Metody testování humorální imunity
Co je to humorální imunita? • Humorální = látková ↓ • Buněčné produkty • Nespecifická imunita příklady: » » » »
Lysozym v slinách, slzách Sérové proteiny (proteiny akutní fáze) Komplementový systém ECP
• Specifická imunita » Protilátky
Opakování - Komplementový systém (1/2) • Soubor zhruba 30 sérových proteinů • Hlavní složky – C1-C9 • Ústřední složkou fragment C3 • Samovolné štěpení→ C3b (reaktivní skupina), C3a • C3b možnost vazby na různé povrchy • C3a - chemotaxe
Protilátky a jejich využití Komerční výroba protilátek Užití principu vazby protilátky s antigenem
antigen + protilátka
Imunokomplex antigen-protilátka
Krev je odrazem našich nemocí • Funkce krve • Transportní • Homeostatická • Obranná, imunitní
• Srážlivá krev • Sérum
• Nesrážlivá krev – antikoagulans (např. EDTA) • Krevní plazma
Jaké humorální složky se testují? (1/2) • Protilátky • Kvantitativní testy – hladiny protilátek • Funkční testy – afinita k danému antigenu » Exoantigen » Autoantigen
• Cirkulující imunokomplexy
Jaké humorální složky se testují? (2/2) • Komplement • Složky • Inhibitory
• Proteiny akutní fáze • CRP
• ECP
Imunologické vyšetřovací metody • 1. Aglutinace • 2. Precipitace • 3. Praktické využítí precipitace: Turbidimetrie, nefelometrie • 4. Enzymatická imunoanalýza (ELISA) • 5. Nepřímá imunofluorescence • 6. Elektroforéza • 7. Western blot
1. Aglutinace (shlukování) Shlukování korpuskulárních částic nesoucích na svém povrchu antigen (aglutinogen) reagující s protilátkou (aglutininem) ve vyšetřovaném vzorku
• Princip • Reakce:
Antigen (aglutinogen) + protilátka (aglutinin) → shluk (aglutinát)
Aglutinace v praxi • Aglutinogen (antigen) • • • •
Viry Bakterie Erytrocyty Latex
• Aglutinin • Specifické protilátky
• Užití • Průkaz protilátek » Viry, bakterie » Revmatoidní faktor
• Limitace – nespecifičnost • Zkřížená reaktivita
2. Precipitace (srážení)
Aglutinace (shlukování) je reakce protilátky a korpuskulárního antigenu (krvinky, bakterie, latexové částice)
x
Precipitace (srážení) je reakce protilátky a koloidního antigenu
3. Praktické využítí precipitace: Turbidimetrie, nefelometrie • Reakce antigen+protilátka = imunokomplex • Princip • Měření množství imunokomplexů (zákal)
• Koncentrace antigenu • Úměrná » Rychlosti tvorby zákalu » Hustotě zákalu
• Kalibrační křivka Měření úbytku světla, které prošlo roztokem obsahujícím imunokomplexy Měření světla rozptýleného na imunokomplexech
Kalibrační křivka
ax + by + c = 0
Př. 3x + 5y + 6 = 0
Laboratorní využití nefelometrie a turbidimetrie • Imunoglobuliny • Složky komplementu • C3 • C4
• Proteiny akutní fáze • CRP
• ECP
• Hladiny léků
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Enzymem značená protilátka váže analyt. Po odmytí nenavázané protilátky přeměňuje enzym dodaný substrát na barevný produkt měřitelný spektrofotometrem. • Analyt • Antigen • Protilátka
• Kalibrační křivka
Jak detekovat antigen ELISou? • Přímá ELISA • Vazba značené protilátky přímo na antigen
• Nepřímá ELISA • Vazba protilátky např. ze séra na antigen • Detekce nepřímo pomocí sekundární značené protilátky
• Sandwichová ELISA • Antigen je pomocí protilátky navázané na destičku připoután k pevné fázi – detekce: » Přímo » Nepřímo
ELISA v praxi • Měření • Protilátkové třídy • Protilátková odpověď » Autoantigen » Alergen » EBV » HIV » Onemocnění - Borelióza - Toxoplazmóza - Hepatitidy
• Přítomnost antigenu » Hormony – př. tyroxin » Léků – digoxin » Proteinů - CEA
↓
5. Nepřímá fluorescenční analýza
Fluorescence je emise záření fluorescenční látkou, která byla předtím excitována
Imunologická fluorescenční analýza • Vazba protilátek ze séra na známý substrát → detekce autoprotilátek • Nepřímá detekce • Substrát např.: • • • •
Tkáňové řezy – např. opičí Prvok - Crithidia luciliae Lidské granulocyty Tkáňové kultury – HEp-2 buňky
Mikroskopická fluorescenční analýza
Obr.1 Opičí jícen - IgA protilátky proti endomyziu A
Obr.2 Crithidia luciliae -protilátky proti dsDNA B C
< cytoplazmatic staining
Obr.3 Lidské granulocyty - různá specifita protilátek proti granulocytům
Obr.4 Hep-2 buňky- protilátky proti a) jaderným strukturám b) mitochodriím c) aktinu
6. Elektroforéza Elektroforéza je pohyb nabitých částic v elektrickém poli • SDS page elektroforéza • Denaturace proteinů za přítomnosti » Merkaptoetanolu – zrušení S-S můstků » SDS – vazba na denaturovaný protein → záporný náboj je úměrný velikosti proteinu
• Možnost použití gelu → rozdělení proteinů dle velkosti SDS
+
↓
SDS page elektroforéza
↑
Ultrastruktura gelu
7. Western blot
→
7. Western blot • Navazuje na elektroforézu • Přenesení proteinů z gelu na membránu za pomocí elektrického pole • Značení detekovaného proteinu protilátkou • Přímá detekce antigenu • Nepřímá detekce – přidání séra pacienta
• Zviditelnění vazby (reakce enzym-substrát) • Fluorescence • Luminiscence – detekce pomocí filmu → negativ • Nerozpustné barvivo
Western blot v klinické diagnostice • Testování reakce jednotlivých sérových protilátek se specifickým antigenem • Konfirmační testování pro ELISA • Testování protilátek př.: • Chlamydie • Borelie • HIV
Děkuji za pozornost
