VYUŽITÍ KVANTOVÝCH TEČEK V IN VIVO ZOBRAZOVÁNÍ Iva BLAŽKOVÁ Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělska 1, 613 00 Brno, Česká republika PGS09_2012
ABSTRAKT Kvantové tečky jsou polovodičové nanokrystaly, které mají široké uplatnění, lze je využít ke značení proteinů, molekul, bakterií, eukaryotických buněk, prionů a dokonce i tkání a orgánů. Tato práce se zabývá využitím kvantových teček ve vizualizaci buněk. Pozornost je věnována také limitům detekce kvantových teček v tkáni. 1. ÚVOD Kvantové tečky (quantum dots – QDs) představují anorganické polovodičové nanokrystaly o velikosti 1–20 nm, jednu tečku tvoří 100 až 100 000 atomů. Kvantové tečky mají výborné fluorescenční vlastnosti, mají vysoké kvantové výtěžky, široká absorpční spektra, úzká emisní spektra závislá na jejich velikosti, velký Stokesův posun, vysoký molární extinkční koeficient a jsou odolné vůči zhášení a chemické degradaci. Často používané jsou kvantové tečky telluridové, sulfidové, selenidové, arzenidové s ionty kadmia, olova, zinku, india, rtuti a galia. Vlastnosti kvantových teček závisí na způsobu jejich syntézy a povrchové modifikaci. Změnou podmínek mikrovlnného ohřevu (výkonem, teplotou a časem reakce) lze měnit velikost připravených kvantových teček. Zpravidla při nižších teplotách a době reakce vznikají nejmenší tečky, které mají zbarvení do modra až do zelené. Naopak při vyšších teplotách a delším ohřevu se tvoří větší částice, které jsou oranžové až červené [1-7]. Kvantové tečky lze aplikovat v bioanalytické chemii a biologii jako značky DNA, ve fluorescenčním značení mikroskopických preparátů, ke specifickému značení tkání organizmu, protilátek, oligonukleotidů, enzymů, aptamerů, ve FRET (Förstrův rezonanční přenos energie), BRET (bioluminescenční rezonanční přenos energie), ECL (elektrochemiluminiscenci) atd. Možnost konjugace kvantových teček s biomolekulami otevírá cestu jejich využití ve značení v biologických testech. Kvantové tečky lze použít jako značky v imunologických stanoveních. Na kvantových tečkách založená imunologická stanovení pro detekci nízkomolekulárních látek lze využít ve zdravotnictví, kontrole bezpečnosti potravin, ve farmacii a monitoringu životního prostředí. Kvantové tečky jsou dobrou alternativou tradičních organických barviv, enzymatických značek, nebo izotopových značek [1, 4, 5, 8, 9]. Díky vlastnostem kvantových teček je možné jejich využití nejen in vitro, ale také v in vivo zobrazování. Studium kvantových teček patří mezi nejvíce se rozvíjející oblasti nanotechnologií [10]. V budoucnu lze očekávat využití kvantových teček v humánní medicíně, neboť je možné jejich využití k vizualizaci transportu léčiv. V oblasti základního výzkumu je detekce fluorescence terapeutik přínosná především v oblasti vývoje
cílené léčby a kontroly zacílení léčiva na místo s nádorovou tkání. Díky svým rozměrům se snadno dostávají k cílovým orgánům. Pro využití kvantových teček v zobrazování a léčbě je nutná jejich vysoká biokompatibilita [11]. Vhodnou modifikací povrchu kvantových teček snížíme jejich toxicitu a umožníme specifickou vazbu na konkrétní místo v organizmu [12, 13]. Uhlíkové nanotrubice (carbon nanotubes - CNTs) se díky snadnému pronikání přes buněčnou membránu zdají být dobrým nástrojem k dopravě léčiv, jestliže je označíme kvantovými tečkami můžeme tento transport úspěšně pozorovat [14-16]. Nevýhodou in vivo zobrazování je vysoká autofluorescence tkání při nízkých vlnových délkách, proto je vhodnější při studiu živých organizmů využití blízkého infračerveného záření (NIR). Blízké infračervené záření také lépe proniká