STANOVENÍ KYSELINY PROPIONOVÉ V PEKAŘSKÝCH VÝROBCÍCH KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY

STANOVENÍ KYSELINY PROPIONOVÉ V PEKAŘSKÝCH VÝROBCÍCH KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ DETERMINATION OF PROPIONIC ACID IN BAKERY PRODUCTS BY LIQUID CHROMATOGRAPHY

DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER'S THESIS

AUTOR PRÁCE

Bc. DAGMAR SMĚTALOVÁ

AUTHOR

VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR

BRNO 2009

Ing. PAVEL KUČERA

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12

Zadání diplomové práce Číslo diplomové práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí diplomové práce: Konzultanti diplomové práce:

FCH-DIP0251/2008 Akademický rok: 2008/2009 Ústav chemie potravin a biotechnologií Bc. Dagmar Smětalová Chemie a technologie potravin (N2901) Potravinářská chemie a biotechnologie (2901T010) Ing. Pavel Kučera RNDr. Milena Vespalcová, Ph.D.

Název diplomové práce: Stanovení kyseliny propionové v pekařských výrobcích kapalinovou chromatografií

Zadání diplomové práce: Literární část: a) Vlastnosti kyseliny propionové, její působení jako konzervačního činidla b) Legislativa a použití kyseliny propionové v potravinách c) Postupy stanovení kyseliny propionové vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií Experimentální část: a) Výběr a ověření separačního systému b) Úprava matric pro analýzy kyseliny propionové c) Stanovení kyseliny propionové ve vybraných reálných vzorcích

Termín odevzdání diplomové práce: 22.5.2009 Diplomová práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu diplomové práce. Toto zadání je přílohou diplomové práce.

----------------------Bc. Dagmar Smětalová Student(ka)

V Brně, dne 1.10.2008

----------------------Ing. Pavel Kučera Vedoucí práce

----------------------doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Ředitel ústavu ----------------------doc. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty

ABSTRAKT Tato práce se zabývá vývojem metody stanovení kyseliny propionové v pekaĜských výrobcích pomocí vysokoúþinné kapalinové chromatografie (HPLC). Práce vycházela z potĜeb a podmínek laboratoĜe Státní zemČdČlské a potravináĜské inspekce v BrnČ. V teoretické þásti jsou popsány vlastnosti kyseliny propionové, její výroba, metabolismus, toxicita a konzervaþní úþinek. Dále je pojednáno o kapalinové chromatografii, validaci analytické metody a zpĤsobech stanovení kyseliny propionové. Praktická þást je zamČĜena na stanovení kyseliny propionové ve vČtšinČ dostupných výrobcích na þeském trhu, kde byl pĜedpoklad použití této konzervaþní látky. Kyselina byla ze vzorku extrahována ve vodČ, zfiltrována a filtrát pĜímo stanoven HPLC. Separace byla provedena na kolonČ XBridge C18 (3 x 150 mm, 3,5 µm) s použitím fosfátového pufru (pH upravené na 2,8) jako mobilní fáze a UV detekcí pĜi 210 nm. Použitá metoda izolace kyseliny propionové z matrice byla porovnána s metodami opakované extrakce ve vodČ, extrakce v roztoku mobilní fáze a destilace s vodní parou jak u komerþních vzorkĤ, tak u laboratornČ upeþených chlebĤ se známým pĜídavkem kyseliny propionové. Technika HPLC s využitím extrakce ve vodČ byla vyhodnocena jako vhodná metoda stanovení kyseliny propionové v pekaĜských výrobcích.

ABSTRACT This thesis deals with the development of high performance liquid chromatography method (HPLC) for the determination of propionic acid in bakery products. This work is resulting from the requirements and conditions of Czech Agriculture and Food Inspection Authority (CAFIA) laboratory in Brno. The theoretical part of the thesis describes properties, production, metabolism, toxicity and preservative effect of propionic acid. Furthermore it is treating about HPLC, validation of some analytical method and methods of propionic acid determination. Experimental part is focused on the propionic acid determination in the major part of available products with this preservative on the Czech market. Propionic acid was extracted from the sample with water, filtered and the filtrate was analyzed directly by HPLC. Separation was performed on a XBridge C18 column (3 x 150 mm, 3,5 µm) with a mobile phase of phosphate buffer (pH adjusted to 2,8) and UV detection at 210 nm. Used method of propionic acid isolation was compared with repeated extraction method, extraction in the mobile phase solution and steam destilation both in commercial samples and in laboratory baked breads with known addition of propionic acid. HPLC with water extraction technique was evaluated as a suitable method for propionic acid determination in bakery products.

KLÍýOVÁ SLOVA Kyselina propionová, konzervanty, HPLC, stanovení

KEYWORDS Propionic acid, preservatives, HPLC, determination 3

SMċTALOVÁ, D. Stanovení kyseliny propionové v pekaĜských výrobcích kapalinovou chromatografií. Brno: Vysoké uþení technické v BrnČ, Fakulta chemická, 2009. 73 s. Vedoucí diplomové práce Ing. Pavel Kuþera.

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatnČ a že všechny použité literární zdroje jsem správnČ a úplnČ citovala. Diplomová práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v BrnČ a mĤže být využita ke komerþním úþelĤm jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a dČkana FCH VUT.

.............................................. podpis studenta

Touto cestou bych ráda podČkovala RNDr. MilenČ Vespalcové, Ph.D. a Ing. Pavlovi Kuþerovi za odborné vedení, konzultace, cenné rady a pĜipomínky, které mi poskytovali v prĤbČhu Ĝešení diplomové práce. Dále bych chtČla podČkovat vedoucí odboru zkušební laboratoĜe Ing. Dagmar Vošmerové za to, že mi umožnila vypracovat diplomovou práci v laboratoĜi Státní zemČdČlské a potravináĜské inspekce v BrnČ. 4

OBSAH 1.
Úvod ................................................................................................................................ 7
2.
Teoretická þást ................................................................................................................. 8
2.1.
Vlastnosti kyseliny propionové................................................................................ 8
2.2.
Výroba...................................................................................................................... 9
2.3.
Legislativa ................................................................................................................ 9
2.4.
Metabolismus a toxicita ......................................................................................... 10
2.5.
Kažení peþiva ......................................................................................................... 11
2.6.
Konzervace peþiva ................................................................................................. 13
2.6.1.


Konzervaþní úþinek slabých kyselin .............................................................. 13


2.6.2.


Konzervaþní úþinek kyseliny propionové ...................................................... 15


2.6.3.


Srovnání úþinku konzervantĤ peþiva pĜi rĤzných podmínkách ...................... 15


2.7.
Teorie kapalinové chromatografie ......................................................................... 18
2.7.1.


Instrumentace HPLC ...................................................................................... 19


2.7.2.


Analytické vyhodnocení chromatogramu ....................................................... 20


2.8.
Analýza kyseliny propionové................................................................................. 21
2.8.1.


HPLC analýza organických kyselin ............................................................... 21


2.8.2.


Konkrétní postupy stanovení kyseliny propionové HPLC ............................. 23


2.8.3.


Stanovení kyseliny propionové GC ................................................................ 24


2.8.4.


Stanovení kyseliny propionové CZE .............................................................. 25


2.9.
Validace analytické metody ................................................................................... 26
2.9.1.


Druhy validací ................................................................................................ 26


2.9.2.


Vybrané validaþní parametry.......................................................................... 26


2.10.


Shewhartovy regulaþní diagramy ....................................................................... 28


3.
Experimentální þást ....................................................................................................... 29
3.1.
Použité chemikálie a roztoky ................................................................................. 29
3.1.1.


Chemikálie ...................................................................................................... 29


3.1.2.


Roztoky........................................................................................................... 29


3.1.3.


Použité pomĤcky a pĜístroje ........................................................................... 29


3.2.
Popis vzorkĤ........................................................................................................... 30
3.3.
Postupy práce ......................................................................................................... 36
3.3.1.


PĜíprava roztokĤ ............................................................................................. 36


3.3.2.


Úprava vzorkĤ ................................................................................................ 36


3.3.3.


Stanovení kapalinovou chromatografií ........................................................... 38
5

3.3.4.


Identifikace a kvantitativní vyhodnocení ....................................................... 38


3.4.
Validaþní parametry metody .................................................................................. 38
3.4.1.


Linearita odezvy detektoru – kalibraþní kĜivka .............................................. 38


3.4.2.


Mez detekce a mez stanovitelnosti ................................................................. 39


3.4.3.


Opakovatelnost ............................................................................................... 39


3.4.4.


VýtČžnost ........................................................................................................ 40


4.
Výsledky a diskuze........................................................................................................ 41
4.1.
Absorpþní spektrum kyseliny propionové ............................................................. 41
4.2.
Stanovení validaþních parametrĤ ........................................................................... 42
4.2.1.


Linearita odezvy detektoru – kalibraþní kĜivka .............................................. 42


4.2.2.


Mez detekce a mez stanovitelnosti ................................................................. 44


4.2.3.


Opakovatelnost ............................................................................................... 45


4.2.4.


VýtČžnost ........................................................................................................ 47


4.3.
OvČĜení validované metody stanovení kyseliny propionové na vzorcích peþiva .. 48
4.3.1.


Srovnání obsahu kyseliny propionové v þerstvém a sušeném vzorku ............ 50


4.3.2.


Srovnání obsahu kyseliny propionové v þerstvém a zmraženém vzorku ....... 52


4.3.3.


Srovnání obsahu kyseliny propionové v kĤrce a stĜídce toustového chleba .. 53


4.3.4.


Stabilita kyseliny propionové v peþivu bČhem skladování ............................ 54


4.3.5.


Interní referenþní materiál .............................................................................. 55


4.4.
Srovnání rĤzných zpĤsobĤ extrakce kyseliny propionové..................................... 56
4.4.1.


Vliv doby extrakce ve vodČ na extrahované množství kyseliny propionové . 56


4.4.2.


Analýza upeþeného chleba se známým pĜídavkem propionanu sodného ....... 57


4.4.3.


Opakovaná extrakce ve vodČ .......................................................................... 59


4.4.4.


Extrakce v mobilní fázi................................................................................... 59


4.4.5.


Destilace s vodní parou ................................................................................... 60


5.
ZávČr.............................................................................................................................. 63
6.
Seznam použitých zdrojĤ .............................................................................................. 65
7.
Seznam použitých zkratek a symbolĤ ........................................................................... 68
8.
Seznam pĜíloh ................................................................................................................ 69
9.
PĜílohy ........................................................................................................................... 70


6

1. ÚVOD Potraviny jsou þasto napadány mikroorganismy, které je znehodnocují, a mohou být pro lidský organismus škodlivé nebo tvoĜit toxické látky. Proto se používají pĜídatné konzervaþní látky, které rozvoji bakterií, plísní nebo kvasinek zamezují a prodlužují trvanlivost potravin. V poslední dobČ však spotĜebitelé vnímají konzervanty spíše negativnČ, obávají se jejich negativních úþinkĤ na zdraví a snaží se preferovat þerstvé potraviny. Kažení pekaĜských výrobkĤ je však vážný problém, jak z hygienického, tak z ekonomického hlediska a používání konzervantĤ je proto u peþiva s prodlouženou trvanlivostí nevyhnutelné. Jako konzervaþní látky se používají slabé kyseliny propionová a sorbová, a to hlavnČ ve formČ solí propionanĤ a sorbanĤ. Kyselina propionová a propionany zamezují rĤstu plísní a nČkterých druhĤ bakterii. Jejich použití je stejnČ jako u ostatních aditivních látek regulováno legislativou ýeské republiky. V této práci bude studován obsah kyseliny propionové a propionanĤ v komerþních pekaĜských výrobcích. Bude použita metoda doporuþená Státní zemČdČlskou a potravináĜskou inspekcí (SZPI), extrakce kyseliny propionové ve vodČ, následná separace vysokoúþinnou kapalinovou chromatografií (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) na kolonČ s reverzní fází a detekce v UV (ultraviolet, ultrafialové) oblasti. Budou stanoveny validaþní parametry pro akreditaci této metody na SZPI. Také bude analyzován obsah kyseliny propionové v chlebech laboratornČ upeþených se známým pĜídavkem propionanu. ZpĤsob extrakce kyseliny propionové ve vodČ bude srovnána s dalšími zpĤsoby, které byly použity v zahraniþních pracích: destilace s vodní parou, extrakce s použitím roztoku mobilní fáze a opakovaná extrakce ve vodČ. Destilace s vodní parou je klasická metoda extrakce organických kyselin a konzervantĤ popisovaná v literatuĜe. Extrakce v roztoku mobilní fáze by mohla díky kyselejšímu pH a disociaþním vlastnostem kyseliny propionové vykazovat vyšší úþinnost. Opakovaná extrakce ve vodČ bude vyzkoušena pro zjištČní, zda v již jednou extrahovaném vzorku nezĤstane ještČ nČjaké množství kyseliny propionové.

7

2. TEORETICKÁ ýÁST 2.1. Vlastnosti kyseliny propionové Kyselina propionová (anglicky propionic nebo propanoic acid) je organická kyselina, která patĜí mezi nejbČžnČji se vyskytující látky v potravinách. Pochází z biochemických procesĤ, aktivity mikroorganismĤ nebo je do potravin pĜidaná jako aditivní látka (konzervant, okyselující látka nebo stabilizátor). PĜispívá k senzorickým vlastnostem potravin, napĜíklad typická chuĢ a vĤnČ ementálu mĤže být pĜipisována kyselinČ propionové a nČkolika dalším slouþeninám (napĜ. prolinu). Organické kyseliny jsou charakterizovány karboxylovou skupinou (–COOH), která disociuje na proton a konjugovanou bázi. Mohou být klasifikovány podle typu uhlíkatého ĜetČzce (alifatické, alicyklické, aromatické, heterocyklické), stupnČ saturace (nasycené a nenasycené) a substituce (substituované, nesubstituované) a podle poþtu obsažených karboxylových skupin (monokarboxylové, dikarboxylové, atd.). Kyselina propionová je monokarboxylová alifatická nesubstituovaná kyselina s tĜíuhlíkatým nasyceným ĜetČzcem. PatĜí mezi nižší monokarboxylové kyseliny (C1 – C4), které jsou vysoce tČkavé. [1] Propionová kyselina je olejovitá kapalina s mírnČ štiplavým, nepĜíjemným, žluklým zápachem. Je dobĜe mísitelná s vodou, alkoholem, etherem a chloroformem. MĤže být vysolena z vodného roztoku pĜídavkem chloridu vápenatého nebo jiné soli. [2] Je povolena pro použití v potravinách jako konzervaþní þinidlo, stejnČ jako její soli, a to propionan (nebo také propionát) sodný, vápenatý a draselný. Propionan sodný je bílá nebo bezbarvá krystalická hygroskopická látka se slabým zápachem kyseliny. Je dobĜe rozpustný ve vodČ (150 g ve 100 ml pĜi 100 °C), rozpustný v alkoholu (4 g ve 100 ml pĜi 25 °C). Propionan vápenatý je bílá krystalická látka, prášek nebo granule se slabým zápachem kyseliny. Vyskytuje se jako mono- nebo trihydrát. Je dobĜe rozpustný ve vodČ (55,8 g ve 100 ml pĜi 100 °C), ale jen slabČ rozpustný v alkoholu. Sodná sĤl má tedy vČtší rozpustnost než vápenatá sĤl. Propionan draselný je bílá nebo bezbarvá krystalická látka, dobĜe rozpustná ve vodČ a rozpustná v ethanolu. [2, 3, 4] Tabulka 1: Vlastnosti kyseliny propionové a jejich solí [2, 4]

Sumární vzorec CAS þíslo E kód Molární hmotnost Teplota tání Teplota varu pKa LD50 orálnČ u krys

8

Kyselina propionová C3H6O2 79-09-4 E 280 74,08 -21,5 °C 141,1 °C 4,87 (25 °C) 4,29 g.kg-1

Propionan sodný C3H5O2Na 137-40-6 E 281 96,06

Propionan vápenatý C6H10O4Ca 4075-81-4 E 282 186,22

Propionan draselný C3H5O2K 327-62-8 E 283 112,17

2.2. Výroba Kyselina propionová se nejþastČji vyrábí chemickou cestou z ropy. Syntéza mĤže probíhat následujícími zpĤsoby: z ethylenu pĤsobením oxidu uhelnatého a vody, oxidací propionaldehydu, z ethanolu a oxidu uhelnatého s využitím katalyzátoru fluoridu boritého BF3, ze zemního plynu metodou Fischer-Tropsch nebo jako vedlejší produkt pĜi pyrolýze dĜeva. Velmi þistá kyselina propionová mĤže být získávána z propionitrilu. [2, 3] V dnešní dobČ nicménČ roste požadavek po produkci kyseliny propionové biotechnologickou cestou z obnovitelných zdrojĤ, mimo jiné kvĤli zvyšující se cenČ ropy. Fermentaþní postupy byly popsány již v roce 1923 a dodnes se provádí další studie na zdokonalení tČchto metod. Pro fermentaci mĤže být použito nČkolik uhlíkatých surovin, napĜ. glukosa, xylosa, maltosa, sacharosa nebo syrovátka. Fermentace probíhá v anaerobním režimu a jako producent se používají grampozitivní, nesporulující, fakultativnČ anaerobní bakterie rodu Propionbacterium. Nevýhodou fermentace je nížší rychlost reakce a koncentrace produktu. DĤvodem je inhibice reakce kyselým pH, a tedy inhibice produktem. Reakce je navíc heterogenní (vedle kyseliny propionové vznikají další vedlejší produkty), což také vede k obtížnČjší a dražší purifikaci produktu. Proto mohou fermentaþní postupy jen stČží konkurovat výrobČ kyseliny propionové chemickou cestou. [3, 5]

2.3. Legislativa PotravináĜské aditivní látky, pĜídatné látky þi také potravinová aditiva jsou takové slouþeniny nebo jejich smČsi, které se k potravinČ zámČrnČ pĜidávají pĜi výrobČ, zpracování, skladování nebo balení za úþelem zvýšení jejich kvality (prodloužení údržnosti, zlepšení vĤnČ, chuti, barvy, textury, výživové hodnoty, technologických vlastností aj.) Mohou být i pĜirozenou souþástí potraviny. Jako potravina se nepoužívají samostatnČ, mohou i nemusí mít urþitou výživovou hodnotu. [6] Druhy a podmínky použití pĜídatných látek pĜi výrobČ potravin stanovuje vyhláška ministerstva zdravotnictví þ. 4/2008 Sb. Je povoleno používání kyseliny propionové (E 280), propionanu sodného (E 281), vápenatého (E 282) a draselného (E 283). Tyto konzervanty mohou být používány pĜi výrobČ potravin uvedených v tabulce 2 maximálnČ do hodnoty nejvyššího povoleného množství (NPM). Hodnoty NPM se vztahují na potraviny ve stavu, v jakém se uvádČjí na trh. PĜídatné látky, pro které není stanovena hodnota NPM, lze použít pĜi výrobČ potravin v množství nezbytnČ nutném k dosažení zamýšleného technologického úþinku pĜi zachování zásad správné výrobní praxe (nezbytné množství, NM). Kyselina propionová a její soli mohou být pĜirozenČ pĜítomny v urþitých fermentovaných výrobcích jako dĤsledek fermentaþního procesu pĜi zachování zásad správné výrobní praxe. V takovém pĜípadČ se tyto látky nepovažují za látky pĜídatné. PĜídatnou látku lze použít: • pokud je prokázána technologická potĜeba jejího použití a úþelu nelze dosáhnout jinými prostĜedky, • pokud v použitém množství nepĜedstavuje riziko pro spotĜebitele, • k zachování výživové hodnoty potraviny, pĜiþemž zámČrné snížení výživové hodnoty se pĜipouští pouze, pokud taková potravina nepĜedstavuje podstatnou složku bČžné stravy nebo pokud je použití pĜídatné látky nezbytné pro výrobu potravin urþených pro zvláštní výživu, 9

• •

k dodání potĜebné složky do potraviny urþené pro zvláštní výživu, ke zvýšení trvanlivosti potraviny nebo zlepšení jejích organoleptických vlastností, pokud se nezmČní jakost potraviny.[7]

Tabulka 2: Potraviny, do kterých je možné pĜidávat kyselinu propionovou a propionany a jejich maximální povolené množství [7] ýíslo E E 280 E 281 E 282 E 283

Látka

Název potraviny

kyselina propionová propionát sodný propionát vápenatý propionát draselný

balený plátkový chléb s trvanlivostí delší než 5 dnĤ a žitný chléb chléb se sníženým obsahem energie s trvanlivostí delší než 5 dnĤ pĜedpeþený a balený chléb s trvanlivostí delší než 5 dnĤ balené jemné peþivo a cukráĜské výrobky z mouky s trvanlivostí delší než 5 dnĤ s vodní aktivitou vyšší než 0,65, balené výrobky „rolls“,“ buns“ a „pitta“ balený chléb s trvanlivostí delší než 5 dnĤ „Christmas pudding“ balený „polsebrod“, „boller“ a „dansk flutes“ sýr a analogy sýra (pouze k ošetĜení povrchu)

NPM mg.l-1 resp. mg.kg-1 3000 jako kyselina propionová 2000 jako kyselina propionová 2000 jako kyselina propionová 2000 jako kyselina propionová

1000 jako kyselina propionová 1000 jako kyselina propionová 2000 jako kyselina propionová NM

2.4. Metabolismus a toxicita Kyselina propionová není tČlu cizí slouþenina, nýbrž jde o bČžný meziprodukt metabolismu. TvoĜí se rozkladem mnoha aminokyselin a oxidací mastných kyselin obsahujících lichý poþet uhlíkových atomĤ. Kyselina i její soli jsou díky dobré rozpustnosti ve vodČ v trávicím traktu snadno absorbovány. Neexistuje riziko jejich akumulace v tČle, protože kyselina propionová je v tČle metabolizovaná podobnČ jako mastné kyseliny. Rozkládá se zapojením koenzymu A pĜes methylmalonyl-CoA, sukcinyl-CoA a sukcinát až po CO2 a H2O. Dokonce ani po vysokých dávkách kyseliny propionové se v moþi nevyluþuje její významné množství. [3, 8] Kyselina propionová tvoĜí pĜirozenou souþást nČkterých potravin a považuje se za bezpeþnou látku, která u vČtšiny lidí nevyvolává po konzumaci žádné nežádoucí úþinky. NČkteĜí lidé však mohou být na kyselinu propionovou a propionany pĜecitlivČlí. Mezi citované pĜíznaky patĜí bolest hlavy a bĜicha, podráždČnost a náladovost. [9] Propionan sodný je alergen. PĜi tepelném rozkladu uvolĖuje toxické páry Na2O a má také lokální antihistaminickou aktivitu. 10

