Vliv vnitřních a vnějších faktorů na mikroorganizmy v potravinách
Faktory ovlivňující růst mikroorganismů v potravinách Vnitřní : živiny, pH, redox potenciál, vodní aktivita,antimikrobiální aktivity Vnější: vlhkost, teplota, atmosféra Implicitní: specifická růstová rychlost, synergismus, antagonismus, komensalismus Technologické: krájení, mytí, balení, záření, pasteurizace
Mikroorganizmus a potravina • uchycení mikroorganizmů (fimbrie, pouzdra, slizová vrstva) • kontaminační dávka • druh mikroorganizmů (růstová fáze, generační doba) • mikroflóra potraviny (vzájemné vztahy mezi mikroorganizmy) • vliv vnitřních faktorů • vliv vnějších faktorů
Vnitřní faktory Působením mikroorganismů se mění vlastnosti potravin (např. textura, konzistence, vůně, chuť, vzhled). K jakým změnám dojde je závislé na chemických a fyzikálních vlastnostech potraviny (intrinsic factors): • složení potraviny (dostupnost živin) • koncentrace vodíkových iontů (pH) • aktivita vody (aw) • oxido-redukční potenciál (Eh) • textura potraviny • přítomnost antimikrobiálních látek v potravinách
Vnější faktory Způsob uchování a skladování potravin má významný vliv na mikroflóru potravin. Jakost a trvanlivost potravin je určována vnějšími faktory (extrinsic factors). • teplota prostředí • relativní vlhkost vzduchu (% RV) • složení atmosféry • čas
Další faktory Vedle vnitřních a vnějších faktorů má na trvanlivost potravin z pohledu mikrobiologického vliv také počet a druhové zastoupení mikroflóry. Čím méně je v potravině mikroorganismů a čím méně jsou aktivní, tím delší čas je potřeba k jejich pomnožení a vzniku senzorických změn (dlouhá lag fáze a delší generační čas) Tlak, záření, působení dezinfekčních prostředků
antimikrobiálních
látek,
Vztahy mezi mikroorganismy Komenzalizmus - volné sdružení MO, kteří si vzájemně neškodí ani neprospívají (např. mikroflóra úst, kožní mikroflóra, atd.) Synergizmus (syntrofizmus) - umožňuje žít určitým MO v daném prostředí pouze v přítomnosti MO jiných (např. aeroby odčerpávají kyslík z prostředí → umožňují růst anaerobů, štěpení makromolekul extracelulárními enzymy, kefírové kultury)
Vztahy mezi mikroorganismy Symbióza - vzájemně prospěšné soužití MO, např. s hmyzem, rostlinami nebo vyššími živočichy (např. rozklad celulózy v bachoru přežvýkavců, produkce vitaminu K bakteriemi střevního traktu) Antagonizmus - nepříznivé působení jedné skupiny mikroorganizmů na druhou (např. bakterie mléčného kvašení a hnilobné bakterie)
Vztahy mezi mikroorganismy Parazitizmus - jeden MO využívá vnitrobuněčných meziproduktů metabolismu jiného druhu a tím jej ničí. Jev častější pro soužití mikroorganizmů s živočichy nebo rostlinami (např. bakteriofágy, mykoviry) Metabióza - produkty metabolismu jedněch mikroorganizmů jsou postupně využívány mikroorganizmy dalšími (např. zoctovatění alkoholických nápojů) umožňuje rychlou mineralizaci - metabióza organických látek v přírodě - koloběh prvků
Vnitřní faktory - složení potraviny Obecně platí, že potraviny obsahující více nízkomolekulárních látek a větší množství vody se kazí rychleji. • obsah vody v potravině • zdroj energie a zdroj dusíku (sacharidy, alkoholy, AMK) • zdroj dusíku (AMK, peptidy, bílkoviny) • vitamíny a růstové faktory (B vitamíny) • minerální látky
pH Bakterie – slabě kyselé až slabě alkalické pH Kvasinky – preferují kyselé prostředí Plísně – tolerují velmi široké rozmezí
pH Hodnota pH ovlivňuje: - rozmnožování bakterií, rychlost růstu, vitalitu - intenzitu a charakter metabolizmu - odolnost buněk ke zvýšených teplotám - kyselé pH (<4,0) zabraňuje klíčení spór - změna dostupnosti kovových iontů v alkalickém prostředí Vliv má nejen nízká hodnota pH, ale i druh kyselin, které se na snížení hodnoty podílely.
