Laboratoř oboru Výroba léčiv (N111049) a Organická technologie (N111025)
E VPHP - dekontaminační metoda na bázi par peroxidu vodíku pro aseptickou produkci léčiv
Vedoucí práce:
Ing. Jiří Kovářík
Umístění práce:
A78
OBSAH 1. 2. 3.
ÚVOD ................................................................................................................. 1 CÍLE PRÁCE ....................................................................................................... 5 POSTUP PRÁCE ................................................................................................. 6 3.1 Příprava experimentální aparatury ........................................................ 6 3.2 Příprava vzorků .................................................................................... 7 3.3 Experiment ........................................................................................... 8 3.4 Vyhodnocení výsledků ......................................................................... 9
1. ÚVOD V posledních desetiletích můžeme pozorovat významný pokrok ve sterilizačních a dekontaminačních technologiích. Používání klasických metod sterilizace suchým teplem nebo horkou parou pomalu ustupuje z důvodu zvyšování výroby termolabilních léčiv anebo tyto metody nejsou kompatibilní se sterilizovanými materiály z důvodu narůstajícího používání plastů. Další typické dekontaminační metody využívající etylenoxid nebo formaldehyd se ukázaly jako nevhodné či dokonce škodlivé pro životní prostředí z toho důvodu, že vzniklé degradační produkty nebo dekontaminační činidlo samotné jsou toxické nebo karcinogenní. Proto byly zavedeny metody nové a mezi nimi VPHP (Vapour Phase Hydrogen Peroxide), v současnosti jedna z nejefektivnějších a nejekologičtějších sterilizačních metod. VPHP nachází široké uplatnění v průmyslu, zejména farmaceutickém, pro aseptickou produkci léčiv a v medicíně pro sterilizaci operačních sálů a nástrojů. V medicíně se VPHP používá ke sterilizaci nástrojů či zařízení citlivých na teplo a také různých nemocničních prostor, jako jsou například karanténní lůžková oddělení. Ve farmaceutickém průmyslu se VPHP používá většinou k dekontaminaci laminárních boxů, „glove boxů“ a zejména izolátorů. Izolátory jsou prostory navržené tak, aby poskytovaly ochranu výrobního procesu uvnitř od okolního prostředí nebo okolního prostředí (včetně personálu obsluhy nebo údržby) od výrobního procesu uvnitř a zároveň udržovaly stabilní vnitřní podmínky (např. sterilitu). Příklady izolátorů jsou na Obr. 1.
Obr. 1: Příklady izolátorů
1
Hlavním principem VPHP metody je převod vodného roztoku peroxidu vodíku do parní fáze a následná expozice dekontaminovaného prostoru těmto parám. VPHP proces typicky sestává ze čtyř fází (Obr. 2):
Dehumidifikace – relativní vlhkost je snížena na požadovanou úroveň. Kondicionace – páry peroxidu vodíku jsou generovány, dokud není dosaženo požadované koncentrace. Dekontaminace – konstantní úroveň koncentrace VPHP je udržována generováním dalších par, aby byl kompenzován rozklad peroxidu vodíku. Aerace – po dosažení požadované úrovně sterility jsou zbývající páry peroxidu vodíku odfiltrovány a případně rozloženy.
Obr. 2: Schéma fází VPHP dekontaminačního cyklu
V současné době se pro validaci a monitorování VPHP používají bioindikátory. Bioindikátor je specifický mikroorganismus o definované populaci a čistotě, který disponuje definovanou a stabilní resistencí vůči určitému sterilizačnímu procesu. V případě VPHP jsou tímto mikroorganismem bakteriální spory nanesené na nerezovém nosiči ve formě stripů nebo disků. Výsledky sterilizace jsou vyhodnocovány pomocí kultivace exponovaných bioindikátorů v příslušném živném médiu, což je velice časově náročný proces (typicky kultivace trvá sedm dní). V průběhu této časové prodlevy existuje nejistota, zda vyráběný produkt splňuje požadavky na kvalitu, jelikož zjištěná kontaminace může vyústit v likvidaci nevyhovující šarže. Klíčovým parametrem výroby je tedy rychlé a přesné vyhodnocení dosažené sterility. Z toho důvodu jsou stále více využívány a dále vyvíjeny chemické indikátory tak, aby byly schopny poskytnout stejnou informaci okamžitě, v ideálním případě monitorovat VPHP proces v reálném čase a pokud možno tak nahradit bioindikátory.
