Vladimír Beran
Detekce a typizace Clostridium difficile a stanovení citlivosti na antimikrobní látky
Ostravská univerzita v Ostravě
Izolace a identifikace Clostridium difficile ze vzorků stolice, PCR – ribotypizace, detekce faktorů patogenity a stanovení citlivosti na antimikrobní látky
Vladimír Beran, Ed Kuijper, Céline Harmanus, Ingrid Sanders
Katedra biomedicínských oborů, Lékařská fakulta, Ostravská univerzita, Ostrava, Česká republika, Department of medical microbiology, Leiden univerzity medical center, Leiden, Nizozemsko
Ostrava 2015
Odborní recenzenti: PhDr. Jozef Matula, Ph.D. doc. PhDr. Lubor Kysučan, Ph.D.
© Vladimír Beran, 2015 © Ostravská univerzita v Ostravě, 2015 ISBN
Tato práce je výstupem ze zahraniční stáže v Leiden University Medical Center v Nizozemsku. Pobyt byl hrazen z grantu Postdok 2 Ostravské univerzity ve spolupráci s Evropským sociálním fondem v ČR, Evropskou unií, Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy ČR v rámci Operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost.
OBSAH CLOSTRIDIUM DIFFICILE ............................................................................................................. 6 Izolace a identifikace Clostridium difficile .................................................................................. 8 Materiál (vzorky, vybavení, kultivační média, chemikálie) .................................................... 8 Bezpečnost práce.................................................................................................................... 8 Příprava vzorku, kultivace ....................................................................................................... 9 Odečítání kultur, identifikace C. difficile................................................................................. 9 Izolace DNA Clostridium difficile .............................................................................................. 12 Materiál (vzorky, vybavení, chemikálie) ............................................................................... 12 Příprava reagencií QIAamp® DNA Blood Mini Kit ................................................................. 12 Bezpečnost práce.................................................................................................................. 13 Postup izolace ....................................................................................................................... 13 PCR-ribotypizace Clostridium difficile ...................................................................................... 15 Postup PCR ............................................................................................................................ 15 Gelová elektroforéza ............................................................................................................ 17 Bezpečnost práce.................................................................................................................. 17 Chemikálie ............................................................................................................................ 18 Vybavení ............................................................................................................................... 18 Postup ................................................................................................................................... 18 Multiplex PCR pro charakterizaci izolátů Clostridium difficile ................................................. 21 Postup ................................................................................................................................... 21 Stanovení citlivosti na antimikrobní látky ................................................................................ 25 Stanovení citlivosti na antimikrobní látky metodou E-test ...................................................... 25 Materiál a vybavení .............................................................................................................. 25 Postup ................................................................................................................................... 26 Literatura .................................................................................................................................. 28
5
CLOSTRIDIUM DIFFICILE
Clostridium difficile se řadí mezi striktně anaerobní grampozitivní tyčinky tvořící spóry. Bakterie způsobuje u člověka onemocnění trávicího ústrojí v různém stupni závažnosti od bezpříznakových až po život ohrožující stavy. Často se jedná o nozokomiální infekce spojené s pobytem pacientů v nemocnici, anebo jde o průjmy jako o následek léčby jiných infekčních chorob širokospektrými antibiotiky. Klinickými projevy onemocnění u člověka jsou průjmy, u vážnějších případů se objevuje krvácení, nebo pseudomembranózní kolitida. Rizikovými faktory vzniku onemocnění jsou vysoký věk, hospitalizace pacienta, chirurgický zákrok v oblasti střeva a léčba širokospektrými antibiotiky. Nejčastěji je s průjmy spojováno předchozí podávání antibiotik klindamycin, cefalosporiny a fluorochinolony. Obecně platí, že onemocnění způsobují pouze toxigenní kmeny. Zejména v posledních letech se množí zprávy o výskytu tzv. hypervirulentních kmenů C. difficile. Tyto kmeny jsou spojovány se závažnějším průběhem střevního onemocnění a změněnou citlivostí na některá antibiotika. Lékem volby pro léčbu infekcí způsobených C. difficile je nejčastěji metronidazol nebo vankomycin. V poslední době se na trhu objevují nové preparáty, kde rovněž není zaznamenána rezistence. Zejména fidaxomicin je doporučován v případě recidiv průjmů. Předpokladem správné laboratorní diagnózy je správně provedený odběr stolice, či postižené střevní tkáně s použitím vhodných odběrových transportních souprav. Standardními metodami diagnostiky je anaerobní kultivace etiologického agens klostridiové kolitidy společně se stanovením produkce toxinů. Nejčastěji se používá enzymová imunoanalýza (EIA), která detekuje hlavní faktory patogenity C. difficile, toxiny A a B, přímo ze stolice. Méně často jsou používány metody stanovení cytotoxicity pomocí buněčných kultur. Další možností je detekce antigenu glutamát dehydrogenázy (GDH) enzymovou imunoanalýzou, nebo specifická PCR sledující geny pro vybrané faktory patogenity.
