Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin
VYUŽITÍ KULTUR IN VITRO KLANOPRAŠKY ČÍNSKÉ PRO PRODUKCI SEKUNDÁRNÍCH METABOLITŮ Bakalářská práce
Brno 2006
Vedoucí bakalářské práce:
Vypracovala:
prof. RNDr. Ladislav Havel, CSc.
Irena Bohatcová
2
3
Prohlášení
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Využití kultur in vitro klanoprašky čínské pro produkci sekundárních metabolitů vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.
V Brně, dne 11. května 2006
Podpis: ................................................
4
Dovoluji si touto cestou poděkovat vedoucímu mé bakalářské práce prof. RNDr. Ladislavu Havlovi, CSc. za cenné rady při zpracování práce. Dále ing. Heleně Vlašínové za odborné rady, metodické vedení pokusu a trpělivou pomoc při řešení zadané problematiky. Děkuji také Mgr. Jiřímu Slaninovi, Ph.D. z LF MU za analýzu vzorků a poskytnuté výsledky a pracovníkům laboratoře Ústavu biologie rostlin AF MZLU v Brně.
5
Annotation Increase of production of lignans, main secondary metabolites Schisandra chinensis, can be reached by using adsorbents which eliminate lignans from culture medium. Cell cultures of line LAT 10 and LA I were cultivated in liquid culture medium with addition of polymeric resins. The addition of styrofoam resin markedly increased the overall production of lignans in both lines in comparison with control without presence of the adsorbents, particulary the production of deoxyschizandrin both lines and also gama-schizandrin
in
line
LAT 10.
Polyacrylic
resin
increased
production
of deoxyschizandrin and gama-schizandrin in line LA I in comparison with the control. However it had rather negative influence in line LAT 10. In line LA I both resins adsorbed lignans from medium much more actively than in line LAT 10. Both resins adsorbed mainly deoxyschizandrin on their surface. Use of biotechnological methods in Schisandra chinensis is perspective for targeted production of single lignans.
Keywords: adsorption; cell cultures; lignans; polymeric resins; Schisandra chinensis
6
Obsah Annotation .............................................................................................................................5 Seznam tabulek a obrázků .....................................................................................................8 Seznam použitých zkratek .....................................................................................................9 1.
Úvod.............................................................................................................................10
2.
Literární přehled ..........................................................................................................11 2.1.
Klanopraška čínská ..............................................................................................11
2.1.1.
Nomenklatura...............................................................................................11
2.1.2.
Popis rostliny ...............................................................................................11
2.1.3.
Původ a místa výskytu .................................................................................13
2.1.4.
Pěstování......................................................................................................13
2.1.5.
Chemické složení rostliny............................................................................14
2.1.6.
Použití ..........................................................................................................15
2.2.
2.1.6.1.
Historie užívání....................................................................................15
2.1.6.2.
Použití v lékařství, farmakologické vlastnosti a účinky ......................15
2.1.6.3.
Další využití.........................................................................................16
Sekundární metabolity .........................................................................................17
2.2.1.
Úvod.............................................................................................................17
2.2.2.
Fenolické látky.............................................................................................18
2.2.3.
Lignany ........................................................................................................18
2.2.3.1.
Protinádorová aktivita..........................................................................19
2.2.3.2.
Antivirová aktivita ...............................................................................19
2.2.3.3.
Kardiovaskulární aktivita.....................................................................20
2.2.3.4.
Antioxidační aktivita............................................................................20
2.2.3.5.
Lignany u savců a člověka...................................................................21
2.2.4. 2.3.
Lignany rodu Schisandra.............................................................................21
Metody produkce sekundárních metabolitů rostlin in vitro.................................23
2.3.1.
Využití suspenzních buněčných kultur ........................................................23
2.3.2.
Metody zvýšení produkce sekundárních metabolitů ...................................25
2.3.2.1.
Varianty kultivačních podmínek a složení živného média ..................25
2.3.2.2.
Přidání prekurzorů příslušných produktů do živného média ...............25
2.3.2.3.
Elicitace ...............................................................................................25
7
2.3.2.4. 2.3.3.
Využití sorbentů sekundárních metabolitů ..........................................26 Způsoby kultivace buněčných kultur ...........................................................27
2.3.3.1.
Pohybující se médium..........................................................................27
2.3.3.2.
Stacionární kultura...............................................................................27
2.4.
Somatická embryogeneze ....................................................................................28
2.5.
Somatická embryogeneze u Schisandra chinensis ..............................................30
3.
Cíl práce.......................................................................................................................35
4.
Materiál a metody zpracování......................................................................................35 4.1.
Rostlinný materiál................................................................................................35
4.2.
Chemikálie ...........................................................................................................35
4.3.
Metody zpracování ..............................................................................................37
4.3.1.
Varianty experimentu ..................................................................................37
4.3.2.
Příprava kultivačního média ........................................................................37
4.3.3.
Založení kultur.............................................................................................38
4.3.4.
Kultivace......................................................................................................38
4.3.5.
Hodnocení kultur .........................................................................................39
4.3.6.
Analýza vzorků ............................................................................................39
5.
Výsledky ......................................................................................................................40
6.
Diskuse.........................................................................................................................46
7.
Závěr ............................................................................................................................48
8.
Soupis literatury...........................................................................................................49
8
Seznam tabulek a obrázků Tab. 1
Biochemické složení plodu a listu S. chinensis v syrovém stavu. ......................15
Tab. 2
Akumulace lignanů v rostlinných buněčných a orgánových kulturách různých rostlinných druhů. ...............................................................................................24
Tab. 3
Médium Murashige a Skoog (Duchefa). .............................................................36
Obr. 1
Schisandra chinensis (Turcz.) Baillon. ...............................................................12
Obr. 2
Chemické vzorce hlavních lignanů S. chinensis. . ...............................................22
Obr. 3
Somatická embryogeneze ze zygotických embryí S. chinensis I. .......................32
Obr. 4
Somatická embryogeneze ze zygotických embryí S. chinensis II. .....................33
Obr. 5
Somatická embryogeneze ze zygotických embryí S. chinensis III. ....................34
Obr. 6
Kultivační nádoba Magenta (Sigma). .................................................................37
Obr. 7
Embryogenní linie LA I a LAT 10 po 49 dnech kultivace. ................................39
Obr. 8
Růstové křivky kultur. ........................................................................................40
Obr. 9
Průměrný obsah lignanů [µg] v pokusech s amberlity (kultura + médium + amberlit) a v kontrolních pokusech (kultura + médium). ................................41
Obr. 10 Průměrný obsah jednotlivých lignanů [µg] v pokusech s amberlity (kultura + médium + amberlit) a v kontrolních pokusech (kultura + médium). ...............42 Obr. 11 Průměrný obsah jednotlivých lignanů [µg] v kulturách, médiích a na amberlitech. .........................................................................................................43 Obr. 12 Průměrný obsah lignanů [µg] v kulturách, médiích a na amberlitech. ...............44 Obr. 13 Obsah lignanů [%] v kulturách přepočtený na sušinu. .......................................45
9
Seznam použitých zkratek 2,4-D
2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina
ABA
kyselina abscisová
BAP
6-benzylaminopurin
cAMP
cyklický adenozinmonofosfát
CNS
centrální nervový systém
HDL
lipoprotein s vysokou hustotou [angl. High Density Lipoprotein]
HIV
virus lidské imunodeficience
HPLC
vysokotlaká kapalinová chromatografie
LDL
lipoprotein s nízkou hustotou [angl. Low Density Lipoprotein]
MS
médium Murashige a Skoog
NDGA
kyselina nordihydroguajaretová
PTOX
podophyllotoxin
TDZ
thidiazuron
WV5
médium Westvaco
10
1. Úvod Klanopraška čínská je léčivá rostlina, používaná po staletí v orientální medicíně k léčbě kašle, při poruchách hybnosti a k posílení organismu. Aktivními látkami obsaženými v klanoprašce jsou především dibenzocyklo[a,c]oktadienové lignany, hlavní sekundární metabolity této rostliny. Nacházejí se ve všech částech rostliny, jejich nejvyšší obsah byl zjištěn v semenech. Vykazují široké spektrum významných biologických účinků, největší pozornost je věnována zejména jejich antioxidační a hepatoprotektivní aktivitě, dále antivirovým, protinádorovým a kardiovaskulárním účinkům. Přestože obsahové látky S. chinensis vykazují řadu perspektivních efektů, není této rostlině u nás věnována větší pozornost a její výzkum probíhá převážně ve východoasijských zemích, kde je její přirozené stanoviště. K produkci lignanů klanoprašky čínské je možné využít explantátové kultury, zejména kultivaci embryogenních kultur, odvozených ze semen rostliny.
11
2. Literární přehled 2.1. Klanopraška čínská 2.1.1. Nomenklatura Klanopraška čínská, latinsky Schisandra chinensis (Turcz.) Baillon, patří do čeledi Schisandraceae (Magnoliaceae) (MC KENNA, 2002), která zahrnuje dva rody, Kadsura a Schisandra (OPLETAL a kol., 2004). Její anglický název je Magnolia vine, ruský Limonnik, čínský Wuweizi, korejský Omicha a v Japonsku se nazývá Gomishi (MC KENNA, 2002). Jako synonymum uvádí DUKE (2002) název Kadsura chinensis Turcz.
2.1.2. Popis rostliny Schisandra chinensis je vytrvalá opadavá dřevina (MC KENNA, 2002), vzrostlá keřovitá liána, která na pohled připomíná vinnou révu (MAZNĚV, 2003). Mohutný dřevnatý stonek o průměru 1-2,2 cm je popínavý, dlouhý 10-15 m. Pevné elastické stonky liány ovíjí kmeny stromů a keřů a vyrůstají do jejich korun. V severních oblastech vytváří klanopraška keřovitou formu porostu s početnými oddenky. Borka na starých stoncích je tmavě hnědá, svraštělá a odlupující se, na mladých žlutavá, lesklá a hladká. Obsahuje četné množství podélně natažených čočinek (MAZNĚV, 2003). HEJDUK (2005) uvádí, že v našich podmínkách dorůstá klanopraška délky šesti metrů. Střídavé listy jsou rozloženy v trsu na zkrácených stoncích. Jsou řapíkaté, velice mírně zdužnatělé, dlouhé 5-10 cm, široké 3-5 cm a světle zelené barvy. Čepel je zašpičatělá, vejčitého tvaru, s mělce zoubkovaným okrajem a klínovitou bází. Žilnatina na spodní straně listu je vystouplá a mírně ochmýřená. Řapíky mají růžovou nebo načervenalou barvu (MAZNĚV, 2003). Květy jsou jednopohlavné, jednodomé, občas se vyskytují květy oboupohlavné. Jsou shromážděny po 2-5 kusech na zkrácených větvích nebo na bázi popínavých stonků a příjemně voní. Tenké květní stopky jsou růžovočervené a dlouhé 1-4 cm. Jednoduché okvětí má průměr asi 2 cm. Je složeno z 6 až 9 plátků voskovité, bílé, krémové nebo narůžovělé barvy (obr. 1 A). Samčí květy mají 5-7 tyčinek s krátkými nitkami. Samičí květy mají apokarpní gyneceum, které je tvořeno 10-48 okrouhlými plodolisty. Semeníky jsou svrchní. Květní lůžko je podlouhlé, válcovité a nazelenalé. S. chinensis kvete ve druhé
12
polovině května až začátkem června (MAZNĚV, 2003). HEJDUK (2005) uvádí, že klanopraška kvete ve čtvrtém roce, v prvních letech kvetení se objevují zpravidla pouze samčí květy a později se přidají i květy samičí. Plodem jsou kulaté bobule o průměru 5-10 mm. Mají sytě červenou barvu, jsou jednosemenné i dvousemenné, šťavnaté (obr. 1 B, C). Souplodí je dlouhé 8-10 cm a tvoří je 10-40 volných plodů (MAZNĚV, 2003). V Číně jsou za nejlepší sušené plody považovány plody lesklé, velké, splasklé a svraštělé, nafialovělé až červené barvy. Plody zrají od září do listopadu a během zrání nabývají charakteristického hroznovitého tvaru. Zralé plody mají hořkou příchuť a vyvolávají typické pálení na rtech (MAZNĚV, 2003), mají citrónovou vůni, exokarp je sladký, mezokarp a endokarp kyselý a semena štiplavá či svíravě pálivá. Celková chuť je slaná, proto název wuweizi, čili ,,plody pěti chutí” (MC KENNA, 2002). Plody S. chinensis jsou intenzivně studovány z fytochemického a farmakologického hlediska (OPLETAL a kol., 2004). Semena jsou široká přibližně 3,5 mm a dlouhá 4,5 mm (MC KENNA, 2002). Jsou lesklá, mají ledvinovitý tvar a silné osemení (obr. 1 D). Při sklizni mají semena žlutou nebo světle oranžovou barvu, při skladování okrově hnědou (MAZNĚV, 2003).
