje dysfunkci, která se projevuje na úrovni proteinů a proteomů. V případě rakoviny mohou být tyto znaky důleţitými biomarkry pro detekci a následnou terapeutickou intervenci [22, 23]. 3.2.2

Metody analýzy v proteomice

V dnešní době se do popředí dostávají moderní instrumentální metody analytické chemie, pro které je charakteristická citlivost, rychlost a velmi často vysoká selektivita a sníţený vliv subjektivních faktorů lidské obsluhy. Metody analytické chemie se dělí na klasické a instrumentální; ty poslední se pak dále dělí dle fyzikálně.-chemické podstaty měření nebo postupu na optické, elektrochemické, separační, radiochemické a termické [23]. 3.2.2.1

Chromatografické separační metody

Principem těchto metod je oddělení sloţek obsaţených ve vzorku. Vzorek se vnáší mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze – stacionární a mobilní. Pohyb mobilní fáze způsobuje unášení vzorku přes fázi stacionární. Jednotlivé sloţky vzorku se mohou zachytit v nepohyblivé fázi, coţ způsobí postupnou separaci vzorku [24]. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC – High Performance Liquid Chromatography) je separační metoda, jejíţ podstatou je dělení analýz mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze [25]. Základem iontově výměnné chromatografie (IEC – Ion Exchange Chromatography) je vratná výměna iontů mezi roztokem a tuhou fázi (ionexem). Tuhá fáze je zpravidla makromolekulární matrice (polystyren, dextran, celulosa apod.), která obsahuje vhodné funkční skupiny kyselé nebo zásadité povahy. V gelové permeační chromatografii (GPC – Gel Permeation Chromatography) jsou molekuly oddělovány dle své velikosti. Při průchodu kolonou jsou molekuly sloţek zadrţovány v důsledku permeace do rozpouštědlem naplněných pórů [24]. 3.2.2.2

Elektromigrační separační metody

Separace těmito metodami je zaloţena na rozdílné pohyblivosti elektricky nabitých částic (iontů, micel) v jednosměrném elektrickém poli. Jakmile se nabité částice dostanou k elektrodě, je proces ukončen. Postup je pouţitelný pro široké spektrum částic – od anorganických iontů po sloţité makromolekuly a koloidy [26]. 3.2.2.2.1 Elektroforéza Principem je migrace elektricky nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli, které se vytváří vkládáním konstantního napětí mezi elektrody [24]. V případě, ţe jde o zónovou elektroforézu, děj probíhá na vhodném nosiči, který je napuštěn elektrolytem (obvykle tlumivým roztokem). Nabité částice se při pohybu nosičem pohybují pomaleji, a proto je vzorek nanášen zpravidla do středu [27]. Po vloţení napětí kationty migrují k zápornému pólu, anionty ke kladnému pólu a neutrální molekuly se nepohybují [24]. 13

Sloţky pak vytváří zóny. Tato metoda se nejčastěji pouţívá k separaci koloidních částic a makromolekulových iontů [26]. Dvojrozměrná elektroforéza kombinuje dva postupy. Nejprve dojde k separaci vzorku proteinu metodou isoelektrické fokusace podle izoelektrických bodů v gradientu pH. V kolmém směru jsou pak proteiny rozděleny SDS-elektroforézou podle velikosti. Na velkých gelech lze detekovat aţ několik tisíc nejpočetnějších proteinových skvrn, co jiţ představuje významnou část proteomu [28]. 3.2.2.2.2 Kapilární elektroforéza Kapilární elektroforéza (CE – Capillary Electrophoresis) je obměnou elektroforézy, jeţ se provádí jako volná elektroforéza bez nosiče v tenké kapiláře [27]. Vlásečnice z taveného křemene je naplněna základním elektrolytem, který vede proud, a její konce jsou ponořeny do zásobníku s elektrolytem, společně s elektrodami z inertního materiálu [24]. Elektroosmotický tok rozhoduje o směru pohybu kapaliny. V neutrálním aţ zásaditém prostředí pufru se silanolové skupiny na vnitřním povrchu kapiláry deprotonizují a vytváří se záporný náboj stěny. Pufr naopak nabývá kladného náboje, coţ v elektrickém poli vede k velkému toku kationtů pufru směrem k záporné elektrodě [24, 27]. Ten s sebou strhává veškerou kapalinu. Vzniklý tok je natolik silný, ţe nese ke katodě i anionty. Neutrální částice se pohybují stejně rychle jako elektroosmotický tok a nabité částice buď rychleji (kationty) nebo pomaleji (anionty) v závislosti na své elektroforetické pohyblivosti [27]. SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE) rozděluje proteiny na základě molekulové hmotnosti [24]. Princip SDS-PAGE separace je podrobněji popsán v jedné z dalších kapitol. 3.2.2.2.3 Kapilární elektrochromatografie Rychle rozvíjející se technikou je mezi jinými i kapilární elektrochromatografie (CEC – Capillary ELectrochromatography), která slučuje principy kapilární elektroforézy a HPLC. Tato metoda je aplikovatelná pro neutrální, ale i nabité látky nejrůznějšího chemického charakteru. Je také vysoce účinná pro nepatrná mnoţství vzorků, a proto našla široké uplatnění v biochemii, farmakologii či chemii ţivotního prostředí [24]. 3.2.2.2.4 Izotachoforéza Izotachoforéza (ITP – IsoTachoPhoresis) je elektroforéza v diskontinuálním elektrolytickém systému. Vzorek je nanášen mezi dva elektrolyty s odlišnou pohyblivostí iontů. Separují se buď jenom kationty, nebo jenom anionty [27]. V případě ţe separujeme kationty, vzorek je vnášen mezi vedoucí elektrolyt, jehoţ kationty mají vyšší pohyblivost, a koncový elektrolyt, jehoţ kationty mají niţší pohyblivost neţ kterýkoli z kationtů vzorku. Vedoucí elektrolyt je na začátku izotachoforézy obsaţen v katodovém prostoru a v koloně, koncový elektrolyt se nachází v anodovém prostoru. Vzorek se začne dělit, jakmile je připojeno stejnosměrné napětí, které je udrţováno konstantní řádově 102 µA. Rychlejší kationty se dostávají do popředí a pomalejší se opoţďují. Po určité době se ustálí stacionární stav, ve kterém jsou jednotlivé kationty seřazeny dle klesající elektroforetické pohyblivosti kationtů [24].

14

3.2.2.3

Hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie vyuţívá ionizaci molekul, následnou separaci a detekci iontů pro charakteristiku sloţek, kvantitativní analýzu a analýzu struktury. Hmotnostní spektrum je závislost proudu iontů od poměru relativní hmotnosti a počtu elementárních nábojů iontů (m/z). Jako základní jednotka hmotnosti byla zavedena jedna dvanáctina hmotnosti izotopu 12C, coţ odpovídá hodnotě 1,66053·10 -27 kg. Zařízení pro získávání hmotnostního spektra se nazývá hmotnostní spektrometr a skládá se z napouštěcího zařízení, iontového zdroje, urychlovače, separátoru, detektoru a vakuového systému. Hmotnostní spektrometrie je rozdělena do několika kategorií podle způsobu ionizace. Ta můţe vznikat například působením elektrostatického pole (FI – Field Ionisation), desorpci laserem za přítomnosti matrice (MALDI – Matrix-assisted laser desporption/ionisation) nebo pevných částic (SALDI), ionizací elektrosprejem (ESI) či termosprejem (TSI). Díky novým technologiím umoţňují hmotnostní analyzátory separovat v čase a v prostoru směsi iontů o různých hmotnostech. Existuje několik druhů hmotnostních analyzátorů – kvadrupólový analyzátor, iontová past či průletové analyzátory (TOF) [29]. 3.2.2.3.1 Laserová desorpce a ionizace za účasti matrice MALDI se řadí mezi měkké ionizační metody, jejichţ základem je tvorba molekulárních iontů analytu, naopak stupeň fragmentace analytu je nízký. Vzorek se smíchá s matricí na MALDI destičce a následně je ozařován laserem. Při tomto procesu dochází k ionizaci molekul matrice a molekuly vzorku jsou ionizovány přenosem protonů z matrice, která zabraňuje rozpadu vzorku a napomáhá k jeho odpaření a ionizaci Elektrické pole vzniklé ionty přitahuje do hmotnostního separátoru, kterým často bývá průletový analyzátor (TOF – Time-of-Flight). Rychlosti průletu iontů jsou závislé na poměru m/z. Velkou výhodou analyzátoru je schopnost detekce molekul bez teoretického limitu m/z a krátký čas záznamu spektra [29, 30, 31].