6
Obr. 1: Mikroskopický obraz Clostridium difficile, preparát barvený dle Grama, zvětšeno 1000x (Foto: J. Vrtný).
7
Izolace a identifikace Clostridium difficile
Níže popsaná metodika slouží k izolaci a předběžné identifikaci C. difficile ze vzorků stolice. Metoda alkoholového šoku selektivně zabíjí vegetativní formy buněk. Spóry klostrídií a aerobních baktérií přežívají a mohou být následně kultivovány na agarových médiích.
Materiál (vzorky, vybavení, kultivační média, chemikálie)
Vzorek stolice v plastové nádobce (skladovat při teplotě 4 až -20 °C) Anaerobní hrnec nebo anaerobní box Termostat (37 °C) Dlouhovlnná UV lampa (365 nm) Clostridium difficile selektivní médium 70 % metanol ve vodě Microscreen C. difficile latexový aglutinační test
Bezpečnost práce Clostridium difficile je podmíněně patogenní baktérie, která způsobuje průjmy spojené s užíváním antibiotik u citlivých osob. Symptomy onemocnění se pohybují od asymptomatického, přes lehkou formu průjmu, pseudomembranózní kolitidu, až po těžké případy končící smrtí. Postižení mívají narušenou střevní mikroflóru (často z důvodu užívání širokospektrých antibiotik), nebo jsou imunosuprimovaní. Rizikovou skupinou jsou zejména pacienti starší 65 let.
Rizikové chemikálie a vybavení: metanol (vysoce hořlavý, toxický), UV lampa (nebezpečí poškození očí a kůže).
8
Příprava vzorku, kultivace
1. V digestoři: 1 g nebo 1 ml odebraného vzorku stolice se smíchá přibližně v poměru 1:1 se 70 % metanolem ve sterilní skleněné nádobce. 2. Promícháme pomocí Vortexu a necháme sedimentovat při pokojové teplotě po dobu 30-60 min. 3. Sterilní jednorázovou Pasteurovou pipetou očkujeme dvě kapky sedimentu na selektivní agar a důkladně rozetřeme po povrchu Petriho misky. 4. Misky
co
nejrychleji
přemístíme
do
anaerobního
hrnce
nebo
boxu
a kultivujeme při 37 °C po dobu 48-72 hodin.
Odečítání kultur, identifikace C. difficile
Předběžná identifikace narostlých kolonií C. difficile je prováděna na základě následujících kritérií: 1. Charakteristická
morfologie
kolonií
(šedobílé,
poněkud
ploché,
s nepravidelným okrajem, nehemolytické). Na stejné misce se mohou objevit různě velké kolonie (v průměru 1-5 mm). 2. Na médiích s přídavkem vaječného žloutku není pozorován bílý difúzní zákal v okolí kolonií (na rozdíl od jiných druhů klostrídií neprodukují lecitinázu). 3. Gramovo barvení kolonií z neselektivního média odhalí Gram pozitivní tyčky se subterminálními spórami. 4. Zápach připomínající koňský hnůj. 5. Zelenožlutá fluorescence pod UV lampou. 6. Aglutinace s latexovým činidlem pro C. difficile. 7. Identifikace druhu pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie.
Clostridium difficile se dá odlišit od podobně vyhlížejících druhů klostrídií na základě růstu na C. difficile selektivním médiu s přídavkem antibiotik cefoxitin, amfotericin B a cykloserin. Diagnostika infekce C. difficile musí být podložena kromě izolace také
9
detekcí toxinů ve stolici nebo u izolátů. Některé kmeny jsou netoxigenní, a tudíž nepatogenní.
Subkultivace kmenů identifikovaných jako C. difficile se provádí na neselektivním anaerobním krevním agaru. Pro vyloučení kontaminace se doporučuje stejné izoláty kultivovat rovněž aerobně na krevním agaru. Doba inkubace se pohybuje v rozmezí 24-48 hodin. Čistota kultury je důležitá zejména v případě uchovávání izolátů (např. při -70 °C), nebo před provedením dalších testů (detekce toxinů, antimikrobiálních citlivostí, PCR-ribotypizace atd.).