2
Chemické indikátory jsou fyzikální nebo chemická zařízení používaná pro monitorování jednoho nebo více procesních parametrů sterilizačního cyklu. Jsou navrženy k odhalování problémů spojených s nesprávným balením, plněním nebo jinými výrobními poruchami. Hrají tedy důležitou roli v zajišťování kvality každého výrobku nebo šarže, nicméně chemické indikátory nejsou testem sterility. Nejjednodušší způsob pro monitorování VPHP procesu pomocí chemických indikátorů je využít proužky na bázi papíru s adsorbovaným barvivem, které reaguje na oxidaci nějakou specifickou barevnou změnou – nejčastěji odbarvením – která je poté vyhodnocena pomocí kolorimetrické detekce. Kolorimetrie je měření barev a umožňuje logicky a opakovaně popisovat, řadit a srovnávat barevné objekty. Barva je aspektem vizuálního vnímání, který je obtížné definovat nebo měřit, nicméně bylo vyvinuto několik systémů pro měření a řazení barev. Nejdůležitějším z nich je CIE systém (Commission Internationale de l’Eclairage).
Lab barevná škála Lab barevná škála je založena na “teorii protilehlých barev”. Tato teorie předpokládá, že lidské oko vnímá barvu jako následující dvojice protikladů: L škála: světlá vs. tmavá, kde nízká čísla (0 – 50) vyjadřují tmavou a vysoká čísla (51 – 100) vyjadřují světlou. a škála: červená vs. zelená, kde kladná čísla vyjadřují červenou a záporná zelenou. b škála: žlutá vs. modrá, kde kladná čísla vyjadřují žlutou a záporná modrou. Hodnota L potom pro každou škálu vyjadřuje úroveň jasu, hodnota a “červenost” nebo “zelenost” a hodnota b “žlutost” nebo “modrost”. Všechny tři hodnoty jsou nutné k úplnému popisu barvy každého objektu. Grafické vyjádření Lab barevné škály je na Obr. 3.
Obr. 3: Zjednodušené a kulové vyjádření Lab barevné škály
3
Pro vyhodnocení účinnosti VPHP procesu byla v této práci zvolena Anilinová modř na nosiči z chromatografického papíru. Tyto nosiče jsou na jedno použití, ale reprezentují jednoduchou, levnou a přesnou vyhodnocovací metodu pro VPHP sterilizace.
Anilinová modř Anilinová modř (AB) byla vybrána jako barvivo citlivé na molekulární peroxid vodíku a oxidační prostředí obecně. AB je ze skupiny trifenylmethanových barviv a je běžně používána pro barvení vlny, hedvábí, bavlny, papíru a kůže. AB je také využívána v histologii pro barvení kolagenu a dalších tkání. V přítomnosti oxidačního prostředí AB podléhá okamžitému odbarvení z tmavě fialově modré barvy na téměř bílou. Struktura AB je na Obr. 4.
Obr. 4: Anilinová modř
4
2. CÍLE PRÁCE - Seznámit se s moderní VPHP dekontaminační metodou. - Naučit se ovládat malý izolátor v laboratorním měřítku (peroxybox) - Seznámit se s prací s chemickými indikátory pro monitorování účinnosti VPHP procesu. - Naučit se připravovat testovací kupóny pro chemické indikátory s homogenní distribucí barviva na povrchu papírového nosiče. - Seznámit se s kolorimetrickou vyhodnocovací metodou. - Provést modelový dekontaminační cyklus s připravenými chemickými indikátory. - Vyhodnotit výsledky s použitím získaných znalostí o kolorimetrii.
5
3. POSTUP PRÁCE 3.1 Příprava experimentální aparatury Před započetím samotné práce je třeba připravit experimentální aparaturu – model malého izolátoru v laboratorním měřítku (peroxybox, Obr. 5).
Obr. 5: Schéma peroxyboxu
1) odpojit z víka peroxyboxu sondu na měření koncentrace H2O2, vyjmout teploměr a trubičku pro nástřik H2O2, 2) sejmout z víka peroxyboxu obě závaží, 3) otevřít peroxybox, 4) vysunout oba držáky na vzorky (vzorkovnice), 5) vyjmout z peroxyboxu 4 podpůrné trubice pro vzorkovnice, 6) vyjmout z peroxyboxu odpařovací mechanismus, 7) vyjmout z odpařovacího mechanismu odpařovací síťky, použitou gázu odložit do skleněné reagenční láhve s vodou ve výlevce, odpařovací síťky vypláchnout destilovanou vodou a usušit proudem tlakového vzduchu, 8) omýt všechny skleněné části peroxyboxu destilovanou vodou a osušit papírovou utěrkou, 9) odpařovací síťky obalit novou gázou a sestavit odpařovací mechanismus, 10) sestavit peroxybox provedením kroků 1 – 6 v opačném sledu (6 – 1), 11) zapojit do elektrické sítě sondu na měření koncentrace H2O2, vlhkoměr a peroxybox samotný.
