Vyšetření albuminurie vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií 1,2Fořtová 1Ústav
M., 1Klapková E., 1Kotaška K., 1Průša R.
lékařské chemie a klinické biochemie 2. LF UK a FN Motol, 2Klinika nefrologie 1. LF UK a VFN
Albuminurie
časná predikce diabetické nefropatie rizikový faktor kardiovaskulárních onemocnění (nejen u diabetiků) nefropatie u hypertenze časná diagnostika nefropatie jiného původu (hereditární, renovaskulární, infekční nefropatie) kontrola těhotenského diabetu patologické těhotenství (preeklampsie)
Typ vzorku
„mikroalbuminurie“
Sběr moči
30-300 mg/24hod
Časovaný vzorek
20-200 ug/min
Náhodný vzorek
2,8-28 g/mol kreat * (25-250 mg/g kreat) * M >2,5 g/mol, Ž > 3,5 g/mol
Prokázaná „mikroalbuminurie“: dosažení uvedených hodnot ve dvou ze tří po sobě následujících vzorcích v intervalu 3-6 měsíců proteinurie 1g/24h ≈ 0,1 g proteinu/ mmol kreat
Metody stanovení albuminurie
Imunoturbidimetrie, imunonefelometrie
RIA, ELISA
Elektroforéza
HPLC
LC-MS/MS
Lieske, J.C., Bondar, O., Miller, W.G., Bachmann, L.M., Narva, A.S. et al. A reference system for urinary albumin: current status. Clin. Chem. Lab. Med. CCLM FESCC, 2013, 51(5), p. 981-989.
Východisko
Mnohými studiemi bylo zjištěno, že albuminurie stanovená vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií je především v pásmu „mikroalbuminurie“ až 4x vyšší než albuminurie stanovená rutinními imunochemickými metodami.
Rozdíl mezi metodami se vysvětluje dvěma zcela odlišnými způsoby: 1) sníženou imunoreaktivitou močového albuminu, 2) nespecifičností HPLC metody pro vyšetření albuminurie.
Comper, W.D., Osicka, T.M., Clark, M., Maclssac, R.J., Jerums, G. Earlier detection of microalbuminuria in diabetic patients using a new urinary albumin assay. Kidney Int., 2004, 65, p.1850-1855. Osicka, T.M., Comper W.D. Characterization of immunochemically nonreactive urinary albumin. Clin.Chem., 2004, 50, p.2286-2291. Magliano, D.J., Polkinghorne, K.R., Barr, E.L.M. et al. HPLC-detected albuminuria predicts motrality. J.Am.Soc.Nephrol., 2007, 18, p.3171-3176. Sviridov, D., Meilinger, B., Drake S.K., Hoehn, G.T., Hortin G.L. Coelution of other proteins with albumin during site-exclusion HPLC: Implications for analysis of urinary albumin. Clin.Chem., 2006, 52, p.389-397.
Imunochemické metody hrubě podhodnocují koncentrace albuminu v moči Příčinou ztráta části imunoreaktivity albuminu ???
Ztráta imunoreaktivity albuminu:
fragmenty albuminu určitý podíl intaktního albuminu (Mr 66 500) při průchodu proximálními tubuly ledvin proteolyticky štěpen lyzozomálními enzymy na fragmenty o Mr 500-15000
„nicked albumin“ konformačně změněný albumin (v důsledku přítomnosti fragmentů albuminu), velikost molekuly zůstává nezměněna, pravděpodobně dojde ke ztrátě některých disulfidových můstků
Rozdíl imunochemické metody vs. HPLC podstatně výraznější u diabetiků než u nediabetiků.
Detekce zvýšených koncentrací imunochemicky nereaktivního albuminu v moči metodou HPLC umožní diagnostikovat diabetickou nefropatii v průměru o 4 roky dříve u DM I. typu a o 2,5 roku u DM II. typu
Mikroalbuminurie zachycená HPLC (imunochemicky negativní) koreluje se zvýšenou mortalitou též u jedinců z „obecné“ populace tito jedinci by mohli významně profitovat z běžných preventivních opatření
Comper, W.D., Osicka, T.M., Jerums, G. High prevalence of immuno-unreactive albumin in urine of diabetic patients. Am.J.Kidney Dis., 2003, 41, p.336-342. Comper, W.D., Osicka, T.M., Clark, M., Maclssac, R.J., Jerums, G. Earlier detection of microalbuminuria in diabetic patients using a new urinary albumin assay. Kidney Int., 2004, 65, p.1850-1855. Osicka, T.M., Comper W.D. Characterization of immunochemically nonreactive urinary albumin.Clin.Chem., 2004, 50, p.2286-2291. Magliano, D.J., Polkinghorne, K.R., Barr, E.L.M. et al. HPLC-detected albuminuria predicts motrality. J.Am.Soc.Nephrol., 2007, 18, p.3171-3176.
Kontroverzní zjištění: zvýšené hodnoty albuminu získané HPLC nejsou způsobeny imunochemicky nereaktivním albuminem, ale koelucí některých močových proteinů z kolony (α-1-kyselý glykoprotein, transferin, α-1-antitrypsin, hemopexin…) HPLC tedy není schopna rozlišit albumin od těchto močových proteinů
a poskytuje falešně zvýšené výsledky
Sviridov, D., Meilinger, B., Drake S.K., Hoehn, G.T., Hortin G.L. Coelution of other proteins with albumin during site-exclusion HPLC: Implications for analysis of urinary albumin. Clin.Chem., 2006, 52, p.389-397.