Aþkoli technologické limity omezují množství a možnosti používání kyseliny propionové jako konzervantu, SvČtovou zdravotnickou organizací (World Health Organization, WHO) a Organizací pro výživu a zemČdČlství (Food and Agriculture Organization, FAO) nebyla urþena hodnota pĜijatelného denního pĜíjmu (Acceptable Daily Intake, ADI). Ve Spojených státech amerických patĜí mezi skupinu látek, které se v souþasné dobČ považují za bezpeþné pro lidské zdraví a oznaþují se zkratkou GRAS (Generally Recognized As Safe, všeobecnČ považované za bezpeþné). Tyto látky se obvykle používají dlouhou dobu a jejich bezpeþnost je podložena toxikologickými studiemi nebo zkušenostmi z praxe. Akutní toxicita je charakterizována hodnotami LD50 (lethal dose, smrtelná dávka v 50 % pĜípadĤ), které jsou uvedeny v tabulce 3. Toxicita kyseliny propionové byla studována u myší, propionanĤ u krys. [3] Tabulka 3: Hodnoty LD50 kyseliny propionové, propionanu sodného a vápenatého [3] LD50 [mg.kg-1 tČlesné hmotnosti] orálnČ intravenóznČ

Kyselina propionová 625

Propionan sodný 5100 1380 – 3200

Propionan vápenatý 3340 580 – 1020

2.5. Kažení peþiva Dostanou-li se mikroorganismy do styku s potravinou, mĤže docházet k rĤzným dČjĤm. Ty mají za následek zmČny vzhledu, vĤnČ, barvy, tvaru, chuti i nutriþní hodnoty potraviny. NČkteré mikroorganismy navíc vytváĜejí toxiny, které mohou být pro þlovČka velmi nebezpeþné. [9] Kažení peþiva je zpĤsobeno hlavnČ plísnČmi a kvasinkami, zĜídka také bakteriemi. Je považováno za vážný ekonomický problém, protože pekaĜské výrobky jsou hlavní složkou potravinového trhu. NČkdy dokonce dochází k tomu, že se peþivo kazí ještČ pĜed uplynutím doby minimální trvanlivosti, pravdČpodobnČ hlavnČ díky kondenzaci vlhkosti na povrchu po zabalení peþiva, které nebylo dostateþnČ zchlazeno. Za nejþastČjší dĤvod zkažení peþiva je považováno plesnivČní. I když jsou spory plísní inhibovány pĜi procesu peþení, dochází ke druhotné kontaminaci ze vzduchu nebo povrchĤ v pekárenských závodech bČhem chlazení, dokonþování a balení. NejþastČjšími mikroorganismy zpĤsobujícími kažení peþiva jsou xerofilní druhy plísní, hlavnČ rodĤ Penicillium, Aspergillus a Eurotium. PekaĜské produkty jsou uchovávány pĜi pokojové teplotČ, tedy v podmínkách optimálního rĤstu xerofilních mikroorganismĤ. NejdĤležitČjší druhy plísní na pšeniþném chlebu jsou druhy rodu Penicillium (P. commune, P. crustosum, P. brevicompactum, P. chrysogenum, P. roqueforti) a Aspergillus (A. versicolor a A. sydowii). Na žitném chlebČ je hlavní kontaminant P. roqueforti, dále pak P. corylophilum a druhy rodu Eurotium (E. repens, E. rubrum). Na koláþích s nízkou vodní aktivitou je oþekávaná pĜítomnost druhĤ rodĤ Eurotium, Aspergillus a Wallemia sebi. Kvasinkové kontaminanty (také známy jako „hrudkové plísnČ“) jsou nejbČžnČjší na krájeném a žitném chlebČ. Dominantní druhy jsou Endomyces fibuliger a Hyphopichia burtonii. Kažení peþiva bakteriemi je zpĤsobeno hlavnČ termorezistentními sporotvornými bakteriemi rodu Bacillus (B. subtilis a B. mesentericus), které zpĤsobují nitkovitost chleba. [10, 11, 12]

11

Nitkovitost je vada chleba, eventuelnČ i peþiva, která se pĜíliš þasto nevyskytuje, ale mĤžeme se s ní setkat v teplých letních mČsících. Je výsledkem tvorby slizovitých pouzder bakterií spoleþnČ s enzymovou hydrolýzou lepku a škrobu, který po zcukĜení podporuje tvorbu pouzder. StĜídka chleba zaþne druhý a tĜetí den po upeþení vlhnout, maže se, je lepivá, zbarvuje se dožluta a odpornČ hnilobnČ páchne (Obr. 1). V posledním stádiu se stĜídka lepí na pĜitlaþený prst a po jeho odtažení (nebo také po rozlomení bochníku) se tvoĜí tenké nitky – odtud název nitkovitost. Tato choroba chleba mĤže být zpĤsobena nedostateþným propeþením pekaĜských výrobkĤ. Pokud teplota peþení uvnitĜ chleba nepĜekroþí 100 °C, spory uvedených bakterií (vyskytující se bČžnČ v menším množství v mouce) teplotu pĜeþkají a mohou za pĜíznivých podmínek vyklíþit a dále se množit. Vznik nitkovitosti podporují následující podmínky: • kontaminace surovin, pĜedevším mouky, ale i droždí, sušeného mléka þi sladových pĜípravkĤ sporami uvedených bakterií rodu Bacillus, • nedostateþnČ vyþištČné výrobní zaĜízení, • pomalé chlazení chleba po upeþení (nejkritiþtČjší teplota je mezi 30 a 45 °C), • nízká kyselost chleba (zmínČné bakterie se množí nejlépe pĜi neutrální reakci, rĤst je potlaþován pĜi kyselosti kolem pH 5,0), • skladování chleba v teplé a vlhké atmosféĜe (optimální teplota pro vznik nitkovitosti je pĜi teplotČ 30 – 35 °C).

Obr. 1: Nitkovitost chleba [13] Touto vadou bývají napadány zejména výrobky vyšší hmotnosti a z pšeniþné mouky. Nitkovitost chleba sice nemĤže nijak ohrozit zdraví spotĜebitele, je však závažným jakostním nedostatkem. [13, 14]

12

2.6. Konzervace peþiva Konzervanty neboli antimikrobiální látky jsou slouþeniny, které chrání potraviny pĜed znehodnocením zpĤsobeným nežádoucími mikroorganismy a prodlužují tak dobu použitelnosti. [6] PĜi výbČru konzervantu se musí brát v úvahu vlastnosti konzervované potraviny (napĜ. hodnota pH, vodní aktivita), typ mikroorganismu, který se v ní mĤže vyskytovat, potĜebná skladovatelnost a snadnost aplikace. Žádný konzervant nemĤže být používán ve všech potravinách pro inhibici všech mikroorganismĤ. Proto se þasto pro prodloužení trvanlivosti potravin používají kombinace konzervantĤ. [15] Ke konzervaci pekaĜských produktĤ se používají slabé kyseliny, nejþastČji kyselina propionová, sorbová a benzoová. Koncentrace pĜidaného konzervantu musí být vhodnČ zvolena. PĜi nízké koncentraci mĤže docházet ke stimulaci rĤstu plísní, napĜíklad díky schopnosti nČkterých mikroorganismĤ metabolizovat nČkteré konzervanty pĜítomné v subletálních koncentracích. Naopak vysoké koncentrace konzervantu mohou v koneþném výrobku zpĤsobit nepĜíjemný zápach, a proto je vždy doporuþeno senzorické vyhodnocení. NČkteré konzervaþní látky mohou mít také nepĜíznivé zdravotní úþinky. Z tČchto dĤvodĤ je jejich používání limitováno legislativní pĜedpisy. Na konzervaci peþiva má také vliv aktivita vody a pH produktu. NapĜíklad výrazné oddálení plesnivČní je teoreticky možné jen ve výrobcích s nízkou aktivitou vody. Dnes se bČžnČ k ošetĜení potravin používá kombinace parametrĤ, které mohou pĤsobit synergicky, tedy tzv. hurdles technologie. Mezi nejvíce používané kombinace ošetĜení patĜí ty, ve kterých je aplikována antimikrobiální kyselina a její úþinnost je zvýšená snížením pH. Dále se používá mírné snížení aktivity vody, tepelné ošetĜení, úprava skladovací teploty apod. [3, 11, 12, 16] SpotĜebitelé dnes mají k aditivĤm a hlavnČ konzervantĤm negativní vztah, a proto nejen v pekárenství existuje tendence ke snížení obsahu konzervantĤ. Lepšími alternativami by mohla být dobrá hygiena v pekárnách, doplĖkové balení, tepelné ošetĜení nebo balení peþiva v modifikované atmosféĜe. [10] 2.6.1. Konzervaþní úþinek slabých kyselin Slabé kyseliny se ve vodném roztoku nachází v rovnováze mezi nedisociovaným a disociovaným stavem molekuly, na rozdíl od silných kyselin, které jsou v roztoku kompletnČ disociovány. Tato rovnováha je dána disociaþní konstantou dané kyseliny, uvádČnou vČtšinou jako pKa (záporný dekadický logaritmus disociaþní konstanty). Hodnota pKa uvádí hodnotu pH, pĜi které je kyselina z 50 % disociovaná. ýím je hodnota pKa vyšší, tím je kyselina slabší a míra disociace menší. Hodnota pKa kyseliny propionové je 4,87, pro srovnání kyseliny sorbové 4,76 a benzoové 4,18. Pokud se hodnota pH prostĜedí snižuje, roste množství nedisociované kyseliny. Ta má mnohem vČtší antimikrobiální úþinek než disociovaná kyselina, protože má schopnost volného pĜechodu pĜes membránu mikroorganismĤ. Konzervaþní úþinek slabých kyselin je tedy silnČ závislý na pH potraviny. NapĜíklad pĜi pH 6 bude jen 7 % kyseliny propionové v nedisociované formČ, ale pĜi pH 4,5 už 71 % kyseliny (Obr. 2). Nejvyšší pĜijatelné rozmezí pH pro aktivitu konzervantĤ je 5,0 – 5,5 pro propionan, 6,0 – 6,5 pro sorban a 4,0 – 4,5 pro benzoan. Proto musí být množství pĜidaného konzervantu posouzeno podle hodnoty pH výrobku.[3, 10, 17] 13

D kĜivka kyseliny propionové [3] Obr. 2:: Disociaþní Nedisociované lipofilní mol olekuly jsou schopny volného pĜechodu pĜes membránu. m Prochází z vnČjšího prostĜedí s nízkým ým pH (kde rovnováha podporuje nedisoci ciovanou molekulu) do cytoplasmy s vysokým pH H (rovnováha podporuje disociovanou molek ekulu). UvnitĜ buĖky se kyselina ionizuje za vzniku iku protonu a anionu, které nejsou schopny difundovat d zpČt ven z buĖky. Difúze pokraþuje, do dokud není koncentrace kyseliny stejná na obou ob stranách membrány, a proto se aniony a protony p koncentrují v cytoplasmČ. Anionyy jsou buć z buĖky odstranČny, nebo použity jakoo zdroje uhlíku. DĤležitČjší je, že protony sniž ižují pH cytoplasmy. Aby buĖka udržela vnitĜní pH, p zkouší vytlaþovat vstupující protony, což c vyžaduje velké množství energie. K tomu odvádí od energii potĜebnou k rĤstu buĖky, a proto p rychlost rĤstu buĖky klesá. Pokud má konze zervant dostateþnou koncentraci, nahromadČné né protony pĜekonají pufrovací schopnost cytoplasm smy a sníží vnitĜní pH, þímž nepĜíznivČ ovlivn ivní gradient protonĤ, protonmotivní sílu pĜes mem mbránu a tedy i tvorbu energie, transport živin ž a pohyblivost buĖky. Mimo to, nízké intr ntracelulární pH pĤsobí na strukturu bunČþ Čþných komponentĤ reakcemi s iontovými vazbam mi, zpĤsobuje denaturaci nukleových kyselin in a enzymĤ, inhibici esenciálních metabolických reakcí r energetickým vyþerpáním, rozpad membrány m a buĖka posléze umírá. Tato teorie antimikrobiálníh ího úþinku slabých kyselin je platná jen pro slabé sl kyseliny, které jsou lipofilní a tedy schopny ny volnČ difundovat pĜes membránu. Dále musí m mít schopnost koncentrovat se v cytoplasm mČ jako dĤsledek nízké pKa a uvolĖovat at dostatek protonĤ v cytoplasmČ k pĜekonání pufr frující schopnosti cytoplasmy a snížit tak pH cytoplasmy. c [3, 17]

14

2.6.2. Konzervaþní úþinek kyseliny propionové Kyselina propionová je efektivní proti plísním, až na nČkteré druhy rodu Penicillium, které mohou rĤst na médiích obsahujících až 5 % kyseliny propionové. Dále inhibuje bakterie Bacillus subtilis a mesentericus, a to dokonce pĜi pH 6,0. Kvasinky a vČtšina bakterií jsou obecnČ ménČ citlivé na pĤsobení kyseliny propionové jako konzervaþního þinidla. Kyselina propionová má využití také jako inhibitor plísní u sýrĤ. Používá se hlavnČ jako soli kyseliny, které jsou více rozpustné ve vodČ. Preferuje se používání propionanu vápenatého, protože také pĜispívá k obohacení potraviny vápníkem. Sodná sĤl je používaná pĜedevším v cukráĜských výrobcích, zatímco vápenatá v chlebu. Kyselina propionová má nízkou chemickou reaktivitu a dlouhou stálost v potravinách, což jsou dvČ vysoce žádoucí vlastnosti potravináĜských konzervantĤ. Propionany vápenaté a sodné mají také antimykotické úþinky pĜi migraci z potravinových obalových materiálĤ (napĜ. u másla). Je známo, že propionan sodný inhibuje rĤst plísní na povrchu sladového extraktu. Také zpožćuje kažení nejen þerstvých fíkĤ, sirupĤ, jableþné šĢávy, bobulí nebo višní, ale také neutrální zeleniny jako fazolí a hrášku. [3, 16] 2.6.3. Srovnání úþinku konzervantĤ peþiva pĜi rĤzných podmínkách Kyselina propionová inhibuje plísnČ a spory Bacillu a v menší míĜe také kvasinky, a proto je tradiþní volbou pro konzervaci chleba. Za úþinnČjší je ale považována kyselina sorbová, která inhibuje plísnČ i kvasinky a používá se v široké škále potravináĜských výrobkĤ. Benzoová kyselina se používá v mnoha typech kyselých potravin, ale je hlavnČ spojena s konzervací ovoce. [10] Vliv tČchto konzervantĤ na inhibici mikroorganismĤ v pekaĜských výrobcích v rĤzných koncentracích (0 – 0,3 %) pĜi rĤzných hodnotách aktivity vody (aW 0,80 – 0,95) a pH (4,5 – 7,5) byl v zahraniþí nČkolikrát studován. V dále zmínČných pracích byly použity soli kyselin propionan vápenatý, sorban draselný, a benzoan sodný. ObecnČ lze Ĝíci, že všechny tĜi konzervanty jsou úþinnČjší pĜi nižších hodnotách pH a rychlost rĤstu plísní znaþnČ klesá se snižováním vodní aktivity potraviny. Aktivita vody je pravdČpodobnČ nejdĤležitČjší faktor prostĜedí, který urþuje, zda a jakou rychlostí budou mikroorganismy rĤst. NicménČ není konstantní a prochází zmČnami bČhem výroby a uchovávání peþiva. Také stojí za zmínku, že studované rozmezí aW je velmi široké. VČtšina bČžných pekaĜských produktĤ má hodnotu aktivity vody v rozmezí 0,70 – 0,88, což samo o sobČ rĤst plísní omezuje. [10, 11, 12] Výsledky první práce, provedené ve ŠpanČlsku v roce 2002, byly získány na agarových médiích, a proto nemohou být závČry pĜímo extrapolovány na reálné produkty. Úþinky konzervantĤ se mohou významnČ lišit v potravinách ve srovnání s kultivaþními médii. Výsledky pro rĤzné testované izoláty ukázaly, že Aspergillus a Penicillium nepĜedstavují riziko kažení peþiva, pokud je technologický proces dobĜe kontrolován a aW je pod 0,80. Jako rizikovČjší druhy byly vyhodnoceny E. amstelodami a E. rubum, které byly schopny rĤst pĜi nízké aktivitČ vody. Bylo zjištČno, že nejúþinnČjší konzervaþní látkou proti napadení potravin E. amstelodami je propionan vápenatý. NicménČ 0,003% koncentrace propionanu stimulovala rĤst E. amstelodami pĜi všech hodnotách pH a 0,03% koncentrace propionanu vykazovala konzervaþní úþinky jen pĜi pH 4,5. Koncentrace propionanu 0,3 % kontrolovala rĤst pĜi pH 4,5 i 6,0, ale byla samozĜejmČ více efektivní pĜi pH 4,5 (Obr. 3).

15

Obr. 3: Kombinovaný úþinek propionanu vápenatého, pH a aW na rychlost rĤstu (mm/den) E. amstelodami [11] Propionan vápenatý a benzoan sodný byly vhodné pro všechny testované hodnoty aW jen pĜi koncentraci 0,3 % a pH 4,5, zatímco sorban draselný úplnČ inhiboval rĤst za testovaného rozpČtí podmínek. Proto byl považován za nejvhodnČjší konzervant ze skupiny slabých kyselin pro použití v pekaĜských produktech. Zamezoval rĤstu plísní pĜi pH 4,5 i 6,0 bez hledu na aktivitu vody (0,80 – 0,95). [11] V roce 2004 byla ve ŠpanČlsku provedena další studie, tentokrát s použitím laboratornČ pĜipraveného peþiva s pH 4,5 a 5,5. Taktéž bylo zjištČno, že sorban draselný je nejvíce úþinný v prevenci kažení plísnČmi tČchto druhĤ výrobkĤ, jelikož byl jediný, který kompletnČ inhiboval plesnivČní pĜi aW 0,90 a pH 4,5. Propionan vápenatý a benzoan sodný byly úþinné jen pĜi nízkých hodnotách aW. PĜi aW 0,80 a bez pĜídavku konzervantĤ nebyl pozorován rĤst druhĤ Aspergillus ani P. corylophilum pĜi obou zkoumaných hodnotách pH. Druhy rodu Eurotium byly také inhibovány pĜi snížení vodní aktivity, nicménČ byl vždy požadovaný pĜídavek konzervantĤ pro kontrolu jejich rĤstu. Ve srovnání s pĜedchozí studií, provedené na agarovém médiu, tato práce pozorovala menší úþinek sorbanu draselného proti stejným druhĤm plísní. PĜi pH 5,5 byla koncentrace 0,3 % úþinná jen pĜi aW 0,80. Když vodní aktivita vzrostla, plesnivČní bylo pouze zpomalené. MĤže to být zpĤsobeno interakcí sorbanu se složkami potraviny, napĜ. proteiny a lipidy. [12]

16

Obr. 4: Kombinovaný úþine inek koncentrace propionanu a hodnoty aW naa rĤst r A. flavus pĜi pH 4,5 po 28 dnech inkubace pĜi teplotČ 25°C [12]

Obr. 5: Kombinovaný úþinek ek koncentrace propionanu a hodnoty aW na rĤst rĤs E. herbariorum pĜi pH 4,5 ,5 po 28 dnech inkubace pĜi teplotČ 25°C [12] V roce 2004 byl v Dánsku studován úþinek propionanu sodného na plesnivČní ple peþiva pĜi u že nejvyšší podmínkách žitného chleba (aaW 0,94 – 0,97 a pH 4,4 – 4,8). Výsledky ukázaly, koncentrace propionanu (0,3 ,3 %) pĜi všech podmínkách nemluvČ o vy vysokých aW (0,97) a vysokém pH (4,8) úplnČ inhibovala in rĤst plísní po dobu dvou týdnĤ nĤ. Výjimku tvoĜily P. roqueforti, P. commune a E. rubrum, které nebyly propionanem inhibovány in a rostly na všech médiích. Koncentrac ace propionanu byla nejdĤležitČjším faktorem m rĤstu pro všechny testované plísnČ, s výjimkou P. P roqueforti, která byla více nebo stejnČ citl itlivá na aW. CelkovČ vysoká aktivita vody zvyšov ovala rĤst plísní s výjimkou druhu Eurotium ium a pH mČlo jen minoritní efekt v testovaném rozsahu. ro

17

ÚrovnČ propionanu pod 0,3 % mČly velmi malé inhibiþní úþinky, druhy rodu Penicillium dokonce ukázaly stimulovaný rĤst. Konzervace žitného chleba propionanem vápenatým a ostatními slabými kyselinami nemĤže být dlouhodobČ doporuþena, protože dochází ke stimulaci rĤstu P. roqueforti. To by mohlo vést k vývoji resistentních kmenĤ ve výrobním prostĜedí. Byl také studován efekt propionanu na produkci sekundárních metabolitĤ (kyselina mykofenolová, rugulovasin, echinulin, flavoglaucin). Bylo zjištČno, že produkce sekundárních metabolitĤ závisí na studovaném mikroorganismu. Mezi sekundárními metabolity produkovanými druhy rodu Penicillium nebyly identifikované žádné toxické metabolity. ProtichĤdné výsledky byly nalezeny v literatuĜe, kde nČkteĜí autoĜi zjistili, že konzervanty v sub-inhibujících dávkách stimulují produkci mykotoxinu, zatímco naopak inhibice byla zaznamenána jinými. P. roqueforti a P. brevicompactum produkuje kyselinu mykofenolovou a P. commune rugulovasin. P. roqueforti produkuje pĜi aW 0,97 asi o 10 % víc kyseliny mykofenolové ve srovnání s aW 0.95, pĜiþemž pH prostĜedí produkci významnČ neovlivĖuje. Produkce kyseliny mykofenolové druhem P. brevicompactum byla rovnČž pĜi aW 0,97 vyšší než pĜi aW 0,95 (v prĤmČru o 8 %) a je také podporována vyšším pH (v prĤmČru o 4 % pĜi pH 4,8 ve srovnání s pH 4,4) s výjimkou médií bez pĜidaného propionanu. Produkce rugulovasinu druhem P. commune nebyla významnČ ovlivnČna koncentrací propionanu, pH ani aktivitou vody. Mezi metabolity druhĤ Eurotium byly identifikovány echinulin, flavoglaucin a jiné slouþeniny podobné flavoglaucinu. Produkce echinulinu a flavoglaucinu E. repens a E. rubrum nebyla závislá na aktivitČ vody a pH média, závisela ale na koncentraci propionanu. Se stoupající koncentrací propionanu se snížil rĤst, zatímco naopak produkce metabolitĤ byla významnČ vyšší na médiích obsahující 0,3 % propionanu ve srovnání s médii s nižšími koncentracemi. Jsou tedy nezbytné další studie pĜed definitivním závČrem o úþinku konzervantĤ na produkci metabolitĤ a pro urþení minimální koncentrace slabých kyselin potĜebných na konzervaci pekaĜských výrobkĤ. [10]