A
B
C
D
Obr. 1 Schisandra chinensis (Turcz.) Baillon. (A) Květ. (B) Nezralé plody. (C) Zralé plody. (D) Semena.
13
2.1.3. Původ a místa výskytu Schisandra chinensis byla introdukována do evropských botanických zahrad z východního Ruska po roce 1850. Je často pěstována v zahradách Anglie a západní Evropy jako okrasná rostlina. Všechny druhy pochází z východní Asie, kromě druhu Schisandra coccinea, který se vzácně vyskytuje na jihovýchodě USA na Floridě, v Louisianě, v Georgii, v Arkansasu, v Tennessee a v Severní Karolíně (MC KENNA, 2002). KIM a kol. (2005) uvádějí, že rod Schisandra zahrnuje 25 druhů ve východní a jihovýchodní Asii a jeden v severní Americe. Schisandra chinensis, druh nejvíce komerčně užívaný, se vyvinul v Severní Číně a má červené až fialovočervené plody (MC KENNA, 2002). V Rusku se S. chinensis vyskytuje v Přímořském kraji, na jihu Chabarovského kraje a v Amurské oblasti, vzácněji na Jižním Sachalinu a Kurylských ostrovech. Roste podél horských cedrovo-listnatých lesů, v údolích podél lesů a vodních toků, na dobře drenážovaných půdách, bohatých na organické látky. Rozsáhlé porosty vytváří na místech po požárech, na vykácených a holých místech, ve výšce 200-700 m.n.m. Porosty průmyslového významu se nacházejí na západních výběžcích Sichote-Alinu, v údolí středního toku Amuru v Přímořském kraji. Celková plocha výskytu S. chinensis v Rusku představuje přes 4000 ha (MAZNĚV, 2003).
2.1.4. Pěstování Klanopraška je náročná na vlhkost, ale nesnáší zamokření ve spodních vrstvách půdy. Pěstuje se v lehké, výživné, kyselé a vlhké, dobře odvodňované půdě, nevhodné jsou půdy těžké, málo propustné (KAMÍR, 1991; PAUKRTOVÁ, REK, 1996; HEJDUK, 2005). Rozmnožuje se převážně vegetativně, oddenky a řízky. Lze ji množit i semeny, která se vysévají před nástupem zimy nebo na jaře po stratifikaci (MAZNĚV, 2003). Semena se dva měsíce před výsevem uloží do vlhkého hrubozrnného písku o teplotě do 15 °C. Před výsadbou je třeba zajistit opěrnou konstrukci (HEJDUK, 2005). V severních oblastech se klanopraška v pozdním podzimu sundává z podpěr, pokládá na zem a přihrnuje vrstvou suchého listí, na jaře se liány znovu připevňují (MAZNĚV, 2003). Tato rostlina snáší mrazy do -35 °C bez jakéhokoliv krytu, pouze mladé rostliny je dobré na zimu zakrýt. Plodí ve stáří tří až čtyř let (PAUKRTOVÁ, REK, 1996). Plody se sklízí v období plné zralosti (září-říjen), do nástupu prvních mrazíků. Z jedné rostliny se sklidí 4 až 5 kg plodů. Trhají
14
nebo stříhají se celé „hrozny“, čistí se od příměsí a po dobu 2-3 dnů vysouší pod přístřeškem. Poté se plody oddělí od květního lůžka a suší v sušičkách při teplotě do 60 °C nebo se z nich připravuje šťáva. Sběr se musí provádět opatrně, protože poškozené liány obvykle přestanou rodit. Semena se získávají po vymačkání šťávy a odstranění dužiny, propírají se a vysouší. Sběr listů pro získání flavonoidů se provádí ve fázi pučení, pro získání slizu v období padání listů. Borka se sbírá v době tvorby plodů (MAZNĚV, 2003). S. chinensis může být pěstována i za středoevropských klimatických podmínek, fenologické faktory však negativně ovlivňují podíl samičích květů na rostlině a četnost vytvářejících se souplodí. Během některých let dochází i ke snížení plodnosti rostlin (VLAŠÍNOVÁ a kol., 2004).
2.1.5. Chemické složení rostliny Hlavními aktivními látkami obsaženými v klanoprašce jsou lignany (MC KENNA, 2002). O problematice lignanů bude pojednáno dále v textu. Plody obsahují velké množství organických kyselin. Kyselinu citrónovou (10,94-11,36 %), jablečnou (7,6-8,4 %), vinnou (0,8 %), fumarovou a tartarovou. V dužině plodů jsou obsaženy cukry (do 1,5 %), taniny a barviva (0,15 %) (MAZNĚV, 2003; MC KENNA, 2002). Olej získaný lisováním semen je směsí mastných kyselin (do 33,8 %) a éterického oleje. Mastné kyseliny, linolová (55,9-59,8 %), olejová (28,5-34,1 %) a další kyseliny, mají podobu vazké, zlatožluté tekutiny. Ve všech orgánech rostliny je obsažen éterický olej, čirá, zlatožlutá tekutina citrónové vůně. Jeho obsah v borce je 2,6-3,21 %, v semenech 1,6-1,9 % a ve stonku 0,2-0,7 %. Éterický olej obsahuje seskviterpeny (do 30 %), aldehydy a ketony (přibližně 20 %) (MAZNĚV, 2003). MC KENNA (2002) uvádí, že obsah oleje v celém plodu je 38 % a v semeni od 30 % do 33 %. Listy obsahují makroelementy [mg/g] - K (19,2), Ca (0,7), Mg (1,7), Fe (0,06) a mikroelementy [µg/g] - Zn (0,13), Cr (0,01), Al (0,02), Ba (31,05), Se (33,3), Ni (0,33), Pb (0,03), I (0,09), B (0,9) a mohou hromadit Se, B, Mo, Ni, Mn, Cu (MAZNĚV, 2003). Rostlina dále obsahuje vitamíny C a E, terpeny, alkaloidy a další látky (MC KENNA, 2002). GARANOVICH (2004) uvádí biochemické složení plodu a listu S. chinensis v syrovém stavu (tab. 1).
15
Tab. 1 Biochemické složení plodu a listu S. chinensis v syrovém stavu (GARANOVICH, 2004, upraveno).
Látka
Plod
List
Prvek
Plod
List
volné organické kyseliny
24,50
50,90
N
1,70
1,48
mastné kyseliny
17,46
4,14
P
0,25
0,40
3,30
30,20
K
2,36
2,73
kyselina askorbová
552,10
331,80
Ca
0,43
1,40
mg% fenol-karboxylové kyseliny
422,50
872,50
Mg
0,09
0,73
15,60
59,70
S
0,08
0,26
%
karotenoidy
antokyany flavonoidy
%
%
1479,00 3907,40
glukóza
2,26
1,28
Fe
122,00
113,00
fruktóza
1,62
0,85
Mn
36,50
20,00
sacharóza
6,80
0,76
Zn
17,50
10,00
pektiny
2,23
5,50
Cu
3,50
12,00
škrob
5,62
1,27
taniny
2,10
6,40
mg/kg
2.1.6. Použití 2.1.6.1.
Historie užívání
Schisandra byla poprvé citována ve Shen Nong Ben Cao Jing (Božský léčebný materiál), což je kniha napsaná před více než čtyřmi tisíci lety. Je zde popsána významnost plodů pro jejich prospěšnost při léčbě kašle, vyhublosti a malátnosti, při poruchách hybnosti a k posílení organismu. V osmnáctém století byla Schisandra v Číně používána k léčbě impotence (MC KENNA, 2002).
2.1.6.2.
Použití v lékařství, farmakologické vlastnosti a účinky
Jako kvalitní léčivé suroviny se využívají plody, semena, listy, kořeny a borka. Schisandra se používá ve formě extraktu z usušených listů, odvaru, šťávy, kořalky z plodů a prášku ze semen (MAZNĚV, 2003).
16
Přípravky z klanoprašky zesilují podráždění v mozkové kůře, zvyšují reflexní aktivitu, stimulují a tonizují centrální nervový systém, srdečně-cévní systém, povzbuzují dýchací systém, zesilují ostrost zraku, snižují obsah cukru v krvi, rozšiřují periferní cévy a zesilují kontrakce dělohy. Užívají se při astenických a astenodepresivních stavech, při duševních a nervových potížích. Jako posilující prostředek působí při léčbě pacientů s pneumonií, s cévní nedostatečností, s nízkým krevním tlakem a dále při špatně se hojících ranách a trofických vředech. U zdravých lidí předchází užití S. chinensis při fyzické námaze pocitu únavy. Účinek je podmíněn přítomností schizandrinu, který zvyšuje reflexní dráždivost míchy, stimuluje činnost srdce a dýchání (MAZNĚV, 2003). DUKE (2002) uvádí, že S. chinensis je pro své účinky indikována v případech, jako jsou například infekční stavy, bakteriální, virová a nádorová onemocnění, rakovina, křeče, kašel, astma, alergie, únava, slabost, vyčerpání, stres, nervozita, úzkost, nespavost, amnézie, psychóza, senilní demence, deprese, Parkinsonova choroba, neurastenie, neuropatie, dermatóza, diabetes mellitus, průjem, dyspnoe, enuréza, Meniérův syndrom, ataxie, dystrofie, tuberkulóza, škrkavka, hepatitida, kapavka, impotence, svědění, ischémie, infarkt, palpitace, nekróza, nefróza, noční pocení, ochrnutí, polakisurie a polyurie. Používá se při snížené imunitě, dále při porodu, ve stáří a jako podpůrný lék při chemoterapii. Má antimutagenní a antioxidační účinek. Z hlediska lékových skupin se označuje S. chinensis
jako
antacidum,
antikonvulzivum,
antidepresivum,
antiflogistikum,
antineurotikum, anorektikum, antiseptikum, antitusikum, afrodiziakum, kardiotonikum, cerebrotonikum, choleretikum, sedativum, tonikum, CNS stimulancium, digestivum, expektorancium,
hepatoprotektivum,
imunodepresivum,
imunostimulancium,
myorelaxancium, nefrotonikum, neuroleptikum, uterotonikum a vazodilatancium. Podle MAZNĚVA (2003) nemají preparáty vedlejší účinky. DUKE (2002) však uvádí, že se vzácně vyskytuje potlačení chuti k jídlu, dyspepsie a svědění. Schisandra je kontraindikována v těhotenství, kromě usnadnění porodu. Jako prevence poruch spánku se nedoporučuje požívat přípravky z klanoprašky ve večerních hodinách, dále se nedoporučuje při vysokém krevním tlaku a epilepsii (DUKE, 2002; MAZNĚV, 2003; PAUKRTOVÁ, REK, 1996).
