Využití antibakteriálních testů v textilním průmyslu Mgr. Irena Šlamborová, Ph.D. Fakulta Přírodovědně-humanitní a pedagogická, katedra chemie
OBSAH:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Stavba a fyziologie bakterií. Kultivace bakterií, kultivační média. Klasifikace bakterií. Antibiotika. Bakteriální kmeny používané k testům. Testovací normy a metody. Možnosti, výhled.
Bakterie (Bacteria) 0,2 – 2 mikrometry
Množení a růst bakterií A – lag-fáze a fáze zrychlujícího se růstu B – exponenciální fáze C – stacionární fáze D – postupné odumírání buněk
Kultivace bakterií Fyzikálně-chemické podmínky 1. Přítomnost vody – vstřebávání živin 2. Optimální pH – 7,2 – 7,4 3. Isotonie kultivačního prostředí – přídavkem NaCl (většinou 0,5%) 4.
Optimální plynná atmosféra (aerobní a anaerobní bakterie)
Kultivace bakterií 5. Optimální teplota minimum – nejnižší teplota, kdy se zastavuje růst
maximum – nejvyšší teplota, kdy se růst zastaví, ale při ochlazení na nižší teplotu dále pokračuje optimum – tepelný bod, při kterém je rychlost růstu maximální: 30°C až 40°C (v laboratořích 37°C) – viz růstová křivka
6. Nároky bakterií na živiny
Mikrobiologické půdy 1. Kultivační půdy tekuté – základem je masopeptonový bujón, pepton, cukry,... + soli, vitamíny 2. Kultivační půdy pevné – přidává se 1-2% agar – nalévá se do sterilních Petriho misek – základem je masopeptonový agar – přídavkem 5% ovčích erytrocytů vzniká tzv. krevní agar
Mikrobiologické půdy 3. Tkáňové kultury – některé bakterie se množí pouze v buňkách (riketzie, chlamydie)
Agarové půdy
Krevní agary s bakteriálními koloniemi
Očkování kultivačních půd Očkování (inokulace) - přenesení kultury do tekuté půdy nebo na pevnou půdu - pevné půdy po zaočkování zředěnou bakteriální kulturou zasušíme v termostatu po dobu 15 – 30 minut při teplotě 37°C
Očkování kultivačních půd
Ředění bakterií Koncentrace
Odebrání
Získaná koncentrace
z z z z
108 CFU/ml 106 CFU/ml 105 CFU/ml 103 CFU/ml
0,1 ml do 10 ml f.r. 1 ml do 9 ml f.r. 0,1 ml do 10 ml f.r. 0,5 ml do 4,5 ml f.r.
106 CFU/ml 105 CFU/ml 103 CFU/ml 102 CFU/ml
f.r. – fyziologický roztok: 8,5 g NaCl/1000 ml destilované vody CFU – Colony Forming Units
Barvení bakterií podle Grama 1. 2.
grampozitivní (G+) – modře zbarvené gramnegativníG-) – červeně zbarvené
Princip barvení: vychází z odlišného složení buněčné stěny u G- obsahuje lipopolysacharidy a proto při jejich odbarvování ethanolem dochází k vyplavení komplexu krystalové violeti s jodem z cytoplasmy bakterie
Barvení bakterií podle Grama G+ mají pevnější buněčnou stěnu, a proto se výše uvedený komplex nevyplavuje Příklady: G+ : Staphylococcus aureus G - : Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae
Grampozitivní bakterie
Gramnegativní bakterie
Gramovo barvení (VLAS) 1. 2.
3. 4.
5. 6. 7.
