Vybrané imunologické metody Ing. Petra Šandová Klinická imunologie a alergologie – laboratoř ÚKBLD a 1. LF UK VFN
Laboratorní imunologická vyšetření
Humorální imunita proteiny
krevního séra (Ig, C, CRP), IK paraproteiny, kryoglobuliny specifické IgE, ECP autoprotilátky
Buněčná imunita subpopulace
lymfocytů - imunofenotypizace intracelulární cytokiny fagocytóza HLA B27
Laboratorní imunologická vyšetření
Periferní krev
Humorální imunita - sérum, plazma
Buněčná imunita - plná krev s antikoagulačním činidlem
Tělní tekutiny - likvor, BAL, punktáty, výpotky
Indikace laboratorních vyšetření v klinické imunologii
Určení diagnózy
Diferenciální diagnostika
Potvrzení diagnózy
Monitorování terapie
Screening rodin
Imunologické laboratorní metody 1. volby
Hladiny imunoglobulinů - IgG, IgA, IgM event. IgE
Cirkulující imunokomplexy metodou PEG
C3, C4 složka komplementu
Antinukleární protilátky (ANAb) metodou NIF ENA screening
Stanovení povrchových znaků lymfocytů (CD3, CD4, CD8), B lymfocytů (CD19, CD20), NK buněk (CD3-CD16+56+)
U dětí vyšetření fagocytózy
Imunologické laboratorní metody 1. volby
Součástí kompletního imunologického vyšetření je vždy:
kompletní krevní obraz t.j. včetně diferenciálního rozpočtu leukocytů
FW (ev. CRP zejména u dětí)
Imunologické laboratorní metody 2. volby
Autoprotilátky orgánově nespecifické (dsDNA, ENA typizace, ANCA, APLA, SMAb, AMAb a další)
Orgánově specifické protilátky (anti-tTG, ASCA, anti-TG, anti-TPO, LKM a další)
Další ukazatele buněčné imunity např. znaky aktivace T lymfocytů, adhezívní molekuly
Funkční testy T a B lymfocytů (blastická transformace)
Vyšetření fagocytárních funkcí včetně oxidativního vzplanutí granulocytů
Imunologické laboratorní metody 2. volby
Stanovení specifických IgE
ECP
C1 inhibitor, C1inh funkční test
Stanovení sekrečního IgA
Stanovení podtříd IgG1, IgG2, IgG3, IgG4
Principy laboratorních imunochemických metod
Antigen + protilátka
imunitní komplex
detekce
protilátky pomocí antigenu detekce antigenu pomocí protilátky
Principy detekce přímá
detekce nepřímá detekce detekce založená na značení antigenu nebo protilátky
Přímá detekce Ag nebo Ab Imunonefelometrie Imunoturbidimetrie Radiální imunodifúze Imunoelektroforéza Protisměrná imunoelektroforéza Imunofixační elektroforéza
Imunonefelometrie
Ig, složky komplementu, CRP, CIK-C1q Měření světla rozptýleného na komlexech Ag-Ab
Imunonefelometrie
Dade Behring – BN II
Radiální imunodifúze
C1q Kruhová difúze roztoku Ag z kruhové jamky do vrstvy gelu s obsahem protilátky
CH100
Funkční test stanovení celkové hemolytické aktivity komplementu V gelu ovčí ery s navázanou Ab proti ovčím ery. Séra se pipetují do aplikačních jamek Komplement se aktivuje při 37 0C (klasická cesta) Lýza ery - projasnění
Protisměrná imunoelektroforéza
ENA screen Migrace antigenu a protilátky při elektroforéze proti sobě
Imunofixační elektroforéza
Gamapatie Elektroforetická separace proteinů na gelu Imunoprecipitace s monospecifickými antiséry
Nepřímá detekce Ag nebo Ab
Latex fixační test
Nepřímá (pasivní) hemaglutinace
