W18 Zelf aan de slag met de leskist DNA
Caspar Geraedts (De Praktijk / VU)
IK
DOELEN Aan het eind van de workshop… • weet je wat je moet regelen om bij jou op school met de leskist DNA te kunnen werken, • weet je in grote lijnen welke practica je met de leskist(en) kunt doen, • voel je je in staat om zelfstandig met de kist te werken, • heb je kennis gemaakt met de belangrijkste stappen van protein fingerprinting.
OVER DE LESKISTEN www.itsacademy.nl zelf ophalen
sportprestatie = gratis leskist DNA = prijs kit
LESKIST DNA overzicht leskisten DNA DNA
eiwit
bioinformatica stempelen
NFI: forensisch DNAonderzoek
SILS: genexpressie SILS: genexpressie en chromosoom- en toxicologie vouwing
PCR, horizontale gelelektroforese
verticale gelektroforese
BLAST (online)
A Life Typeface
3 tot 4 lessen
3 tot 4 lessen
1 tot 2 lessen
1 tot 2 lessen
[geen context]
LESKIST DNA - GENEXPRESSIE Organisatieniveaus: van organisme naar molecuul
LESKIST DNA - GENEXPRESSIE Voorbereidende les (vooruitblik technieken – minds on)
Practicum (doen – hands on)
Vervolgopdracht (recent onderzoek chromosoomvouwing)
LESKIST DNA - GENEXPRESSIE Leerdoelen • ervaren dat er tussen verschillende cellen en weefsels (grote) verschillen zijn in genexpressie, • leren over de structuur van eiwitten, • ervaring opdoen met het hoe, wat en waarom van labwerk (pipetteren, gelelektroforese). Wij doen vandaag een stuk van het practicum. We beginnen met een filmpje…
LESKIST DNA - GENEXPRESSIE Kenmerken practicum - eigen keuze monsters, dus uitkomst is open - veilig (kant-en-klare gels) - voorbereiding eenvoudig - eigenlijk ontwikkeld voor evolutieonderzoek (zelfde weefsel, verschillende organismen)
EIWITEXTRACTIE Stap 1: • label vijf epjes voor de vijf monsters (A t/m E) • voeg 250 µl Laemmli sample buffer toe aan elk epje • voeg ongeveer 0.25 cm3 visorgaan toe aan de epjes en schrijf op welk orgaan bij welke letter hoort • tik 15 keer tegen het buisje om te mengen • incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur
EIWITEXTRACTIE Stap 2: • label ook de vijf schroefdopbuisjes (A t/m E) • schenk de buffer uit elk buisje voorzichtig in het corresponderende schroefdopbuisje; NIET de vis meeschenken! • verhit de schroefdopbuisjes 5 minuten bij 95˚C (eiwitten denatureren)
GELELEKTROFORESE Waarom gebruiken we polyacrylamidegel om eiwitten te sorteren? • acrylamide gel heeft een dichte matrix en dus kleinere poriën dan agarose • eiwitten zijn veel kleiner dan DNA, want… gemiddeld aminozuur = 110 Da gemiddeld basenpaar = 649 Da 1 kilobase DNA = 650 kDa 1 kilobase DNA codeert voor 333 aminozuren = 36 kDa
GELELEKTROFORESE Hoe laad je een gel? • houd de pipetpunt boven het slotje • maak contact met het achterste (hogere) plaatje • beweeg voorzichtig het puntje naar de bovenkant van het slotje • pipeteer het monster rustig uit (doordrukken tot tweede punt) • het monster moet onderin het slotje liggen • gebruik steeds een nieuw puntje
GELELEKTROFORESE Gewichtsstandaard • eiwitten, met kleurstof, van verschillende groottes • de werkelijke groottes verschillen van batch tot batch (maar worden meegeleverd) Actine myosine standaard • actine en myosinefilamenten van bekende lengtes
KLEUREN Na de gelelektroforese… • haal de gel uit de tank en verwijder het plastic • scheid de platen door de kam tussen de platen te plaatsen en voorzichtig te wrikken Kleuren • spoel de gel met kraanwater • giet 50 ml Bio-Safe coomassie bij de gel • kleur de gel 1 uur op het schudplatform • giet de kleurstof af en voeg (lauwwarm) water toe • ontkleur minimaal een paar uur
ANALYSE ItsAcademy
ANALYSE Welke overeenkomsten en verschillen zie je (tussen de weefsels)? Zijn er andere organen dan de ‘bewegingsspieren’ waar spiereiwitten in voorkomen? Wat zegt de dikte van een bandje? Zijn gelijke bandjes ook altijd gelijke eiwitten?
VERVOLGOPDRACHT
EEN BLIK OP DE ANDERE PRACTICA Forensisch DNA-onderzoek “Het bloedspoor gevonden op de plaats delict moet onderzocht worden op de aanwezigheid van celmateriaal, teneinde een DNA-profiel te maken, waarna het verkregen DNA-profiel vergeleken dient te worden met de profielen van de gearresteerde – of nog te arresteren – verdachten en het slachtoffer in deze zaak.”
EEN BLIK OP DE ANDERE PRACTICA De stempelset A Life Typeface
EEN BLIK OP DE ANDERE PRACTICA Bioinformatica – Welke genen zorgen er voor dat de dansmug zo tolerant is?
VRAGEN
Is het geweest wat je er van verwachtte? Wat neem je mee? Welke vragen blijven over?