Dělení potravin dle pH
Aktivita vody - aw Aktivita vody - je definována jako poměr parciálního tlaku vodní páry nad potravinou (p) k parciálnímu tlaku vodní páry nad čistou vodou (p0) při dané teplotě: p aw = p0 - množství vody dostupné pro mikroorganizmy pro chemické reakce buněk - optimální hodnota pro většinu mikroorganizmů aw>0,98
Aktivita vody - aw Bakterie halofilní x halotolerantní xerofilní x xerotolerantní osmofilní x osmotolerantní
Aktivita vody - aw Snížení aktivity vody: • odstranění využitelné odpařením, mražením
vody
sušením,
uzením,
• zvýšení obsahu tuku • zvýšení koncentrace rozpuštěných látek v prostředí (cukry - sacharosa, NaCl) → zvýšení osmotického tlaku (hypertonické prostředí) → difuze vody z buňky do prostředí → zastavení metabolizmu až smrt buňky
Aktivita vody - aw Potraviny • lehce kazitelné (více než 0,95) • středně kazitelné (0,95-0,92) • málo kazitelné (pod 0,91) Důležitá je kombinace aw s ostatními ovlivňujícími přežívání MO v potravinách.
faktory
Aktivita vody - aw
Redox potenciál - Eh Oxidačně redukční potenciál prostředí - je rozdíl potenciálu mezi platinovou (kovovou) elektrodou umístěnou do daného prostředí a standardní vodíkovou elektrodou. látka redukovaná
oxidace redukce
látka oxidovaná + n elektronů
Snížení redox potenciálu: - přidání redukujících látek - růst aerobních mikroorganismů - vakuové balení, atd.
Redox potenciál - Eh
Textura potraviny Přirozené krytí povrchu potravin - skořápka vajec, skořápky ořechů, kůže, vazivová pouzdra orgánů, povázka masa, kůrka chleba, atd.
Přítomnost antibakteriálních látek (biocidů) v potravinách potraviny obsahují přirozené • Některé antimikrobiální látky (koření, minerální oleje, česnek, hořčice, med) • Kravské mléko obsahuje laktoferrin, laktoperoxidázový systém, lysozym, kasein • Vejce lysozym, conalbumin, ovotransferrin, avidin
Antimikrobiální enzymy Jsou hojně rozšířeny v přírodě a hrají důležitou roli při obranných mechanizmech živých mikroorganizmů proti infekcím. Hydrolázy – degradují klíčové struktury buněčných stěn (peptidoglykan) Oxidoreduktázy – vytváří reaktivní molekuly, které rozrušují vitální proteiny v buňce.
Antimikrobiální enzymy Bakteriolytické 1. N-acetylhexosaminidázy katalyzují štěpení glukosidických vazeb sacharidů peptidoglykanu 2. N-acetylmuramyl-L-alaninamidázy katalyzují štěpení mezi sacharidovou a peptidovou částí peptidoglykanu 3. Endopeptidázy hydrolyzují peptidové vazby peptidoglykanu 4. Ostatní – chitinázy, ß-glukanázy
Antimikrobiální enzymy Bakteriolytické Lysozym je aktivní především u G pozitivních bakterií.
Antimikrobiální enzymy Oxidoreduktázy Glukozooxidázy jsou produkovány některými plísněmi, podstata cytotoxicity spočívá v tvorbě peroxidu vodíku (oxidace glukózy na kys. glukonovou a H 2O2 ) Laktoperoxidázy se vyskytují např. ve slinách, mléce (oxidace thiokyanátu na hyperthiokyanát) Laktoferrin je glykoprotein tvořící komplexy s ionty železa
Vnější faktory • • • •
Teplota Složení atmosféry Relativní vlhkost vzduchu Čas
Teplota • Je jedním z hlavních faktorů vnějšího prostředí, který ovlivňuje rychlost rozmnožování (přežívání) bakterií • Rozeznáváme 3 základní body teploty minimální teplotu optimální teplotu maximální teplotu
Hodnota D • Mnoho druhů mikroorganismů jsou patogeny, schopné vyvolávat onemocnění ostatních organismů. Proces sterilizace, jakým je tepelné působení je ničí. • D-hodnota odpovídá délce času nutného k decimálnímu snížení počtu. • Čas nutný za dané teploty k usmrcení 90% mikroorganismů byl studován. • Je-li snížení množství organismů o jeden řád, pak zůstává živých pouze 10% z původní populace. Obecně, každý tepelně odolný organismus má svou jedinečnou D-hodnotu. Uvádíme-li D hodnoty je nutné vyznačit teplotu pro kterou byly naměřeny jako dolní index. • Např. hypotetický organismus byl redukován o 90% po vystavení teplotě 62 stupňů Celsia po 2 minuty, tudíž tato D-hodnota by s měla psát jako D62C = 2 (minuty).