Obr.4: Nejčastěji využívané matrice pro MALDI [32]

3.2.2.3.2 Laserová desorpce a ionizace s modifikací nosiče vzorku Technika SELDI (Surface enhanced laser desorption/ionization) je modifikací metody MALDI. Molekuly na základě svých fyzikálně chemických vlastnosti reagují s povrchem terčíku (spotu), který pokrývá povrchově aktivní látka. Mezi nejčastěji vyuţívané aktivní 15

povrchy řadíme povrchy hydrofobní, hydrofilní, anexy, katexy, povrchy pro navázání molekul, které se váţou na měďnatý kation, či povrchy s navázanou specifickou protilátkou vázající molekuly proteinů nebo například DNA [33]. 3.2.2.3.3 Kvadrupolový analyzátor Kvadrupolový analyzátor je sloţen ze čtyř rovnoběţných tyčových elektrod. Na kaţdou z nich je přiváděno stejnosměrné napětí a současně radiofrekvenční pole. Hodnoty těchto dvou sloţek předurčují trajektorii drah, po kterých se budou mezi tyčemi pohybovat ionty s určitou hodnotou m/z. Zbylé ionty k detektoru neprojdou. Nastavení veličin analyzátoru se během měření postupně mění a detektor zachycuje ionty o různých hodnotách m/z [24]. 3.2.2.3.4 Kvadrupolová iontová past Princip kvadrupolové iontové pasti (QIT – Quadrupol Ion-Trap analyser) je obdobný jako u kvadrupolového analyzátoru. V tomto přístroji se však nachází pouze tři elektrody, z nichţ jedna je kruhová a dvě vyklenuté do prostoru kruhu, ve kterém se shlukuje oblak iontů. Ionty se mohou v iontové pasti zdrţet nějakou dobu a změnou nastavení veličin jsou odváděny k detektoru. Nevýhodou tohoto hmotnostního analyzátoru je větší vliv rušivých reakcí v prostoru a omezený dynamický rozsah [24, 27]. 3.2.2.3.5 Ionizace elektrosprejem Tato metoda spolu s MALDI je jednou z nejpouţívanějších technik měkké ionizace v moderní hmotnostní spektrometrii. Vzorek ve formě roztoku protéká kapilárou, na jejíţ konec je přiváděno elektrické napětí (zejména 2,5 – 5 kV) pomocí kapalinového spojení nebo pokovaného hrotu kapiláry. Protější pól se nalézá na elektrodě s otvorem, který plní funkci vstupu do hmotnostního spektrometru. Během působení elektrického pole dochází k nárůstu kladného náboje a vzniku tzv. Taylorova kuţele. Vyzařované kapky vzorku a rozpouštědla získávají stejný náboj s polaritou rovnou náboji na hrotu kapiláry. Tento fakt způsobuje pohyb částic ke vstupnímu otvoru na opačné straně. Protiproudý sušící plyn vypařuje rozpouštědlo, zároveň se zvyšuje povrchová hustota náboje. Jakmile je dosaţena limitní mez, kapka se vlivem odpuzování shodných nábojů rozpadá na menší kapky. Děj se opakuje do doby, neţ se v kapce nachází pouze nabitá molekula analytu, který prochází vstupní štěrbinou komor do hmotnostního analyzátoru [34]. 3.2.2.3.6 Tandemová hmotnostní spektrometrie Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS), známá také jako hmotnostní spektrometrie n-tého stupně (MSn), zahrnuje více kroku selekce s nějakou formou fragmentace v mezistupni [35]. Tato metoda slouţí k bliţší charakterizaci analyzovaného vzorku. Příkladem můţe být stanovení aminokyselinové sekvence či lokalizace posttranslačních modifikací. Přístroj je sloţen ze dvou hmotnostních analyzátorů spojených sériově kolizní celou. V prvním analyzátoru nejprve dojde k rozlišení mateřských (prekurzorových) iontů a k selekci jednoho z nich. Iont se následně podrobí aktivační kolizi s plynem a vzniklé (dceřiné) ionty jsou poté rozlišeny v druhém analyzátoru. Byla demonstrována hmotnostní spektrometrie 10-tého stupně, avšak v praxi se dnes vyuţívá zpravidla MS2 aţ MS3. Důvode je klesající výtěţek iontů [29].

16

3.2.3

Základní úkony v laboratoři proteomiky

Ačkoli mohou laboratoře proteomiky slouţit k různým účelům, podstata vyhodnocování je vţdy stejná. Analýza proteomu je zaloţena na sedmi základních úkonech, které jsou: 1) separace proteinů a peptidů, 2) proteinový digest, 3) jednoduchá identifikace proteinů, 4) rozlišení bílkovinných části z komplexních směsí, 5) mapování posttranslačních proteinových úprav, 6) kvantitativní analýza a v neposlední řadě 7) proteinové profilování [23]. 3.2.3.1 Kultivace buněk Buněčné kultury mají dnes široké uplatnění jak ve výzkumu, tak i ve výrobě například protilátek, bílkovinných molekul či peptidů. Vyuţití buněčných kultur v experimentální práci s sebou nese hned několik výhod oproti jiným biologickým modelům. Pokus probíhá na jediném buněčném přesně definovaném typu, výsledky nejsou ovlivněny reakcemi s jinými tkáněmi a v poměrně krátké době můţeme získat mnoţství přesně charakterizovaného homogenního materiálu. Limitujícím faktorem však můţe být neschopnost vytvořit fyziologické podmínky, coţ můţe vést k fenotypovým změnám kultivovaných buněk a ve výsledku zkreslit závěry [36]. 3.2.3.1.1 Získání buněčné kultury a primokultura Buňky pro kultivaci se odebírají především z lidí nebo laboratorních zvířat. Kultury mohou být orgánové, tkáňové nebo buněčné (buněčná kultura vzniká, kdyţ buňky opustí původní tkán a samostatně se dělí v médiu). Jako primokultura se označuje první kultura izolovaných buněk. Sekundární kultura vzniká namnoţením primární kultury a jejím přenesením do nových kultivačních nádob. Buňky jsou poté pěstovány, dokud se nezíská potřebné mnoţství pro práci. Primární kultura můţe pocházet z normální nebo nádorové tkáně. Buňky mají odlišné vlastnosti; zpravidla se lépe mnoţí a snáze kultivují nádorové buňky. Kultury zdravých buněk podléhají na rozdíl od tumorových po několika pasáţích tzv. zestárnutí kultury [36]. 3.2.3.1.2 Podmínky kultivace Nejdůleţitější částí celého procesu pěstování je vytvoření optimálních podmínek pro růst buněk. Mezi hlavní podmínky patří vhodné kultivační nádoby, sloţení média a další vlastnosti prostředí (teplota, sloţení atmosféry, relativní vlhkost). Většina buněk podléhá adhezi, tzn., roste na vhodném povrchu. Zpravidla se pouţívají skleněné nebo umělé nádobky plněné médiem s rozptýlenými buňkami. U náročnějších kultur je zapotřebí povrch potáhnout látkou, která adhezi zvýší, například kolagen, fibronektin či laminin. Vzácné buňky se nechávají vrůstat do trojrozměrného prostředí tvořené nejčastěji kolagenem. Buňky se poté přechovávají v termostatu při 37 °C. Jakmile ulpí na stěnách nádoby, začnou se dělit. U některých kultivací se přidává oxid uhličitý. Aby nedocházelo k odpařování vody z kultivačního média a tím nedocházelo ke změně koncentrace jednotlivých sloţek, udrţuje se relativní vlhkost atmosféry v hodnotách okolo 90 % [36].

17

3.2.3.1.3 Růst buněk Proces růstu buněk můţeme rozdělit do sedmi časových období, která mají rozdílnou délku. V lag-fázi dochází k mnoţení buněk. Tato část růstové křivky je z praktického hlediska neţádoucí, a proto je nutné vytvořit optimální podmínky, aby se zkrátila na minimum. Nejdůleţitější fází je naopak fáze exponenciálního růstu, kdy jsou buňky nejaktivnější. Jakmile buňky dosáhnou bodu influence – na kultivačním povrchu se vytvoří hustá vrstva buněk, dojde k zastavení mnoţení. V tomto bodě se kultura musí naředit a přenést do nové kultivační nádoby, aby nedošlo k předčasnému úmrtí buněk z důvodu nedostatku ţivin [36, 37]. Obrázek znázorňuje růstovou křivku buněk.