2.1.6.3.
Další využití
Éterické oleje se využívají v parfumerii a mýdlařství. Šťáva a plody se využívají při výrobě cukrovinek, džemů, ovocných rosolů a sirupů (MAZNĚV, 2003).
17
2.2. Sekundární metabolity 2.2.1. Úvod Sekundární metabolity se tvoří biosyntézou, přeměnami a odbouráváním z meziproduktů primárního metabolismu. Jejich důležitým stavebním materiálem jsou kódované aminokyseliny nebo jejich prekurzory (např. šikimát), acetyl- a sukcinylkoenzym A a koenzymem A aktivované další karboxylové kyseliny, izopentenyldifosfát, sacharidy. Sekundární metabolity většinou v rostlinách zůstávají a skladují se v buněčných kompartmentech, buněčných stěnách nebo ve specializovaných buňkách k tomu určených. Zadržování sekundárních metabolitů v rostlinných organismech umožňuje jejich další přeměny a tím vznik nových látek (ZEHNÁLEK, 2003). Rostlinné sekundární metabolity mají během životního cyklu rostlin řadu funkcí. Jsou mediátory v interakci mezi rostlinou a prostředím, jako je například interakce mezi rostlinou a hmyzem, rostlinou a mikroorganismy a mezi rostlinami navzájem. Produkce sekundárních metabolitů je součástí obranného systému rostlin. Sekundární metabolismus hraje také roli při rozmnožování rostlin, jedná se například o lákání opylovačů a o samčí fertilitu. Rostlinné pigmenty jsou významné v diverzitě okrasných rostlin a květin. (VERPOORTE, MEMELINK, 2002). Mnohé sekundární metabolity jsou důležité pro život organismu (např. rostlinné hormony), jiné fungují jako atraktanty, odpuzující látky, toxické obranné nebo útočné látky, kofaktory enzymů, stavební materiál buněčných stěn, ochrana před světlem, skladovací formy dusíku a uhlíku, některé hrají úlohu při fotosyntéze nebo transportu iontů atd. (ZEHNÁLEK, 2003). Sekundární metabolity určují důležité aspekty kvality lidské stravy (chuť, barva, aroma). Kromě toho se některé rostlinné sekundární metabolity používají k výrobě léčiv, barviv, insekticidů a aromatických látek. Je tedy zřejmé, že sekundární metabolismus je zajímavý i z hlediska šlechtění rostlin. Molekulární šlechtění je, pomocí genetického inženýrství, z tohoto hlediska nadějnou cestou. I když v posledních deseti letech byly v této oblasti prováděny výzkumy, je jen velmi málo dostupných genů souvisejících se sekundárním metabolismem. Nejlépe prostudovanou dráhou na genetické úrovni je dráha vedoucí k syntéze flavonoidů a antokyanů (VERPOORTE, MEMELINK, 2002).
18
2.2.2. Fenolické látky Fenolické látky představují velmi rozsáhlou a různorodou skupinu sekundárních metabolitů. Patří do ní látky od jednoduchých derivátů benzenu, kyseliny benzoové a skořicové, přes flavonoidy, antokyany a kumariny až po látky složité, jako jsou třísloviny či lignin. Vyskytují se často ve značných koncentracích, většinou jsou uloženy ve vakuolách. Syntéza fenolických látek vychází z fenylalaninu, který je za katalýzy enzymem fenylalaninamoniaklyázou přeměněn na kyselinu skořicovou, do jejíž molekuly jsou pak zaváděny hydroxylové a metoxylové skupiny. Tyto látky mohou být polymerizovány na lignin, ale mohou z nich vznikat i kumariny, flavonoidy apod. (PROCHÁZKA a kol., 1998).
2.2.3. Lignany Lignany jsou poměrně rozsáhlou skupinou sekundárních metabolitů cévnatých rostlin se zajímavými fyziologickými účinky (SLANINA, 2000) a prokazují širokou škálu biologických aktivit (FUSS, 2003). Skládají se ze dvou fenylpropanových jednotek, které jsou spojeny přes centrální (β) uhlíky obou postranních řetězců. Název lignany byl odvozen z toho, že tyto sloučeniny byly původně považovány za meziprodukty při biosyntéze ligninu (C6-C3)n, polymeru rovněž složeného z fenylpropanových jednotek jako lignany (C6-C3)2. Dnes je zřejmé, že vzhledem ke struktuře ligninu a lignanů pouze některé z nich mohou sloužit k tomuto účelu. Navíc, lignin je na rozdíl od naprosté většiny lignanů opticky inaktivní. Biosyntéza lignanů začíná oxidační dimerizací koniferylalkoholu za vzniku chirálních produktů, lignanů. V rostlinách se vyskytují sloučeniny, které mají podobné strukturní znaky jako lignany. Jsou to především neolignany, ve kterých jsou dvě fenylpropanové jednotky spojeny jinou vazbou, než je vazba přes centrální (β) uhlíky alifatických
řetězců.
kumarinolignany
a
Existují také hybridní lignan-iridoidy,
v nichž
lignany jako jsou jedna
část
flavanolignany,
molekuly
je
tvořena
fenylpropanovou jednotkou a druhá část jinou přírodní látkou. Mohou se v rostlinách vyskytovat ve formě glykosidů, většinou jsou však přítomny ve formě aglykonů (SLANINA, 2000). Lignany jsou přítomny u velké řady rostlinných čeledí od mechorostů po rostliny krytosemenné (FUSS, 2003). V současnosti je známo více jak 200 lignanů nacházejících se ve více než 70 čeledích rostlin, hojně se vyskytují u rostlin nahosemenných a dvouděložných. Jsou hlavními sekundárními metabolity čeledi Podophyllaceae a čeledi
19
Schisandraceae, která je vývojově nejstarší čeledí dvouděložných rostlin. Lignany byly nalezeny ve všech částech rostlin, typická je jejich přítomnost ve dřevě a borce stromů a v pryskyřicích. U některých druhů byl jejich nejvyšší obsah nalezen v semenech. O fyziologické funkci lignanů v rostlinách je toho známo málo. Protože vykazují antimikrobiální, antivirové, antioxidační a antimitotické vlastnosti, předpokládá se, že zvyšují rezistenci rostlin k různým patogenům. Nepolární charakter lignanů umožňuje jejich snadnou prostupnost buněčnými membránami a schopnost ovlivnit v buňkách řadu biologických dějů (SLANINA, 2000).
2.2.3.1.
Protinádorová aktivita
Výrazná protinádorová aktivita byla popsána u řady lignanů. Patří mezi ně tetrahydronaftalenové lignany z oddenků noholistu (Podophyllum peltatum nebo Podophyllum emodi). Nejlépe prostudovaný podophyllotoxin (PTOX) je známým mitotickým jedem. Působí jako inhibitor polymerace tubulinu, zabraňuje tvorbě dělícího vřeténka a zastavuje tak buněčné dělení v metafázi. Také deriváty PTOX působí jako inhibitory polymerace tubulinu. Tyto sloučeniny, které mají jen velmi malou afinitu k tubulinu, inhibují topoisomerázu II. Do klinické praxe byly jako cytostatika zavedeny na konci sedmdesátých a na začátku osmdesátých let dva deriváty, teniposid a etoposid. K hlavním indikacím teniposidu a etoposidu patří malobuněčný karcinom plic a testikulární nádory. Známými mitotickými jedy jsou také dibenzocyklooktadienové laktony ze Steganotaenia araliacea. Nejsilnější antitubulinový a protinádorový účinek z lignanů této rostliny vykazuje steganangin. Také některé další dibenzocyklooktadienové lignany s methylendioxydovou skupinou vykazují protinádorový účinek, přestože se neváží na mikrotubuly. Příkladem je gomisin A ze Schisandra chinensis, který tlumí u krys hepatokarcinogenní působení azobarviv a aflatoxinů, nebo schiarisanrin ze Schisandra arisanensis. Dalším terapeutickým lignanem je kyselina nordihydroguajaretová (NDGA), používaná v prevenci a léčbě premaligních kožních lézí, především aktinické keratózy (SLANINA, 2000).
2.2.3.2.
Antivirová aktivita
Tetrahydronaftalenové lignany jsou účinnými látkami v léčbě kožních výrůstků, které jsou způsobeny papilomaviry. V dermatologii se používá alkoholový extrakt z oddenků Podophyllum peltatum nebo Podophyllum emodi nazývaný podofylin a lignan
20
PTOX v masti nebo v roztoku. Podophyllotoxin, deoxypodophyllotoxin a β-peltatin vykazují aktivitu proti viru spalniček a viru herpes simplex, rhinacanthin E proti viru chřipky typu A. Některé lignany jsou aktivní proti viru HIV. Arctigenin a trachelogenin, izolované
z tropického
popínavého
keře
Ipomoea
cairica,
v submikromolárních
koncentracích inhibují replikaci viru HIV-1 a reverzní transkriptázu. Demethylovaný derivát arctigeninu je účinným inhibitorem HIV integrasy. Replikaci viru HIV-1 a reverzní transkriptázu inhibují také dibenzocyklooktadienové lignany ze Schisandra chinensis, Gomisin J a jeho halogenované deriváty, schisantherin D a gomisin G (SLANINA, 2000).
2.2.3.3.
Kardiovaskulární aktivita
Poměrně velké množství lignanů inhibuje cAMP fosfodiesterázu, tím zvyšuje intracelulární koncentraci cAMP a stimuluje činnost myokardu. Jsou to především dibenzocyklooktadienové a dibenzylbutanové lignany, z nichž nejúčinnější jsou Gomisin N a NDGA. Kadsurenon a futoenon, neolignany z Piper futokadsura a diterpenové gingolidy z Gingo biloba, jsou antagonisty fosfolipidu PAF (z angl. platelet activating factor). Tento fosfolipid je endogenním aktivátorem agregace trombocytů, uplatňuje se při vzniku trombů, hypotenzi, akutním zánětu a anafylaktické reakci. Nejvýraznějším lignanovým blokátorem vápníkových iontů je trachelogenin z Arctium lappa a Tracheolospermum jasminoides. Antihypertenzní aktivitu mají pinoresinol z Eucommia ulmoides a sezamin, lignan sezamového oleje. Sezamin zvyšuje u krys hladinu HDL-cholesterolu a snižuje hladinu aterogenního LDL-cholesterolu (SLANINA, 2000).
2.2.3.4.