Hodnota D • Mnoho druhů mikroorganismů jsou patogeny, schopné vyvolávat onemocnění ostatních organismů. Proces sterilizace, jakým je tepelné působení je ničí. • D-hodnota odpovídá délce času nutného k decimálnímu snížení počtu. • Čas nutný za dané teploty k usmrcení 90% mikroorganismů byl studován. • Je-li snížení množství organismů o jeden řád, pak zůstává živých pouze 10% z původní populace. Obecně, každý tepelně odolný organismus má svou jedinečnou D-hodnotu. Uvádíme-li D hodnoty je nutné vyznačit teplotu pro kterou byly naměřeny jako dolní index. • Např. hypotetický organismus byl redukován o 90% po vystavení teplotě 62 stupňů Celsia po 2 minuty, tudíž tato D-hodnota by s měla psát jako D62C = 2 (minuty).
Hodnota D • Delší čas při dané teplotě znamená vyšší termální rezistenci. Se zvýšením teploty D-hodnota klesá. Tato závislost je exponenciální, neboť při vynesení koncentrace buněk v závislosti na čase v semilogaritmickém uspořádání získáme přímku. • Z toho lze odvodit další významný parametr tepelného působení, z-hodnota je změna teploty, která vyvolá desetinásobnou změnu D.
Rozdělení bakterií podle vztahu k teplotě Mikroorganizmy dělíme do skupin podle nároků na teplotu při které se rozmnožují a metabolizují Psychrofilní bakterie (12-15 °C) Psychrotrofní bakterie (25-30 °C) Mezofilní bakterie (30-40 °C) Termofilní bakterie (50-70 °C)
Vliv vysokých teplot Smrtící účinek vysokých teplot (letální teplota) • je nejnižší teplota, při které dochází za určitý čas k usmrcení (70 °C/10 minut) • denaturace bílkovin, inaktivace enzymů, narušení DNA a cytoplazmatické membrány • je závislá na:
druhu mikroorganismu jeho fyziologickém stavu koncentraci buněk v prostředí charakteru prostředí
Termorezistence Stupeň odolnosti mikroorganizmů je závislý na: • fyziologickém stavu bakterií • jejich genetické výbavě • množství bakterií • obsahu vody v substrátu • množství ochranných látek (lipidy, proteiny, sacharidy)
Sterilizace • jednorázové použití teploty nad 100 °C • sterilizace je definována jako kombinace teploty a času • sterilizaci potravin přežívají některé spóry (rody Bacillus a Clostridium) • praktická (obchodní) sterilita x absolutní sterilita STERILIZOVANÉ POTRAVINY MOHOU OBSAHOVAT SPÓRY!
Pasterace Správně provedená pasterace zaručí: devitalizaci patogenních mikroorganismů (M. tuberculosis) • devitalizaci podstatné části saprofytické mikroflóry •
(vegetativních buněk) • zachování původních fyzikálních, chemických, výživových a senzorických vlastností PASTEROVANÉ POTRAVINY OBSAHUJÍ MIKROORGANISMY!