Obr. 2: Clostridium difficile - po 48 hod. kultivaci v anaerobním prostředí (Foto: D. Chmelař).
10
Obr. 3: Anaerobní kultivační systém od firmy Oxoid (Foto: autor).
11
Izolace DNA Clostridium difficile
Materiál (vzorky, vybavení, chemikálie)
Izoláty Clostridium difficile QIAamp® DNA Blood Mini Kit (proteáza, AL, AW1, AW2) Fosfátový pufr a destilovaná voda Centrifuga Eppendorf Pipety a zkumavky Termoblok (56 °C a 70 °C) Vortex
Příprava reagencií QIAamp® DNA Blood Mini Kit
Proteáza: V čisté místnosti přidáme 5,5 ml roztoku k lyofilizovanému enzymu (proteáze) a skladujeme při teplotě -20 °C. AL: Obsahuje guanidinium chlorid, který denaturuje proteiny. Napomáhá k rozbití buněk a k extrakci DNA pro analýzu. AW1: Přidáme 125 ml čistého etanolu k 95 ml AW1. Skladujeme při pokojové teplotě. Pufr AW1 obsahuje guanidinium chlorid. Roztok slouží k denaturaci proteinů ve vzorku.
AW2: Přidáme 160 ml čistého etanolu k 66 ml AW2. Skladujeme při pokojové teplotě. Pufr AW2 je vlastně 70 % etanol, který se používá k odsolení vzorku a purifikaci DNA.
12
Bezpečnost práce
AL a AW1 pufr obsahuje guanidinium chlorid, který může způsobovat podráždění. Pufry AW1 a AW2 obsahují azid sodný jako konzervant, který je velmi toxický a může reagovat explozivně při kontaktu s kovy. Proteáza může dráždit oči a kůži. Při práci používáme rukavice, oči v případě zasažení vymyjeme vodou.
Postup izolace
Všechny centrifugační kroky se provádí při pokojové teplotě. Vzorky a připravené roztoky necháme temperovat při pokojové teplotě. Zapneme a zahřejeme termoblok na teplotu 56 °C. Jestliže se vytvoří sraženina v AL pufru, rozpustíme ji zahřátím na teplotu 56 °C v termobloku.
Do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky přidáme 200 µl fosfátového pufru a resuspendujeme v ní 1 kolonii bakteriální kultury z Petriho misky. Ke vzorku přidáme 20 µl připravené proteázy a pak 200 µl AL pufru. Zamícháme na Vortexu cca po dobu 15 sekund. Směs inkubujeme nejméně 10 minut při 56 °C v termobloku. Mikrocentrifugační zkumavku krátce centrifugujeme, abychom odstranili kapky z vnitřní strany víčka. Ke vzorku přidáme 200 µl čistého etanolu a směs pečlivě napipetujeme do QIAamp Mini spin kolony (v 2 ml sběrné zkumavce). Centrifugujeme při 8 000 otáčkách za minutu po dobu 1 minuty. QIAamp Mini spin kolonu umístíme do čisté 2 ml sběrné zkumavky. Použitou sběrnou zkumavku s filtrátem vyhodíme. Do kolony přidáme 500 µl AW1 pufru. Centrifugujeme při 8 000 otáčkách za minutu po dobu 1 minuty. QIAamp Mini spin kolonu umístíme do čisté 2 ml sběrné zkumavky. Použitou sběrnou zkumavku s filtrátem vyhodíme.
13
Do kolony přidáme 500 µl AW2 pufru. Centrifugujeme při 14 000 otáčkách za minutu po dobu 3 minut. QIAamp Mini spin kolonu umístíme do čisté 1,5 ml sběrné zkumavky. Použitou sběrnou zkumavku s filtrátem vyhodíme. Do QIAamp Mini spin kolony přidáme 200 µl destilované vody. Směs inkubujeme při pokojové teplotě po dobu 5 minut. Centrifugujeme při 8 000 otáčkách za minutu po dobu 1 minuty. Odstraníme kolonu. Izolovanou DNA ve zkumavce skladujeme při teplotě 4 °C až -20 °C pro další analýzy.