Antioxidační aktivita
Antioxidanty potlačují účinky volných kyslíkových radikálů, které se podílejí na velkém množství patologických stavů v lidském organismu. Neolignany honokiol a magnolol z borky rostlin rodu Magnolia inhibují peroxidaci lipidů mitochondriálních a mikrosomálních membrán a hemolýzu erytrocytů vyvolanou oxidačními činidly. NDGA se používá v potravinářství jako antioxidační aditivum. Lignany ze Schisandra chinensis jsou schopny zvýšit hladinu redukovaného glutathionu v buňce a ochránit biologické membrány před lipoperoxidací. Mechanismus účinku není přesně znám, může spočívat také v indukci detoxikačních enzymů a zvýšení proliferace endoplazmatického retikula v hepatocytech (SLANINA, 2000). Vzorce základních lignanů S. chinensis viz obr. 2.
21
2.2.3.5.
Lignany u savců a člověka
Lignany byly identifikovány v séru a moči savců, včetně člověka. Jedná se především o enterolakton a enterodiol, které vznikají jako produkt metabolismu střevní mikroflóry z rostlinných prekurzorů, především z matairesinolu a secoisolariciresinolu, které se nacházejí v semenech rostlin, celozrnném pečivu, vláknině, v některé zelenině a ovoci. Při nízké koncentraci estrogenů působí v organismu jako slabé estrogeny, při vysoké koncentraci estrogenů mohou působit jako antiestrogeny. Enterolakton ve vysoké koncentraci inhibuje růst nádorových buněk kolorektálního karcinomu a rakoviny prsu nezávislé na estrogenech. Přibývá důkazů, že příjem potravin s vysokým obsahem lignanů snižuje riziko vzniku kolorektálního karcinomu, rakoviny prsu u žen a rakoviny prostaty u mužů. Proti nádorovým onemocněním mohou lignany působit preventivně díky antiestrogenní aktivitě, schopnosti inhibovat klíčové enzymy biosyntézy steroidních hormonů (5α-reduktázu a aromatázu) a vyvolat indukci syntézy enzymů, které se podílejí na II. fázi detoxikace xenobiotik (SLANINA, 2000).
2.2.4. Lignany rodu Schisandra Dibenzocyklo[a,c]oktadienové lignany jsou produkovány pouze rostlinami čeledi Schisandraceae a jejich vzorky nejsou běžně komerčně dostupné. Vykazují široké spektrum biologických účinků, které byly popsány v předchozí kapitole, největší pozornost je věnována zejména jejich antioxidační a hepatoprotektivní aktivitě (SLANINA a kol., 2003). Lignany se nacházejí ve všech částech rostliny. Nejvyšší obsah byl zjištěn v semenech (2-4 %), která obsahují až 30 různých lignanů a jejich obsah značně kolísá. Hlavními lignany jsou schizandrin, gomisin A, deoxyschizandrin, gomisin N, gamaschizandrin a wuweizisu C (viz obr. 2). Výzkum obsahových látek S. chinensis probíhá převážně ve východoasijských zemích (SLANINA a kol., 2003; MC KENNA, 2002). Jsou to bezbarvé, obvykle krystalické substance bez zápachu. Mají podobu hranolu nebo hrotu, někdy jsou vylučovány z roztoku jako amorfní prášek. Obsah lignanů v drogách pocházejících z Evropy je nižší než v drogách původem z Číny, které se zdají být nejlepší a hlavní lignany jsou obvykle získávány z plodů odtud dovážených (OPLETAL a kol., 2004). Analýzou vzorků z různých částí rostliny S. chinensis, pocházejících ze Severních Čech, byl zjištěn průměrný obsah lignanů v semenech 2,294 %, ve stoncích 0,480 % a v listech 0,201 % (KŘENKOVÁ cit. OPLETAL a kol., 2004).
22
SLANINA a kol. (2003) uvádějí, že zatímco hlavním lignanem semen je schizandrin, ve vzorcích in vitro kultur byl vždy obsah gomisinu A a deoxyschizandrinu vyšší než obsah schizandrinu. Spektrum lignanů obsažené v kultuře je bližší listům než semenům, množství lignanů produkované kulturou S. chinensis bylo nižší než množství obsažené v listech a semenech. Ve vzorcích kultury byl v nejvyšší koncentraci nalezen lignan deoxyschizandrin (0,013 %), toto množství je asi třikrát menší než v listech (SLANINA a kol., 2002).
H3CO
O O
H3CO H3CO H3CO H3CO
CH3 CH3 OH
H3CO
schizandrin
CH3 CH3 OH
H3CO
H3CO H3CO
CH3 CH3
H3CO
H3CO
gomisin A
O
O
H3CO
H3CO H3CO
O
O
H3CO
H3CO
deoxyschizandrin
H3CO H3CO H3CO
CH3 CH3
CH3
H3CO H3CO
CH3
O
H3CO
gomisin N
Obr. 2 Chemické vzorce hlavních lignanů S. chinensis (SLANINA, 2003).
O
wuweizisu C
23
2.3. Metody produkce sekundárních metabolitů rostlin in vitro 2.3.1. Využití suspenzních buněčných kultur Rostliny kultivované in vitro nabízí z hlediska produkce sekundárních metabolitů několik výhod oproti rostlinám žijícím ve volné přírodě nebo pěstovaným na poli. Metabolity mohou být produkovány za řízených podmínek, nezávisle např. na geografických, klimatických a půdních faktorech. Kultury jsou kultivovány asepticky, jsou prosté mikroorganismů či hmyzu a není proto nutná aplikace herbicidů nebo insekticidů. Suspenzní buněčné kultury se mohou projevit rychlým růstem spojeným s vysokou akumulací požadovaných metabolitů v krátké době. Tato technologie může být účinným prostředkem k produkci komerčně významných rostlinných produktů. Z hlediska produkce lignanů je tedy zajímavá (FUSS, 2003; PUROHIT 2003). SLANINA a kol. (2003) prokázali, že embryogenní kultura S. chinensis je schopna produkovat lignany, jejich obsah byl však v buňkách kultury nízký, přibližně 10krát nižší než v listech a 50krát nižší než v semenech. V tabulce 2 je uvedena akumulace lignanů v rostlinných buněčných a orgánových kulturách různých rostlinných druhů.
24
Tab. 2 Akumulace lignanů v rostlinných buněčných a orgánových kulturách různých rostlinných druhů (DOP-deoxypodophyllotoxin; MATAI-matairesinol;
LARI-lariciresinol;
PINO-pinoresinol;
6MPTOX-6-methoxypodophyllotoxin;
PTOX-podophyllotoxin;
SECO-secoisolariciresinol)
(FUSS, 2003).
Druh Callitris drummondii
Typ kultury kalus, suspenze
Lignany PTOX
Daphne odora
kalus, suspenze
Forsythia x intermedia Forsythia x intermedia Forsythia x intermedia Forsythia spec.
kalus, suspenze kalus, suspenze suspenze kalus, suspenze
Haplophyllum patavinum
kalus
Ipomea cairica Ipomea cairica Jamesoniella autumnalis
kalus kalus gametofyt
Juniperus chinensis Larix leptolepis
kalus kalus
Linum album
suspenze
Linum austriacum
kalus, suspenze, kořen, kořenové vlásky kořen
MATAI, LARI, PINO, SECO, wikstromol epi-PINO MATAI PINO, MATAI MATAI, epi-PINO, phillyrin, arctigenin justicidin B, diphyllin, tuberculatin, arctigenin trachelogenin, arctigenin PINO 8´,8,2´-trikarboxy-5,4-dihydroxy7´(5´)-6´-pyranonyl-7´,8´dihydronaftalen a jeho dva monomethylestery PTOX PINO; 2,3-dihydro-2-(4-hydroxy3-methoxyphenyl)-3-hydroxymethyl5-(ω-hydroxypropyl)-7methoxybenzofuran; LARI, SECO, iso-LARI PTOX, 6MPTOX, DOP, PINO, MATAI, LARI, β-PELT, α-PELT justicidin B, isojusticidin B
Linum flavum Linum flavum Linum flavum Linum flavum Linum mucronatum spp. armenum Linum nodiflorum Picea glehni
suspenze, embryogenní suspenze suspenze, kořenové pletivo kořenové vlásky suspenze z prýtu suspenze suspenze
Podophyllum hexandrum
kalus, suspenze
Podophyllum hexandrum Podophyllum peltatum Podophyllum peltatum
embryogenní kalus kalus embryogenní suspenze
Podophyllum spec. Sesamum indicum
kalus kalus, suspenze, kořenové vlásky
Odkaz Van Uden a kol., 199Oc; Van Uden a Pras, 1993 Okunishi a kol., 2002 Rahman a kol., 1986 Rahman a kol., 1990b Schmitt a Petersen, 2002a, b Dewick, 1994 Puricelli a kol., 2002 Páska a kol., 1998, 1999 Páska a kol., 2002 Tazaki a kol., 1995
Muranaka, 1998 Nabeta a kol., 1991; Nabeta, 1994
Smollny a kol., 1998 Mohagheghzadeh a kol., 2002
6MPTOX (omylem označován jako β- PELT-A methyl ether) 6MPTOX
Berlin a kol., 1986, 1988
6MPTOX, 5´-demethoxy-6-methoxy-PTOX 6MPTOX 6MPTOX, PTOX
Wichers a kol., 1990, 1991
6MPTOX, PTOX, DOP PINO, dihydro-dehydrodikoniferylalkohol PTOX
PTOX PTOX PTOX, DOP, 4´-demethoxypodophyllotoxin, podophyllotoxon PTOX sesamin, sesamolin
Van Uden a kol., 199Ob, d
Oostdam a kol., 1993 Konunklugil a kol., 2001 Konunklugil a kol., 1999 Nabeta a kol., 1994 Van Uden a kol., 1989, 1990a; Giri and Narasu, 2000, 2001; Chattopadhyay a kol., 2001 Sharma a kol., 2000 Kadkade, 1982; Fujii, 1991 Kutney a kol., 1991, 1993 Fujji, 1991 Khanna a Jain, 1973; Mimura a kol., 1987; Ogasawara a kol., 1998
25
2.3.2. Metody zvýšení produkce sekundárních metabolitů 2.3.2.1.
Varianty kultivačních podmínek a složení živného média
Zisk produktů explantátových kultur může být zvýšen optimalizací procesů v kulturách. Toho lze dosáhnout výběrem vysokoprodukčních buněčných linií, optimalizací složení a pH živného média, působením stresu (snížení koncentrace živin v médiu, vynechání růstového regulátoru) či změnou jiných kultivačních parametrů, například světelných podmínek a teploty (FUSS, 2003; HRADILÍK 2005). FUSS (2003) sledovala vliv světelných podmínek na produkci PTOX u Linum album a zjistila, že světlo nemá přímý vliv na jeho produkci. Uvádí, že dvě buněčné linie kultivované ve tmě akumulovaly přibližně desetkrát více PTOX než na světle, jedna linie neakumulovala ve tmě skoro žádný PTOX a na světle jen jeho nepatrné množství a další linie neprokazovaly rozdíl v jeho akumulaci při růstu na světle či ve tmě.
2.3.2.2.
Přidání prekurzorů příslušných produktů do živného média
Hlavním cílem použití biosyntetických intermediátorů je získání velkého množství požadovaných sloučenin. Mezi komerčně dostupné prekurzory, které biosyntézu podporují, patří například L-fenylalanin či koniferylalkohol (FUSS, 2003).
2.3.2.3.