Vliv nízkých teplot Nižší než optimální teploty přežívá většina mikroorganizmů dlouhou dobu. Přenesou-li se však z optimálních teplot do teploty kolem 0 °C dochází k chladovému šoku. šoku Při pomalém zmrazování buněk na teploty pod 0 °C ze z vnitro i mimobuněčné vody tvoří velké krystaly ledu, které buňku nevratně poškozují. Při rychlém zmrazování buněk na teploty -30 °C – 180 °C se tvoří mikrokrystalky ledu, které buňky poškozují jen minimálně. Po rozmrazení se potraviny rychleji kazí (poškození živočišných i rostlinných pletiv krystaly vody)
Složení atmosféry Skladování potravin v řízené atmosféře plynů má ochranný účinek • Vakuově balené potraviny (v obalech nepropustných pro kyslík) • CO2 brání růstu aerobní mikroflóry, používá se při skladování ovoce a zeleniny, nesmí se používat pro potraviny s vysokým obsahem tuku, protože má silné oxidační účinky a způsobuje žluknutí tuků
Relativní vlhkost prostředí Vysoká relativní vlhkost ovlivňuje aw potraviny (význam balení)
Čím vyšší je teplota, tím nižší musí být relativní vlhkost prostředí a naopak
Čas Čím delší je doba expozice, tím výraznější je účinek
Vnitřní faktory
Vnější faktory
Technologie překážek Technologie překážek (Hurdle technology) je využití kombinace (synergie) několika konservačních faktorů k zesílení jejích účinku a dodání lepších organoleptických a výživových vlastností potravin. Hnací silou těchto postupů je požadavek veřejnosti po více přirozených, zdraví prospěšných potravinách, které mají vynikající chuťa zlepšené výživové hodnoty. Na příklad, je-li limitující aw 0.85 nebo pH 4.6 a mohou samy o sobě zabránit růstu patogenů přenášených potravinami, podobnou ochranu mohou dát podmínky aw 0.92 a pH 5.2. Chlazení ještě dále posílí tento synergismus.Každý faktor limitující růst ja překážka.
aw
pH
Teplota
Hurdle technology - Synergie
aw aw
Vodní aktivita potřebná pro zvýšení údržnosti (shelf-life) dané potraviny sama (0.83) nebo v kombinaci (0.92)
pH
Teplota
Synergie = “součet částí je větší nežli celek”
Technologie překážek Kombinací různých faktorů vzniká řada překážek, které musí mikroorganizmy překonat. I když jednotlivé faktory nejsou dostatečné k zabránění růstu MO, jejich kombinací dochází k zesílení účinku. Čím nepříznivější překážka, tím vyšší úsilí musí mikroorganizmy vyvinout.
Prediktivní mikrobiologie Vychází ze znalostí vnitřních a vnějších faktorů • Predikce růstu • Pravděpodobnostní modely • Kinetické modelování
Predikce růstu – modelování typ zákusek
Počáteční počet LM 104 CFU pH 7
Teplota 20/10°C aw 0,997
• Vliv dalších faktorů na mikroorganizmy v potravinách
Povrchové napětí • Některé mikroorganizmy se špatnou smáčitelností buněk rostou v tekutinách ve formě blanky (křísu) • Povrchové napětí prostředí snižujeme přídavkem povrchově aktivních látek (tenzidů)
Záření Elektromagnetické vlnění různých délek se značně liší svými účinky na mikroorganizmy • Infračervené – nemá přímé letální účinky (teplo!) • Viditelné světlo – ovlivňuje pozitivně i negativně některé aktivity buněk • Ultrafialové – má silně mutagenní a letální účinky (malá pronikavost) • Ionizační záření- má silně mutagenní a letální účinky (vysoká pronikavost)
Hydrostatický tlak Většina mikroorganizmů se rozmnožuje za normálního atmosférického tlaku. Zvýšení tlaku na 10-20 MPa rozmnožování zpomaluje a 30-40 MPa zcela zastavuje. Některé bakterie se dobře rozmnožují i při tlaku 60 MPa – barofilní x barotolerantní (v hlubinách moří)
Ultrazvuk Ultrazvuk jsou zvukové vlny o frekvenci vyšší než 20 kHz, na bakterie působí letálně pouze při vysoké intenzitě. Kavitační ultrazvuk v důsledku kmitání vzniká prudká pulzace buněčných membrán a cytoplazmy (letální účinek) Citlivé k ultrazvuku jsou především tyčinky a vlákna, koky jsou odolnější
Mechanické vlivy Vysoká odolnost mikroorganizmů je způsobena pevnou buněčnou stěnou a malými rozměry K destrukci buněk dochází: • opakovaným pomalým zamrazováním a roztáváním (odolnost enzymů) • ošetření vysokým tlakem • třepání s abrazivním materiálem
Působení antimikrobiálních látek Některé látky přítomné v prostředí mají na mikroorganizmy nepříznivý vliv v důsledku svého specifického složení (antimikrobiální). Mikrobistatické - látky zastavující rozmnožování mikroorganizmů Mikrobicidní – látky usmrcující mikroorganizmy Vliv koncentrace (účinek stimulační)
Podle mechanizmu účinku dělíme antimikrobiální látky Látky poškozující strukturu buňky nebo její funkci (např. buněčná stěna, cytoplazmatická membrána, ribozomy) Látky působící na mikrobiální enzymy (oxidační činidla, chelatační látky, těžké kovy, antimetabolity) Látky reagující s DNA (např. chemické mutageny – alkylační nebo dezaminační činidla, cytostatika)
Cílová místa působení AML na bakteriální buňku
Dezinfekční látky Sanitace = čištění a dezinfekce Čištění – odstranění nečistot a zbytků organického materiálu Dezinfekce – odstranění mikroorganismů. Teplota a doba působení čistících a dezinfekčních prostředků!