14
PCR-ribotypizace Clostridium difficile
Tato metoda slouží k typizaci izolátů Clostridium difficile. V současnosti je známo přibližně 400 různých PCR ribotypů tohoto druhu. PCR-ribotypizace je založena na přítomnosti několika RNA operonů na různých místech v DNA. Množství a umístění těchto operonů se u každého kmene liší, což se projevuje rozdíly v počtu a velikosti jednotlivých fragmentů DNA mezi těmito operony. Každý ribotyp má svůj jedinečný profil proužků na gelu zobrazující fragmenty DNA. K pomnožení (amplifikaci) těchto úseků DNA slouží specifické primery. Tyto primery jsou komplementární k 3´ konci genu pro 16S rRNA a k 5´ konci genu pro 23S rRNA, čímž k amplifikaci vymezí „intergenic spacer region“ (ISR).
Primery (Bidet et al., 2000):
16S
A321BacS-16S
5´- gtgcggctggatcacctcct
-3´ 23S
A322BacAS-23S
5´- ccctgcacccttaataacttgacc -3´
Velikost fragmentu: 200 – 600 bp.
Postup PCR
Z důvodu rizika DNA kontaminace je nutné provádět jednotlivé kroky v oddělených prostorech (laboratořích). V jedné laboratoři se připravuje pouze PCR směs, v druhé laboratoři se provádí pouze izolace DNA a její pipetování do PCR směsi a v další laboratoři vlastní PCR a gelová elektroforéza. V každé z těchto laboratoří se pak používá vlastní nepřenosné vybavení: pláště, roztoky a chemikálie, pipety, stojany a další pomůcky. Používají se sterilní špičky s filtrem a pipety označované jako „čisté“ pro roztoky neobsahující DNA a „špinavé“ pro roztoky obsahující DNA. Pracovní plochy a stojany pravidelně dezinfikujeme.
15
Pro PCR ribotypizaci je nutná předchozí pozitivní identifikace Clostridium difficile. Na cca 7 vzorků připadá jedna negativní kontrola (bez DNA) a pozitivní kontrola (např. DNA určeného ribotypu 027). DNA ze vzorku (kultury) identifikovaného jako C. difficile izolujeme pomocí metody popsané v předchozí kapitole příp. jiné dostupné metody. PCR směs pro jednu reakci sestává z: Hot star mix*
12,5 µl
16S primer
0,25 µl
23S primer
0,25 µl
H2O (pro PCR)
9,5 µl
Celkový objem
22,5 µl
*obsahuje dNTP, MgCl2 a Taq polymerázu Připravíme PCR směs podle uvedeného schématu v celkovém objemu pro všechny reakce (vzorky). Objemy tedy vynásobíme počtem analyzovaných vzorků včetně pozitivní a negativní kontroly a rezervního objemu. Připravenou směs pipetujeme do PCR mikrozkumavek podle počtu vzorků. Skladujeme při teplotě -20 °C.
V oddělené laboratoři přidáme do každé PCR mikrozkumavky 2,5 µl izolované DNA. Celkový objem jedné směsi bude 25 µl. V případě pozitivní kontroly přidáme 2,5 µl DNA ribotypu 027 (skladujeme při -20 °C). V případě negativní kontroly přidáme 2,5 µl vody. Uzavřeme víčky.
V další oddělené místnosti vložíme mikrozkumavky do PCR cykléru, nastavíme program a spustíme PCR. 15´
95 °C
1´
94 °C _
1´
57 °C _
1´
72 °C _
35X
16
7´
72 °C
Hold 15 °C
Po skončení PCR analyzujeme produkty reakce pomocí gelové nebo kapilární elektroforézy (viz níže).
Gelová elektroforéza
S pomocí horizontální gelové elektroforézy je možné separovat DNA fragmenty podle jejich velikosti. Agarózový gel je tvořen polymerní sítí, kde velikost pórů závisí na koncentraci agarózy. Gel je uložen ve vaničce naplněné elektroforetickým pufrem. Průchod stejnosměrného elektrického proudu při konstantní hodnotě napětí způsobuje, že fragmenty DNA, které jsou negativně nabité, putují ke kladnému pólu. Rychlost, se kterou molekuly putují agarózovým gelem, závisí na velikosti a orientaci molekuly DNA. Větší molekuly proto migrují pomaleji než menší. Do gelu se přidává etidium bromid. Etidium bromid je karcinogenní substance, která se váže na dvoušroubovici DNA. Jedná se o fluorescenční barvivo, které po ozáření UV světlem emituje oranžové záření ve viditelné oblasti spektra. Etidium bromid navázaný na DNA vyzařuje 20-30 krát více než nenavázaný (v roztoku). Velikost analyzovaného fragmentu DNA se odečítá na základě standardu o známých velikostech fragmentů DNA, který se přidává do gelu k neznámým vzorkům.