Obr. 5: I – lag fáze, II – fáze zrychleného růstu, III – fáze exponenciálního růstu, IV – fáze zpomalení růstu, V – stacionární fáze, VI a VII – fáze odumírání buněk [38]

3.2.3.1.4 Dělení buněčných kultur podle životnosti Nejkratší ţivotaschopnost mají primokultury. Jsou to buňky právě izolované z organismu a po umístění v kultivačním médiu přeţívají pouze některé. Zpravidla ţijí jen několik dní a významná je aţ sekundární kultura. Z primární kultury vychází buněčné kmeny, coţ jsou kultury jiţ namnoţených buněk, které však byly nejméně jednou pasáţovány (tzn. naředěny a přeneseny na nové médium). Buňky zanikají přibliţně po 50 děleních. Libovolně dlouho můţeme uchovávat buněčnou linii, která je také nazývaná permanentní linie. Tyto buňky mají schopnost neomezeně se dělit a jsou celé adaptované na podmínky in vitro. Můţe se jednat o transformované buněčné kmeny či původně nádorové buňky [36, 37]. 3.2.3.1.5 MCF-7 buňky Primární kultura buněk karcinomu prsu byla získána v roce 1970 původně z pleurálního výpotku pacientky s metastatickým onemocněním. Buňky se vyuţívají 18

především pro detekci xenoestrogenní aktivity. Tato buněčná linie se stala modelovou pro výzkum rakoviny prsu [39]. 3.2.3.2 Izolace proteinů a peptidů Pro izolaci proteinů nebo jiných biologických makromolekul je zapotřebí látky převést z homogenizovaných tkání do roztoku. V dnešní době existuje velké mnoţství extrakčních a frakčních metod. Způsob provedení je závislý na fyzikálně-chemických a strukturních vlastnostech vzorku. Zde můţeme zahrnout rozpustnost, isoelektrický bod (pI), molární hmotnost a mnoho dalších. Zásadní je, aby byly z analyzovaného vzorku odstraněny všechny rušivé elementy [40, 41]. 3.2.3.2.1 Rozrušení buněk Jednou ze základních úloh je homogenizace vzorku, coţ je postup, při kterém dokonalým promícháváním vzorku vznikne jednotná směs. Metody mohou být rozděleny do pěti hlavních skupin: mechanická, ultrazvuková a tlaková homogenizace, tepelná a chemická denaturace a osmolýza [41]. 3.2.3.2.2 Rozpuštění/Srážení proteinů Příprava vzorku je klíčovým úkonem v laboratorní práci. Kaţdý vzorek vyţaduje specifický postup, který je třeba upravit tak, aby nedošlo k proteolýze či modifikaci poţadovaných proteinů, coţ by mělo zásadní vliv na výsledek. 3.2.3.2.2.1 Organická rozpouštědla Pro extrakci rostlinných proteinů se nejčastěji pouţívá směs kyselina trichloroctová/aceton (TCA/aceton). Tato metoda byla navrţena v roce 1986 pro extrakci proteinů z různých obilovin, luštěnin a ovoce. Extrémní pH a záporný náboj kyseliny ve spojení s acetonem způsobuje okamţitou denaturaci proteinů a zastavení aktivity proteolytických enzymů. Nevýhodou je, ţe proteiny vysráţené TCA jsou obtíţně znovu rozpustné. Další rozšířenou metodou je fenolová extrakce, která je charakteristická vysokou čistotou vzorků. Na druhou stranu není tatoextrakce vhodná pro rozpuštění polysacharidů a nukleových kyselin. Dalším negativem je časová náročnost a toxicita. Proteiny získané alkoholovou extrakci jsou v další práci dobře vyuţitelné. V komerčním měřítku se nejčastěji pouţívají ethanol, isopropylalkohol a butanol. Nevýhodou je, ţe během této metody můţe docházet ke koagulaci proteinů a tím k ovlivnění jejich vlastností. 3.2.3.2.2.2 Vodné roztoky Vzhledem k rostoucím obavám o ţivotní prostředí se v posledních letech rozšířila extrakce vodními roztoky. Voda je z hlediska ekonomiky i bezpečnosti výhodnější neţ alkoholy. 3.2.3.2.2.3 Enzymové extrakce Tyto metody kombinují vodní a enzymovou extrakci. Enzymy mají schopnost sniţovat aktivační energii reakce, coţ umoţňuje práci za mírných podmínek s vysokými výtěţky proteinů. Nevýhodou je cena enzymů [41]. 19

Obr. 6: Schematické znázornění izolace proteinů a peptidů

3.2.3.3 Separace proteinů a peptidů Většina analýz začíná se směsicí vzorků, a proto je zapotřebí provézt separační kroky. Gelová elektroforéza, z níţ nejúčinnější metoda v dnešní době je 2-D elektroforéza, byla pouţita jako analytická metoda jiţ na konci 70. let. Avšak hojně vyuţívána v postupech byla teprve poté, co se zdokonalily metody pro přípravu vzorků proteinů a sekvenování [42]. SDS-Polyakrylamidová Gelová Elektroforéza proteinů (SDS-PAGE) je metoda, při které hydrofobní konec molekuly SDS (sodium dodecylsulfát) silně interaguje s proteinovým řetězcem. Počet molekul SDS, které se váţí na protein je úměrný délce proteinu. Neredukované proteiny váţí 0,9-1,0 g SDS na protein). Kaţdá molekula SDS přispívá negativním nábojem a samozřejmě překrývá případný náboj proteinu. Tato skutečnost dovoluje oddělovat vzorek pouze podle molekulové hmotnosti (velikosti), nikoli podle náboje, protoţe konečný náboj proteinu po asociaci s SDS je vţdy negativní a úměrný velikosti proteinu. Jiným pozitivem SDS je, ţe ruší terciární strukturu protein. V případě, ţe navíc pouţijeme při přípravě vzorku β-merkaptoethanol, který přerušuje disulfidické vazby v proteinu, vzniknou tzv. redukované proteiny, které jsou schopné na sebe vázat větší mnoţství SDS (1,4 g SDS na protein) [45]. Po nanesení vzorku na gel a umístění gelu do elektrického pole, dochází k migraci proteinu ke kladné elektrodě (anodě). Obrázek schematicky popisuje působení SDS.

20

Obr. 7: Působení SDS při gelové elektroforézi [43]

Další uţitečnou metodou separace intaktních bílkovin je 1D-SDS-PAGE. Běţně se vyuţívá v biochemických a biologických laboratořích. Tato metoda je uţitečná pro dělení sloţitějších proteinových komplexů [23]. Isoelektická fokusace se provádí v jednom směru (rozměru), kdy jsou látky separovány zleva doprava na základě svých isoelektrických bodů (pI) [44]. 3.2.3.4 Enzymatické štěpení proteinů Enzymatické štěpení nebo také trávení (enzymatic digestion/cleavage) je nutný krok pro samotnou identifikaci proteinů. Je to děj, při kterém dochází k narušení peptidické vazby dle pouţitého enzymu. Vzniká směs peptidů (tzv. digest), která má charakteristický „otisk“ analyzovaného proteinu. Výhodou samotné metody je sníţení poměru m/z z vysokých hodnot do oblasti nízkých hodnot m/z. Výsledkem jsou pak kvalitnější a přesnější hmotnostní spektra. Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS) umoţňuje nejlépe identifikovat peptidy o délce 5-30 aminokyselin. Ačkoli existují dva způsoby štěpení proteinů – 21

enzymatický a neenzymatický, enzymové štěpení nabízí větší škálu moţností štěpení za mírných podmínek. Nejuţívanější proteázou je Trypsin, který je dostupný ve vysoké čistotě a za přijatelnou cenu. Jeho výsledky štěpení jsou excelentní zejména pro Lysin a Arginin. Dále se v praxi vyuţívá chymotrypsin, který za stějných podmínek jako trypsin štěpí peptidy hlavně v místech Phenylalaninu, Tyrosinu, Tryptofanu a Leucinu. V některých postupech se pro štěpení kyseliny glutamové rovněţ můţe aplikovat proteáza V8 pocházející z grampozitivní bakterie Staphyloccocus aureus [23]. 3.2.3.4.1 Enzymatické štěpení v gelu Štěpení v gelu se pouţívá především pro separaci proteinů z 2D gelů. Výhodou tohoto postupu je ukotvení proteinů v gelu, takţe nedochází k jejich modifikaci. Nevýhodou však je, ţe póry gelu ztěţují dostup enzymu k proteinu, a proto trávení probíhá delší dobu. Je také nutné pouţít větší mnoţství enzymu a vzniklé naštěpené fragmenty je zapotřebí extrahovat z gelu opakovaným pouţitím acetonitrilu. Všechny tyto faktory mohou mít negativní dopad na výtěţnost. 3.2.3.4.2 Enzymatické štěpení v roztoku Dochází-li ke štěpení vzorku v roztoku, není protein nikde zachycen. Je proto volně dostupný pro enzym, který v tomto případě nemusí být v nadbytku a produkty není třeba extrahovat. Klesá také autolýza trypsinu. Nevýhodou je vyšší riziko vzniku modifikací proteinů, protoţe dodaná činidla zůstávají se vzorkem v roztoku [45]. 3.2.3.5 Jednoduchá identifikace proteinů Rozštěpení vzorky peptidů jsou analyzovány metodami hmotnostní spekrometrie [42]. Většinou se jedná o analýzu pomocí MALDI-TOF hmotnostního spektroskopu, kdy jsou peptidy umístěny na matrix. Vzniklé krystalky jsou ionizovány pomocí laseru a nárůst napětí matrix způsobí jejich vyraţení proti detektoru. Čas, za který ion dorazí k detektoru, je závislý na hmotnosti iontu; větší částice letí delší dobu. Takto získána hmotnostní spektra jsou dále analyzována pomocí metody zvané peptide mass fingerprinting (PMF). Principem této metody je porovnávání získaných spekter s „virtuálními“. Počítačový program přenese informace z genomu do proteinů, teoreticky je štěpí na peptidy a vypočítá jejich hmotnostní spektra. Finální fázi je porovnání hmotnostních spekter neznámých proteinů se spektry všech peptidů, které kóduje genom [23]. 3.2.3.6 Rozlišení bílkovinných části z komplexních směsí Většina separačních metod se provádí pomocí 2D-SDS PAGE s MS nebo MS/MS identifikaci sekvence daného peptidu. Tento potup je však pracný a obtíţný pro automatizaci [45]. Problém nastává v případě identifikace multiproteinových komplexů, protoţe metoda není pouţitelná pro všechny druhy proteinů. Stanovení je například nemoţné pro menší počet proteinů neţ 2 a větší neţ 50, také extrémně kyselé nebo bazické proteiny či vzorky obsahující větší počet nespecificky vázaných proteinů v různých mnoţstvích [23]. Vhodnou alternativou se stala metoda kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní chromatografii (LC-MS-MS), která umoţňuje práci v systémech s normálními i obracenými fázemi prakticky bez omezení průtoku a sloţení mobilní fáze od 100 % organické sloţky do 100 % vody. Tato metoda je hojně uţívaná v oblasti klinické chemie pro stanovení látek v tělních tekutinách [23]. 22