Dezinfekční látky • buněčná stěna - poškození • cytoplazmatická membrána – indukce difuze látek z buňky, inhibice enzymů CM, oslabení elektrochemického potenciálu CM • cytoplazma – koagulace enzymů, ribozomů, NK Dezinfekční mechanizmus - oxidace, hydrolýza, tvorba solí s bílkovinami, koagulace bílkovin, změny permeability, poškození enzymatického systému, mechanická disrupce.
Anorganické sloučeniny Silné kyseliny a silné zásady - poškozují BS a CM x poškozují povrchy zařízení Hašené vápno - dezinfekce stěn, kvasných kádí, atd. Uhličitan sodný, fosforečnan sodný, polyfosfáty - odstranění zbytků tuků a bílkovin x polyfosfáty ekologicky nežádoucí (eutrofizace vod) Oxid siřičitý - síření ovocných a vinných polotovarů, síření sudů, sklepů, atd.
Anorganické sloučeniny Oxid uhličitý - uchovávání ovocných šťáv Organocíničité sloučeniny - Lastanoxy - antifugální účinek, nátěry stěn, omítek, atd. Sloučeniny chlóru - plynný chlór – dezinfekce vody - chlorové vápno – desinfekce podlah, skladovacích ploch - chloramin – směsné čistící prostředky, velmi časté použití v lékařství i potravinářství
Anorganické sloučeniny Jodové preparáty - Jodonal M – desinfekce mléčné žlázy Peroxid vodíku - sterilizace korunkových uzávěrů, obalů z plastu (kelímky, tetrapakové obaly,atd.), sýrařství
Organické sloučeniny Organické kyseliny – konzervace potravin - kyselina benzoová - kyselina sorbová (plísně) - kyselina mravenčí (kvasinky, plísně) Kyselina peroctová - Persteril Povrchově aktivní látky - mýdla (sodné soli vyšších MK) - kvartérní amoniové báze (Ajatin, Septonex) Antibiotika - nisin (konzervace potravin)
Laboratorní metody přímé
1. kultivační 2. mikroskopické 3. imunologické 4. molekulárně biologické
nepřímé
1. impedanční 2. konduktometrické 3. metabolická aktivita 4. redukce barviv
Kultivační metody Metoda plotnová je používána pro průkaz (kvalita) nebo stanovení počtu (kvantita) určitých skupin, rodu nebo druhu bakterií Výhody • vysoká citlivost - REFERENČNÍ METODA (ISO, EN) Nevýhody • dlouhá doba do dosažení výsledků • kvantita je vyjádřena jako CFU (KTJ) ne počtem bakterií
Kultivační metody Variantou klasické kultivační metody pro stanovení počtu (kvantita) určitých skupin nebo rodu bakterií jsou • • •
Spirálová plotnová metoda Petrifilmy Hygikulty
Kultivační metody - spirálová plotnová metoda Malé množství vzorku (35 µl) je nanášeno na rotující Petriho misku tryskou spirálovitě ve směru od středu misky k její periferii. Pomocí šablony (manuálně) nebo laseru (automaticky) je odečítán počet CFU (KTJ) na misce a ten je přepočten na výchozí objem inokula. Výhody • automatizace, eliminace chyb způsobených lidským faktorem Nevýhody • vysoké pořizovací náklady
Kultivační metody - Petrifilmy Petrifilmy jsou destičky potažené kultivačními médii ve formě gelu. Destičky se inokulují 1 ml naředěného vzorku a inkubují v termostatu. Výhody • destička je opatřena mřížkou pro snazší počítání kolonií • speciální indikátory zbarvují narostlé kolonie a tím je zvýrazňují
Kultivační metody - Hygikulty Hygikult je plastová destička oboustranně pokrytá kultivačním médiem, umístěná ve sterilní nádobce. Je určen k rychlému monitorování úrovně mikrobiální kontaminace v potravinářských provozech. Výhody • snadnost použití mimo laboratoř Nevýhody • sortiment destiček je omezen pouze na indikátorové mikroorganizmy