2.7. Teorie kapalinové chromatografie Chromatografie se Ĝadí k separaþním metodám, jejichž principem je oddČlování – separace složek pĜítomných ve vzorku. V chromatografii se vzorek vnáší mezi dvČ vzájemnČ nemísitelné fáze, nepohyblivou stacionární a pohyblivou mobilní. Vzorek se umístí na zaþátek stacionární fáze. Pohybem mobilní fáze pĜes stacionární fázi je vzorek touto soustavou unášen. Složky vzorku mohou být stacionární fází zachycovány, a proto se pĜi pohybu zdržují. Více se zdrží složky, které jsou stacionární fází poutány silnČji. Tím se složky od sebe postupnČ separují a dĜíve jsou eluovány složky ménČ zadržované. [18] Kapalinová chromatografie je charakterizována používáním kapaliny jako mobilní fáze. Využívá se k separaci smČsí látek, které jsou netČkavé nebo špatnČ tČkavé a termicky labilní. Mobilní fáze hraje v kapalinové chromatografii aktivní roli. ZmČna vlastností mobilní fáze je v systému s danou stacionární fází hlavním faktorem ovlivĖujícím retenci jednotlivých složek smČsi a tím i jejich vzájemné rozdČlení. Jsou na ni kladeny vysoké požadavky, jako vysoká þistota, nízká viskozita, chemická inertnost, rozpustnost vzorku, kompatibilita s detektorem a pĜijatelná cena. Vliv teploty je malý a vČtšinou kolony pracují pĜi laboratorní teplotČ. 18

Podle uspoĜádání stacionární fáze rozlišujeme kolonovou a tenkovrstvou þi papírovou kapalinovou chromatografii. Klasická kolonová chromatografie nemá potĜebnou úþinnost, ale stala se základem vysoce úþinné (vysokotlaké) kapalinové chromatografie. HPLC je nepoužívanČjší analytická technika. K úþinné separaci je tĜeba použít dostateþnČ malých þástic sorbentu, které kladou prostupující kapalinČ znaþný odpor, a proto je nutno pracovat pĜi vysokém tlaku. NejrozšíĜenČji používaným typem HPLC je chromatografie na obrácených fázích (Reversed-Phase Chromatography – RPC). Stacionární fáze je nepolární a mobilní fáze polární. Retence složek roste s jejich klesající polaritou a zvČtšující se nepolární þástí molekul. Separace na obrácených fázích se hodí pro látky jakékoliv polarity. Je univerzální technikou pro separaci nepolárních, polárních a disociovatelných vzorkĤ. [18, 19, 20, 21] 2.7.1. Instrumentace HPLC Kapalinový chromatograf je tvoĜen následujícími þástmi: zásobníky s mobilní fází, zaĜízení pro odplynČní mobilní fáze, þerpadlo mobilní fáze, smČšovací zaĜízení, dávkovací zaĜízení, uzavĜenou kolonu se stacionární fází, termostat kolon, detektor s prĤtoþnou celou a vyhodnocovací zaĜízení. ýásti, které pĜicházejí do kontaktu se vzorkem nebo mobilní fází, musí být vyrobeny z inertních materiálĤ, aby nedocházelo ke kontaminaci kapaliny nebo ke korozi tČchto þástí. NejbČžnČjšími zásobníky na mobilní fázi jsou sklenČné lahve, které mohou být doplnČny speciálními víky. Mobilní fáze mĤže být uchovávána pod héliem, nebo je do ní hélium vnášenou hadiþkou, což zabezpeþuje dostateþné odplynČní roztoku. ýerpadlo musí zajišĢovat konstantní prĤtok v dostateþnČ velkém rozsahu (0,1 – 10 ml/min) s ménČ než 1 % kolísáním prĤtoku pĜi tlaku až 35 MPa. NejþastČji se používají þerpadla pístová. PrĤtok mobilní fáze musí být bez pulzĤ, což lze znaþnČ omezit použitím zdvojených þerpadel, zaĜízením tlumiþe pulzĤ a programovaným pohybem pístu. Složení mobilní fáze mĤže zĤstávat stálé (izokratická eluce) nebo se bČhem separace mČní (gradientová eluce). Naprogramované smČšovací zaĜízení mĤže s využitím zásobníkĤ rĤzných kapalin pĜipravovat smČs kapalin stálého složení nebo Ĝídit zmČny ve složení výsledné mobilní fáze v prĤbČhu separace pĜi konstantním prĤtoku. Dávkování vzorku injekþní stĜíkaþkou, používané v minulosti, pĜináší nevýhody z hlediska tČsnosti, udržení tlaku a zejména vnášení stop materiálu injekþní stĜíkaþky. V souþasné dobČ bývají injekþní systémy nahrazeny automatickými dávkovaþi. Ty jsou spojené se zásobníkem vzorku, ve kterém jsou umístČny mikronádobky (vialky) uzavĜené pryžovým septem nebo perforovanou zátkou z polypropylenu. Vzorek je dávkován pomocí šesticestných ventilĤ. PĜi dávkování tímto zpĤsobem je tok mobilní fáze kolonou pĜerušen na minimální dobu. K zamezení kontaminace vzorkĤ (crossover, cross contamination) se používá oplach jehly a to jak vnitĜní tak vnČjší oplach. Prostor pro vzorky je vČtšinou temperován (0 – 50 °C) a chránČn pĜed svČtlem. Chromatografická kolona je v podstatČ trubka nebo kapilára rovnomČrnČ naplnČná stacionární fází. PlášĢ kolony musí odolávat pomČrnČ vysokým tlakĤm a vnitĜní povrch musí být dostateþnČ hladký. NejpoužívanČjší materiály k výrobČ kolon jsou nerezová ocel, plasty (polyetheretherketon – PEEK) nebo sklo. Kolony pro analytické využití jsou pomČrnČ krátké (zpravidla 10, 15 nebo 25 cm) s vnitĜním prĤmČrem 2 až 5 mm. NáplĖový materiál pro

19

analytické kolony má prĤmČr 3 až 5 ȝm. Jako ochrana hlavní kolony jsou hojnČ používány pĜedkolony spojené tČsnČ s analytickou kolonou. VČtšina separací HPLC probíhá pĜi laboratorní teplotČ a nevyžaduje termostatování. NČkteré separace se významnČ zlepší zvýšením teploty, což vČtšina nových chromatografĤ umožĖuje. Termostace kolon je také dĤležitá v pĜípadČ, že má teplota velký vliv na kapacitní pomČry a zmČna teploty ovlivní retenci látek (zmČna teploty v letním a zimním období v neklimatizovaných laboratoĜích). Detektory v HPLC by mČly být selektivní pro analyty a málo citlivé na mobilní fázi. Zaznamenávají rozdíl mezi prĤchodem þisté mobilní fáze a mobilní fáze obsahující eluovanou složku. PrĤtoþná cela detektoru musí snést tlak mobilní fáze a udržet tČsnost. Ve spojení s kapalinovou chromatografií se používají tyto typy detektorĤ: fotometrický neboli detektor záĜení UV-VIS (visible, viditelné záĜení), refraktometrický, fluorescenþní a jiné. NejþastČji používaný je detektor fotometrický, který mČĜí absorbanci eluátu vycházejícího z kolony. Jednodušší detektory mČĜí pĜi jedné vlnové délce, složitČjší dovolují nastavení vlnové délky pomocí monochromátoru. Detektory diodového pole (photodiode-array detector, PDA, DAD) snímají zadaný výsek spektra v reálném þase bez pĜerušení chromatografické separace. Zaznamenávají tedy údaje o absorbanci pĜi každé z vybraných vlnových délek v každém okamžiku. UmožĖují ve spolupráci s Ĝídící jednotkou (poþítaþem) detekci látky pĜi jakékoliv zvolené vlnové délce, porovnávat snímaná spektra s knihovnou spekter nebo vypoþítat þistotu píku (identifikace látky). [18, 19, 20, 21, 22] 2.7.2. Analytické vyhodnocení chromatogramu Výsledkem kapalinové chromatografie je chromatogram, tedy závislost signálu detektoru na þase. Pro identifikaci látky je podstatné umístČní maxima píku v chromatogramu, které lze vyjádĜit retenþním þasem, tedy dobou, kterou složka stráví v kolonČ. KvantitativnČ se obsah složky ve vzorku vypoþítá z plochy nebo výšky píku, které rostou s obsahem složky ve vzorku. Výška píku lze snadnČji zmČĜit, ale je mnohem více ovlivnitelná malými zmČnami podmínek pĜi prĤbČhu stanovení. Proto se nejþastČji používá výpoþet z plochy píku, která se urþuje integrací poþítaþovým softwarem. [18] Odezva detektoru je rĤzným zpĤsobem ovlivnČna: objemovou rychlostí toku mobilní fáze celou detektoru, teplotou, napČtím v síti, neþistotami v mobilní fázi, nestabilitou lampy detektoru, apod., obecnČ náhodným šumem. Šum signálu jsou zjednodušenČ všechny zmČny výstupního signálu, které nejsou zpĤsobeny elucí složky vzorku. MČĜený signál se tedy skládá z užiteþného, koncentrací analytu podmínČného signálu a z poruch, které jsou zpĤsobeny náhodnými nebo soustavnými vlivy v pĜenosovém kanálu. Šum je faktor, který limituje citlivost detektoru. Ke kvalitativnímu urþení obvykle musí být výška píku trojnásobku šumu (mez detekce) a ke kvantitativnímu stanovení desetinásobek šumu (dále viz kapitola 2.9.2). Charakteristickou veliþinou pro každou separovanou látku v daném systému je retenþní (eluþní) þas tR nebo retenþní objem VR. Retenþní þas je doba, která uplyne od nástĜiku vzorku do dosažení maxima píku dané složky a retenþní objem je proteklý objem kolonou za tuto dobu. Dále je definován mrtvý retenþní objem kolony VM a jemu odpovídající mrtvý retenþní þas tM, což je retenþní þas složky (inertu), která není v kolonČ zadržována a pohybuje se stejnou rychlostí jako mobilní fáze (Obr. 6). Vztah mezi tČmito veliþinami definuje kapacitní faktor k (kapacitní pomČr). Ten udává, kolikrát je eluþní objem separované látky vČtší než mrtvý objem. 20




   

Kapacitní pomČr je mírou retence solutu v kolonČ. ýím vČtší je hodnota kapacitního faktoru, tím více je solut v kolonČ zadržován a je eluován pozdČji. Jak vyplývá z definice, kapacitní pomČr je bezrozmČrné þíslo. [19, 22, 23]

Obr. 6: Chromatografický záznam analytu a nesorbujícícho se inertu [24]

2.8. Analýza kyseliny propionové Pro kvantitativní stanovení kyseliny propionové se používají metody vysokoúþinné kapalinové chromatografie, plynové chromatografie (Gas Chromatography, GC) nebo kapilární zónové elektroforézy (Capillary Zone Electrophoresis, CZE). Kyselina propionová patĜí mezi tČkavé kyseliny a je vhodná pro stanovení plynovou chromatografií. Výhoda GC je v její rychlosti, pĜesnosti, citlivosti a jednoduchosti kvantifikace. Pro pĜípravu vzorku se ve spojení s GC obvykle používá metoda destilace s vodní parou a pro zjednodušení a zrychlení analýzy byly zavedeny metody extrakce v rozpouštČdle. Kyselina propionová mĤže být také separována a identifikována s využitím tenkovrstvé kapalinové chromatografie. Detekþní limit této metody je 50 mg.kg-1 kyseliny propionové. Pro rychlou identifikaci mĤže být také použita papírová chromatografie s acidobazickým indikátorem pro zviditelnČní bodĤ. [16, 25, 26, 27] 2.8.1. HPLC analýza organických kyselin Metoda HPLC se považuje za jednu z nejvýkonnČjších metod instrumentální analýzy potravináĜských aditiv. UmožĖuje rychlé, citlivé a jednoduché kvantitativní stanovení velkého množství slouþenin a obvykle eliminaci kroku derivatizace. Je vhodná pro kvantitativní stanovení celé skupiny pĜíbuzných slouþenin souþasnČ v jedné analýze. Další výhodou HPLC je pomČrnČ jednoduchá možnost automatizace. Použití automatického dávkovaþe zjednodušuje analýzu nČkolika vzorkĤ, pomáhá snížit náklady a analýzy mohou být provádČny pĜes noc. Proto se HPLC stala základním kamenem analýzy potravin.

21

HPLC je nejvhodnČjší volba pro stanovení organických kyselin díky její rychlosti (chromatogram obvykle zaznamenává 15 minut), citlivosti (nízký detekþní limit), selektivitČ (výtČžnost obvykle blízká 100 %) a spolehlivosti (koeficient odchylky je obvykle menší než 5 %). Také pĜíprava vzorku je vČtšinou relativnČ jednoduchá a cena analýzy je docela nízká. NejþastČji se pro stanovení organických kyselin v potravinách používají UV-VIS detektory, v menší míĜe také detektory indexu lomu nebo vodivostní detektory. Pro nederivatizované kyseliny se používá detekce pĜi 206 – 220 nm, u které se obvykle nevyskytuje žádný vážný problém se stanovením. PĜi použití PDA detektoru je stanovení organických kyselin jednodušší díky kontrole þistoty píku, protože nástĜik jednoho vzorku poskytuje veškeré spektrální informace pro dané rozpČtí vlnových délek, které jsou uloženy pro pozdČjší zpracování. NejpoužívanČjší technikou je iontovČ výmČnná chromatografie a chromatografie na reverzních fázích. Lepší tvar píkĤ je dosažen použitím ionovýmČnné chromatografie, ale rychlejší analýza použitím kolon s reverzní fází. VýbČr metody je v každém pĜípadČ závislý na typu stanovované kyseliny, obsahu této kyseliny a povahy potraviny, ve které je obsažena. [1] Chromatografie na reverzní fázi VČtšina používaných stacionárních fází je založena na oktadecylsilanu (C18 kolony). Typicky používané mobilní fáze jsou voda, pufr o daném pH a iontové síle a smČsi vody s mísitelným organickým modifikátorem, napĜ. methanolem nebo acetonitrilem. Oktadecylsilan je nepolární stacionární fáze, která dovoluje separaci relativnČ polárních látek (vþetnČ organických kyselin) použitím vodné mobilní fáze o nízkém pH, které zabraĖuje ionizaci rozpuštČných slabých kyselin. PĜi tČchto podmínkách je retence Ĝízená hydrofobními interakcemi mezi uhlíkovým zbytkem solutu (analyzované kyseliny) a uhlíkovými ĜetČzci stacionární fáze. Základem této hydrofobní chromatografie je teorie, podle které kapacitní faktor a tedy i retence solutu závisí na pH mobilní fáze, které ovlivĖuje jeho ionizaci. Kapacitní faktor iontových slouþenin se zvyšuje s koncentrací soli nebo iontovou silou mobilní fáze. Tedy þím více je analyzovaná kyselina disociovaná, tím pozdČji je eluovaná. Kapacitní faktor se také zvyšuje u vysoce hydrofobních kyselin, které mají dlouhý alifatický ĜetČzec nebo aromatický kruh. Mohou vznikat i derivatizací, napĜ. esterifikací. Pro analýzu tČchto kyselin se používá mobilní fáze s pĜídavkem organického modifikátoru (methanol, acetonitril), který kapacitní faktor snižuje. Nejvíce používaný typ kolony pro tyto úþely je C18 5 µm, 250 x 4 mm, pĜes který prochází mobilní fáze 10-3 – 10-1 M KH2PO4/H3PO4 s pH 2,2 – 4,2. Nederivatizované kyseliny vyžadují ménČ než 5 % organického modifikátoru, zatímco derivatizované a hydrofóbní kyseliny 35-85 % acetonitrilu nebo methanolu a izokratickou nebo gradientovou eluci. [1] PĜíprava vzorku pro HPLC PĜíprava vzorku obvykle zahrnuje pouhé rozpuštČní ve vhodném rozpouštČdle nebo v mobilní fázi pro kapalinovou chromatografii. RozpuštČní je obvykle následováno centrifugací nebo pĜefiltrováním pĜes filtry s póry o velikosti 0,45 – 0,22 µm. Vysoce komplexní substráty vyžadují odstranČní potenciálních interferujících látek a obþas také zvýšit koncentraci analytu a tím i pĜesnost a citlivost stanovení. Organické kyseliny se mohou izolovat z pevné matrice dvČma hlavními zpĤsoby: • destilace s vodní parou, která mĤže být následovaná extrakcí tČkavých kyselin z vodného destilátu organickými rozpouštČdly (zkoncentrování),

22

•

pĜímá extrakce vhodným rozpouštČdlem. Volba rozpouštČdla závisí na rozpustnosti kyseliny, typu vzorku, a na ostatních spoleþnČ extrahovaných složkách. Mezi vhodná rozpouštČdla patĜí voda (obþas i 60 °C teplá voda), která mĤže být okyselená nebo s pĜídavkem nepolárního rozpouštČdla, samostatné nepolární rozpouštČdlo (ethanol, acetonitril, diethylether, chloroform, methanol) nebo jejich smČsi. [1] 2.8.2. Konkrétní postupy stanovení kyseliny propionové HPLC

V Japonsku byla v roce 1998 publikována studie, která se zabývala stanovením kyseliny propionové v potravinách. Kyselina propionová byla nalezena v malém množství vzorkĤ chleba, koláþĤ, mléþných produktĤ a sojových omáþkách, a dále ve všech vzorcích rybích a ústĜicových omáþek. Vzorky byly upraveny destilací s vodní parou a destilát byl pĜeþištČn na C18 kolonkách (MAXI-CLEAN SAX a Sep-Pak Vac C-18). Kyselina propionová byla separována na kolonČ Inertsil ODS-3 s mobilní fází acetonitril:voda (v pomČru 6:94) s pH 2,5 a byla detekována pĜi 210 nm. VýtČžnosti pĜidané kyseliny propionové do rĤzných druhĤ potravin þinily 84 – 98 %. Mez detekce byla stanovena na 10 µg.g-1. [28] Další studie byla publikována v roce 1999 opČt v Japonsku. Zabývala se stanovením kyseliny propionové, propionanu vápenatého a sodného v krmivu pro zvíĜata. Vzorek byl upraven destilací s vodní parou s použitím chloridu sodného a kyseliny fosforeþné. Destilovaná kyselina propionová byla stanovena HPLC s UV detekcí pĜi 210 nm. Byla separovaná na kolonČ ULTRON PS-80H (8 x 300 mm) s 0,1% obj. fosforeþnou kyselinou jako mobilní fází. VýtČžnost u tĜech druhĤ krmiv s obsahem kyseliny propionové 0,05, 0,15 a 0,3 % byla v prĤmČru 91,4 % a relativní odchylka 3,8 %. V šesti laboratoĜích byla také provedena mezilaboratorní studie s krmivem, které obsahovalo 0,15 % kyseliny propionové. PrĤmČrná výtČžnost byla 98,7 % a koeficienty opakovatelnosti a reprodukovatelnosti byly 4,2 % a 4,6 %. [29] V roce 2006 byla v ýínČ vyvinuta metoda rychlého stanovení organických kyselin (mravenþí, mléþné, octové, jantarové a propionové) v anaerobním médiu. Jako mobilní fáze byla použita smČs acetonitrilu a fosfátového pufru (KH2PO4, 0,02 mol.l-1, pH 2,8), rychlost toku a podíl organického rozpouštČdla byly kontrolovány programem gradientové eluce. Vlnová délka detekce byla 215 nm, teplota kolony 30 °C a þas analýzy 4 minuty. Relativní smČrodatná odchylka (RSD) byla stanovena na 0,3 – 1,3 %, výtČžnost 95,0 – 100,8 % a všechny korelaþní koeficienty byly menší než 0,9998. [30] Ve stejné zemi byla v roce 2007 vyvinuta metoda stanovení organických kyselin, které vznikají ve fermentaþním systému kyseliny propionové (šĢavelová, mravenþí, mléþná, octová, jantarová a propionová). Kyseliny byly separovány s použitím kolony dC(18) s mobilní fáze obsahující 10 mmol.l-1 fosfátového pufru (KH2PO4, pH 2,8) a acetonitrilu (95:5) pĜi rychlosti toku mobilní fáze 1,00 ml.min-1 a teplotČ kolony 25 °C. Kyseliny byly detekovány pĜi vlnové délce 215 nm, doba analýzy nepĜekroþila 8 minut. VýtČžnosti byly v rozsahu 99 – 102 %, relativní odchylka 0,6 – 1,7 %. [31] Následující metody jsou popsány v knize Food analysis by HPLC. V pomeranþovém džusu byly stanoveny kyseliny šĢavelová, chinová, vinná, jableþná, isocitronová, citronová, askorbová, fumarová, jantarová, propionová a isoakonitová. Separace byla provedena na kolonČ YMC-Pack ODS-AQ 5 µm (250 x 4,6 mm) s mobilní fází 20 mM KH2PO4 (pH 2,8) a kyseliny byly detekovány pĜi vlnové délce 214 nm. V medu byly stanoveny kyseliny galakturonová, glukonová, vinná, pyrohroznová, chinová, jableþná, isocitronová, jantarová, fumarová, propionová, dimethylglycerová, 2-oxopentanová, glutarová. Separace byla prove23

dena na kolonČ Spherisorb ODS 5 µm (250 x 4,6 mm) s mobilní fází H2SO4 (pH 2,45) a kyseliny byly detekovány pĜi vlnové délce 210 nm. [1] Cílem studie publikované v USA v roce 1993 bylo stanovení organických kyselin v jogurtu v jedné analýze (orotové, citronové, pyrohroznové, mléþné, moþové, mravenþí, octové, propionové, máselné a hippurové). Jogurty byly vyrobeny pĜi laboratorních podmínkách a vzorky byly analyzovány bČhem fermentace a po skladování pĜi 4 °C. Byly srovnány dva postupy extrakce: acetonitril a voda a 0,1 N H2SO4. VýtČžnost kyseliny propionové u obou metod byla 90 %. HPLC stanovení bylo provedeno s použitím Waters sestavy (pumpa 501, automatický dávkovaþ 715, UV-VIS detektor 410). Separace byla provedena na AMINEX HPX-87H ionovýmČnné kolonČ (300 x 7,8 mm). Teplota kolony byla 65 – 66 °C. Mobilní fáze byla pĜipravena 0,0075 N H2SO4, rychlost toku byla 0,7 ml.min-1 a detekce pĜi vlnové délce 210 nm. [32] V Itálii byla v roce 1995 provedena studie, která se zabývala stanovením pĜíslušných kyselin (citronová, jableþná, mléþná, mravenþí, octová, propionová, máselná, valerová a pyroglutamová) v cukerných výrobcích (cukerné sirupy, vyloužené cukerné Ĝízky). Stanovení bylo provedeno použitím Dionex ionového chromatografu a srovnáno se standardní HPLC a enzymovou analýzou. Analýza byla provádČna na kolonČ Biorad HPX-87H s izokratickou elucí pĜi teplotČ 50 °C. Byla použita mobilní fáze 5 mM H2SO4 a rychlost toku 0,6 ml.min-1. Detekce probíhala pĜi vlnové délce 210 nm. Pomocí použitých metod nedochází k separaci kyseliny propionové a pyroglutamové a obČ kyseliny jsou eluovány v jednom píku. [33] V roce 2006 probČhla v USA studie zamČĜená na analýzu organických kyselin (mravenþí, pyrohroznová, jableþná, isojableþná, mléþná, octová, orotová, citronová, moþová, propionová, máselná, vinná, isovinná) v kozích sýrech Monterey Jack. Vzorky sýru byly zmraženy tekutým dusíkem a homogenizovány. Poté bylo 3,5 g zmraženého pĜáškového vzorku rozpuštČno v 20 ml roztoku mobilní fáze a mícháno 1 hodinu. Vzorek byl zcentrifugován, zfiltrován a poté znovu zfiltrován pĜes 0,45 µm membránový filtr. Stanovení probíhalo na HPLC systému (Hewlet-Packard) s detektorem diodového pole. Byla použita kolona PDS Hypersil 5 µm (125 x 4 mm) a mobilní fáze 0,5 % (NH4)2HPO4 s rychlostí toku 0,3 ml.min-1. Detekce probíhala pĜi vlnové délce 214 nm. [34] 2.8.3. Stanovení kyseliny propionové GC Následující metoda byla vyvinuta ve Spojených státech v roce 1987 pro chléb obsahující propionan vápenatý, ale mĤže být použitá také pro propionan sodný nebo draselný a rĤzné pekaĜské výrobky. Pro analýzu byly pĜipraveny vzorky chleba obsahující známé množství kyseliny propionové. Nejprve byly vzorky chleba vysušeny na vzduchu a poté pomlety, ale protože je pH chleba blízké pKa kyseliny propionové, pokusy dávaly nižší výsledky a byl zjištČn znaþný úbytek propionanu pĜi sušení. Proto byly vzorky analyzovány bez vysušení. PĜi této metodČ je samozĜejmČ nezbytné zvážit vzorek rychle po mletí, nebo ho chránit pĜed ztrátou vlhkosti v uzavĜené nádobČ. Chléb byl zhomogenizován a propionan byl 5 minut extrahován v mixéru do 0,050 M roztoku kyseliny mravenþí s pĜídavkem známé koncentrace interního standardu kyseliny máselné. Filtrát byl pĜímo analyzován plynovou chromatografií. Chromatografická separace byla provedena na kolonČ Carbopack C. Z množství propionanu pĜidaného do chleba a stanoveného plynovou chromatografií byla stanovena relativnČ velká chyba, která prezentuje hlavnČ úbytek propionanu vypaĜením bČhem peþení. Ztráta byla kolem 25 % u bílého a žitného chleba a kolem 20 % u celozrnného 24