3.2.3.7 Mapování posttranslačních proteinových úprav Posttranslační úpravy proteinů jsou součásti mnoha biologických procesů a zkoumání jejich rozmanitostí je rozhodující pro pochopení mechanismu regulace buněk. MS je základním nástrojem pro detekci a mapování kovalentních modifikací (nejčastěji fosforylace a defosforylace) a kvantifikaci jejich změn [46]. MS-MS spektra poskytují informace o sekvenci peptidů a zároveň o hmotnosti a poloze modifikované skupiny. Ačkoli MS měření rovněţ poskytují důkaz o modifikaci, pouze MS-MS můţe potvrdit sekvenční pozici. Jakmile jsou získána spektra modifikovaných peptidů, zbývá určit, která odpovídají upraveným částem. Dostupné databáze pro identifikaci proteinů jako například Sequest a Mascot umoţňují uţivateli určit fixní a variabilní úpravy, to však vyţaduje znalost molárních hmotností a sekvenčních specifik modifikací [47]. Obecně vyhodnocování tohoto typu výsledků je časově nejnáročnější části práce [23]. 3.2.3.8 Kvantitativní analýza Nemalou část laboratorní práce tvoří kvalitativní analýza vzorku. Cílem vyhodnocení je kvantifikace změn v proteinech, která můţe být provedena pomocí 2D gelové elektroforézy, kdy jsou navzájem porovnávány dva gely. Přesnější a sofistikovanější je v tomto směru 2D diferenční gelová elektroforéza, kdy jsou vzorky označeny různými fluorescenčními barvivy a následně jsou analyzovány [23]. 3.2.4

Proteinové profilování

Proteinové profilování je rychle rozvíjející se technika. Cílem je získání hmotnostních spekter, které představují intaktní bílkoviny přítomné ve vzorku. Metoda se pouţívá nejčastěji u séra a tkáňových vzorků, ale je pouţitelná pro jakékoliv sloţité vzorky [23].

23

3.3 3.3.1

Využití proteomiky ve výzkumu karcinomu prsu Úvod

Rozluštění lidského genomu způsobilo revoluci v biologii a medicíně. Velkým přínosem v oblasti proteomiky a funkční genomiky byl prudký nárůst nových a výkonných technologií, které přináší slibnou budoucnost pro léčebné postupy v kaţdodenní klinické praxi. Vzhledem k tomu, ţe je rakovina onemocnění postihující značnou část populace na celém světě, je vyvíjeno velké úsilí v této oblasti. 3.3.2

Analýza tkáňových biopsií

Pro analýzu komplexních a heterogenních vzorků tkáně, které jsou často sloţeny z různých buněk, se dnes pouţívá 2-D elektroforéza. Ta odděluje proteiny na základě jejich molekulové hmotnosti a izoelektrických bodů [48]. Metoda se skládá ze tří hlavních bodů – příprava vzorku, isoelektrická fokusace (IEF), polyakrylamidová elektroforéza a vizualizace obrazu. Výsledkem je dvourozměrná proteinová mapa, která má souřadnice pI a Mr. Mapy vzorků mohou být dále porovnávány a z toho je moţné vyvodit závěry týkající se hladin proteinů v jednotlivých vzorcích. Samotná identifikace je zpravidla prováděná pomocí hmotnostní spektrometrie. Negativem je časová a manuální náročnost. Problémovou oblastí je také analýza extremních proteinů – příliš malé, velké, bazické nebo kyselé. Také proteiny s příliš nízkou koncentraci nemusí být po obarvení gelu vůbec detekovány či mohou být překryty spoty hojněji zastoupených proteinů [49]. 3.3.3

Nádorové onemocnění prsu

Rakovina byla nejvýznamnější příčinou úmrtí v roce 2010 ve všech členských státech EU. Mezinárodní klasifikace nemocí (MKN) uvádí, ţe mezi nejčastější formy rakoviny patřily maligní nádory hrtanu, průdušnice, průdušek a plic, tračníku a prsu. Nejvíce postiţenou skupinou byli obyvatelé Maďarska, Slovenska, Polska, Slovinska, České republiky, Litvy a Lotyšska. Mamografický screening je dnes nejrozšířenějším nástrojem pro včasné odhalení rakoviny prsu a významně sniţuje mortalitu karcinomu prsu [50]. Mezi parametry stěţejní pro výběr vhodné systémové terapie patří například zhodnocení stavu lymfatických uzlin, velikost nádoru a jeho histologický stupeň či věk v kombinaci s prediktivními faktory jako jsou estrogenové a progesteronové receptory [51]. Adjuvantní systémová léčba (chemoterapie nebo/a endokrinní terapie) je zvaţována u pacientů, u kterých se předpokládá citlivost k cytostatikům. Další skupinu tvoří pacienti s recidivujícími formami národů. Výsledky chemoterapie závisí mimo jiné na typu nádoru a celkové tělesné kondici nemocného. Jelikoţ jsou reakce pacientů na léčbu odlišné, je zapotřebí ke kaţdému přistupovat individuálně [52]. I kdyţ léčba vedla k významnému zlepšení prognózy pacientů, nese s sebou také významné mnoţství vedlejších účinku, které nepříznivě ovlivňují stav nemocného [23]. Obecně platným pravidlem v onkologické praxi je změna léčby při progresu u onemocnění. Protoţe ţádná technologie v léčbě karcinomu prsu není stoprocentní, vědci se snaţí aplikovat mnoţství poznatků z oblasti genomiky, proteomiky, funkční genomiky, buněčné biologie a bioinformatiky pro efektivnější analýzu tkáňových biopsií získaných od stejného pacienta [23].

24

Charakteristické znaky nádorů

produkce růstových signálů nekontrolovatelné dělení poškození apoptózy neomezený replikační potenciál posílení angiogeneze tvorba metastáz

Obr. 8: Grafické znázornění charakteristických znaků nádorů

25

4

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

4.1

Analyzovaný buněčný materiál

Práce byla provedena ve spolupráci se Slovenskou akademií věd v Bratislavě, která analyzovaný buněčný materiál zajistila. Vzorky dodal Ústav experimentální endokrinologie, který je její součásti. Buňky byly nakultivovány dle postupu, který je popsán níţe a buněčný lyzát poté převzal Ústav analytické chemie Akademie věd se sídlem v Brně.

4.2

Buněčné kultury

Buněčná linie MCF-7 byla udrţovány v Dulbecově roztoku (DMEM) obsahujícím 10% fetální bovinní sérum (FBS) a antibiotika (penicilin, streptomycin, gentamycin). Sérum bylo pouţito, protoţe obsahuje vysoký obsah růstových faktorů, které umoţňují lepší proliferaci buněk. Kultivace probíhala při teplotě 37 °C ve zvlhčené atmosféře s 5 % CO2 a 95 % vzduchu. Buňky byly kultivovány 10-6 M 9-cis-kyselinou (9cRA) nebo 10-6 M all-trans retinovou kyselinou, a také jejich kombinaci po dobu 48 hodin. Sloučeniny o zvolené koncentraci byly následně rozpuštěny v ethanolu a poté přidány do média, které obsahovalo určitou koncentraci ethanolu. Po inkubaci byly buňky dvakrát promyty chlazeným PBS. Lýze buněk byla provedena dle protokolu RIPA (Radio-Imunoprecipitace Assay) a buněčný lyzát byl poté uchováván při – 70 °C pro další pouţití [53].

