Využití luminometrických metod při sledování vrozené imunity živočichů

Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie živočichů

Mgr. Libor Vojtek

Využití luminometrických metod při sledování vrozené imunity živočichů

Dizertační práce

Školitel: RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.

Brno, 2014

Bibliografický záznam Autor:

Mgr. Libor Vojtek Oddělení fyziologie a imunologie živočichů Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita

Název dizertační práce:

Využití luminometrických metod při sledování vrozené imunity živočichů

Studijní program:

Biologie

Studijní obor:

Fyziologie živočichů

Školitel:

RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.

Rok obhajoby:

2014

Počet stran:

117

Klíčová slova:

bioluminiscence, Photorhabdus luminescens, Escherichia coli K12, antimikrobiální peptidy, komplementový systém, oxidační stres, antioxidanty, TRAP

Bibliographic entry Author:

Mgr. Libor Vojtek Department of Animal Physiology and Immunology Institute of Experimental Biology Faculty of Science Masaryk University

Title of dissertation:

Usage of luminometric methods in animal innate immunity studies

Degree programme:

Biology

Field of study:

Animal Physiology

Supervisor:

RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.

Year of defence:

2014

Number of pages:

117

Key words:

bioluminescence, Photorhabdus luminescens, Escherichia coli K12, antimicrobial peptides, complement system, oxidative stress, antioxidants, TRAP

©Libor Vojtek, Masarykova univerzita 2014

Poděkování V první řadě bych velice rád poděkoval svému školiteli RNDr. Pavlu Hyršlovi, Ph.D., který mě příkladně vedl po celou dobu mého studia na MU a umožnil mi tak nahlédnout do problematiky studia vrozené imunity živočichů ve spojení s luminometrickými metodami. Děkuji za odborné rady, cenné náměty, pomoc pří řešení problémů a za vstřícné, přátelské a ochotné jednání. Dále bych chtěl poděkovat všem kamarádům a kolegům z Oddělení fyziologie a imunologie živočichů za vytvoření plodného pracovního prostředí. Jmenovitě bych chtěl poděkovat především Mgr. Pavlu Dobešovi, Ph.D. za příkladnou pomoc v laboratoři i mimo ni a také Mgr. Kateřině Tomanové za jazykové korektury této práce. Mé velké díky patří také prof. Esa-Matti Liliusovi a Jannemu Atosuovi z Univerzity v Turku (Finsko) za uvedení do problematiky bioluminiscenčních bakterií a za poskytnutí příjemného zázemí, odborných rad a příkladného vedení od doby mého prvního pobytu v jejich laboratoři až doposud. V neposlední řadě bych moc rád poděkoval své rodině a přítelkyni za projevenou trpělivost, podporu a pochopení během celého studia, bez kterých by bylo ukončení velice složité. Za finanční podporu této práce děkuji projektům: GA206/09/P470, NAZV-KUS 2012 QJ1210047 a MUNI/A/0927/2013.

Abstrakt Luminiscence, tedy produkce světelného signálu přeměnou elektromagnetické, chemické, elektrické či mechanické energie, je důležitým fyzikálním jevem využívaným v mnoha biologických či chemických metodách. Bioluminiscenční organismy představují fascinující objekty zájmu nejen obyčejných lidí, ale především vědců zabývajících se tímto fenoménem. Asi nejznámějším živočichem schopným produkce světla je světluška, avšak drtivá většina bioluminiscenčních organismů žije ve vodním prostředí, včetně nejpočetnější skupiny - bioluminiscenčních bakterií. Pro účely této práce byly vybrány dva druhy bakterií, a to přirozeně svítící Photorhabdus luminescens a geneticky modifikovaná Escherichia coli K12, která nese multikopie plasmidů obsahujících geny pro bakteriální luciferázu a její substráty původně pocházející z P. luminescens. Obě bakterie produkují světelný signál díky oxidaci substrátů, aldehydu s dlouhým řetězcem a flavin mononukleotidu, katalyzované enzymem luciferázou. Tvorba těchto substrátů probíhá pouze za spotřeby energie produkované živými buňkami, což znamená, že bioluminiscence je přímo úměrná viabilitě bakterií. Tohoto jevu využívají antibakteriální měření založená na poklesu bioluminiscenčního signálu po přidání jakékoliv látky s antibakteriálními účinky k suspenzi bakteriální kultury. Práce popisuje optimalizační experimenty znázorňující podmínky kultivace, teplotní optimum, závislost počtu bakterií na optické hustotě suspenze či reakce jednotlivých bakterií na přítomnost systému peroxid vodíku/myeloperoxidáza. Studie 1, 2 a 5 popisují zavedení a využití popsaných metod při měření některých parametrů vrozené imunity živočichů, tedy antibakteriální aktivity lidského komplementu a hemolymfy hmyzu (především antimikrobiálních peptidů), a navíc také vliv rostlinných extraktů. Vrozené imunitní pochody využívají k zabíjení bakterií a dalších patogenů infiltrovaných do nitra organismu účinnou zbraň v podobě reaktivních metabolitů kyslíku a dusíku. Pokud se tyto molekuly vymknou kontrole, či jejich produkce jednoduše přesáhne únosnou koncentraci, mohou poškozovat molekuly tělu vlastní a nastává tak oxidační stres. Oxidační stres hraje významnou roli při iniciaci závažných onemocnění, jako jsou nemoci kardiovaskulárního systému, rakovina či Alzheimerova choroba. Pro odstranění oxidačního stresu je zapotřebí látek s redukčním potenciálem, tzv. antioxidantů. Jejich příjem v potravě hraje hlavní roli při ochraně proti oxidačnímu stresu. Existuje několik metod měřících antioxidační kapacitu biologických vzorků, patří mezi ně i metoda TRAP (Total Radical-trapping Antioxidant Parameter) založená na eliminaci peroxylových radikálů antioxidanty přítomnými ve vzorcích. Pokud tyto radikály nejsou inhibovány, oxidují přítomný luminol, jež produkuje světelný signál měřitelný luminometrem. Nejvíce antioxidantů je obsaženo v ovoci či zelenině, ale zatím neexistuje velké množství studií zabývajících se obsahem jednotlivých antioxidantů v rostlinách. Studie 4 a 5 popisují měření antioxidační kapacity rostlinných extraktů pomocí 4 metod (včetně TRAP) spolu s jejich antibakteriálními účinky a s vlivem na produkci reaktivních metabolitů kyslíku fagocyty. Výsledky ukazují na rostliny, z nichž by měla být připravována funkční jídla pro posílení příjmu antioxidačních látek. Metoda TRAP byla použita také ve studii 3, jež se zabývá adaptivní fylogeografií norníka rudého a především jeho osidlováním Británie na konci poslední doby ledové.

Z výsledků vyplývá, že při tomto osidlování hrála velkou roli mutace zvýhodňující nově příchozí populaci v lepší antioxidační ochraně molekuly hemoglobinu. Antioxidační kapacita hemolyzátu byla měřena metodou TRAP, jež umožnila funkční ověření teoretické hypotézy. Tato studie ukazuje na důležitost ověření funkčnosti produktů jednotlivých genů označených za molekulární markery odpovědné za selekční procesy kolonizace. Výsledky všech experimentů obsažených v této práci mohou v budoucnu napomoci např. řešení otázek narůstající bakteriální antibiotické resistence či při prevenci chorob kardiovaskulárního systému spojené s příjmem dostatečného množství antioxidantů v potravě.

Abstract Luminescence - light signal production by conversion of electromagnetic, chemical, electric or mechanical energy - is an important physical phenomenon used in many biological or chemical methods. Bioluminescence organisms present fascinating objects of interest not only to public but scientists above all. Most famous and also well studied bioluminescent animal is firefly; however majority of bioluminescent organisms live in an aquatic environment including the most numerous group - bioluminescent bacteria. Two species of bioluminescent bacteria were chosen for the purposes of this work, namely the naturally luminous Photorhabdus luminescens and genetically modified Escherichia coli K12 carrying multicopy plasmids containing genes for bacterial luciferase and its substrates originating from P. luminescens. Both bacterial species produce bioluminescent signal via oxidation of substrates, long chain aldehyde and flavin mononucleotide, catalyzed by luciferase enzyme. Production of these substrates consume a lot of energy which is produced only by living cells, which means that bioluminescent signal is equal to the bacterial viability. This effect utilizes antibacterial assays based a on decrease of the luminescent signal after addition of any antibacterial material to the bacterial suspension. This thesis presents optimization experiments that illustrate optimal cultivation conditions, the temperature optimum, dependence of the optical density on the bacterial cell number in the suspension, or reaction of both the bacterial species to hydrogen peroxide/myeloperoxidase system. Study 1, 2 and 5 describe the introduction and usage of the described methods on measurements of certain innate immunity factors, such as human complement system and insect haemolymph (mostly antimicrobial peptides), and moreover the influence of plant extracts. Innate immunity processes are using very efficient weapon in the form of reactive oxygen species to kill bacteria and other pathogens infiltrating the organism. Once these molecules are out of control or their production exceeds the marginal concentration, they attack own body molecules, which causes the oxidative stress. The oxidative stress plays a crucial role in initiation of numerous serious diseases such as cardiovascular diseases, cancer or the Alzheimer’s disease. To avoid the oxidative stress, reduction molecules called antioxidants are needed. Nutrition intake of antioxidants plays an essential role in the oxidative stress protection. There are several methods of measuring antioxidant capacity of the biological samples including the TRAP method (Total Radical-trapping Antioxidant Parameter), which is based on peroxyl radical elimination by antioxidants presented in the samples. If these antioxidants are not inhibited, they oxidise present luminol, which produces a light signal measured by luminometer. Huge amount of the antioxidants are included in fruits or vegetables, but there are not many studies dealing with the antioxidant content in plants yet. Study 4 and 5 present the antioxidant capacity of plant extracts measurements using 4 methods (including TRAP), together with their antibacterial properties and impact on the reactive oxygen species production by phagocytes. The results point on the plants which should be used for the preparation of functional foods to strengthen the intake of antioxidants. Study 3 presents the adaptive phylogeography of bank vole and first of all its settlement in Britain at the end of the last glacial. The results point out, that the mutation

favouring a new incoming population in a better antioxidant protection of haemoglobin molecule played a significant role during the colonization. The antioxidant capacity of hemolysate measured by TRAP enabled a functional examination of theoretical hypothesis. This study shows the importance of genes (selected as molecular markers) products function examination. The results of the experiments contained in this thesis may in the future help resolve the bacterial antibiotic resistance problem, or be helpful in prevention of cardiovascular diseases by sufficient nutrition intake of antioxidants.

Obsah 1.

Úvod ................................................................................................................................. 11

2.

Cíle práce ........................................................................................................................ 12

3.

Luminiscence .................................................................................................................. 13 3.1.

Chemiluminiscence .................................................................................................. 13

3.2.

Bioluminiscence ....................................................................................................... 14

3.2.1.

Bioluminiscenční bakterie .................................................................................. 15

3.2.1.1.

Vybrané druhy bioluminiscenčních bakterií ............................................... 17

3.2.1.1.1. Photorhabdus luminescens .................................................................... 17 3.2.1.1.2. Escherichia coli K12 ............................................................................. 19 3.2.1.2.

Optimalizační experimenty vybraných bakteriálních druhů ....................... 20

3.2.1.2.1. Podmínky kultivace ............................................................................... 20 3.2.1.2.2. Teplotní optimum .................................................................................. 24 3.2.1.2.3. Změna počtu bakterií v závislosti na OD .............................................. 27 3.2.1.2.4. Bakterie a zabíječský systém H2O2/MPO .............................................. 29 4.

Vrozená imunita ............................................................................................................. 34 4.1.

5.

Vrozené antibakteriální mechanismy živočichů....................................................... 35

4.1.1.

Antimikrobiální peptidy ..................................................................................... 35

4.1.2.

Komplementový systém ..................................................................................... 39

Oxidační stres ................................................................................................................. 42 5.1.

Reaktivní metabolity kyslíku a dusíku ..................................................................... 42

5.2.

Antioxidační mechanismy ........................................................................................ 43

5.2.1.

Enzymatické antioxidanty .................................................................................. 44

5.2.2.

Neenzymatické antioxidanty .............................................................................. 44

5.3.

Metody měření celkové antioxidační kapacity......................................................... 46

6.

Shrnutí a perspektivy popsaných luminometrických metod ...................................... 50

7.

Seznam použité literatury .............................................................................................. 51

8.

Seznam zkratek .............................................................................................................. 64

9.

Publikované výsledky ..................................................................................................... 66 9.1.

Podíl na publikacích uvedených v dizertační práci .................................................. 67

9.2.

Studie 1 ..................................................................................................................... 69

9.3.

Studie 2 ..................................................................................................................... 71

9.4.

Studie 3 ..................................................................................................................... 73

9.5.

Studie 4 ..................................................................................................................... 75

9.6.

Studie 5 ..................................................................................................................... 77

10. Ostatní publikace............................................................................................................ 79

10

Úvod

1. Úvod Fotobiologií, potažmo luminiscencí jako jedním z jejich podoborů, jsou lidé fascinováni od nepaměti. Organismy schopné bioluminiscence vždy přitahovaly pozornost nejen obyčejných lidí, ale především vědců. Schopnost vyzařovat světlo je vlastní obrovskému množství především hlubokomořských organismů, počínaje bakteriemi a houbami přes prvoky, láčkovce, měkkýše, členovce a rybami konče. Z hlediska studia imunitních reakcí jsou však nejdůležitější právě bakterie. Bioluminiscenční bakterie představují jedny z nejjednodušších organismů schopných produkce světla, jejich studium však nabízí velké množství hodnotných informací. V době narůstající antibiotické resistence bakterií se stále více vědců snaží najít alternativní řešení léčby bakteriálních infekcí, které se mohou v krátkém časovém období zcela vymknout kontrole. Využití bioluminiscenčních bakterií jako nástroje pro měření antibakteriálních účinků nejrůznějších chemických či biologických systémů v reálném čase je tedy velice aktuální. Metody využívající těchto bakterií jsou časově, finančně i odborně nenáročné, přesto zajišťují rychlé a přesné výsledky. Při likvidaci bakteriální nákazy vrozenými mechanismy imunitního systému je využíváno také oxidačních pochodů, jež mohou vyústit v tzv. oxidační stres. Oxidační stres, tedy narušení oxidačně redoxní rovnováhy organismu, je jedním z dalších témat, která jsou v současné době podrobně studována. Nesprávná životospráva, stres či špatné stravovací návyky jsou v dnešní době rozšířeny mezi lidmi z celého světa a výrazně ovlivňují oxidačně redoxní rovnováhu organismu. Zvýšená produkce reaktivních metabolitů kyslíku (RMK) a dusíku (RMD), respektive snížená produkce antioxidantů může vést k poškození biomolekul, buněčné smrti či ke vzniku zánětlivých procesů uvnitř tkání. Tyto děje úzce souvisí se správnou funkcí jednotlivých složek imunitního systému a jejich nerovnováha tak může způsobit patologické stavy nebo dokonce smrt celého organismu. Měření celkové antioxidační kapacity nejrůznějších biologických vzorků by tedy mělo být nedílnou součástí celkového imunologického vyšetření jedince. Předkládaná dizertační práce pojednává o využití dvou druhů bioluminiscenčních bakterií ke sledování antibakteriální aktivity antimikrobiálních peptidů hmyzí hemolymfy, stejně jako komplementového systému obratlovců. Druhá část dizertační práce se zabývá metodami měření celkové antioxidační kapacity biologických vzorků, především pak luminometrickou metodou TRAP (Total Radical-trapping Antioxidant Potential). Práce byla realizována na Oddělení fyziologie a imunologie živočichů (Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita). Část týkající se bioluminiscenčních bakterií byla provedena v rámci dlouhodobého zahraničního pobytu na Univerzitě v Turku (Oddělení biochemie, Fakulta matematiky a přírodních věd, Turku, Finsko).

11

Cíle práce

2. Cíle práce Prvním z cílů této dizertační práce byl popis, příprava, optimalizace a aplikace metod využívajících bioluminiscenční bakterie rodu Photorhabdus luminescens a geneticky modifikovanou Escherichia coli pro stanovení antibakteriálních vlastností biologicky aktivních látek v reálném čase, což jiné metody neumožňují. Nově měla být prostudována především možnost měření antibakteriálních účinků humorální složky vrozené imunity hmyzu, tedy zejména vliv antimikrobiálních peptidů, podobně jako antibakteriální účinek komplementového systému obratlovců. Modelovými organismy pro studium hmyzích imunitních pochodů byly laboratorně hojně využívané druhy Galleria mellonella (zavíječ voskový) a Bombyx mori (bourec morušový). Dílčím cílem bylo také srovnání odlišností jednotlivých druhů námi použitých bakterií při navození různých životních podmínek či mezidruhové porovnání odolnosti vůči jednotlivým zabíječským systémům. Druhým, neméně důležitým cílem, byla optimalizace a využití luminometrického stanovení celkové antioxidační kapacity biologických vzorků. Za tímto účelem byla vybrána metoda TRAP. Oxidačně-redukční systémy organismu jsou totiž nedílnou součástí mnoha fyziologických pochodů včetně těch imunitních a jejich znalost dokresluje celkový obraz kondice daného jedince. Funkční metoda tedy měla přinést poznání dalšího důležitého parametru v mnoha navazujících projektech.

12

Luminiscence

3. Luminiscence Slovo luminiscence je odvozeno od latinského lumen, jenž znamená světlo. Luminiscencí je nazývána emise fotonů formou tzv. "studeného světla" vznikajícího následkem návratu elektronů z jejich excitovaného stavu do stavu základního, a to za relativně nízkých teplot (Goldberg et Weiner, 1989). K emisi světla tedy nedochází přeměnou z energie tepelné, jako je tomu u incandescence (slunce, žárovka, žhavé železo apod.), ale k excitaci elektronů může docházet především v důsledku příjmu následujících forem energií:     

elektromagnetické záření - fluorescence a fotoluminiscence energie chemických reakcí - chemiluminiscence a bioluminiscence elektrický proud - elektroluminiscence mechanická energie (tlak) - triboluminiscence ionizující záření - radioluminiscence

Z výše popsaných typů luminiscence jsou pro potřeby této práce nejdůležitější chemiluminiscence a bioluminiscence, následující kapitoly tedy budou věnovány jim.

3.1.

Chemiluminiscence

Chemiluminiscence využívá pro tvorbu světla energii chemických reakcí. Pro svou jednoduchost a spolehlivost jsou dnes chemiluminiscenční metody využívány jako nástroj pro detekci nejrůznějších biologických systémů - např. eukaryotických buněk (Yamashoji, 2009), bakterií (Kawasaki et al., 2004), proteinů (Yang et al., 2014) či antioxidantů (Wayner et al., 1985). Své opodstatněné využití nalezly chemiluminiscenční metody také ve forenzních vědách např. při detekci krevních skvrn (Castelló et al., 2012; Soderquist et al., 2012). Míra světla produkovaného fotochemickou reakcí je totiž přímo úměrná koncentraci jednotlivých reaktantů a na rozdíl od fluorescence či fosforescence není pro detekci chemiluminiscence potřeba excitačních zdrojů či optických filtrů (Aslan et Geddes, 2009). Základním principem chemiluminiscenční reakce je oxidace luminoforu silným oxidačním činidlem. Celý proces může být navíc urychlen chemickým či biologickým katalyzátorem. Luminofor je organická sloučenina umožňující vlastní chemickou excitaci a následné vyzáření energie ve formě světla. Mezi běžně používané luminofory patří například luminol a isoluminol (Rájecký et al., 2012), acridan (Osman et al., 2000) či lucigenin (Caldefie-Chézet et al., 2002). Některé luminofory jsou odvozeny z bioluminiscenčních živočichů jako např. coelenterazin představující nejrozšířenější luminofor mořské říše (Haddock et al., 2010), či Pholasin pocházející z mořského měkkýše Pholas dactylus (Glebska et Koppenol, 2005). Mezi nejpoužívanější katalyzátory chemiluminiscenčních reakcí patří křenová peroxidáza (Kim et al., 1991) a nejčastějším oxidačním činidlem je peroxid vodíku (Navas Díaz et al., 1997). Typická chemiluminiscenční reakce včetně jednotlivých komponent je znázorněna na obrázku 1.

13

Luminiscence

Obr. 1: Základní chemiluminiscenční reakce luminolu s peroxidem vodíku za vzniku modrého světla o vlnové délce cca 450 nm (upraveno podle Aslan et Geddes, 2009).

3.2.

Bioluminiscence

Bioluminiscence je druh chemiluminiscence odehrávající se v živých organismech, jde tedy o produkci světla z biochemických reakcí probíhajících uvnitř živočichů, hub či bakterií. Bioluminiscence je typická především pro hlubokomořské organismy, v omezené míře se však vyskytuje také u sladkovodních a terestriálních druhů (Herring et Widder, 2001). Evoluční preference hlubin moří je zřejmě spojena s relativně stálým a neměnným prostředím, trvalým pobytem v šeru či úplné tmě, opticky čistou vodou ve srovnání s řekami či rybníky a v neposlední řadě také s interakcemi velkého množství bioluminiscenčních organismů zahrnujících predátory, parazity i kořist (Haddock et al., 2010). Základními kameny bioluminiscenčních reakcí je substrát luciferin, enzym katalyzující jeho oxidaci nazývaný luciferáza a molekulární kyslík (Meighen, 1993; Hou et al., 2014). Zjednodušená biochemická reakce většiny bioluminiscenčních organismů probíhá dle následující rovnice:

luciferáza luciferin + O2

oxyluciferin + světlo

Luciferin je buď v organismu syntetizován za spotřeby energie v podobě adenosin-tri-fosfátu (ATP), nebo je přijímán v potravě z jiných bioluminiscenčních organismů (Thomson et al., 1997). Luciferin a luciferáza mohou být spolu také vzájemně svázány a tvořit tak systémovou jednotku zvanou fotoprotein. Ten je většinou aktivován vazbou dalšího kofaktoru, jenž mění jeho konformaci, nejčastějšími kofaktory jsou ionty Ca2+ nebo Mg2+. Takto může daný organismus poměrně přesně kontrolovat emisi světla (Haddock et al., 2010). Luciferiny či fotoproteiny jsou většinou druhově specifické, např. bakterie využívají flavin mononukleotid (FMNH2; Dunlap, 2009), láčkovci coelenterazin či aequorin (Jones et al., 1999) a korýši vargulin (Petushkov et Rodionova, 2007). Pravděpodobně nejvíce prostudovaným systémem produkce světla je systém, který používají světlušky. Na rozdíl od většiny ostatních bioluminiscenčních organismů jsou světlušky schopny kontrolovat luminiscenci pomocí nervového systému (Greenfield, 2001). Díky neurotransmiteru 14

Luminiscenční bakterie oktopaminu mohou světlušky ovládat produkci oxidu dusnatého (NO), jež ovlivňuje spotřebu kyslíku v mitochondriích fotocytů (buňky světelného orgánu) a tedy i samotnou produkci světla (Trimmer et al., 2001). Další podrobně studovanou skupinou organismů produkujících světlo, a zároveň stěžejních pro tuto práci, jsou bioluminiscenční bakterie.

3.2.1.