Cíl studie
Zavést HPLC metodu pro stanovení albuminurie.
Potvrdit či vyvrátit tvrzení, že HPLC poskytuje falešně vyšší hodnoty albuminurie díky koeluci dalších bílkovin (α-1-kyselý glykoprotein, transferin, α-1-antitrypsin, hemopexin…) z chromatografické kolony.
Testovat hypotézu o přítomnosti imunochemicky nereaktivního albuminu.
Porovnat hodnoty albuminurie stanovené imunoturbidimetricky a chromatograficky v pacientských vzorcích.
Podmínky chromatografické analýzy
Složení mobilní fáze: složka A: voda, složka B: acetonitril, složka C: 100 mM NaH2PO4, složka D: 1 % trifluoroctová kyselina Kontinuální gradient mobilní fáze Průtok mobilní fáze 2 ml/min Teplota analýzy 22 ºC UV detekce při 280 nm Trvání analýzy: 8 minut Kolona Zorbax 300 SB-C3, 3,5 μm, 4,6 cm x 50 mm (Agilent Technologies, USA)
Kapalinový chromatograf
Agilent 1200, Agilent Technologies, USA
Analýza standardního vzorku albuminu
Analýza směsného vzorku standardů bílkovin
Analýza standardního vzorku α-1-antitrypsinu
Analýza standardního vzorku α-1-antichymotrypsinu
Analýza standardního vzorku prealbuminu
Analýza směsného vzorku standardů albuminu (o koncentraci 100 mg/l) a prealbuminu (o koncentraci 50 mg/l)
Analýza pacientské moči PŘÍKLAD 1 albuminurie IT: 46,3 mg/l HPLC: 60,0 mg/l
Analýza pacientské moči PŘÍKLAD 2 albuminurie IT: 213,0 mg/l HPLC: 280,8 mg/l
Analýza 1. směsného vzorku moči Směsný vzorek připraven z 30 IT negativních močí (4,4 mg/l), přidán standardu albuminu, výsledná koncentrace stanovená IT: 79,1 mg/l HPLC: 82,5 mg/l
+4%
Analýza 2. směsného vzorku moči Směsný vzorek připraven z 30 IT „mikroalbuminurických“ vzorků, koncentrace stanovená IT: 79,5 mg/l HPLC: 99,9 mg/l
+ 26 %
Soubor pacientů
N = 1092, 595 mužů a 497 žen
věk 43,3 25,6 let
636 diabetiků a 456 nediabetiků
Albuminurie IT vs. HPLC 80
p < 0,0001
p < 0,0001
p < 0,0001
70
41,2 ± 27,6
albuminurie [mg/l]
60
50
31,6 ± 16,9
25,3 ± 21,1 30,1 ± 23,6
40
20,0 ± 15,0
14,6 ± 19,3
30
20
10
0
celý soubor
diabetici imunoturbidimetrie
nediabetici HPLC
Median ± SEM, test normality D´Agostina a Pearsona, Mann-Whitneyův test
Poměr albumin/kreatinin u jednotlivých pacientů s imunoturbidimetricky stanovenou „normoalbuminurií“ 9
mikroalbuminurie
7
6
5
4
3
2
1
0 0
100
200
300
400
číslo pacie nta
imunoturbidimetrie
HPLC
500
normoalbuminurie
albumin/kreatinin [mg/mmol]
8
Závěr I
Zavedenou metodou lze účinně separovat α-1-kyselý glykoprotein, transferin a hemopexin.
Za testovaných podmínek nedošlo k eluci α-1-antitrypsinu ani α-1-antichymotrypsinu, tyto bílkoviny tedy s albuminem neinterferují.
Eluční křivka prealbuminu se štěpí na několik píků, z nichž některé z nich s albuminem koeluují. Vzhledem k nízkým sérovým a močovým koncentracím prealbuminu lze usuzovat, že je tato interference klinicky nevýznamná.
Tyto výsledky a výsledky analýz směsných vzorků moči nasvědčují na existenci imunochemicky nereaktivního albuminu.
Závěr II
Byl zjištěn statisticky významný rozdíl mezi metodami v pacientských vzorcích moči, a to jak u diabetiků, tak i u nediabetiků, nejvýznamnější v oblasti imunoturbidimetricky zjištěné „normoalbuminurie“.
Do oblasti HPLC zjištěné „mikroalbuminurie“ se posunulo 30 % pacientů s imunoturbidimetricky zjištěnou „normoalbuminurií“.
Závěr III
Naše výsledky svědčí pro vyšší senzitivitu HPLC metody pro zachycení „mikroalbuminurie“.
Nepotvrdili jsme nespecifičnost této metody.
V budoucnu by vyšetření albuminurie metodou HPLC mohlo najít uplatnění u vybraných rizikových skupin pacientů.
Pro zavedení do rutinní praxe však nepřichází hlavně pro svoji časovou náročnost a nutnost obsluhy pouze vysoce proškoleným personálem s dostatečnou praxí v úvahu.
Děkuji vám za pozornost