Elicitace
V souvislosti s akumulací produktů v suspenzních buněčných kulturách mohou abiotické nebo biotické elicitory působit jako mediátory při jejich syntéze nebo jako stresové faktory. Mezi abiotické elicitory se řadí UV záření, alkalita, osmotický tlak či ionty těžkých kovů (PUROHIT, 2003). Jedním z biotických elicitorů je methyljasmonát, který v pokusech s buněčnými suspenzemi Linum album po přidání do kultivačního média u jedné buněčné linie desetinásobně zvýšil obsah PTOX (FUSS, 2003). Elicitory polyetylenglykol a methyljasmonát působí stimulačně na produkci lignanů v suspenzní kultuře S. chinensis. Po přidání polyetylenglykolu do kultivačního média došlo ke zvýšení obsahu schizandrinu a gomisinu N, přídavkem methyljasmonátu k navýšení zejména deoxyschizandrinu a wuweizisu C (VLAŠÍNOVÁ a kol., 2004). Pro zvýšení produkce plumbaginu u Plumbago rosea KOMARAIAH a kol. (2003) imobilizovali buněčnou kulturu v alginátu vápenatém, jako elicitor použili chitosan (200 mg/l) a k in situ odstranění plumbaginu amberlit XAD-7. Polyamin putrescin přidaný do kultivačního média
26
v koncentraci 250 mg/l zvýšil obsah gomisinu N v kultuře S. chinensis přibližně 3,8krát a v koncentraci 500 mg/l přibližně desetkrát (VLAŠÍNOVÁ a kol., 2004).
2.3.2.4.
Využití sorbentů sekundárních metabolitů
Produkované sekundární metabolity se hromadí v cytoplazmě či ve vakuolách. Aby nedošlo k zastavení jejich produkce, je nutné odčerpávat je bez narušení metabolické aktivity buňky. K adsorpci sekundárních metabolitů jsou používány hydrofobní materiály, například polymerní pryskyřice (VLAŠÍNOVÁ a kol., 2004; KOMARAIAH a kol., 2003). VLAŠÍNOVÁ a kol. (2004) použili dvě polymerní pryskyřice, amberlit XAD-2 (nepolární polystyrenová pryskyřice) a amberlit XAD-7 (středně polární polyakrylátová pryskyřice, méně hydrofobní než XAD-2) a tři buněčné linie, pocházející ze zygotických embryí S. chinensis (LA 58, LA 4, LAT 52). V kulturách buněk pěstovaných bez přítomnosti amberlitu byly lignany lokalizovány převážně intracelulárně (71-98 %) a kultivační média obsahovala jen velmi malé, ale analyzovatelné množství lignanů. Obě pryskyřice byly schopny převést lignany z buněk do kultivačního média a vázat je na svůj povrch, výrazně zvýšily produkci lignanů kulturami a vedly k účinné extrakci lignanů z tekutého média adsorpcí. Přídavek amberlitu XAD-2 do kultivačního média výrazně zvýšil podíl extracelulárních lignanů, amberlit XAD-7 nebyl tak účinný ve zvýšení podílu extracelulárních lignanů. Byla pozorována určitá selektivita v účinku obou pryskyřic. Zatímco
amberlit
XAD-2
zvyšoval
především
produkci
deoxyschizandrinu
a deoxyschizandrin tvořil 86-94 % lignanů vázaných na amberlit XAD-2, amberlit XAD-7 zvyšoval převážně produkci wuweizisu C, který tvořil 55-79 % všech lignanů vázaných na sorbent. Gomisin N zůstává lokalizován i v přítomnosti obou amberlitů intracelulárně. Účinnější pryskyřicí ve zvýšení produkce lignanů byl amberlit XAD-2, protože je to polystyrenová pryskyřice, více hydrofobní (nepolární) než XAD-7 a dá se předpokládat, že má vyšší afinitu k nepolárním lignanům než XAD-7 (VLAŠÍNOVÁ a kol., 2004).
27
2.3.3. Způsoby kultivace buněčných kultur 2.3.3.1.
Pohybující se médium
Ke kultivaci buněčných suspenzí se používají sterilní tekutá živná média, která se pohybují. Pohybující se médium je současně provzdušňováno a je zajištěn snadný přístup živin k buňkám, čímž je umožněn rychlý růst buněčné suspenze. Stálý pohyb živného média napomáhá rozpadu buněčných shluků. K zajištění pohybu tekutého média je používán pro vertikální rotaci roller, otáčející se rychlostí 1-10 otáček za minutu nebo třepačka, na které dochází k horizontálnímu protřepání média při rychlosti 30-130 otáček za minutu a amplitudě výkyvu 2-5 cm. Doporučený objem kultivačního média v baňkách pro buněčné suspenze je asi jedna pětina celkového objemu baňky. Pro kontinuální kultivaci buněčných suspenzí jsou používány bioreaktory s automatickou kontrolou hustoty suspenze, obsahu živin a kyslíku a se stálou regulací pH. V těchto zařízeních je pohyb kultivačního média zajišťován míchadlem nebo probubláváním sterilního vzduchu. Pro rostlinné buňky jsou nejčastěji používány bioreaktory o objemu 5-10 litrů (HRADILÍK, 2005).
2.3.3.2.
Stacionární kultura
Buněčné kultury je možno kultivovat i v tekutém médiu, které se nepohybuje. Metoda spočívá v kultivaci kultur na raftech, které jsou umístěny v kultivačních nádobách Magenta s obsahem tekutého kultivačního média. Při této kultivaci je kultura oddělena od kultivačního média membránou, což umožňuje snadnou manipulaci s kulturou i výměnu média a zároveň jednoduchou aplikaci substancí, adsorbujících na svém povrchu organické molekuly lignanů (VLAŠÍNOVÁ a kol., 2004).
28
2.4. Somatická embryogeneze V normálních podmínkách představuje embryogeneze proces, při kterém postupnými strukturálními změnami vzniká z jedné buňky zárodek. Embryo se nemusí vyvíjet vždy jen ze zygoty, může vznikat apomikticky z buněk gametofytu nebo z buněk somatických. V přirozených podmínkách se u krytosemenných rostlin jedná o diploidní somatické buňky pletiv vajíčka, tedy nucellu nebo integumentů a u některých druhů rostlin o buňky listů. Základem somatických embryí v semeni nemusí být jenom diploidní pletiva vajíčka, mohou vznikat i z buněk zygotického embrya v raných stádiích vývoje po jeho poškození chemickým nebo fyzikálním působením. Menší poškození vede ke vzniku četných děloh, při větším poškození dochází k rozštěpení původního embrya a vzniku nejčastěji dvou embryí na bázi srostlých (PROCHÁZKA a kol., 1998). Somatická embryogeneze může být přímá nebo nepřímá. Případů, kdy se somatická embrya vyvíjejí přímo na diferencovaných pletivech bez tvorby kalusu, je podstatně méně. Patří sem například vznik somatických embryí z buněk nucellu nebo pokožky. Může nastat i situace, kdy není od počátku vytvářena přísně organizovaná struktura, ale z původní buňky vzniká dělením nejprve tzv. proembryonální komplex a teprve na něm začíná organizovaný vývoj. Při těchto způsobech embryogeneze nevznikají chiméry, které se často tvoří při organogenezi (PROCHÁZKA a kol., 1998). Embryogenní kalus se většinou odvozuje z juvenilních pletiv, jako např. z endospermu, pletiv zygotických embryí, květních primordií, prašníků, pylových zrn nebo z částí klíčních rostlin (HRADILÍK, 2005). Průběh somatické embryogeneze lze rozdělit do několika fází: indukce, vývoj somatických embryí, jejich zrání a „klíčení“. Při indukci nabývá somatická buňka stejných vlastností, jako má zygota a stádia vývoje somatických embryí jsou v podstatě stejná jako u zygotické embryogeneze příslušné systematické skupiny. Pro indukci embryogenních buněk je na počátku kultivace nutná přítomnost látek auxinové povahy v kultivačním médiu, především 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny (2,4-D). Využívají se i značně vysoké koncentrace auxinu v kultivačním médiu, ale pouze po omezenou dobu (tzv. pulzní působení) a po jejím snížení dochází k průběhu vlastní embryogeneze, kdy je nutná přítomnost cytokininů. Pro další vývoj somatických embryí je vyžadována přítomnost dusíku v kultivačním médiu v redukované formě (dusičnan amonný) a ve formě aminokyselin, dodávaných velmi často v nedefinovaných směsích (hydrolyzát kaseinu, kokosové mléko). V pokročilejších vývojových stádiích působí příznivě přítomnost
29
kyseliny abscisové (ABA) v kultivačním médiu, která zabraňuje předčasnému „klíčení“ nevyvinutých zárodků a tím vývoji aberantních rostlin (PROCHÁZKA a kol., 1998; HRADILÍK 2005). Značný vliv na pravidelný vývoj somatických embryí má osmotická hodnota kultivačního média, zajišťovaná sacharózou, manitolem nebo sorbitolem. Její růst v určitých
stádiích
kultivace
zvyšuje
počty
pravidelně
vyvinutých
zárodků
(PROCHÁZKA a kol., 1998). Vlastní somatický zárodek může vykazovat určité odchylky od zárodku normálního, jako je zvýšení počtu děloh, změna jejich morfologie, odchylky od normálních poměrů velikostí plumuly a radikuly nebo neúplný vývoj až vymizení jejich některých částí. Veškeré anomálie vznikající v raných stádiích vývoje somatického embrya jsou důsledkem déletrvajícího dělení než za normálních podmínek, předčasné vakuolizace, pokračování buněčného dělení i u zvětšených buněk, změn orientace dělícího vřeténka, předčasné diferenciace buněk a opožděného zakládání děloh a apexu stonku. Tyto nepravidelnosti jsou zřejmě způsobeny neoptimálními kultivačními podmínkami (PROCHÁZKA a kol., 1998). Proces somatické embryogeneze představuje do budoucna ve spojení se suspenzní kulturou velmi perspektivní a efektivní metodu vegetativního množení rostlin, zejména při vybudování bioreaktorů pro kontinuální kultivaci somatických embryí. Například z jednoho gramu buněčné suspenze mrkve je možné získat až tisíc somatických embryí (HRADILÍK, 2005).