Bioluminiscenční bakterie

Bioluminiscenční bakterie jsou nejrozšířenější organismy schopné produkce světla. Stejně jako většina ostatních bioluminiscenčních organismů jsou i bakterie druhově nejvíce zastoupeny v mořském prostředí, nicméně existují i sladkovodní a terestrické druhy (Meighen, 1991). Většina bioluminiscenčních bakterií však nežije volně v okolním prostředí, ale symbiotickým způsobem života uvnitř větších organismů (Close et al., 2009). Bakterie jsou takto chráněny před negativními vlivy vnějšího prostředí a jejich symbiont získává schopnost bioluminiscence, jež může být využita např. při lovu, maskování či dorozumívání. Přestože jsou bakterie nejrozšířenějším druhem bioluminiscenčních organismů na Zemi, patří mezi ně pouze tři gramnegativní rody: Vibrio, Photobacterium a Photorhabdus (dříve Xenorhabdus), a z těchto tří rodů je pouze Photorhabdus terestrickým. Genetická výbava pro tvorbu světelného signálu je evolučně konzervovaná a je tedy u všech tří rodů obdobná. Protein tvořící vlastní enzym bakteriální luciferázy (Lux) je heterodimer (podjednotky α a β) kódovaný dvěma geny luxA a luxB. Zbylé tři geny, luxC, luxD a luxE, kódují dohromady pracující komplex reduktáz, transferáz respektive syntáz potřebných pro syntézu aldehydu s dlouhým řetězcem (RCHO) fungujícího jako substrát luminiscenční reakce (Close et al., 2012). Většina druhů má navíc gen frp (též nazývaný luxG) odpovědný za produkci flavin-reduktázy potřebné při regeneraci redukovaného FMNH2 spolupůsobícího jako substrát luciferázy (Dunlap, 2009). Pro regeneraci substrátů luciferázy je však zapotřebí také velké množství energie ve formě ATP, jenž je produkován pouze živými buňkami, což jinými slovy znamená, že míra bioluminiscenčního signálu produkovaného bakteriální kulturou je přímo úměrná viabilitě jednotlivých bakterií v této kultuře obsažených (Meighen, 1991; Hakkila et al., 2002; Close et al., 2012). K produkci světla tedy bakteriím stačí pouze výše popsané komponenty a molekulární kyslík (Urbanczyk et al., 2011). Většina bakterií produkuje modro-zelené viditelné světlo o vlnové délce přibližně 490 nm. Typicky probíhá bakteriální bioluminiscence dle následující reakce (Meighen , 1991):

Lux

FMNH2 + RCHO + O2

FMN + RCOOH + H2O + světlo (~490 nm)

Bakteriální bioluminiscence však není závislá pouze na chemické reakci uvnitř jediné buňky. Většina přirozeně bioluminiscenčních bakterií potřebuje dosáhnout určité prahové koncentrace jedinců v prostředí, aby byly schopné produkce světla (Nealson et Hastings, 1979). Stejně jako eukaryotické organismy se totiž i bakterie potřebují dorozumívat jedna s druhou pomocí mezibuněčných signálních molekul, což jim umožňuje využívat výhod chování složitějších (vícebuněčných) organismů a kontrolovat tak expresi některých genů v závislosti na hustotě populace (Waters et Bassler, 2005). Tento jev se nazývá quorum 15

Luminiscenční bakterie sensing a byl poprvé popsán u Vibrio fischeri. Quorum sensing umožňuje této bakterii rozlišovat její dvě životní stádia - buď žije volně v mořské vodě, kde díky nedostatečné hustotě populace není schopná bioluminiscence, nebo žije v symbióze s nejrůznějšími mořskými živočichy, kde osidluje jejich světelné orgány a díky vysoké hustotě populace bakteriálních buněk v těchto orgánech produkuje světlo (Kaplan et Greenberg, 1985). Přechod mezi těmito dvěma stavy je zajištěn díky rozdílné genové expresi. Exprese genů pro bakteriální luciferázu je u gramnegativních bakterií kontrolována geny luxI a luxR. LuxI kóduje syntázu autoinduktoru produkující acyl-homoserin lakton (AHL) a luxR kóduje cytoplasmatický receptor výše zmíněného autoinduktoru. AHL může volně procházet vně a dovnitř buněk a po dosažení dostatečné hustoty populace může aktivovat LuxR (Stevens et al., 1994). Takto aktivovaný komplex AHL-LuxR následně spouští transkripci operonu kódujícího bakteriální luciferázu a umožňuje tak produkci světla. Zároveň ale také posiluje produkci AHL, jelikož gen luxI je rovněž obsažen v tomto operonu, což vyvolá pozitivní zpětnou vazbu, vylití velkého množství AHL a masivní emisi světla (Fuqua et al., 1994). Celý proces znázorňuje obrázek 2. Mechanismus quorum sensing grampozitivních bakterií je poněkud odlišný, nezávislý na koloběhu LuxI, LuxR a AHL. Grampozitivní bakterie většinou sekretují peptidové signální molekuly skrze ATP-vázající transportní proteiny. Tyto peptidové molekuly jsou následně rozpoznávány cytoplazmatickými senzorickými kinázovými proteiny aktivujícími odpovídající regulační proteiny (Bassler, 1999).

AHL

LuxI

LuxR

LuxR Světlo

luxI luxICDABE

Obr. 2: Quorum sensing gramnegativních bakterií, schéma signálování komplexu LuxI-R pomocí autoinduktoru AHL (upraveno podle Waters et Bassler, 2005).

16

Photorhabdus luminescens

3.2.1.1. Vybrané druhy bioluminiscenčních bakterií Pro studium antibakteriální aktivity byly použity dva druhy bioluminiscenčních bakterií. První z nich je přirozeně luminiscenční terestrická bakterie Photorhabdus luminescens. Naproti tomu druhou vybranou bakterií je geneticky modifikovaná Escherichia coli K12. Obě tyto bakterie byly záměrně vybrány pro své jedinečné vlastnosti a nároky na životní podmínky. Důležité byly hlavně odlišné požadavky na teplotní optimum a s tím úzce související cílová skupina hostitelských organismů, dále odlišné podmínky kultivace a růstu vztažené především na rozdíly mezi geneticky modifikovaným a přirozeně svítícím organismem. Zásadním rozdílem byla také míra produkce světla přirozeně luminiscenčních bakterií nesoucích genetickou informaci pro tvorbu světla pouze v jádře oproti geneticky modifikovaným bakteriím obsahujícím tutéž informaci ve stovkách kopií plasmidů v cytoplasmě. V neposlední řadě byla samozřejmě důležitá také odlišná míra přežití obou druhů po přidání stejného baktericidního agens.

3.2.1.1.1. Photorhabdus luminescens Photorhabdus luminescens, rod Photorhabdus z čeledi Enterobacteriaceae, třída Gammaproteobacteria, je hmyzí patogenní bakterie žijící v symbiotickém vztahu s entomopatogenními hlístovkami čeledi Heterorhabditidade. P. luminescens, který byl do roku 1993, kdy vznikl samostatný rod Photorhabdus na základě odlišností v DNA a schopnosti emise bioluminiscenčního signálu, znám jako Xenorhabdus luminescens (Boemare et al., 1993), je jedním z 3 známých druhů tohoto rodu. Zbylé dva druhy jsou P. temperata a P. asymbiotica (Peat et al., 2010). Jak již bylo řečeno, jedná se o jediný terestrický rod bioluminiscenčních bakterií. Pod mikroskopem lze P. luminescens pozorovat jako gramnegativní pohyblivé nesporulující tyčky o průměrné velikosti 0,8 - 2 x 4 - 10 µm živící se chemoorganotroficky a žijící fakultativně anaerobně (Thomas et Poinar, 1979). Životní cyklus P. luminescens je zajímavý především možností existence ve dvou pleomorfních formách obvykle označovaných jako fáze I a fáze II. Obě fáze se od sebe odlišují ve fyziologických, strukturních a růstových vlastnostech bakterií a pravděpodobně vznikly jako reakce na změnu životního prostředí (Owuama, 2001). Fáze I je obvykle spojena s životem uvnitř symbiotických entomopatogenních hlístovek, kdežto fáze II se vyskytuje u bakterií volně žijících v kultivačních mediích. Ve fázi I bakterie produkují antibiotika, přirozené bakteriální pigmenty, intracelulární inkluzní proteiny a jsou schopny adsorbovat barviva. Naopak ve fázi II bakterie nejsou schopny tyto pochody zajišťovat (Adams et al., 2006). Nemožnosti adsorbovat barviva se tak využívá pro jednoduchou identifikaci fáze, ve které se bakterie momentálně nacházejí. Kolonie ve fázi I jsou totiž schopny z adsorbované bromthyolové modři přidané do růstového média (NBTA medium) redukovat trifenyltetrazolium chlorid na formazán, takže kolonie fáze I mají modrou barvu, kdežto kolonie fáze II barvu neadsorbují a zůstávají červené (Han et Ehlers, 2001). Fáze I vykazuje odlišnou patogenitu pro hmyz a je pravděpodobně nadřazená fázi II a zároveň pouze fáze I podporuje růst a vývoj hlístovek. Přechod z fáze II zpět do fáze I zatím nebyl u P. luminescens pozorován (Adams et al., 2006). 17

Photorhabdus luminescens P. luminescens vykazuje obrovskou patogenitu pro hmyzí hostitele nejrůznějších skupin. Jakmile se bakterie pomocí entomopatogenních hlístovek dostanou do hmyzího organismu, produkují velké množství nejrůznějších toxinů, enzymů, proteinů a dalších látek odpovědných za usmrcení a natrávení hostitele. V první řadě se na usmrcení hostitele podílejí proteinové toxinové komplexy (Tc) s vysokou molekulovou hmotností produkované bakteriemi do okolního prostředí. Jednotlivé druhy těchto komplexů (TcA, TcB, TcC a TcD) izolovaných z kultivačního media jsou pro většinu hmyzích hostitelů smrtelné již v nízkých koncentracích. Po orálním podání dochází k ničení buněk střevního epitelu, což vede k následnému odumření celého střeva a smrti organismu (Bowen et al., 1998). Kromě toxinových komplexů produkují bakterie P. luminescens také tzv. Pir toxiny (Photorhabdus Insect-Related) s obdobnými účinky jako Tc (Ullah et al., 2014). Dalšími toxiny produkovanými těmito bakteriemi jsou Mcf toxiny (Makes Caterpillar Floppy) rovněž způsobující smrt buněk střevního epitelu a hemocytů, následkem je ztráta nitrotělního tlaku. Typickým jevem je pak zvýšená ohebnost mrtvých larev (Ullah et al., 2014). Posledním doposud identifikovaným toxinem je PVC toxin (Photorhabdus Virulence Cassette) ničící hmyzí hemocyty kondenzací jejich cytoskeletu (Rodou et al., 2010). Další skupinou sekretovaných látek účastnících se usmrcení a rozložení hmyzího hostitele jsou extracelulární enzymy. P. luminescens produkuje uvnitř hostitele množství lipáz, fosfolipáz, proteáz či DNAáz. Produkce těchto enzymů nastává během pozdní logaritmické a rané stacionární fáze růstu bakterií (viz kapitola 3.2.1.2.1.; Forst et Nealson, 1996). Jak již bylo naznačeno, hlavní úlohou výše popsaných enzymů je rozložit usmrcený organismus a vytvořit tak živiny pro symbiotické hlístovky i bakterie samotné. Jediné, co zůstává po infikaci a usmrcení hostitelé intaktní, je kutikula, která chrání bakterie i hlístovky před vlivy vnějšího prostředí. Kromě sekretovaných enzymů produkují bakteriální buňky ve fázi I také krystalinní inkluzní proteiny CipA a CipB, jež zůstávají uvnitř buněk a jejichž funkce zatím není zcela známá, avšak do jisté míry souvisí právě se sníženou produkcí enzymů, jako jsou proteázy, lipázy, fosfolipázy nebo hemolyzin. Tyto krystalinní proteiny jsou s největší pravděpodobností také zdrojem aminokyselin nepostradatelných pro růst a vývoj symbiotických hlístovek (You et al., 2006). Mezi poslední skupinu látek produkovaných bakterií P. luminescens patří antimikrobiální látky. Na jejich velké množství a mikrobicidní účinky proti širokému spektru mikroorganismů poukázal již v roce 1982 Akhurst. Význam produkce těchto látek pravděpodobně spočívá v ochraně mrtvého těla hmyzího hostitele před infekcí jinými druhy bakterií, hub a kvasinek pocházejících z vnějšího okolí či kolonizujících střevo hostitele. Dosud byla u P. luminescens popsána antibiotika spadající do 3 skupin - stilbeny (ST), karbapenemy a antrachinony (AQ). Stilbeny jsou produkovány pouze rostlinami a bakteriemi rodu Photorhabdus. Patří mezi ně například 3,5-dihydroxy-4-ethylstilben (eST) nebo epoxystilben (epoxyST). Jsou účinné především proti grampozitivním bakteriím, kde inhibují syntézu RNA. Kromě antibiotických účinků působí u hmyzu také jako inhibitory fenoloxidázy, což napomáhá virulenci komplexu bakterie-hlístovka (Eleftherianos et al., 2007; Joyce et al., 2011). Karbapenemy jsou skupinou klinicky používaných antibiotik β-laktamů. Produkují je převážně gramnegativní bakterie a jsou účinné jak proti gramnegativním, tak i grampozitivním bakteriím (McGowan et al., 1999; Joyce et al., 2011). Stejně jako stilbeny jsou i antrachinony přirozeně produkovány především rostlinami, 18

Escherichia coli K12 ale vyskytují se i u některých bakterií, přičemž jedinou známou gramnegativní bakterií produkující tato barviva s antibiotickými vlastnostmi je právě P. luminescens. Přesná funkce antrachinonů produkovaných těmito bakteriemi zatím není známa, avšak způsobují červené zbarvení mrtvých těl hmyzích hostitelů, což odpuzuje další predátory živící se za normálních podmínek mrtvými pozůstatky těl hmyzu například vosy nebo mravence (Joyce et al., 2011). Jak již bylo zmíněno výše, všechny popsané sekundární metabolity P. luminescens jsou produkovány ve stádiu fáze I, a to především ve stacionární fázi bakteriálního růstu. V experimentální části této práce byly použity následující poddruhy bakterie P. luminescens: P. luminescens subsp. luminescens CCM 7077T (Česká sbírka mikroorganismů, Brno, Česká republika) a P. luminescens subsp. kayaii CCM 7002 (Česká sbírka mikroorganismů, Brno, Česká republika).

3.2.1.1.2. Escherichia coli K12 Rod Escherichia patří stejně jako rod Photorhabdus do čeledi Enterobacteriaceae a třídy Gammaproteobacteria. E. coli je gramnegativní fakultativně anaerobní nesporulující tyčka měřící 2 x 0,25 - 1 µm přirozeně žijící ve střevě teplokrevných živočichů včetně člověka (Kubitschek, 1990). E. coli se vyskytuje ve více než 250 sérotypech od neškodného střevního symbionta až po patogenní bakterii vyskytující se jak vně, tak uvnitř střeva a způsobující závažné infekce urogenitálního traktu (Beloin et al., 2008). E. coli je zároveň jedním z nejdůležitějších modelových organismů používaných v biologii. E. coli K12 je jedním z nejpoužívanějších laboratorních kmenů přizpůsobených pro kultivaci v kontrolovaných podmínkách a na rozdíl od její "wild type" formy již není schopna osídlit střevo živočichů. Poprvé byla izolována v roce 1922 z pacienta zotavujícího se ze záškrtu a po více než 50 letech pasážování byl v roce 1997 osekvenován její genom, což bylo základem pro její použití při mnoha genetických modifikacích (Fux et al., 2005). Existuje několik geneticky modifikovaných bioluminiscenčních E. coli, jež jsou schopny produkce světla. Většinou nesou genetickou informaci pocházející z přirozeně luminiscenčních organismů, například geny hmyzí luciferázy (lucFF) pocházející ze světlušky Photinus pyralis či geny bakteriální luciferázy (luxAB) z mořské bakterie Vibrio harveyi (Gonzáles-Flecha et Demple, 1994; Greer et Szalay, 2002). Tyto bioluminiscenční systémy sice přímo odráží viabilitu jednotlivých bakteriálních buněk měřitelnou pomocí míry světelného signálu, ale nejsou kompletní. Do takto modifikovaných bakteriálních kultur je potřeba uměle dodávat substráty luciferáz, což s sebou přináší komplikace např. v podobě nerovnoměrného transportu těchto substrátů do nitra buněk (Lehtinen et al., 2003). Bioluminiscenční E. coli K12 vytvořená na Univerzitě v Turku (Turku, Finsko) v laboratoři prof. E. M. Liliuse a používaná ve všech následujících experimentech však tyto nedostatky nemá. Nese totiž plasmid obsahující původní operon (luxABCDE) pocházející z P. luminescens, jež obsahuje všechny genetické informace potřebné pro tvorbu bioluminiscenčního signálu (luciferázu + substráty). Zmíněný operon byl ještě doplněn o pEGFP motiv, čímž vznikl plasmid pEGFPluxABCDEAmp (obr. 3), který byl následně vpraven do zmíněné E. coli K12 pomocí elektroporace. Doplněný motiv obsahuje geny pro produkci GFP (Green Fluorescein Protein) a resistenci k antibiotiku ampicilinu, což umožňuje jednoduchou kontrolu úspěšnosti přenesení plasmidu mezi jednotlivými buňkami v bakteriální 19

Optimalizační experimenty suspenzi. Podrobnější popis konstrukce a zavedení plasmidu je uveden ve studii 1 (Atosuo et al., 2013).

Obr. 3: Schematické znázornění plasmidu pEGFPluxABCDEAmp vneseného do E. coli K12.

3.2.1.2. Optimalizační experimenty vybraných bakteriálních druhů Následující čtyři kapitoly popisují základní experimenty porovnávající jednotlivé bioluminiscenční bakterie z hlediska jejich odlišných vlastností a reakcí na měnící se životní podmínky. Experimenty proběhly v rámci optimalizace metodiky využívající zmíněné bioluminiscenční bakterie a většina z nich byla provedena v laboratoři prof. E. M. Liliuse (Univerzita v Turku, Finsko).

3.2.1.2.1. Podmínky kultivace Jak již bylo popsáno výše, P. luminescens je přirozeně silně vázán symbiotickým vztahem s entomopatogenními hlístovkami. Většina jeho fyziologických procesů (tvorba antibiotik, toxinů, pigmentů či vlastní emise světla) se odehrává ve větší míře, nebo pouze, v růstové fázi I (viz druhý odstavec kapitoly 3.2.1.1.1.), jež je navozena právě symbiózou s hlístovkami, proto není jednoduché udržovat laboratorní kulturu těchto bakterií ve stavu schopném emise světla. Po mnoha experimentech zahrnujících kombinace nejrůznějších růstových médií (tekutých i solidních, s živinami nebo bez) s uchováváním v odlišných teplotách (od -80 °C do +39 °C) a současně při zkouškách mnoha mikrobiologických manuálů pro vytvoření zásobní kultury těchto bakterií jsem zjistil, že pro dosažení tohoto stavu je nevyhnutelně nutné nechat bakteriální kulturu procházet jejich přirozeným životním cyklem 20

Optimalizační experimenty uvnitř hlístovek. Toto zjištění představuje obrovskou nevýhodu pro další využití P. luminescens ve většině biologických/biochemických laboratoří, jelikož jeho kultivace vyžaduje současný chov entomopatogenních hlístovek, potažmo jejich hmyzích hostitelů (např. Galleria mellonella). Na druhou stranu se jedná o přirozeně svítící bakterie vyskytující se v půdě téměř všech kontinentů, a na rozdíl od geneticky modifikované E. coli K12 tedy nejsou pro jejich manipulaci potřeba žádné speciální prostory a povolení. Pro získání stabilní luminiscence schopné kultury P. luminescens je tedy nejvhodnější postupovat dle následujících kroků: 1. Nakažení larev hostitelského hmyzu (G. mellonella) hlístovkami Heterorhabditis bacteriophora, larvy jsou přidány do uzavřených Petriho misek s filtračním papírem a suspenzí invazních stádií hlístovek, následuje inkubace přibližně 24 - 48 hodin při 30°C. 2. Nejlépe těsně před, nebo ihned po usmrcení larev následuje sterilizace povrchu larvy 96% etanolem, osušení a odebrání hemolymfy nastřihnutím panožky. Vzniklá kapka hemolymfy je rozetřena na předem připravenou Petriho misku s LB nutričním agarem, následuje inkubace přes noc při 30 °C. 3. Vyrostlé kolonie P. luminescens jsou přeneseny bakteriální kličkou do tekutého LB média a bakteriální kultura třepána po dobu 1 hodiny při laboratorní teplotě. 4. Následuje ředění narostlé kultury na optickou hustotu (OD) přibližně 0,1 při vlnové délce 400 nm. 5. Po zředění jsou bakteriální buňky z kultury odděleny centrifugací (1500 - 2000 ot./min.), supernatant je odstraněn a objem doplněn na původní hodnotu pomocí fosfátového pufru (pH = 7). Buňky jsou takto promyty celkem 3x. 6. Po finálním promytí je část bakteriální suspenze logaritmicky zředěna (většinou ředění 102-106) a jednotlivé koncentrace vyočkovány na Petriho misky s LB nutričním agarem. Po cca 12 hodinové inkubaci je odečten počet vzniklých kolonií a vypočítána přibližná hodnota koncentrace buněk v původní bakteriální suspenzi. Zbytek suspenze je připraven k použití a lze jej uchovávat v lednici při 4 °C po dobu přibližně 7 dnů. 7. Těsně před použitím je suspenzi ještě potřeba naředit na požadovanou koncentraci bakterií v určitém objemu. Pro většinu měření antibakteriálních účinků je ideální ~250 000 buněk/jamku mikrotitrační destičky (200 - 300 µl). Na rozdíl od P. luminescens je příprava stejně jako používaní zásobní kultury E. coli K12 relativně jednoduchá, časově nenáročná a nevyžaduje zvýšené nároky na vybavení laboratoře, nicméně, jak již bylo popsáno výše, jedná se o geneticky modifikovaný organismus (GMO), se kterým je nutno zacházet dle speciálních předpisů. Vytvoření zásobní bakteriální kultury bioluminiscenční E. coli K12 se děje v následujících krocích: 1. Stará bakteriální suspenze E. coli K12 je v malém množství (např. 5 µl) přidána do tekutého LB média (např. 20 ml) a třepána přes noc při 37 °C. 2. Z nové, přerostlé suspenze bakterií je odebráno 5 ml a přidáno do 150 ml tekutého LB média. Tato kultura je třepána při 37 °C dokud nedosáhne OD 0,25 při vlnové délce 620 nm.

21

Optimalizační experimenty 3. Následně jsou ze suspenze pomocí centrifugace (1500 - 2000 ot./min.) odděleny bakteriální buňky, odebrán supernatant a objem doplněn pomocí čerstvého tekutého LB média. 4. Buňky jsou takto promyty celkem 3x, ale při posledním promytí je potřeba pro vysoké zakoncentrování suspenze 80x snížit objem resuspendovaného LB média. 5. K takto vzniklé kultuře je přidán stejný objem 50% glycerolu, finální kultura je rozdělena po malých alikvotech (např. 25 µl) a uskladněna při teplotě -80 °C. Zamraženou zásobní kulturu lze používat minimálně 1 rok. 6. Stejně jako u P. luminescens je v části suspenze pomocí logaritmického ředění, vyočkování na nutriční LB agar a spočítání přes noc vzniklých kolonií (inkubace ve 37 °C) vypočtena koncentrace bakteriálních buněk. 7. Takto uskladněnou zásobní kulturu E. coli K12 lze pro stanovení antibakteriálních účinků ihned po rozmražení doplnit fosfátovým pufrem (pH = 7) na požadovanou koncentraci ~250 000 buněk/jamku mikrotitrační destičky (200 - 300 µl).  Všechna média použitá při přípravě kultury bioluminiscenční E. coli K12 obsahují pro udržení selekčního tlaku 100 µg ampicilinu/ml média. Takto připravené bakteriální kultury lze využít k mnoha antibakteriálním testům ať už biologických či syntetických vzorků. Studie 1 (Atosuo et al., 2013), studie 2 (Vojtek et al., 2014) a studie 5 (Denev et al., 2014b) využívají bioluminiscenční bakterie ke stanovení antibakteriálních účinků živočišných (krevní plasma, hemolymfa), rostlinných (rostlinné extrakty) i synteticky připravených (etanol, polymyxin B) vzorků.

Typický růst bakteriální kultury se většinou rozděluje do 4 fází a je popisován růstovou křivkou (Vogel et al., 2014; obr. 4). První fází je tzv. lag fáze, ke které dochází např. čerstvě po přenesení kultury na nové médium. Bakterie se v ní především biochemicky přizpůsobují novým růstovým podmínkám, syntetizují nové enzymy, RNA a další potřebné molekuly a nejsou ještě schopné se dělit (Madar et al., 2013). Druhou fází životního cyklu bakterií je tzv. log fáze, též nazývaná logaritmická či exponenciální. Jedná se o fázi, ve které se jednotlivé bakteriální buňky dělí, a tak populace obsažená v bakteriální kultuře logaritmicky narůstá. Rychlost exponenciálního růstu takovéto populace je individuální pro každý bakteriální kmen, nicméně může být ovlivněna okolními podmínkami (Zwietering et al., 1990). Jakmile začnou bakteriím v médiu docházet živiny či se naopak začnou hromadit odpadní látky, počet nově vzniklých buněk se vyrovná počtu umírajících buněk, přičemž tato část životního cyklu se nazývá stacionární fáze (Kivisaar, 2010). Poslední fází je fáze odumírání, jež se vyznačuje vysokou úmrtností buněk především z důvodu nedostatku živin či nahromaděných toxických látek v živném médiu. V této fázi dochází často ke sporulaci, tvorbě klidových stádií, jež dokážou přežít nepříznivé podmínky (Nyström, 2003).