4.3 4.3.1

Separační metody 1D elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (1D PAGE)

Vysušené vzorky byly rozpuštěny ve 150 µl vzorkovacího pufru (Leammli SampleBuffer: 62,5 mM Tris-HCl, (hodnota pH 6,8), 2% dodecylsulfát dodný, 25% glycerol, 0,01% bromfenolová modř), který byl smíchán v poměru 19:1 s β- merkaptoethanolem. Vzorky byly povařeny 5 min ve vroucí vodě a vţdy mnoţství 13 µl bylo naneseno na polyakrylamidový gel. Pro separaci proteinů byl pouţit gel firmy BIO-RAD, který se skládal ze dvou částí – separačního a zaostřovacího gelu. Separační gel (12%) byl připraven smícháním 25 ml roztoku A (A – 30 g akrylamidu + 0,8 g bisakrylamidu bylo doplněno destilovanou vodou do 100 ml), 30 ml roztoku C (9,1 g TRIS rozpuštěno v 50 ml destilované vody, následně dotitrováno na pH 8.8 a doplněno destilovanou vodou do 100 ml), 0,6 ml roztoku B (B – 10 g SDS doplněno destilovanou vodou do 100 ml), 3,8 ml destilované vody. Těsně před nalitím gelu bylo přidáno 20 µl TEMEDu a 0,15 ml roztoku F (F – 0,15 g persíranu amonného doplněny destilovanou vodou do 10 ml). Gel připravený tímto způsobem byl nalit mezi dvě skla a nechal se polymerovat. Na vrstvu separačního gelu se po ztuhnutí nalil gel zaostřovací. Zaostřovací gel byl připraven smícháním 1 ml roztoku A, 5 ml roztoku D (D – 3 g TRIS rozpuštěné v 50 ml destilované vody, směs byla následně dotitrována koncentrovanou HCl na pH 6,8 a doplněna destilovanou vodou do 100 ml), 0,1 ml roztoku B a 3,8 ml destilované vody. Těsně před nalitím gelu bylo přidáno 5 µl TEMEDu a 0,15 ml roztoku F. Roztoky A,B, a F jsou identické jako u separačního gelu. Jakmile byl nalitý zaostřovací gel, mezi dvě skla byl ihned vloţen hřebínek, který slouţí k vytvoření dávkovacích jamek v gelu. 26

Po ztuhnutí gelu byl hřebínek vyjmut a na gel byl nalit elektrodový pufr (3 gTRIS, 14,4 g glycinu a 1 g SDS byly rozpuštěny ve 1000 ml destilované vody). Pomocí mikropipety byly do jamek nanesen SDS standard a vzorky. Separace probíhala 76 minut při konstantním napětí 160 V. Gely byly obarveny Coomassie Brilliant Blue R 250. Před vlastním barvením byly gely zafixovány fixačním roztokem (36 g TCA rozpuštěno v 300 ml destilované vody) a ponechány 15 minut na třepačce. Jakmile byly gely promyty destilovanou vodou, ponořily se do barvicího roztoku (0,5 g Coomassie Blue R 250, 450 ml metanolu, 100 ml kyseliny octové a 450 ml destilované vody). Barvení probíhalo přes noc. Další den byly gely promývány odbarvovacím roztokem (250 ml metanolu, 100 ml kyseliny octové a 650 ml destilované vody) do zesvětlání.

Obr. 9: Aparatura pro gelovou elektroforézu [43]

4.3.2

2D elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (2D PAGE)

Pro tuto metodu byly pouţité stejné vzorky jako pro 1D gelovou elektroforézu. Purifikované vzorky byly rozpuštěny v 300 µl vzorkovacího pufru. IPG strip byl před pouţitím také rehydratován. Vzorky byly následně naneseny na strip (7cm strip značky ReadyStrip IPG). Isoelektrická fokusace probíhala na IPG stripech s nelineárním pH gradientem (3 – 10) na Mini-Protean TGX gelu (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Gelová elektroforéza probíhala při konstantním napětí 160 V (maximálně 50 µl/strip). Proteinové spoty byly zviditelněny barvivem Coomassie Brilliant Blue G-250 [54].

27

4.3.3

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie patří mezi separační metody, které jsou zaloţeny na odlišné distribuci dělených látek mezi dvě navzájem nemísitelné fáze. Metoda našla široké uplatnění v analytické chemii při kvalitativní i kvantitativní analýze. 4.3.3.1 Chromatografie na reverzní fázi (RCP) U tohoto typu rozdělovací chromatografie je stacionární fázi nepolární kapalina (uhlíkový řetězec C4 - C18) a mobilní fázi kapalina polární. Jako mobilní fáze zde byla pouţita směs acetonitrilu a vody. Princip této metody spočíval v tom, ţe na začátku byly látky rozpuštěny ve vodě a svými hydrofobními skupinami se zachytily na kolonu. Následně byly z kolony eluovány rostoucím gradientem koncentrace organického rozpouštědla (acetonitrilu) [55].

Obr. 10: Schéma aparatury pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii [55]

4.3.3.2 Gelová chromatografie (SEC) Tato metoda se vyuţívá pro separaci proteinů (příp. peptidů) v závislosti na jejich molekulové hmotnosti (resp. velikosti). Materiál prochází kolonou s porézním gelovým sorbentem. Komerční sloupce jsou schopny oddělit proteinové sloupce nebo peptidové směsi různých řádů [56].

4.4

Zpracování proteinů

Vzorky pro analýzu na hmotnostním spektrometru byly připraveny podle postupu Shevchenka a Fernandez-Patrona [57, 58], který byl pouţit pro 1D i 2D gelovou elektroforézu.

28

4.4.1

Separace proteinů z gelu

Po separaci byly z čistého gelu skalpelem vyříznuty spoty proteinů a blanku, který slouţil jako kontrolní pokus. Kousky byly poté nařezány na kostičky o velikosti přibliţně 1 x 1 mm a vloţeny do mikrozkumavek. 4.4.2

Promývaní kousků gelu:

Kousky gelu byly dvakrát po 15 minutách omyty ve vodě a směsi acetonitril:voda v poměru 1:1 (v:v). Mnoţství pouţité pro omytí činilo přibliţně dvojnásobek objemu gelu. Následně byla odstraněna kapalina a kousky gelu byly zality acetonitrilem, který se odstranil, jakmile došlo ke sraţení gelu. Přidáním 0,1 M hydrogenuhličitanu amonného (NH 4HCO3) došlo k dehydrataci a po 5 minutách byl přidán stejný objem acetonitrilu, aby byly gely inkubovány v roztoku 0,1 M NH4HCO3:acetonitril v poměru 1:1. Na závěr byla odstraněna veškerá kapalina a kousky gelu byly vysušeny na vakuové odparce. 4.4.3

Redukce a alkylace

Vysušené kousky se nechaly nabobtnat ve směsi 10 mM dithiothreitol a 0,1 M NH4HCO3. Proteiny byly inkubovány 45 min při 56 °C, aby došlo k redukci. Mikrozkumavky byly následně ochlazeny na laboratorní teplotu a kapalina byla odstraněna. Ihned byl přidán stejný objem 55 mM roztoku jodoacetamidu v 0,1 M NH4HCO3 a zkumavky byly inkubovány 30 min ve tmě při laboratorní teplotě. Jodacetamid byl odstraněn a částečky gelu byly promývány roztokem 0,1 M NH4HCO3:acetonitril v poměru 1:1 jako v kroku 4.4.2 aţ do odbarvení gelu. 4.4.4

Enzymatické štěpení v gelu

Gelové částice byly vysušeny ve vakuové odparce a rehydratovány při 4 °C roztokem, který se obsahoval 50 mM NH 4HCO3, 5 mM CaCl2 a 12,5 ng/µL trypsinu. Gel částečně absorboval roztok. Po 45 minutách byl supernatant odstraněn a částečky byly překryty stejným roztokem, který však jiţ neobsahoval enzym. Proteiny byly ponechány štepění při 37 °C přes noc. 4.4.5

Extrakce peptidů hydrogenuhličitanem amonným

Hlavní část peptidů byla uvolněna během nočního štěpení. Zbytek byl z gelu extrahován přidáním dostatečného mnoţství 25 mM NH 4HCO3. Po 15 minutách inkubace byl ke směsi přidán stejný objem acetonitrilu a po15 minutách byla veškerá kapalina odstraněna. Extrakce se následně ještě opakovala přidáním 5% kyseliny mravenčí. Supernatant byl přidán k hlavní části peptidů a vše bylo odpařeno na vakuové odparce. 4.4.6

Extrakce peptidů acetonitrilem

Do skleněných vilialek byly připraveny roztoky na promývání – 50% acetonitril a 0,1% TFA. Vzorky byly resuspendovány v 10 µl 0,1% TFA. Směsi byly poté důkladně homogenizovány na vortexu a ultrazvuku. Peptidy byly přeneseny do elučního roztoku (acetonitril:TFA v poměru 1:1) pomocí ZipTip C18 špiček (Millipore). Následně bylo na MALDI destičku naneseno 0,45 µl připraveného vzorku a 0,45 µl CHCA matrice a směs se nechala zaschnout. Zbylé vzorky před i po extrakci byly odpařeny a uchovány pro další pouţití. 29

4.5

Identifikace proteinů

Získaná hmotnostní spektra byla měřena na hmotnostním spektrometru AB SCIEX TOF/TOFTM 5800 (AB SCIEX, Framingham, MA, USA). Přístroj je vybaven laserem 1 kHz Nd:YAG. Hmotnostní spektra byla dále zpracována pomocí softwaru 4000 Series Explorer a údaje byly předány k vyhledávání v databázi Mascot. Proteinové identifikace byly přiřazeny pomocí taxonomie NSBInr databáze dle omezení na Homo sapiens.

30

5

VÝSLEDKY DISKUZE

Základem analýzy pomocí hmotnostní spektrometrie je kvalitní separace vzorku. Pro tuto práci byly vyuţity separační techniky jednorozměrná (1D) a dvojrozměrná (2D) gelová elektroforéza a vysokoúčinná kapalinová chromatografie. MCF-7 buňky dodané Ústavem experimentální endokrinologie v Bratislavě byly kultivovány s isomery kyseliny retinové po dobu 48 hodin se snahou zjistit rozdíly v expresi proteinů v průběhu buněčného cyklu. Proteiny byly následně extrahovány pufrem RIPA, odděleny jiţ zmíněnými metodami a stanovovány [53].

