Vérsejtszámlálás 1. Az emberi vér alakos elemei • vörösvértestek (vvt, angol: RBC = red blood cells) • fehérvérsejtek (fvs, angol: WBC = white blood cells) • vérlemezkék (trombociták, angol: PLT = platelet, thr = thrombocyte) limfociták
granulociták
vérlemezkék monociták
vörösvértestek
granulociták
A vérben az alakos elemek térfogati aránya a hematokrit érték, ez normálisan 36 – 47% közötti.
Vörösvértestek • • • • • • • •
a vér alakos elemeinek több, mint 99%-át teszik ki a vöröscsontvelőben képződnek az érett vörösvérsejtnek már nincs sejtmagja (ezért vörösvértest) érésük közben hemoglobin-molekulákat szintetizálnak, így oxigén szállítására képesek részt vesznek a CO2 szállításában is számuk felnőtt nő vérében 4,5×1012 db/liter, férfiakban valamivel magasabb, 5×1012 db/liter átmérőjük 7 – 8 µm átlagos élettartamuk 120 nap, a lépben és a májban bomlanak le.
1
Fehérvérsejtek • • • • •
valódi sejtek, sejtmaggal rendelkeznek a szervezet védekezési mechanizmusaiban játszanak szerepet számuk átlagosan 9 × 109 db/liter, de a 4 – 11 × 109 db/liter is normális 3 fő típusuk: granulociták, monociták és limfociták egészséges ember fehérvérsejtjeinek 50 – 70%-a granulocita, 20 – 40%-a limfocita és 2 – 8%-a monocita • granulociták – a citoplazmában előforduló, nagy mennyiségű granulum (szemcse) – a szemcsékben tárolt anyagok szerepet játszanak a gyulladásos, illetve allergiás reakciókban – A fiatal granulociták patkó alakú sejtmagja a sejtek érésével párhuzamosan lebenyezetté válik. – Hisztológiai festési tulajdonságaik alapján különíthetőek el a neutrofil (semleges), bazofil (lúgos) vagy eozinofil (savas) granulociták. – neutrofil granulociták ∗ ezekből van a legtöbb (3 – 6 × 109 db/L). ∗ a keringésben eltöltött féléletidejük rövid (átlagosan kb 6 óra), ezért naponta igen nagy mennyiségben keletkeznek. ∗ A bakteriális fertőzések elleni sejtes védelem alapját biztosítják, nagy mennyiségben képesek a szövetekbe is belépni. ∗ Granulumaikból antimikrobiális hatású fehérjék, proteolitikus hatású és oxidatív szabadgyökök előállítására képes enzimek szabadulhatnak fel. ∗ Fagocitáló képességük miatt mikrofágoknak is nevezik őket. – eozinofil granulociták ∗ vérben normálisan csak 1,5 – 3 × 108 db/liter ∗ allergiás reakciók esetén több ∗ elsősorban a lég-, húgy- és bélutak nyálkahártyájában találhatóak, ahol a paraziták elleni védekezésben játszanak szerepet. – bazofil granulociták ∗ granulumaikban heparint, hisztamint és más gyulladásmediátorokat tartalmaznak ∗ számuk alacsony (<1×108 db/liter) ∗ szerepük van: az azonnali túlérzékenységi immunreakciókban és az anafilaxiás rohamok kiváltásában • limfociták – viszonylag kicsik – citoplazmájukat a kerek sejtmag szinte kitölti – számuk normálisan 1,5 – 4×109 db/liter között – az adaptív immunválasz kialakításában vesznek részt – 2 fő csoportjuk: a T limfociták a sejtes immunválasz, a B limfociták a 2
humorális immunválasz kialakításában és az ellenanyagok termelésében játszanak szerepet. – prekurzor sejtjeik a vörös csontvelőben alakulnak ki – a T sejtek érése a csecsemőmirigyben (thymusban) – a B sejtek érése a Bursa-ekvivalens nyirokszervekben – a limfociták döntő többsége a nyirokszervekben tartózkodik és a nyirokkeringésen keresztül jut a véráramba – a perifériás keringésben csak mintegy 2%-uk található • monociták – a fehérvérsejtek mintegy 2 – 8%-a (3 – 6×108 db/liter) – sejtmagjuk nagy, vese alakú – A vörös csontvelőből a véráramba jutnak, ahonnan mintegy 72 óra elteltével az érfalakon átlépve szöveti makrofágokká alakulnak (ilyenek pl. a máj Kupfer sejtjei, az agyi mikroglia sejtek vagy a tüdőalveolusokban található makrofágok). – Aktivációjukat a T limfociták által szekretált limfokinek indítják meg, aminek hatására idegen anyagokat, így pl. baktériumokat tudnak fagocitálni és számos gyulladás-mediátort (pl. prosztaglandin E-t) szabadítanak fel. A vérlemezkék • • • •
a megakariociták sejthártyával körülvett sejtplazmatöredékei, sejtmagjuk nincs szintén a vöröscsontvelőben keletkeznek méretük 2 – 5 µm az érpályából kilépve és az egyenetlen érfalon lebomlanak, a véralvadásban van jelentős szerepük • átlagos trombocita szám 3×1011 db/liter • 1,4 – 4,4×1011 db/liter normális
3
2. Statisztikai háttér Több, azonos térfogatban számoljuk majd az egyes térfogatokba eső sejtek számát. Ha a sejtek egymástól függetlenül helyezkednek el az oldatban, azaz (1) elég ritkák ahhoz, hogy egymás helyét a térfogatban ne befolyásolják lényegesen, és (2) az oldatot elég jó felráztuk és (3) a sejtek nem ragadnak össze és nem is taszítják egymást akkor az egy-egy térfogatban talált sejtek száma Poisson eloszlást követ.