do tkání a dostává se do hloubky několika centimetrů [17, 18]. CdTe kvantové tečky mohou být použity jako vysoce citlivé sondy k detekci prionových proteinů. Přídavkem rekombinantního prionového proteinu (rPrP) k roztoku zelených CdTe kvantových teček se do 30 sekund objeví sraženina emitující oranžové záření. Toto umožňuje kolorimetrickou kvalitativní a semi-kvantitativní detekci rPrP. Kvantitativní detekce prionových proteinů by mohlo být dosaženo měřením změny intenzity fluorescence supernatantu. Tato metoda se jeví jako slibný způsob detekce v klinické diagnóze prionových proteinů [19]. Současné zobrazovací metody užívané v diagnostice a kontrole léčby jsou magnetická rezonance (MRI), ultrazvuk (US), pozitronová emisní tomografie (PET), počítačová tomografie (CT), jednofotonová emisní výpočetní tomografie (SPECT) a optické zobrazovací metody [20, 21]. Optické metody jsou relativně levné, neionizující metody založené na specifických optických vlastnostech látek a jsou významným nástrojem neinvazivní a objektivní diagnostiky se stále lepším rozlišením [22, 23]. Výhodné je využití přirozených fluorescenčních vlastností látek a značených molekul [24]. Zdrojem fluorescence pro tyto účely mohou být organické fluorofory (fluorescein, rhodamine), biologické fluorofory (green fluorescence protein), kvantové tečky, nebo vlastní fluorescence některých léčiv [24-27]. V oblasti základního výzkumu je detekce fluorescence terapeutik přínosná především v oblasti vývoje cílené léčby a kontroly zacílení léčiva na místo s nádorovou tkání. Vlastní fluorescence léčiva může být zesílena jeho konjugací s kvantovou tečkou [28]. Fluorescence může být detekována pomocí fluorescenčního spektroskopu, který měří signál celého vzorku v kyvetě nebo v jamce mikrotitrační destičky. Fluorescenční mikroskopie je široce využívána v biomedicínském výzkumu ke studiu molekulárních a buněčných procesů v buněčných kulturách a v tkáních. Toto je umožněno vysokou citlivostí fluorescenčních technik, dobrým rozlišením vzhledem k velikosti buněk, stabilitou značek a sofistikovanými metodami barvení, které umožňují selektivní barvení cílových molekul. Dvourozměrné a třírozměrné metody optického zobrazování jsou užívány k monitoringu biologických procesů v organizmu a to nejen u zvířat, ale i u lidí. Problémem při těchto stanoveních je velký rozptyl a absorpce záření tkáněmi. Ačkoli jsou in vivo optické metody velmi citlivé, signál značně závisí na okolí, signál detekovaný ze stejného zdroje bude ve větší hloubce v tkáni slabší a značně závislý na optických vlastnostech okolí [34]. Zobrazování fluorescenčních značek v tkáních umožňuje fluorescence reflectance imaging (FRI), při tomto zobrazování fluorescence se nachází zdroj záření i detektor na téže straně objektu, spojení laseru a citlivého CCD zařízení společně s pokročilými matematickými
modely umožňuje citlivou detekci fluorescence. Třírozměrné zobrazení fluorescenčních značek v tkáni umožňuje fluorescence-mediated molecular tomography [29-31] . Försterův rezonanční přenos energie (Förster resonance energy transfer - FRET) je jedinečný v generaci fluorescenčního signálu v závislosti na molekulových konformacích a jejich sdružení a oddělení v rozmezí 1 - 10 nm [32]. Pro studium chování fluoroforů v organizmu může být využit přístroj Carestream In-vivo Xtreme Imaging Systém. Přístroj umožňuje vysoce citlivé zobrazení fluorescenčně značených biomolekul, radioizotopů, luminiscence a je opatřeni rentgenem. Umožňuje excitaci nejen ve viditelné oblasti, ale i v oblasti delších vlnových délek (NIR) a tím sledování fluoroforů v živém organizmu. Je uzpůsoben pro in vivo zobrazování malých zvířat (anestézie, termoregulátor). Přístroj disponuje vysoce kvalitním fotoaparátem, software umožňuje kvantifikaci intenzity záření a separaci jednotlivých fluoroforů. Výběrem vhodných excitačních a emisních filtrů lze s vysokou citlivostí identifikovat a odlišit řadu fluoreskujících látek. Pomocný přístroj MARS (Multimodal Animal Rotation System) umožňuje 3D zobrazení orgánů a celého organizmu. 