Membránová filtrace Metoda slouží k zakoncentrování bakterií • kultivační metoda • mikroskopie filtry z nylonu, PVC, polykarbonátu, polyesteru, kovu Výhody • filtrací většího objemu lze zvýšit citlivost metody • teplý agar nepoškozuje bakterie
Mikroskopické metody Klasické metody - stanovení počtu bakterií po obarvení preparátu Moderní metody - epifluorescence spojuje metodu filtrace a fluorescenční mikroskopie Princip spočívá ve vazbě fluorochromového barviva na DNA (RNA) mikrobů (DEFT, BACTOSCAN) Výhody • rychlost provedení Nevýhody • metoda detekuje i mrtvé buňky
Imunologické metody Princip metody ELISA Enzymaticky značená specifická protilátka je vázána na vhodný povrch (mikrotitrační destička). Za přítomnosti antigenu (specifické bakterie) vzniká komplex AgAb. Ten je možné detekovat buď přímo spektrofotometricky nebo vizualizovat konjugátem.
Imunologické metody Výhody - automatizace - rychlost - vyšetření velkých sérií vzorků Nevýhody – vyšší náklady na vyšetření - skríningová metoda Využití – detekce bakteriálních patogenů - detekce bakteriálních toxinů
Imunomagnetická separace Princip jsou-li v substrátu přítomny sledované bakterie, váží se na super-para-magnetické částice obalené specifickou protilátkou. Komplex antigen - protilátka se odseparuje pomocí magnetu a dále zpracuje. Výhody zkracuje dobu kultivace zachycuje i subletálně poškozené buňky
Imunomagnetická separace
Polymerázová řetězová reakce Princip Princip PCR je založen na využití DNA polymerázy pro opakované kopírování templátové (vzorové) molekuly DNA. Syntéza je řízena krátkými oligonukleotidy (primery), které nasedají na templátovou DNA na začátku a konci amplifikovaného fragmentu, každý s jiným vláknem původní dvouřetězcové DNA. PCR je velice citlivá metoda umožňující detekci jediné buňky. Mnohonásobné amplifikace je dosaženo opakováním tří základních kroků - denaturace, hybridizace a syntézy nových vláken
Polymerázová řetězová reakce Vysvětlení základních pojmů
• templát – DNA, která slouží jako vzor (šablona) pro syntézu nových řetězců. Pro reakci PCR se používá genomová DNA o koncentraci přibližně 10 ug/ml. • DNA polymeráza – termostabilní enzym používaný k syntéze nové DNA ve směru 5´-3´ podle sekvence nukleotidů v templátu od místa navázaného primeru až po jeho konec. Enzym Taq DNA, který se nejčastěji používá pro PCR, je izolován z bakterie Thermus aquaticus a umožňuje opakované zahřátí na teplotu 95 °C. Enzym zůstává při této teplotě aktivní až 40 minut. • dNTP - nukleotidtrifosfáty (adenin, guanin, cytosin a thymin)
Polymerázová řetězová reakce Vysvětlení základních pojmů
• primery – jsou oligonukleotidy (obvykle 20-25 bazí) , které svou sekvencí odpovídají DNA templátu a které vymezují úsek templátu, který bude amplifikován • master mix – reakční směs zajišťující optimální podmínky pro průběh reakce. Je složena z koncentrovaného pracovního
pufru obsahujícího hořečnaté ionty zajišťujícího vhodné podmínky pro aktivitu polymerázy, směsi dNTP, polymerázy, specifických primerů a vody.