Bezpečnost práce
Etidium bromid je silně mutagenní a toxický. Je citlivý na světlo (tmavá láhev zabalená v alobalu) a teplo. Při manipulaci s jeho roztokem je nutné používat jednorázové rukavice. Všechny předměty a chemikálie, které přijdou do kontaktu s tímto roztokem, se likvidují jako zvláštní odpad.
17
Chemikálie
Destilovaná voda Nanášecí pufr 10 x TAE pufr Agaróza (electrophoresis grade) 100 bp DNA standard Etidium bromid (10 mg/ml)
Vybavení
Mikrovlnná trouba Elektroforetická vana s nosičem gelu a hřebínkem Síťový zdroj Erlenmeyerovy baňky a odměrné válce Váhy Bio-Rad Molecular Imager ® GelDocTM XR
Postup
Sestavíme aparaturu pro nalévání gelů. Lepicí páskou oblepíme oba konce gelového nosiče a připevníme na něho hřebínek. Připravíme 0,5 x TAE pufr ze zásobního 10 x roztoku rozpuštěním v destilované vodě (50 ml 0,5 x TAE + 950 ml dest. vody). Připravíme 1,5 % roztok agarózy v 100 ml 0,5 x TAE pufru do 500 ml Erlenmeyerovy baňky. Baňku vložíme do mikrovlnné trouby a zahříváme 3-5 min na plný výkon. Pokud roztok začne vřít, vypneme troubu a baňku promícháme (používáme kuchyňskou rukavici). Zahřívání a promíchávání opakujeme, dokud se roztok nevyčeří. Vychladíme na přibližně 60 °C, pak přidáme 3 µl (10 mg/ml) etidium bromidu na 100 ml roztoku agarózy. Obsah baňky vylijeme do připravené aparatury,
18
případné bubliny eliminujeme. Gel necháme tuhnout po dobu alespoň 30 min při pokojové teplotě.
Elektroforetickou vaničku naplníme 0,5 x TAE pufrem a gel na nosiči umístíme do vaničky tak, aby byl gel zcela ponořen do elektroforetického pufru. Opatrně odstraníme hřebínek a zabráníme vzniku bublin v prostoru gelu. K PCR produktu v každé zkumavce přidáme 5 µl nanášecího pufru a promícháme. Do jamek vytvořených hřebínkem přidáme vždy 10 µl takto připraveného vzorku. Do okrajových jamek a doprostřed přidáme 8 µl DNA standardu z důvodu snadného odečtu velikosti fragmentů DNA. Elektroforetickou vaničku překryjeme víkem a připojíme elektrody ke zdroji stejnosměrného proudu. Nastavíme 85 V a necháme běžet 3 hodiny. Ujistíme se, že se vzorky pohybují směrem k pozitivní elektrodě.
Po skončení elektroforézy vypneme zdroj. Vyjmeme gel i s nosičem z elektroforetické vaničky (použijeme jednorázové rukavice). Gel přeneseme v plastovém kontejneru, umístíme do přístroje Bio-Rad Molecular Imager ® GelDocTM XR a pořídíme fotografii. Snímek uložíme a vytiskneme, gel vyjmeme z přístroje a zlikvidujeme jako speciální odpad. Vnitřní prostor přístroje vyčistíme alkoholem a vodou.
Kromě klasické elektroforézy v agarózovém gelu je pro detekci PCR produktu možné použít kapilární elektroforézu. Následně se provádí analýza fragmentů s pomocí software GeneMapper® (Applied Biosystems). Program BioNumerics® (Applied Maths) obsahuje knihovnu známých profilů, na jejímž základě provede identifikaci neznámého vzorku a přiřazení konkrétního ribotypu.
19
standard
Obr. 4: PCR-ribotypizace Clostridium difficile. Gelová elektroforéza DNA testovaných izolátů (Foto: autor).
20
Multiplex PCR pro charakterizaci izolátů Clostridium difficile
Metoda slouží k identifikaci Clostridium difficile a stanovení faktorů patogenity. Dva hlavní toxiny C. difficile jsou enterotoxin A a cytotoxin B, které jsou kódovány geny tcdA a tcdB. Pouze toxiny produkující kmeny C. difficile jsou enteropatogenní pro člověka a zvířata. Některé izoláty navíc obsahují ještě tzv. binární toxin, který je kódován geny cdtA a cdtB. Přítomnost nebo nepřítomnost těchto tří toxinů je používána k charakterizaci patogenních izolátů. Při detekci se používá systém dvou kontrol. K testování úspěšné izolace bakteriální DNA (ve vzorku jsou tedy přítomny bakterie) se používá sada primerů vymezujících gen pro 16S rRNA. V rámci druhé kontroly se testuje přítomnost genu pro glutamát dehydrogenázu (gluD), která potvrzuje identifikaci C. difficile. Toto uspořádání PCR, kdy detekujeme několik specifických sekvencí najednou, se nazývá multiplex PCR. Naopak, pokud detekujeme pouze jednu specifickou sekvenci, hovoříme o single PCR. Z dalších faktorů patogenity je u některých kmenů přítomna delece v genu tcdC, který reguluje produkci toxinů.