30
2.5. Somatická embryogeneze u Schisandra chinensis Somatická embryogeneze je poměrně účinnou metodou mikropropagace, napomáhá uchování genofondu a je ideální metodou pro produkci umělých semen (KIM a kol., 2005). Pomocí somatické embryogeneze by bylo možné překonat problémy s nízkou klíčivostí a potřebu stratifikace semen, in vitro kultury by mohly být používány k biochemickým, fyziologickým, molekulárním a transformačním studiím, anebo pro množení rostlin a biotechnologie (SMÍŠKOVÁ a kol., 2005). K dosažení dostatečného množství kvalitních somatických embryí byla vyvinuta vícekroková metoda regenerace. I když jsou zygotická embrya S. chinensis v čerstvém semeni nediferencovaná a velmi malá, je možné založit z nich embryogenní kulturu. Semena z nezralých plodů byla povrchově sterilizována, zbavena osemení, podélně rozříznuta a umístěna na médium Murashige a Skoog (MS) s obsahem 5,0 nM thidiazuronu (TDZ). Předošetření semen velmi nízkou koncentrací TDZ (0, 005 µM) způsobilo zvětšení zygotických embryí a jejich vývoj do raného srdčitého stádia během jednoho týdne, bez formování kalusu na jiných částech semena (obr. 3A). Po jednom týdnu byla zygotická embrya v raném srdčitém stádiu vyříznuta a kultivována na iniciačním médiu Westvaco (WV5; Duchefa) s 50 µM 2,4-D. Během následujících tří týdnů se z dvaceti procent zygotických embryí vyvinuly různé typy kalusů, které byly kultivovány odděleně (obr. 3B). Embryogenní kalusy byly převedeny na médium WV5 s 10 µM 2,4-D a 4 µM benzylamonopurinem (BAP) a subkultivovány ve čtyřtýdenních intervalech přibližně po dobu jednoho roku (SMÍŠKOVÁ a kol., 2005). Pro dosažení zrání somatických embryí byly embryogenní kalusy přeneseny na prematurační médium s obsahem 3% osmotického regulátoru polyethylenglykolu 4000 (PEG) a ABA o různých koncentracích a kultivovány 49 dní. Nejvyšší frekvence vývoje globulárních somatických embryí bylo dosaženo na kultivačním médiu s 30 µM ABA (obr. 3C). Následně byla somatická embrya umístěna na filtrační papír s aktivním černým uhlím, kultivace probíhala na maturačním médiu bez růstových regulátorů po dva týdny a došlo k vývoji torpédovitých a raně kotyledonálních somatických embryí (obr. 3D). Kultury ve fázi předpůsobení, v iniciační, udržovací a maturační fázi rostly ve tmě a při teplotě 23 ± 2 °C. Další vývoj kotyledonálních somatických embryí probíhal při rozptýleném světle a fotoperiodě 16/8 po dobu tří týdnů na médiu s 0,05 µM kyselinou indolyl-3-máselnou,
31
která přispěla k rapidní přeměně v rostlinky (obr. 3E). Rostliny byly převedeny do podmínek ex vitro. Přežilo 40 % rostlin (obr. 3F). Metoda analýzy hlavních lignanů ve vyvinuté kultuře S. chinensis by mohla sloužit jako nástroj pro další selekci vhodnějších genotypů, anebo k biologické produkci lignanů
(SMÍŠKOVÁ a kol., 2005). Jinou metodu regenerace S. chinensis pomocí somatické embryogeneze popisují KIM a kol. (2005) (obr. 4 a 5). Ze zralých semen byla po povrchové sterilizaci a dezinfekci izolována zygotická embrya a umístěna na médium Merkle a Sommer's o různých koncentracích auxinu (2,4-D) a cytokininu (BAP a zeatin). Pro indukci embryogenního kalusu byly kultury kultivovány při teplotě přibližně 25 °C ve tmě, po dobu osmi týdnů. Různé koncentrace růstových regulátorů byly testovány individuálně a v kombinacích. Reakce zygotických embryí a indukce kalusu byla různá, 2,4-D (9,04 µM) v kombinaci se zeatinem (9,09 µM) prokázala maximální indukci embryogenního kalusu, následně pak 2,4-D (9,04 µM) v kombinaci s BA (0,44 µM). Zygotická embrya nereagovala na kultivační médium bez rostlinných růstových regulátorů. Další kultivace probíhala při fotoperiodě 16/8. Embryogenní kalus byl přenesen na médium MS bez rostlinných růstových regulátorů, kde probíhal po dobu dvou týdnů vývoj proembryogenní masy. Později se postupně vyvíjela globulární, srdčitá, torpédovitá a kotyledonální stádia somatických embryí přibližně v sedmidenních intervalech. Embryogenní kalus, indukovaný na médiu Merkle a Sommer's s přídavkem 2,4-D (9,04 µM) a zeatinu (9,09 µM), prokázal po přenesení na médium MS bez růstových regulátorů vývoj největšího množství somatických embryí. Z embryogenního kalusu indukovaného na kultivačním médiu s obsahem 2,4-D (9,04 µM) se vyvíjela pouze globulární somatická embrya, k vývoji dalších stádií nedošlo. To dokazuje, že přítomnost cytokininu je nezbytná v průběhu indukce somatické embryogeneze u S. chinensis. K největšímu zrání a „klíčení“ kotyledonálních somatických embryí (46,3%) došlo na médiu Murashige a Skoog s obsahem 2,4-D (0,45 µM) a BAP (1,11 µM). Úspěšnost přežití rostlin odvozených ze somatických embryí byla přibližně 67% (KIM a kol., 2005).
32
Obr. 3 Somatická embryogeneze ze zygotických embryí S. chinensis I. (A) Nezralé zygotické embryo S. chinensis po jednotýdenním předošetření 0, 005 µM TDZ (úsečka = 0,1 cm), obrázek byl obarven pro lepší viditelnost apexu. (B) Aktivně rostoucí embryogenní kalus na udržovacím médiu (úsečka = 1 cm). (C) Somatická embrya v globulárních a srdčitých stádiích vývoje po sedmitýdenní kultivaci na prematuračním médiu s 30 µM ABA (úsečka = 1 cm). (D) Somatická embrya v torpédovitých a raně kotyledonálních stádiích vývoje po dvou týdnech kultivace na filtračním papíru s aktivním černým uhlím na maturačním médiu bez růstových regulátorů (úsečka = 1 cm). (E) Rostlinky po třítýdenní kultivaci na převáděcím médiu (úsečka = 1,5 cm). (F) Aklimatizované rostlinky v rašelinném substrátu (úsečka = 5 cm) (SMÍŠKOVÁ a kol., 2005).
33
Obr. 4
(A-F) Somatická embryogeneze ze zygotických embryí S. chinensis II (úsečka = 1 cm). (A) Explantáty zygotických embryí. (B) Embryogenní kalus. (C) Globulární embryo (ge). (D) Srdčité embryo (ht). (E) Torpédovité embryo (t). (F) Kotyledonální embryo (ct). (Převzato z KIM a kol., 2004.)
34
Obr. 5 (G-M) Somatická embryogeneze ze zygotických embryí S. chinensis III (úsečka = 1 cm). (G) Somatická embrya v různých stádiích vývoje. (H) Na rostlině je vidět prýt a kořen. (I) Rostlina odvozená ze srdčitého somatického embrya. (J-M) Fotografie pořízené pomocí rastrovacího elektronového mikroskopu ukazují: (J) proembryogenní hmota (pem); (K) globulární embryo (ge); (L) srdčité embryo (ht); (M) torpédovité embryo (t). (Převzato z KIM a kol., 2004.)
35
3. Cíl práce
provést literární rešerši metod produkce sekundárních metabolitů rostlin in vitro
experimentálně prozkoumat vliv sorbentů sekundárních metabolitů z kultivačního média na kultury in vitro u klanoprašky čínské (Schisandra chinensis)
4. Materiál a metody zpracování 4.1. Rostlinný materiál V pokusu byly použity dvě embryogenní kultury, asepticky odvozené z nezralých zygotických embryí klanoprašky čínské (Schisandra chinensis (Turcz.) Baillon)). Mateřské rostliny, z nichž byly nezralé plody odebrány, pocházejí jednak z Botanické zahrady Centra léčivých rostlin Lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně, jednak ze soukromé zahrady. Buněčná linie LAT 10 byla odvozena pomocí 2,4-D a TDZ v roce 2004, linie LA I pomocí 2,4-D v roce 2003. Kalusy se vyvíjely na médiu MS s přídavkem růstových regulátorů, 10 µM 2,4-D a 4 µM BAP, v Petriho miskách. Zygotická embrya nepocházejí ze stejné rostliny, liší se tedy v genotypu. Poslední pasáž kalusových kultur před založením pokusu byla provedena 7. 6. 2005.
4.2. Chemikálie
Médium Murashige a Skoog (Duchefa) (tab. 3)
L-glutamine (Duchefa)
Sacharóza (Lachema)
2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina (Sigma)
Benzylaminopurin (Sigma)
Amberlite XAD-2 (Supelco)
Amberlite XAD-7 (Sigma)
36
Tab. 3 Médium Murashige a Skoog (Duchefa).
Mikroelementy CoCl2.6H2O
0,025 mg/l
0,110 µM
CuSO4.5H2O
0,025 mg/l
0,100 µM
FeNaEDTA
36,700 mg/l
0,100 mM
H3BO3
6,200 mg/l
0,100 mM
KI
0,830 mg/l
5,000 µM
16,900 mg/l
0,100 mM
Na2MoO4.2H2O
0,250 mg/l
1,030 µM
ZnSO4.7H2O
8,600 mg/l
29,910 µM
CaCl2
332,020 mg/l
2,990 mM
KH2PO4
170,000 mg/l
1,250 mM
KNO3
1900,000 mg/l
18,790 mM
MgSO4
180,540 mg/l
1,500 mM
NH4NO3
1650,000 mg/l
20,610 mM
2,000 mg/l
26,640 µM
100,000 mg/l
0,560 mM
Nicotinic acid
0,500 mg/l
4,060 µM
Pyridoxine HCl
0,500 mg/l
2,430 µM
Thiamine HCl
0,100 mg/l
0,300 µM
MnSO4.H2O
Makroelementy
Vitamíny Glycine myo-Inositol
4405,190 mg/l
37
4.3. Metody zpracování 4.3.1. Varianty experimentu Embryogenní kultury byly udržovány v kultivačních nádobách Magenta (Sigma), jejichž součástí je membrána a raft (obr. 6), s 50 ml tekutého média. Součástí média byl buď adsorbent amberlit XAD-2 (Supelco) nebo amberlit XAD-7 (Sigma). V případě kontroly nebyly adsorbenty použity. Varianta pokusu s embryogenní linií LAT 10 byla provedena ve třech opakováních a s linií LA I ve dvou opakováních.
A
Obr. 6
B A Kultivační
C nádoba Magenta (Sigma). (A) Membrána. (B) Raft. (C) Kultivační nádoba
v kompletním stavu.
4.3.2. Příprava kultivačního média Tekuté kultivační médium MS bylo připraveno 24. 6. 2005. Bylo naváženo 4,4052 g média MS (Duchefa) v práškové formě a 20 g sacharózy a rozpuštěno v 900 ml destilované vody. Dále byly přidány růstové regulátory, 10 µM 2,4-D a 4 µM BAP. Pomocí 1 N kyseliny chlorovodíkové a 1 N hydroxidu sodného bylo pH kultivačního média upraveno na hodnotu 5,8.
38
Kultivační nádoby, obsahující 45 ml připraveného kultivačního média a případně amberlit, byly sterilizovány v autoklávu po dobu 15 minut, při teplotě 130 °C a tlaku 117 kPa. 2 mM L-glutamin byl připraven rozpuštěním 0,292 g L-glutaminu (Duchefa) ve 100 ml destilované vody a sterilizován filtrací v laminárním boxu. K filtraci bylo použito sterilní zařízení s membránovým filtrem o velikosti pórů 0,2 µm. Po zchladnutí tekutého média na teplotu přibližně 50 °C bylo v laminárním boxu sterilní pipetou přidáno 5 ml glutaminu do každé kultivační nádoby. Kultivační nádoby se sterilním kultivačním médiem byly uchovány po dobu pěti dnů v temnu při teplotě 23 °C (± 2 °C) v kultivační místnosti.
4.3.3. Založení kultur Kultury byly založeny 29. 6. 2005. Práce probíhala za aseptických podmínek v laminárním boxu, jehož vnitřní prostor byl před zahájením práce vydezinfikován 70% ethanolem. Aseptické prostředí je zajištěno prouděním sterilního vzduchu v boxu a používáním sterilních nástrojů. Z kultivační nádoby byla pinzetou vyjmuta membrána raftu, umístěna na váhu a její hmotnost byla zaznamenána. Na membránu byly přenášeny kalusy odebrané z Petriho misky. Po navážení embryogenní kultury, jejíž startovací hmotnost byla přibližně 500 mg čerstvé hmotnosti, byla membrána přenesena zpět do kultivační nádoby. Přesná hmotnost kultury byla zaznamenána. Uzávěr kultivační nádoby byl zajištěn pomocí fólie.