6
3.2 Příprava vzorků 1) Připravte si roztoky anilinové modři v ethanolu o analyticky přesných koncentracích 0,2 mmol/l a 1 mmol/l (2 x 100 ml) – přesnou navážku uveďte v protokolu, MAM = 767,5 g/mol, 2) Z chromatografického papíru si vystříhejte proužky o velikosti 2,5 x 7 cm (minimálně 24 ks), 3) Proužky nechávejte postupně kompletně nasáknout čistým ethanolem, pomocí papírové utěrky odstraňte přebytečné rozpouštědlo a poté je ponořte do roztoku anilinové modři v Petriho misce, 4) Petriho misku zakryjte poklopem a překryjte tak, aby byla chráněna před světlem (např. alobalem), 5) Po 10 minutách proužky otočte a nechte v roztoku dalších 10 minut, misku opět zavřete a zakryjte, 6) Po vyjmutí proužku z roztoku přebytečný roztok odstraňte pomocí papírové utěrky a nechte proužky kompletně uschnout rozložené na papírové utěrce (Obr. 6) a překryté alobalem,
Obr. 6: Příprava vzorků
7
7) Suché proužky si očíslujte a změřte pomocí kolorimetru tak, že provedete 10 měření na každém proužku v různých místech po celé ploše proužku – přístroj automaticky vypočítá průměrnou hodnotu parametrů L a b z celé plochy proužku, 8) Z připravených proužků vyberte 10 od každé koncentrace tak, aby jejich hodnoty L a b byly k sobě co nejblíže: -
vypočítejte aritmetické průměry hodnot parametrů L a b ze všech proužků o stejné koncentraci a poté vyřaďte proužky, jejichž hodnoty jsou od tohoto průměru nejvzdálenější,
-
vypočítejte aritmetické průměry hodnot parametrů L a b pouze z 10 vybraných proužků, vypočítejte směrodatnou odchylku a relativní směrodatnou odchylku,
-
relativní směrodatná odchylka vybraných proužků by neměla být více než 2 %, pokud je vyšší, je potřeba připravit více proužků a výběr opakovat,
-
všechny hodnoty vyneste do tabulky a uveďte v protokolu,
9) Takto připravené vzorky zabalte do alobalu a ponechte zabalené až do jejich dalšího použití.
3.3 Experiment POZOR DŮLEŽITÉ – před zapnutím ventilátoru peroxyboxu je nutno zapnout větrák chladící motorek ventilátoru! 1) Vzorkovnice peroxyboxu připravte do polohy „vytaženo“ 2) Zapněte ventilátor peroxyboxu, 3) Zapněte vyhřívání peroxyboxu a vyhřejte peroxybox na 25 ± 1 °C, 4) Nastavte relativní vlhkost (RH) uvnitř peroxyboxu na 40 % použitím tlakového vzduchu, 5) Zapněte zaznamenávací software (DasyLab) na záznamovém PC, 6) V programu DasyLab spusťte ovládací program (C:\VPHP\Laboratoř_oboru.dsb), 7) Nadávkujte 1 ml 30% H2O2 o laboratorní teplotě rovnoměrně na odpařovací síťku uvnitř peroxyboxu, 8) Jakmile se uvnitř peroxyboxu ustálí reakční podmínky (koncentrace VPHP 300 ± 25 ppm, RH 100 %, T 25 ± 1 °C), umístěte připravené vzorky do pozic ve vzorkovnicích, 9) Zasuňte vzorkovnice se vzorky dovnitř peroxyboxu, zapněte stopky a zapište si čas vsunutí vzorků z programu DasyLab, 10) Odebírejte vzorky každých 10 minut (vždy jeden o koncentraci 0,2 mmol/l a jeden o koncentraci 1 mmol/l), 11) Vzorky změřte ihned po odebrání kolorimetrem obdobně jako v bodě 7) kapitoly 3.2 Příprava vzorků.
8
3.4 Vyhodnocení výsledků 1) V protokolu uveďte grafy, do kterých vynesete závislost hodnoty parametrů L a b na čase pro obě koncentrace anilinové modři (4 závislosti – 4 grafy, případně je možné vynést do jednoho grafu hodnoty parametru L pro obě koncentrace dohromady a do druhého grafu hodnoty parametru b pro obě koncentrace dohromady), 2) V protokolu uveďte graf se záznamem reakčních podmínek v průběhu experimentu z programu DasyLab (nezapomeňte si zkopírovat *.asc soubor, do kterého se tyto hodnoty ukládají, vygenerovaný tímto programem).
Po ukončení práce vypněte všechny přístroje, zbytky roztoků vylejte do nádoby na odpadní rozpouštědla, umyjte všechno nádobí a všechno po sobě ukliďte.
POZOR – před začátkem práce vám bude zadán krátký test na 10 jednoduchých otázek týkajících se tohoto návodu, který ověří vaši teoretickou přípravu na laboratorní cvičení.
Během práce postupujte opatrně a dodržujte zásady bezpečnosti práce v laboratoři. Budete pracovat s peroxidem vodíku o vyšší koncentraci, než je běžné, hrozí proto poleptání. Navíc, páry peroxidu vodíku dráždí oční i nosní sliznice. Některá zařízení, se kterými budete pracovat, jsou buď nákladná, nebo byla vyrobena či sestavena svépomocí a jsou tedy jen obtížně nahraditelná. V případě jakýchkoliv nejasností se tedy neváhejte obrátit na vedoucího práce s jakýmkoliv dotazem.
9