Postup
Připravíme PCR směs a rozpipetujeme ji do jednotlivých PCR mikrozkumavek podle schématu:
Hot star mastermix
12,5 µl
tcdA-F
0,3 µl
tcdA-R
0,3 µl
tcdB-F
0,2 µl
tcdB-RA
0,1 µl
tcdB-RB
0,1 µl
cdtA-FA
0,025 µl
cdtA-FB
0,025 µl
21
cdtA-R
0,05 µl
cdtB-F
0,05 µl
cdtB-R
0,05 µl
PS-F
0,025 µl
PS-R
0,025 µl
gluD-F
0,3 µl
gluD-R
0,3 µl
voda pro PCR
8,15 µl
celkem
22,5 µl
Koncentrace každého primeru je 50 µmol. Do mikrozkumavek přidáme vždy 2,5 µl zkoumaného vzorku izolované DNA nebo pozitivní kontrolu. Celkový objem v jedné zkumavce tedy bude 25 µl.
Provedeme PCR podle následujícího programu:
15´
95 °C
45´´
94 °C _
45´´
50 °C _
1´
72 °C _
10´
72 °C
35X
Hold 15 °C
Po ukončení PCR jsou produkty analyzovány pomocí gelové elektroforézy (viz. předchozí kapitola, s drobnými úpravami).
Sestavíme aparaturu pro nalévání gelů. Lepicí páskou oblepíme oba konce gelového nosiče a připevníme na něho hřebínek. Připravíme 0,5 x TAE pufr ze zásobního 10 x roztoku rozpuštěním v destilované vodě (50 ml 0,5 x TAE + 950 ml dest. vody). Připravíme 2,0% roztok agarózy ve 100 ml 0,5 x TAE pufru do 500 ml Erlenmeyerovy 22
baňky. Baňku vložíme do mikrovlnné trouby a zahříváme 3-5 min na plný výkon. Pokud roztok začne vřít, vypneme troubu a baňku promícháme (používáme kuchyňskou rukavici). Zahřívání a promíchávání opakujeme, dokud se roztok nevyčeří. Vychladíme na přibližně 60 °C, pak přidáme 3 µl (10 mg/ml) etidium bromidu na 100 ml roztoku agarózy. Obsah baňky vylijeme do připravené aparatury, případné bubliny eliminujeme. Gel necháme tuhnout po dobu alespoň 30 min při pokojové teplotě.
Elektroforetickou vaničku naplníme 0,5 x TAE pufrem a gel na nosiči umístíme do vaničky tak, aby byl gel zcela ponořen do elektroforetického pufru. Opatrně odstraníme hřebínek a zabráníme vzniku bublin v prostoru gelu. K PCR produktu v každé zkumavce přidáme 5 µl nanášecího pufru a promícháme. Do jamek vytvořených hřebínkem přidáme vždy 10 µl takto připraveného vzorku. Do okrajových jamek a doprostřed přidáme 8 µl DNA standardu z důvodu snadného odečtu velikosti fragmentů DNA. Elektroforetickou vaničku překryjeme víkem a připojíme elektrody ke zdroji stejnosměrného proudu. Nastavíme 100 V a necháme běžet po dobu 30 minut. Ujistíme se, že se vzorky pohybují směrem k pozitivní elektrodě.
Po skončení elektroforézy vypneme zdroj. Vyjmeme gel i s nosičem z elektroforetické vaničky (použijeme jednorázové rukavice). Gel přeneseme v plastovém kontejneru, umístíme do přístroje Bio-Rad Molecular Imager ® GelDocTM XR a pořídíme fotografii. Snímek uložíme a vytiskneme, gel vyjmeme z přístroje a zlikvidujeme jako speciální odpad. Vnitřní prostor přístroje vyčistíme alkoholem a vodou.
23
standard
Obr. 5: Detekce vybraných faktorů patogenity Clostridium difficile pomocí multiplex PCR. Gelová elektroforéza DNA testovaných izolátů (Foto: autor).