2.1. Poisson eloszlás Mit ír le: Sok független, ritka esemény közül hány következik be egy adott időintervalumban, vagy hány kerül egy adott téri intervallumba. Annak a valószínűsége, hogy k következik be: f (k, λ) =
λk e−λ k!
Itt • • • •
λ > 0 az eloszlás paramétere k = 0, 1, 2, 3, . . . a bekövetkezések száma. e = 2,718 28 . . . a természetes alapú logaritmus alapja, Euler-szám. k! = k faktoriális
A λ paraméterű Poisson eloszlás • • • •
Jele: Pois(λ) Várható értéke: λ Szórásnégyzete: λ √ Szórása: λ A Poisson eloszlás λ = 1, λ = 3 és λ = 10 esetén
4
Közelítés normális eloszlással Nagy λ (kb. λ > 1000) esetén a Poisson eloszlás jól közelíthető λ várható értékű λ szórásnégyzetű normális eloszlással. Ez a közelítés már λ > 10 esetén is elég jó, ha folytonossági korrekcióként N (λ, λ) helyett N (λ − 0.5, λ).
Kapcsolat a binomiális eloszlással Egy n és p paraméterű binomiális eloszlás azt adja meg, hogy egy p valószínűségű esemény n független próbálkozásból milyen valószínűséggel következik be éppen kszor: P (X = k) =
n k p (1 − p)n−k k
Jele: Binom(n, p)
5
A „ritka események törvénye”: Binomiális eloszlások olyan sorozata ahol a várható érték (np) állandó és n → ∞ a λ = np paraméterű Poisson eloszláshoz tart. A λ = 4 paraméterű Poisson eloszláshoz közeledő binomiális eloszlások
Ha n ≥ 20 és p ≤ 0.05, akkor Binom(n, p) elég jól közelíthető Poisson eloszlással. Ha n ≥ 100 és np ≤ 10, akkor nagyon jól.
Konfidenciaintervallum a λ paraméterre Guerriero és mások (2009): Poisson eloszlás λ paraméterére 95%-os konfidenciaintervallum:
N N 1.96 1.96 √ √ , · 1− · 1+ L L N −1 N −1
ahol N az események száma, L az intervallum hossza, N/L az egységnyi intervallumra jutó események száma. Alkalmazási feltétel: N ≥ 15 Így ha N sejtet számoltunk, gyakorisága 95% valószínűséggel akkor ez szerint a sejtek a végeredmény
1−
√1.96 N −1
-szerese és
1+
√1.96 N −1
-szerese közé esik.