2. MATERIÁLY A METODY 2.1 Využití kvantových teček ve fluorescenčním značení buněk Příprava CdTe kvantových teček s merkaptopropionovou kyselinou Kvantové tečky byly připraveny z octanu kademnatého (5 ml; 5,33 g/l), citrátu sodného (100 mg), teluričitanu sodného (1,25 ml; 4,432 g/l), tetrahydridoboritanu sodného (50 mg), vody (44 ml) a merkaptopropionové kyseliny (100 μl). Vzniklý roztok se za stálého míchání nechal 1 hodinu reagovat. Následně byl roztok rozpipetován po 2 ml do skleněných vialek, které byly vloženy do mikrovlné trouby, v níž proběhla syntéza kvantových teček (15 min, 120 °C, 300 W). Kvantové tečky byly po přípravě přečištěny isopropanolem. Přečištění probíhalo smícháním kvantových teček s isopropanolem v poměru 1:1. Po centrifugaci (10 minut, 6000 otáček) byl odsán supernatant a sraženina kvantových teček na dně zkumavky rozpuštěna v ACS H2O na původní objem. Barvení buněk K fluorescenčnímu značení byly použity bakteriální buňky: Staphylococcus aureus a Escherichia coli, tabákové buňky BY-2 a lidské fibroblasty (HFF). Bakteriální buňky v živném médiu byly stočeny na centrifuze a po odsátí supernatantu bylo odebráno do mikrozkumavky 10 μl samotných buněk, k nimž bylo přidáno 100 μl kvantových teček. Po inkubaci (15, 30 a 60 minut) byly buňky třikrát promyty 1000 μl PBS pufru a na závěr promíchány v 1000 μl PBS. K 200 μl buněčné kultury tabákových buněk BY-2 bylo napipetováno 400 μl kvantových teček a inkubováno po dobu 15, 30 a 60 minut. Inkubace probíhala na třepačce (1400 rpm) při 20°C. Po inkubaci bylo odebráno 200 μl roztoku a promícháno s 1000 μl PBS pufru (pH 7,4; na 250 ml: 0,065 g NaH2PO4 × 12 H2O; 0,36 g Na2HPO4 × 2 H2O; 2,195 g NaCl, miliQ H2O)
a stočeno (20 °C, 5 minut, 6000g). Supernatant byl odsán a buňky byly ještě 2x promyty pomocí PBS stejným způsobem a uchovány v 1000 μl PBS. Fibroblasty byly adherované na dně mikrotitrační destičky (Nunc MaxiSorp® s plochým dnem, 96 jamek o průměru 5 mm). Z jamky destičky bylo odsáto živné médium (DMEM + FBS) a k buňkám napipetováno 150 μl kvantových teček. Inkubace probíhala po dobu 15, 30 a 60 minut poté byly buňky třikrát propláchnuty PBS pufrem (200 μl). Detekce buněk pomocí fluorescenční mikroskopie Buňky byly pozorovány fluorescenčním mikroskopem Olympus IX 71 (Tokyo, Japan) za použití excitačního filtru: 520-550 nm a emisního filtru: 580 nm. 2.2 Detekce kvantových teček citlivým CCD detektorem za použití nitrocelulózové membrány Kvantové tečky CdS-2 (CdS kvantové tečky stabilizované glutathionem) a CdS-15 (CdS kvantové tečky stabilizované merkaptopropionovou kyselinou) byly aplikovány na chromatografický papír. K aplikaci kvantových teček na nitrocelulózový chromatografický papír byla použita Bio-Dot aparatura (Biorad). Membrána byla umístěna do jednotky a za vakua byly na membránu (platforma 12 x 8 spotů) pipetovány různé objemy (5, 2, 1 a 0.5 µl) kvantových teček za současného sušení. Připravený chromatografický papír byl analyzován přístrojem Carestream In-vivo Xtreme Imaging System (Rochester, USA). Excitace: 460 nm, emise: 700 nm, čas expozice: 2 s, binning: 2x2 pixels, zorné pole: 7.2 x 7.2 cm.