roztok krystalové violeti – 30 sekund barvivo slít – opláchnout vodou a převrstvit na 30 sekund Lugolovým roztokem slít a opláchnout vodou odbarvit ethanolem nebo acetonem (1-2 sekundy, dokud barvivo odtéká) opláchnout tekoucí vodou dobarvit safraninem – 60 sekund opláchnout tekoucí vodou, usušit na vzduchu
Hemolýza bakterií -
-
-
jedná se o rozpouštění krevního barviva na krevním agaru v okolí bakteriálních kultur beta hemolýza - úplné rozpuštění hemoglobinu (projasnění na krevním agaru) alfa hemolýza(viridace) – neúplná přeměna hemoglobinu na methemoglobin
Beta hemolýza
Hemolýza
Klasifikace bakteriálních kolonií Během inkubace se na agarové půdě za vhodných podmínek z každé bakteriální
buňky vyvine 1 kolonie. Vzhled kolonie je charakteristický pro určitou skupinu nebo pro druh bakterie. Hodnocení kolonií – důležitý
diagnostický znak
Klasifikace bakteriálních kolonií 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
TVAR – okrouhlá, nepravidelná,... PROFIL – plochý, vypouklý,... OKRAJE – rovné, zvlněné, ... POVRCH – lesklý, hladký,... TRANSPARENCE – průhledná, průsvitná,... BARVA – bezbarvé, žluté,... ZMĚNY OKOLÍ – posuzujeme hemolýzu KONZISTENCE – mazlavá, drobivá,... ZÁPACH – fekální, hnilobný,... VELIKOST – tečkovité nebo průměr
ANTIBAKTERIÁLNÍ ÚČINKY BAKTERIOCIDNÍ ÚČINEK – bakterie jsou usmrceny účinkem látky, která je přítomna v testovaném materiálu BAKTERIOSTATICKÝ ÚČINEK – množení bakterií je inhibováno (zastaveno) účinkem látky, která je přítomna v testovaném materiálu
ANTIBIOTIKA 1. Peniciliny – v molekule beta-laktamový kruh (penicilin G, V, oxacilin, ampicilin, augmentin,...) + mají baktericidní účinek, nízkou toxicitu, dobrou snášenlivost - nedostatečně široké spektrum bakterií, krátkodobý účinek, možnost alergií a kožních problémů
ANTIBIOTIKA 2. Cefalosporiny – laktamová antibiotika (cefalotin, cefaloridin, cefalexin, cefixim,...) + výborné baktericidní účinky a široké spektrum bakterií - možnost vzniku alergie, poškození ledvin
ANTIBIOTIKA 3. Tetracykliny -
-
bakteriostatická antibiotika s velmi širokým spektrem působení – působí na G+ i G- bakterie negativa: gastrointestinální potíže, hepatotoxicita, alergie, ukládání do zubů, kostí (kontraindikace – gravidita, děti do 8 let)
ANTIBIOTIKA 4. Chloramfenikol -
-
širokospektré antibiotikum, proniká rychle do mozkomíšního moku negativa: vzácně – útlum kostní dřeně + porucha krvetvorby, kontraindikace u novorozenců a nedonošených dětí
ANTIBIOTIKA 5. Makrolidy (erytromycin, klaritromycin,...) bakteriostatický účinek na G+ a Gproblémy s GAT, kontraindikace při onemocnění jater 6. Sulfonamidy(biseptol, septrin) bakteriostatický účinek, dobře se koncentrují v moči i ve tkáních dýchacích cest při používání: dostatek tekutin bez kyselého pH, aby nedošlo k vysrážení krystalků sulfonamidů v ledvinách -
BAKTERIÁLNÍ KMENY
CCM
Czech Collection of Microorganisms - klasifikovaná sbírka mikroorganismů - bakterie, kvasinky - Masarykova univerzita, PřF Česká sbírka mikroorganismů uchovává pouze kmeny rizikové skupiny 1 a 2 ve smyslu mezinárodních standardů hodnocení patogenity, testované kmeny jsou patogenní, patří do skupiny č. 2
Escherichia coli
Escherichia coli – CCM 2024, ATCC 9637 - gramnegativní, aerobní tyčinkovitá bakterie - součást mikroflóry tlustého střeva (vitamíny K a B12) - jako patogenní kmeny: a) extraintestinální onemocnění b) intestinální onemocnění
Escherichia coli
Staphylococcus aureus, MRSA
Staphylococcus aureus – CCM 229, ATCC 9637 a MRSA CCM 4223 - grampozitivní kokovitá bakterie - fakultativně anaerobní - rezistence – teplota nad 55°C/ 30 minut - výskyt: nosní přepážka, kůže - široké spektrum onemocnění a intoxikace - (abscesy, furunkulózy, meningitidy,…)
Staphylococcus aureus
MRSA
Acinetobacter baumanii Acinetobacter baumanii – CCM 2265 - gramnegativní zaoblená tyčinkovitá bakterie - aerobní bakterie - výskyt: půda, voda, odpadní voda - původce nosokomiálních a kožních infekcí
Acinetobacter baumanii
Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae – CCM 2318 - gramnegativní tyčinkovitá bakterie - fakultativně anaerobní, opouzdřená polysacharidovým pouzdrem - na pouzdře 70 kapsulárních antigenů - výskyt: půda, voda, dýchací cesty, trávicí trakt - hnisavé meningitidy, sepse a kožní záněty
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa/CCM1959 - gramnegativní, aerobní tyčinkovitá b. - odpadní vody, půda, stolice domácích zvířat a lidí - nemocniční patogenní kmeny – vysoce virulentní a rezistentní na antibiotika
Pseudomonas aeruginosa
Proteus mirabilis
Původce mnoha endogenních infekcí – močové, hnisavé abscesy na kůži. Vysoce rezistentní k antibiotikům.
