Vyšetření endometriálních NK buněk průtokovou cytometrií RNDr. Ivana Burešová (Setkání uživatelů Beckman Coulter - květen 2016)
NK buňky Popsány v 80. letech 20. století na základě studií spontánní anti-tumorové aktivity ve slezině myši Mají společný prekurzor s T-lymfocyty, ale nemají TCR Rozpoznávání „vlastního od cizího“ pomocí repertoáru aktivačních a inhibičních receptorů Aktivační – CD16 (FcγRIII), ad. Inhibiční – receptory pro HLA I. třídy Stojí na pomezí nespecifické (cytotoxická aktivita) a specifické složky imunity (produkce cytokinů) Popisuje se 2 – 5 subpopulací (některé se objevují jen za specifických klinických podmínek – např. při HIV infekci)
Subpopulace NK buněk v periferní krvi 90% - CD56dim, obvykle CD16+ vysoká cytotoxická aktivita produkují málo cytokinů
10% - CD56bright slabá cytotoxická aktivita produkují hodně cytokinů
Exprimují odlišný repertoár receptorů pro cytokiny Původně byl za liniový znak NK buněk považován CD57 – oligosacharid se zbytky sulfatované kys. glukuronové, bývá vázán na různé povrchové peptidy nebo lipoproteiny nyní – marker určitého maturačního / funkčního stavu buňky přítomen také na subpopulaci CD3+8+ cytotoxických T-lymfocytů, které se objevují v souvislosti s chronickou antigenní stimulací podíl CD57+ T-lymfocytů i CD57+ NK buněk v cirkulaci přirozeně narůstá s věkem Lopez-Verges (2011) – hypotéza: CD57+ NK buňky jsou „paměťové“ buňky
Endometriální (děložní) NK buňky Endometrium – děložní sliznice; sloupcový epitel, prostoupený tubulárními děložními žlázami; růst ovlivňován progesteronem (ten ovlivňuje i aktivitu NK buněk) Imunitní buňky v endometriu – T-lymfocyty, makrofágy, NK buňky Fenotyp téměř výlučně CD56bright16-; zřejmě zcela unikátní subpopulace NK buněk – jejich expresní profil se významně liší od expresního profilu obou periferních subpopulací (Koopman, 2003) jejich zastoupení roste během menstruačního cyklu s nejvyšším podílem v době časného těhotenství (70-80% v době implementace - zřejmě se podílejí na navození lokální imunosuprese a na vývoji trofoblastu (zevní vrstvy blastocysty) pokud nedojde k otěhotnění, asi 2 dny před začátkem menstruace začínají jevit známky nastupující buněčné smrti CD57+ NK buňky jsou zastoupeny jen málo; vyšší počty jsou považovány za abnormální
NK buňky a poruchy plodnosti Studie NK buněk v periferní krvi: podíly i absolutní počty; všech nebo aktivovaných – CD69+ Studie endometriálních NK buněk – hl. imunohistochemicky; podíly CD56+ i CD57+ buněk Metaanalýza (Seshadri, Sunkara, 2014): Potvrdili statisticky významně vyšší absolutní počet periferních NK buněk u neplodných a plodných žen (v % rozdíl nepotvrdili) Potvrdili statisticky významně vyšší podíl i absolutní počet periferních (ale ne endometriálních) NK buněk u žen s opakovanými potraty ve srovnání s kontrolami Neprokázali vliv NK buněk a jejich cytotoxické aktivity na úspěšnost IVF Závěr: je potřeba další výzkum a další data
Zadání od lékařů Kliniky reprodukční medicíny stanovit zastoupení CD57+ NK buněk ve vzorku endometria, později rozšířený o požadavek specifikovat blíže fenotyp těchto NK buněk Vzorek byl odebírán do 10 ml sterilního fyziologického roztoku Homogenizace vzorku v celoskleněném homogenizátoru Filtrace, redukce supernatantu Test vitality vzorku (+PI) Detekce NK buněk: 1) CD45PB / CD3F CD(16+56)+PE / CD57 AF647 2)
PB
PO
FITC
PE
CD45 CD14 CD16 CD57
PC5.5 APC AF750 CD3
Inkubace 30min při 4°C, promytí, analýza
CD56 CD19
Test vitality vzorku detekce populace živých buněk, eliminace falešné pozitivity, dané autofluorescencí mrtvých buněk
Analýza 7-barevným protokolem 1) Live gate
4) CD45+
2) CD45+ bb
5) NK x T
3) eliminace dubletů
6) CD16 x CD56
7) CD57 x CD56
Statistické vyhodnocení Do léta 2015 analyzováno celkem 61 vzorků od 60 žen s různými poruchami plodnosti žádné CD45+ buňky
3 (4,9%)
velmi málo CD45+ buněk
15 (24,6%)
dostatek CD45+ buněk pro další vyhodnocení
43 (70,5%)
4-barevný protokol
16 (26,2%)
7-barevný protokol
27 (44,3%)
Počet načtených CD45+ buněk: med (min;max) = 395 (34 – 3466)
Zastoupení jednotlivých populací
B-lymfocyty (CD45+14-19+) T-lymfocyty (CD3+) NK buňky (3-(16+56)+/3-19-)
počet vzorků v souboru 27 43 43
med (min – max) (% z CD45+nebo CD45+14-) 2,6 (0 – 28,6) 50,8 (17,6 – 84,4) 41,9 (12,3 – 80,5)
72,2%
34,0%
21,3%
59,9%
CD56+ a CD57+ T-lymfocyty počet vzorků v souboru
med (min – max) (% z CD45+nebo CD45+14-)
CD56+ T-lymfocyty
25
5,2 (1,4 – 29,0)
CD57+ T-lymfocyty
43
14,4 (0,0 – 33,5)
CD56bright, CD56dim a CD57+ NK buňky počet vzorků med (min – max) v souboru (% z CD45+/ CD45+14-) CD56bright NK buňky CD56dim16+/- NK buňky CD57+ NK buňky
med (min – max) (% z NK buněk)
15
28,5 (9,1 – 76,8)
85 (60,9 – 98,2)
15
3,8 (0,5 – 9,5)
10,5 (1,9 – 57,0)
43
1,3 (0 – 10,6)
CD57+ na CD56+ populacích buněk med (min – max) CD57+CD56bright NK buňky CD57+CD56dim16+/- NK buňky CD57+ T-lymfocyty
0,0 (0,0 – 0,7) 33,3 (5,6 – 55,6) 18,2 (0,0 – 71,4)
Závěr Zadání částečně splněno – vypracován protokol, který je dostatečně jednoduchý a přitom poskytuje se slušnou mírou úspěšnosti statisticky hodnotitelné výsledky Výhoda mnohobarevné průtokové cytometrie – umožňuje studovat jednotlivé fenotypové znaky ve vzájemných souvislostech Prokázalo se, že hledat v endometriu CD57+ NK buňky je „nesplnitelný“ úkol Korelace jiných fenotypových nálezů s klinikou? sběr vzorků pokračuje….
Děkuji za pozornost a firmě Beckman Coulter za pozvání