Aglutinační inhibiční test
Komplement fixační reakce
Latex fixační test
RF Latexová částice – Ab + Ag
aglutinace
Nepřímá hemaglutinace
Protilátky proti zona pellucida Antigen je adsorbován na erytrocytech Protilátka je přítomna ve vzorku V případě nepřítomnosti hledané protilátky nedojde k hemaglutinaci
Detekce založená na značení antigenu nebo protilátky
Enzymy – EIA
Flurochromy – FIA
Chemiluminiscenční látky – CLIA
Radionuklidy - RIA
Enzymová imunoanalýza
Stanovení autoprotilátek ELISA – enzymová imunoanalýza na pevné fázi
Enzymová imunoanalýza
Imunoblotting WB Dot
blot
ENA typizace Anti-gangliosidy AMAb II Jaterní blot
Protilátky proti extrahovatelnému nukleárnímu antigenu
Anti-SSA/Ro Anti-SSB/La Anti-Sm (B´B) Anti-Sm (D) Anti-Scl 70 Anti-RNP Anti-Pm-Scl Anti-NuMA Anti-Ku Anti-Jo Anti-histon ACA
SLE, Sjögrenův syndrom SLE, Sjögrenův syndrom SLE SLE systémová sklerodermie smíšená choroba pojiva SLE polymyositida, dermatomyositida Sjögrenův syndrom, SLE, RA sklerodermie dermatomyositida, polymyositida léky indukovaný SLE, SLE, RA CREST syndrom, sklerodermie
Fluorescenční imunoanalýza
Stanovení autoprotilátek
Nepřímá imunofluorescence
Fluorescenční imunoanalýza
Typy substrátů
Tkáňové řezy krysí - LKS Tkáňové řezy opičí - ovaria, ledviny, mozeček, nadledvinky, endomýzium Suspenze - prvok Crithidia luciliae - lidské granulocyty Tkáňové kultury - HEp-2, HUVEC
Tkáňové řezy krysí
AMAb
GPCAb
SMAb
Tkáňové řezy opičí
Protilátky proti bazální membráně glomerulů (GBM)
Suspenze: lidské granulocyty
cANCA
pANCA
Suspenze: prvok Crithidia lucilae
Protilátky proti dsDNA
Tkáňové kultury: HEp-2 buňky
Antinukleární protilátky (ANAb)
cíle v buňce Antigenní Antigenní cíle v buňce Jaderné autoantigeny polynukleotidy histony ribonukleoproteiny antigeny jadérek centroméra další antigeny
Orgánově nespecifické antigeny cytoplazmy buněčné organely antigeny cytoskeletu další antigeny
Jaderná membrána s póry
Antigeny asociované s dělením buňky centriola dělící vřeténko separační zóna buňky
Průtoková cytometrie
Technika umožňující kvantitativně analyzovat velké množství částic (např. buněk) v suspenzi Buňky lze rozlišit dle jejich velikosti (FSC), granularity (SSC), obsahu DNA, značením monoklonálními Ab,…
Průtoková cytometrie 1000 800 400
600
Neutrofily
200
Monocyty
Lymfocyty a 0
SSC
Eosinofily
0
200
Trombocyty, erytrocyty a debris
400
600
800
1000 Bazofily
FSC
Průtoková cytometrie CD19 PE
CD3 FITC
Průtoková cytometrie
Průtokový cytometr BD FACS Canto
Chemiluminiscenční imunoanalýza
Stanovení specifických IgE, ECP Immulite 2000
Alkalická fosfatáza - detekce tímto enzymem vyvolaného luminiscenčního záření
Chemiluminiscenční imunoanalýza
Stanovení specifických IgE Advia Centaur
Acridium ester – emitace světla při oxidaci H2O2 v alkalickém prostředí
Kryoglobuliny
Imunoglobuliny precipitující v chladu Speciální odběr 3 typy:
Typ I. – monoklonální kryoglobuliny, paraproteiny IgG, IgM, IgA
Typ II. – smíšené kryoglobuliny, kombinace paraproteinu s polyklonálním Ig
Typ III. – polyklonální imunoglobuliny
Děkuji za pozornost!