22

Optimalizační experimenty

Obr. 4: Typická křivka růstu bakteriální kultury se všemi čtyřmi fázemi životního cyklu. Pro bioluminiscenční stanovení je potřeba, aby se bakterie nacházely v logaritmické fázi růstu, proto se bakterie při přípravě zásobní kultury nechávají vždy alespoň hodinu třepat. Hodina je u obou námi použitých bakteriálních druhů dostatečný čas pro nasyntetizování biochemických aparátů potřebných pro buněčné dělení, a tedy přechod do log fáze buněčného cyklu. Závislost bioluminiscenčního signálu na počtu bakteriálních buněk v suspenzi měřeného pomocí OD znázorňuje obrázek 5. Míra bioluminiscenčního signálu je u následujících experimentů uváděna v relativních světelných jednotkách (RLU) nebo Counts Per Second (CPS).

23


15000

0,30

RLU OD 400 nm

0,20 9000

log fáze 0,15

OD 400 nm

(RLU) luminiscence RLU

0,25 12000

6000 0,10

3000

0,05 0

20

40

60

80

100 120 140 160 180 200 220 240

čas èas(min) (min)

Obr. 5: Závislost bioluminiscenčního signálu na rostoucím počtu bakteriálních buněk v suspenzi během logaritmické fáze buněčného cyklu bakterií P. luminescens v tekutém LB médiu. Vodorovná modrá úsečka vyznačuje úsek log fáze ideální pro luminiscenční měření, zelená úsečka udává směrnici růstové křivky, jež vyjadřuje rychlost exponenciálního růstu bakteriální kultury.

3.2.1.2.2. Teplotní optimum Oba zvolené bakteriální druhy jsou si v mnoha ohledech podobné, jedná se o gramnegativní tyčky žijící symbioticky ve střevě, nicméně se velmi odlišují v jejich teplotním optimu, jež do značné míry souvisí s jejich hostiteli. P. luminescens jakožto přirozený symbiont entomopatogenních hlístovek, potažmo patogen hmyzu, by měl mít teplotní optimum kolem 30 °C (Hyršl et al., 2004). Naproti tomu teplotní optimum E. coli, přirozeného symbionta/patogena teplokrevných živočichů, by se mělo pohybovat kolem 37 °C (Nguyen, 2006). Při teplotních optimalizačních experimentech jsem zjistil, že P. luminescens není schopný tolerovat teploty přesahující 35 °C, a jeho teplotní optimum se opravdu nachází mezi 29 - 31 °C. Tato teplota je zároveň ideální pro bioluminiscenční experimenty, jelikož poskytuje dostatečně dlouhou logaritmickou fázi růstu při vysokém luminiscenčním signálu. Při teplotách pod 29 °C mají bakteriální buňky zpomalený metabolismus, proto nedosahují vysokého luminiscenčního signálu, ale při použití dostatečně citlivého luminometru je možné provádět experimenty i při laboratorní teplotě, tedy kolem 25 °C. Teplotní závislost růstu bakteriální kultury P. luminescens je znázorněna na obrázku 6a. Stejné experimentálně navozené podmínky také potvrdily teplotní optimum kolem 37 °C u E. coli. Při této teplotě vykazuje dostatečně vysoký luminiscenční signál a zároveň dlouhou exponenciální fázi růstu. Při teplotě 39 °C je již vlivem zvýšeného metabolismu log fáze 24

Optimalizační experimenty zkrácena a při teplotách nižších než 35 °C bakterie nedosahují tak kvalitní emise světla. Teplotní závislost růstu bakteriální suspenze E. coli znázorňuje obrázek 6b. Z výsledků daných experimentů tedy vyplývá, že kulturu bakterií P. luminescens je vhodnější použít pro měření antibakteriálních účinků biologických vzorků poikilotermních živočichů, kdežto kulturu E. coli pro vzorky homoiotermních živočichů. Na obrázku 6 lze také pozorovat markantní rozdíl ve velikosti světelného signálu produkovaného P. luminescens a E. coli. Zhruba desetinásobný nárůst signálu u E. coli oproti P. luminescens je způsoben přítomností velkého počtu kopií plasmidů nesoucích genetické informace pro tvorbu světla v jedné bakteriální buňce E. coli, narozdíl od P. luminescens, jenž nese geny pro tvorbu světelného signálu pouze v jádře.

25


RLU (RLU) luminiscence

10000

a)

27 °C 29 °C 31 °C 33 °C 35 °C 37 °C 39 °C

1000

100 0

20

40

60

80

100

120

èas čas (min)


1000000

b)

27 29 31 33 35 37 39

100000

°C °C °C °C °C °C °C

10000 0

20

40

60

80

100

120


Obr. 6: Teplotní závislost produkce bioluminiscenčního signálu bakteriální kultury P. luminescens (a) a E. coli (b) v tekutém LB médiu.

26


3.2.1.2.3. Změna počtu bakterií v závislosti na OD Měření OD bakteriální suspenze je jedna z metod často používaných pro odhad množství živých bakteriálních buněk v této suspenzi obsažených. Slovo odhad je v tomto případě na místě, jelikož tato metoda není schopná rozlišit, zdali jsou tyto buňky živé či mrtvé. I proto jsou nyní bioluminiscenční bakterie využívány pro nejrůznější testy toxicity čím dál více (Trott et al., 2007; Kurvet et al., 2011). Jak již bylo popsáno výše, bakteriální bioluminiscence je přímo úměrná jejich viabilitě a naše metoda tedy umožňuje poměrně přesné určení počtu živých a zabitých buněk v reálném čase. Měření OD je však stále vhodné pro rychlý a hrubý odhad počtu bakteriálních buněk v suspenzi. Je proto dobré znát přibližné hodnoty počtu bakteriálních buněk odpovídajících určité OD živného média obsahujícího dané bakterie. Hodnoty počtu buněk se totiž u jednotlivých bakteriálních kmenů významně liší, tuto závislost znázorňuje obrázek 7. Z grafů lze vyčíst, že průběh růstu bakteriální suspenze P. luminescens je lineárnější než v případě E. coli, jejíž nárůst je dle předpokladů exponenciální. Tomuto jevu odpovídá i fakt, že při nejvyšší měřené OD (0,9) obsahuje kultura E. coli na ml LB média nejméně o 120 milionů buněk více, než kultura P. luminescens, přičemž naměřené hodnoty pro P. luminescens odpovídají hodnotám uváděným v literatuře - Hyršl et al. (2004) uvádí, že při OD400 1,0 obsahuje suspenze bakterií P. luminescens přibližně 24 x 107 buněk/ml LB média. Volkmer a Heinemann (2011) však uvádí že kultura E. coli K12 při OD600 1,0 obsahuje 78 x 107 buněk/ml LB média, což je téměř dvojnásobek mnou naměřených hodnot. Tento rozdíl může být způsoben použitím různých spektrofotometrů (Matlock et al., 2011) či odlišným způsobem kultivace bakterií. Usuzování přibližného počtu bakteriálních buněk podle měření OD média je proto dobré používat pouze v rámci jednoho pracoviště se zavedenými postupy přípravy bakteriálních kultur a používajícího při měření jeden spektrofotometr.

27


26

a)

24 22 7 107/ml počet /ml bunìk xx10 poèet buněk

20 18 16 14

P. luminescens

12 10 8 6 4 2 0 0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1077/ml počet /ml bunìk xx 10 poèet buněk

OD 400 nm

36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

b)

E. coli

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

OD 620 nm

Obr. 7: Závislost změny počtu bakteriálních buněk P. luminescens (a) a E. coli K12 (b) na měnící se OD bakteriální suspenze v LB médiu. 28


3.2.1.2.4. Bakterie a zabíječský systém H2O2/MPO Jednou z nejúčinnějších chemikálií při eliminaci bakterií je kyselina chlorná (HOCl) a její deriváty, jež jsou výsledkem systému chemických reakcí peroxidu vodíku (H2O2) s enzymem myeloperoxidázou (MPO; Grey et al., 2013); samotný peroxid vodíku je však také vysoce reaktivní, a je tedy schopen zabíjet bakteriální buňky i bez přítomnosti MPO (Clifford et Repine, 1982). Tyto zabíječské systémy jsou součástí výzbroje imunitního systému většiny obratlovců a nejčastěji jsou produkovány fagocytujícími buňkami jako odpověď na pohlcení patogenu (Hurst, 2012). Podrobnější popis tvorby a účinků RMK naleznete v kapitole 5.1. Vzhledem k popsaným účinkům systému H2O2/MPO a možnosti využití bioluminiscenčních bakterií jako indikátoru koncentrace MPO v krevním séru či v jiných biologických materiálech bylo zajímavé porovnat vliv daných chemikálií na jednotlivé bakterie. Antibakteriální účinky samotného H2O2 znázorňuje obrázek 8. Fyziologická koncentrace H2O2 ve fagolysozomu je přibližně 30 µM (Klebanoff et al., 2013). Pro experiment byly tedy vybrány koncentrace od 16 do 2560 µM. Výběr koncentrací vysoko nad fyziologickými hranicemi vycházel z předpokladu, že samotný H2O2 bez přítomnosti MPO nebude příliš účinný. Z obrázku 8b však lze vypozorovat, že i samotný H2O2 již při 64 µM koncentraci viditelně snižuje viabilitu E. coli a nejvyšší 2560 µM koncentrace byla schopna po hodině měření eliminovat téměř 100 % bakterií. Toto zjištění bohužel nedává velké naděje využití E. coli jako indikátoru koncentrace MPO v biologických vzorcích, ale podporuje teorii Winterbourna et al. (1985), že MPO vlastně není při degradaci bakteriální buňky uvnitř fagolysozomu vůbec potřeba. Naopak výsledky stejného experimentu s P. luminescens (obr. 8a) ukazují, že tato bakterie je proti účinkům H2O2 naprosto imunní a ani téměř 100 násobná fyziologická koncentrace H2O2 na ni nemá žádný destruktivní účinek. P. luminescens se tedy jeví jako ideální bakterie pro indikaci koncentrace MPO v biologických vzorcích. Vzhledem k těmto zjištěním jsou u experimentů s MPO prezentovány pouze experimenty s P. luminescens.

29



1000

a)

P.l. P.l. + 2560 µM H2O2 P.l. + 1280 µM H2O2 P.l. + 640 µM H2O2 P.l. + 320 µM H2O2 P.l. + 128 µM H2O2 P.l. + 64 µM H2O2 P.l. + 32 µM H2O2 P.l. + 16 µM H2O2

100

10

1 0

10

20

30

40

50

60

èas (min) čas (min)


1000000

b)

E. coli E. coli + 2560 µM H2O2 E. coli + 1280 µM H2O2 E. coli + 640 µM H2O2 E. coli + 320 µM H2O2 E. coli + 128 µM H2O2 E. coli + 64 µM H2O2 E. coli + 32 µM H2O2 E. coli + 16 µM H2O2

100000

10000

1000

100 0

10

20

30

40

50

60

èas (min)

čas (min)

Obr. 8: Antibakteriální účinek různých koncentrací H2O2 na bakterie P. luminescens (a) a E. coli (b). Koncentrace obou bakteriálních druhů byla 1,2 x 106 buněk/jamku.

30

Optimalizační experimenty Následujícím krokem bylo přidání fyziologicky běžně dostupných a pro danou reakci nezbytných chloridových aniontů (Cl-) v podobě NaCl nebo bromidových aniontů (Br-) v podobě KBr a různých koncentrací MPO. Při optimalizaci byly zvoleny přibližné fyziologické hodnoty Cl- a Br- tedy 155 mM (extracelulární) a 73 mM (intracelulární; Painter et Wang, 2006). Ukázalo se však, že reakce není nijak limitována koncentrací těchto iontů a pro další experimenty byla tedy vzhledem k možnosti budoucích měření koncentrace MPO v krevním séru zvolena vyšší, extracelulární, koncentrace (155 mM). Zároveň bylo zjištěno, že Br- ionty vykazovaly ve spojení s ostatními chemikáliemi lehce vyšší antibakteriální účinky než Cl- ionty, a proto je v následujících grafech použit KBr. Stejně tak bylo vyzkoušeno několik koncentrací MPO, od 0,5 do 2 µg/100 µl reakční směsi a pro následující experimenty byla vybrána střední hodnota - 1 µg/100 µl reakční směsi. Antibakteriální účinky systému H2O2/MPO znázorňuje obrázek 9. Dle očekávání byly bakterie P. luminescens úspěšně zabíjeny vzniklou kyselinou bromnou (HOBr) již při nízkých koncentracích H2O2. Limitní byla koncentrace 128 µM, která zabila přibližně 80 % bakterií, přičemž vyšší koncentrace H2O2 zabíjely od 90 do 100 % bakterií a nižší koncentrace přibližně od 20 do 50 % bakteriálních buněk. Fyziologická koncentrace H2O2 (32 µM) zabila téměř 31 % bakterií, což je přibližně 372 x 103 bakteriálních buněk. Procentuální úmrtnost po půl hodině měření vyjadřuje obrázek 10. Pro srovnání bakterie E. coli K12 byla po přidání MPO zabíjena mnohem efektivněji než P. luminescens a již při 10 µM koncentraci H2O2 došlo po půl hodině měření k inhibici téměř 52 % bakteriálních buněk. Fyziologická koncentrace H2O2 pak zabila necelých 80 % bakterií.


1000

P.l. P.l. + MPO + 2560 µM H2O2 P.l. + MPO + 1280 µM H2O2 P.l. + MPO + 640 µM H2O2 P.l. + MPO + 320 µM H2O2 P.l. + MPO + 128 µM H2O2 P.l. + MPO + 64 µM H2O2 P.l. + MPO + 32 µM H2O2 P.l. + MPO + 16 µM H2O2

100

10

1 0

10

20

30

40

50

60


Obr. 9: Antibakteriální účinky systému H2O2/MPO na bakterii P. luminescens. Do systému byl rovněž přidán 155 mM KBr, koncentrace MPO byla 1 µg/100 µl reakční směsi a koncentrace bakterií byla 1,2 x 106 buněk/jamku.

31


320 µM

100

640 µM

2560 µM

1280 µM

128 µM

úmrtnost (%)

80

60

P. luminescens 64 µM 40 32 µM 20 16 µM 0 0

400

800

1200

1600

2000

2400

2800

µM H2O2

Obr. 10: Procentuální vyjádření úmrtnosti bakterií P. luminescens po 30 minutách měření antibakteriálního účinku systému H2O2/MPO. Do systému byl rovněž přidán 155 mM KBr, koncentrace MPO byla 1 µg/100 µl reakční směsi a koncentrace bakterií byla 1,2 x 106 buněk/jamku. Vzhledem k tomu, že po přidání MPO byly buňky P. luminescens zabíjeny, imunita těchto bakterií vůči samotnému H2O2 musí spočívat v jeho eliminaci. Bakterie nejrůznějších druhů používají na obranu před imunitním systémem svého hostitele různorodé spektrum látek. Jednou z těchto látek je také kataláza, enzym, jenž rozkládá H2O2 na vodu a molekulární kyslík, a jehož účinky využívají jako ochranu před zabíječskými mechanismy H2O2 např. bakterie Bacillus anthracis, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus nebo námi studovaná E. coli K12 a P. luminescens (Mandell, 1975; Chalabaev et al., 2007; Harrison et al., 2012; Tonello et Zornetta, 2012). Naše výsledky měření antibakteriálních účinků čistého H2O2 obou bakterií byly však velice odlišné, a proto jsme se v následujících experimentech pokusili inhibovat účinky bakteriemi produkované katalázy pomocí 5mM azidu sodného (NaN3) - obrázek 11. Jak je vidět, i samotný NaN3 je pro bakteriální buňky lehce toxický, nicméně výsledky potvrdily produkci katalázy oběma druhy bakterií a dle předpokladů při porovnání s výsledky z obrázku 8 naznačují mnohem vyšší produkci katalázy u P. luminescens a nižší u E. coli. Potvrdil se tedy i náš předpoklad, že P. luminescens je díky svým ochranným mechanismům, zahrnujících mimo jiné i produkci velkého množství katalázy, ideální bakterií pro vytvoření metodiky schopné určit množství MPO v biologických vzorcích. Navrhovaná metodika, stejně jako měření množství produkované katalázy P. luminescens pomocí luminiscenčního signálu, jsou nyní rozpracovány ve fázi optimalizací jednotlivých měření a v brzké budoucnosti jistě přinesou zajímavé výsledky. 32



1000

a) P.l. P.l. + 2560 µM H2O2 + NaN3 P.l. + 1280 µM H2O2 + NaN3 P.l. + 640 µM H2O2 + NaN3 P.l. + 320 µM H2O2 + NaN3 P.l. + 128 µM H2O2 + NaN3 P.l. + 64 µM H2O2 + NaN3 P.l. + 32 µM H2O2 + NaN3 P.l. + 16 µM H2O2 + NaN3 P.l. + 5 mM NaN3

100

10

1 0

10

20

30

40

50

60

čas (min) èas (min)


1000000

b) E. coli E. coli + 2560 µM H2O2 + NaN3 E. coli + 1280 µM H2O2 + NaN3 E. coli + 640 µM H2O2 + NaN3 E. coli + 320 µM H2O2 + NaN3 E. coli + 128 µM H2O2 + NaN3 E. coli + 64 µM H2O2 + NaN3 E. coli + 32 µM H2O2 + NaN3 E. coli + 16 µM H2O2 + NaN3 E. coli + 5 mM NaN3

100000

10000

1000

100 0

10

20

30

40

50

60

čas (min) èas (min)

Obr. 11: Antibakteriální účinek různé koncentrace H2O2 na P. luminescens (a) a E. coli (b) po inhibici produkované katalázy 5 mM NaN3, koncentrace bakterií byla 1,2 x 106 buněk/jamku.

33

Vrozená imunita

4. Vrozená imunita Imunitní systém živočichů lze rozdělit do dvou základních kategorií - vrozená (nespecifická) imunita a adaptivní (specifická) imunita. Obě zmíněné kategorie pak zahrnují humorální a buněčnou složku (Delves et Roitt, 2000). Vrozená imunita je evolučně starší a je tedy přítomná jak u bezobratlých živočichů, tak i obratlovců, naopak adaptivní složka imunity založená na protilátkách se vyskytuje pouze u obratlovců. Mechanismy vrozené imunity jsou většinou v organismu připraveny předem a v momentě napadení rychle reagují na velké množství nejrůznějších patogenů. Adaptivní imunita naopak reaguje pomaleji, jelikož její složky jsou většinou syntetizovány až po napadení organismu a jsou přímo cílené na specifické molekuly jednoho daného patogenu (Parkin et Cohen, 2001). Jednotlivé složky vrozené imunity, ať už humorální či buněčné, spolu navzájem spolupracují, a proto je mnohdy složité je přiřadit do jednotlivých skupin. Příkladem může být koagulační kaskáda, jež zahrnuje jak humorální, tak i buněčnou složku vrozené imunity (Braun et al., 1998). Znázornění rozdělení imunitního systému včetně hlavních příkladů jednotlivých mechanismů je na obrázku 12. Pro účely této práce je důležitá především humorální vrozená imunita, jež bude popsána v následujících kapitolách, a její hlavní složky působící v obraně organismu proti bakteriální infekci, tedy antimikrobiální peptidy a komplementový systém.

Obr. 12: Schéma znázorňující rozdělení imunitního systému živočichů s příklady jednotlivých mechanismů.

34

Antimikrobiální peptidy

4.1.

Vrozené antibakteriální mechanismy živočichů

Jak již bylo popsáno výše, mezi vrozené antibakteriální mechanismy živočichů patří buněčné a humorální reakce imunitního systému. Hlavní složkou vrozené buněčné imunity jak bezobratlých, tak i obratlovců je fagocytóza. Proces fagocytózy je definován jako rozpoznání, navázání a pohlcení částic větších než 5 µm buňkou (Flannagan et al., 2012). Při rozpoznání cizích částic hrají důležitou roli molekuly vázané na jejich povrchu. V případě bakterií se nejčastěji jedná o tzv. Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs), tedy molekuly, které se vyskytují pouze u těchto nižších organismů. Mezi nejznámější bakteriální PAMPs patří například lypopolysacharid (LPS) obsažený v buněčné stěně gramnegativních bakterií či peptidoglykan grampozitivních bakterií (Nürnberger et Brunner, 2002). Tyto molekuly jsou rozpoznávány pomocí Pattern-Recognition receptorů (PRR) fagocytujících buněk. Mezi tyto receptory patří například Toll-like receptory (TLR; Moresco et al., 2011) či manózový receptor (Taylor et al., 1990). Pro usnadnění rozpoznání cizích částic fagocytujícími buňkami jsou tyto částice často označeny (opsonizovány) imunoglobuliny (Ig; Akula et al., 2014) či složkami komplementového systému, jako např. iC3b (Ross et al., 1992). Takto označené částice jsou poté snadněji rozpoznány receptory pro Fc fragment imunoglobulinů (Anthony et Ravetch, 2010) či CR1, 3 a 4 receptorem (receptory pro jednotlivé složky komplementu; Ross et al., 1992) fagocytujících buněk. Mezi buňky schopné fagocytózy se u bezobratlých řadí plasmatocyty a granulocyty (Gupta, 2002; Honti et al., 2014), u obratlovců jsou to pak především profesionální fagocyty, mezi které patří neutrofily, monocyty/makrofágy a dendritické buňky (Rabinovitch, 1995; Flannagan et al., 2012) ryb a savců, či heterofily plazů a ptáků (Cooper-Bailey et al., 2011; Wigley, 2013). Po úspěšném pohlcení částice buňkou je tato částice uzavřena ve fagozomu, jenž se následně spojí s lysozomem a vytvoří tak fagolysozom (Harrison et al., 2003). Uvnitř fagolysozomu je poté částice zničena pomocí kyselého prostředí (pH ~ 4,5), vysokého oxidačního stresu prezentovaného velkým množstvím RMK a množství hydrolytických enzymů, jako je např. lysozym (Flannagan et al., 2012). Hlavními složkami humorální vrozené imunity jsou především antimikrobiální peptidy a komplementový systém.

4.1.1.


Antimikrobiální peptidy (AMP) jsou v poslední době velmi studovanými molekulami, o čemž svědčí i fakt, že za posledních 20 let jich bylo popsáno více než 1200. Mohly by totiž sloužit jako náhrada za antibiotika, která začínají být proti mnoha bakteriálním infekcím neúčinná z důvodu narůstající bakteriální resistence. AMP jsou malé peptidy skládající se z 10 - 50 aminokyselin vyskytující se u mikrobů, rostlin, bezobratlých živočichů i obratlovců (Nakatsuji et Gallo, 2012). Postrádají specifické aminokyselinové sekvence, které by byly totožné u všech AMP, avšak většinou mají pozitivní náboj a mají amfipatickou strukturu (obsahují jak hydrofilní, tak i hydrofobní části; Lai et Gallo, 2009). Takovéto složení jim umožňuje interagovat s negativně nabitými fosfolipidovými hlavicemi a hydrofobními mastnými kyselinami bakteriálních membrán, což vede k tvorbě póru, vylití cytozolu a tedy usmrcení bakteriální buňky (Wimley, 2010). Jejich účinky však byly potvrzeny nejen proti 35

Antimikrobiální peptidy bakteriím (gramnegativním/grampozitivním), ale také proti virům, houbám či prvokům (Hultmark, 2003). Mechanismus účinku AMP spočívá především v mechanickém narušení záporně nabité fosfolipidové dvojvrstvy bakteriální membrány, k níž jsou AMP přitahovány elektrostatickými silami. Toto narušení může probíhat podle následujících čtyř popsaných cest (Jenssen et al., 2006). První je tzv. agregační model, spočívá v procházení AMP membránou do nitra buňky, aniž by zaujímaly speciální orientaci. Další cestou je model toroidního póru, kdy hydrofilní části AMP asociují s hlavičkami fosfolipidů a hydrofobní části s jejich tělem, následkem čehož vzniká v membráně pór. Model sudové skruže spočívá v tom, že se AMP zanoří do fosfolipidové dvojvrstvy ve tvaru jakési skruže, kdy hydrofilní části AMP směřují do nitra této skruže a hydrofobní části interagují s lipidovou dvojvrstvou, důsledkem čehož je opět pór v membráně. Poslední cestou narušení membrány je tzv. kobercový model, u kterého se nejprve AMP paralelně naskládají na lipidovou dvojvrstvu a po dosáhnutí potřebné koncentrace peptidů následně obalí a vytrhnou kus této dvojvrtstvy, po které opět zůstane pór. U všech modelů, kde dochází k vytvoření póru, bakterie odumírá díky zvýšené permeabilitě membrány. V případě, že k vytvoření póru nedojde, mohou AMP působit v buňce přímo na replikaci DNA nebo mohou inhibovat skládání proteinů, enzymy upravující aminoglykosidy či syntézu mRNA, proteinů a buněčné stěny (Jenssen et al., 2006). Všechny čtyři mechanismy účinků AMP názorně popisuje obrázek 13.