24
Stanovení citlivosti na antimikrobní látky
K léčbě infekcí způsobených
C. difficile se nejčastěji používají antibiotika
metronidazol a vankomycin. Z hlediska možné zvýšené rezistence není příliš vhodný např. klindamycin nebo moxifloxacin. V současné době jsou testována a zaváděna nová antibiotika, jako je fidaxomicin nebo LFF 571.
Základní metodou ke stanovení citlivosti Clostridium difficile na antimikrobní látky je agarová diluční metoda dle směrnic CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, USA). Antibiotika jsou rozpuštěna v různých koncentracích v Brucella Blood agaru s přídavkem heminu a vitamínu K. Rozsah koncentrace je definován pro každé testované antibiotikum (tzv. koncentrační řada). Izoláty klostridií jsou kultivovány na krevním agaru anaerobně při 37 °C. 48 hodinovou kulturu resuspendujeme ve fosfátovém pufru do
koncentrace
0,5 McFarland
(zákalová
stupnice
dle
McFarlanda). Takto připravené kmeny jsou inokulovány na povrch Brucella Blood agaru s antibiotiky pomocí mnohabodového inokulátoru do konečné koncentrace cca 104 CFU. Misky jsou inkubovány anaerobně při 37 °C a odečítány po 24 a 48 hodinách. Pro každé antibiotikum zjistíme hodnotu MIC, tedy nejnižší koncentraci, která viditelně ještě inhibuje růst mikroorganismů.
Stanovení citlivosti na antimikrobní látky metodou E-test
Materiál a vybavení
Wilkins-Chalgren anaerobní agar (+ G.N. Spore Anaerobic Supplement) Antibiotika vankomycin, metronidazol, fidaxomicin, LFF 571, klindamycin, moxifloxacin (E-test proužky) C. difficile selektivní agar Kmeny C. difficile
25
Anaerobní hrnec, nebo anaerobní box Termostat (37 °C) Fosfátový pufr Zkumavky, odběrové tampóny, pinzeta
Postup
Stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) antibiotika pomocí E-testu se řadí mezi kvantitativní metody. Čistá 48 hodinová kultura testovaného kmene C. difficile narostlá na C. difficile selektivním agaru se odebere pomocí sterilního odběrového tampónu.
Ve fosfátovém
pufru
ve
sterilní
zkumavce
se
připraví
inokulum
o koncentraci 1,5 – 3×108 CFU/ml. Inokulum se rovnoměrně rozetře po povrchu Wilkins–Chalgrenova anaerobního agaru se suplementem. Proužek testovaného antibiotika je umístěn sterilní pinzetou na povrch agaru. Nejprve se přiloží část proužku s nejnižší koncentrací antibiotika a poté se jemně přitlačí zbytek proužku. Petriho misky se inkubují při 36,5 °C v termostatu v anaerobních podmínkách po dobu 48 hodin.
Vyhodnocení citlivosti na antibiotika. Proužky E-testu obsahují gradient koncentrace příslušného antibiotika, který se pohybuje v rozmezí 256–0,015 μg/ml. Odečítání hodnot MIC a jejich interpretace vzhledem ke stanoveným hodnotám breakpointů se provádí podle instrukcí v databázi EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 3.1. 2013): http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/. Tato veřejně přístupná internetová databáze obsahuje aktualizované hodnoty breakpointů pro jednotlivé skupiny bakterií a hub (pro hodnoty MIC i pro velikosti průměru zón u diskové difúzní metody). Na základě těchto údajů je individuálně posouzena citlivost nebo rezistence daného mikroorganismu k příslušnému antibiotiku.
26
Obr. 6: Stanovení citlivosti Clostridium difficile na antibiotika amoxicilin s kys. klavulanovou a klindamycin (dalacin) metodou E-test (Foto: D. Chmelař).