chleba. U každého vzorku chleba byla také zmČĜena koncentrace kyseliny propionové v celém bochníku, jen ve stĜídce a jen v kĤrce. Podle oþekávání bylo v kĤrce kvĤli vysoké teplotČ bČhem peþení stanoveno ménČ kyseliny propionové než ve stĜídce (asi o 40 % u všech typĤ chlebĤ). Také byl studován vliv þasu extrakce na extrahované množství propionanu (v þasech 1 až 30 minut). Bylo zjištČno, že extrakce probíhá okamžitČ a koncentrace kyseliny propionové ve vodní fázi se po jedné minutČ extrakce dále nezvyšuje. Pro postup analýzy je doporuþeno 5 minut, ale tato doba mĤže být pravdČpodobnČ podle požadavku zkrácena. Použitím 0,050 M vodného roztoku kyseliny mravenþí jako extrakþního þinidla se efektivnČ pĜemČní soli na volnou kyselinu propionovou pro chromatografii a navíc slouží k minimalizaci adsorpce na kolonČ a jiných souþástech chromatografického systému. PĜesnost stanovení byla vyhodnocena na 0,035 – 0,226 %. Minimální detekovatelná koncentrace kyseliny propionové ve vodní fázi injektované do chromatografu byla 0,2 mg.l-1. To znamená, že pĜi hmotnosti 6 g chleba extrahovaným do 50 ml roztoku mĤže být analýza uskuteþnČna se vzorkem obsahujícím ménČ než 10 mg.kg-1 propionanu sodného. [25] V roce 1981 byla v Japonsku publikovaná studie zamČĜená na stanovení kyseliny propionové v peþivu. Ke vzorku byla pĜidána smČs dichlormethanu a kyseliny mravenþí jako extrakþní þinidlo a vzorek byl homogenizován 3 minuty elektrickým mixérem. Po filtraci pĜes sklenČný filtr byl filtrát analyzován isotermální plynovou chromatografií. Byla použita sklenČná kolona plnČná 5 % SP-1000. Jako interní standard byla použita kyselina isomáselná, protože se v peþivu nenachází a chemickými vlastnostmi se podobá kyselinČ propionové. Nejnižší detekovatelná koncentrace byla 100 mg.kg-1. VýtČžnost byla stanovena metodou pĜídavku a pohybovala se od 96 do 102 %. Výsledky byly porovnány se stanovením metodou destilace s vodní parou. Byly zjištČny velmi tČsné výsledky obou metod a použitá metoda je tedy stejnČ pĜesná jako metoda destilace s vodní parou. Dále byla metoda srovnána s metodou extrakce etherem, která ale vykazovala nižší výtČžky. [26] 2.8.4. Stanovení kyseliny propionové CZE Studie publikovaná v Nizozemí v roce 2001 byla zamČĜená na extrakci a stanovení propionanu sodného v chlebu. Tato metoda je vhodná pro stanovení propionanĤ v komplexní matrici. Pro analýzu byl použit laboratornČ pĜipravený chléb bez a s pĜídavkem propionanu sodného (propionan sodný byl pĜed pĜípravou tČsta rozpuštČn ve vodČ). Ke zváženému vzorku chleba byl pĜidán desetinásobek hmotnosti vody a po sonikaci a filtraci byl vzorek odpovídajícím zpĤsobem naĜedČn a dávkován. Stanovení probíhalo pomocí systému P/ACE 2000 HPCE s kapilárou Beckman eCAP 75 µm s celkovou délkou 46,7 cm. Vlnová délka UV detektoru byla nastavena na 214 nm. Pro identifikaci píku propionanu byla použita jeho efektivní mobilita a kvantifikace probíhala v pĜímém UV módu. Jedním z možných problémĤ analýzy propionanu by mohla být pĜítomnost interferujících slouþenin v chlebové matrici. Proto musí být známy efekty matrice pro volbu elektrolytu. Za úþelem zjištČní vlivu doby extrakce na stanovenou koncentraci propionanu byla sonikace provedena v þasech 10, 20, 30, 40 a 50 minut. ZjištČná koncentrace propionanu stoupala od 1634 do 1809 mg.kg-1 a výtČžnost od 73,9 do 81,8 %. Dále bylo nutné zjistit, zda je 80% výtČžnost spojena s distribuþní rovnováhou propionanu mezi chlebovou matricí a vodní fází, nebo zda þást propionanu zmizí bČhem peþení. Byla provedena analýza chleba peþeného pĜi 120 a 225 °C s prostou extrakcí (sonikace 30 minut) a 5krát opakovaným 25

extrakþním procesem. PĜi opakované extrakci byla sonikace provádČna 10 minut, filtraþní koláþ byl znovu rozpuštČn ve vodČ a postup opakován. Filtráty byly slity dohromady a analyzovány. Z výsledkĤ vyšlo najevo, že teplota peþení nemá na výtČžnost propionanu vliv a tedy nedochází ke ztrátám bČhem peþení. PrĤmČrná výtČžnost opakované extrakce byla stanovena na 95 %. [27]

2.9. Validace analytické metody Validaci mĤžeme definovat jako proces, jehož cílem je demonstrovat a dokumentovat kvalitu analytické metody ustanovením definovaných kriterií a mČĜením jejich hodnot. ZjednodušenČ Ĝeþeno, validace je ovČĜení platnosti zvoleného analytického postupu (metody). Používá se vždy pĜi validaci nové metody, pĜi pĜevodu validované metody (napĜ. z vývojové do pĜijímací laboratoĜe, publikované validované metody), pĜi kontrole zpĤsobilosti systému a pĜi revalidaci metody, kdy jsou podmínky revalidace striktnČ stanoveny. [22] 2.9.1. Druhy validací Validace metody v rámci jedné laboratoĜe se nazývá interní (vnitĜní) validace. Interní validace, jejímž cílem je na omezeném poþtu vzorkĤ stanovit, zda zvolená analytická metoda je vhodnou metodou pro plnou validaci, se nazývá prĤzkumová validace. ZamČĜuje se na vyhodnocení delikátních validaþních parametrĤ jako je selektivita a robustnost a na stanovení opakovatelnosti na omezeném poþtu vzorkĤ. Po prokázání vhodnosti prĤzkumové validace následuje plná validace, jejímž cílem je demonstrovat vhodnost metody k zamýšlenému použití vyhodnocením všech požadovaných validaþních parametrĤ. PĜi zavedení publikované validované analytické metody (resp. validované metody v jiné laboratoĜi) se používá tzv. validace pĜi pĜevodu metody a obvykle zahrnuje stanovení správnosti laboratoĜe a opakovatelnosti. K ovČĜení platnosti dĜíve plnČ validované metody se používá kontrola zpĤsobilosti metody a zahrnuje pouze kontrolu kalibraþní pĜímky (linearita a citlivost). Existují-li již dĜíve namČĜená data, která byla namČĜena za stejných podmínek, mĤže se použít tzv. retrospektivní validace, která umožĖuje vyhodnotit jeden z nejdĤležitČjších validaþních parametrĤ – opakovatelnost. Externí (vnČjší) validace zahrnuje interní validaci spoleþnČ s validací metody srovnáním výsledkĤ metody z více laboratoĜí (mezilaboratorní porovnávací zkoušky) a zahrnuje výpoþet reprodukovatelnosti metody. [22] 2.9.2. Vybrané validaþní parametry Opakovatelnost Opakovatelnost metody je definována jako tČsnost shody mezi navzájem nezávislými výsledky zkoušek získanými za podmínek opakovatelnosti. To jsou podmínky, kdy se navzájem nezávislé výsledky zkoušek získají opakovaným použitím téže zkušební metody na identickém materiálu, v téže laboratoĜi, týmž pracovníkem za použití týchž pĜístrojĤ a zaĜízení, bČhem krátkého þasového rozmezí.

26

VýtČžnost metody VýtČžnost neboli recovery udává pomČr koncentraþního množství analytu získaného danou analytickou metodou k pĜijaté referenþní hodnotČ. Hodnota výtČžnosti se mĤže vyjadĜovat jako desetinný zlomek nebo v procentech. V pĜípadČ, že srovnávací vzorek není dostupný, použije se referenþní hodnota certifikovaného referenþního materiálu, referenþní hodnota získaná jinou nezávislou metodou nebo se použijí vzorky s pĜídavkem analytu (standardní pĜídavek). Vnesení pĜídavku by se mČlo provést v takovém kroku analytického postupu, aby byl postižen celý pracovní postup. Linearita Linearita je chápána jako pĜímková závislost mezi dvČma náhodnými promČnnými, tj. analytickým signálem a koncentrací analytu. TČsnost vzájemné závislosti dvou náhodných promČnných charakterizuje korelaþní koeficient r. PĜi lineární závislosti nabývá hodnoty +1 a þím více se blíží jedné, tím je závislost obou promČnných tČsnČjší. Hodnota korelaþního koeficientu nesmí klesnout po hodnotu 0,98. Lineární závislost dvou náhodných promČnných je matematicky vyjádĜena obecným vztahem:     kde parametr a je úsek (posunutí), parametr b je smČrnice kalibraþní pĜímky (regresní koeficient). PĜi výpoþtu hodnot koeficientĤ a, b se vychází z platnosti modelu regresní závislosti, který pĜedpokládá konstantní rozptyl pro všechny hodnoty závisle promČnné, tedy použitím metody nejmenších þtvercĤ. Mez detekce metody Mez detekce (limit of detection, LOD) odpovídá koncentraci, pro kterou je analytický signál statisticky významnČ odlišný od šumu. Udává tedy skuteþnou úroveĖ signálu, která ještČ umožĖuje detekci koncentrace. U separaþních metod se používá k výpoþtu meze detekce velikost hodnoty signálu slepého pokusu. Z chromatogramu slepého pokusu se urþí maximální kolísání základní linie v oblasti dané 20násobkem pološíĜky píku stanovovaného analytu. Odezva meze detekce se potom stanoví jako 3násobek kolísání základní linie. Koncentrace na mezi detekce se vypoþítá z koncentraþní závislosti výšky chromatografického píku a ne plochy, jak je obvyklé. Mez stanovitelnosti Mez stanovitelnosti (limit of quantitation, LOQ) je definována jako nejnižší množství analytu ve vzorku, které jsme schopni stanovit se stanovenou pĜesností. U separaþních metod se používá k výpoþtu meze stanovitelnosti velikost hodnoty signálu slepého pokusu. Postup výpoþtu meze stanovitelnosti je podobný výpoþtu meze detekce. Z chromatogramu slepého pokusu se urþí maximální kolísání základní linie v oblasti dané 20násobkem pološíĜky píku stanovovaného analytu. Odezva meze detekce se potom stanoví jako 10násobek kolísání základní linie. Koncentrace na mezi detekce se vypoþítá z koncentraþní závislosti výšky chromatografického píku a ne plochy, jak je obvyklé. [22]

27

2.10. Shewhartovy regulaþní diagramy ShewhartĤv regulaþní diagram slouží ke statistické regulaci procesu. Pracuje s údaji získanými v pĜibližnČ pravidelných intervalech, které mohou být urþeny v þase (napĜ. v hodinách), nebo v množství (každá dávka). ShewhartĤv regulaþní diagram je graf hodnot dané charakteristiky podskupiny proti poĜadovému þíslu podskupiny. PĜi hodnocení, zda výrobní proces (mČĜení) je þi není ve statisticky zvládnutém stavu, je referenþní hodnotou obvykle prĤmČrná hodnota uvažovaných údajĤ. V diagramu je referenþní hodnota zakreslena jako centrální pĜímka (Center Line, CL). Regulaþní diagram má dvČ statisticky stanovené regulaþní meze, po jedné na každé stranČ centrální pĜímky, které se nazývají horní regulaþní mez (Upper Control Limit, UCL) a dolní regulaþní mez (Lower Control Limit, LCL). Regulaþní meze jsou ve vzdálenosti 3ı na každou stranu od centrální pĜímky, kde ı je smČrodatná odchylka sledované statistiky a charakterizuje variabilitu uvnitĜ podskupiny, která se používá jako míra náhodného kolísání. Nezahrnuje tedy kolísání od jedné podskupiny ke druhé, ale pouze složky uvnitĜ podskupin. K výpoþtu ı obvykle slouží výbČrová smČrodatná odchylka. Regulaþní meze 3ı nazývají „akþními mezemi“, protože pĜi objevení urþitého bodu mimo meze by se mČlo neprodlenČ zasáhnout. NČkdy je prospČšné nakreslit na diagram také meze 2ı. Pak každá výbČrová hodnota, která padne mimo meze 2ı, mĤže sloužit jako varování, že hrozí situace, kdy bude proces statisticky nezvládnutým. Regulaþní meze 2ı jsou proto þasto nazývány „varovnými mezemi“. PĜi aplikaci regulaþních diagramĤ jsou možné dva typy chyb. Prvním typem je chyba prvního druhu, která nastává, zĤstane-li pĜíslušný proces ve statisticky zvládnutém stavu, ale bod náhodou padne mimo regulaþní meze. V dĤsledku toho se nesprávnČ vyvozuje, že proces již není ve statisticky zvládnutém stavu a vznikají náklady na pokus nalézt pĜíþiny neexistujícího problému. Druhým typem je chyba druhého druhu. Ta nastává, je-li výrobní proces nebo mČĜení ve statisticky nezvládnutém stavu, ale zanesený bod leží náhodou uvnitĜ regulaþních mezí. V tomto pĜípadČ se nesprávnČ vyvozuje, že výrobní proces je ve stavu statisticky zvládnutém a pak vznikají náklady spojené se selháním schopnosti odhalit nárĤst neshodných jednotek. O velikosti rizika chyby druhého druhu lze vyvodit jen obecné závČry. ShewhartĤv systém bere v úvahu pouze chybu prvního druhu a pĜi mezích 3ı je velikost této chyby 0,3 %. To znamená, že pokud je výrobní proces ve statisticky zvládnutém stavu, uvnitĜ regulaþních mezí 3ı bude pĜibližnČ 99,7 % hodnot pĜíslušných podskupinám. Padne-li zakreslená hodnota mimo jednu z regulaþních mezí nebo vytváĜí-li Ĝada hodnot neobvyklá seskupení (napĜ. dlouhá posloupnost nízkých hodnot), nemĤže být nadále stav statistické regulace považován za vyhovující. Nastanou-li takové situace, zapoþne se se zjišĢováním vymezitelné pĜíþiny, aby se výrobní proces mohl zastavit nebo upravit. Jakmile je vymezitelná pĜíþina jednou zjištČna a odstranČna, výrobní proces mĤže pokraþovat. Jak bylo uvedeno výše, pro chybu prvního druhu nemĤže být, až na Ĝídké pĜípady, zjištČna žádná vymezitelná pĜíþina. Potom se musí dokázat, že nastal málokdy se vyskytující jev, urþitá náhodná pĜíþina, která má za následek, že hodnota leží mimo regulaþní meze, pĜestože je výrobní proces statisticky zvládnut. [35]

28

3. EXPERIMENTÁLNÍ ýÁST 3.1. Použité chemikálie a roztoky 3.1.1. Chemikálie • • • • • • • • • •

voda demineralizovaná propionan sodný CH3CH2COONa (purrum > 99 %, Fluka, Švýcarsko) kyselina propionová CH3CH2COOH (p.a. > 99.5 %, Fluka, Švýcarsko) dihydrogenfosforeþnan draselný KH2PO4 (Merck, NČmecko) kyselina fosforeþná H3PO4 (Dorapis, ýeská republika) hexakyanoželeznatan draselný K4[Fe(CN)6].3H2O (Lachema, ýeská republika) síran zineþnatý ZnSO4.7H2O (Lachema, ýeská republika) síran hoĜeþnatý MgSO4.7H2O (Chemapol, ýeská republika) kyselina sírová H2SO4 (Lach-Ner, ýeská republika) helium (Messer, Rakousko) 3.1.2. Roztoky

• • • • • •

mobilní fáze: 0,005 mol.l-1 roztok dihydrogenfosforeþnanu draselného (pH = 2,8) roztok Carreze I a II standardní zásobní roztok propionanu sodného o koncentraci 1 g.l-1 kys. propionové standardní roztoky propionanu sodného o koncentracích 10, 20, 25, 50, 100, 200 a 400 mg.l-1 kyseliny propionové standardní roztoky kyseliny propionové o koncentracích 10, 20 a 30 mg.l-1 roztok kyseliny sírové o koncentraci 0,5 mol.l-1 3.1.3. Použité pomĤcky a pĜístroje

• • • • • • • • •

• • • •

zaĜízení na demineralizaci vody (Millipore Milli-Q Plus, USA) analytické váhy (Sartorius BP210S, Sartorius A200S, NČmecko) pĜedvážky (Sartorius LC1201S, NČmecko) ultrazvuková lázeĖ (Sonorex Bandelin TK30, NČmecko) pH-metr (Knick pH-Meter 766 Calimatic, NČmecko) aW metr (AW Sprint TH-500, Novasina, Švýcarsko) laboratorní mixér (Braun, NČmecko) domácí pekárna (DOMO B3955, Belgie) HPLC sestava – chromatograf Waters s detektorem diodového pole: automatický dávkovaþ 717 Plus, þerpadlo 600 Controller, termostatovaná kolonová skĜíĖ, detektor PAD 2996. Tento systém byl ovládán pomocí softwaru Millenium32 (version 3.20, Waters, USA) analytická kolona XBridge C18 3 x 150 mm, 3,5 µm (Waters, USA) pĜedkolona XBridge 20 x 4,6 mm (Waters, USA) membránový filtr 0,45 µm bČžné laboratorní sklo a vybavení

29

3.2. Popis vzorkĤ Toustový chléb svČtlý – Tesco - Chléb pšeniþný. - Složení: pšeniþná mouka, voda, droždí, rostlinný olej, jedlá sĤl s jódem, konzervant E282, enzymy, látka zlepšující mouku: kyselina askorbová. - Informace pro alergiky: Výrobek obsahuje výrobky z obilovin obsahujících lepek. - Vyrobeno pro Tesco Stores ýR, a.s., Vršovická 1527/68b, 100 00 Praha 10. - Výrobce: UNITED BAKERIES a.s., Bohunická 24, 619 00 Brno. - Hmotnost: 500 g. Toustový chléb tmavý – Tesco - Chléb pšeniþný. - Složení: pšeniþná mouka, voda, pekaĜská smČs (pšeniþná mouka celozrnná, jedlá sĤl, karamelový slad, cukr, kmín drcený, regulátor kyselosti: octan vápenatý, emulgátory: E471, E472e, jeþná sladová mouka, enzym, látka zlepšující mouku: kyselina askorbová, pšeniþná mouka, emulgátor: sójový lecithin, sójová mouka), droždí, jedlá sĤl s jódem, rostlinný olej, konzervant E282. - Informace pro alergiky: Výrobek obsahuje výrobky z obilovin obsahujících lepek, výrobky ze sóji. - Vyrobeno pro Tesco Stores ýR, a.s., Vršovická 1527/68b, 100 00 Praha 10. - Výrobce: UNITED BAKERIES a.s., Bohunická 24, 619 00 Brno. - Hmotnost: 500 g. Toustový chléb svČtlý – Spar - Chléb pšeniþný krájený. - Složení: pšeniþná mouka (79 %), voda, rostlinný olej, droždí, cukr, sĤl, sušený rostlinný olej, kvasný ocet, laktóza, jeþná sladová mouka, emulgátory E472e, sójový lecitin, E471, pšeniþný lepek, sójová mouka, konzervant E282, mléþné proteiny, glukóza, bobová mouka, látka zlepšující mouku: kyselina askorbová. - Alergeny: pšeniþná mouka, jeþná sladová mouka, sójová mouka, pšeniþný lepek, sójový lecitin, výrobky z mléka. - Výrobce: UNITED BAKERIES a.s., Bohunická 24, 619 00 Brno. - Hmotnost: 500 g. Toustový chléb tmavý – Spar - Chléb pšeniþný krájený. - Složení: pšeniþná mouka (68 %), voda, pšeniþná mouka celozrnná (11 %), rostlinný olej, droždí, cukr, sĤl, kvasný ocet, kmín, pražený slad, jeþná sladová mouka, sušená mléþná syrovátka, emulgátory: E472e, sójový lecitin, E471, pšeniþný lepek, sójová mouka, konzervant: E282, glukóza, bobová mouka, rostlinný tuk, látka zlepšující mouku: kyselina askorbová. - Alergeny: pšeniþná mouka, pšeniþný lepek, sójový lecitin, výrobky z mléka, výrobky ze sladu, sójová mouka. - Výrobce: UNITED BAKERIES a.s., Bohunická 24, 619 00 Brno. - Hmotnost: 500 g. 30

Formanský chléb – Fr. Odkolek - Chléb pšeniþný, krájený. - Složení: celozrnná pšeniþná mouka (34 %), pšeniþná mouka, voda, droždí, zlepšovací pĜípravek (þásteþnČ pražená sladová mouka jeþná a pšeniþná, dextróza, pšeniþná mouka, pšeniþná a kukuĜiþná instantní mouka, sušená mléþná syrovátka, emulgátor: lecitin, stabilizátor: guarová mouka, sójová mouka, ztužený rostlinný tuk, enzymy, látka zlepšující mouku: kyselina askorbová), rostlinný olej, jedlá sĤl s jódem, pšeniþný lepek, konzervant: propionát vápenatý. - Alergeny: výrobky z pšenice, jeþmene a žita, výrobky z mléka, výrobky ze sóji. - Výrobce: UNITED BAKERIES a.s., Bohunická 24, 619 00 Brno. - Hmotnost: 400 g Žitný chléb – Racio - Složení: žito 44 %, voda, pšeniþné klíþky 1%, jedlá sĤl s jódem, otruby, regulátory kyselosti (kyselina mléþná, dioctan sodný), konzervaþní látky (propionát vápenatý, kyselina sorbová). - Obsahuje: lepek. - Uchovejte v chladu a suchu. - Vyrobeno pro RACIO, s.r.o., Národních hrdinĤ 22, 690 02 BĜeclav, ýeská republika. - ZemČ pĤvodu: Holandsko. - Hmotnost 250 g (5 x 50 g). Medové pláty - Trvanlivé peþivo, perníkový korpus pro domácí pĜípravu zákuskĤ. - Složení: pšeniþná mouka, cukr, sušená vajeþná smČs, ztužený rostlinný tuk, kypĜící látka E503, chem. konzervaþní látka E282, med – 1%, koĜení, medové aroma. - Informace pro alergiky: Výrobek obsahuje pšenici, lepek a vejce. - Výrobce: GERAS s.r.o., Ružová 33, 971 01, Prievidza 5, SR, tel.: 0042146 5487033. - Hmotnost: 240 g Babeta s citronovou pĜíchutí – Delta - Jemné peþivo. - Složení: smČs (cukr, pšeniþná mouka, pšeniþný škrob, kypĜící látky: E450, E500, rýžový škrob, emulgátory: E471, E475, sójový lecitin; dextróza, zahušĢovadlo: xanthan, konzervant: E282, sĤl, citronové aroma, barvivo: karoten, enzym), vejce, voda, rostlinný olej, rychlošlehací pasta (voda, cukr, emulgátory: E471, E475, E570, rozpouštČdlo: E1520). - Alergeny: vejce, pšeniþná mouka a škrob, sójový lecitin. - Výrobce: UNITED BAKERIES a.s., Bohunická 24, 619 00 Brno. - Hmotnost: 300 g. Pains au lait – Tesco - Máslové rohlíþky – jemné peþivo z kynutého tČsta, 10 kusĤ. - Informace pro alergiky: Výrobek obsahuje mléko, pšenici, lepek, vejce. Výrobek mĤže obsahovat stopy sóji, suchých skoĜápkových plodĤ a arašídĤ.