5.1 5.1.1

Vyhodnocení 1D gelové elektroforézy Charakteristika 1D gelů

Jako první metoda byla provedena 1D gelová elektroforéza, jejíţ principy uţ byly popsány v předchozích kapitolách. Rozdělení proteinů touto metodou bylo patrné, ne však dostačující pro tuto práci. Můţeme však tvrdit, ţe proteinové zastoupení ve vzorcích bylo stejné. Spoty proteinů určené pro další proteomické analýzy byly vybrány z oblastí 97,4 kDa – 45 kDa (Obr.11), kde se jevil náznak určitých kvalitativních rozdílů.

Obr. 11: Separace vzorků inkubovaných v různých prostředích pomocí SDS-PAGE

31

Spot

Protein

heat shock protein HSP 90-beta 1.

heat shock protein HSP 90-alpha isoform 1

Označení

Počet

Pokrytí

(Da)

peptidů

(%)

gi|20149594

83554

11

17

gi|153792590

98670

5

7

gi|1082886

75694

1

2

gi|5729877

71082

6

14

gi|6729803

41973

6

20

gi|62897129

71083

8

16

gi|30311

47305

3

7

Součást cytoskeletu,

gi|24234699

44079

5

14

Součást cytoskeletu

gi|4507953

27899

3

16

gi|291463695

28225

2

8

v databázi

Hmotnost

tumor necrosis factor type 1

receptor

associated

protein TRAP-1 - human heat shock cognate 71 kDa protein isoform 1 2.

chain A, atpase domain of human heat shock 70kDa protein 1 heat shock 70kDa protein 8 isoform 1 variant

3.

4.

cytokeratin 18 (424 AA) keratin, type I cytoskeletal 19

14-3-3 protein zeta/delta 5.

chain A, binary complex of 14-3-3 sigma and P53 Pt387-peptide

Obr. 12: Přehled identifikovaných proteinů

32

Funkce

Molekulární chaperon, chaperonová aktivita Molekulární chaperon, chaperonová aktivita Procesy apoptózy, vazba ATP Molekulární chaperon, chaperonová aktivita Molekulární chaperon, chaperonová aktivita Molekulární chaperon, chaperonová aktivita

Regulace signálních dráh Regulace signálních dráh

5.2 5.2.1

Vyhodnocení HPLC C18 RCP

Chromatografie na reverzní fázi byla provedena na koloně C18 Poroshell 300SB (2,1 x 7,5 mm, 5 um, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Chromatografická separace byla provedena za pouţití lineárního gradientu 30 – 60% acetonitrilu (ACN) po dobu 4 min. Průtok mobilní fáze byl nastaven na 1 ml/min, teplota sloupce činila 45 °C a separace probíhala 30 min. Jednotlivé frakce byly sesbírány, zakoncentrovány pomocí vysokorychlostní odparky, podrobeny enzymatickému štěpení v roztoku a analyzovány pomocí MALDI a následně identifikovány.

Obr. 13: Znázornění jednotlivých frakcí RCP pomocí chromatogramu

33

5.2.2

SEC HPLC

Vzorky byly také isokraticky separovány na vylučovací koloně BioSEC-3 (7,8 x 150 mm, 3 µm; Agilent Technologies). Průtok byl nastaven na 1 ml/min a teplota sloupce činila 25 °C. S jednotlivými frakcemi bylo postupováno stejně jako u předchozí metody. Čas separace byl 30 min.

5.3 Obr. 14: Znázornění jednotlivých frakcí SEC pomocí chromatogramu

34

5.4 5.4.1

Vyhodnocení 2D gelové elektroforézy Charakteristika 2D gelů

Na závěr byla pouţita metoda 2D PAGE, která účinněji oddělila vzorky. Postup se pouţívá zejména pro identifikaci většího mnoţství proteinů. Jako kontrolní vzorek slouţily buňky karcinomu prsu (MCF-7 buněčná linie), které byly porovnávány s buňkami inkubovanými nejprve s jednotlivými retinoidy a poté s jejich směsí. Rozdíly ve výsledných gelech byly na první pohled patrné. Pro identifikaci byly vybrány oblasti s největšími kvalitativními i kvantitativními změnami mezi jednotlivými vzorky. Všechny proteinové spoty byly vyříznuty, podrobeny štěpení v gelu a analyzovány pomocí MALDI TOF MS. Identifikované proteiny byly porovnávány s kontrolním vzorkem. Pozornost byla zaměřena zejména na proteiny, u kterých byl zaznamenaný nárůst či pokles v důsledku ošetření retinoidy.

Obr. 15: Zaznačení jednotlivých proteinů na 2D-PAGE výstupu kontrolního vzorku

35

1)

3)

2)

4)

Obr. 16: Výstupy z 2D-PAGE ošetřených buněk po dobu 48 hodin a kontrolního vzorku: 1) kontrolní vzorek, 2) 9cRA, 3) ATRA a 4) kombinované.

36

Identifikované protein histone H4 profilin-2 isoform b tropomyosin alpha-4 chain isoform 2 cathepsin D preproprotein cytokeratin 8 (279 AA) Chain B, Structure Of Nedd8 Chain B, Crystal Structure Of Human Nucleosome Core Particle Containing H4k31q Mutation heat shock protein 27 Chain A, Rotamer Strain As A Determinant Of Protein Structural Specificity keratin 1 peroxiredoxin-1 Chain A, Secypa Complexed With Hagpia histone H3 Chain A, Crystal Structure Of Human Nucleosome Core Particle Containing H3k79q Mutation Chain A, Structure And Influence On Stability And Activity Of The N- Terminal Propetide Part Of Lung Surfactant Protein C stathmin isoform a 40S ribosomal protein S24 isoform c heat shock cognate 71 kDa protein isoform 1 ubiquitin Chain A, Synthetic Ubiquitin With Fluoro-Leu At 50 And 67 40-kDa keratin protein, partial cytokeratin 18 (424 AA) keratin, type II cytoskeletal 78 keratin 10 hCG21219 alpha-tubulin protein disulfide isomerase

Označení v databázi

Hmotnost [kDa]

gi|4504301 gi|4505751 gi|4507651 gi|4503143 gi|30313 gi|4558043 gi|347447327 gi|662841 gi|159162145 gi|7331218 gi|4505591 gi|2981743 gi|1568559 gi|347447296

11360 15078 28504 44524 30840 8555 11641 22313

gi|253723240 gi|5031851 gi|4506703 gi|5729877 gi|229532 gi|31615803 gi|386803 gi|30311 gi|89357932 gi|623409 gi|119620305 gi|37492 gi|860986

3614 17292 15413 70854 8446 8555 44065 47305 56830

8560

65978 22096 17790 15332 15676

106838 50126 56644 37

tubulin alpha-8 chain isoform 1 tubulin 5-beta 90kDa heat shock protein Chain A, Hsp90 N-Terminal Domain Bound To Adp-Mg Triosephosphate isomerase Heat shock 70kDa protein 9 (mortalin)

gi|9507215 gi|35959 gi|306891 gi|3891633 gi|136066 gi|12653415

Obr. 17: Vybrané identifikované proteiny označené jako potenciální biomarkery karcinomu prsu

Obr. 18: Hmotnostní spektra Hsp

38

50062 49599 83242 25626 26609 73682

Obr. 19: Aminokyselinová sekvence HSP90 proteinu

39

6

ZÁVĚR

Cílem této bakalářské práce bylo prováděním proteomických metod přispět k pochopení změn v zastoupení proteinů v karcinomových buňkách. Pozornost byla zaměřena především na to, jak isomery kyseliny retinové ovlivňují expresi sledovaných proteinů. Po ošetření buněk retinoidy byly separačními metodami dokázané významné změny v četnosti výskytu specifických biomarkeru karcinomu prsu. Všechny metody dokázaly přítomnost molekulových chaperonů, jejichţ zvýšena aktivita přispívá ke stabilizaci nádorových buněk. Úspěšně bylo vyuţito několik separačních technik včetně 1D a 2D gelové elektroforézy, chromatografie na reverzní fázi a SEC HPLC. Primárně se vyuţívala SDS-PAGE pro separaci proteinů společně se štěpením v gelu a analýzou pomocí MALDI -TOF MS. První metodou pouţitou pro stanovení proteinů v buňkách byla 1D gelová elektroforéza. Ačkoli nebyly výstupy z 1D gelů dostatečně obsáhlé pro tuto práci, objevila se v gelech obarvených Coomassie Brilliant Blue G-250 skupina určitých biomarkerů, které v dnešní době tvoří významný cíl protinádorové terapie. Vhodnou technikou pro rychlou separaci proteinů je HPLC s reverzní fází C18 a SEC HPLC. Pozitivem také je dlouhodobá reprodukovatelnost. V tomto případě však metody nebyly příliš účinné, protoţe vzorky obsahovaly velké mnoţství proteinů, jejichţ molekulová hmotnost dosahovala hodnot v rozmezí několika řádů. HPLC proto jen potvrdila poznatky získané identifikací proteinů z 1D gelů. Nejobsáhlejší poznatky byly získané pomocí 2D gelové elektroforézy. Rozdíly v proteinovém zastoupení v 2D gelech byly patrné jiţ na první pohled. Pro identifikaci bílkovin bylo vybráno několik oblastí, kde se vyskytovaly největší odchylky. Všechny spoty byly po vyříznutí ponechány štěpení v gelu za pouţití trypsinu a následně analyzovány pomocí MALDI-TOF MS. Hmotnostní spektrometry ukázaly, ţe ošetřením retinoidy došlo k významným změnám v jednotlivých vzorcích. Práce ukázala, ţe retinoidy mohou určitým způsobem ovlivnit proteinové zastoupení v karcinomových buňkách za jistých podmínek.