2.3 Interakce kvantových teček s hemagglutininem Jako standard hemagglutininu chřipky A, byla použita chřipková vakcína Vaxigrip (Sanofi Pasteur, France), která obsahovala inaktivované a rozbité viriony následujících standardů: A/California/7/2009 (H1N1) – kmeny odvozeny od NYMC X-179A, A/Perth/16/2009 (H3N2) kmeny užívající NYMC X-187 odvozeny od A/Victoria/210/2009. Kmen byl vypěstován v oplodněných slepičích vejcích ze zdravých drůbežích chovů. Vaxigrip obsahuje 15 μg všech tří HA na 0,5 ml. Příprava CdS kvantových teček CdS kvantové tečky byly připraveny podle lehce upravené publikované metodiky [33]. Tetrahydrát dusičnanu kademnatého Cd(NO3)2·4H2O (0.1 mM) byl rozpuštěn v ACS vodě (25 ml). 3-merkaptopropionová kyselina (35 µl, 0.4 mM) byla pozvolna přidávána za stálého míchání do roztoku. Poté bylo upraveno pH na 9,11 pomocí 1 M NH3 (1,5 ml). Monohydrát sulfidu sodného Na2S·9H2O (0.1 mM) v ACS vodě byl nalit do roztoku za intenzicního míchání. Připravený žlutý roztok byl míchán po dobu 1 hodiny. Připravené kvantové tečky byly skladovány ve tmě při 4 °C. Navázání kvantových teček na hemagglutinin
Vakcína (100 µl) byla smíchána s roztokem kvantových teček (100 µl). Tato směs byla třepána 24 hodin při pokojové teplotě (Vortex Genie2 (Scientific Industries, USA). Objem roztoku byl redukován na 100 µl na Amicon Ultra 3k ařízení do centrifugy (Millipore, Massachusetts, USA). Centrifuga 5417R (Eppendorf, Hamburg, Germany) byla použita za těchto podmínek: 15 min, 6000 g, 20 ºC. Získaný koncentrát byl zředěn 400 µl ACS vody a redukován na centrifuzé na 100 µl ACS, proces byl takto opakován pětkrát. Promytý vzorek byl zředěn do 300 µl a použit na následné analýzy.
2.4 Aplikace kvantových teček do svalové tkáně Kvantové tečky CdTe byly aplikovány do svaloviny (vepřové maso, kuřecí prsní svalovina) pomocí insulinové injekce (Chirana T. injecta, objem: 1 ml, 0.33 x 12 mm). Nebo byla použita infúzní souprava s peristaltickou pumpou (Pump P-1, Amesham Biosciences, AP Czech) s průtokem 100 µl/min. Fluorescence byla detekována přístrojem Carestream In-vivo Xtreme a obrázky byly analyzovány Carestream molecular imaging softwarem. Do svalové tkáně byl aplikován různý objem kvantových teček (0, 100, 200, 300, 400, 500 μl) a pozorováno jejich chování v tkáni. Rovněž byla testována i různá hloubka vpichu kvantových teček za účelem zjištění, do jaké hloubky je možno danné tečky pozorovat. Intenzita fluorescence teček byla detekována také po aplikaci teček na povrch tkáně a detekci jejich fluorescence přes odlišnou sílu tkáně. Takto byla snáze stanovena hloubka, do níž mohou být tečky detekovány.