4.3.4. Kultivace Stacionární kultivace embryogenních kultur probíhala po dobu 49 dnů v kultivační místnosti za řízených podmínek, při teplotě 23 °C (± 2 °C), při rozptýleném světle a fotoperiodě 16/8.
39
4.3.5. Hodnocení kultur Hodnocení kultur probíhalo opět za aseptických podmínek v laminárním boxu. První hodnocení bylo provedeno po 21 dnech kultivace. Přírůstek čerstvé hmotnosti buněčné kultury byl zjištěn z rozdílu hmotností membrány s kulturou a bez kultury a zaznamenán. Po zvážení kultur pokračovala kultivace za stejných podmínek. Druhé hodnocení a zároveň ukončení experimentu bylo provedeno po 49 dnech kultivace. Po zvážení kultur byly odebrány vzorky kultur, médií a amberlitů k analýze. V den ukončení experimentu byla provedena fotodokumentace embryogenních kultur (obr. 7).
A
B
C
D
E
F
Obr. 7 Embryogenní linie LA I a LAT 10 po 49 dnech kultivace. (A) Linie LA I - kontrola. (B) Linie LA I - XAD-2. (C) Linie LA I - XAD-7. (D) Linie LAT 10 - kontrola. Somatická embrya začínají maturovat. (E) Linie LAT 10 - XAD-2. Výrazná maturace somatických embryí. (F) Linie LAT 10 XAD-7. Maturující somatická embrya.
4.3.6. Analýza vzorků Izolace lignanů ze vzorků a jejich kvalitativní a kvantitativní analýza metodou HPLC a charakterizace pomocí instrumentálních metod byla provedena na Biochemickém ústavu Lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně.
40
5. Výsledky Linie LAT 10 a LA I se lišily rychlostí růstu, linie LA I rostla výrazně pomaleji. Amberlit XAD-2 podporoval růst obou linií. Linie LAT 10 rostla pod jeho vlivem přibližně 1,8krát rychleji oproti kontrole, linie LA I přibližně 2,9krát rychleji oproti kontrole. Amberlit XAD-7 inhiboval růst rychle rostoucí linie LAT 10 oproti kontrole, ale u pomalu rostoucí linie LA I růst podporoval (obr. 8). Počáteční hmotnost všech kultur byla stejná, přibližně 500 mg.
Přírůstek hmotnosti na 1 g počáteční hmotnosti u linie LAT 10
A 14 12
11,8
g/1g
10 8 4,8
6 4
6,6
2,7
2
1,0
0
1,5
0 0
21
49
Počet dnů kultivace kontrola
XAD-2
XAD-7
Přírůstek hmotnosti na 1 g počáteční hmotnosti u linie LA I
B 2,5
2,3
2 g/1g
1,4 1,5 1,3 1
1,1
0,5
0,8
0,5
0
0 0
21
49
Počet dnů kultivace kontrola
XAD-2
XAD-7
Obr. 8 Růstové křivky kultur. (A) Linie LAT 10. (B) Linie LA I. (XAD-2 a XAD-7 jsou dva různé amberlity.)
41
Uváděné výsledky obsahů lignanů [µg] představují jejich absolutní množství naměřená na amberlitech, v médiích a v kulturách v čerstvé hmotnosti. Přídavek amberlitu XAD-2 výrazně zvýšil celkovou produkci lignanů v obou liniích oproti kontrole. Na přítomnost amberlitu XAD-7 reagovala linie LA I pozitivně, linie LAT 10 negativně (obr. 9).
Vliv amberlitů XAD-2 a XAD-7 na celkovou produkci lignanů u linií LAT 10 a LA I
Absolutní obsah lignanů [ug]
110
91,67
100 90 80 70 60 50
56,03 47,76 32,42
40 30
20,37
20
6,65
10 0 kontrola
XAD-2 LAT 10
XAD-7
kontrola
XAD-2
XAD-7
LA I
Obr. 9 Průměrný obsah lignanů [µg] v pokusech s amberlity (kultura + médium + amberlit) a v kontrolních pokusech (kultura + médium). LAT 10 a LA I označení linií, XAD-2 a XAD-7 jsou dva různé amberlity. U linie LAT 10 jsou hodnoty průměrem ze tří opakování, u linie LA I ze dvou opakování.
42
U
linie
LAT
10
výrazně
zvýšil
přídavek
amberlitu
XAD-2
produkci
deoxyschizandrinu a gama-schizandrinu oproti kontrole, která produkovala hlavně gomisin N. U linie LA I byla produkce deoxyschizandrinu a gama-schizandrinu zvýšena vlivem amberlitu XAD-2 i XAD-7 (obr. 10). Obě pryskyřice vázaly na svém povrchu u obou linií převážně deoxyschizandrin. U linie LA I adsorbovaly amberlity jeho větší množství než u linie LAT 10 (obr. 11).
Absolutní obsah lignanů [ug]
A
Vliv amberlitů XAD-2 a XAD-7 na produkci jednotlivých lignanů u linie LAT 10
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
schizandrin gomisin A deoxyschizandrin gama-schizandrin gomisin N w uw eizisu C
kontrola
Absolutní obsah lignanů [ug]
B
XAD-2
XAD-7
Vliv amberlitů XAD-2 a XAD-7 na produkci jednotlivých lignanů u linie LA I
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
schizandrin gomisin A deoxyschizandrin gama-schizandrin gomisin N w uw eizisu C
kontrola
XAD-2
XAD-7
Obr. 10 Průměrný obsah jednotlivých lignanů [µg] v pokusech s amberlity (kultura + médium + amberlit) a v kontrolních pokusech (kultura + médium). (A) Linie LAT 10. (B) Linie LA I. U linie LAT 10 jsou hodnoty průměrem ze tří opakování, u linie LA I ze dvou opakování. XAD-2 a XAD-7 jsou dva různé amberlity.
Absolutní obsah lignanů [ug]
43
A
Produkce jednotlivých lignanů linií LAT 10 40 35 30 25 20 15 10 5 0
kultura médium
kultura amberlit médium
Absolutní obsah lignanů [ug]
kontrola
kultura amberlit médium
XAD-2
XAD-7
schizandrin
0,53
0,66
2,64
1,59
0,16
0,07
2,75
0,16
gomisin A
0,59
0,15
1,31
0,29
0,23
0,04
0,71
0,17
deoxyschizandrin
0,22
0,02
13,74
17,28
0,21
0,20
7,57
0,08
gama-schizandrin
7,93
0,53
36,26
1,48
0,49
4,34
0,74
0,64
gomisin N
36,78
0,23
13,35
1,36
0,44
1,48
0,00
0,50
w uw eizisu C
0,13
0,00
0,81
0,00
0,01
0,17
0,26
0,50
B
Produkce jednotlivých lignanů linií LA I 40 35 30 25 20 15 10 5 0
kultura médium
kultura amberlit médium
kontrola
kultura amberlit médium
XAD-2
XAD-7
schizandrin
0,05
0,04
0,05
1,25
0,09
0,04
2,45
0,10
gomisin A
0,03
0,08
0,08
0,69
0,13
0,07
0,24
0,10
deoxyschizandrin
0,14
0,23
0,52
30,60
0,09
0,09
20,85
0,16
gama-schizandrin
2,91
0,86
8,70
4,77
0,24
5,50
1,03
0,23
gomisin N
0,87
0,61
7,15
1,38
0,22
1,26
0,00
0,17
w uw eizisu C
0,78
0,05
0,04
0,00
0,03
0,00
0,00
0,12
Obr. 11 Průměrný obsah jednotlivých lignanů [µg] v kulturách, médiích a na amberlitech. (A) Linie LAT 10. (B) Linie LA I. U linie LAT 10 jsou hodnoty průměrem ze tří opakování, u linie LA I ze dvou opakování. XAD-2 a XAD-7 jsou dva různé amberlity.
44
Kontrolní kultury bez přítomnosti amberlitů v kultivačním médiu uvolňují do média minimum lignanů a akumulují je v pletivu, což není ideální. Amberlit XAD-2 na sebe jímal větší množství lignanů a navíc výrazně zvýšil u linie LAT 10 produkci lignanů v pletivu. U linie LA I adsorbovaly obě pryskyřice lignany kultivačního média mnohem aktivněji než u linie LAT 10 (obr. 12). Na základě obsahu lignanů v sušině (obr. 13) lze výsledky porovnat s jinými prameny.
Produkce lignanů linií LAT 10
Absolutní obsah lignanů [ug]
A 80
68,12
70 60
46,18
50 40 30
22,00
20 1,58
1,54
2,04
kontrola
XAD-2
XAD-7
0
kultura
médium
amberlit
Produkce lignanů linií LA I
B Absolutní obsah lignanů [ug]
12,02
6,31
10
80 70 60 50
38,69
40 24,57
30 16,54
20 10
6,96
4,78 1,87
0,81
0,89
kontrola
XAD-2
XAD-7
0
kultura
médium
amberlit
Obr. 12 Průměrný obsah lignanů [µg] v kulturách, médiích a na amberlitech. (A) Linie LAT 10. (B) Linie LA I. U linie LAT 10 jsou hodnoty průměrem ze tří opakování, u linie LA I ze dvou opakování. XAD-2 a XAD-7 jsou dva různé amberlity.
45
Obsah lignanů v sušině
% [w/w]
0,1100 0,1000 0,0900 0,0800 0,0700 0,0600 0,0500 0,0400 0,0300 0,0200 0,0100 0,0000
kontrola
XAD-2
XAD-7
kontrola
LAT 10
XAD-2
XAD-7
LA I
schizandrin
0,0003
0,0010
0,0004
0,0006
0,0003
0,0003
gomisin A
0,0004
0,0005
0,0002
0,0004
0,0006
0,0005
deoxyschizandrin
0,0001
0,0049
0,0010
0,0012
0,0035
0,0006
gama-schizandrin
0,0054
0,0131
0,0298
0,0350
0,0557
0,0374
gomisin N
0,0199
0,0047
0,0094
0,0099
0,0291
0,0087
w uw eizisu C
0,0001
0,0003
0,0011
0,0104
0,0003
0,0000
lignany celkem
0,0262
0,0245
0,0419
0,0575
0,1041
0,0473
Obr. 13 Obsah lignanů [%] v kulturách přepočtený na sušinu (LAT 10 a LA I označení linií, XAD-2 a XAD-7 jsou dva různé amberlity).