40

7

ZDROJE

[1]

BUSK, L. Vitamin A (retinoids) as a modifier of chemical Mutagenesis and carcinogenesis. Uppsala, 1984.

[2]

HONG, W. K., LOTAN R. Retinoids in oncology. New York: Marcel Dekker, Inc, 1993, 352 s. ISBN 0-8247-9048-0.

[3]

BRTKO, J., THALHAMER J. Renaissance of the Biologically Active Vitamin A Derivatives: Established and Novel Directed Therapies for Cancer and Chemoprevention. Current Pharmaceutical Design. 2003-10-01, vol. 9, issue 25, s. 2067-2077. DOI: 10.2174/1381612033454144.

[4]

SUN, S.-Y., LOTAN R. Retinoids as chemopreventive and therapeutic agents: Established and Novel Directed Therapies for Cancer and Chemoprevention. Drugs of the Future. 1998, vol. 23, issue 6, s. 621-. DOI: 10.1358/dof.1998.023.06.858360.

[5]

HINDS, T. S., WEST W. L., KNIGHT E. M. Carotenoids and Retinoids: A Review of research, Clinical, and Public Health Applications. The Journal of Clinical Pharmacology. 1997, vol. 37, issue 7, s. 551-558. DOI: 10.1002/j.15524604.1997.tb04336.x.

[6]

BIENOVÁ, M., KUČEROVÁ R. Retinoidy v dermatologii. Dermatologie pro praxi. 2008; 2(4): 171-174. Dostupné z: http://www.dermatologiepropraxi.cz/pdfs/der/2008/04/03.pdf

[7]

www.faqs.org/patents/. [online] Upraveno podle: http://www.faqs.org/patents/imgfull/20120309833_16

[8]

VAHLQUIST A. What are natural retinoidů? Dermatology 1999: 3-11.

[9]

HLÚBIK, P., OPLTOVÁ L. Vitaminy. 1. vyd. Praha: Grada, 2004, 232 s. ISBN 80-2470373-4.

[10]

ZEMPLENI, J. Handbook of vitamins. 4th ed. Boca Raton: Taylor, c2007, xii, 593 p. ISBN 08-493-4022-5. Dostupné z: http://medaku.com/images/handbook_of_vitamins_-_4th_edition.pdf

[11]

DE LUCA, L.M. Retinoids in differentiation and cancer research. Drugs of the Future. 1998, vol. 23, issue 4, s. 415-. DOI: 10.1358/dof.1998.023.04.858354. Upraveno podle: http://journals.prous.com/journals/servlet/xmlxsl/pk_journals.xml_summary_pr?p_Jour nalId=2

[12]

KLIEWER, S. A. Orphan Nuclear Receptors: Shifting Endocrinology into Reverse. Science. vol. 284, issue 5415, s. 757-760. DOI: 10.1126/science.284.5415.757. Dostupné z: http://www.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.284.5415.757

41

[13]

ESCRIVA H., DELAUNAY F., LAUDET V. Ligand binding and nuclear receptor evolution. BioEssays. 2000, vol. 22, s. 717

[14]

FLODROVÁ D., BENKOVSKÁ D., MACEJOVÁ D., BIALEŠOVÁ D., BOBÁLOVÁ J., BRTKO J. Effects of retinoic acid isomers on proteomic pattern in human breast cancer MCF-7 cell line. Endocrine Regulations. Roč. 47, č. 4 (2013), s. 205-209. ISSN 1210-0668

[15]

SUN, S.-Y., LOTAN R. Retinoids and their receptors in cancer development and chemoprevention. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2002, vol. 41, issue 1, s. 41-55. DOI: 10.1016/S1040-8428(01)00144-5. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1040842801001445

[16]

KLENER, P. Základy klinické onkologie. 1. vyd. Praha: Galén, c2011, 96 s. ISBN 978807-2627-165.

[17]

SIMMS, W. A ROSS P. S. Vitamin A physiology and its application as a biomarker of contaminant-related toxicity in marine mammals: a review. Toxicology and Industrial Health. 2000-08-01, vol. 16, 7-8, s. 291-302. DOI: 10.1177/074823370001600706.

[18]

http://oregonstate.edu/. [online]. Dostupné z: http://lpi.oregonstate.edu/infocenter/vitamins/vitaminA/rxr.html

[19]

KLENER, P. Klinická onkologie. 1. vyd. Praha: Galén, 2002, xxxvii, 686 s. ISBN 8046-0468-X.

[20]

BREMNER, J. D., SHEARER K. D., MCCAFFERY P. J. Retinoic Acid and Affective Disorders. The Journal of Clinical Psychiatry. 2012-01-15, vol. 73, issue 01, s. 37-50. DOI: 10.4088/JCP.10r05993. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21903028

[21]

LIEBLER, D. C. Introduction to proteomics: tools for the new biology. Totowa, NJ: Humana Press, c2002, ix, 198 s. ISBN 08-960-3992-7.

[22]

VAN EYK, J. E, DUNN, M. J. Clinical proteomics: from diagnosis to therapy. Weinheim: Wiley-VCH, 2007. ISBN 978-352-7316-373.

[23]

LIEBLER, D. C. Proteomics in cancer research. Nashville, TN: Wiley-Liss, c2005, xii, 201 p. ISBN 04-714-4475-8.

[24]

KLOUDA, P. Moderní analytické metody. 2., upr. a dopl. vyd. Ostrava: Pavel Klouda, 2003, 132 s. ISBN 80-863-6907-2.

[25]

JANČÁŘOVÁ, I., JANČÁŘ L. Analytická chemie. Vyd. 1. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2003, 195 s. ISBN 978-80-7157-647-12008.

[26]

GARAJ, J., BUSTIN D., HLADKÝ Z. Analytická chémia. 1. vyd. Bratislava: Alfa, vydavatelstvo technickej a ekonomickej literatúry, 1987, 744 s.

42

[27]

VOLKA, K. Analytická chemie II. 1. vyd. Praha: VŠCHT, 1995, 236 s. ISBN 80-7080227-8.

[28]

ÜNLÜ, M., MORGAN M. E., MINDEN J. S. Difference gel electrophoresis. A single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis. 1997, vol. 18, issue 11, s. 2071-2077. DOI: 10.1002/elps.1150181133. Dostupné z: http://www.els.net/WileyCDA/ElsArticle/refId-a0021881.html

[29]

HERNYCHOVÁ, L. Základy hmotnostní spektrometrie. [online]. Dostupné z: http://www.pmfhk.cz/Prednasky/Hmotnostn%C3%AD%20spektrometrie%20Faf.pdf

[30]

BENSIMON, A., HECK A. J. R., AEBERSOLD R. Mass Spectrometry–Based Proteomics and Network Biology. Annual Review of Biochemistry. 2012-07-07, vol. 81, issue 1, s. 379-405. DOI: 10.1146/annurev-biochem-072909-100424. Dostupné z: http://akka.genetics.wisc.edu/sandbox/groups/genetics875/wiki/3a514/attachments/56 874/Aebersold-Mann_Nature_2003.pdf

[31]

MARVIN, L. F., ROBERTS M. A., FAY, L. B. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 2003, vol. 337, 1-2, s. 11-21. DOI: 10.1016/j.cccn.2003.08.008. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009898103003863

[32]

GOVORUN, V. M., ARCHAKOV A. I. Biochemistry (Moscow). vol. 67, issue 10, s. 1109-1123. DOI: 10.1023/A:1020959106412. Upraveno podle: http://link.springer.com/10.1023/A:1020959106412

[33]

PILNÝ, R. Průkaz signifikantních artefaktů v séru metodou SELDI TOF MS a optimalizace přípravy biologického materiálu pro metodu SELDI TOF MS [online]. 2008 [cit. 2014-04-27]. Rigorózní práce. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. Vedoucí práce. Dostupné z: .

[34]

BANERJEE, S., MAZUMDAR S. Electrospray Ionization Mass Spectrometry: A Technique to Access the Information beyond the Molecular Weight of the Analyte. International Journal of Analytical Chemistry. 2012, vol. 2012, s. 1-40. DOI: 10.1155/2012/282574. Dostupné z: http://www.hindawi.com/journals

[35]

IUPAC. Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (the "Gold Book"). Compiled by A. D. McNaught and A. Wilkinson. Blackwell Scientific Publications, Oxford (1997). XML on-line corrected version: http://goldbook.iupac.org (2006-) created by M. Nic, J. Jirat, B. Kosata; updates compiled by A. Jenkins. ISBN 0-9678550-9-8.