36


Replikace DNA

syntéza mRNA

syntéza buněčné stěny

syntéza proteinů

skládání proteinů enzymy upravující aminoglykosidy

Obr. 13: Typy mechanismů působení AMP, A - agregační model, B - model toroidního póru, C - model sudové skruže, D - kobercový model, E až I - mechanismy účinků AMP uvnitř buňky (upraveno dle Jenssen et al., 2006). AMP se dělí dle nejrůznějších kritérií, nejčastěji však dle jejich sekundární struktury na AMP obsahující α-helikální strukturu, strukturu skládaného listu stabilizovaného disulfidickými můstky, strukturu dlouhých vláken a strukturu uzavřených smyček (Lai et Gallo, 2009). Toto dělení zahrnuje především AMP produkované obratlovci. Mezi nejstudovanější AMP obratlovců patří především cathelicidiny a defensiny. Cathelicidiny byly popsány jak u obratlovců, tak i bezobratlých. Nejznámější savčí cathelicidin je LL37 produkovaný především granulocyty, NK buňkami a žírnými buňkami v inaktivní formě jako hCAP18. LL37 je aktivován serinovými proteázami a proteinázou 3 a má široké spektrum antimikrobiálních účinků (Cole et al., 2001; Lai et Gallo, 2009). Defensiny jsou kationické 37

Antimikrobiální peptidy AMP obsahující vždy šest cysteinových reziduí. U savců bylo doposud popsáno přibližně 50 α-defensinů a 90 β-defensinů. Produkovány jsou neutrofily, Panethovými buňkami, monocyty/makrofágy, keratinocyty či slizničními buňkami dýchacího, zažívacího, močového a pohlavního traktu. Stejně jako cathelicidiny jsou mikrobicidní účinky defensinů aktivovány proteolytickým štěpením jejich inaktivní formy (Yang et al., 2002; Pazgier et al., 2006). AMP bezobratlých živočichů, především hmyzu, jsou nejdůležitější humorální složkou jejich vrozené imunity. AMP jsou rychle syntetizovány především po proniknutí mikrobiální infekce do těla hmyzu, avšak některé AMP jsou v nízkých hladinách přítomny neustále (Neubauerová et al., 2009). AMP hmyzu jsou produkovány do hemolymfy tukovým tělesem a hemocyty. Nejčastěji se dělí do čtyř tříd na peptidy obsahující α-helikální strukturu jako jsou cecropiny a moriciny; peptidy obsahující cystein, kam patří např. defensiny, drosomycin či thanatin; dále pak peptidy bohaté na prolin např. drosocin, lebocin nebo formaecin a poslední skupinou jsou gloveriny, tedy peptidy bohaté na glycin (Bulet et al., 1999; Bulet et Stöcklin, 2005). Hmyzí defensiny obsahují stejně jako defensiny obratlovců šest cysteinových reziduí, dělí se na α- a β-defensiny a jsou rozšířeny skrz většinu hmyzí říše. Jsou účinné především proti grampozitivním bakteriím jako např. E. coli, Micrococcus luteus, Bacillus thuringiensis a dalším. Jejich antimikrobiální aktivita spočívá ve vytváření kanálů v cytoplasmatické membráně bakterií (Gao et Zhu, 2014; Yi et al., 2014). Hmyzí cecropiny byly zatím popsány u řádů Lepidoptera, Diptera a Coleoptera. Jsou účinné proti gramnegativním i grampozitivním bakteriím a také houbám. Kromě svých antimikrobiálních vlastností jsou cecropiny schopny inhibovat in vitro např. replikaci HIV-1 viru či ničit některé parazity (Wachinger et al., 1998; Li et al., 2012). Attaciny hmyzu se dělí na dvě skupiny bazické a kyselé - a byly zatím pozorovány u řádů Lepidoptera a Diptera. Aktivované attaciny vznikají z pro-attacinů štěpením furinovými enzymy. Většina má antibakteriální účinky proti gramnegativním bakteriím jako např. E. coli či Pseudomonas cichorii a grampozitivním bakteriím Bacillus subtilis nebo Listeria monocytogenes (Bang et al., 2012). Jejich mikrobicidní aktivita spočívá ve tvorbě póru ve vnější bakteriální membráně, čímž se zvyšuje její permeabilita (Gunne et Steiner, 1993; Yi et al., 2014). Lebociny byly poprvé objeveny u bource morušového (Bombyx mori), ale doposud byly pozorovány i u jiných lepidopter. Stejně jako většina ostatních AMP jsou aktivovány proteolytickým štěpením inaktivního prekurzoru. Lebociny jsou rovněž aktivní proti gramnegativním i grampozitivním bakteriím a některým houbám (Rao et al., 2012). Moriciny byly stejně jako lebociny objeveny u B. mori a zatím nalezeny pouze u řádu Lepidoptera. Jsou také účinné proti gramnegativním i grampozitivním bakteriím tím, že zvyšují permeabilitu jejich buněčné membrány. Kromě antibakteriálního účinku jsou některé moriciny schopné ničit také houby a kvasinky, stejně jako attaciny (Yang et al., 2011; Yi et al., 2014). Gloveriny jsou bazické peptidy účinkující proti gramnegativním i grampozitivním bakteriím, houbám a virům. Antimikrobiální účinky některých gloverinů zatím nejsou zcela objasněny, avšak usuzuje se na jejich vazbu na bakteriální LPS a následnou inhibici tvorby proteinů vnější membrány, a tím zvýšení její permeability (Yi et al., 2013). Ve studii 2 (Vojtek et al., 2014) byla sledována antimikrobiální aktivita hemolymfy bource morušového (B. mori) a zavíječe voskového (Galleria mellonella) proti gamnegativním bakteriím, jež je zajišťována AMP. U B. mori byly zatím popsány následující AMP: cecropiny, lebociny, attaciny a moriciny (Yamakawa et Tanaka, 1999). 38

Komplementový systém U G. mellonella byly identifikovány tyto AMP: cecropiny, attaciny, defensiny, gloveriny a moricinu podobné gallerimicin a galiomicin (Schuhmann et al., 2003; Lee et al., 2004). Produkce všech zmíněných AMP hmyzu je kontrolována především dvěma signálními dráhami a to Toll a Imd. Aktivace membránového receptoru Toll grampozitivními bakteriemi či houbami spouští kaskádu signálních molekul až k transkripčním faktorům Dorsal a Dif, jež po translokaci do jádra spouští expresi genů odpovědných za produkci konkrétních AMP. Signální dráha Imd je spouštěna gramnegativními bakteriemi - ty se váží pomocí peptidoglykanů na transmembránový receptor PGRP-LC, který pomocí několika dalších signálních proteinů aktivuje transkripční faktor Relish. Ten je následně - obdobně jako Dorsal a Dif - translokován do jádra, kde spouští expresi genů odpovědných za produkci potřebných AMP (Hultmark, 2003; Lemaitre, 2004). Zvláštním AMP je enzym lysozym, jenž se vyskytuje jak u bezobratlých, tak i u obratlovců. Poprvé byl objeven v roce 1922 Alexandrem Flemingem ve vaječném bílku. Jedná se o muramidázu, tedy enzym katalyzující hydrolýzu 1,4-beta spojů mezi N-acetylmuramovou kyselinou a N-acetyl-D-glukosaminem v peptidoglykanu (mureinu; Callewaert et al., 2008). Murein je přítomný v buněčné stěně všech bakterií, avšak u gramnegativních bakterií je kryt vrstvou LPS, proto je lysozym účinný hlavně proti grampozitivním bakteriím. Existují tři typy lysozymu: C (chicken), G (goose) - oba přítomny u obratlovců - a lysozym I (invertebrate) nacházející se u bezobratlých živočichů (Van Herreweghe et al., 2010). Lysozym je obsažen v slzách, slinách, potu, spermatické tekutině, mléce, plasmě, vaječném bílku, rybím mukusu, hemolymfě hmyzu a mnoha dalších živočišných tekutinách.

4.1.2.

Komplementový systém

Stejně jako hrají AMP klíčovou roli v humorální vrozené imunitě hmyzu (bezobratlých), komplement plní tuto roli u většiny obratlovců. Jedná se o systém více než 35 plasmatických či membránově vázaných proteinů, které jsou aktivovány kaskádou enzymatických reakcí, jež vyúsťují ve vytvoření póru v bakteriální membráně a tedy ve smrt samotné bakterie. Komplement však při bakteriální infekci neplní pouze finální zabíječskou funkci, ale má také funkci chemotaktickou a opsonizační, čímž napomáhá při fagocytóze, či atrahuje ostatní buňky imunitního systému včetně T a B lymfocytů k zapojení do eliminace patogenů. Navíc je komplement do značné míry spojen také s koagulací (Amara et al., 2008), z čehož vyplývá, že spojuje jak humorální, tak buněčnou imunitu, ale také vrozenou a adaptivní imunitu (Dunkelberger et Song, 2010). Komplementový systém může být aktivován třemi cestami: alternativní, klasickou, a lektinovou. Všechny 3 cesty aktivace znázorňuje obr. 14. Alternativní cesta aktivace komplementu je evolučně nejstarší a je spouštěna vazbou molekuly C3b (jež je v malých dávkách neustále odštěpována z plazmatického proteinu C3) na specifické karbohydráty, lipidy či proteiny vystavené na povrchu bakterií či jiných patogenů (Camous et al., 2011). Po navázání dochází k vazbě faktoru B na molekulu C3b a jeho následnému rozštěpení faktorem D. Vzniká tak komplex C3bBb neboli alternativní C3 konvertáza. Ta je chráněna plasmatickým properdinem vypouštěným aktivovanými neutrofily proti účinkům faktorů H a I, jež působí jako zpětnovazebné inhibitory aktivace komplementu. 39

Komplementový systém Kemper et al. (2010) rovněž naznačuje, že properdin je schopný přímé aktivace komplementu po vazbě na patogenní částici. Klasická cesta aktivace komplementu je závislá na protilátkách IgG či IgM navázaných na povrchu patogenu (Sarma et Ward, 2012). Na jejich Fc fragment se totiž váže C1 komplex pomocí molekuly C1q, což aktivuje zbylé dvě molekuly C1r a C1s. C1s následně štěpí proteiny C4 a C2, jejichž větší části následně vytváří komplex C4bC2a zvaný klasická C3 konvertáza. Lektinová cesta aktivace komplementu začíná při vazbě manózu vázajícího lektinu (Mannose Binding Lectin, MBL) či ficolinu na karbohydrátové struktury na povrchu bakterií či kavasinek (Matsushita et al., 2013). MBL je většinou vázán v komplexu s MBL-Asociovanými Serinovými Proteázami (MASP) 1 - 3, jež jsou obdobou molekul C1r a C1s klasické cesty aktivace komplementu. Tyto MASP jsou tedy také schopny štěpit proteiny C4 a C2 za vzniku klasické C3 konvertázy C4bC2a.

Obr. 14: Tři cesty aktivace kaskády komplementového systému včetně jeho inhibitorů uvedených v rámečcích (upraveno podle Sarma et Ward, 2011). 40

Komplementový systém Po vytvoření C3 konvertáz pokračují všechny 3 cesty aktivace komplementu stejně (Dunkelberger et Song, 2010). Tyto C3 konvertázy štěpí v plasmě přítomné C3 molekuly na složku C3a a C3b. Molekula C3b se opět váže na povrch dalších patogenů (opsonizuje), čímž znásobuje aktivaci komplementového systému a napomáhá fagocytóze. Další molekuly C3b se váží na již vzniklé C3 konvertázy a vznikají tak C5 konvertázy, komplexy C3bBbC3b a C4bC2aC3b schopné štěpit proteiny C5 na molekuly C5a (menší) a C5b (větší). C5a spolu s C3a působí jako anafylatoxiny, tedy mediátory zánětu způsobující např. vazodiltaci a chemotaxi dalších buněk imunitního systému (Sarma et Ward, 2012). Molekula C5b navázaná na patogenu pak na sebe dále váže molekulu C6, C7, C8 a větší množství molekul C9, jež se zanořují do bakteriální membrány a vytváří tak pór vedoucí k lýze dané buňky. Takto vzniklý komplex molekul se nazývá Memabrane Attack Complex (MAC) a je výsledkem tzv. lytické fáze aktivace komplementu (Rodríguez et al., 2014). Komplementový systém je velice účinnou zbraní proti invazi patogenů, avšak při jeho poruše může být stejně jako většina imunitních procesů destruktivní i pro buňky tělu vlastní. Proto je regulován mnoha inhibitory na nejrůznějších místech své aktivace (Sarma et Ward, 2011) počínaje C1 inhibitorem inhibujícím molekuly C1r, C1s a MASP2, tedy ranou fázi aktivace komplementu, přes faktory I a H, jež inhibují tvorbu C3 konvertázy, dále přes inhibiční účinek Decay Acceleration Factor (DAF) a C4 Binding Protein (C4BP) na již vytvořenou C3 konvertázu, až po molekulu CD59, jež zabraňuje vytvoření struktury MAC při lytické fázi (Camous et al., 2011). Možností měření aktivity komplementového systému není mnoho, nejčastěji se pouze stanovují hladiny jednotlivých proteinů v krvi pomocí imunohistochemických metod. Vlastní aktivita těchto proteinů však zůstává neznámá. Metody využívající bioluminiscenčních bakterií (popsány v kapitole 3.2.1.1.) však nabízejí měření kinetiky aktivity klasické či alternativní cesty aktivace komplementového systému v reálném čase. Toto měření je podrobněji popsáno ve studii 1 (Atosuo et al., 2013). V rámci svého doktorského studia jsem se rovněž podílel na optimalizaci a využití měření aktivity komplementového systému pomocí bioluminiscenčních bakterií u několika druhů sladkovodních ryb: cejn velký (Abramis brama), kapr obecný (Cyprinus carpio), karas stříbřitý (Carassius auratus), lín obecný (Tinca tinca), plotice obecná (Rutilus rutilus), pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss), siven alpský (Salvelinus alpinus) a siven americký (Salvelinus fontalis). Většina získaných výsledků je součástí dizertační práce Mgr. Soni Tolarové a vznikly ve spolupráci s Ústavem biologie obratlovců Akademie věd ČR, v.v.i., oddělením Parazitologie Ústavu botaniky a zoologie Masarykovy univerzity, Ústavem zoologie, rybářství, hydrobiologie a včelařství Mendelovy univerzity v Brně, Ústavem ekologie a chorob zvěře, ryb a včel Veterinární a farmaceutické univerzity Brno a Výzkumným ústavem rybářským a hydrobiologickým Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích. Výsledky jsem prezentoval na mezinárodní konferenci VIth International Workshop on Biology and Culture of the Tench (Tinca tinca L.), Písek 17. - 20.9.2012 a jsou součástí dvou připravovaných spoluautorských článků.

41

Oxidační stres

5. Oxidační stres Oxidační stres vyjadřuje porušení rovnováhy mezi tvorbou RMK či RMD a schopností daného organismu efektivně odbourávat tyto molekuly pomocí antioxidačních mechanismů, převládají tedy pro-oxidační procesy (Halliwell et Gutteridge, 1999). Tato rovnováha může být narušena buď nadměrnou produkcí RMK nebo RMD způsobenou např. přehnanou odpovědí imunitního systému na infekci organismu patogenem, nebo naopak nedostatečným příjmem/syntézou antioxidačních molekul či enzymů. Takovéto vychýlení může mít za následek oxidativní poškození molekul, buněk a tkání tělu vlastních, což může vést k závažným onemocněním, jako jsou např. ateroskleróza, Parkinsonova a Alzheimerova choroba či infarkt myokardu (Rajendran et al., 2014). Tvorba RMK a RMD je úzce spojena s obranou organismu před patogeny a tedy i s imunitním systémem jak bezobratlých živočichů, tak i obratlovců. Studium antioxidační kapacity nejrůznějších vzorků je tedy velice aktuální a vhodně doplňuje měření imunitních parametrů jednotlivých organismů.

5.1.

Reaktivní metabolity kyslíku a dusíku

RMK a RMD jsou důležitou součástí fyziologických pochodů mnoha živočichů včetně člověka. Za normálních podmínek jsou tyto molekuly produkovány kontinuálně v nízkých koncentracích v rámci běžného buněčného metabolismu a jsou nezbytné při dějích, jako jsou buněčná signalizace, fosforylace proteinů, aktivace transkripčních faktorů, proliferace a diferenciace buněk, apoptóza či buněčná imunita (Rajendran et al., 2014). Ke zvýšené produkci především RMK, ale i RMD, dochází zejména u fagocytujících buněk imunitního systému v důsledku jejich snahy zlikvidovat nalezený patogen. Tyto reaktivní molekuly však nepůsobí specificky pouze proti patogenním částicím, ale poškozují lipidy, proteiny či DNA jakýchkoliv buněk nacházejících se v jejich dosahu (Valko et al., 2007). RMK jsou nejčastěji tvořeny volnými radikály. Jako volné radikály se označují molekuly nebo jejich fragmenty, jež nesou jeden nebo více volných (nespárovaných) elektronů ve svém atomovém orbitalu (Halliwell et Gutteridge, 1999). Právě tyto volné elektrony udávají reaktivitu radikálu. Molekulární kyslík (O2), který se do organismu dostává dýcháním, má unikátní elektronovou strukturu a sám je radikálem (Valko et al., 2007). Z molekulárního kyslíku vzniká univalentní redukcí superoxidový anion (O2●-), který je základem pro mnoho dalších RMK. Tato reakce je nejčastěji katalyzována enzymy NAD(P)H oxidázami či xantin oxidázou (obr. 15a; Dröge, 2002). Ze superoxidového aniontu vzniká peroxid vodíku (H2O2). Tento děj probíhá samovolně při nízkém pH nebo je katalyzován enzymem superoxid dismutázou (SOD, obr. 15b; Lanciano et al., 2013). Peroxid vodíku je velmi malá molekula schopná lehce difundovat přes membrány a oxidovat biomolekuly. V přítomnosti přechodných kovů jako jsou např. železnaté (Fe2+) ionty vzniká z peroxidu vodíku za tzv. Fentonovy reakce vysoce reaktivní hydroxylový radikál (OH●, obr. 15c). Hydroxylový radikál může vznikat také Haber-Weisovou reakcí, tedy interakcí peroxidu vodíku se superoxidovým aniontem (obr. 15d; Valko et al., 2007). Peroxid vodíku může být také katalyticky štěpen glutation peroxidázou (GPX) na vodu (Dröge, 2002; Sies, 2014). Ve fagolysozomech aktivovaných neutrofilů či monocytů může být H2O2 za 42

Oxidační stres přítomnosti Cl- či Br- iontů sloužících jako donor elektronů využit enzymem MPO pro tvorbu HOCl (obr. 15e), který je vysoce reaktivní, a je tedy využívána při likvidaci pohlcených bakterií či jiných patogenů (viz kapitola 3.2.1.2.4; Halliwell et Gutteridge, 1999; Grey et al., 2013). Zmíněné RMK působí svými oxidačními účinky destruktivně na DNA, polynenasycené mastné kyseliny fosfolipidů či řetězce aminokyselin proteinů (Valko et al., 2007). RMD jsou stejně jako RMK tvořeny hlavně látkami radikálové povahy. Základním RMD je oxid dusnatý (NO●), jenž je ve tkáních produkován syntázami oxidu dusnatého (NOS) při přeměně argininu na citrulin (Ghafourifar et Cadenas, 2005). Tato molekula hraje roli především v buněčném signálování, např. při přenosu signálu mezi neurony, regulaci krevního tlaku, relaxaci hladké svaloviny či regulaci imunitní odpovědi. Aktivované fagocyty produkují oxid dusnatý stejně jako superoxidový anion během zánětu za účelem eliminace patogenní infekce. Při vzájemné interakci těchto dvou molekul vzniká mnohem reaktivnější peroxinitritový anion (ONOO-, obr. 15f; Carr et al., 2000). Peroxinitrit může stejně jako většina RMK působit fragmentaci DNA a oxidaci lipidů.

a)

O2 + e-

NAD(P)H oxidáza

O2●-

(SOD)

b)

O2●-+ O2●- + 2H+

c)

H2O2 + Fe2+

Fe3+ + OH- + OH●

d)

H2O2 + O2●-

OH- + O2 + OH●

e)

H2O2 + Cl-

f)

NO● + O2●-

H2O2 + O2

MPO

HOCl + OHONOO-

Obr. 15: Chemické reakce vzniku jednotlivých RMK: a) superoxidový anion, b) peroxid vodíku, c) hydroxylový radikál (Fentonova reakce), d) hydroxylový radikál (Haber-Weisova reakce), e) kyselina chlorná; a RMD: f) peroxinitritový anion (upraveno podle Halliwell et Gutteridge, 1999).

5.2.

Antioxidační mechanismy

Jak již bylo popsáno výše, pro udržení redoxní rovnováhy a tedy potlačení možnosti vzniku oxidačního stresu jsou nepostradatelné antioxidanty, tedy látky, jež jsou schopny i v relativně nízkých koncentracích konkurovat ostatním potenciálně oxidovatelným 43

Oxidační stres substrátům, a tím oddálit či zcela inhibovat jejich oxidační destrukci (Halliwell et Gutteridge, 1999). Antioxidanty lze rozdělit do dvou základních skupin, a to na antioxidanty enzymatické a neenzymatické.

5.2.1.

Enzymatické antioxidanty

Enzymatické antioxidanty lze rozdělit do dvou skupin na primární a sekundární. Primární předchází tvorbě či přímo likvidují vzniklé volné radikály a řadí se mezi ně tři významné enzymy: SOD, kataláza (CAT) a GPX. Sekundární enzymatické antioxidanty nepůsobí přímo proti tvorbě RMK či RMD, ale účastní se recyklace jiných antioxidantů zpět do jejich aktivní redukované formy tak, aby mohly znovu využít svůj redukční potenciál. Mezi tyto enzymatické antioxidanty patří glutation reduktáza a glukóza-6-fosfát-dehydrogenáza (Carocho et Ferreira, 2013). SOD katalyzuje přeměnu superoxidového aniontu na peroxid vodíku, jenž je dále štěpen CAT nebo GPX, a molekulární kyslík. Existují tři formy SOD: Cu, Zn-SOD vyskytující se v cytosolu, mitochondriální Mn-SOD a extracelulární SOD (Landis et Tower, 2005). CAT je syntetizována v peroxizomech aerobních buněk a je vysoce účinná při přeměně peroxidu vodíku generovaného uvnitř buněk na vodu a molekulární kyslík. Jedna molekula CAT dokáže rozložit přibližně 6 milionů molekul peroxidu vodíku za minutu (Matés et al., 1999). Existují dvě formy GPX, a to na selenu závislé (GPx) a nezávislé (glutation-S-transferáza, GST). GPx vychytávají peroxid vodíku právě pomocí selenu a znemožňují mu tak vstoupit do Fentonovy reakce, GST jsou asociovány s tripeptidem glutationem (GSH) a katalyzují přeměnu peroxidu vodíku na vodu za současné oxidace GSH. Na rozdíl od CAT působí GPX při nízkých koncentracích peroxidu vodíku (Chaudiére et Ferrari-Iliou, 1999). Sekundární antioxidační enzym glutation reduktáza (GR) redukuje glutation peroxidázou oxidovaný glutation disulfid (GSSG) zpět na jeho redukovanou formu GSH a glukóza-6-fosfát-dehydrogenáza regeneruje NAD(P)H (nikotinamid adenin dinukleotid fosfát), čímž vytváří v cytosolu buňky redukční prostředí a přispívá tak k regeneraci GR (Chaudiére et Ferrari-Iliou, 1999; Carocho et Ferreira, 2013).