46
6. Diskuse Analýzou bylo zjištěno, že množství lignanů produkované kulturou S. chinensis bylo nižší, než množství obsažené v listech a semenech, jak uvádějí SLANINA a kol. (2002), podle nichž semena obsahují 1,815 % lignanů a listy 0,301 % lignanů. Tento fakt se vysvětluje tím, že buněčná kultura je mladá. Obsah lignanů v buňkách nejproduktivnější varianty v sušině byl přibližně 2,9krát nižší než v listech a 17,4krát nižší než v semenech, zatímco SLANINA a kol. (2003) uvádějí obsah lignanů přibližně 10krát nižší než v listech a 50krát nižší než v semenech. V pokusu byly srovnávány dvě odlišné linie. Linie LA I snadněji uvolňovala lignany do kultivačního média než linie LAT 10. Linie LAT 10 sice rostla vlivem polystyrenové pryskyřice, amberlitu XAD-2, nejrychleji a vyprodukovala absolutně největší množství lignanů, v přepočtu na suchou hmotnost byl však obsah lignanů v této kultuře nejnižší. Pravděpodobně by bylo ideální nalézt kulturu, která by rostla rychle a produkovala velké množství lignanů. Přídavek obou typů amberlitů zvyšuje produkci lignanů u obou linií. U linie LAT 10 bylo množství celkových lignanů při použití pryskyřic 0,9-1,6krát větší oproti kontrole, u linie LA I bylo množství vyšší 0,8-1,8násobné. U linie LAT 10 zvyšoval celkovou produkci lignanů více amberlit XAD-7, u linie LA I více amberlit XAD-2. VLAŠÍNOVÁ a kol. (2004) uvádějí 30-130krát vyšší celkové množství lignanů oproti kontrole u linie LA 58, 4-9ti násobné zvýšení u linie LA 4 a 3-5ti násobné zvýšení u linie LAT 52. Nejvíce lignanů (0,1041 % suché hmotnosti buněk) bylo detekováno u linie LA I s přídavkem amberlitu XAD-2, což bylo přibližně 4krát více, než množství lignanů produkované linií LAT 10 s přídavkem stejné pryskyřice. Množství lignanů produkované buňkami obou linií s přídavkem polyakrylátové pryskyřice, amberlitu XAD-7, bylo přibližně stejné. Rovněž kontrolní linie LAT 10 bez přídavku pryskyřice rostla výrazně rychleji než kontrola LA I, vyprodukovala však dvakrát méně lignanů než kontrolní linie LA I. Ve všech kulturách byl v nejvyšší koncentraci nalezen lignan gama-schizandrin, s výjimkou kontroly LAT 10, kde hlavním lignanem byl gomisin N. U linie LAT 10 byla produkce gama-schizandrinu zvýšena především přídavkem amberlitu XAD-7, u linie LA I především přídavkem amberlitu XAD-2. Tyto výsledky však není možné porovnat s jinými prameny, protože gama-schizandrin nebyl dříve detekován.
47
Lze potvrdit tvrzení VLAŠÍNOVÉ a kol. (2004), že účinnější pryskyřicí ve zvýšení produkce lignanů byl amberlit XAD-2 než XAD-7. U linie LAT 10 zvýšil amberlit XAD-2 produkci deoxyschizandrinu přibližně 49krát a 3krát u linie LA I, zatímco amberlit XAD-7 zvýšil produkci deoxyschizandrinu pouze u linie LAT 10, a to 10krát. VLAŠÍNOVÁ a kol. (2004) uvádějí zvýšení produkce deoxyschizandrinu účinkem amberlitu XAD-2 u linie LA 4 přibližně 50krát a 13krát u linie LAT 52, účinkem amberlitu XAD-7 zvýšení 2-4krát. Zatímco VLAŠÍNOVÁ a kol. (2004) uvádějí, že amberlit XAD-7 zvýšil u linie LA 58 produkci wuweizisu C 185krát a obě pryskyřice u linií LA 4 a LAT 52 zvyšovaly jeho produkci 3-9krát, ke zvýšení produkce wuweizisu C došlo pouze u linie LAT 10, kde se jeho množství zvýšilo třikrát působením amberlitu XAD-2 a 11krát působením amberlitu XAD-7. Nebylo potvrzeno, že ve vzorcích kultur in vitro byl vždy obsah gomisinu A a deoxyschizandrinu vyšší než obsah schizandrinu, jak uvádějí SLANINA a kol. (2003). Produkci schizandrinu zvyšovaly obě pryskyřice oproti kontrolám poměrně málo u obou linií, 1,3-3krát u linie LAT 10 a 1,25-1,5krát u linie LA I. Zvýšení produkce gama-schizandrinu u linie LA I bylo malé, pouze 1,1-1,6ti násobné, u linie LAT 10 však došlo k navýšení jeho produkce 2-5krát. Ke zvýšení produkce gomisinu N došlo pouze vlivem amberlitu XAD-2 u linie LA I oproti kontrole, 2,9krát. Rovněž VLAŠÍNOVÁ a kol. (2004) uvádějí zvýšení produkce gomisinu N jen od 1,0 do 3,2 násobku oproti kontrolám bez přídavku pryskyřice. Potvrdilo se, jak uvádějí VLAŠÍNOVÁ a kol. (2004), že amberlit XAD-2 zvyšoval především produkci deoxyschizandrinu a amberlit XAD-7 wuweizisu C.
48
7. Závěr Výsledky naznačují, že metoda jímání lignanů na pryskyřice je velmi slibná. Přídavek obou typů amberlitů zvýšil produkci lignanů u obou linií oproti kontrolám. Nejvíce lignanů bylo detekováno u linie LA I s přídavkem amberlitu XAD-2. K největšímu zvýšení produkce přídavkem pryskyřic došlo u linie LAT 10 u lignanu deoxyschizandrinu a wuweizisu C. Amberlit XAD-2 zvyšoval především produkci deoxyschizandrinu, amberlit XAD-7 především produkci wuweizisu C. Ve všech buněčných kulturách byl v nejvyšší koncentraci nalezen lignan gama-schizandrin, s výjimkou kontrolní linie LAT 10, kde hlavním lignanem byl gomisin N. Linie LAT 10 a LA I se lišily rychlostí růstu, linie LA I rostla výrazně pomaleji. Obsah lignanů v buňkách nejproduktivnější varianty v sušině byl přibližně 2,9krát nižší než v listech a 17,4krát nižší než v semenech. Pryskyřice kontinuálně odjímají lignany produkované kulturou a jejich získání je možné bez poškození kultury. Amberlity účinkují specificky na určitý lignan a proto by se měly dále zkoumat podmínky, jak pomocí těchto nástrojů zvýšit produkci určitého lignanu. Kultura klanoprašky čínské in vitro se zdá být vhodným nástrojem k cílené produkci vybraných typů lignanů. Podmínkou je však optimalizace kultivačního média pro jednotlivé linie a selektivní elicitace jednotlivých lignanů dvěma různými typy polymerních sorbentů.
49
8. Soupis literatury 1.
DUKE, J. A. Handbook of medicinal herbs. 2rd edition. USA: CRC Press, 2002. 896 s. ISBN 0-8493-1284-1.
2.
FUSS, E. Lignans in plant cell and organ cultures: An overview. Phytochemistry reviews, 2003, vol. 2, no. 3, s. 307-320. ISSN 1568-7767.
3.
GARANOWICH, I. M. Medicinal raw materials of introduced wood plants in Belarus. In Proceedings of the 8th International Congress Phytopharm 2004: Actual problems of creation of new medicinal preparations of natural origin. Mikkeli, Finland,
21-23
June,
2004.
St.-Petersburg:
VVM.co.,
2004.
771
s.
ISBN 5-96510021-3.
4.
HEJDUK, J. Klanopraška čínská (Schisandra chinensis) - podivuhodná rostlina z Dálného východu. [online]. Poslední aktualizace 25. března 2006. [citováno 16. října 2005]. Dostupné z: http://www.pelargonie.cz .
5.
HRADILÍK, J. Rostlinné explantáty. 1. vyd. Brno: MZLU v Brně, 2005. 85 s. ISBN 80-7157-915-7.
6.
KAMÍR, P. Bylinář: Rostlinné stimulátory fyzických a duševních sil. 1. vyd. Brno: Littera, 1991. 124 s. ISBN 80-900327-1-0.
7.
KIM, T. D. - RAMESH ANBAZHAGAN, V. - PARK, J. I. Somatic embryogenesis in Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 2005, vol. 41, no. 3, s. 253-257. ISSN 1054-5476.
50
8.
KOMARAIAH, P. - RAMAKRISHNA, S. V. - REDDANNA, P. - KAVI KISHOR, P. B. Enhanced production of plumbagin in immobilized cells of Plumbago rosea by elicitation and in situ adsorption. Journal of Biotechnology, 2003, vol. 101, no. 2, s. 181-187. ISSN 0168-1656.
9.
MAZNĚV, N. I. Enciklopedija lekarstvennych rastenij. Moskva: Martin, 2003. 496 s. ISBN 5-8475-0136-6.
10.
MC KENNA, D. J. - JONES, J. - HUGHES, K. - HUMPNEY, S. Botanical Medicines: The desk reference for Major Herbal Supplements. 2rd edition. Binghamton: The Haworth Herbal Press, 2002. 1138 s. ISBN 07890-1265-0.
11.
OPLETAL, L. - SOVOVÁ, H. - BÁRTLOVÁ, M. Dibenzo[a,c]cyclooctadiene lignans of the genus Schisandra: importance, isolation and determination. Journal of chromatography B, 2004, vol. 812, no. 1-2, s. 357-371. ISSN 1570-0232.
12.
PAUKRTOVÁ, I. - REK, S. Klanopraška čínská. Zahrádkář, 1996, roč. 28, č. 2, s. 2. ISSN 0139-7781.
13.
PROCHÁZKA, S. - MACHÁČKOVÁ, I. - KREKULE, J. - ŠEBÁNEK, J. Fyziologie rostlin. 1. vyd. Praha: Academia, 1998. 484 s. ISBN 80-200-0586-2.
14.
PUROHIT, S. S. Agricultural Biotechnology. Jodhpur: Agrobios, 2003. 938 s. ISBN 81-7754-156-0.
51
15.
SLANINA, J. - TÁBORSKÁ, E. - SMÍŠKOVÁ, A. - VLAŠÍNOVÁ, H. Lignany v in vitro kultuře
Schisandra
chinensis.
In
Pokroky
v organické,
bioorganické
a farmaceutické chemii, Nymburk 28. - 30. listopadu 2003. Chemické listy, 2003, roč. 97, č. 12, s. 1206. ISSN 0009-2770.
16.
SLANINA,
J.
-
TÁBORSKÁ,
E.
-
VLAŠÍNOVÁ,
H.
Stanovení
dibenzo[a,c]cylooktadienových lignanů v tkáňové kultuře Schisandra chinensis. In Pokroky v organické, bioorganické a farmaceutické chemii: sborník abstraktů, Nymburk 22. - 24. listopadu 2002. Chemické listy, 2002, roč. 96, s. 936-937. ISSN 0009-2770.
17.
SLANINA, J. Biologická a farmakologická aktivita lignanů. Chemické listy, 2000, roč. 94, č. 2, s. 111-116. ISSN 0009-2770.
18.
SMÍŠKOVÁ, A. - VLAŠÍNOVÁ, H. - HAVEL, L. Somatic embryogenesis from zygotic embryos of Schisandra chinensis. Biologia plantarum, 2005, vol. 49, no. 3, s. 451-454. ISSN 0006-3134.
19.
VERPOORTE, R. - MEMELINK, J. Engineering secondary metabolite production in plants. Current Opinion in Biotechnology, 2002, vol. 13, no. 2, s. 181-187. ISSN 0958-1669.
20.
VLAŠÍNOVÁ, H. - SLANINA, J. - KRAMÁŘOVÁ, E. - TÁBORSKÁ, E. Využití biotechnologických
metod
k produkci
sekundárních
metabolitů,
šlechtění
a mikropropagaci léčivé rostliny klanoprašky čínské. Závěrečná zpráva projektu GA ČR 521/02/1129, 2004. 15 s.
21.
ZEHNÁLEK, J. Biochemie 2. 1. vyd. Brno: MZLU v Brně, 2003. 202 s. ISBN 80-7157-716-2.