[36]

VEJRAŢKA, M. Buněčné kultury. [online]. Dostupné z: http://bioprojekty.lf1.cuni.cz/3381/sylaby-prednasek/textova-verzeprednasek/bunecne-kultury-vejrazka.pdf

[37]

ALBERTS, B. Molecular biology of the cell. 4th ed. New York: Garland Science, 2002, 1463 s. ISBN 08-153-4072-9.

[38]

ROSYPAL, S. Nový přehled biologie. 1. vyd. Praha: Scientia, 2003, 797 s. ISBN 80718-3268-5. 43

[39]

LACROIX, M., LECLERCQ G. Relevance of Breast Cancer Cell Lines as Models for Breast Tumours: An Update. Breast Cancer Research and Treatment. 2004, vol. 83, issue 3, s. 249-289. DOI: 10.1023/B:BREA.0000014042.54925.cc. Dostupné z: http://link.springer.com/article/10.1023%2FB%3ABREA.0000014042.54925.cc

[40]

KÁŠ, J., KODÍČEK M., VALENTOVÁ O. Laboratorní techniky biochemie. 1. vyd. Praha: VŠCHT, 2005, 258 s. ISBN 80-708-0586-2.

[41]

TOLDRÁ, F., NOLLET, L. M. Proteomics in foods principles and applications. New York: Springer, 2013. ISBN 978-146-1456-261.

[42]

GEVAERT, K., VANDEKERCKHOVE J. Protein identification methods in proteomics. In: Electrophoresis. 6. vyd., 2000, s. 1145-1154. Dostupné z: http://scholar.google.cz/scholar?q=kris+gevaert+protein+separation&hl=cs&as_sdt=0 &as_vis=1&oi=scholart&sa=X&ei=ZVtdU96TOsm57AbLuIDwDA&ved=0CCgQgQMw AA

[43]

http://www.med.muni.cz/. [online]. Dostupné z: http://www.med.muni.cz/patfyz/tmbg/Western_bak.pdf

[45]

PAZOUREK, J. Moderní elektroforetické analytické metody (přednášky pro magisterské studium). Dostupné z: http://faf.vfu.cz/pub-files/ustavy/ustav-chemickychleciv/vyuka-predmetu/analyticka-chemie-i-ii/separacni-metody---elektroforeza.pdf

[44]

PEŠ, O. Identifikace proteinů enzymatickým štěpením a MALDI - TOF MS [online]. 2006 [cit. 2014-04-27]. Diplomová práce. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. Vedoucí práce Jan Preisler. Dostupné z: .

[45]

GYGI, S. P., RIST B., GERBER S. A., TURECEK F., GELB M. H., AEBERSOLD R. Nature Biotechnology. vol. 17, issue 10, s. 994-999. DOI: 10.1038/13690. Dostupné z: http://stuff.mit.edu:8001/afs/athena/course/other/be.400/www/Papers/9_26/Additional/ Gygi_Nat_Biotech_1999.pdf

[46]

PETRICOIN, E. F., ZOON K. C., KOHN E. C., BARRETT J. C., LIOTTA L. A. Clinical proteomics: translating benchside promise into bedside reality. Nature Reviews Drug Discovery. 2002, vol. 1, issue 9, s. 683-695. DOI: 10.1038/nrd891. Dostupné z: http://psgmac43.ucsf.edu/ticr/syllabus/courses/26/2003/02/27/Lecture/readings/clinicalproteomics.pdf

[47]

MERRIHEW, G. E., DAVIS C., EWING B., WILLIAMS G., KALL L., E. FREWEN B., NOBLE W. S., GREEN P., THOMAS J. H., MACCOSS M. J. Use of shotgun proteomics for the identification, confirmation, and correction of C. elegans gene annotations. Genome Research. 2008-08-07, vol. 18, issue 10, s. 1660-1669. DOI: 10.1101/gr.077644.108. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2556273/

44

[48]

CELIS, J., BRAVO R. Two-dimensional gel electrophoresis of proteins: methods and applications. New York: Academic Press, 1984, xvi, 487 p. ISBN 01-216-4720-X.

[49]

ŠOPÍKOVÁ, M. Změny proteinového profilu v průběhu sladování ječmene. Brno: Vysokéučení technické v Brně, Fakulta chemická, 2008. 69 s. Vedoucí diplomové práce Ing. JanetteBobáľová, CSc.

[50]

European Commision - eurostat. [online]. Dostupné z: http://epp.eurostat.ec.europa.eu/statistics_explained/index.php/Causes_of_death_sta tistics/cs#Rakovina

[51]

FERANEC, R. Detekce sentinelové uzliny u pacientek s karcinomem endometria s vyuţitím hysteroskopie [online]. 2012 [cit. 2014-05-05]. Disertační práce. Masaryk University, Faculty of Medicine. Vedoucí práce Vuk Fait. Dostupné z: .

[52]

ŠLAMPA, P. Co potřebujete vědět o nádorech mozku. Brno: Masarykův onkologický ústav, c2003, 23 s. ISBN 80-86793-00-1.

[53]

FLODROVÁ D., BENKOVSKÁ D., MACEJOVÁ D., BIALEŠOVÁ D., BRTKO J., BOBÁLOVÁ J. Proteomic evaluation of MCF-7 human breast cancer cells after treatment with retinoic acid isomers: Preliminary insights. In Foret, František; Křenková, Jana; Guttman, Andras; Klepárník, Karel; Boček, Petr (ed.). CECE 2012. 9th International Interdisciplinary Meeting on Bioanalysis. Brno : Ústav analytické chemie AV ČR, v. v. i, 2012, s. 146-150. ISBN 978-80-904959-1-3. [CECE 2012. International Interdisciplinary Meeting on Bioanalysis /9./, Brno, 01.11.201202.11.2012, CZ]. Dostupný z: .

[54]

LOCHMANOVA, G., ZDRAHAL, Z., KONECNA, K., KOUKALOVA, S., MALBECK, J., SOUCEK, P., VALKOVA, M., KIRAN, N., S., BRZOBOHATY, B. Cytokinin induced photomorphogenesis in dark-grown Arabidopsis: A proteome analysis. J. Exp. Bot. 2008, 59(13), p. 3705-3719.

[56]

BENKOVSKA, D., FLODROVA, D., BOBALOVA, J., Application of monolithic affinity HPLC column for fast determination of malt glycoproteins. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 2013, 36(5), pp. 561–572.

[57]

BENKOVSKÁ, D. Proteomické studie ječmene související s výrobou piva. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2013. 130 s. Vedoucí dizertační práce Ing. Janette Bobáľová, CSc.

[58]

SHEVCHENKO, A., WILM M., VORM O., MANNM. Mass Spectrometric Sequencing of Proteins from Silver-Stained Polyacrylamide Gels. Analytical Chemistry. 1996, vol. 68, issue 5, s. 850-858. DOI: 10.1021/ac950914h. Dostupné z: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac950914h

45

[58]

46

FERNANDEZ-PATRON, C., CALERO M., COLLAZO P.R., GARCIA J.R., MADRAZO J., MUSACCHIO A., SORIANO F., ESTRADA R., FRANK R., CASTELLANOSSERRA L.R., MENDEZ E. Protein Reverse Staining: High-Efficiency Microanalysis of Unmodified Proteins Detected on Electrophoresis Gels. Analytical Biochemistry. 1995, vol. 224, issue 1, s. 203-211. DOI: 10.1006/abio.1995.1031. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0003269785710317

8

ZKRATKY

9cRA

9-cis retinoic acid

ATRA

all-trans retinoic acid

CE

capillary electrophoresis

CEC

capillary electrochromatography

CHCA

α-cyano-4-hydroxycinnamic acid

DHBA

2,5-dihydroxybenzoic acid

DHC

dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (sinapinic acid)

DMEM

Dulbecco´c modified eagle medium

ESI

electrospray ionization

FBS

fetal bovine serum

FI

field ionisation

GPC

gel permeation chromatography

HPLC

high performance liquid chromatography

IEC

ion exchange chromatography

IEF

isoelectric focusing

IPG strips

immobilized pH gradient strips

ITP

isotachophoresis

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry

LC

liquid chromatography

LXR

liver X receptor

MALDI

matrix-assisted laser desorption/ionization

MS/MS

tandem mass spectrometry

PAGE

polyacrylamide gel electrophoresis

PBS

phosphate buffered saline

pI

isoelectric point

PMF

peptide mass fingerprints

QIT

quadrupol ion-trap analyser

RA

retinoic acid

RAR

retinoic acid receptor

RARE

retinoic acid receptor element

RBP

retinol binding protein

RCP

reversed phase chromatography

RIPA

radio-imunoprecipitate assay

RXR

retinoid X receptor 47

RXRE

retinoid X receptor element

SALDI

surface-assisted laser desorption/ionization

SDS

sodium dodecylsulfate

SEC

size exclusion chromatography

TCA

trichloracetic acid

TEMED

tetramethylethylenediamine

TFA

trifluoracetic acid

TOF

time-of-flight

TRIS

tris(hydroxymethyl)aminimethane

TSI

termospray ionization

UV

ultraviolet

48