5.2.2.

Neenzymatické antioxidanty

Na rozdíl od enzymatických antioxidantů existuje neenzymatických antioxidantů velké množství, lze je však rozdělit např. na vitamíny, kofaktory enzymů, dusíkaté sloučeniny či peptidy. Většina těchto antioxidantů se nachází v extracelulárním prostoru a je syntetizována uvnitř organismu, nicméně některé jsou esenciální a jsou tedy přijímány s potravou. Mezi nejvýznamnější neenzymatické antioxidanty patří následující látky. Mezi vitamíny působící jako antioxidanty patří např. vitamín A, E a C. Vitamín A neboli retinol patří mezi karotenoidy a vzniká rozpadem β-karotenu v játrech. Kromě blahodárných účinků na kůži, oči a vnitřní orgány je rovněž schopen redukovat peroxylové radikály (Carocho et Ferreira, 2013). Vitamín E je jediný v tucích rozpustný antioxidant, 44

Oxidační stres existuje v několika formách, z čehož nejznámější je α-tokoferol, jenž zabraňuje především peroxidaci lipidů poskytnutím fenolového vodíku peroxylovému radikálu. Jeho oxidovaná forma je regenerována vitamínem C (Pryor, 2000). Vitamín C, tedy kyselina askorbová, je jedním z esenciálních antioxidantů přijímaných v potravě. Kyselina askorbová je schopná vychytávat superoxidový anion, peroxid vodíku, hydroxylový radikál, singletový kyslík či oxid dusnatý a zároveň je také schopna regenerovat malé antioxidanty, jako jsou např. α-tokoferol, GSH či β-karoten. Je tedy jedním z nejvýznamnějších neenzymatických antioxidantů (Carr et Frei, 1999). Koenzym Q10 a jeho redukovaná forma ubiquinol je nejvýznamnější antioxidant patřící mezi kofaktory enzymů, je přítomen ve všech buňkách a membránách a je důležitou součástí dýchacího řetězce. Koenzym Q10 je schopen inhibovat tvorbu lipidových peroxylových radikálů (Navas et al., 2007). Kyselina močová je odpadním produktem metabolismu dusíku a tudíž antioxidantem obsahujícím dusíkaté sloučeniny. Vyskytuje se ve většině tělních tekutin, kdy např. v krvi chrání hemoglobin před účinky peroxidů při tvorbě oxo-hem oxidantů (Kanďár et al., 2006). Mezi nejvýznamnější neenzymatické antioxidanty patří tripeptid GSH. Jedná se o multifunkční intracelulární antioxidant nacházející se v cytosolu, endoplasmatickém retikulu, jádře a mitochondriích. Jak již bylo popsáno výše, GSH může vystupovat jako kofaktor některých antioxidačních enzymů, účastní se přímé likvidace peroxylových radikálů a singletového kyslíku a je schopen regenerovat vitamín C a E zpět do jejich redukované formy (Masella et al., 2005). GSH hraje významnou roli také při ochraně erytrocytů obratlovců, jež jsou jako přenašeči kyslíku vystaveny velkému oxidačnímu tlaku. K antioxidační ochraně erytrocytů přispívají také thiolové skupiny hemoglobinu (Hb), jež jsou kromě přímého vychytávání RMK rovněž schopny regenerace GSSG zpět na GSH (Rossi et al., 1998). Antioxidační vlastnosti různých forem Hb u norníka rudého (Clethrionomys glareolus) popisuje studie 3 (Kotlík et al., 2014). Antioxidační účinky vykazuje také neurohormon melatonin syntetizovaný epifýzou. Tento hormon má velké množství fyziologických funkcí, přičemž jednou z nich je odklízení volných radikálů vzniklých při metabolismu kyslíku. Je tedy schopen bránit oxidačnímu poškození DNA, proteinů a membrán (Rahimi et al., 2005). Esenciálními antioxidanty produkovanými rostlinami jsou flavonoidy, tedy deriváty benzo-γ-pyronu. Jedná se o významné antioxidanty přijímané v potravě obsahující fenolové a pyrenové kruhy, na které jsou během metabolismu přidány hydroxylové skupiny, jež určují jejich biologické vlastnosti. Flavonoidy inhibují lipidovou peroxidaci, přímo vychytávají peroxylové radikály a singletový kyslík a zabraňují katalytickému rozpadu peroxidu vodíku (Fentonově reakci) díky chelaci redoxně aktivních kovů (Schroeter et al., 2002). Flavonoidy se vyskytují v ovoci, zelenině, obilí, ořeších, semenech, čaji či bylinkách (Sak, 2014). Další z řady významných esenciálních antioxidantů jsou karotenoidy, tedy skupina pigmentů produkovaná rostlinami a mikroorganismy, nikoliv však živočichy. Karotenoidy obsahují konjugované dvojné můstky schopné delokalizovat nespárované elektrony volných radikálů, proto jsou např. schopny "umlčet" singletový kyslík bez degradace. Karotenoidy rovněž inhibují peroxidaci lipidů, avšak za určitých podmínek mohou tyto pigmenty působit také jako prooxidanty - např. při jejich zvýšené koncentraci nebo při zvýšeném parciálním

45

Metody měření antioxidační kapacity tlaku kyslíku (Stahl et Sies, 2003). Karotenoidy jsou stejně jako flavonoidy běžně obsaženy především v ovoci a zelenině (Ciccone et al., 2013). Důležitými rostlinami produkovanými antioxidanty jsou také fenolové kyseliny skládající se z kyseliny hydroxyskořicové a hydroxybenzoové. Tyto látky mohou působit jako "odklízeči" hydroxylových a peroxylových radikálů, superoxidových aniontů či peroxinitritů (Carocho et Ferreira, 2013). Fenolové kyseliny se ve velké míře nachází především v plodech, jako jsou např. ostružiny, borůvky, černý rybíz, brusinky, jahody, maliny a další (Paredes-López et al., 2010). Jak již bylo uvedeno v kap. 5, oxidační stres způsobuje velké množství závažných chorob, jako jsou nemoci kardiovaskulárního systému či rakovina. Tyto nemoci jsou jedněmi z nejčastějších příčin úmrtí ve vyspělých zemích (Riccioni et al., 2012). Správná životospráva a především dostatečný přísun pro člověka esenciálních antioxidantů je tedy nezbytný pro zachování redoxní rovnováhy v organismu. Bohužel o obsahu těchto látek v některých rostlinách zatím není dostatek informací. Práce zabývající se analýzou těchto látek a jejich antioxidační kapacitou u jednotlivých druhů rostlin a jejich plodů proto představují důležitý zdroj informací při dietní prevenci zmíněných onemocnění. Antioxidační účinky vybraných plodů rostlin či jejich extraktů popisuje studie 4 a 5 (Denev et al., 2014a; Denev et al., 2014b).

5.3.

Metody měření celkové antioxidační kapacity

Existuje několik metod, jež se využívají pro měření celkové antioxidační kapacity (Total Antioxidant Capacity, TAC) nejrůznějších biologických vzorků. TAC reflektuje aktivitu všech potenciálních antioxidantů obsažených ve vzorku. Vzhledem k tomu, že se in vivo mechanismy účinků jednotlivých antioxidačních molekul významně liší, není možné TAC zcela objektivně změřit jen jednou metodou, naopak je potřeba kombinovat metod více (Pellegrini et al., 2003). Je tedy možné využít metod spektrofotometrických, fluorescenčních či luminometrických. Základní metodou měřící TAC je tzv. Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TAEC) poprvé zveřejněná v roce 1993 Millerem et al. Jedná se o spektrofotometrickou metodu využívající tmavě modrý oxidant ABTS●- vznikající oxidací kyseliny 2,2´-azinobis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonové) (ABTS2-) persulfátem draselným (Huang et al., 2005). Vzniklý tmavě modrý roztok je naředěn etanolem či pufrem na OD734 = 0,7 a následně je k němu přidán vzorek o různých koncentracích či Trolox (kyselina 6-hydroxy-2,5,7,8-tetrametylchroman-2-karboxylová) jako antioxidační standard. Koncentrace vzorku dávající stejnou procentuální změnu absorbance roztoku jako 1mM Trolox je považována za TAEC (Huang et al., 2005). Hodnoty TAEC některých důležitých antioxidantů jsou uvedeny v tabulce 1.

46

Metody měření antioxidační kapacity

antioxidant: kyselina askorbová α-tokoferol glutation kyselina močová kyselina ferulová kyselina p-kumarová quercetin

TAEC 1,05 0,97 1,28 1,01 1,90 2,00 3,00

Tabulka 1: Hodnoty TAEC vybraných antioxidantů (Huang et al., 2005). Další spektrofotometrickou metodou využívanou ke stanovení antioxidačních vlastností biologických vzorků je tzv. Ferric Reducing Ability of Plasma tedy FRAP. Metoda využívá redukčního potenciálu antioxidačních látek na tripyridyltriazin železitý (Fe III-TPTZ), který je za nízkého pH redukován na svou železnatou formu spolu s intenzivním modrým zbarvením (Benzie et Strain, 1996). Změna absorbance po přidání vzorku je měřena při 593 nm a výsledky jsou následně porovnávány proti změně absorbance standardního roztoku železnaté (FeII) formy TPTZ. Jedna jednotka FRAP je tedy definovaná jako redukce 1 mol FeIII na FeII (Huang et al., 2005). Hodnoty FRAP některých antioxidantů jsou uvedeny v tabulce 2. antioxidant: kyselina askorbová α-tokoferol kyselina močová bilirubin

FRAP 2,00 2,00 2,00 4,00

Tabulka 2: Hodnoty FRAP vybraných antioxidantů (Huang et al., 2005). Významnou fluorescenční metodou měření TAC je Oxygen Radical Absorbance Capacity - ORAC, jež byla poprvé popsána Cao et al. v roce 1993. Metoda je založena na měření vychytávání peroxylového radikálu antioxidanty obsaženými ve vzorku. Peroxylový radikál je indukován 2,2-azobis-2-amidinopropan hydrochloridem (ABAP) při 37 °C. Zbylé peroxylové radikály, jež nejsou odstraněny antioxidanty, dále oxidují (ničí) fluorescenční próbu, např. fluorescein, což má za následek úbytek fluorescenčního signálu (Ou et al., 2001; Huang et al., 2005). K vyhodnocení celé metody se buď používá porovnání plochy pod křivkou fluorescenčního signálu, kdy plocha blanku je nižší než plocha vzorku obsahujícího antioxidanty, nebo se porovnávají křivky vzorků s křivkami standardu, např. Troloxu (Huang et al., 2005). Obrázek 16 vyjadřuje typický průběh měření ORAC.

47

Relativní Fluorescenční Intenzita


čas (min) Obr. 16: Typická křivka rozpadu fluoresceinu, za přítomnosti různých koncentrací α-tokoferolu během měření metody ORAC (upraveno podle Huang et al., 2005). Nejpoužívanější luminometrickou metodou, a tedy pro tuto práci i nejdůležitější, měřící TAC je Total Radical-trapping Antioxidant Parameter (TRAP). Metoda je stejně jako u ORAC založena na termální dekompozici ABAPu, jež produkuje stálou hladinu peroxylového radikálu (Slavíková et al., 1998). Ten oxiduje luminol, který produkuje chemiluminiscenční signál měřený luminometrem. Pokud je přidán vzorek obsahující antioxidanty nebo Trolox, který se používá jako standard, peroxylové radikály jsou těmito látkami vychytávány až do doby, než jsou všechny antioxidanty vyčerpány a chemiluminiscenční signál tedy narůstá až po uplynutí této doby (Čížová et al., 2004). Typickou koncentrační závislost antioxidační kapacity Troloxu znázorňuje obrázek 17. Pro získání výsledků se z křivek Troloxu i vzorků odečte poloviční čas potřebný k dosažení nejvyššího bodu křivky (píku). Různé koncentrace Troloxu následně vytvoří kalibrační křivku a podle rovnice regrese této křivky je možné dopočítat antioxidační kapacitu vzorku vyjádřenou jako odpovídající antioxidační kapacita určité koncentrace Troloxu (nmol/ml). Pro přesné měření je většinu biologických vzorků nutné naředit tak, aby k píku reakce došlo mezi píky nejvyšší a nejnižší koncentrace Troloxu. Metodu TRAP lze využít pro stanovení antioxidační kapacity nejrůznějších biologických vzorků - např. krve/plasmy obratlovců, hemolymfy hmyzu (obrázek 18), rostlinných extraktů a dalších, proto mohla být použita také ve studiích 3, 4 a 5 (Kotlík et al., 2014; Denev et al., 2014a; Denev et al., 2014b).

48


(CPS) luminiscence CPS

2500

2000

ABAP Trolox 0,5 nmol/ml Trolox 1 nmol/ml Trolox 1,5 nmol/ml Trolox 2 nmol/ml

1500

1000

500

0 0

20

40

60

80

100

120

čas Èas (min) (min)

Obr. 17: Ukázkový graf koncentrační závislosti antioxidační kapacity Troloxu.

(CPS) luminiscence CPS

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 ABAP hemolyzát (Clethrionomys glareolus) hemolymfa (Apis mellifera)

500 0 0

10

20

30

40

50

60


Obr. 18: Ukázkový graf měření antioxidační kapacity vzorků použitých v dizertační práci 10x ředěný vzorek hemolyzátu norníka rudého (Clethrionomys glareolus) a 16x ředěný vzorek hemolymfy včely medonosné (Apis mellifera).

49

Shrnutí a perspektivy

6. Shrnutí a perspektivy popsaných luminometrických metod Předešlé kapitoly popisují hojné využití luminometrických metod při studiu vrozené imunity živočichů včetně souvisejících měření antioxidačních mechanismů obrany proti oxidačnímu stresu. Využití bioluminiscenčních bakterií P. luminescens a geneticky modifikované E. coli K12 jako jedinečných indikátorů účinnosti nepřeberného množství látek (ať už biologických či syntetických) s antibakteriálními účinky v reálném čase se ukázalo jako unikátní nástroj poskytující rychlé, levné a především přesné výsledky. Tyto výsledky umožňují vyhodnocení funkčnosti vrozených imunitních pochodů zajišťujících základní obranné odpovědi organismu, jakými jsou např. komplementový systém obratlovců, antimikrobiální peptidy bezobratlých živočichů či antibakteriální složky rostlinných extraktů. Budoucnost využití těchto bakterií se pravděpodobně skrývá v toxikologických testech umožňujících rychlé funkční vyhodnocení rizika přítomnosti pro člověka potenciálně škodlivých či toxických látek, nebo v testech pro detekci hladiny MPO v krvi či jiných biologických vzorcích, které mohou odhalit možné výkyvy a tedy nadcházející patologické stavy. Stejně tak studium účinnosti AMP jako možné náhrady za nyní používaná antibiotika může být v budoucnu velmi perspektivní. Měření celkové antioxidační kapacity pomocí luminiscenční metody TRAP přináší nové poznatky o nejrůznějších biologických vzorcích, jako jsou např. extrakty rostlin a jejich plodů, hemolymfa hmyzu či hemolyzát norníků. Výsledky těchto měření naznačují zvýšený obsah antioxidačních látek u některých rostlin (šípek, hloh) či rostlinných extraktů (listy ostružiníku, tužebník), nebo dokumentují evoluční zvýhodnění norníků rudých, nesoucích mutaci pro vysoce reaktivní tiolovou skupinu v molekule hemoglobinu, jež jim zajišťuje lepší antioxidační ochranu erytrocytů. Oxidační stres vyvolaný špatnými životními návyky je díky svým dopadům na zdraví lidské populace ve vyspělých zemích studován stále intenzivněji. Příjem antioxidantů v potravě či potravinových doplňcích tedy hraje a bude hrát podstatnou roli při eliminaci dopadu oxidačního stresu na lidské zdraví. Intenzivnější studium množství antioxidačních látek v nejrůznějších rostlinách a jejich plodech či extraktech je velkou nadějí pro budoucí snížení výskytu nemocí kardiovaskulárního systému a dalších chorob přímo či nepřímo indukovaných oxidačním stresem, a i zde mají luminometrické metody svoje nezastupitelné místo.

50

Použitá literatura

7. Seznam použité literatury

ADAMS BJ, FODOR A, KOPPENHÖFER HS, STACKEBRANDT E, STOCK SP, KLEIN MG. Biodiversity and systematics of nematode–bacterium entomopathogens. Biological Control, 37(1): 32-49, 2006.

AKHURST RJ. Antibiotic activity of Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with insect pathogenic nematodes of the families Heterorhabditidae and Steinernematidae. Journal of General Microbiology, 128(12): 3061-5, 1982.

AKULA S, MOHAMMADAMIN S, HELLMAN L. Fc receptors for immunoglobulins and their appearance during vertebrate evolution. PLoS One, 9(5): e96903, 2014.

AMARA U, RITTIRSCH D, FLIERL M, BRUCKNER U, KLOS A, GEBHART F, LAMBRIS JD, HUBER-LANG M. Interaction between the coagulation and complement system. Advances in Experimental Medicine and Biology, 632: 71-9, 2008.

ANTHONY RM, RAVETCH JV. A novel role for the IgG Fc glycan: the anti-inflammatory activity of sialylated IgG Fcs. Journal of Clinical Immunology, 30(1): S9-14, 2010.

ASLAN

K, GEDDES CD. Metal-enhanced chemiluminescence: advanced chemiluminescence concepts for the 21st century. Chemical Society Reviews, 38(9): 255664, 2009.

BANG K, PARK S, YOO JY, CHO S. Characterization and expression of attacin, an antibacterial protein-encoding gene, from the beet armyworm, Spodoptera exigua (Hübner) (Insecta: Lepidoptera: Noctuidae). Molecular Biology Reports, 39(5): 5151-9, 2012.

BASSLER BL. How bacteria talk to each other: regulation of gene expression by quorum sensing. Current Opinion in Microbiology, 2(6): 582-7, 1999.

BELOIN C, ROUX A, GHIGO JM. Escherichia coli biofilms. Current Topics in Microbiology and Immunology, 322: 249-89, 2008.

BENZIE IF, STRAIN JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of "antioxidant power": the FRAP assay. Analytical Biochemistry, 239(1): 70-6, 1996.

BOEMARE NE, AKHURST RJ, MOURANT RG. DNA relatedness between Xenorhabdus spp. (Enterobacteriaceae), symbiotic bacteria of entomopathogenic nematodes, and a proposal to transfer Xenorhabdus luminescens to a new genus, Photorhabdus gen. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 43(2): 249-55, 1993.

BOWEN D, ROCHELEAU TA, BLACKBURN M, ANDREEV O, GOLUBEVA E, BHARTIA R, FFRENCH-CONSTANT RH. Insecticidal toxins from the bacterium Photorhabdus luminescens. Science, 280(5372): 2129-32, 1998. 51


BRAUN A, HOFFMANN JA, MEISTER M. Analysis of the Drosophila host defense in domino mutant larvae, which are devoid of hemocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95(24): 14337-42, 1998.

BULET P, HETRU C, DIMARCQ JL, HOFFMANN D. Antimicrobial peptides in insects; structure and function. Developmental and Comparative Immunology, 23(4-5): 329-44, 1999.

BULET P, STÖCKLIN R. Insect antimicrobial peptides: structures, properties and gene regulation. Protein and Peptide Letters, 12(1): 3-11, 2005.

CALDEFIE-CHÉZET F, WALRAND S, MOINARD C, TRIDON A, CHASSAQNE J, VASSON MP. Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow cytometry and cytochrome c reduction. Clinica Chimica Acta, 319(1): 9-17, 2002.

CALLEWAERT L, AERTSEN A, DECKERS D, VANOIRBEEK KG, VANDERKELEN L, VAN HERREWEGHE JM, MASSCHALCK B, NAKIMBUGWE D, ROBBEN J, MICHIELS CW. A new family of lysozyme inhibitors contributing to lysozyme tolerance in gram-negative bacteria. PLoS Pathogens, 4(3): e1000019, 2008.

CAMOUS L, ROUMENINA L, BIGOT S, BRACHEMI S, FRÉMEAUX-BACCHI V, LESAVRE P, HALBWACHS-MECARELLI L. Complement alternative pathway acts as a positive feedback amplification of neutrophil activation. Blood, 117(4): 1340-9, 2011.

CAO G, ALESSIO HM, CUTLER RG. Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants. Free Radical Biology and Medicine, 14(3): 303-11, 1993.

CAROCHO M, FERREIRA IC. A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives. Food and Chemical Toxicology: an International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association, 51: 15-25, 2013.

CARR AC, FREI B. Does vitamin C act as a pro-oxidant under physiological conditions? FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 13(9): 1007-24, 1999.

CARR AC, MCCALL MR, FREI B. Oxidation of LDL by myeloperoxidase and reactive nitrogen species: reaction pathways and antioxidant protection. Arteriosklerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 20(7): 1716-23, 2000.

CASTELLÓ A, FRANCÉS F, VERDÚ F. Chemistry in crime investigation: sodium percarbonate effects on bloodstains detection. Journal of Forensic Sciences, 52(2): 500-2, 2012.

CHAUDIÉRE J, FERRARI-ILIOU R. Intracellular antioxidants: from chemical to biochemical mechanisms. Food and Chemical Toxicology: an International Journal 52

Použitá literatura Published for the British Industrial Biological Research Association, 37(9-10): 949-62, 1999.

CICCONE MM, CORTESE F, GESUALDO M, CABONARA S, ZITO A, RICCI G, DE PASCALIS F, SCICCHITANO P, RICCIONI G. Dietary intake of carotenoids and their antioxidant and anti-inflammatory effects in cardiovascular care. Mediators of Inflammation, 2013: 782137, 2013.

ČÍŽOVÁ H, LOJEK A, KUBALA L, ČÍŽ M. The effect of intestinal ischemia duration on changes in plasma antioxidant defense status in rats. Physiological Research, 53(5): 52331, 2004.

CLIFFORD DP, REPINE JE. Hydrogen peroxide mediated killing of bacteria. Molecular and Cellular Biochemistry, 49(3): 143-9, 1982.

CLOSE DM, RIPP S, SAYLER GS. Reporter proteins in whole-cell optical bioreporter detection systems, biosensor integrations, and biosensing applications. Sensors, 9(11): 9147-74, 2009.

CLOSE DM, XU T, SMARTT A, ROGERS A, CROSSLEY R, PRICE S, RIPP S, SAYLER G. The evolution of the bacterial luciferase gene cassette (lux) as a real-time bioreporter. Sensors, 12(1): 732-52, 2012.

COLE AM, SHI J, CECCARELLI A, KIM YH, PARK A, GANZ T. Inhibition of neutrophil elastase prevents cathelicidin activation and impairs clearance of bacteria from wounds. Blood, 97(1): 297-304, 2001.

COOPER-BAILEY K, SMITH SA, ZIMMERMAN K, LANE R, RASKIN RE, DENARDO D. Hematology, leukocyte cytochemical analysis, plasma biochemistry, and plasma electrophoresis of wild-caught and captive-bred Gila monsters (Heloderma suspectum). Veterinary Clinical Pathology, 40(3): 316-23, 2011.

DELVES PJ, ROITT IM. The immune system. The New England Journal of Medicine, 343(1): 37-49, 2000.

DRÖGE W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological Reviews, 82(1): 47-95, 2002.

DUNKELBERGER JR, SONG WC. Complement and its role in innate and adaptive immune responses. Cell Research, 20(1): 34-50, 2010.

DUNLAP PV. Bioluminescence, Microbial. Encyklopedia of Microbiology, Schaechter M, Elsevier (Oxford), 45-61, 2009.

ELEFTHERIANOS I, BOUNDY S, JOYCE SA, ASLAM S, MARSHALL JW, COX RJ, SIMPSON TJ, CLARKE DJ, FFRENCH-CONSTANT RH, REYNOLDS SE. An antibiotic produced by an insect-pathogenic bacterium suppresses host defenses through 53

Použitá literatura phenoloxidase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 104(7): 2419-24, 2007.

FLANNAGAN RS, JAUMOUILLÉ V, GRINSTEIN S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease, 7: 61-98, 2012.

