Vércsoportszerológiai alapfogalmak
Dr. Csépány Norbert Transzfúziós tanfolyam Debrecen 1
Vércsoportszerológia
Az immunológia tudományának speciális ága, mely a vörösvérsejtek felületi antigénjeivel, és az ezek ellen termelődő, ezekkel reagáló antitestekkel, illetve in vitro antigén-antitest reakciókkal foglalkozik
2
Alapfogalmak Antigén – bármely anyag, mely a szervezetbe jutva immunválaszt vált ki
Antitest – az immunrendszer által antigén hatására termelődőtt molekula - a fehérjék immunglobulin családjába tartoznak
Antigén determináns (epitóp) – az antigén azon része melyet egy adott B-sejt receptor vagy T-sejt receptor felismer
Hordozó – az antigénnek a receptorokkal közvetlenül nem reagáló része 3
Immunrendszer
4
Immunrendszer Cél: az antigének eltávolítása
●
Immunválasz: felismert antigén kiküszöbölése saját – idegen struktúrák megkülönböztetése
●
Az immunválasz szakaszai: 1. Kognitív szakasz 2. Centrális szakasz 3. Efferens szakasz
5
Immunválasz szakaszai
6
Vérképzés
7
Veleszületett immunitás
Adaptív immunintás
Fő alkotóelemek
Fő alkotóelemek
Komplement rendszer
●
Hő-shock fehérjék
●
Makrofágok ●
●
●
Granulociták
Regulatorikus citokinek ●
NK sejtek
●
Funkcionális jelleg ●
Nem antigén specifikus ●
Nincs immunológiai memória ●
●
Gyors reakció Lineáris erősítés
Limfociták (B és T)
Antigén prezentáló sejtek
●
Funkcionális jelleg ●
MHC
T sejt és B sejt antigén receptorok
●
Gyulladásos citokinek ●
Antitestek ●
Fc receptorok
●
●
●
Antigén specifikus Immunológiai memória
Latencia után aktiválódik
●
●
Exponenciális erősítés 8
Immunválasz
Elsődleges IgM Ellenanyag affinitás alacsony
Másodlagos IgG Ellenanyag affinitás magas 9
B-sejt aktiváció
10
Immunglobulinok termelődése
11
B-sejtes immunválasz
12
Komplement rendszer
13
Komplement rendszer
●
●
21 inaktív fehérje,melyek egymást aktiválják Az antigén – antitest reakció a komplement rendszert a klasszikus úton aktiválja
14
Antitestek (Immunglobulinok) - plazmasejtek termelik - fehérjék, gamma globulinok - 2 könnyű és 2 nehéz lánc - nyaki kapocs (hinge) régió - másodlagos kötések - 5 alosztály IgM, IgG, IgA, IgD, IgE - 2 könnyű lánc (kappa, lambda) - komplement aktiváció - antitesttel fedett vvt makrofágok általi felismerése 15
Immunglobulinok ●
F(ab) és Fc fragmentek
●
F(ab) – antigén kötés
●
Fc – effektor funkciók
●
●
Fc régió hiányában az immunglobulin nem képes komplentet aktiválni, phagocitózist indukálni
Pepszin után képes lehet agglutinációra – F(ab')2 bivalens szerkezet 16
Immunglobulin osztályok
17
IgG ●
4 alosztály , monomer 75%
●
Antigén kötés nélkül T alak
●
Antigén kötődés után Y alak
●
IgG3 hosszú nyaki rész
●
Leggyakoribb Ig a vérben (1g/ttkg)
●
Áthatol a placentán
●
●
●
IgG1 és IgG3 erős komplement aktiváló IgG2 gyengébb, IgG4 nem aktivál komlementet Félélet idő: 21 nap 18
IgM - Pentamer szerkezet - J lánc - 10% - Nem megy át a placentán - Komplentet az IgG-nél erősebben aktivál - összes IgM 74%-a intravaszkularisan - félélet idő: 5 nap
19
IgA ●
Általában dimer forma (monomer is lehet)
●
Két alosztály IgA1 és IgA2
●
Szekrétumokban főleg
●
Szerológiai reakciókban megjelenhet
●
Félélet ideje 6 nap
IgD ●
Szabad formában nem található meg a vérben
●
B sejtek receptora, antigén ezen keresztül aktiválja a B sejtet
20
Antitestek osztályozása
●
●
●
Autoantitest – Saját antigénnel szemben termelődik Alloantitest – Idegen, de saját fajon belüli antigénnel szemben Xenoantitest – Más fajon belüli antigénnel szemben
21
Vércsoportszerológia kezdete ●
Karl Landsteiner
22
A vér antigén rendszerei ●
Sejtek: - vörösvérsejt antigének - thrombocita antigének - fehérvérsejt antigének
●
Szolubilis antigének: plazmafehérjék, szénhidrátok, zsírok
23
Vörösvérsejt membrán ●
Egyéb sejtekhez hasonlóan alapja a lipid kettős réteg
●
Foszfolipid 60%
●
Koleszterin 30%
●
Glikolipidek 10%
●
Ebben a kettős rétegben találhatók meg a vércsoport antigének
24
Vércsoport antigének ●
A vércsoport tulajdonságok a vörösvérsejteken, fehérvérsejteken, trombocitákon, vérfehérjéken megjelenő egyediséget kifejező öröklött jellegek.