• termocykler (teplotní cyklátor) - je zařízení, ve kterém za optimálních teplotních podmínek probíhá PCR reakce. • marker – velikostní standard, používá se k odhadu velikostí DNA produktů na základě pohyblivosti v agarózovém gelu
Turbidimetrie Podstata Bakterie v průběhu množení tvoří v tekutém vzorku zákal. Metoda využívá měření změn intenzity zákalu média v závislosti na čase. Intenzita zákalu je závislá na počáteční koncentraci mikroorganizmů. Využití – k měření celkového počtu mikroorganizmů (aerobních i anaerobních)
Průtoková cytometrie Podstata Metoda vyjadřuje kvantitativní fotometrické stanovení fluorochromu navázaného na specifické bakterie. Buněčná suspenze po obarvení prochází kapilárou přes trysku, kde je laserem ozářena. Intenzita excitovaného světla vyjadřuje kvantitu specifických bakterií. Využití – rychlá detekce technologicky významných a patogenních bakterií. Výsledky nejsou porovnatelné se standardními metodami (CFU)
Impedanční metoda Metabolická činnost bakterií mění složení kultivačního média, což vede ke změnám vodivosti. Systém je složen ze dvou elektrod ponořených do živného média. Ty jsou připojeny na zdroj střídavého proudu a měříme jimi impedanci. Stoupající vodivost vede k poklesu impedance. Výhody - automatizace Nevýhody – vyšší cena přístroje - při smíšených kulturách nestandardní výsledky Využití – indikátorové skupiny mikroorganizmů
Metabolická aktivita Bioluminiscence ATP je zdrojem energie všech živých buněk. Podstata metody spočívá v reakci ATP s enzymem luciferázou vázanou na luciferin. luciferin Tři tvorbě luciferin-adenylátového komplexu se z ATP uvolňuje pyrofosfát. Za přítomnosti kyslíku dochází k uvolnění světla, jehož intenzita je závislá na výchozím množství ATP. Použití – rychlá detekce mikrobiální kontaminace v potravinářských provozech (HACCP)
Enzymatická aktivita Redukce barviv Resazurinový test je založen na průkazu bakteriálních reduktáz. Ty redukují resazurin rezorufin hydrorezorufin met. modř leukoforma Rychlost barevné změny je závislá na množství mikroorganizmů. Využití – rychlá detekce CPM v mléce nebo mase
Metody typizace IDENTIFIKACE - zařazení neznámých kmenů (druh, poddruh) TYPIZACE - zařazení neznámých kmenů pod úroveň druhu FINGERPRINTING - vzájemné porovnání kmenů jednoho druhu poddruhu nebo variety
Kategorie typizačních metod - fenotypová charakteristika BIOTYPIZACE - zkoumání vlastností kultur na základě biochemických vlastností (API, Enterotest, Stafytest atd.) REZISTENCE k antibiotikům - zkoumání citlivosti kultur k antimikrobiálním látkám (disková difuzní metoda, MIC) SÉROTYPIZACE - nejstarší typizační technika, sklíčková, mikrozkumavková, Ag O:H:K
Kategorie typizačních metod - genotypová charakteristika 1. Generace 2. Generace
- analýza plazmidové DNA - restrikční analýza plazmidové DNA - restrikční analýza chromozomální DNA - hybridizací s próbami - ribotypizace
3. Generace - PFGE - typizační metody na bázi PCR (RAPD, REP PCR) 4. Generace - DNA sekvenování
Restrikční analýza plazmidové DNA RE - sekvenčně specifická nukleáza, která štěpí dsDNA ve specifických sekvencích vytvářením dvouřetězcových zlomů
Pulzní gelová elektroforéza (PFGE) Makrorestrikční analýza bakteriálního genomu, technika určená pro separaci molekul DNA o velikosti až 12Mb, při níž dochází ke změně směru elektrického pole.
Molekuly DNA putují pohybem cik-cak v závislosti na pulzním čase a napětí
Pulzní gelová elektroforéza (PFGE) Rare cutting endonukleázy -RE vzácně štěpící – rozpoznávají a štěpí sekvence, které se v genomové DNA vyskytují zřídka a vytváří dlouhé restrikční fragmenty (XbaI, SpeI,SmaI,NotI)
Randomly amplified polymorfic DNA (polymerázová řetězová reakce náhodná - RAPD)
Metoda PCR detekující polymorfizmus DNA za použití jediného krátkého oligonukleotidového primeru, který se na cílovou DNA váže v náhodných místech. Výsledkem je soubor amplikonů charakteristický pro daný mikroorganizmus Podle délky primerů rozlišujeme metody: AP-PCR (Arbitrary primed PCR) RAPD DAF (DNA amplification fingerprinting)
18-24 mer 10 mer 5-8 mer
Téma příští přednášky Potravinářsky významné mikroorganizmy