31

-

-

Složení: pšeniþná mouka, vejce, cukr, rekonstituované odstĜedČné mléko (8 %), rostlinný olej a hydrogenovaný rostlinný olej (7 %), emulgátory (mono a diglyceridy mastných kyselin, mono a diacetyl vinné estery mono a diglyceridĤ mastných kyselin), koncentrované máslo (1,5 %), aroma, kvasnice, jedlá sĤl, zahušĢovadla (guma tara, mouþka z rohovníku obecného), konzervant (propionát vápenatý), amyláza, antioxidant (kyselina L-askorbová), barvivo (betakaroten). Skladujte v suchu. Minimální trvanlivost do 22. 11. 2008. Vyrobeno ve Francii. Prodávající: Tesco Stores ýR a.s., Vršovická 1527/68b, 100 00 Praha 10. Hmotnost: 350 g

Croissants – Tesco - Croissanty – jemné peþivo z kynutého listového tČsta, 8 kusĤ. - Složení: pšeniþná mouka, rekonstituované odstĜedČné mléko, koncentrované máslo (13 %), rostlinný olej a hydrogenovaný rostlinný olej (8 %), cukr, kvasnice, emulgátory (mono a diglyceridy mastných kyselin, mono a diacetyl vinné estery mono a diglyceridĤ mastných kyselin), jedlá sĤl, zahušĢovadla (guma tara, mouþka z rohovníku obecného), amyláza, konzervant (propionát vápenatý), aroma, antioxidant (kyselina L-askorbová), vejce, barvivo (betakaroten). - Informace pro alergiky: Výrobek obsahuje mléko, pšenici, lepek, vejce. Výrobek mĤže obsahovat stopy sóji, suchých skoĜápkových plodĤ a arašídĤ. - Vyrobeno ve Francii. - Prodávající: Tesco Stores ýR a.s., Vršovická 1527/68b, 100 00 Praha 10. - Hmotnost: 320 g Croissant with strawberry jam – 7Days - Croissant s jahodovou náplní – jemné peþivo. - Složení: pšeniþná mouka, jahodový džem 25 % (glukózo-fruktózový sirup, jahody, cukr, aroma, želírovací þinidlo: pektin, kyselina: kyselina citrónová, barvivo: E120, konzervant: sorban draselný 0,1%), margarín (emulgátor: mono- a diglyceridy mastných kyselin, kyselina: kyselina citrónová, konzervant: sorban draselný 0,1 %), cukr, droždí, stabilizátor: mono- a diglyceridy mastných kyselin, jedlá sĤl, aroma: vanilín, konzervant: propionan vápenatý 0,1 %. - Vyrobeno v továrnČ zpracovávající vajeþné produkty, produkty z lískových oĜíškĤ, sojové produkty. - Prodejce v ýR: Chipita CZ s.r.o., Branická 211, Praha 4, tel.: 241444800, fax: 241444801. - Hmotnost: 65 g Mini croissant with cocoa filling – 7Days - Mini croissanty s kakaovou náplní – jemné peþivo. - Složení: pšeniþná mouka, kakaová náplĖ 33 % (cukr, ztužené rostlinné oleje, nízkotuþný kakaový prášek 7 %, sušené odtuþnČné mléko, alkohol, emulgátor: estery mono- a diglyceridĤ s kyselinou mléþnou, želírovací þinidlo: alginát sodný, aroma: vanilín, konzervant: sorban draselný 0,1 %) margarín (emulgátor: mono- a diglyceridy mastných kyselin, kyselina: kyselina citrónová, konzervant: sorban draselný 0,1 %), 32

-

cukr, droždí, stabilizátor: mono- a diglyceridy mastných kyselin, jedlá sĤl, aroma: vanilín, konzervant: propionan vápenatý 0,1 %. Vyrobeno v továrnČ zpracovávající vajeþné produkty, produkty z lískových oĜíškĤ, sojových výrobkĤ. Prodejce v ýR: Chipita CZ s.r.o., Branická 211, Praha 4, tel.: 241444800, fax: 241444801. Hmotnost: 200 g

Mini croissant with spumante flavour filling – 7Days - Mini croissanty s náplní s pĜíchutí italského sektu – jemné peþivo. - Složení: pšeniþná mouka, náplĖ s pĜíchutí spumante 33 % (kukuĜiþný sirup, þásteþnČ ztužené rostlinné oleje, voda, cukr, sušené odtuþnČné mléko, sušená mléþná syrovátka, alkohol, sušený vajeþný žloutek, emulgátor: estery mono- a diglyceridĤ s kyselinou mléþnou, melírující þinidlo: alginát sodný, spumante aroma, konzervant: sorban draselný 0,1 %) margarín (þásteþnČ ztužené rostlinné oleje, jedlá sĤl, emulgátor: mono- a diglyceridy mastných kyselin, kyselina: kyselina citrónová, aroma, konzervant: sorban draselný 0,1 %), cukr, stabilizátor: mono- a diglyceridy mastných kyselin, droždí, jedlá sĤl, vanilkové aroma, konzervant: propionan vápenatý 0,1 %. - Vyrobeno v továrnČ zpracovávající sojové produkty, oĜechy. - Prodejce v ýR: Chipita CZ s.r.o., Branická 211, Praha 4, tel.: 241444800, fax: 241444801. - Hmotnost: 200 g Kubíþek croissant nugát – PéCé - Croissant nugát – jemné peþivo s náplní s pĜíchutí lískových oĜechĤ. - Složení: mouka pšeniþná, náplĖ s pĜíchutí lískových oĜechĤ 27 % (cukr, rostl. tuk, syrovátka, kakao, emulgátor sojový lecitin, aroma, sĤl), rostlinný tuk (rostlinné oleje a tuky ztužené a neztužené, emulgátory sojový lecitin a mono- a diglyceridy mastných kyselin, sĤl, konzervant kyselina sorbová, kyselina citrónová, aroma, barviva annato, kurkumim a karoten), vejce, cukr, pitná voda, emulgátory sojový lecitin a mono- a diglyceridy mastných kyselin, škrobový sirup, aroma, sušené mléko, rafinovaný líh, sĤl, droždí, konzervant propionát vápenatý. - Výrobce: Pekárny a cukrárny Náchod, a.s., Plhovská 87, 547 34 Náchod, ýeská republika. - Minimální trvanlivost: 1. 1. 2009. - Hmotnost: 40 g Kubíþek croissant meruĖka – PéCé - Croissant meruĖka – jemné peþivo s ovocnou náplní meruĖkovou. - Složení: mouka pšeniþná, ovocná náplĖ meruĖková 26 % (cukr, ovocný protlak s obsahem meruĖek, modifikovaný škrob acetylovaný škrobový adipan, kyselina citrónová, zahušĢovadlo xanthan, konzervant kyselina sorbová, zahušĢovadlo xanthan, konzervant kyselina sorbová, aroma), rostlinný tuk (rostlinné oleje a tuky ztužené a neztužené, emulgátory sojový lecitin a mono- a diglyceridy mastných kyselin, sĤl, konzervant kyselina sorbová, kyselina citrónová, aroma, barviva annato, kurkumin a karoten), vejce, cukr, pitná voda, emulgátory sojový lecitin a mono- a diglyceridy 33

-

mastných kyselin, škrobový sirup, aroma, sušené mléko, rafinovaný líh, sĤl, droždí, konzervant propionát vápenatý. Výrobce: Pekárny a cukrárny Náchod, a.s., Plhovská 87, 547 34 Náchod, ýeská republika. Minimální trvanlivost: 26. 11. 2008. Hmotnost: 40 g

OtíkĤv dezert – Tesco - CukráĜský výrobek s tukovou náplní (14 %) a cukráĜskou tmavou polevou (8,5 %). - Složení: cukr, rostlinné ztužené a neztužené tuky a oleje (emulgátor: E471, jedlá sĤl, konzervant: E200, aroma, kyselina citrónová, barviva: annato, kurkumin), fondánová hmota (cukr, glukózový sirup, voda), pšeniþná mouka, cukráĜská tmavá poleva (cukr, ztužený rostlinný tuk, kakao, sušená syrovátka, sójový lecitin, aroma), voda, sušená vejce, sušený mléþný výrobek (obsahuje rostlinný tuk), glukózový sirup, lihovina: tuzemák, kokos, aroma, pšeniþný škrob, zvlhþující látka: glycerol, sušené mléko, emulgátory: sójový lecitin, E471 a E470a, kypĜící látky: E450 a E500, hovČzí želatina, konzervant: propionan sodný. - Informace pro alergiky: Výrobek obsahuje pšeniþný lepek, vejce, mléko a sóju. - Skladování: Skladujte v suchu, chraĖte pĜed teplem. - Tesco kvalita: Kvalita výrobku a podmínky výroby jsou pravidelnČ kontrolovány. - Vyrobeno pro Tesco Stores ýR a.s., Vršovická 1527/68b, 100 00 Praha 10. - Výrobce: Michelské pekárny a.s., Pekárenská 10/1151, 141 00 Praha 4. - ZemČ pĤvodu: ýeská republika. - Hmotnost: 120 g Dezert punþový – Metro - CukráĜský výrobek s náplní tukovou (12 %) a polevou tukovou (13 %). - Složení: cukr, rostlinné ztužené tuky a oleje (emulgátor: E471, sĤl, konzervant: E200, aroma, regulátor kyselosti E330, barviva: annato, kurkumin), fondant, tuková poleva (cukr, ztužený rostlinný tuk, sójová mouka, sušená syrovátka, emugátor: sójový lecitin, aroma), pšeniþná mouka, voda, sušená vejce, sušené mléko, kakaová poleva (cukr, ztužený rostlinný tuk, kakao, sušená syrovátka, emulgátor: sójový lecitin, aroma), glukózový sirup, aromatické látky, punþ vinný (1%), kokos, pšeniþný škrob, zvlhþující látka: glycerol, emulgátory: sójový lecitin, E471 a E470a, kypĜící látky: E450 a E500, želatina, konzervant: propionan sodný. - Výrobce: Michelské pekárny a.s., Pekárenská 10/1151, 141 00 Praha 4, ýR/CZ. - Hmotnost: 120g Závin s náplní makovou – Tesco - Jemné peþivo s náplní makovou. - Složení: pšeniþná mouka, náplĖ (32%) /mák, voda, glukózový sirup, cukr, ovocná náplĖ, strouhanka, pšeniþná mouka, skoĜice, citrónové aroma (zvlhþující látka: glycerol, voda, rozpouštČdlo: E1520, pĜírodní citrónové aroma)/, voda, cukr, rostlinný olej, droždí, vejce (vejce, kyseliny: kyselina mléþná a kyselina octová), sirup z invertního cukru (cukr, voda, regulátor kyselosti: kyselina citrónová, jedlá soda), zlepšovací pĜípravek (pšeniþná mouka, emulgátory: E471, E481, pšeniþná mouka 34

-

bobtnavá, aroma, regulátory kyselosti: uhliþitan vápenatý, E341, zahušĢovadlo: guma guar, pšeniþná sladová mouka, cukr, jedlá sĤl, látka zlepšující mouku: kyselina askorbová, barvivo: riboflavin, enzymy), jedlá sĤl s jódem, konzervant: propionát vápenatý. Informace pro alergiky: Výrobek obsahuje výrobky z obilovin obsahujících lepek, vejce. Tesco kvalita: Kvalita výrobku a podmínky výroby jsou pravidelnČ kontrolovány. Vyrobeno pro Tesco Stores ýR a.s., Vršovická 1527/68b, 100 00 Praha 10. Výrobce: UNITED BAKERIES a.s., Bohunická 24, 619 00 Brno. Hmotnost: 400 g

ýeské buchtiþky s náplní tvarohovou – Tesco - Jemné peþivo s náplní tvarohovou. - Složení: pšeniþná mouka, tvarohová náplĖ (30%) /tvaroh, voda, cukr, dextróza, modifikovaný škrob: E1412, E1422, sušená vejce, kukuĜiþný škrob, jedlá sĤl, zahušĢovadlo: E466, pĜírodní a pĜírodnČ identické aroma, kyselina: kyselina citrónová, citrónové aroma (zvlhþující látka: glycerol, voda, rozpouštČdlo: E1520, pĜírodní citrónové aroma)/ voda, rostlinný olej, cukr, sirup z invertního cukru (cukr, voda, regulátor kyselosti: kyselina citrónová, jedlá soda), droždí, zlepšovací pĜípravek (pšeniþná mouka, emulgátory: E471, E481, pšeniþná mouka bobtnavá, aroma, regulátory kyselosti: uhliþitan vápenatý, E341, zahušĢovadlo: guma guar, pšeniþná sladová mouka, cukr, jedlá sĤl, látka zlepšující mouku: kyselina askorbová, barvivo: riboflavin, enzymy), jedlá sĤl s jódem, konzervant: propionát vápenatý. - Informace pro alergiky: Výrobek obsahuje výrobky z obilovin obsahujících lepek, vejce, výrobky z mléka. - Tesco kvalita: Kvalita výrobku a podmínky výroby jsou pravidelnČ kontrolovány. - Vyrobeno pro Tesco Stores ýR a.s., Vršovická 1527/68b, 100 00 Praha 10. - Výrobce: UNITED BAKERIES a.s., Bohunická 24, 619 00 Brno. - Hmotnost: 360 g Bauernbrot - Küchenmeister - SmČs na sedlácký chléb. - Složení: pšeniþná mouka (70 %), žitná mouka (20 %), sušené kysané tČsto, jedlá sĤl jodovaná, sušené droždí, jeþný slad, hroznový cukr, sladový výtažek, regulátor kyselosti: natriumacetat, okyselující prostĜedek: k. jableþná, calcium fosfát, k. askorbová, k. listová. - Výhradní dovozce: SH ProDiet, Husovo nám. 45, Roudnice n/L - Hmotnost: 500 g.

35

3.3. Postupy práce 3.3.1. PĜíprava roztokĤ PĜíprava standardních roztokĤ propionanu sodného Na analytických vahách bylo naváženo 0,1297 g propionanu sodného, kvantitativnČ pĜevedeno do 100 ml odmČrné baĖky a doplnČno vodou po rysku. Byl získán zásobní standardní roztok o koncentraci 1 g.l-1 (vztaženo na kyselinu propionovou). Ze zásobního roztoku bylo odpipetováno 1, 2,5 a 5 ml do 100 ml odmČrné baĖky, 5 ml do 50 ml odmČrné baĖky, a do 25 ml odmČrné baĖky bylo odpipetováno 5 a 10 ml zásobního roztoku kyseliny propionové. BaĖky byly doplnČny vodou po rysku, þímž vznikly standardní roztoky o koncentracích 10, 25, 50, 100, 200 a 400 mg.l-1 kyseliny propionové. Pro destilaci s vodní parou byl pĜipraven standardní roztok o koncentraci 10 g.l-1 kyseliny propionové rozpuštČním 1,2967 g propionanu sodného ve 100 ml odmČrné baĖce. Roztoky byly uchovávány v chladniþce maximálnČ jeden týden. PĜíprava roztokĤ Carreze I a II Roztok Carreze I byl pĜipraven rozpuštČním 150 g hexakyanoželeznatanu draselného, doplnČním vodou na objem 1 l a dĤkladným promícháním. Na pĜípravu roztoku Carreze II bylo naváženo 300 g síranu zineþnatého, rozpuštČno, doplnČno vodou na objem 1 l a dĤkladnČ promícháno. PĜíprava mobilní fáze Jako mobilní fáze byl použit 0,005 mol.l-1 roztok KH2PO4 o pH 2,8. Na analytických vahách bylo naváženo 0,6805 g dihydrogenfosforeþnanu draselného, kvantitativnČ pĜevedeno do 1000 ml kádinky a rozpuštČno ve vodČ. Byla provedena kalibrace pH metru pomocí kalibraþních roztokĤ o pH 4,01 a 1,68. Poté bylo za stálého míchání a mČĜení pH k roztoku postupnČ pĜidáno asi 160 µl kyseliny fosforeþné pro úpravu pH na hodnotu 2,8. Objem fosfátového pufru byl doplnČn vodou do 1 litru. Mobilní fáze byla pĜevedena do zásobní lahve a odplynČna v ultrazvukové lázni po dobu 15 minut. PĜíprava roztoku kyseliny sírové o koncentraci 0,5 mol.l-1 Do 100 ml odmČrné baĖky s vodou bylo napipetováno 2,66 ml koncentrované kyseliny sírové a doplnČno vodou po rysku. 3.3.2. Úprava vzorkĤ Extrakce ve vodČ Po dokonalé homogenizaci bylo na analytických vahách naváženo 5 až 10 g vzorku do 100 ml Kohlrauschovy baĖky. Bylo pĜidáno asi 50 ml vody a promíchaný roztok byl extrahován v ultrazvukové lázni 10 minut. Poté byl vyþeĜen 4 ml roztoky Carreze I a II, doplnČn vodou po rysku a dokonale promíchán. Roztok byl zfiltrován pĜes skládaný filtr a poté pĜes mikrofiltr o porozitČ 0,45 µm. Filtrát byl naplnČn do vialky a použit ke stanovení kapalinovou chromatografií.

36

Vzorky s náplní nebo s polevou, které po homogenizaci tvoĜily lepkavé tČsto, byly pro lepší úþinnost extrakce nejprve rozmíchány sklenČnou tyþinkou v kádince. Po extrakci v ultrazvukové lázni byly kvantitativnČ pĜevedeny do 100 ml Kohlrauschovy baĖky. Extrakce v mobilní fázi Postup je shodný s postupem extrakce ve vodČ, jen je místo demineralizované vody použita mobilní fáze, tedy roztok dihydrogenfosforeþnanu draselného o pH 2,8. Opakovaná extrakce PĜi prvním zpĤsobu bylo naváženo 10 g homogenizovaného vzorku do 100 ml Kohlrauschovy baĖky, pĜidána demineralizovaná voda a provedena sonikace 10 minut v ultrazvuku. Poté byl roztok vyþeĜen 4 ml roztoky Carreze I a II, doplnČn vodou po rysku, dokonale promíchán a zfiltrován. Vzorek byl odebrán z filtru, spolu s filtrátem vložen do 200 ml Kohlrauschovy baĖky, rozpuštČn ve vodČ a opČt byla provedena 10 minutová sonikace. Poté byl roztok doplnČn po rysku, zfiltrován a filtrát stanoven kapalinovou chromatografií. PĜi druhém zpĤsobu opakované extrakce byl homogenizovaný roztok navážen do kádinky a bylo k nČmu pĜidáno 100 ml vody. Po sonikaci a vyþeĜení byl zfiltrován, vzorek i s filtrem vložen zpČt do kádinky a bylo opČt pĜidáno 100 ml vody. Po sonikaci a filtraci byly filtráty spojeny a stanoveny kapalinovou chromatografií. Destilace s vodní parou Na analytických vahách bylo naváženo 10 g vzorku a kvantitativnČ pĜevedeno do destilaþní baĖky. K navážce bylo pĜidáno 5 – 10 g síranu hoĜeþnatého, 10 – 15 ml roztoku kyseliny sírové o koncentraci 0,5 mol.l-1 a cca 30 – 50 ml vody. Byla sestavena aparatura pro destilaci s vodní parou a destilováno do 250 ml odmČrné baĖky po rysku. Peþení chleba se známým pĜídavkem kyseliny propionové Do každého dílu pĤlené formy domácí pekárny byla kvantitativnČ pĜevedena navážka propionanu sodného rozpuštČna ve 160 ml vody. Poté bylo pĜidáno 250 g smČsi pro pĜípravu sedláckého chleba. Byl zapnut základní program domácí pekárny pro malý chléb se svČtlou kĤrkou, jehož prĤbČh je rozepsán v tabulce 4. Takto byly upeþeny dva chleby se stejnou navážkou propionanu a po vychladnutí pekárny byly stejným postupem upeþeny další dva chleby s druhou navážkou propionanu. Tabulka 4: Program peþení domácí pekárny HnČtení 1 Kynutí 1 HnČtení 2 Kynutí 2 Kynutí 3 Peþení

Teplota bez zahĜívání 28 °C 33 °C 35 °C 37 °C 122 °C

ýas 10 minut 20 minut 15 minut 35 minut 45 minut 60 minut

37

3.3.3. Stanovení kapalinovou chromatografií Vialky se vzorky byly umístČny do automatického dávkovaþe a bylo provedeno stanovení HPLC. Pro separaci byla použita kolona s reverzní fází XBridge C18 3 x 150 mm, 3,5 µm s pĜedkolonou XBridge 20 x 4,6 mm. Pro izokratickou eluci byl použit fosfátový pufr: roztok KH2PO4 o koncentraci 0,005 mol.l-1 a pH 2,8. Do mobilní fáze bylo pĜed i v prĤbČhu analýzy zavádČno hélium pro zajištČní odplynČní. K detekci byl použit detektor s diodovým polem. MČĜení bylo sledováno pĜi vlnové délce 210 nm, což je hodnota blízká maximu absorbance kyseliny propionové, pĜi které je nižší pravdČpodobnost absorbance interferujících látek. Detektor snímal absorbance v rozpČtí vlnových délek 200 – 450 nm. Podmínky pĜi HPLC analýze: • Teplota kolony: 40 °C • Teplota nástĜiku: 25 °C • Objem nástĜiku: 20 µl • PrĤtok mobilní fáze: 0,5 ml/min (odpovídá tlaku asi 1900 Psi) • UV detekce: 210 nm 3.3.4. Identifikace a kvantitativní vyhodnocení Identifikace píku kyseliny propionové byla provádČna porovnáním retenþních þasĤ s retenþním þasem standardní látky, popĜípadČ snímáním spekter v daném rozsahu vlnových délek pomocí detektoru s diodovým polem. Kvantitativní vyhodnocení bylo provánČno metodou kalibraþní kĜivky pomocí programu Millenium32. Integrací byly vypoþítány plochy píkĤ a byla sestavena kalibraþní závislost ploch píkĤ (y) na koncentraci standardu (x) s rovnicí regresní pĜímky     . Z následující rovnice byla vypoþítána koncentrace kyseliny propionové ve studovaném vzorku:

  kde

PVZ mVZ V a b

         

plocha píku kyseliny propionové navážka vzorku [g] objem roztoku vzorku [ml] konstanta, smČrnice kalibraþní kĜivky konstanta, úsek vytþený pĜímkou na ose y

3.4. Validaþní parametry metody 3.4.1. Linearita odezvy detektoru – kalibraþní kĜivka Podle postupu uvedeného v kapitole 3.3.1 byly pĜipraveny standardní roztoky. NejþastČji byla použita Ĝada standardĤ s koncentracemi 25, 50, 100 a 200 mg.l-1 kyseliny propionové. Linearita odezvy detektoru byla vyhodnocena sestrojením kalibraþní kĜivky softwarem Millenium32. PĜi každé výmČnČ mobilní fáze byla promČĜena nová kalibraþní závislost.