3. Výsledky 3.1 Využití kvantových teček ve fluorescenčním značení buněk Pomocí fluorescenční mikroskopie bylo pozorováno obarvení buněk kvantovými tečkami. U bakteriálních buněk nebyly kvantové tečky detekovány. Kvantové tečky ale velmi dobře obarvily tabákové buňky BY-2 (Obrázek 1.). Kvantovými tečkami se tedy velmi dobře barví rostlinné buňky. K detekci významné fluorescence dochází zřejmě také díky velké velikosti rostlinných buněk. K obarvení došlo již po 15 minutách. Pro lidské fibroblasty byla dávka kvantových teček toxická, buňky byly poškozeny a odlepovaly se od misky, proto nebylo možné pozorovat jejich obarvení. Kvantové tečky se tedy jevily jako vhodné značky pouze pro rostlinné buňky.
A
B
Obrázekk 1. Tabákkové buňkyy BY-2 obaarvené kva antovými teečkami. A) světelné pole; p B) fluoresccence buněěk obarvenýých kvantovvými tečka ami; fluoresscence deteekována za a použití excitačnního filtru: 520-550 5 nm m a emisníhoo filtru: 580 0 nm; zvětšeení: 100x
3.4 Aplikace kvan ntových tečeek do svaloové tkáně Kvantovvé tečky byly b injekččně aplikovvány do sv valové tkán ně a byla detekován na jejich fluoresccence v závislosti na ap plikovaném m objemu a hloubce h vpiichu. Při applikaci byla injekční stříkačkka pevně uppevněna na stojanu, s abyy bylo zajištěno stejné místo vpichhu při opak kovaných aplikacíích kvantovvých teček do tkáně. Z důvodu nepřesného o dávkovánní nízkých objemů injekčníí stříkačkouu, byla k apllikaci zvoleena infúzní souprava s peristalticko kou pumpou u. Pumpa zajistilaa výrazně leppší opakovaatelnost v applikovaném m objemu (50 μl) léčivaa (RSD 5%). Se vzrůůstajícím mnnožstvím lééčiva (50 – 500 μl) apllikovaným do tkáně linneárně roste plocha prostoroové distribuuce kvantov vých teček v tkáni. Ro ovněž byl zaaznamenán významný lineární růst maxximální inteenzity fluorrescence kvvantových teeček. Na ob brázku 5 jsoou distribučční mapy fluoresccence CdTe kvantových h teček applikovaných h do svalovéé tkáně o steejné hloubce vpichu (3 mm),, v množstvví 100, 200, 300, 400 a 500 μl. Je vidět, žee intenzita fluorescencce stejně jako proostorová disstribuce kvaantových teeček se s apllikovaným množstvím m zvyšuje. Dále D bylo zjištěnoo, že po apllikaci kvanttových tečeek do svalo ové tkáně k prostorovéé distribuci dochází téměř ookamžitě a k dalšímu u viditelném mu rozšiřov vání plochy y fluoresceenčního sig gnálu již nedocháází ani po delším časse (3 hodinny), síla siignálu se však v mírněě zvyšuje z důvodu distribuuce v ose z (směrem ( do olů, tzn. k deetektoru).