Candida albicans kvasinka Komensál u zdravého člověka na kůži a sliznicích. Někdy – zvýšení virulence – invaze kvasinek do tkání. Léčba – kortikosteriody, imunosupresiva a cytostatika.
Candida albicans – kvasinkové infekce
Testovací metody a normy
1. ČSN EN ISO 20645
TESTOVACÍ METODA – NORMA: Testy byly provedeny dle ČSN EN ISO 20645 – Plošné textilie – zjišťování antibakteriální aktivity – zkouška šíření agarovou destičkou.
Výsledky testů jsou dle výše uvedené normy hodnoceny následovně:
Inhibiční zóna (mm): A. >1 mm až inhibiční zóna do 1 mm – DOBRÝ ANTIBAKTERIÁLNÍ EFEKT B. 0 mm – LIMIT ANTIBAKTERIÁLNÍ ÚČINNOSTI ( bez inhibiční zóny, pouze omezené kolonie, růst téměř zcela potlačen), neboť stejně dobře 0 růst uvádí hranice účinnosti C. 0 mm – NEDOSTATEČNÝ EFEKT
VÝSLEDKY TESTOVÁNÍ
Čistá halo zóna
2. AATCC Method 100 An American Standard 1993 (2008)
AATCC Method 100 – kvantitativní metoda, je hodnoceno % redukce bakterií R(%) = 100.(B – A)/B A – standard (neupravený vzorek) B – upravený vzorek (s úpravou) výsledkem je počet znovu obnovených bakteriálních kolonií
2. AATCC Method 100 – An American Standard 1993 Jednotlivé bakteriální kolonie
2. AATCC Method 100 – An American Standard 1993 (revize metody 2009) Jednotlivé bakteriální kolonie + hemolýza
3. AATCC Method 147 – An American Standard 1993 AATCC Method 147 – kvalitativní metoda - je hodnocena halo zóna (zóna zábrany růstu bakterií) W= (T-D)/2 [mm2] T – celkový rozměr standardu D – celkový rozměr upraveného vzorku
AATCC Method 147 – An American Standard 1993
Halo zóny
AATCC Method 147 – An American Standard 1993 Negativní výsledek – bez známky halo zón
4. Testování na pevných substrátech
Sklo, keramika, kovy, plasty, … Nanést určitý objem (koncentrace bakteriální suspenze), vystavit např. UV záření nebo ponechat na světle (zářivka) V určitých intervalech – odběr (cca 200 – 300 mikrolitrů) – vyočkovat na bakteriální půdu – kultivace Hodnotíme počet znovu obnovených bakteriálních kolonií
Nové možnosti
Chitosan + tetracyklin (E.coli, S. A.)
Křemičitá nanovlákna + tetracyklin (E.coli, S.A.)
PVB + tetracyklin (E.C., S.A.)
POZITIVA NANOVLÁKENNÝCH OBVAZŮ 1. Kopíruje ránu, nezatěžuje jí 2. Snadná výměna a aplikace 3. Kontaktní účinek antibiotika – přímo do rány – nenaruší vnitřní homeostázu těla pacienta
Sol-gel metoda
Konstrukce inteligentních obvazů metoda sol – gel Zabudování stříbra a dalších látek do různých textilních substrátů touto metodou Stabilita zabudovaných látek
Princip metody sol-gel Záměna kationtů dle schématu ≡Si–OH+Ag+→ ≡Si–O–Ag+H+ Obecný postup alkoxid + organické rozpouštědlo polykondenzací na SOL dále na GEL – odpařit rozpouštedlo, dále tepelně zpracovat = vstvy Ag
Výhody sol-gel metody
1. Schopnost tvořit vrstvu na různých substrátech (bavlna, viskóza, len, …) 2. Různorodost a variabilita přísad (různé vlastnosti vrstev)
3. Stabilita vpravovaných přísad
4. Nízká investiční a energetická náročnost
Příklad testování – S. aureus 1. Bavlna + Ag 2. Fotochemicky upravená bavlna + Ag 3. Nanovlákna + Ag 4. Viskóza + Ag
1.
4.
3.
2.
Děkuji za pozornost