38

Pro zjištČní kolísání smČrnic jednotlivých kalibraþních závislostí byl sestrojen ShewhartĤv regulaþní diagram. Jako centrální pĜímka diagramu byl zakreslen prĤmČr všech smČrnic a regulaþní meze 3násobek a 2násobek smČrodatné odchylky výbČru, vypoþítané v programu MS Excel. 3.4.2. Mez detekce a mez stanovitelnosti Pro stanovení tČchto validaþních parametrĤ byl použit chromatogram standardního roztoku o koncentraci 25 mg.kg-1. Z chromatogramu bylo urþeno maximální kolísání základní linie (hmax). Pro odezvu meze detekce (yD) a meze stanovitelnosti (yS) platí:   

!"#

$  %&

!"#

a pro koncentraci na mezi detekce (xD) a na mezi stanovitelnosti (xS) platí:

kde b1

 





$ 

$



smČrnice kalibraþní pĜímky závislosti výšky chromatografického píku na koncentraci standardu

3.4.3. Opakovatelnost Opakovatelnost metody byla vyjádĜena jako relativní smČrodatná odchylka RSD a platí: '()  kde s x n

* %&& + 

smČrodatná odchylka opakovatelnosti z n stanovení [mg.kg-1] prĤmČrná hodnota z n stanovení [mg.kg-1] poþet stanovení (n • 6)

SmČrodatná odchylka byla vypoþítána pomocí funkce smČrodatná odchylka výbČru v programu MS Excel.

39

3.4.4. VýtČžnost VýtČžnost metody byla stanovena analyzováním vzorku s pĜídavkem známého množství standardní látky a vzorku bez pĜídavku. Je vyjádĜená vztahem: 

,-  ,. %&&+ ,/

kde cP namČĜená koncentrace kyseliny propionové ve vzorku s pĜídavkem [mg.kg-1] c0 namČĜená koncentrace kyseliny propionové ve vzorku bez pĜídavku [mg.kg-1] cs pĜidané množství kyseliny propionové do vzorku [mg.kg-1], které se vypoþítá podle vztahu ,/  kde

40

,  

c pĜidané množství kyseliny propionové do vzorku [mg.l-1] V objem roztoku vzorku [ml] m navážka vzorku [g]

4. VÝSLEDKY A DISK SKUZE Kyselina propionová byla yla stanovována metodou doporuþenou St Státní zemČdČlskou a potravináĜskou inspekcí v BrnČ B (metoda þ. 4839): úprava vzorkĤ pomoc ocí extrakce ve vodČ a stanovení vysokoúþinnou ka kapalinovou chromatografií s UV detekcí. M MČĜení bylo souþástí validace této metody na SZPI. SZ Analýza kyseliny propionové probíh bíhala za podmínek uvedených v kapitole 0. Reten enþní þas píku kyseliny propionové se pohybov oval v rozmezí 7,3 – 8,4 minut. Celková doba anal nalýzy byla stanovena na 10 minut u standard ardních roztokĤ a 15 minut u vzorkĤ. Výsledky byly porovnányy se zpĤsobem úpravy vzorku pomocí opak akované extrakce ve vodČ, extrakce v roztoku mob obilní fáze a destilace s vodní parou. Kyselin lina propionová byla stanovena kapalinovou chroma matografií za stejných podmínek.

4.1. Absorpþní spektru trum kyseliny propionové Absorpþní spektrum kyselin liny propionové v rozsahu vlnových délek 200 20 – 450 nm je uvedeno na obrázku 7.

Obr 7:: Absorpþní spektrum kyseliny propionové Diskuze Z obrázku je zĜejmé, že maaximum absorbance kyseliny propionové see nachází pĜi vlnové délce 204,9 nm.

41

4.2. Stanovení validaþn þních parametrĤ 4.2.1. Linearita odez ezvy detektoru – kalibraþní kĜivka Kalibraþní kĜivky byly sestr strojeny pomocí softwaru Millenium32 jako závislost zá plochy píku na koncentraci standardních roztokĤ. r Na obrázku 8 je uvedena kalibraþní ní kĜivka pro rozpČtí -1 koncentrací 25 – 200 mg.l . Data D k této závislosti jsou uvedeny v tabulce 5. 5 Tabulka 5: Data ke kalibraþní ní kĜivce kyseliny propionové Koncentrace standardu [mg.l-1] 25 25 50 50 100 100 200 200

Plocha píku 26040 27676 57983 55597 112811 115048 231556 233430

Vypoþítaná koncentrace [mg.l-1] 24,309 25,703 51,533 49,500 98,261 100,168 199,464 201,061

Obr.. 8: 8 Kalibraþní kĜivka kyseliny propionové

42

O Odchylka [%] -2,763 2,814 3,066 -1,001 -1,739 0,168 -0,268 0,531

Diskuze Korelaþní koeficient nesmí být nižší než 0,9800 a rozdíly smČrnic pĜímek by nemČly pĜesahovat 10 %. TČmto kritériím vyhovovaly všechny mČĜené kalibrace. Standardní roztoky propionanu sodného vykazovaly i po dvou týdnech stále stejné hodnoty koncentrace, nicménČ pro každou kalibraþní kĜivku byly dle požadavkĤ patných pro akreditovanou laboratoĜ pĜipraveny roztoky nové. Odezva tČchto roztokĤ byla srovnána s odezvou standardních roztokĤ pĜipravených z kyseliny propionové. Plochy píkĤ byly srovnatelné. Regulaþní diagram smČrnice kalibraþní kĜivky Pro zjištČní kolísání hodnot smČrnic bČhem celé práce byl sestrojen regulaþní diagram. Data k diagramu jsou uvedeny v tabulce 6. Tabulka 6: Hodnoty smČrnic sestrojených kalibraþních kĜivek ýíslo mČĜení 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Datum 1. 9. 2008 8. 9. 2008 10. 9. 2008 11. 9. 2008 12. 9. 2008 16. 9. 2008 25. 9. 2008 29. 9. 2008 13. 10. 2008 20. 10. 2008 20. 11. 2008 21. 11. 2008 9. 12. 2008 6. 1. 2009 24. 1. 2009 24. 2. 2009 15. 4. 2009

SmČrnice 1135 1221 1131 1131 1152 1135 1056 1151 1187 1149 1171 1190 1173 1204 1173 1220 1191

43

       

















       

Obr. 9: ShewhartĤv regulaþní diagram smČrnic kalibraþní kĜivky Diskuze Všechny hodnoty smČrnic leží v regulaþních mezích Shewhartova diagramu, pouze jedna smČrnice pĜekroþila varovné meze. PĜíþinou je zĜejmČ náhodná chyba pĜi odmČĜování standardních roztokĤ. 4.2.2. Mez detekce a mez stanovitelnosti Pro výpoþet meze detekce a stanovitelnosti bylo urþeno maximální kolísání základní linie hmax = 120. Závislost výšky chromatografického píku na koncentraci kyseliny propionové je znázornČna na obrázku 10, smČrnice této závislosti je b1 = 71,43. 16000 14000

Výška píku

12000 10000 8000 6000 4000 2000

y = 71,43x R² = 0,999

0















 



Koncentrace [mg.l-1]

Obr. 10: Závislost výšky chromatografického píku na koncentraci kyseliny propionové

44

Výpoþet meze detekce:    !"#    %0&   1&   23 4    1&45%67   86& mg.l-1 Výpoþet meze stanovitelnosti: $  %& !"# $  %& %0& $  %0&& $  29 4  $  %0&&45%67 $  %16: mg.l-1 Diskuze Byla vypoþítána mez detekce 5,0 mg.l-1 a mez stanovení mČĜení 16,8 mg.l-1. To znamená, že pĜi navážce 5 g vzorku do 100 ml musí matrice obsahovat minimálnČ 336 mg stanovované látky (kyseliny propionové) v 1 kg, aby bylo možné analýzu spolehlivČ provést. Pokud by byla navážka vzorku dvojnásobná, tedy 10 g do 100 ml, staþí, aby matrice obsahovala pouze 168 mg kyseliny propionové v 1 kg. 4.2.3. Opakovatelnost Opakovatelnost mČĜení byla stanovena opakovanými nástĜiky jednoho vzorku, opakovatelnost stanovení opakovanou pĜípravou stejného vzorku v jeden den. Opakovatelnost mČĜení Opakovatelnost mČĜení byla stanovena opakovanými nástĜiky þtyĜ rĤzných koncentrací standardních roztokĤ kyseliny propionové: 10, 50, 200 a 400 mg.l-1. Dále byl 6krát nastĜíknut vzorek croissantu s kakaovou náplní (navážka 10 g) a vzorek medových plátĤ (navážka 5 g). Výsledky byly srovnány na hladinách koncentrace 50 a 200 mg.l-1 a jsou uvedeny v následujících tabulkách.

45

Tabulka 7: Opakovatelnost mČĜení (zjišĢovaná na standardech) ýíslo nástĜiku 1 2 3 4 5 6 PrĤmČr SmČrodatná odchylka RSD [%]

-1

10 mg.l 10074 10565 10056 10584 10548 10668 10416 275 2,64

Plochy píkĤ 50 mg.l-1 200 mg.l-1 55914 239151 55115 240697 53998 239908 55950 238938 53207 240409 57390 241770 55262 240145 1501 1050 2,72 0,44

400 mg.l-1 481852 476029 479182 476436 476465 479687 478275 2337 0,49

Tabulka 8: Opakovatelnost mČĜení (stanovovaná na vzorcích) ýíslo nástĜiku 1 2 3 4 5 6 PrĤmČr SmČrodatná odchylka RSD [%]

Koncentrace [mg.kg-1] / Plochy píkĤ Croissant kakao Medové pláty 391,245 43402 3860,712 230007 413,545 45930 3862,190 230095 415,709 46176 3868,858 230494 404,349 44888 3875,159 230870 416,561 46272 3878,569 231074 411,350 45681 3884,743 231443 408,8 45392 3871,7 230664 9,6 1093 9,5 566 2,36 2,41 0,24 0,25

Opakovatelnost stanovení metodou extrakce ve vodČ Bylo pĜipraveno 6 vzorkĤ zmraženého croissantu s náplní s pĜíchutí sektu. Každý vzorek byl nastĜíknut 2krát a z výsledkĤ byl vypoþítán prĤmČr. Opakovatelnost stanovení byla vyjádĜena hodnotou RSD. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.

46

Tabulka 9: Opakovatelnost stanovení pro croissant s náplní s pĜíchutí sektu ýíslo vzorku 1 2 3 4 5 6

Koncentrace [mg.kg-1] 332,495 334,215 323,987 325,531 318,091 316,044 322,064 311,251 323,478 321,239 303,367 306,711

PrĤmČry [mg.kg-1]

PrĤmČr [mg.kg-1] SmČrodatná odchylka [mg.kg-1] RSD [%]

333,4 324,8 317,1 316,7 322,4 305,0 319,9 9,5 2,97

Diskuze Hodnoty RSD jsou závislé na homogenitČ vzorku, koncentraci kyseliny propionové ve vzorku a dalších faktorech. ZjištČné hodnoty opakovatelnosti mČĜení i stanovení lze považovat za velmi dobré. Hodnota opakovatelnosti stanovení obsahu kyseliny propionové ve vzorku croissantu nepĜekroþila 3 %. To lze hodnotit jako velmi dobrý výsledek zejména vzhledem k tomu, že se jednalo o výrobek s náplní, a tedy o nehomogenní matrici. 4.2.4. VýtČžnost VýtČžnost metody byla stanovena u dvou vzorkĤ (croissant s jahodovou náplní a svČtlý sušený toustový chléb znaþky Tesco) metodou standardních pĜídavkĤ. Byly analyzovány vzorky bez pĜídavku a poté s pĜídavkem známého množství kyseliny propionové. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 10 a 11. Tabulka 10: VýtČžnost metody u croissantu s jahodovou náplní Bez pĜídavku S pĜídavkem 50 mg.l-1 ýíslo nástĜiku Koncentrace [mg.kg-1] ýíslo nástĜiku Koncentrace [mg.kg-1] 1 480,403 1 1373,046 2 480,293 2 1459,441 3 496,274 3 1355,827 4 508,709 4 1411,326 PrĤmČr: c0 491,4 PrĤmČr: cP 1399,9 PĜidané množství kyseliny propionové: cS [mg.kg-1] 996,5 VýtČžnost [%] 91,2

47

Tabulka 11: VýtČžnost metody u svČtlého sušeného toustového chleba znaþky Tesco Bez pĜídavku S pĜídavkem 100 mg.l-1 ýíslo nástĜiku Koncentrace [mg.kg-1] ýíslo nástĜiku Koncentrace [mg.kg-1] 1 1316,139 1 3213,695 2 1308,051 2 3198,325 3 1331,745 4 1322,752 PrĤmČr: c0 1319,7 PrĤmČr: cP 3206,0 -1 PĜidané množství kyseliny propionové: cS [mg.kg ] 1975,2 VýtČžnost [%] 95,5 Bez pĜídavku S pĜídavkem 150 mg.l-1 -1 ýíslo nástĜiku Koncentrace [mg.kg ] ýíslo nástĜiku Koncentrace [mg.kg-1] 1 1316,139 1 4160,739 2 1308,051 2 4133,007 3 1331,745 4 1322,752 PrĤmČr: c0 1319,7 PrĤmČr: cP 4146,9 -1 PĜidané množství kyseliny propionové: cS [mg.kg ] 2962,7 VýtČžnost [%] 95,4

Diskuze VýtČžnost byla stanovena na 91,2 % u vzorku croissantu a 95,4 – 95,5 % u vzorku toustového chleba. VýtČžnost metody by mČla ležet v intervalu 90 až 105 %, nalezené hodnoty této podmínce vyhovují.

4.3. OvČĜení validované metody stanovení kyseliny propionové na vzorcích peþiva Kyselina propionová byla ze vzorkĤ extrahována vodou a dále analyzována kapalinovou chromatografií s UV detekcí. U každého vzorku byly provedeny minimálnČ dvČ stanovení. U vČtšiny vzorkĤ bylo bráno k analýze 5 a 10 g, u toustových chlebĤ 2 x 10 g. Pro analýzu byly homogenizovány celé kusy jednotlivých výrobkĤ, u vČtších výrobkĤ (toustové chleby, závin) byly nejprve odstranČny krajní þásti (patky). PrĤmČrné koncentrace kyseliny propionové ve studovaných vzorcích (v þerstvém stavu) a hodnoty RSD jsou uvedeny v tabulce 12. Jsou zde rovnČž uvedeny hodnoty nejvyššího povoleného množství (NPM) podle vyhlášky ministerstva zdravotnictví þ. 4/2008 Sb. Podle této vyhlášky studované výrobky patĜí do dvou skupin: „balený plátkový chléb s trvanlivostí delší než 5 dnĤ a žitný chléb“ (NPM 3000 mg.kg-1) a „balené jemné peþivo a cukráĜské výrobky z mouky s trvanlivostí delší než 5 dnĤ s vodní aktivitou vyšší než 0,65“ (NPM 2000 mg.kg-1).

48

Tabulka 12: PĜehled výsledkĤ stanovení kyseliny propionové ve studovaném komerþním peþivu metodou HPLC a úpravou vzorku pomocí extrakce ve vodČ Vzorek Toustový chléb svČtlý – Tesco Toustový chléb tmavý – Tesco Toustový chléb svČtlý – Spar Toustový chléb tmavý – Spar Formanský chléb – Fr. Odkolek Žitný chléb – Racio Medové pláty Babeta s citronovou pĜíchutí – Delta Pains au lait – Tesco Croissant – Tesco Croissant with strawberry jam – 7Days Mini croissant with cocoa filling – 7Days Mini croissant with spumante flavour filling – 7Days Kubíþek croissant nugát – PéCé Kubíþek croissant meruĖka – PéCé OtíkĤv dezert – Tesco Dezert punþový – Metro Závin s náplní makovou – Tesco ýeské buchtiþky s náplní tvarohovou – Tesco

Koncentrace [mg.kg-1] 1197,4 1537,1 1123,4 1831,8 1106,6 1034,1 3894,6 1372,7 1279,4 1014,4 491,4 408,8 400,5 634,9 471,9 1063,8 604,0 ménČ než LOQ ménČ než LOQ

RSD [%] 0,85 0,59 1,30 1,52 1,21 3,06 0,69 1,24 3,06 2,60 2,80 2,36 2,32 2,67 2,97 2,45 1,68 -

NPM [mg.kg-1]

3000

2000

Obrázek 11: Chromatogram vzorku Pains au lait

49

Obrázek 12: Chromatogram vzorku Otíkova dezertu Diskuze VČtšina testovaných vzorkĤ nepĜekroþila povolený limit koncentrace kyseliny propionové. Pouze medové pláty obsahovaly témČĜ dvojnásobek povoleného množství. Tato hodnota byla pĜekvapivá, protože výrobek má nízkou vodní aktivitu (která sama rozvoji plísní ve velké míĜe zabraĖuje) a je pravdČpodobnČ zpĤsobena chybou pĜi výrobČ. U tohoto výrobku byla také stanovena vodní aktivita, jelikož je v souvislosti s kyselinou propionovou také regulována vyhláškou (výrobek s aW 0,65 a nižší nesmí obsahovat žádnou kyselinu propionovou). Výsledek þinil v prĤmČru aW = 0,68, výrobek tedy patĜí do skupiny s povolenou koncentrací kyseliny propionové 2000 mg.kg-1. Byl dán podnČt k šetĜení a kontrole potravináĜskou inspekcí. Ve vzorcích závinu s makovou náplní a þeských buchtiþek s tvarohovou náplní nebyla kyselina propionová detekována, pĜestože je tento konzervant uveden na obale. Je to považováno za nadbyteþný údaj, který se nepostihuje sankcemi. Píky kyseliny propionové byly u vČtšiny vzorkĤ chromatografií dostateþnČ oddČlené od okolních píkĤ a nedocházelo ke koeluci. Pouze u tĜech vzorkĤ (žitný chléb, nugátový Kubíþek a tmavý toustový chléb) obsahovalo spektrum píku kyseliny propionové i malý pík s maximální absorbancí kolem 256 nm, ale pĜedpokládá se, že tato látka výslednou koncentraci kyseliny propionové ovlivní jen minimálnČ. Na obrázcích 11 a 12 jsou uvedeny chromatogramy dvou vzorkĤ. Ostatní vybrané chromatogramy jsou uvedeny v pĜíloze U všech vzorkĤ byly zjištČny velmi dobré hodnoty relativní smČrodatné odchylky. Nebyly zaznamenány rozdíly mezi výsledky paraelních stanovení s navážkami 5 a 10 g. 4.3.1. Srovnání obsahu kyseliny propionové v þerstvém a sušeném vzorku Bylo provedeno srovnání obsahu kyseliny propionové v þerstvém a sušeném vzorku pro zjištČní, zda lze stanovení provádČt se stejnými výsledky i s vysušeným vzorkem peþiva. Plátky toustového chleba byly rozprostĜeny na filtraþní papír a nechány 3 dny vysušit pĜi laboratorní teplotČ. Máslové rohlíþky Pains au lait byly nejdĜíve rozlámány na malé kousky a poté vysušeny stejnČ jako toustové chleby. Po vysušení byly vzorky zhomogenizovány. 50

Na pĜedvážkách byla zvážena hmotnost pĜed a po vysušení a byl vypoþítán obsah sušiny. Koncentrace v þerstvém vzorku byla nepĜímou úmČrou pĜepoþítána na sušinu a poté byla vypoþítána procentuální ztráta kyseliny propionové sušením. Toustový chléb – Tesco Obsah kyseliny propionové v þerstvém a sušeném vzorku znaþky Tesco byl stanoven dvakrát, vždy s novým balením výrobku. Obsah sušiny v prvním testu byl stanoven na 72,1 % u svČtlého a na 72,5 % u tmavého toustového chleba. Tabulka 14: Srovnání obsahu kyseliny propionové v þerstvém a sušeném vzorku toustového chleba znaþky Tesco – první test Toustový chléb – Tesco Koncentrace [mg.kg ] vzorek 1 vzorek 2 SvČtlý þerstvý 1190,227 1204,569 SvČtlý sušený 1464,501 1479,364 Koncentrace v þerstvém vzorku pĜepoþítáno na sušinu Ztráta kyseliny propionové sušením [%] Tmavý þerstvý 1530,633 1543,556 Tmavý sušený 1699,485 1715,580 Koncentrace v þerstvém vzorku pĜepoþítáno na sušinu Ztráta kyseliny propionové sušením [%] -1

prĤmČr 1197,4 1471,4 1661,4 11,4 1537,1 1707,5 2119,5 19,4

Obsah sušiny ve druhém testu byl stanoven na 73,4 % u svČtlého a na 72,2 % u tmavého toustového chleba znaþky Tesco. Tabulka 15: Srovnání obsahu kyseliny propionové v þerstvém a sušeném vzorku toustového chleba znaþky Tesco – druhý test Toustový chléb – Tesco Koncentrace [mg.kg ] vzorek 1 vzorek 2 SvČtlý þerstvý 1149,907 1111,793 1160,307 SvČtlý sušený 1376,854 1392,936 1386,568 1392,814 Koncentrace v þerstvém vzorku pĜepoþítáno na sušinu Ztráta kyseliny propionové sušením [%] Tmavý þerstvý 1140,258 1142,715 1133,289 1145,891 Tmavý sušený 1312,445 1333,121 1331,879 1330,366 Koncentrace v þerstvém vzorku pĜepoþítáno na sušinu Ztráta kyseliny propionové sušením [%] -1

prĤmČr 1140,7 1387,3 1554,5 10,8 1140,5 1327,0 1579,3 16,0

51

Toustový chléb – Spar Obsah sušiny byl stanoven na 69,3 % u svČtlého a na 71,2 % u tmavého toustového chleba znaþky Spar. Tabulka 13: Srovnání obsahu kyseliny propionové v þerstvém a sušeném vzorku toustového chleba znaþky Spar Koncentrace [mg.kg-1] vzorek 1 SvČtlý þerstvý 1111,021 1134,090 SvČtlý sušený 1363,400 1308,903 Koncentrace v þerstvém vzorku pĜepoþítáno na sušinu Ztráta kyseliny propionové sušením [%] Tmavý þerstvý 1795,744 1862,763 Tmavý sušený 2023,238 2094,475 Koncentrace v þerstvém vzorku pĜepoþítáno na sušinu Ztráta kyseliny propionové sušením [%]

vzorek 2 1110,709 1137,900 1333,825 1356,128

1828,713 2114,324

1839,963 2118,691

prĤmČr 1123,4 1340,6 1621,1 17,3 1831,8 2087,7 2574,2 18,9

Pains au lait Obsah sušiny u máslových rohlíþkĤ Pains au lait byl stanoven na 80,8 %. Tabulka 16: Srovnání obsahu kyseliny propionové v þerstvém a sušeném vzorku Pains au lait Pains au lait Koncentrace [mg.kg ] vzorek 1 ýerstvý 1234,165 1303,476 Sušený 1210,409 1224,075 Koncentrace v þerstvém vzorku pĜepoþítáno na sušinu Ztráta kyseliny propionové sušením [%] -1

vzorek 2 1300,510 1219,074

prĤmČr 1279,4 1217,9 1583,0 23,1

Diskuze Bylo zjištČno, že sušením pĜi laboratorní teplotČ dojde k vytČkání kyseliny propionové a ke snížení jejího obsahu v peþivu, a to v prĤmČru o 13 % u svČtlého toustového chleba, o 18 % u tmavého toustového chleba a o 23 % u máslových rohlíþkĤ. Tato hodnota není zanedbatelná. Je proto nutné provádČt stanovení kyseliny propionové jen v þerstvých vzorcích peþiva, aby k tČmto ztrátám pĜi sušení nedocházelo. 4.3.2. Srovnání obsahu kyseliny propionové v þerstvém a zmraženém vzorku Pro zjištČní, zda zmražením vzorku dojde ztrátČ obsažené kyseliny propionové, byly srovnány výsledky získané analýzou þerstvých a zmražených vzorkĤ. Vzorky byly uchovávány v homogenizovaném stavu v mrazniþce pĜi -25 °C. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 17.