FORST S, NEALSON K. Molecular biology of the symbiotic-pathogenic bacteria Xenorhabdus spp. and Photorhabdus spp. Microbiological Reviews, 60(1): 21-43, 1996.

FUQUA WC, WINANS SC, GREENBERG EP. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. Journal of Bacteriology, 176(2): 269-75, 1994.

FUX CA, SHIRTLIFF M, STOODELY P, COSTERTON JW. Can laboratory reference strains mirror "real-world" pathogenesis? Trends in Microbiology, 13(2): 58-63, 2005.

GAO B, ZHU S. An insect defensin-derived β-hairpin peptide with enhanced antibacterial activity. ACS Chemical Biology, 9(2): 405-13, 2014.

GHAFOURIFAR P, CADENAS E. Mitochondrial nitric oxide synthase. Trend in Pharmacological Sciences, 26(4): 190-5, 2005.

GLEBSKA J, KOPPENOL WH. Chemiluminescence of Pholasin caused by peroxynitrite. Free Radical Biology and Medicine, 38(8): 1014-22, 2005.

GOLDBERG MC, WEINER ER. The science of luminescence. Luminescence Applications, 383(1): 1-22, 1989.

GONZÁLES-FLECHA B, DEMPLE B. Intracellular generation of superoxide as a by-product of Vibrio harveyi luciferase expressed in Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 176(8): 2293-9, 1994.

GREENFIELD MD. Missing link in firefly bioluminescence revealed: NO regulation of photocyte respiration. BioEssays: news and reviews in molecular, cellular and developmental biology, 23(11): 992-5, 2001.

GREER LF 3rd, SZALAY AA. Imaging of light emission from the expression of luciferases in living cells and organisms: a review. Luminescence, 17(1): 43-74, 2002.

GREY MJ, WHOLEY WY, JAKOB U. Bacterial responses to reactive chlorine species. Annual Review of Microbiology, 67: 141-60, 2013.

GUNNE H, STEINER H. Efficient secretion of attacin from insect fat-body cells requires proper processing of the prosequence. European Journal of Biochemistry, 214(1): 287-93, 1993.

GUPTA AP. Immunology of Invertebrates: Cellular. Encyclopedia of life sciences, John Wiley and Sons Ltd., 2002. 54


HADDOCK SHD, MOLINE MA, CASE JF. Bioluminescence in the sea. Annual Review of Marine Science, 2: 443-93, 2010.

HAKKILA K, MAKSIMOW M, KARP M, VIRTA M. Reporter genes lucFF, luxCDABE, gfp, and dsred have different characteristics in whole-cell bacterial sensors. Analytical Biochemistry, 301(2): 235-42, 2002.

HALLIWELL B, GUTTERIDGE JMC. Oxidative stress: adaptation, damage, repair and death. Free radicals in biology and medicine (3rd edition), Oxford University Press, 1999.

HAN R, EHLERS R. Efect of Photorhabdus luminescens phase variants on the in vivo and in vitro development and reproduction of the entomopathogenic nematodes Heterorhabditis bacteriophora and Steinernema carpocapsae. FEMS Microbiology Ecology, 35(3): 239-47, 2001.

HARRISON A, BAKALETZ LO, MUNSON RS. Haemophilus influenzae and oxidative stress. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2(40): 1-11, 2012.

HARRISON RE, BUCCI C, VIEIRA OV, SCHROER TA, GRINSTEIN S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: Role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology, 23(18): 64946506, 2003.

HERRING PJ, WIDDER EA. Bioluminescence. Encyclopedia of Ocean Sciences, 1: 30817, 2001.

HONTI V, CSORDÁS G, KURUCZ É, MÁRKUS R, ANDÓ I. The cell-mediated immunity of Drosophila melanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology, 42(1): 47-56, 2014.

HOU C, LIU YJ, FERRÉ N, FANG WH. Understanding bacterial bioluminescence: a theoretical study of the entire process, from reduced flavin to light emission. Chemistry, 20(26): 7979-86, 2014.

HUANG D, OU B, PRIOR RL. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 53(6): 1841-56, 2005.

HULTMARK D. Drosophila immunity: paths and patterns. Current Opinion in Immunology, 15(1): 12-19, 2003.

HURST JK. What really happens in the neutrophil phagosome? Free Radical Biology and Medicine, 53(3): 508-20, 2012.

HYRŠL P, ČÍŽ M, LOJEK A. Comparison of the bioluminescence of Photorhabdus species and subspecies type strains. Folia Microbiologica, 49(5): 539-42, 2004.

55


JENSSEN H, HAMILL P, HANCOCK REW. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews, 19(3): 491-511, 2006.

JONES K, HIBBERT F, KEENAN M. Glowing jellyfish, luminescence and a molecule called coelenterazine. Trends in Biotechnology, 17(12): 477-81, 1999.

JOYCE SA, LANGO L, CLARKE DJ. The regulation of secondary metabolism and mutualism in the insect pathogenic bacterium Photorhabdus luminescens. Advances in Applied Microbiology, 76: 1-25, 2011.

KANĎÁR R, ŽÁKOVÁ P, MUŽÁKOVÁ V. Monitoring of antioxidant properties of uric acid in humans for a consideration measuring of levels of allantoin in plasma by liquid chromatography. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry, 365(1-2): 249-56, 2006.

KAPLAN HB, GREENBERG EP. Diffusion of autoinducer is involved in regulation of the Vibrio fischeri luminescence system. Journal of Bacteriology, 163(3): 1210-14, 1985.

KAWASAKI S, YAMASHOJI S, ASAKAWA A, ISSHIKI K, KAWAMOTO S. Menadione-catalyzed luminol chemiluminescence assay for the rapid detection of viable bacteria in foods under aerobic conditions. Journal of Food Protection, 67(12): 2767-71, 2004.

KEMPER C, ATKINSON JP, HOURCADE DE. Properdin: emerging roles of a patternrecognition molecule. Annual Review of Immunology, 28: 131-55, 2010.

KIM BB, PISAREV VV, EGOROV AM. A comparative study of peroxidases from horse radish and Arthromyces ramosus as labels in luminol-mediated chemiluminescent assays. Analytical Biochemistry, 199(1): 1-6, 1991.

KIVISAAR M. Mechanisms of stationary-phase mutagenesis in bacteria: mutational processes in pseudomonads. FEMS Microbiology Letters, 312(1): 1-14, 2010.

KLEBANOFF SJ, KETTLE AJ, ROSEN H, WINTERBOURN CC, NAUSEEF WM. Myeloperoxidase: a front-line defender against phagocytosed microorganisms. Journal of Leukocyte Biology, 93(2): 185-98, 2013.

KUBITSCHEK HE. Cell volume increase in Escherichia coli after shifts to richer media. Journal of Bacteriology, 172(1): 94-101, 1990.

KURVET I, IVASK A, BONDARENKO O, SIHTMÄE M, KAHRU A. LuxCDABE-transformed constitutively bioluminescent Escherichia coli for toxicity screening: comparison with naturally luminous Vibrio fischeri. Sensors, 11(8): 7865-78, 2011.

LAI Y, GALLO RL. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends in Immunology, 30(3): 131-41, 2009.

56


LANCIANO P, KHALFAOUI-HASSANI B, SELAMOGLU N, GHELLI A, RUGOLO M, DALDAL F. Molecular mechanisms of superoxide production by complex III: a bacterial versus human mitochondrial comparative case study. Biochimica et Biophysica Acta, 1827(11-12): 1332-9, 2013.

LANDIS GN, TOWER J. Superoxide dismutase evolution and life span regulation. Mechanisms of Ageing and Development, 126(3): 365-79, 2005.

LEE YS, YUN EK, JANG WS, KIM I, LEE JH, PARK SY, RYU KS, SEO SJ, KIM CH, LEE IH. Purification, cDNA cloning and expression of an insect defensin from the great wax moth, Galleria mellonella. Insect Molecular Biology, 13(1): 65-72, 2004.

LEHTINEN J, VIRTA M, LILIUS EM. Fluoro-luminometric real-time measurement of bacterial viability and killing. Journal of Microbiological Methods, 55(1): 173-86, 2003.

LEMAITRE B. The road to Toll. Nature Reviews Immunology, 4: 521-7, 2004. LI Y, XIANG Q, ZHANG Q, HUANG Y, SU Z. Overview on the recent study of antimicrobial peptides: origins, functions, relative mechanisms and application. Peptides, 37(2): 207-15, 2012.

MADAR D, DEKEL E, BREN A, ZIMMER A, PORAT Z, ALON U. Promoter activity dynamics in the lag phase of Escherichia coli. BMC Systems Biology, 7(136): 1-13, 2013.

MANDELL GL. Catalase, superoxide dismutase, and virulence of Staphylococcus aureus. In vitro and in vivo studies with emphasis on staphylococcal--leukocyte interaction. The Journal of Clinical Investigation, 55(3): 561-6, 1975.

MASELLA R, DI BENEDETTO R, VARI R, FILESI C, GIOVNNINI C. Novel mechanisms of natural antioxidant compounds in biological systems: involvement of glutathione and glutathione-related enzymes. The Journal of Nutritional Biochemistry, 16(10): 577-86, 2005.

MATÉS JM, PÉREZ-GÓMEZ C, NÚŇEZ DE CASTRO I. Antioxidant enzymes and human diseases. Clinical Biochemistry, 32(8): 595-603, 1999.

MATLOCK BC, BERINGER RW, ASH DL, PAGE AF, ALLEN MW. Differences in bacterial optical density measurements between spectrophotometers. Thermo Fischer Scientific inc., 2011.

MATSUSHITA M, ENDO Y, FUJITA T. Structural and functional overview of the lectin complement pathway: its molecular basis and physiological implication. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 61(4): 273-83, 2013.

MCGOWAN SJ, HOLDEN MT, BYCROFT BW, SALMOND GP. Molecular genetics of carbapenem antibiotic biosynthesis. Antonie van Leeuwenhoek, 75(1-2): 135-41, 1999.

57


MEIGHEN EA. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiological Reviews, 55(1): 123-42, 1991.

MEIGHEN EA. Bacterial bioluminescence: organization, regulation, and application of the lux genes. The FASEB Journal, 7(11): 1016-22, 1993.

MILLER NJ, RICE-EVANS C, DAVIES MJ, GOPINATHAN V, MILNER A. A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates. Clinical Science, 84(4): 407-12, 1993.

MORESCO EMY, LAVINE D, BEUTLER B. Toll-like receptors. Current Biology, 21(12): R488-93, 2011.

NAKATSUJI T, GALLO RL. Antimicrobial peptides: old molecules with new ideas. The Journal of Investigative Dermatology, 132(3): 887-95, 2012.

NAVAS DÍAZ A, GONZÁLES GARCÍA JA, LIVILLO J. Enhancer effect of fluorescein on the luminol-H2O2-horseradish peroxidase chemiluminescence: energy transfer process. Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 12(4): 199-205, 1997.

NAVAS P, VILLALBA JM, DE CABO R. The importance of plasma membrane coenzyme Q in aging and stress responses. Mitochondrion, 7: 34-40, 2007.

NEALSON KH, HASTINGS JW. Bacterial bioluminescence: its control and ecological significance. Microbiological Reviews, 43(4): 496-518, 1979.

NEUBAUEROVÁ T, MACKOVÁ M, MACEK T, KOUTEK B. Kationické antimikrobiální peptidy. Chemické Listy, 103: 460-8, 2009.

NGUYEN MT. The effect of temperature on the growth of the bacteria Escherichia coli DH5α. Saint Martin’s University Biology Journal, 1: 87-94, 2006.

NÜRNBERGER T, BRUNNER F. Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns. Current opinion in Plant Biology, 5(4): 318-24, 2002.

NYSTRÖM T. Conditional senescence in bacteria: death of the immortals. Molecular Microbiology, 48(1): 17-23, 2003.

OSMAN AM, ZOMER G, LAANE C, HILHORST R. Comparative studies of the chemiluminescent horseradish peroxidase-catalysed peroxidation of acridan (GZ-11) and luminol reactions: effect of pH and scavengers of reactive oxygen species on the light intensity of these systems. Luminescence, 15(3): 189-97, 2000.

OU B, HAMPSCH-WOODILL M, PRIOR RL. Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 49(10): 4619-26, 2001. 58


OWUAMA CI. Entomopathogenic symbiotic bacetria, Xenorhabdus and Photorhabdus of nematodes. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 17(5): 505-15, 2001.

PAINTER RG, WANG G. Direct measurement of free chloride concentrations in the phagolysosomes of human neutrophils. Analytical Chemistry, 78(9): 3133-7, 2006.

PAREDES-LÓPEZ O, CERVANTES-CEJA ML, VIGNA-PÉREZ M, HERNÁNDEZPÉREZ T. Berries: improving human health and healthy aging, and promoting quality life-a review. Plant Foods for Human Nutrition, 65(3): 299-308, 2010.

PARKIN J, COHEN B. An overview of the immune system. Lancet, 357(9270): 1777-89, 2001.

PAZGIER M, HOOVER DM, YANG D, LU W, LUBKOWSKI J. Human beta-defensins. Cellular and Molecular Life Sciences, 63(11): 1294-31, 2006.

PEAT SM, FFRENCH-CONSTANT RH, WATERFIELD NR, MAROKHÁZI J, FODOR A, ADAMS BJ. A robust phylogenetic framework for the bacterial genus Photorhabdus and its use in studying the evolution and maintenance of bioluminescence: a case for 16S, gyrB, and glnA. Molecular Phylogenetics and Evolution, 57(2): 728-40, 2010.

PELLEGRINI N, SERAFINI M, COLOMBI B, DEL RIO D, SALVATORE S, BIANCHI M, BRIGHENTI F. Total antioxidant capacity of plant foods, beverages and oils consumed in Italy assessed by three different in vitro assays. The Journal of Nutrition, 133(9): 2812-19, 2003.

PETUSHKOV VN, RODIONOVA NS. Purification and partial spectral characterization of a novel luciferin from the luminous enchytraeid Fridericia heliota, Journal of Photochemistry and Photobilogy, 87(2): 130-6, 2007.

PRYOR WA. Vitamin E and heart disease: basic science to clinical intervention trials. Free Radical Biology and Medicine, 28(1): 141-64, 2000.

RABINOVITCH M. Professional and non-professional phagocytes: an introduction. Trends in Cell Biology, 5(3): 85-7, 1995.

RAHIMI R, NIKFAR S, LARIJANI B, ABDOLLAHI M. A review on the role of antioxidants in the management of diabetes and its complications. Biomedicine and Pharmacotherapy, 59(7): 365-73, 2005.

RÁJECKÝ M, LOJEK A, ČÍŽ M. Differentiating between intra- and extracellular chemiluminescence in diluted whole-blood samples. International Journal of Laboratory Hematology, 34(2): 136-42, 2012.

RAJENDRAN P, NANDAKUMAR N, RENGARAJAN T, PALANISWAMI R, GNANADHAS EN, LAKSHMINARASAIAH U, GOPAS J, NISHIGAKI I. Antioxidants and human diseases. Clinica Chimica Acta, 436: 332-47, 2014. 59


RAO XJ, XU XX, YU XQ. Functional analysis of two lebocin-related proteins from Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 42(4): 231-9, 2012.

RICCIONI G, D'ORAZIO N, SALVATORE C, FRANCESCHELLI S, PESCE M, SPERANZA L. Carotenoids and vitamins C and E in the prevention of cardiovascular disease. International Journal for Vitamin and Nutrition Research, 82(1): 15-26, 2012.

RODOU A, ANKRAH DO, STATHOPOULOS C. Toxins and secretion systems of Photorhabdus luminescens. Toxins, 2(6): 1250-64, 2010.

RODRÍGUEZ E, RIERA M, BARRIOS C, PASCUAL J. Value of plasmatic membrane attack complex as a marker of severity in acute kidney injury. BioMed Research International, 2014: 361065, 2014.

ROSS GD, REED W, DALZELL JG, BECKER SE, HOGG N. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. Journal of Leukocyte Biology, 51(2): 109-17, 1992.

ROSSI R, BARRA D, BALLELLI A, BOUMIS G, CANOFENI S, DI SIMPLICIO P, LUSINI L, PASCARELLA S, AMICONI G. Fast-reacting thiols in rat hemoglobins can intercept damaging species in erythrocytes more efficiently than glutathione. The Journal of Biological Chemistry, 273(30): 19198-206, 1998.

SAK K. Cytotoxicity of dietary flavonoids on different human cancer types. Pharmacognosy Reviews, 8(16): 122-46, 2014.

SARMA JV, WARD PA. The complement system. Cell and Tissue Research, 343(1): 22735, 2011.

SARMA JV, WARD PA. New developments in C5a receptor signaling. Cell Health and Cytoskeleton, 4: 73-82, 2012.

SCHROETER H, BOYD C, SPENCER JPE, WILLIAMS RJ, CADENAS E, RICE-EVANS C. MAPK signaling in neurodegeneration: influences of flavonoids and of nitric oxide. Neurobiology of Aging, 23: 861-80, 2002.

SCHUHMANN B, SEITZ V, VILCINSKAS A, PODSIADLOWSKI L. Cloning and expression of gallerimycin, an antifungal peptide expressed in immune response of greater wax moth larvae, Galleria mellonella. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 53(3): 125-33, 2003.

SIES H. Role of metabolic H2O2 generation: redox signaling and oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry, 289(13): 8735-41, 2014.

SLAVÍKOVÁ H, LOJEK A, HAMAR J, DUŠKOVÁ M, KUBALA L, VONDRÁČEK J, ČÍŽ M. Total antioxidant capacity of serum increased in early but not late period after intestinal ischemia in rats. Free Radical Biology and Medicine, 25(1): 9-18, 1998. 60


SODERQUIST TJ, CHESNIAK OM, WITT MR, PARAMO A, KEELING VA, KELEHER JJ. Evaluation of the catalytic decomposition of H2O2 through use of organo-metallic complexes - a potential link to the luminol presumptive blood test. Forensic Science International, 219(1-3): 101-5, 2012.

STEVENS AM, DOLAN KM, GREENBERG EP. Synergistic binding of the Vibrio fischeri LuxR transcriptional activator domain and RNA polymerase to the lux promoter region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91(26): 12619-23, 1994.

TAYLOR ME, CONARY JT, LENNARTZ MR, STAHL PD, DRICKAMER K. Primary structure of the mannose receptor contains multiple motifs resembling carbohydrate-recognition domains. The Journal of Biological Chemistry, 265(21): 1215662, 1990.

THOMAS GM, POINAR GO. Xenorhabdus gen. nov., a genus of entornopathogenic, nematophilic bacteria of the family Enterobacteriaceae. International Journal of Systematic Bacteriology, 29(4): 352-60, 1979.

THOMSON CM, HERRING PJ, CAMPBELL AK. The widespread occurrence and tissue distribution of the imidazolopyrazine luciferins. Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 12(2): 87-91, 1997.

TONELLO F, ZORNETTA I. Bacillus anthracis factors for phagosomal escape. Toxins, 4(7): 536-53, 2012.

TRIMMER BA, APRILLE JR, DUDZINSKI DM, LAQACE CJ, LEWIS SM, MICHEL T, QAZI S, ZAYAS RM. Nitric oxide and the control of firefly flashing. Science, 292(5526): 2486-8, 2001.

TROTT D, DAWSON JJ, KILLHAM KS, MIAH MR, WILSON MJ, PATON GI. Comparative evaluation of a bioluminescent bacterial assay in terrestrial ecotoxicity testing. Journal of Environmental Monitoring, 9(1): 44-50, 2007.

ULLAH I, JANG EK, KIM MS, SHIN JH, PARK GS, KHAN AR, HONG SJ, JUNG BK, CHOI J, PARK Y, KWAK Y, SHIN JH. Identification and characterization of the insecticidal toxin "makes caterpillars floppy" in Photorhabdus temperata M1021 using a cosmid library. Toxins, 6(7): 2024-40, 2014.

URBANCZYK H, AST JC, DUNLAP PV. Phylogeny, genomics, and symbiosis of Photobacterium. FEMS Microbiology Reviews, 35(2): 324-42, 2011.

VALKO M, LEIBFRITZ D, MONCOL J, CRONIN MT, MAZUR M, TELSER J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 39(1): 44-84, 2007.

VAN HERREWEGHE JM, VANDERKELEN L, CALLEWAERT L, AERTSEN A, COMPERNOLLE G, DECLERCK PJ, MICHIELS CW. Lysozyme inhibitor conferring 61

Použitá literatura bacterial tolerance to invertebrate type lysozyme. Cellular and Molecular Life Sciences, 67 (7): 1177-88, 2010.

VOGEL SJ, TANK M, GOODYEAR N. Variation in detection limits between bacterial growth phases and precision of an ATP bioluminescence system. Letters in Applied Microbiology, 58(4): 370-5, 2014.

VOLKMER B, HEINEMANN M. Condition-dependent cell volume and concentration of Escherichia coli to facilitate data conversion for systems biology modeling. PLoS One, 6(7): e23126, 2011.

WACHINGER M, KLEINSCHMIDT A, WINDER D, VON PECHMAN N, LUDVIGSEN A, NEUMANN M, HOLLE R, SALMONS B, ERFLE V, BRACKWERNER R. Antimicrobial peptides melittin and cecropin inhibit replication of human immunodeficiency virus 1 by suppressing viral gene expression. The Journal of General Virology, 79(4): 731-40, 1998.

WATERS CM, BASSLER BL. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology, 21: 319-46, 2005.

WAYNER DD, BURTON GW, INGOLD KU, LOCKE S. Quantitative measurement of the total, peroxyl radical-trapping antioxidant capability of human blood plasma by controlled peroxidation. The important contribution made by plasma proteins. FEBS Letters, 187(1): 33-7, 1985.

WIGLEY P. Immunity to bacterial infection in the chicken. Developmental and Comparative Immunology, 41(3): 413-17, 2013.

WIMLEY WC. Describing the mechanism of antimicrobial peptide action with the interfacial activity model. ACS Chemical Biology, 5(10): 905-17, 2010.

WINTERBOURN CC, GARCIA RC, SEGAL AW. Production of the superoxide adduct of myeloperoxidase (compound III) by stimulated human neutrophils and its reactivity with hydrogen peroxide and chloride. The Biochemical Journal, 228(3): 583-92, 1985.

YAMAKAWA M, TANAKA H. Immune proteins and their gene expression in the silkworm, Bombyx mori. Developmental and Comparative Immunology, 23(4-5): 281-9, 1999.

YAMASHOJI S. Determination of viable mammalian cells by luminol chemiluminescence using microperoxidase. Analytical Biochemistry, 386(1): 119-20, 2009.

YANG D, BIRAGYN A, KWAK LW, OPPENHEIM JJ. Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal. Trends in Immunology, 23(6): 291-96, 2002.

YANG W, CHENG T, YE M, DENG X, YI H, HUANG Y, TAN X, HAN D, WANG B, XIANG Z, CAO Y, XIA Q. Functional divergence among silkworm antimicrobial 62

Použitá literatura peptide paralogs by the activities of recombinant proteins and the induced expression profiles. PLoS One, 6(3): e18109, 2011.

YANG X, ZHOU T, YU L, TAN W, ZHOU R, HU Y. A competitive chemiluminescence enzyme immunoassay method for Luminescence, v tisku, 2014.

β-defensin-2 detection in

transgenic

mice.

YI HY, CHOWDHURY M, HUANG YD, YU XQ. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology, 98(13): 5807-22, 2014.

YI HY, DENG XJ, YANG WY, ZHOU CZ, CAO Y, YU XQ. Gloverins of the silkworm Bombyx mori: structural and binding properties and activities. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 43(7): 612-25, 2013.

YOU J, LIANG S, CAO L, HAN R. Nutritive significance of crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens in Steinernema nematodes. FEMS Microbiology Ecology, 55(2): 178-85, 2006.

ZWIETERING MH, JONGENBURGER I, ROMBOUTS FM, VAN´T RIET K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and Environmental Microbiology, 56(6): 1875-81, 1990.