0 µl
100 µl
200 µl
300 µl
400 µl
500 µl
Obrázek 4. Kvantové tečky CdTe injektované do svaloviny (vepřové maso) v objemu 0 – 500 μl. Carestream In-vivo Xtreme Imaging System (Rochester, USA). Excitation wavelength : 410 nm, emission wavelength: 535 nm, expoziční čas: 1 s, binning: 1x1 pixels, zorné pole: 7.2 x 7.2 cm. Kvantové tečky byly aplikovány do různých hloubek svalové tkáně (1 – 12 mm) a při těchto aplikacích byla zaznamenána špatná opakovatelnost měření intenzity fluorescence kvantových teček (± 40 %) díky nerovnoměrné struktuře tkáně. Červené CdTe-7 kvantové tečky (excitace: 600 nm, emise: 700 nm) je možné dobře detekovat přes vrstvu tkáně 8 mm (Obrázek 5), signál kvantových teček se zcela ztrácí až v hloubce 12 mm. Tečky fluoreskují v oblasti vyšších vlnových délek, díky čemuž je umožněna jejich detekce do větších hloubek tkáně.
5 mm 8 mm
Obrázek X. Vliv síly (5 mm, 8mm) svalové tkáně (kuřecí prsní svalovina) na intenzitu fluorescence červených CdTe-7 kvantových teček. Aplikováno 5 μl kvantových teček na povrch tkáně a přes tuto tkáň byly tečky detekovány. Carestream In-vivo Xtreme Imaging System (Rochester, USA); excitace: 600 nm, emise: 700 nm; expoziční čas: 1 s, binning: 1x1 pixels, zorné pole: 10 x 10 cm. 4. ZÁVĚR Kvantové tečky lze využít k fluorescenčnímu značení buněk. Pomocí CdTe kvantových teček lze vizualizovat rostlinné buňky. Tyto polovodičové nanokrystaly lze úspěšně použít i ke znační v živých organizmech. Jejich detekce je však omezena mohutností tkáně, detekovány jsou do hloubky maximálně 12 mm. 5. POUŽITÁ LITERATURA
1.
2. 3.
4. 5. 6. 7. 8. 9.
10. 11. 12. 13. 14.
Algar, W.R., A.J. Tavares, and U.J. Krull, Beyond labels: A review of the application of quantum dots as integrated components of assays, bioprobes, and biosensors utilizing optical transduction. Analytica Chimica Acta, 2010. 673(1): p. 1-25. Biju, V., et al., Bioconjugated quantum dots for cancer research: Present status, prospects and remaining issues (vol 28, pg 199, 2010). Biotechnology Advances, 2011. 29(2): p. 259-260. Dabbousi, B.O., et al., (CdSe)ZnS core-shell quantum dots: Synthesis and characterization of a size series of highly luminescent nanocrystallites. Journal of Physical Chemistry B, 1997. 101(46): p. 9463-9475. Han, B.F., et al., Polyethyleneimine modified fluorescent carbon dots and their application in cell labeling. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces, 2012. 100: p. 209-214. Medintz, I.L., et al., Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and sensing. Nature Materials, 2005. 4(6): p. 435-446. Resch-Genger, U., et al., Quantum dots versus organic dyes as fluorescent labels. Nature Methods, 2008. 5(9): p. 763-775. Rosenthal, S.J., et al., Biocompatible Quantum Dots for Biological Applications. Chemistry & Biology, 2011. 18(1): p. 10-24. Esteve-Turrillas, F.A. and A. Abad-Fuentes, Applications of quantum dots as probes in immunosensing of small-sized analytes. Biosensors & Bioelectronics, 2013. 41: p. 12-29. Liskova, M., et al., Conjugation reactions in the preparations of quantum dot-based immunoluminescent probes for analysis of proteins by capillary electrophoresis. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2011. 400(2): p. 369-379. Cai, W.B., et al., Are quantum dots ready for in vivo imaging in human subjects? Nanoscale Research Letters, 2007. 2(6): p. 265-281. Frasco, M.F. and N. Chaniotakis, Bioconjugated quantum dots as fluorescent probes for bioanalytical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010. 396(1): p. 229-240. Jun, B.H., et al., Ultrasensitive, Biocompatible, Quantum-Dot-Embedded Silica Nanoparticles for Bioimaging. Advanced Functional Materials, 2012. 22(9): p. 1843-1849. Aboulaich, A., et al., Physicochemical properties and cellular toxicity of (poly)aminoalkoxysilanes-functionalized ZnO quantum dots. Nanotechnology, 2012. 23(33). Bianco, A., K. Kostarelos, and M. Prato, Applications of carbon nanotubes in drug delivery. Current Opinion in Chemical Biology, 2005. 9(6): p. 674-679.