52

Tabulka 17: Srovnání obsahu kyseliny propionové v þerstvém a zmraženém vzorku Koncentrace [mg.kg-1] Babeta s citronovou pĜíchutí Croissant s pĜíchutí sektu OtíkĤv dezert Dezert punþový

þerstvý vzorek 1372,7 400,5 604,0 1063,8

zmražený vzorek 1313,1 319,9 622,9 1103,8

rozdíl [%] – 4,3 – 20,1 + 3,0 + 3,6

Diskuze Získané výsledky byly velmi rĤznorodé, u dvou vzorkĤ obsah kyseliny propionové mírnČ klesnul, u dvou vzorkĤ se naopak zvýšil, ale pouze u jednoho vzorku (Croissant s pĜíchutí sektu) je tento rozdíl podstatný. Je potĜeba další studie pro zjištČní vlivu zmražení vzorku na obsah kyseliny propionové. 4.3.3. Srovnání obsahu kyseliny propionové v kĤrce a stĜídce toustového chleba Koncentrace konzervantu v kĤrce má rozhodující vliv na zabránČní plesnivČní chleba, protože tyto mikroorganismy rostou právČ na povrchu peþiva. Proto bylo provedeno srovnání obsahu kyseliny propionové v kĤrce a stĜídce toustového chleba. Z plátkĤ toustového chleba znaþky Tesco byla odkrojena asi 0,5 cm silná kĤrka a poté byly kĤrka a stĜídka zvlášĢ zhomogenizovány. Bylo pĜedpokládáno, že obsah vody v kĤrce bude díky jejímu vČtšímu propeþení nižší než ve stĜídce. Bylo tedy potĜeba znát obsah sušiny ve vzorku. Od každého vzorku bylo na analytických vahách naváženo kolem 5 g a vysušeno na Petriho misce pĜi laboratorní teplotČ. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 18. Tabulka 18: Srovnání obsahu kyseliny propionové v kĤrce a stĜídce toustového chleba Toustový chléb svČtlý Koncentrace ve stĜídce [mg.kg-1] Koncentrace v kĤrce [mg.kg-1] sušina [%] vzorek 1 vzorek 2 prĤmČr sušina [%] vzorek 1 vzorek 2 prĤmČr 69,9 1237,441 1194,097 1215,8 75,9 1034,037 1061,569 1047,8 PĜepoþítáno na sušinu 1739,3 PĜepoþítáno na sušinu 1380,5 Rozdíl koncentrace kyseliny propionové ve stĜídce a kĤrce 20,6 Toustový chléb tmavý Koncentrace ve stĜídce [mg.kg-1] Koncentrace v kĤrce [mg.kg-1] sušina [%] vzorek 1 vzorek 2 prĤmČr sušina [%] vzorek 1 vzorek 2 prĤmČr 69,8 1515,309 1555,028 1535,2 75,6 1599,415 1590,587 1595,0 PĜepoþítáno na sušinu 2199,4 PĜepoþítáno na sušinu 2109,8 Rozdíl koncentrace kyseliny propionové ve stĜídce a kĤrce 4,1

Diskuze Bylo zjištČno, že koncentrace kyseliny propionové v kĤrce je nižší než ve stĜídce, u svČtlého toustového chleba o 20,6 %, u tmavého pouze o 4,1 %. DĤvodem je zĜejmČ vyšší teplota na povrchu chleba pĜi peþení. Rozdílné výsledky u svČtlého a tmavého chleba mohou být zpĤsobeny rozdílnou teplotou pĜi peþení nebo nepĜesným okrajováním kĤrky.

53

4.3.4. Stabilita kyseliny propionové v peþivu bČhem skladování Následující test byl proveden pro zjištČní, zda za dobu minimální trvanlivosti peþiva nedochází k podstatnému úbytku koncentrace kyseliny propionové. Toustový chléb znaþky Tesco byl uchováván na temném místČ pĜi laboratorní teplotČ po dobu minimální trvanlivosti. Byl analyzován první, šestý a osmý den po zakoupení. Homogenizace vzorku byla provedena vždy v den analýzy. Výsledky testu jsou uvedeny v tabulce 19 a znázornČny do grafu na obrázku 13. Tabulka 19: Výsledky testu stability kyseliny propionové v þerstvém toustovém chlebu SvČtlý [mg.kg-1] Koncentrace PrĤmČr 1149,907 1111,793 1140,7 1160,307

ýas

1. den

1179,267 1177,802 1175,848 1187,072 1169,588 1178,400 1171,063 1167,200

6. den

8. den PrĤmČr všech výsledkĤ [mg.kg-1] RSD [%]

Tmavý [mg.kg-1] Koncentrace PrĤmČr 1140,258 1142,715 1140,5 1133,289 1145,891 1140,415 1127,613 1136,0 1139,504 1136,261 1132,541 1131,56 1141,2 1148,822 1151,833 1139,2 0,64

1180,0

1171,6 1166,2 1,77



Koncentrace [mg.kg-1]

      

















ýas [dny]

svČtlý

tmavý

Obr. 13: Stabilita kyseliny propionové v þerstvém toustovém chlebu

54



Diskuze Hodnoty relativní smČrodatné odchylky pro stanovení v rámci osmi dnĤ jsou velmi nízké a blízké hodnotám opakovatelnosti stanovení na této hladinČ. Byla prokázána velmi dobrá stabilita kyseliny propionové v toustovém chlebu po dobu minimální trvanlivosti výrobku. 4.3.5. Interní referenþní materiál Cílem tohoto testu bylo zjistit, zda je vzorek babety s citronovou pĜíchutí vhodný pro uchovávání jako interní referenþní materiál pro potĜeby SZPI. Tento výrobek byl vybrán pro svou dobrou homogenitu. Vzorek byl rozdČlen na šest þástí a uchováván ve zmraženém stavu po dobu pĤl roku, pĜiþemž každý mČsíc byla provedena analýza. Tabulka 20: Stabilita kyseliny propionové ve zmraženém vzorku babety s citronovou pĜíchutí MČsíc

1. 2. 1300,795 1304,429 Vzorek 1 1277,760 1303,459 1339,143 1306,308 Vzorek 2 1296,923 1295,186 -1 PrĤmČr [mg.kg ] 1303,7 1302,3 RSD [%] 1,97 0,38 -1 PrĤmČr všech výsledkĤ = CL [mg.kg ] UCL [mg.kg-1] LCL [mg.kg-1] RSD všech výsledkĤ [%]

3. 1345,538 1351,623 1364,264 1349,943 1352,8 0,59

4. 1314,076 1319,200 1289,355 1300,356 1305,7 1,04

5. 1311,510 1310,823 1308,261 1299,718 1307,6 0,41

6. 1348,134 1343,043 1270,493 1264,447 1306,5 3,46 1313,1 1371,8 1254,5 1,49

           











Obr 14: ShewhartĤv regulaþní diagram stability kyseliny propionové ve zmraženém vzorku babety s citronovou pĜíchutí

55

Diskuze Zmražený vzorek babety s citronovou pĜíchutí byl vyhodnocen jako vhodný interní referenþní materiál. Až na hodnotu ve tĜetím mČsíci skladování, která je zĜejmČ zpĤsobená chybou pĜi stanovení, jsou výsledky stabilní a nebyl zaznamenán pokles koncentrace kyseliny propionové. RSD ze všech výsledkĤ lze oznaþit jako velmi dobrou dlouhodobou opakovatelnost, hodnota 1,64 % se blíží opakovatelnosti stanovení tohoto vzorku.

4.4. Srovnání rĤzných zpĤsobĤ extrakce kyseliny propionové 4.4.1. Vliv doby extrakce ve vodČ na extrahované množství kyseliny propionové Byly pĜipraveny dva vzorky svČtlého þerstvého toustového chleba znaþky Tesco a po extrakci vodou v ultrazvukové lázni byly uloženy na 3 dny do chladniþky. Výsledky stanovení kyseliny propionové byly porovnány s klasickou extrakcí uvedenou v kapitole 3.3.2, byl vypoþítán procentuální rozdíl koncentrace a odchylka RSD. Tabulka 21: Prodloužená extrakce kyseliny propionové Koncentrace [mg.kg-1] Klasická extrakce Prodloužená extrakce Rozdíl koncentrace [%] RSD [%]

vzorek 1 1190,227 1296,278

vzorek 2 1204,569 1278,316

prĤmČr 1197,4 1285,8 6,9 5,04

Dále bylo pĜipraveno 6 vzorkĤ svČtlého sušeného toustového chleba znaþky Tesco a byly extrahovány v ultrazvukové lázni po dobu 10 až 60 minut. Poté byly vzorky analyzovány obvyklým zpĤsobem. Výsledky testu jsou uvedeny v tabulce 22 a znázornČny do grafu na obrázku 15. Tento test byl po þase zopakován se stejným vzorkem. Tabulka 22: Prodloužená extrakce kyseliny propionové v ultrazvuku Koncentrace [mg.kg-1]

nástĜik 1 10 minut 1442,488 20 minut 1430,829 30 minut 1440,709 40 minut 1445,291 50 minut 1458,104 60 minut 1486,777 PrĤmČr všech výsledkĤ [mg.kg-1] RSD všech výsledkĤ [%]

56

1. mČĜení nástĜik 2 1485,250 1449,978 1449,726 1465,271 1498,653 1504,908

prĤmČr 1463,9 1440,4 1445,2 1455,3 1478,4 1495,8 1463,2 1,43

nástĜik 1 1413,175 1473,220 1494,874 1517,587 1514,182 1530,888

2. mČĜení nástĜik 2 1436,409 1521,070 1452,840 1558,199 1494,576 1539,391

prĤmČr 1424,8 1497,1 1473,9 1537,9 1504,4 1535,1 1492,5 2,82

Koncentrace [mg.kg-1]

            















ýas [minuty]

1. mČĜení

2. mČĜení

Obrázek 15: Závislost koncentrace kyseliny propionové na dobČ extrakce v ultrazvuku Diskuze PĜi prodloužené extrakci po dobu 3 dnĤ byl zjištČn nárĤst obsahu kyseliny propionové o témČĜ 7 %. Tento zpĤsob je ale nevhodný pro rutinní stanovení a pro pĜesné zjištČní vlivu této prodloužené extrakce by bylo potĜeba více paraelních stanovení. Dále bylo zjištČno, že delší extrakce v ultrazvuku nemá podstatný vliv na množství extrahované kyseliny propionové, byl zpozorován jen lehce stoupavý charakter. Získané výsledky jsou v rámci chyby metody a homogenity vzorku. 4.4.2. Analýza upeþeného chleba se známým pĜídavkem propionanu sodného Chleby byly pĜipraveny podle postupu uvedeného v kapitole 3.3.2. Do dvou chlebĤ bylo pĜidáno 1,0374 g propionanu sodného a do dalších dvou chlebĤ 1,5560 g propionanu sodného. PĜed analýzou byly celé chleby zváženy na pĜedvážkách a byla vypoþítána koncentrace kyseliny propionové v jednotlivých chlebech. Hmotnost chlebĤ se pohybovala od 350 do 356 g. Výsledky prvního zpĤsobu opakované extrakce jsou uvedeny v tabulce 23. První zpĤsob opakované extrakce mČl velmi nízkou výtČžnost, a proto byl vyzkoušen také druhý zpĤsob. Druhé stanovení probČhlo asi 3 týdny po prvním. Protože došlo ke ztrátČ kyseliny propionové v chlebech, byl pĜídavek u každého chleba pĜepoþítán (byl od nČj odeþten procentuální úbytek z první a druhé klasické extrakce). Výsledky druhého zpĤsobu opakované extrakce jsou uvedeny v tabulce 24.

57

Tabulka 23: Výsledky analýzy upeþeného chleba a výtČžnosti jednotlivých zpĤsobĤ extrakce ZpĤsob extrakce Chléb 1 Klasická V mobilní fázi Opakovaná 1 Chléb 2 Klasická V mobilní fázi Opakovaná 1 Chléb 3 Klasická V mobilní fázi Opakovaná 1 Chléb 4 Klasická V mobilní fázi Opakovaná 1

Koncentrace [mg.kg-1] Vzorek 1 Vzorek 2 PĜídavek: 2074,400 2060,757 2055,543 2039,415 2000,345 1976,693 1938,078 1955,443 1748,647 1751,509 PĜídavek: 2012,341 2013,948 2029,545 2027,537 2040,903 2001,989 1986,580 1990,645 1724,734 1735,320 PĜídavek: 2992,855 2990,485 2986,352 2982,833 2929,311 2934,072 2957,565 2942,676 2580,327 2578,630 PĜídavek: 2980,453 2964,334 2973,884 2965,797 2918,281 2908,627 2610,638 2610,986 2587,147 2595,800

PrĤmČr 2285,7 2057,5 1967,6 1750,1 2279,2 2020,8 2005,0 1730,0 3342,6 2988,1 2940,9 2579,5 3370,8 2971,1 2913,5 2591,5

VýtČžnost [%] 90,0 86,1 76,6 88,7 88,0 75,9 89,4 88,0 77,2 88,1 86,4 76,9

Tabulka 24: Srovnání klasické a opakované extrakce (druhý zpĤsob) ZpĤsob extrakce Chléb 1 Klasická Opakovaná 2 Chléb 2 Klasická Opakovaná 2 Chléb 3 Klasická Opakovaná 2 Chléb 4 Klasická Opakovaná 2

Koncentrace [mg.kg-1] Vzorek 1 Vzorek 2 PĜídavek: 1587,994 1631,902 1683,970 1633,716 1576,447 1561,62 1614,092 1617,597 PĜídavek: 1738,363 1775,627 1756,627 1664,127 1625,067 1673,309 1620,368 1582,757 PĜídavek: 2573,204 2695,766 2571,820 2544,355 2592,579 2564,375 2540,742 2573,212 PĜídavek: 2650,975 2704,603 2653,524 2696,725 2660,787 2672,621 2628,195 2630,695

PrĤmČr 1862,6 1634,4 1592,4 1992,0 1733,7 1625,4 2950,8 2596,3 2567,7 3076,1 2676,5 2648,1

VýtČžnost [%] 87,7 85,5 87,0 81,6 88,0 87,0 87,0 86,1

Diskuze Nejprve bylo analýzou laboratornČ upeþeného chleba bez pĜídavku kyseliny propionové ovČĜeno, že chlebová smČs tento konzervant neobsahuje. VýtČžnost klasického zpĤsobu extrakce se u všech chlebĤ pohybovala kolem 89 %. Otázkou však stále zĤstává, jaké množství kyseliny propionové se ztratilo bČhem peþení, ale vzhledem k tomu, že sušením pĜi laboratorní teplotČ vytČká kolem 15 % konzervantu, u peþení pĜi 122 °C se také oþekává podobná ztráta. Použitá metoda má tedy velmi dobrou výtČžnost. Extrakce v roztoku mobilní fáze vykazovala o nČco nižší výtČžnost než extrakce ve vodČ. 58

První zpĤsob opakované extrakce vykazoval výtČžnost kolem 75 %, což je asi o 14 % ménČ než výtČžnost klasické extrakce. DĤvodem jsou zĜejmČ velké ztráty kyseliny propionové na filtraþním papíĜe po první extrakci, které by mohly být eliminovány druhým zpĤsobem opakované extrakce. Vzorky použité pĜi druhém zpĤsobu opakované extrakce byly uchovány asi 3 týdny v mrazniþce. PĜi skladování došlo k úbytku kyseliny propionové o 9 – 18 %. Je to zĜejmČ zpĤsobeno tím, že byl vzorek bČhem úchovy jednou rozmražen. PĜi stanovení výtČžností metod bylo s touto ztrátou poþítáno. PĜi výpoþtu koncentrace kyseliny propionové byl použit koneþný objem filtrátu 175 ml. Výsledky jsou srovnatelné s klasickým zpĤsobem extrakce. U chlebĤ s koncentrací kyseliny propionové 2000 mg.kg-1 bylo pĜi senzorickém hodnocení zjištČno ovlivnČní aroma kyselinou propionovou, u chlebĤ s koncentrací 3000 mg.kg-1 dokonce velmi silný štiplavý zápach. 4.4.3. Opakovaná extrakce ve vodČ Úprava vzorku pomocí opakované extrakce ve vodČ byla vyzkoušena pro zjištČní, zda v již jednou extrahovaném vzorku nezĤstane ještČ nČjaké množství kyseliny propionové. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 25. Tabulka 25: Srovnání stanovení pomocí klasické extrakce a opakované extrakce ve vodČ druhým zpĤsobem Koncentrace [mg.kg-1] Klasická extrakce Opakovaná extrakce 2 Klasická extrakce Opakovaná extrakce 2

Vzorek 1 Vzorek 2 Babeta s citronovou pĜíchutí 1348,134 1343,043 1270,493 1264,447 1321,736 1292,507 Formanský chléb 1103,517 1097,936 1126,259 1098,579 1100,944 1071,524 1106,854 1113,642

PrĤmČr

Rozdíl [%]

1306,5 1307,1

0,04

1106,6 1098,2

– 0,8

Diskuze Výsledky stanovení pomocí druhého zpĤsobu opakované extrakce jsou srovnatelné s klasikou extrakcí. I když bylo použito 200 ml vody, pĜi výpoþtu koncentrace byl použit koneþný objem fitrátu, který se pohyboval kolem 175 ml. Zbylý objem roztoku zĤstal pĜi druhé filtraci nasáklý ve filtraþním papíĜe a ve vzorku a výslednou koncentraci by zkresloval. Dá se tedy pĜedpokládat, že se ze vzorkĤ extrahuje veškeré množství kyseliny propionové klasickou extrakcí ve vodČ a pĜi druhé extrakci již nedochází k navyšování množství kyseliny propionové. 4.4.4. Extrakce v mobilní fázi Extrakce v roztoku mobilní fáze byla provedena pro zjištČní, zda má na extrahované množství kyseliny propionové vliv pH extrakþního roztoku. Demineralizovaná voda má pH kolem 5,6 a mobilní fáze má upravené pH na hodnotu 2,8. Výsledky experimentu shrnuje následující tabulka.

59

Tabulka 26: Srovnání stanovení pomocí extrakce ve vodČ a v mobilní fázi Koncentrace [mg.kg-1] Extrakce ve vodČ Extrakce v mobilní fázi Extrakce ve vodČ Extrakce v mobilní fázi

Vzorek 1 Vzorek 2 Babeta s citronovou pĜíchutí 1299,718 1308,261 1310,823 1311,510 1356,359 1359,812 1355,478 1349,635 Formanský chléb 1103,517 1097,936 1126,259 1098,579 1082,604 1102,543 1114,598 1098,856

PrĤmČr

Rozdíl [%]

1307,6 1355,3

3,5

1106,6 1099,7

– 0,6

Diskuze Kyselejší pH mobilní fáze nezvyšuje úþinek extrakce, výsledky jsou srovnatelné s extrakcí ve vodČ. Proto mohou být vzorky pĜipravovány extrakcí vodou, která je rychlejší a levnČjší než extrakce mobilní fází. 4.4.5. Destilace s vodní parou Použitý zpĤsob úpravy vzorku pomocí extrakce vodou byl srovnán destilací s vodní parou, což je klasická metoda extrakce organických kyselin a konzervantĤ. Nejprve byla metoda vyzkoušena bez vzorku pouze s pĜídavkem standardního roztoku kyseliny propionové o koncentraci 100 mg.l-1 v koneþném objemu. Destilace byla provádČna do 250 ml odmČrné baĖky po rysku. Do destilaþní baĖky pĜidáno 2,5 ml standardního roztoku o koncentraci 10 g.l-1. Výsledky experimentu shrnuje následující tabulka. Tabulka 27: Výsledky destilace s vodní parou standardních roztokĤ Plochy píkĤ Vzorek 1 Vzorek 2 Destilace do 250 ml 108593 107843 108500 108483 Standard 100 mg.l-1 113007 115346 115235 116152 VýtČžnost destilace do 250 ml [%]

PrĤmČr 108355 114953

s

RSD [%]

344,6 1315,4 94,3

0,32 1,14

VýtČžnost pĜi stanovení kyseliny propionové destilací s vodní parou byla stanovena na 94,3 %, což bylo vyhodnoceno jako uspokojující. Doba destilace trvala asi jednu hodinu. Dále byl zpĤsob extrakce kyseliny propionové destilací s vodní parou aplikován na celkem 6 reálných vzorkĤ peþiva. V tabulce 28 jsou uvedeny výsledky analýzy vzorkĤ pomocí destilace s vodní parou a srovnání s analýzou pomocí extrakce kyseliny propionové ve vodČ. Destilace byla provádČna do 250 ml odmČrné baĖky po rysku. Stanovení metodou extrakce ve vodČ bylo provedeno vždy se stejným vzorkem ve stejné dobČ jako destilace, aby se pĜedešlo zkreslení výsledkĤ vlivem možné ztráty kyseliny propionové pĜi skladování.