63

Seznam zkratek

8. Seznam zkratek ABAP ABTS AHL AMP AQ ATP C4BP CAT CCM CFU CPS CR DAF DNA FeIII-TPTZ FMNH2 FRAP GFP GMO GPX GPx GR GSH GSSG GST H2O2 Hb HOBr HOCl HORAC Ig IgG IgM Imd KBr LB LPS Lux MAC MASP MBL Mcf

2,2-azobis-2-amidinopropan hydrochlorid kyselina 2,2´-azinobis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonová) acyl-homoserin lakton antimikrobiální peptid antrachinon adenosin-tri-fosfát C4 vázající protein kataláza Česká sbírka mikroorganismů Colony Forming Unit Counts Per Second, relativní jednotka luminiscenčního signálu receptor složek komplementu Decay Acceleration Factor deoxyribonukleová kyselina tripyridyltriazin železitý flavin mononukleotid Ferric Reducing Ability of Plasma zelený fluorescenční protein geneticky modifikovaný organismus glutation peroxidáza na selenu závislá forma GPX glutation reduktáza glutation glutation disulfid glutation-S-transferáza peroxid vodíku hemoglobin kyselina bromná kyselina chlorná Hydroxyl Radical Antioxidant Capacity imunoglobulin imunoglobulin třídy G imunoglobulin třídy M Immune Deficiency signální dráha bromid draselný Luria Broth médium lipopolysacharid bakteriální luciferáza membrány atakující komplex MBL asociovaná serinová proteáza manózu vázající lektin Makes Caterpillar Floppy toxiny 64

Seznam zkratek MPO mRNA NaCl NADPH NaN3 NBTA NO NOS OD ORAC PAMP PGRP-LC Pir PRR PVC RCHO RLU RMD RMK RNA SOD ST TAC TAEC Tc TLR TRAP

myeloperoxidáza mediátorová RNA chlorid sodný nikotinamid adenin dinukleotid fosfát azid sodný agar obsahující bromthymolovou modř a trifenyltetrazolium chlorid oxid dusnatý syntáza oxidu dusnatého optická hustota Oxygen Radical Absorbance Capacity Pathogen-Associated Molecular Patterns peptidoglykan rozpoznávající protein LC Photorhabdus Insect-Related toxiny Pattern-Recognition receptory Photorhabdus Virulence Cassette toxiny aldehyd s dlouhým řetězcem relativní světelné jednotky reaktivní metabolity dusíku reaktivní metabolity kyslíku ribonukleová kyselina superoxid dismutáza stilbeny celková antioxidační kapacita Trolox Equivalent Antioxidant Capacity bakteriální toxinový komplex Toll-like receptor Total Radical-traping Antioxidant Potential

65

Publikované výsledky

9. Publikované výsledky Studie 1: ATOSUO J, LEHTINEN J, VOJTEK L, LILIUS EM. Escherichia coli K-12 (pEGFPluxABCDEamp): a tool for analysis of bacterial killing by antibacterial agents and human complement activities on a real-time basis. Luminescence, 28(5): 771-9, 2013. Impakt faktor (2013): 1,675

Studie 2: VOJTEK L, DOBEŠ P, BÜYÜKGÜZEL E, ATOSUO J, HYRŠL P. Bioluminescent assay for evaluating antimicrobial activity in insect haemolymph. European Journal of Entomology, 111(3): 335-40, 2014. Impakt faktor (2013): 1,076

Studie 3: KOTLÍK P, MARKOVÁ S, VOJTEK L, STRATIL A, ŠLECHTA V, HYRŠL P, SEARLE JB. Adaptive phylogeography: functional divergence between haemoglobins derived from different glacial refugia in the bank vole. Proceedings of the Royal Society BBiological Sciences, 281(1786): 20140021, 2014. Impakt faktor (2013): 5,292

Studie 4: DENEV P, KRATCHANOVA M, ČÍŽ M, LOJEK A, VAŠÍČEK O, NEDELCHEVA P, BLAZHEVA D, TOSHKOVA R, GARDEVA E, YOSSIFOVA L, HYRŠL P, VOJTEK L. Biological activities of selected polyphenol-rich fruits related to immunity and gastrointestinal health. Food Chemistry, 157: 37-44, 2014a. Impakt faktor (2013): 3,259

Studie 5: DENEV P, KRATCHANOVA M, ČÍŽ M, LOJEK A, VAŠÍČEK O, BLAZHEVA D, NEDELCHEVA P, VOJTEK L, HYRŠL P. Antioxidant, antimicrobial and neutrophil-modulating activities of herb extracts. Acta Biochimica Polonica, 61(2): 359-67, 2014b. Impakt faktor (2013): 1,389

66


Podíl na publikacích uvedených v dizertační práci

9.1. Studie 1:

ATOSUO J, LEHTINEN J, VOJTEK L, LILIUS EM. Escherichia coli K-12 (pEGFPluxABCDEamp): a tool for analysis of bacterial killing by antibacterial agents and human complement activities on a real-time basis. Luminescence, 28(5): 771-9, 2013.    

Všechna měření prováděná s P. luminescens včetně přípravy bakteriální suspenze těchto bakterií Některá měření prováděná s E. coli K12 Poskytnutí informací/konzultací týkajících se P. luminescens 1/4 podíl na celkové korektuře manuskriptu

Studie 2: VOJTEK L, DOBEŠ P, BÜYÜKGÜZEL E, ATOSUO J, HYRŠL P. Bioluminescent assay for evaluating antimicrobial activity in insect haemolymph. European Journal of Entomology, 111(3): 335-40, 2014.    

Všechna měření antibakteriální aktivity hemolymfy Vyhodnocení všech dat Sepsání manuskriptu - především metodické a výsledkové části, menší podíl na zbylých částech Celková korektura manuskriptu

Studie 3: KOTLÍK P, MARKOVÁ S, VOJTEK L, STRATIL A, ŠLECHTA V, HYRŠL P, SEARLE JB. Adaptive phylogeography: functional divergence between haemoglobins derived from different glacial refugia in the bank vole. Proceedings of the Royal Society B - Biological Sciences, 281(1786): 20140021, 2014.    

Měření antioxidační kapacity hemolyzátu norníků rudých pomocí metody TRAP. Vyhodnocení dat získaných metodou TRAP Sepsání metodické části týkající se TRAPu Připomínky k části diskuze týkající se výsledků metody TRAP

67


Studie 4: DENEV P, KRATCHANOVA M, ČÍŽ M, LOJEK A, VAŠÍČEK O, NEDELCHEVA P, BLAZHEVA D, TOSHKOVA R, GARDEVA E, YOSSIFOVA L, HYRŠL P, VOJTEK L. Biological activities of selected polyphenol-rich fruits related to immunity and gastrointestinal health. Food Chemistry, 157: 37-44, 2014a.    

Měření antioxidační kapacity rostlinných vzorků metodu TRAP Vyhodnocení dat získaných metodou TRAP Sepsání metodické části týkající se TRAPu Připomínky k části diskuze týkající se výsledků metody TRAP

Studie 5: DENEV P, KRATCHANOVA M, ČÍŽ M, LOJEK A, VAŠÍČEK O, BLAZHEVA D, NEDELCHEVA P, VOJTEK L, HYRŠL P. Antioxidant, antimicrobial and neutrophil-modulating activities of herb extracts. Acta Biochimica Polonica, 61(2): 359-67, 2014b.    

Měření antioxidační kapacity rostlinných vzorků metodu TRAP Vyhodnocení dat získaných metodou TRAP Sepsání metodické části týkající se TRAPu Připomínky k části diskuze týkající se výsledků metody TRAP

V online verzi dizertační práce jsou přiloženy pouze první strany publikací a práce tak má celkem 81 stran. V tištěné verzi jsou obsaženy celé publikace a celkový počet stran je tedy 117.

68


9.2.

Studie 1

Viabilita bakteriálních buněk je definována jako jejich schopnost tvořit kolonie na nutričním agaru či proliferovat v mediích s dostatkem živin. Měření viability bakterií se nejčastěji provádí pomocí měření optické hustoty bakteriální suspenze či pomocí počítání kolonií na agarových miskách - Colony Forming Units (CFU). Tyto metody však buď nedokážou rozlišit mezi živými a mrtvými buňkami, nebo nejsou založeny na měření v reálném čase. Dalšími možnostmi měření viability bakterií je využití bakteriálních kmenů značených reportérovými geny, např. luciferázou světlušek, bakteriální luciferázou z Vibrio fischerii či GFP. Tyto však vyžadují dodávání externích substrátů a jejich transport do nitra buněk, nebo jsou vysoce stabilní a neumožňují tedy rozlišení mezi živými a mrtvými buňkami. Proto byla vytvořena bioluminiscenční E. coli K12, do níž byly pomocí plasmidu vpraveny geny pro bakteriální luciferázu a její substráty (luxABCDE) pocházející z přirozeně luminiscenční terestrické bakterie P. luminescens. E. coli K12 je tedy schopna produkce světla bez nutnosti dodávky externích substrátů a schopnost produkce světla je vzhledem k vysoké spotřebě ATP přímo úměrná viabilitě jednotlivých buněk. E. coli K12 produkuje díky velkému množství obsažených plasmidů zhruba 10x vyšší luminiscenční signál než P. luminescens. Zároveň, dle předpokladů, velikost bioluminiscenčního signálu u obou bakterií pozitivně koreluje s narůstající optickou hustotou a během logaritmické fáze růstu zůstává bioluminiscenční signál konstantní. Vzhledem k pozitivní korelaci mezi poklesem bioluminiscenčního signálu a snížením počtu CFU spolu s optickou hustotou, tedy se snižujícím se počtem živých bakterií, jsou oba bakteriální kmeny vhodné pro luminiscenční měření antibakteriálního efektu nejrůznějších antibakteriálních agens. Na rozdíl od počítání CFU poskytuje luminiscenční měření data o viabilitě jednotlivých bakteriálních buněk v reálném čase. Oba bakteriální kmeny byly použity pro měření antibakteriálních účinků etanolu, polymyxinu B a lidského komplementu. Ve všech případech se E. coli K12 jeví více citlivá k účinkům antibakteriálních látek než P. luminescens, což spolu s nestabilní produkcí světla a o jeden řád vyšším detekčním limitem pro luminiscenci u P. luminescens podporuje především využití E. coli K12.

Celá publikace dostupná z: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bio.2435/abstract;jsessionid=DC34F18D2C2D29C 9738F56E814FC0DE3.f04t04

69

Research article Received: 10 February 2012,

Revised: 14 August 2012,

Accepted: 14 August 2012

Published online in Wiley Online Library: 6 November 2012

(wileyonlinelibrary.com) DOI 10.1002/bio.2435

Escherichia coli K-12 (pEGFPluxABCDEamp): a tool for analysis of bacterial killing by antibacterial agents and human complement activities on a real-time basis Janne Atosuo,a* Janne Lehtinen,a Libor Vojteka,b and Esa-Matti Liliusa ABSTRACT: Photorhabdus luminescens luxCDABE genes were integrated into E. coli K-12 using a high copy number plasmid containing modified luxABCDE genes under the control of the powerful Lac promoter. This strain emitted 10 times higher bioluminescence (BL) than P. luminescens. BL production under different growth conditions was studied. In both bacterial strains, the increase in BL signal correlated with the increase in optical density (OD) in a rich growth medium. However, at the logarithmic growth phase, the BL signal was roughly constant. By contrast, in minimal growth media, there was no substantial growth and the BL/cell was approximately five times higher than in the rich medium. The dynamic measurement range of BL was 102–107 colony-forming units (CFU) in E. coli and 103–107 CFU in P. luminescens. Because the decrease in the BL signal correlated with the decrease in CFU and OD, i.e. the number of bacterial cells killed, it proved to be very suitable for assessing the antibacterial effects of different antimicrobial agents. Unlike with plate counting, the kinetics of killing can be monitored on a real-time basis using BL measurements. Complement activities in different samples can be estimated using only one serum dilution. The transformed E. coli strain appeared to be superior to P. luminescens in these applications because E. coli was complement sensitive, the detection limit of E. coli was one order lower and the BL-producing system of P. luminescens appeared to be quite unstable. Copyright © 2012 John Wiley & Sons, Ltd. Keywords: bioluminescence; bacterial luciferase; Escherichia coli; Photorhabdus luminescens; complement system

Introduction

Luminescence 2013; 28: 771–779

* Correspondence to: Janne Atosuo, Department of Biochemistry and Food Chemistry, University of Turku, Turku, Finland. E-mail: janato@utu.fi a

Department of Biochemistry and Food Chemistry, The University of Turku, Turku, Finland

b

Department of Experimental Biology, Masaryk University, Brno, Czech Republic

Copyright © 2012 John Wiley & Sons, Ltd.

771

Viability is traditionally defined as the ability of bacterial cells to form colonies on solid agar plates under suitable conditions and/or to proliferate in solutions with sufficient nutrients. In order to reliably monitor changes in bacterial cell number, real-time data for the whole incubation period are necessary. Optical density (OD) measurement provides such a real-time assay, but the high cell number required for turbidity measurements and an inability to distinguish between live and dead bacteria, restricts the application of this method. The colonycounting assay traditionally estimates bacterial viability and killing. Kinetic measurement of killing by colony counting is troublesome and the results are not obtained on a real-time basis because the plates require a long incubation period. Another method for measuring the number of bacterial cells is the use of bacteria with reporter genes, encoding products with detectable functionality linked to the viability of the cells, such as insect luciferase (lucFF) from the firefly Photinus pyralis or bacterial luciferase (luxAB) from Vibrio harveyi. Expression of these genes results in bacterial cells emitting bioluminescence (BL) (1,2,4–8). Green fluorescent protein (GFP) is another commonly used reporter. GFP is highly fluorescent and extremely stabile, and accumulates within the bacterial cell during growth (2–4). Using these reporters, bacterial viability and the effects of different antimicrobial agents such as antiseptics, toxins, antibiotics and the function of immune mechanisms such as the serum complement system can be studied (2–14). However, both luciferase systems require the addition of an external substrate (4–6).

Moreover, the reaction is dependent on substrate transport into the cells and thus is strongly affected by external factors such as pH. GFP works without any additional substrates or cofactors and the fluorescent signal is linked to the number of bacterial cells. However, GFP cannot be used in a killing assay because it is stable and remains fluorescent in dead cells (2,7). Bacterial luciferase catalyses the oxidation of a long-chain fatty aldehyde and reduced flavin mononucleotide (FMN/ FMNH2), simultaneously emitting BL with an emission maximum at 490 nm (15–19). Bacterial luciferase is a chimeric protein with two nonidentical subunits encoded by separate genes (luxA and luxB). In the lux operon, these two genes are flanked by three additional genes (luxC, luxD and luxE) that are involved in the synthesis of its fatty aldehyde substrate. Expression of the whole operon (luxCDABE), under the control of Lac promoter, produces the luciferase holoenzyme complex resulting in bacterial cells emitting BL without addition of any substrate, providing a convenient indicator of metabolic activity in the cell. In this study, we describe an approach in which Escherichia coli K-12 was transformed with plasmid including a modified


9.3.

Studie 2

Imunita hmyzu zahrnuje stejně jako imunita obratlovců buněčnou i humorální složku. Buněčná imunita je zprostředkována hemocyty, které obstarávají fagocytózu, enkapsulaci větších patogenů či nodulaci velkého počtu bakterií. Humorální složky imunity jsou produkovány především tukovým tělesem a hemocyty do hemolymfy. Nejpodstatnějšími složkami humorální imunity hmyzu jsou antimikrobiální peptidy (AMP) a fenoloxidázová kaskáda. Existuje velké množství AMP, jež jsou tříděny do 4 hlavních skupin a každý druh hmyzu produkuje vlastní soubor těchto jedinečných peptidů. Zároveň rozdílné druhy mikroorganismů mohou jako odpověď na infekci organismu spouštět syntézu různých AMP. Metoda využívající bioluminiscenční bakterie P. luminescens a E. coli K12 (blíže popsané ve studii 1) představuje jedinečnou možnost měření antibakteriálních účinků hmyzí hemolymfy. Přidání různých koncentrací hemolymfy bource morušového (B. mori) či zavíječe voskového (G. mellonella) k bakteriálním suspenzím vyvolává koncentrační závislost úbytku luminiscenčního signálu, tedy viability jednotlivých bakterií potvrzenou měřením počtu CFU. Antibakteriální účinek hemolymfy je humorálního původu, jelikož odstranění hemocytů centrifugací nemá vliv na míru zabíjení bakteriálních buněk. Septické zranění vyvolává díky syntéze inducibilních AMP v hemolymfě odebrané po 5 hodinách silnější antibakteriální účinek. Měření antibakteriálních účinků hemolymfy hmyzu obdobně jako aktivity komplementu obratlovců pomocí bioluminiscenčních bakterií tedy představuje rychlou, levnou a přesnou metodu přinášející výsledky o skutečném zabíjení bakteriálních buněk v reálném čase. Metoda se po základní optimalizaci zdá být využitelná pro většinu hmyzích druhů či dokonce i jiných bezobratlých živočichů.

Celá publikace dostupná z: http://www.eje.cz/artkey/eje-201403-0004_bioluminescent_assay_for_evaluating_antimicrobi al_activity_in_insect_haemolymph.php#.VCqYDBa7ZGo

71

Eur. J. Entomol. 111(3): 335–340, 2014 doi: 10.14411/eje.2014.045 ISSN 1210-5759 (print), 1802-8829 (online)

Bioluminescent assay for evaluating antimicrobial activity in insect haemolymph Libor VOJTEK1, Pavel DOBEŠ1, Ender BÜYÜKGÜZEL2, Janne ATOSUO 3 and Pavel HYRŠL1 Department of Animal Physiology and Immunology, Institute of Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlářská 2, 61137 Brno, Czech Republic; e-mails: [email protected]; [email protected]; [email protected]

1

Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Sciences and Arts, Bülent Ecevit University, 67100 Zonguldak, Turkey; e-mail: [email protected]

2

3

Department of Biochemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Turku, FI-20014 Turku, Finland; e-mail: [email protected]

Key words. Lepidoptera, Bombyx mori, Galleria mellonella, antibacterial activity, antimicrobial peptides, bioluminescent bacteria, Escherichia coli, Photorhabdus luminescens Abstract. We describe an antibacterial assay based on bioluminescence of two Gram negative bacteria, Photorhabdus luminescens and transformed Escherichia coli, which can be used as a real-time measurement of antibacterial activity in insect haemolymph. This method is based on the production of the bioluminescence signal depending on the viability of bacterial cells. We observed a significant rapid dose-dependent decrease in bioluminescence using both bacterial species, and Bombyx mori or Galleria mellonella haemolymph, which was confirmed by the decrease in bacterial viability determined by plating. The humoral origin of the antibacterial activity observed in whole haemolymph was confirmed for haemolymph plasma without haemocytes. Antibacterial activity directed against Gram negative bacteria was recorded in unaffected insect larvae as well as after septic injury; increased antibacterial activity of haemolymph was detected in the latter case confirming the inducibility of antimicrobial agents. We think it is likely that this method could be widely used for determining antibacterial activity in insects and other invertebrates. Introduction

Bioluminescence is the production and emission of light by living organisms; it is a naturally occurring form of chemiluminescence in which energy is released in the form of light by an enzymatic reaction. In bacteria the expression of genes related to bioluminescence is controlled by lux operon encoding the enzyme luciferase. Although luciferases differ among bacteria they all emit light with a maximum at 490 nm and the emission requires both a reduced flavin mononucleotide (FMNH2) and long-chain aliphatic aldehyde (Poinar et al., 1980). The genus Photorhabdus (previously known as Xenor habdus) was described by Boemare et al. (Boemare et al., 1993) and includes terrestrial Gram negative bacteria of the family Enterobacteriaceae, which are mainly found in association with entomopathogenic nematodes Hetero rhabditis spp. (Nematoda: Heterorhabditidae). Upon entering an insect host nematodes release bacterial cells from their intestinal tract, which quickly establish a lethal septicaemia in the host (ffrench-Constant et al., 2003). When an insect is infected with Photorhabdus bacteria the carcass becomes visibly bioluminescent (Poinar et al., 1980). In addition to the species of Photorhabdus found in nematodes, P. asymbiotica was obtained from human clinical specimens. Similarly to naturally bioluminescent bacterium, P. lu minescens, transformed Escherichia coli K12 is capable of light production. This transformed E. coli contains a plasmid with the complete luxABCDEamp operon originating from Photorhabdus, which results in the expression of

bacterial luciferase and its substrate long-chain aldehyde (Atosuo et al., 2013). This Gram negative bacterium is very sensitive to the vertebrate complement system but not to lytic enzymes such as lysozyme. Traditionally few methods are used for measuring bacterial viability. The most frequently used method is a colony counting assay carried out using agar plates and estimation of cell number in liquid solutions measured in terms of optical density (OD). To measure kinetic of killing by plating is time-consuming and due to the long incubation time far from real-time. On the other hand OD measurements bring real-time based results, but cannot distinguish between live and dead bacterial cells. Assays based on bacterial bioluminescence offer fast and accurate real-time kinetic viability observation if proven that bioluminescence equals viability (Atosuo et al., 2013). Methods using bioluminescent E. coli are routinely used for determining bacteriolytic complement activity (Virta et al., 1997; Nikoskelainen et al., 2002; Kilpi et al., 2009). Insect immunity in general involves both humoral and cellular activities, which closely interact. Cellular activity of insect immune systems rely on different classes of haemocytes, which phagocytose and form capsules around larger intruders and defend organism against large numbers of bacteria by enclosing them in nodules. Humoral factors are secreted by the fat body and haemocytes into the haemolymph. They include especially highly potent antimicrobial peptides (AMPs) and the enzyme phenoloxidase, whose activity is accompanied by the production of quinones that are both cytotoxic and involved in cross linking of proteins. Activation of phenoloxidase, which leads 335


9.4.

Studie 3

Fylogeografie je moderní rychle se vyvíjející vědní obor využívající molekulární markery pro odvození historického biogeografického rozšíření populací v rámci jednoho druhu. Adaptivní fylogeografie pak zkoumá, které genetické aspekty byly během kolonizace preferovány a tedy vedly k tomu, že někteří jedinci osídlili právě dané území na úkor jiných. Nejčastěji se tak děje při změně klimatických podmínek, jakou je např. konec doby ledové. Kromě molekulárních markerů je však důležité studovat také funkční produkty daných genů pro vysvětlení selektivních procesů během kolonizace. Británie byla na konci poslední doby ledové kolonizována z centrální Evropy norníkem rudým (Clethrionomys glareolus) ve dvou fázích. V první fázi byla celá Británie kolonizována z jednoho refugia a při druhé kolonizaci došlo k částečnému genetickému nahrazení z jiného refugia. Genotyp zvířat z prvního refugia se vyskytuje především na severozápadě a jihu, kdežto genotyp pocházející z druhého refugia se nachází v centrální a východní části Británie. Tomuto prostorovému rozlišení dvou genotypů odpovídá rozmístění jedinců s dvěma přirozeně se vyskytujícími genotypově i funkčně odlišnými variantami Hb, jež může poskytovat svému nositeli jisté výhody. Tyto dvě varianty Hb se liší v sekvenci aminokyselin, kdy jedna z variant obsahuje alelickou změnu - substituci serinu 52 za cystein v molekule β-globinu. Strukturní modelování odhalilo, že tento protein nese 52Cys tiolovou skupinu, jež je velice reaktivní a schopná vychytávat RMK, což bylo následně potvrzeno in vitro. Tato změna tedy přináší svému nositeli zvýšenou ochranu erytrocytů před oxidačním stresem. Tato zjištění poskytují důkaz, že vytlačení jedinců pocházejících z jiného refugia se dělo pod selekčním tlakem vycházejícím z fyziologické výhody poskytnuté produktem změny genetické varianty molekuly Hb. Podporují tedy teorii, že v minulosti mohlo docházet během globálního oteplování na konci doby ledové ke genetickým záměnám v populacích velice často, což neguje doposud uznávané teorie, jež tvrdí, že jedinci s daným genetickým charakterem, kteří osídlili určité místo jako první, se zde vyskytují dodnes.