27
Literatura
Cohen J., Powderly W.G., Opal S.M. Infectious Diseases. Mosby Elsevier, 3rd Edition, Vol. 2, 2010, 1918 p. Riddle D.J., Dubberke E.R. (2009). Trends in Clostridium difficile disease: epidemiology and intervention. Infect Med 26: 211-20. Stevens D.L., Bryant A.E., Berger A., von Eichel-Streiber C. Clostridium. In: Versalovic et al. Manual of Clinical Microbiology. Washington, ASM Press, 10th Edition, Vol. 1, 2011, p. 834-57. Brazier J.S. (1995). The laboratory diagnosis of C. difficile associated disease. Rev Med Microbiol 6: 236-45. Brazier J.S. and Hooker J. (1989). Cross reactivity of Clostridium glycolicum with the latex particle slide agglutination reagent for Clostridium difficile identification. Lett Appl Microbiol 8: 199-202. Fedorko D.P. and Williams E.C. (1997). Use of cycloserine-cefoxitin-fructose agar and L-prolineaminopeptidase (PRO Discs, Rosco) in the rapid identification of Clostridium difficile. J Clin Microbiol 35: 1258-59. Veloo A.C., Knoester M., Degener J.E., Kuijper E.J. (2011). Comparison of two matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry methods for the identification of clinically relevant anaerobic bacteria. Clin Microbiol Infect 10: 1501-06. Persson S., de Boer R.F., Kooistra-Smid A.M., Olsen K.E. (2011). Five commercial DNA extraction systems tested and compared on a stool sample collection. Diagn Microbiol Infect Dis 69: 240-44. QIAamp DNA Mini Kit and QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook, Qiagen, Hilden, Germany. Bidet P., Lalande V., Salauze B., Burghoffer B., Avesani V., Delmée M., Rossier A., Barbut F., Petit J.C. (2000). Comparison of PCR-ribotyping, arbitrarily primed PCR,
28
and pulsed-field gel electrophoresis for typing Clostridium difficile. J Clin Microbiol 38: 2484-87. O'Neill G.L., Ogunsola F.T., Brazier J.S., Duerden B.I. (1996). Modification of a PCR ribotyping method for application as a routine typing scheme for Clostridium difficile. Anaerobe 2: 205-09. Stubbs S.L., Brazier J.S., O'Neill G.L., Duerden B.I. (1999). PCR targeted to the 16S23SrRNA gene intergenic spacer region of Clostridium difficile and construction of a library consisting of 116 different PCR ribotypes. J Clin Microbiol 37: 461-63. Matamouros S., England P., Dupuy B. (2007). Clostridium difficile toxin expression is inhibited by the novel regulator TcdC. Mol Microbiol 64: 1274-88. Paltansing S., van den Berg R.J., Guseinova R.A., Visser C.E., van der Vorm E.R., Kuijper E.J. (2007). Characteristics and incidence of Clostridium difficile associated disease in the Netherlands, 2005. Clin Microbiol Infect 13: 1058-64. Persson S., Torpdahl M., Olsen K.E. (2008). New multiplex PCR method for the detection of Clostridium difficile toxin A and toxin B and the binary toxin genes applied to a Danish strain collection. Clin Microbiol Infect 14: 1057-64. Stevens D.L., Bryant A.E., Berger A., von Eichel-Streiber C. Clostridium. In: Versalovic et al. Manual of Clinical Microbiology. Washington, ASM Press, 10th Edition, Vol. 1, 2011, s. 834-57. Beran V., Chmelar D., Vobejdova J., Konigova A., Nemec J., Tvrdik J. (2014). Sensitivity to antibiotics of Clostridium difficile toxigenic nosocomial strains. Folia Microbiol (Praha) 59: 209-15. Erikstrup L.T., Danielsen T.K., Hall V., Olsen K.E., Kristensen B., Kahlmeter G., Fuursted K., Justesen U.S. (2012). Antimicrobial susceptibility testing of Clostridium difficile using EUCAST epidemiological cut-off values and disk diffusion correlates. Clin Microbiol Infect 18: E266-72. Freeman J., Vernon J., Morris K., Nicholson S., Todhunter S., Longshaw C., Wilcox M.H.; the Pan-European Longitudinal Surveillance of Antibiotic Resistance among Prevalent Clostridium difficile Ribotypes' Study Group (2014). Pan-European
29
longitudinal surveillanc, of antibiotic resistance among prevalent Clostridium difficile ribotypes. Clin Microbiol Infect, pii: S1198-743X(14)00053-6. Tran M.C., Claros M.C., Goldstein E.J. (2013). Therapy of Clostridium difficile infection: perspectives on a changing paradigm. Expert Opin Pharmacother 14: 237586.
30
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Název:
Detekce a typizace Clostridium difficile a stanovení citlivosti na antimikrobní látky
Autor:
Vladimír Beran
Jazyková a grafická korektura:
Markéta Balzarová
ISBN:
978-80-7464-738-3
Nakladatel:
Ostravská univerzita v Ostravě, Dvořákova 7, 701 03 Ostrava
Tisk:
X-MEDIA servis s.r.o., U Cementárny 1171/11, 703 00 Ostrava – Vítkovice
1.vydání
31