15. 16. 17. 18.
19.
20. 21. 22.
23. 24.
25.
26. 27.
28. 29. 30.
31. 32. 33.
Karchemski, F., et al., Carbon nanotubes-liposomes conjugate as a platform for drug delivery into cells. Journal of Controlled Release, 2012. 160(2): p. 339-345. Popov, V.N., Carbon nanotubes: properties and application. Materials Science & Engineering R-Reports, 2004. 43(3): p. 61-102. Frangioni, J.V., In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology, 2003. 7(5): p. 626-634. Ntziachristos, V., J. Ripoll, and R. Weissleder, Would near-infrared fluorescence signals propagate through large human organs for clinical studies? Optics Letters, 2002. 27(5): p. 333-335. Zhang, L.Y., et al., CdTe quantum dots as a highly selective probe for prion protein detection: Colorimetric qualitative, semi-quantitative and quantitative detection. Talanta, 2011. 83(5): p. 1716-1720. Mura, S. and P. Couvreur, Nanotheranostics for personalized medicine. Advanced Drug Delivery Reviews, 2012. 64(13): p. 1394-1416. Schnall, M. and M. Rosen, Primer on imaging technologies for cancer. Journal of Clinical Oncology, 2006. 24(20): p. 3225-3233. Balas, C., Review of biomedical optical imaging-a powerful, non-invasive, non-ionizing technology for improving in vivo diagnosis. Measurement Science & Technology, 2009. 20(10). Stemmer, N., et al., Noninvasive Fluorescence Imaging in Animal Models of Stroke. Current Medicinal Chemistry, 2012. 19(28): p. 4786-4793. Niedre, M.J., et al., Early photon tomography allows fluorescence detection of lung carcinomas and disease progression in mice in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008. 105(49): p. 19126-19131. Miyake, R., et al., Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy for the Monitoring of Green Fluorescent Protein-Tagged Androgen Receptors in Living Cells. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 2013. 61(1): p. 82-84. Minotti, G., et al., Anthracyclines: Molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity. Pharmacological Reviews, 2004. 56(2): p. 185-229. Scaramel, F.S., F.R. Lourenco, and T.J.A. Pinto, Evaluation of Cisplatin, Doxorubicin and Paclitaxel Inactivation Using Asepto 75 (TM) 0.5 %, Sodium Hypochloride 10 % and Sodium Thiosulfate 10 % by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and In Vitro Cytotoxicity Test. Latin American Journal of Pharmacy, 2011. 30(8): p. 1602-1607. Savla, R., et al., Tumor targeted quantum dot-mucin 1 aptamer-doxorubicin conjugate for imaging and treatment of cancer. Journal of Controlled Release, 2011. 153(1): p. 16-22. Bremer, C., V. Ntziachristos, and R. Weissleder, Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European Radiology, 2003. 13(2): p. 231-243. Ntziachristos, V., C. Bremer, and R. Weissleder, Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. European Radiology, 2003. 13(1): p. 195-208. Stuker, F., J. Ripoll, and M. Rudin, Fluorescence Molecular Tomography: Principles and Potential for Pharmaceutical Research. Pharmaceutics, 2011. 3: p. 229-274. Jares-Erijman, E.A. and T.M. Jovin, FRET imaging. Nature Biotechnology, 2003. 21(11): p. 1387-1395. Li, H., W.Y. Shih, and W.H. Shih, Synthesis and characterization of aqueous carboxyl-capped CdS quantum dots for bioapplications. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2007. 46(7): p. 2013-2019.