Celá publikace dostupná z: http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/281/1786/20140021.long

73

Downloaded from rspb.royalsocietypublishing.org on May 14, 2014

rspb.royalsocietypublishing.org

Adaptive phylogeography: functional divergence between haemoglobins derived from different glacial refugia in the bank vole Petr Kotlı´k1, Silvia Markova´1, Libor Vojtek3, Antonıń Stratil1, Vlastimil Sˇlechta2, Pavel Hyrsˇl3 and Jeremy B. Searle4

Research Cite this article: Kotlı´k P, Markova´ S, Vojtek L, Stratil A, Sˇlechta V, Hyrsˇl P, Searle JB. 2014 Adaptive phylogeography: functional divergence between haemoglobins derived from different glacial refugia in the bank vole. Proc. R. Soc. B 281: 20140021. http://dx.doi.org/10.1098/rspb.2014.0021

Received: 5 January 2014 Accepted: 11 April 2014

Subject Areas: evolution Keywords: adaptation, antioxidative capacity, climate change, cysteine, oxidative stress, redox

Author for correspondence: Petr Kotlı´k e-mail: [email protected]

Electronic supplementary material is available at http://dx.doi.org/10.1098/rspb.2014.0021 or via http://rspb.royalsocietypublishing.org.

1

Laboratory of Molecular Ecology, and 2Laboratory of Fish Genetics, Institute of Animal Physiology and Genetics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Libeˇchov 27721, Czech Republic 3 Department of Animal Physiology and Immunology, Institute of Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University, Brno 61137, Czech Republic 4 Department of Ecology and Evolutionary Biology, Cornell University, Ithaca, NY 14853, USA Over the years, researchers have used presumptively neutral molecular variation to infer the origins of current species’ distributions in northern latitudes (especially Europe). However, several reported examples of genic and chromosomal replacements suggest that end-glacial colonizations of particular northern areas may have involved genetic input from different source populations at different times, coupled with competition and selection. We investigate the functional consequences of differences between two bank vole (Clethrionomys glareolus) haemoglobins deriving from different glacial refugia, one of which partially replaced the other in Britain during end-glacial climate warming. This allows us to examine their adaptive divergence and hence a possible role of selection in the replacement. We determine the amino acid substitution Ser52Cys in the major expressed b-globin gene as the allelic difference. We use structural modelling to reveal that the protein environment renders the 52Cys thiol a highly reactive functional group and we show its reactivity in vitro. We demonstrate that possessing the reactive thiol in haemoglobin increases the resistance of bank vole erythrocytes to oxidative stress. Our study thus provides striking evidence for physiological differences between products of genic variants that spread at the expense of one another during colonization of an area from different glacial refugia.

1. Introduction Phylogeography has been one of the mainstays of evolutionary study over the 25 years since the seminal paper of Avise et al. [1] launched the field. Over 10 000 phylogeographic papers have been published and, for instance, the review article by Hewitt [2] has been cited more than 2000 times. The core aim of phylogeography is to use molecular markers to infer historical biogeographic scenarios at the within-species level. The ideal markers for such analysis would seem to be those that are selectively neutral, because these will purely reflect historical processes, revealing population origins and geographical spread [3]. However, colonization is not necessarily a selectively neutral process, and if we are properly to understand why individuals of a particular genetic constitution are in a particular area, we need to determine what aspect of that genetic constitution may have been favoured during the colonization process. This is what we mean by ‘adaptive phylogeography’. Recently, phylogeographic data have been used to provide a historical context for adaptive divergence by local adaptation, for example to inform on how many independent times an adaptive phenotype evolved or a timeframe for the adaptation [4–6]. Such studies use phylogeographic data to study adaptation and also can qualify as adaptive phylogeography. However, we use the term

& 2014 The Author(s) Published by the Royal Society. All rights reserved.


9.5.

Studie 4

Existuje velké množství studií prokazujících pozitivní korelaci mezi konzumací čerstvého ovoce a zeleniny a prevencí vážných nemocí negativně ovlivněných či přímo způsobených oxidačním stresem - např. rakovina, nemoci kardiovaskulárního systému či Alzheimerova choroba. Rostliny (ovoce a zelenina) či jejich části obsahují velké množství bioaktivních molekul (např. polyfenolycké látky či jiné látky s antioxidačními účinky), a proto jsou vhodným materiálem pro přípravu nejen chutných, ale také funkčních jídel. Byly sledovány antioxidační vlastnosti extraktů 6 zástupců ovocných plodin - šípku (Rosa canina), temnoplodce (Aronia melanocarpa), hlohu (Crataegus monogyna), černého rybízu (Ribes nigrum), borůvky (Vaccinium myrtillus) a jeřabiny (Sorbus aucuparia). Pro přesné výsledky měření byly vzorky analyzovány pomocí 4 metod zjišťujících antioxidační kapacitu jednotlivých vzorků. Použité metody byly ORAC, TRAP, HORAC a inhibice lipidové peroxidace. Kromě antioxidační kapacity byl také zjišťován efekt na produkci RMK aktivovanými fagocyty, antimikrobiální vlastnosti proti 11 lidským patogenům a mitogenní efekt na lymfocyty pocházející ze sleziny křečka. Metodami ORAC, TRAP a HORAC byla zjištěna nejvyšší antioxidační kapacita u extraktu z šípku a nejlepším inhibitorem lipidové peroxidace je extrakt z borůvek. Všechny zkoumané extrakty působí inhibičně na produkci RMK fagocyty aktivovanými opsonizovaným zymozanem díky narušení signální kaskády dějů vedoucích k aktivaci proteinkinázy C. Extrakty temnoplodce, černého rybízu a jeřabiny prokázaly silné antimikrobiální účinky vůči širokému spektru mikroorganismů a také měly nejvyšší mitogenní aktivitu. Výsledky naznačují velký potenciál těchto rostlin či jejich extraktů jako zdrojů bioaktivních látek majících antioxidační, antibakteriální a podpůrné vlastnosti, jež hrají významnou roli při zachování homeostázy lidského organismu. Bohužel kromě borůvek a černého rybízu nejsou tyto plodiny běžnou součástí jídelníčku širší populace, nicméně tyto výsledky mohou přispět k jejich rozšíření a případnému uvedení na trh.

Celá publikace dostupná z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814614001964

75

Food Chemistry 157 (2014) 37–44

Contents lists available at ScienceDirect

Food Chemistry journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodchem

Biological activities of selected polyphenol-rich fruits related to immunity and gastrointestinal health Petko Denev a, Maria Kratchanova a,⇑, Milan Ciz b, Antonin Lojek b, Ondrej Vasicek b, Plamena Nedelcheva c, Denitsa Blazheva c, Reneta Toshkova d, Elena Gardeva d, Liliya Yossifova d, Pavel Hyrsl e, Libor Vojtek e a

Institute of Organic Chemistry with Centre of Phytochemistry, Bulgarian Academy of Sciences, Laboratory of Biologically Active Substances, 139 Ruski Blvd., 4000 Plovdiv, Bulgaria Institute of Biophysics of the AS CR, Kralovopolska 135, 612 65 Brno, Czech Republic University of Food Technologies, 26 Maritsa Blvd., 4002 Plovdiv, Bulgaria d Institute of Experimental Morphology, Pathology and Anthropology with Museum, Bulgarian Academy of Sciences, Acad. G. Bonchev Str., bl. 2, 1113 Sofia, Bulgaria e Department of Animal Physiology and Immunology, Institute of Experimental Biology, Masaryk University, Kotlarska 2, 611 37 Brno, Czech Republic b c

a r t i c l e

i n f o

Article history: Received 10 October 2013 Received in revised form 7 January 2014 Accepted 5 February 2014 Available online 12 February 2014 Keywords: Small fruits Polyphenols Antioxidant activity Oxidative burst Antimicrobial properties Mitogenic activity

a b s t r a c t Small fruits are a rich source of bioactive substances, including polyphenols, and are therefore suitable raw materials for the production of functional foods. In the current work, we studied the antioxidative properties of six fruits: rosehip, chokeberry, hawthorn, blackcurrant, blueberry and rowanberry via different methods (ORAC, TRAP, HORAC and inhibition of lipid peroxidation). Their effect on the production of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes, antimicrobial properties against 11 human pathogens, and mitogenic effect on hamster spleen lymphocytes were also tested. Rosehip extract showed the highest antioxidant activity via ORAC, TRAP and HORAC assays, whereas blueberry extract was the most potent inhibitor of lipid peroxidation. All extracts inhibited ROS production of opsonized zymosan-activated phagocytes, indicating that extracts interfere with the signaling cascade of phagocyte activation upstream to the protein kinase C activation. Chokeberry, blackcurrant and rowanberry extracts revealed strong antimicrobial properties against a broad spectrum of microorganisms and also had the highest mitogenic activity. Ó 2014 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction There are numerous studies demonstrating a correlation between the consumption of fresh fruits and vegetables with the prevention of socially significant diseases including cancer, cardiovascular diseases and Alzheimer disease (Heber, 2004; Hertog et al., 1996). A considerable amount of evidence indicates that increased oxidative damage contributes to the development of these diseases and several epidemiologic studies point out that the consumption of polyphenol-rich foods and beverages is associated with a lower risk of oxidative stress-related diseases (Ames, Shigenaga, & Hagen, 1993; Hertog et al., 1996). Polyphenols are a class of secondary plant metabolites that are thought to exert beneficial health effects through their antioxidant properties (Halliwell, Zhao, & Whiteman, ⇑ Corresponding author. Tel./fax: +359 32 642759. E-mail addresses: [email protected] (P. Denev), [email protected] (M. Kratchanova), [email protected] (M. Ciz), [email protected] (A. Lojek), ondrej.vasicek@ ibp.cz (O. Vasicek), [email protected] (P. Nedelcheva), dblazheva@gmail. com (D. Blazheva), [email protected] (R. Toshkova), elena.gardeva@ gmail.com (E. Gardeva), [email protected] (L. Yossifova), [email protected] (P. Hyrsl), [email protected] (L. Vojtek). http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.02.022 0308-8146/Ó 2014 Elsevier Ltd. All rights reserved.

2000). Although there is a considerable volume of scientific data regarding flavonoid health benefits, the majority of the mechanisms of their bioactivity still remain unclear. Many of the polyphenol compounds are barely, if not at all, absorbed in the gastrointestinal tract (GIT). For example, anthocyanins which are broadly distributed in many plants, appear to be poorly absorbed in the small intestine. They are recovered in blood and urine in nanomolar concentrations, so significant amounts probably pass into the large intestine where bacterial degradation occurs. Similarly, proanthocyanidins, which are referred to as polymeric flavonoids and are strong antioxidants in vitro, have very limited absorption in the GIT; oligomers larger than trimers are unlikely to be absorbed in the small intestine in their native forms (Denev, Kratchanov, Ciz, Lojek, & Kratchanova, 2012). Although some flavonoids can be absorbed through the GIT, maximal plasma concentrations achieved are very low, in part because of rapid metabolism by human tissues and colonic bacteria (Halliwell, Rafter, & Jenner, 2005). Since absorption of phenolic compounds is incomplete, the majority passes through the GIT and enters the colon. Their local action may nevertheless be important because the intestine is particularly exposed to oxidising agents and may be affected by


9.6.

Studie 5

Lidský zažívací trakt je neustále vystaven velkému množství prooxidačních látek nejrůznějšího původu. Tyto látky vyvolávají oxidační stres, jenž může vést k závažným onemocněním gastrointestinálního traktu, jako jsou rakovina žaludku, tlustého střeva či konečníku nebo žaludeční vředy. Při prevenci těchto onemocnění hrají velkou roli látky přijímané v potravě nesoucí především antioxidační a antimikrobiální vlastnosti. Antioxidační, antimikrobiální a lymfocyty ovlivňující vlastnosti byly studovány u extraktů 6 zástupců medicínských rostlin. Jedná se o listy ostružiníku (Rubus fruticosus), listy temnoplodce (Aronia melanocarpa), listy hlohu (Crataegus monogyna), nadzemní části kontryhele (Alchemilla glabra), nadzemní části tužebníku (Filipendula ulmaria) a listy malinovníku (Rubus idaeus). Pro přesné měření antioxidační kapacity jednotlivých vzorků byly použity 4 metody: ORAC, TRAP, HORAC a inhibice lipidové peroxidace. Všechny metody určily extrakt z listů ostružiníku a nadzemní části tužebníku jako vzorky s nejvyšší antioxidační kapacitou. Všechny extrakty zcela inhibovaly produkci RMK fagocyty aktivovanými opsonizovaným zymozanem, avšak inhibice produkce RMK fagocyty aktivovanými forbol myristát acetátem byla mnohem nižší, což naznačuje, že extrakty narušují signální kaskádu aktivace proteinkinázy C. Antimikrobiální aktivita extraktů proti 11 lidským patogenům byla měřena třemi různými metodami. Nejvyšší obsah antimikrobiálních látek a zároveň nejnižší minimální inhibiční koncentrace proti testovaným mikrobům byly zaznamenány u extraktu z nadzemní části tužebníku a listů ostružiníku. Z výsledků vyplývá, že všechny studované rostliny, nejvíce však listy ostružiníku a tužebníku, obsahují velké množství antioxidantů a inhibitorů lipidové peroxidace, jsou také schopny inhibovat produkci RMK neutrofily a působí antibakteriálně vůči širokému spektru mikroorganismů. Celá publikace dostupná z: http://www.actabp.pl/pdf/2_2014/359.pdf

77

Vol. 61, No 2/2014 359–367 on-line at: www.actabp.pl Regular paper

Antioxidant, antimicrobial and neutrophil-modulating activities of herb extracts Petko Denev1, Maria Kratchanova1*, Milan Ciz2, Antonin Lojek2, Ondrej Vasicek2, Denitsa Blazheva3, Plamena Nedelcheva3, Libor Vojtek4 and Pavel Hyrsl4 1Institute of Organic Chemistry with Centre of Phytochemistry, Bulgarian Academy of Sciences, Laboratory of Biologicaly Active Substances, Plovdiv, Bulgaria; 2Institute of Biophysics of the AS CR, Brno, Czech Republic; 3University of Food Technologies, Plovdiv, Bulgaria; 4Department of Animal Physiology and Immunology, Institute of Experimental Biology, Masaryk University, Brno, Czech Republic

The present study provides a comprehensive data on the antioxidant, antimicrobial and neutrophil-modulating activities of extracts from six medicinal plants — blackberry (Rubus fruticosus) leaves, chokeberry (Aronia melanocarpa) leaves, hawthorn (Crataegus monogyna) leaves, lady’s mantle (Alchemilla glabra) aerial parts, meadowsweet (Filipendula ulmaria) aerial parts and raspberry (Rubus idaeus) leaves. In order to analyze the antioxidant activity of the herbs, several methods (ORAC, TRAP, HORAC and inhibition of lipid peroxidation) were used. Blackberry leaves and meadowsweet extracts revealed the highest antioxidant activities via all methods. All extracts studied blocked almost completely the opsonized zymosan particle-activated ROS production by neutrophils from human whole blood. On the other hand, the effect of extracts on phorbol myristate acetate-activated ROS production was much milder and even nonsignificant in the case of chokeberry leaves. This latter result suggests that extracts (apart from their antioxidative activity) interfere with the signaling cascade of phagocyte activation upstream of the protein kinase C activation. The antimicrobial activity of the investigated extracts against 11 human pathogens was investigated using three different methods. Meadowsweet and blackberry leaves extracts had the highest antimicrobial effect and the lowest minimal inhibiting concentrations (MICs) against the microorganisms tested. Key words: herbs, polyphenols, antioxidant activity, antimicrobial activity, phagocytes, reactive oxygen species Received: 31 January, 2014; revised: 15 April, 2014; accepted: 08 May, 2014; available on-line: 18 June, 2014

INTRODUCTION

Human gastrointestinal tract (GIT) is constantly exposed to oxidizing agents of diverse origins. The diet contains various prooxidants, including metals (copper and free or heme-bound iron), lipid hydroperoxides, aldehydes and nitrite, and consequently elevated levels of lipid peroxides have been observed in the postprandial state (Kanner & Lapidot, 2001). These prooxidants may induce oxidative stress in the GIT, resulting in stomach ulcer and stomach, colon, and rectal cancers. Besides that, oxidative stress induced by microbial infections is another major contributor to the development of gastro-intestinal diseases. There is increasing evidence that microbial pathogens induce oxidative stress in host cells,

resulting in considerable accumulation of inflammatory cell, which could be related to the development of gastric mucosal as well as neuromuscular disorders (Suzuki et al., 2012). Recent studies have shown that many bacterial pathogens can trigger apoptosis of infected host cells (Krzyminska et al., 2011). It has been shown that phagocyte-derived reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) are important factors inducing apoptosis (Circu & Aw, 2010). The activation of phagocytes in the gut may also increase the ROS and RNS production, and gastric juice may promote lipid peroxidation (Kanner & Lapidot, 2001). Phagocytic cells such as macrophages and neutrophils play a key role in innate immunity owing to their ability to recognize, ingest, and destroy pathogens by oxidative and nonoxidative mechanisms. In response to a variety of stimuli, NADPH oxidase present in neutrophils is activated in a phenomenon described as the respiratory burst, characterized by the production of the superoxide anion which gives rise to other forms of ROS. In addition nitric oxide (NO) and other RNS produced mainly by macrophages are among the major microbicidal agents of inflammation during the fight against pathogenic microorganisms and tumor cells. However, excessive or inappropriate ROS and RNS production by phagocytes is associated with oxidative damage to membrane lipids, DNA, proteins, and lipoproteins, resulting in various autoimmune and inflammatory diseases. Thus, the modulation of inflammation and oxidative stress by natural substances can be beneficial. Therefore, the role of antioxidants in the GIT may be very important and antioxidants contained in foods could suppress the oxidative stress and related diseases in the gastrointestinal tract before being absorbed (Halliwell et al., 2000) and thus could modulate the level of oxidative stress by enhancing anti-inflammatory or antioxidant capacity (Suzuki et al., 2012). In the recent search for novel sources of anti-inflammatory and antioxidant agents medicinal plants have attracted particular attention. Since ancient times herbs have been used in *

e-mail: [email protected] Abbreviations: AAPH, 2,2´-azobis (2-amidino-propane) dihydrochloride; AUC, area under the curve; CL, chemiluminescence; DW, dry weight; GAE, gallic acid equivalents; GIT, gastrointestinal tract; HBSS, Hank‘s balanced salt solution; HORAC, hydroxyl radical averting capacity; HPLC, high performance liquid chromatography; LPS, lipopolysaccharide; MIC, minimal inhibiting concentration; ORAC, oxygen radical absorbance capacity; OZP, opsonized zymosan particles; PKC, protein kinase C; PLD, phospholipase D; PMA, phorbol myristate acetate; RLU, relative light units; RNS, reactive nitrogen species; ROS, reactive oxygen species; S.D., standard deviation; TE, trolox equivalents; TRAP, total peroxyl-radical antioxidant parameter

Ostatní publikace

10. Ostatní publikace Články: ONDRAČKOVÁ M, VALOVÁ Z, KORTAN J, VOJTEK L, ADÁMEK Z. Consequent effects of the great cormorant (Phalacrocorax carbo sinensis) predation on parasite infection and body condition of common carp (Cyprinus carpio). Parasitology Research, 110(4): 1487-93, 2012. IF(2012): 2,852

RAMPL I, PALKO L, HYRŠL P, VOJTEK L. Pulsed vector magnetic potential field existence. World Journal of Condensed Matter Physics, 2: 202-7, 2012.

bez IF

Přednášky: KOTLÍK P, MARKOVÁ S, VOJTEK L, KONCZAL M, HYRŠL P, SAERLE J. Functional divergence and population replacement in British bank voles. 14th Rodens et Spatium, Lisabon, 2014.

VOJTEK L, TOLAROVÁ S, DÁVIDOVÁ M, VETEŠNÍKOVÁ ŠIMKOVÁ A, FLAJŠHANS M, HYRŠL P. The seasonal changes of innate immunity of tench, Tinca tinca (L.) with different ploidy level. VIth International Workshop on Biology and Culture of the Tench (Tinca tinca L.), Písek, 2012.

ONDRAČKOVÁ M, VALOVÁ Z, KORTAN J, VOJTEK L, ADÁMEK Z. Parasitic infection in common carp wounded by cormorant (Phalacrocorax carbo sinensis) attacks. 13th European congress of Ichthyology, Klaipeda, 2009.

Postery: BAUEROVÁ P, BAINOVÁ H, VINKLEROVÁ J, HYRŠL P, VOJTEK L, VINKLER M, SVOBODOVÁ J. Vliv prostředí na zdravotní stav a orientaci samců sýkory koňadry (Parus major). Zoologické dny Ostrava 2014, Ostrava, 2014.

DOBEŠ P, BERKA J, HURYCHOVÁ J, VOJTEK L, HYRŠL P. Pathogenicity of nematobacterial complexes and its development. International Congress on Invertebrate Pathology and Microbial Control & 47th Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology, Mohuč, 2014.

HYRŠL P, DOBEŠ P, VOJTEK L, BERKA J. Infection of honeybee larvae by entomopathogenic nematodes - natural model to study honeybee immunity. Sixth European Conference of Apidology, Murcia, 2014.

79

Ostatní publikace

VOJTEK L, DOBEŠ P, PROKOPOVÁ L, VINKLEROVÁ J, VINKLER M, HYRŠL P. Chemiluminescent determination of reactive oxygen species using Pholasin luminophore in birds and insect phagocytes. 18th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, Uppsala, 2014.

FLÖSSLER J, DOBEŠ P, VOJTEK L, HYRŠL P. Imunitní systém včel a metody stanovení jednotlivých imunitních parametrů. Zoologické dny Brno 2013, Brno, 2013.

FLÖSSLER J, DOBEŠ P, VOJTEK L, KAMLER M, TYL J, TITĚRA D, HYRŠL P. Bee immune system and methods evaluating its immune parameters. XXXXIII. International Apicultural Congress Apimondia, Kyjev, 2013.

PAVLIŇÁK D, ŠVACHOVÁ V, ALBERTI M, DUŠKOVÁ M, HYRŠL P, VOJTEK L, DOBEŠ P, NEJEZCHLEBOVÁ H. Plasmachemical modifications of cellulose for biomedical application. 5th Central European Symposium on Plasma Chemistry, Balatonalmádi, 2013.

SILNICOVÁ K, VOJTEK L, HYRŠL P. Přirozená imunita ryb. Zoologické dny Brno 2013, Brno, 2013.

VOJTEK L, DOBEŠ P, BÜYÜKGÜZEL E, HYRŠL P. Bioluminescence determination of antibacterial activity of Bombyx mori and Galleria mellonella haemolymph. Insect pathogens and entomoparasitic nematodes, IOBC-WPRS 2013, Záhřeb, 2013.

LUBAWY J, RUOTSI M, VOJTEK L, DOBEŠ P, HYRŠL P. Patogenność różnych gatunków nicieni owadobójczych (EPNs) u D. melanogaster oraz G. mellonella, I Ogólnopolską Konferencję Młodych Naukowców - ARTHROPOD, Katowice, 2012.

PANZARINO O, DOBEŠ P, VOJTEK L, VOSTAL K, BARI G, DE LILLO E, HYRŠL P. Wax moth (Galleria mellonella) as a bio-indicator model in ecotoxicological studies on cadmium. Zoologické dny Olomouc 2012, Olomouc, 2012.

PAVLIŇÁK D, ŠVACHOVÁ V, KEDROŇOVÁ E, ALBERTI M, HYRŠL P, DUŠKOVÁ M, NEJEZCHLEBOVÁ H, VOJTEK L. Nanofibrous scaffolds for tissue engineering. Potencial and Applications of Surface Nanotreatment of Polymers and Glass, Brno, 2011.

VLK D, VOJTEK L, HYRŠL P. Účinek ultrazvukového pole na bioluminiscenční bakterie. XXXIV. Dny Lékařské biofyziky, Plzeň, 2011.

VOJTEK L, DOBEŠ P, HYRŠL P. Antibacterial agents in innate immunity: comparison of vertebrates and invertebrates. Workshop on Animal Physiology and Immunology 2011, Brno, 2011.

VOJTEK L, DOBEŠ P, HYRŠL P. Antibacterial methods based on bioluminescent bacteria. Zoologické dny Brno 2011, Brno, 2011.

80

Ostatní publikace

HYRŠL P, BUCHTÍKOVÁ S, VOJTEK L, PALKO L, RAMPL I. Bioluminiscenční bakterie jako citlivý prostředek pro měření vlivu pole impulsního vektorového magnetického potenciálu a impulsního magnetického pole. XXXIII. dny lékařské biofyziky, Mikulov, 2010.

VOJTEK L, DOBEŠ P, HYRŠL P. Nematobacterial complex HeterorhabditisPhotorhabdus in immunity studies. EMBO Young Scientists Forum 2010 Prague, Praha, 2010.

81

Využití luminometrických metod při sledování vrozené imunity živočichů

Recommend Documents