60

Tabulka 28: Srovnání stanovení pomocí extrakce ve vodČ a destilace s vodní parou Koncentrace [mg.kg-1] Extrakce ve vodČ Destilace s vodní parou Extrakce ve vodČ Destilace s vodní parou Extrakce ve vodČ Destilace s vodní parou Extrakce ve vodČ Destilace s vodní parou Extrakce ve vodČ Destilace s vodní parou Extrakce ve vodČ Destilace s vodní parou

Vzorek 1 Vzorek 2 Toustový chléb svČtlý – Tesco (sušený) 1263,291 1278,028 1295,406 1267,694 1290,871 1285,174 Toustový chléb tmavý – Tesco (sušený) 1478,493 1484,308 1542,108 1570,359 1510,801 1451,308 1444,288 1464,574 Žitný chléb 1015,733 953,188 1041,058 1021,095 317,221 359,694 342,006 340,275 Babeta s citronovou pĜíchutí 1356,976 1348,695 1390,187 1384,464 1101,244 1123,043 1104,263 1129,481 OtíkĤv dezert 1126,595 1125,1 1084,748 1078,77 1042,162 1067,721 1085,64 1088,896 Dezert punþový 493,554 504,063 738,618 755,353 793,534 809,251 883,46 837,407

PrĤmČr

Rozdíl [%]

1276,1 1288,0

+ 0,9

1518,8 1467,7

– 3,4

1007,8 339,8

– 66,3

1370,1 1114,5

– 18,7

1103,8 1071,1

– 3,0

622,9 830,9

+ 25,0

Diskuze ObecnČ byla zjištČna u destilace s vodní parou nižší výtČžnost než u extrakce kyseliny propionové ve vodČ. Až na žitný chléb, který vykazoval velmi malé hodnoty oproti extrakci ve vodČ, byly všechny výsledky v rozpČtí kalibrace 25 až 100 mg.l-1 a není tedy potĜeba zkoncentrování destilátu. U toustových chlebĤ a Otíkova dezertu jsou výsledky srovnatelné a destilace s vodní parou je tedy vhodná metoda pro stanovení kyseliny propionové v tČchto výrobcích. Velice nevhodné je stanovení kyseliny propionové pomocí destilace s vodní parou v žitném chlebu, u kterého byla zjištČna o 66 % nižší koncentrace. Lepší výsledky byly dosaženy u punþového dezertu znaþky Metro. Tento výrobek ale vykazoval znaþnou nehomogenitu, která mohla výsledek ovlivnit. Lze to vidČt na velkém rozdílu zjištČných koncentrací dvou stanovení extrakcí ve vodČ. Špatná homogenita je zĜejmČ zpĤsobena velkým podílem tuhé polevy v tomto vzorku. Možným Ĝešením by mohla být homogenizace vzorku bez polevy a pĜepoþítání obsahu kyseliny propionové na hmotnost celého výrobku. Destilace byla provedena také se vzorky závinu s náplní makovou a þeských buchtiþek s náplní tvarohovou, u kterých nebyla pomocí extrakce ve vodČ zjištČna pĜítomnost kyseliny propionové, i když je tento konzervant uveden na obale. Ke vzorkĤm byl pĜidán standardní roztok s koncentrací kyseliny propionové v koneþném objemu 100 mg.kg-1. Výsledek pĜedstavoval u obou vzorkĤ asi 85 % pĜidané koncentrace standardu. Je tedy pravdČpodobné, že pĜi destilaci docházelo k úniku kyseliny propionové netČsným zábrusem u aparatury.

61

Ve stejný den probíhala i destilace babety s citronovou náplní, u které byla zjištČna o 20 % nižší koncentrace než pĜi stanovením pomocí extrakce ve vodČ. Tato chyba by mohla být zpĤsobena také špatným utČsnČním aparatury. Destilace s vodní parou trvaly asi jednu hodinu. Ve srovnání s extrakcí ve vodČ je tato úprava vzorku více zdlouhavá, pracnČjší (sestavování aparatury) a má vČtší nároky na vybavení laboratoĜe (práce v digestoĜi, pĜívod plynu pro kahan a vody na chlazení). Dochází také k vČtšímu zĜedČní vzorku (10 g do 250 ml oproti 100 ml u extrakce). Dále je nutné kontrolovat tČsnost celé aparatury, aby nedocházelo k úniku stanovované látky, který vede k nižší výtČžnosti stanovení. Destilace s vodní parou byla vyhodnocena jako ménČ vhodná metoda úpravy vzorku pro stanovení kyseliny propionové v peþivu kapalinovou chromatografií.

62

5. ZÁVċR Kyselina propionová a její soli propionany patĜí mezi aditivní látky s antimikrobiálním úþinkem. Používají se hlavnČ na konzervaci pekaĜských výrobkĤ, napĜíklad chlebĤ s prodlouženou trvanlivostí nebo jemného peþiva. Používají se hlavnČ soli kyseliny, které jsou více rozpustné ve vodČ. ZabraĖují rĤstu mnoha druhĤ plísní, ale také nČkterých druhĤ bakterií, které zpĤsobují napĜíklad vadu peþiva zvanou nitkovitost chleba. Naopak nejsou úþinné proti kvasinkám, což je u kynutého peþiva víceménČ pozitivní. Mají také úþinek jako inhibitory plísní pĜi povrchovém ošetĜení sýrĤ. V ýeské republice reguluje používání tČchto konzervantĤ v potravinách vyhláška ministerstva zdravotnictví þ. 4/2008 Sb. Kyselina propionová a propionany sodné, vápenaté a draselné se oznaþují kódy E280 – E283. Nejvyšší povolené množství dosahuje až 3000 mg.kg-1 u baleného plátkového chleba s trvanlivostí delší než 5 dnĤ a žitného chleba, u dalších typĤ peþiva jsou povoleny maximální koncentrace 2000 nebo 1000 mg.kg-1. V zahraniþí byl studován úþinek kyseliny propionové a dalších konzervantĤ peþiva pĜi rĤzných podmínkách (koncentrace konzervantu, pH prostĜedí, aktivita vody). Za nejúþinnČjší konzervant pekaĜských výrobkĤ je považována kyselina sorbová. Kyselina propionová v koncentraci 3000 mg.kg-1 inhibuje rĤst vČtšiny druhĤ plísní, pĜi vyšším pH a aktivitČ vody se ale její úþinek snižuje. Koncentrace kyseliny propionové 300 mg.kg-1 vykazovala jen slabé inhibiþní úþinky, a dokonce stimulovala rĤst nČkterých druhĤ plísní. Kyselina propionová byla ve vzorcích stanovována metodou požadovanou laboratoĜí Státní zemČdČlské a potravináĜské inspekce v BrnČ: extrakce kyseliny propionové ve vodČ a stanovení kapalinovou chromatografií s UV detekcí. Tato metoda vykazovala velmi dobré výsledky. Separace chromatografií na reverzní fázi C18 je úþinná a pík kyseliny propionové je dostateþnČ oddČlen od okolních píkĤ jiných látek. Byly také stanoveny validaþní parametry této metody. Závislost analytického signálu na koncentraci kyseliny propionové vykazuje velmi dobrou linearitu. Mez detekce byla stanovena na 5,0 mg.l-1 a mez stanovitelnosti 16,8 mg.l-1. Metoda extrakce ve vodČ i stanovení kapalinovou chromatografií vykazovaly velmi dobrou opakovatelnost, hodnoty RSD se pohybovaly cca od 0,05 do 3,0 %. VýtČžnost byla stanovena metodou standardních pĜídavkĤ a pohybovala se kolem 94 %. VČtšina testovaných vzorkĤ nepĜekroþila povolený limit koncentrace kyseliny propionové. Pouze medové pláty obsahovaly témČĜ dvojnásobek povoleného množství. Byl dán podnČt k šetĜení a kontrole potravináĜskou inspekcí. Ve dvou vzorcích nebyla kyselina propionová detekována, pĜestože je tento konzervant uveden na obale. Je to považováno za nadbyteþný údaj, který se nepostihuje sankcemi. U vČtšiny studovaného peþiva se koncentrace kyseliny propionové pohybovala kolem 1000 – 1500 mg.kg-1, v jemném peþivu s náplní bylo stanoveno ménČ kyseliny propionové (400 – 600 mg.kg-1). Vzhledem k výsledkĤm studií úþinku tohoto konzervantu však není jisté, zda má toto množství konzervantu požadovaný efekt na rozvoj plísní a bakterií. Extrakce kyseliny propionové ve vodČ se jeví jako vhodný zpĤsob analýzy tohoto konzervantu. Pro extrakci postaþuje doba 10 minut v ultrazvukové lázni, delší doba extrakce nevykazovala podstatné zvýšení koncentrace kyseliny v extrakþním rozpouštČdle. Také nebyl zaznamenán rozdíl mezi dvČma paralelními stanoveními s 5 a 10 gramy vzorku. Kyselina propionová je v peþivu pomČrnČ stálá, za dobu minimální trvanlivosti toustových chlebĤ nebyl zaznamenán pokles její koncentrace. Ke ztrátám dochází pĜi sušení vzorku, asi o 15 % pĜi sušení pĜi laboratorní teplotČ. DĤvodem jsou pravdČpodobnČ tČkavé vlastnosti této 63

kyseliny. Také bylo zjištČno, že kĤrka toustového chleba obsahuje ménČ kyseliny propionové než stĜídka, zĜejmČ díky rozdílným teplotám na povrchu a ve stĜedu bochníku chleba bČhem peþení a vytČkání kyseliny propionové. Ztráty zpĤsobené zmražením vzorku nejsou pĜesnČ známé, výsledky u jednotlivých druhĤ peþiva se mírnČ lišily. Je možné, že pokud byl vzorek v prĤbČhu úchovy již jednou rozmražen a opČt zmražen, obsah kyseliny propionové klesne. Ke ztrátČ kyseliny propionové ve zmraženém vzorku pĜi dlouhodobém uchování nedochází, jak bylo zjištČno u vzorku babety s citronovou náplní, která byla vyhodnocena jako vhodný interní referenþní materiál pro potĜeby SZPI. Je však dĤležité dodržet podmínky úchovy vzorku, tedy rozdČlit vzorek na více þástí, a rozmrazit až pĜed analýzou. Analýzou laboratornČ upeþených chlebĤ se známým pĜídavkem kyseliny propionové byla zjištČna výtČžnost asi 90 %, což je velmi dobrá hodnota vzhledem k pĜedpokladu ztráty propionanu pĜi peþení. Kyselina propionová negativnČ ovlivĖuje senzorický profil peþiva a propĤjþuje mu nepĜíjemný štiplavý zápach. Ten byl zaznamenán u laboratornČ upeþeného chleba s koncentrací 2000 mg.kg-1, u chleba s koncentrací 3000 mg.kg-1 byl dokonce velmi silný. Jen u medových plátĤ s koncentrací témČĜ 4000 mg.kg-1 tento zápach nebyl cítit, protože byl maskován výrazným medovým aroma. U studovaného komerþního peþiva nebyl senzorický profil zĜetelnČ ovlivnČn. Byly vyzkoušeny také další zpĤsoby extrakce kyseliny propionové ze vzorku. Po srovnání výsledkĤ destilace s vodní parou s výsledky získanými metodou extrakce ve vodČ vyšlo najevo, že pĜi destilaci se dosahuje nižších výtČžkĤ, pouze u nČkterých vzorkĤ byly výtČžky podobné nebo o nČco vyšší. Extrakcí použitím roztoku mobilní fáze (fosfátového pufru s upraveným pH na hodnotu 2,8) byly zjištČny srovnatelné nebo mírnČ nižší hodnoty koncentrace kyseliny propionové. Kyselé pH tedy nezvyšuje výtČžnost extrakce této kyseliny. PĜi opakované extrakci také nebyl zjištČn nárĤst koncentrace kyseliny propionové. Také pĜi prodloužené extrakci ve vodČ nebylo zjištČné podstatnČ vyšší množství konzervantu, tudíž se pĜedpokládá, že témČĜ všechna kyselina propionová pĜejde do vody v 10 minutách extrakce. Vybrané chromatogramy jsou uvedeny v pĜíloze. Na chromatogramech metody destilace s vodní parou je podle pĜedpokladĤ patrné menší množství píkĤ než na chromatogramech metody extrakce ve vodČ, protože pĜi destilaci s vodní parou se extrahují jen tČkavé látky. Chromatogramy u metod extrakce v mobilní fázi a opakované extrakce jsou podobné chromatogramĤm metody extrakce ve vodČ, dochází tudíž k extrakci stejných látek. Metoda použitá v této práci, extrakce kyseliny propionové ve vodČ a stanovení vysokoúþinnou kapalinovou chromatografií s UV detekcí, byla vyhodnocena jako vhodná metoda pro stanovení kyseliny propionové v pekaĜských výrobcích. Jejími výhodami jsou jednoduchost, rychlost a citlivost.

64

6. SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJģ [1]

NOLLET, L.M.L. Food Analysis by HPLC. 2nd rev. edition. [s.l.] : CRC Press, c2000. 1049 s. ISBN 082478460X.

[2]

O'NEIL, MARYADELE, J. et al. The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals (14th Edition - 2nd Electronic Update). Merck & Co., Inc.. c2006, 2008.

[3]

ROBINSON, R.K. Encyclopedia of Food Microbiology. [s.l.] : Elsevier, c2000.

[4]

FAO: JECFA specifications for food additives [online]. c2008 [cit. 2008-12-08]. Dostupný z WWW: .

[5]

KUMAR, S., BABU, B.V. A Brief Review on Propionic Acid: A Renewal Energy Source. Birla Institute of Technology and Science [online]. 2006 [cit. 2008-12-07]. Dostupný z WWW: .

[6]

VELÍŠEK, J., et al. Chemie potravin 3. 1. vyd. Tábor: OSSIS, 1999. 368 s. ISBN 80-902391-5-3.

[7]

Vyhláška ministerstva zdravotnictví þ. 4/2008 Sb.

[8]

LÜCK, E., JAGER, M., LAICHENA, S.F. Antimicrobial Food Additives: Characteristics, Uses, Effects. 2nd rev. edition. [s.l.] : Springer, 1997. 260 s.

[9]

VRBOVÁ, T. Víme, co jíme? : aneb PrĤvodce "Éþky" v potravinách. [s.l.] : EcoHouse, 2001. 268 s. ISBN 80-238-7504-3.

[10] SUHR, KI, NIELSEN, PV. Effect of weak acid preservatives on growth of bakery product spoilage fungi at different water activities and pH values. International journal od food microbiology [online]. 2004-08-15, vol. 95, is. 1 [cit. 2008-03-26], s. 67-78. [11] MARÍN, S., et al. Risk assessment of the use of sub-optimal levels of weak-acid preservatives in the control of mould growth on bakery products.. International Journal of Food Microbiology. 2002-02-28, no. 79, s. 203-211. [12] GUYNOT, M.E., et al. Study of benzoate, propionate, and sorbate salts as mould spoilage inhibitors on intermediate moisture bakery products of low pH (4.5–5.5). International Journal of Food Microbiology [online]. 2005, vol. 101, is. 2 [cit. 2008-0821], s. 161-168. [13] KOLEJKOVÁ, D. Za „nemocný“ chleba pokuta. Státní zemČdČlská a potravináĜská inspekce [online]. 2005-07-20 [cit. 2008-10-09]. Dostupný z WWW:

65

[14] Bezpeþnost potravin: A-Z slovník pro spotĜebitele: Nitkovitost chleba [online]. c2008 [cit. 2008-10-09]. Dostupný z WWW: . [15] HUI, Y. H. (Ed.): Handbook of Food Science, Technology and Engineering. Dekker/CRC Press, New York, USA, 2005, 3632 s. ISBN: 0-8493-9847-9. [16] CABALLERO, B., et al. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition: Second edition. [s.l.] : Academic Press, 2003. 630 s. ISBN 0-12-227055-x. [17] BRUL, S., COOTE, P. Preservative agents in foods: Mode of action and microbial resistance mechanisms. International Journal of Food Microbiology [online]. 1999, vol. 50, is. 1-2 [cit. 2009-01-05], s. 1-17. [18] KLOUDA, P. Moderní analytické metody. 2. upr. dopl. vyd. Ostrava : Pavel Klouda, 2003. 132 s. ISBN 80-86369-07-2. [19] SOMMER, L. Základy analytické chemie. 1. vyd. Brno: Vysoké uþení technické v BrnČ, VUTIUM, 2000. 347 s. [20] KAZAKEVICH, Y., MCNAIR, H.M. . HPLC Frames [online]. c1996-2002 [cit. 200811-23]. Dostupný z WWW: . [21] VOLKA, K. Analytická chemie II.. 1. vyd. Praha: Vysoká škola chemickotechnologická, 1995. 236 s. ISBN 8070802278. [22] DOUŠA, M.. HPLC, High Performance Liquid Chromatography [online]. c1999-2008 [cit. 2008-11-22]. Dostupný z WWW: . [23] ýĤta, F., et al. Instrumentální analýza. Praha: SNTL, 1986. 295 s. [24] COUFAL, P. HPLC [online]. c2004 [cit. 2009-01-24]. Dostupný z WWW: . [25] LAMKIN, W. M., UNRUH, N. C., POMERANZ, Y. Gas chromatographic determination of calcium propionate added as preservative to bread. Journal of the Association of Official Analytical Chemists. 1987, vol. 70, no. 4, s. 763-767. [26] ISSHIKI, K., TSUMURA, S., WATANABE, T. Gas chromatographic determination of propionic acid in bread and cake. Journal of the Association of Official Analytical Chemists. 1981, vol. 64, no. 2, s. 280-281. [27] ACKERMANS, M. T., ACKERMANS-LOONEN, J. C. J. M., BECKERS, J. L. Determination of propionate in bread using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1992, vol. 627, is. 1-2, s. 273-279. [28] YUKINARI, T., et al. Determination of Propionic Acid in Foods by High Performance Liquid Chromatography. Annual Report of Tokyo Metropolitan Research Laboratory of Public Health. 1998, vol. 49, s. 77-83. ISSN 0082-4771. 66

[29] MASATO, S., KOKI, F., TOSHIAKI, Y. Determination of Propionic acid, Calcium propionate and Sodium propionate in Mixed Feed by High Performance Liquid Chromatoraphy. Shiryo Kenkyu Hokoku. 1999, vol. 24, s. 79-90. [30] LIU, C. M., et al. Fast detection of organic acid in anaerobe medium with gradient elution-high performance liquid chromatography. Chinese Journal of Analytical Chemistry. 2006, vol. 34, is. 9, s. 1231-1234. [31] QIAN, B., et al. Determination of organic acids in propionic acid fermentation broth by reversed phase high performance liquid chromatography. Chinese Journal of analytical chemistry. 2007, vol. 35, is. 11, s. 1651-1653. [32] FERNANDEZ-GARCIA, E., MCGREGOR, J. U. Determination of Organic Acids During the Fermentation and Cold Storage of Yogurt. Journal of Dairy Science. 1994, vol. 77, no. 10, s. 2934-2939. [33] LODI, S., ROSSIN, G. Determination of some organic acids in sugar factory product. Journal od Chromatography A. 1995, vol. 106, is. 1-2, s. 375-383. [34] PARK, Y. W., LEE, J. H. Effect of freezing on organic acid contents and lipolytic index of plain soft and Monterey Jack goat milk cheeses. Small Ruminant Research. 2006, vol. 63, is. 1-2, s. 58-65. [35] ýSN ISO 8258 (010271) : Shewhartovy regulaþní diagramy. Praha: ýeský normalizaþní institut, 1994. 36 s.

67

7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLģ ADI CL CZE FAO GC GRAS HPLC LCL LD50 LOD LOQ NM NPM PDA, DAD RPC RSD UCL UV VIS WHO

68

Acceptable Daily Intake, pĜijatelný denní pĜíjem Center Line, centrální pĜímka Capillary Zone Electrophoresis, kapilární zónová elektroforéza Food and Agriculture Organization, Organizace pro výživu a zemČdČlství Gas Chromatography, plynová chromatografie Generally Recognized As Safe, látky všeobecnČ považované za bezpeþné High Performance Liquid Chromatography, vysoce úþinná kapalinová chromatografie Lower Control Limit, dolní regulaþní mez Lethal Dose, smrtelná dávka v 50 procentech pĜípadĤ Limit of Detection, mez detekce Limit of Quantitation, mez stanovitelnosti Nezbytné množství Nejvyšší povolené množství Photodiode-Array Detector, detektor diodového pole Reversed-Phase Chromatography, chromatografie na obrácených fázích Relativní smČrodatná odchylka Upper Control Limit, horní regulaþní mez Ultraviolet, ultrafialové Visible, viditelné World Health Organization, SvČtová zdravotnická organizace

8. SEZNAM PěÍLOH PĜíloha 1: Chromatogram vzorku svČtlého toustového chleba (extrakce ve vodČ) PĜíloha 2: Chromatogram vzorku svČtlého toustového chleba (destilace s vodní parou) PĜíloha 3: Chromatogram vzorku babety s citronovou náplní (extrakce ve vodČ) PĜíloha 4: Chromatogram vzorku babety s citronovou náplní (destilace s vodní parou) PĜíloha 5: Chromatogram vzorku medových plátĤ (extrakce ve vodČ) PĜíloha 6: Chromatogram croissantu znaþky Tesco (extrakce ve vodČ) PĜíloha 7: Chromatogram vzorku nugátového croissantu Kubíþek (extrakce ve vodČ) PĜíloha 8: Chromatogram laboratornČ upeþeného chleba s pĜídavkem kyseliny propionové kolem 3000 mg.kg-1 (extrakce ve vodČ)

69

9. PěÍLOHY

PĜíloha 1: Chromatogram vzorku svČtlého toustového chleba (extrakce ve vodČ)

PĜíloha 2: Chromatogram vzorku svČtlého toustového chleba (destilace s vodní parou)

70

PĜíloha 3: Chromatogram vzorku babety s citronovou náplní (extrakce ve vodČ)

PĜíloha 4: Chromatogram vzorku babety s citronovou náplní (destilace s vodní parou)

71

PĜíloha 5: Chromatogram vzorku medových plátĤ (extrakce ve vodČ)

PĜíloha 6: Chroatogram croissantu znaþky Tesco (extrakce ve vodČ)

72

PĜíloha 7: Chromatogram vzorku nugátového croissantu Kubíþek (extrakce ve vodČ)

PĜíloha 8: Chromatogram laboratornČ upeþeného chleba s pĜídavkem kyseliny propionové kolem 3300 mg.kg-1 (extrakce ve vodČ)

73