= ±0.1265 ≈ ±13% Például ha 241 sejtet számoltunk, akkor ± √1.96 240
6
3. Vérsejtszámlálás Eszközök • • • • • • • • •
ujjbegy fertőtlenítéshez spray steril, egyszer használatos injekciós tű gumikesztyű vatta (vér törlése ujjbegyről) automata pipetták (1000 és 200 µL), pipettahegyek, Eppendorf csövek (1.5 mL, fedeles) Hayem oldat (hipertóniás, vvt-k zsugorodnak) Türk oldat (vvt-t hemolizálja, fvs magját metilénkékkel festi) (Türk-oldat: 0,5 %-os ecetsav metilénkékkel színezve) Bürker kamra mikroszkóp (40× nagyítás)
Bürker kamra Számláló kamra H alakú vájat
Fedőlemez
Csavar
• két 3x3 mm-es számlálókamra vonalakkal 3x3 részre osztva • a részeken belül közeli vonalak 1/20 mm távolságra, távoliak 1/5 mm-re • a fedőlemez alatt 1/10 mm magas hely van
7
Teendők Elővigyázatosság: csak saját vérrel dolgozik! Ha segíteni kell: gumikesztyű • Bürker kamra előkészítése – mosás csapvízzel, alkohollal, szárítás – fedőlemez rögzítése • bal kéz középső ujj ujjbegy fertőtlenítése • steril tűvel 2–3 mm mélyen megszúr • első csepp vér letörlése száraz vattával • pipetták – P1000 pipettán: 10 µL× a beállított szám a térfogat – P200 pipettán: 1 µL× a beállított szám a térfogat • vvt: 1:100 higítás – Hayem oldat 990 µL (P1000 pipetta, számot 099-re) – Vér: 10 µL • fvs: 1:10 higítás – Türk oldat: 180 µL (P1000/018 vagy P200/180) – Vér: 2×10 µL • keverés: Eppendorfot lezár, 2 percig rázza • oldatot a Bürker kamra felső szélén az üvegcsík és fedőlemez közé, a számlálókamrába szivárogtat (pipettával 6 µL) • Bürker kamra a mikroszkóp alá – szűk diafragma, süllyesztett kondenzor – a kamra vonalkáit élesen lássuk – 40× nagyítás – vvt számolás: mindkét számlálókamrában 20 – 20 kis négyzetben – fvs számolás: mindkét számlálókamrában 20 – 20 nagy négyzetben • Bürker kamra elmosása
8
Számolás • Becslés: adatok a négyzetekbeli sejtszámok x1 , . . . , x40 – vvt: ∗ x az x1 , . . . , x40 átlaga. 1 1 1 ∗ Ez egy négyzetre vonatkozik, azaz 20 · 20 · 10 = ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗
1 4000
mm3 oldatra
1 mm3 = 1016 liter 100-szoros higítás volt x · 4000 · 106 · 100 = x · 0,4 · 1012 a literenkénti szám nő: 4,5–4,8×1012 a normál férfi: 4,5–5,5×1012 a normál SI előtag: 1012 =tera (T), ezért néha T/L mértékegységgel adják meg (L vagy l a liter)
– fvs: ∗ x az egy négyzetbeli térfogatra vonatkozó átlag 1 1 ∗ ez 51 · 15 · 10 = 250 mm3 oldatban volt 1 mm3 = 1016 liter 10-szeres higítás volt x · 250 · 106 · 10 = x · 2,5 · 109 a literenkénti szám 4–11×109 a normál SI előtag: 109 =giga (G), ezért néha G/L mértékegységgel adják meg P (xi −x)2 • Az egy-egy négyzetben talált sejtszámok szórásnégyzete: s2 = n−1 ∗ ∗ ∗ ∗ ∗
• Poisson eloszlás esetén s2 = λ = x kellene hogy legyen. Hasonlítsa össze az s2 és x értékeket (vvt-re és fvs-re is) – Ha a sejtek csoportosulnak (például összeragadnak), akkor s2 > x lehet. – Ha a sejtek „taszítják egymást”, akkor s2 < x lehet. Ebbe az irányba hat ha túl sok sejt van, ezért nem elhanyagolható a méretük.
9
4. Vércsoport AB0 vércsoport-rendszer • vvt felületén antigén: A vagy/és B. Ebből 4 vércsoport: 0 A B AB • Vérplazmában lehet anti-A vagy/és anti-B antitest. A saját vvt-ken előforduló (A,B) antigének elleniek nincsenek, de a többi antigén elleni antitestek általában jelen vannak. • Vérátömlesztéskor: anti-X ne találkozzon az X antigénnel. – teljes vér adása ritka, vvt és plazma általában külön – Az AB0 mellett sok más vércsoport-rendszer is létezik (kb 30). – AB0 vércsoport megállapítása ezért csak a kezdet, a páciens vére és a készítmény egymásra hatását alkalmazás előtt tesztelni kell • Bombay-jelenség: ritka, de előfordul, hogy az A és B antigének közös alapanyaga, a H antigén hiányzik. Ekkor a vércsoport nullás, noha genetikailag nem feltétlenül az. A normális nullások vérében van H antitest, ezért a Bombay fenotípusúak csak Bombay fenotípusúaktól kaphatnak vért.
Rh vércsoport-rendszer • Rh vércsoport: D antigén (Rh+). • Az Rh vércsoportrendszerben vannak még további antigének (kb 50), de a hétköznapi szóhasználatban az Rh+ vércsoportot a D antigénre használják. • Rh− embernek lehet anti-D antitestje, de nem feltétlenül van. Ha Rh+ vérrel találkozik, megjelenhetnek az anti-D antitestek. • Rh− anya anti-D antitestjei megtámadhatják az Rh+ magzat vörösvértestjeit. • Szülőképes Rh− nők ne kapjanak Rh+ vörösvértesteket • Rh− nő Rh+ magzattal: ha a magzat vére az anyáéba juthat (például szüléskor) anti-D-t kap, hogy ne kezdjen saját maga anti-D-t termelni (a következő magzat miatt).
10