●
Jellemző a Mendeli öröklődés (domináns – recesszív vagy intermedier) Egyedfejlődés során különböző időben jelennek meg Rh rendszer antigénjei születéskor már jelen vannak ABO rendszer antigénjeinek száma születéskor még alacsonyabb, mint későbbi életévekben 25
Vércsoport antigének Vércsoport antigének - poliszacharidok, polipeptid, glikoprotein
26
Vércsoport antigének funkciói ●
Diego – anion csere
●
Kidd – urea transzport
●
Colton – aquaporin 1 transzporter
●
Duffy – Plasmodium vivax receptora
●
Kell – cink kötő endopeptidáz
●
Rh – vörösvérsejt membrán stabilitás
27
Vörösvérsejt antigének ●
A vércsoportok között a vvt-ken megjelenő antigénszám különböző - ABO antigének 1-2 millió/vvt - M,N antigének 500 ezer/vvt - I antigén 100-500 ezer/vvt - D, S, Duffy, Kidd 30-40 ezer/vvt
28
Vércsoportrendszerek A napjainkig a vörösvérsejteken kimutatott több mint 500 antigént az ISBT a következő csoportokba sorolja:
●
Vércsoport rendszerek (30 vércsoport rendszer)
●
Vércsoport antigén kollekciók
●
Ritkán előforduló antigének
●
Nagy gyakorisággal előforduló antigének
29
Vércsoportrendszer klinikai jelentősége ●
ABO rendszer
●
Rh rendszer
●
Immunogén rendszerek (Kell, Duffy, Kidd)
●
ABO társrendszerei (Lewis, P, Lutheran)
30
Vércsoportrendszerek jelentősége Orvostudomány szempontjából: ●
Transzfúziós
●
Transzplantációs (ABO antigének szöveti sejteken)
●
Igazságügyi – orvostani
●
Antropológiai szempontok
Transzfúziós szempontból az antitest okoz-e: ●
Hemolítikus transzfúziós szövődményt
●
Újszülöttkori hemolítikus betegséget 31
Vércsoport antigének tulajdonságai ●
Antigén specificitása - epitóp határozza meg
●
Immunogenitás (antigenitás) - antigén milyen mértékben vált ki immunválaszt - anitgén kémiai szerkezete és molekulasúlya határozza meg - tiszta fehérje Rh antigén a legimmunogénebb, már 1 ml vér is elegendő az immunizáláshoz - cukor tartalmúak immunogenitása kisebb, legkevésbé immunogének a lipid tartalmú antigének - terhességben az antigének megjelenése is fontos tényező
●
Antigén valencia – antigén sűrűség a vvt-n 32
Az antigének eliminációja: ag-at reakció in vivo következményei - Neutralizáló antitestek semlegesítik az Ag-t - Immunkomplexek aktiválják a komplement rendszert, vörösvérsejteket elpusztítják az érpályán belül (intravazális hemolízis)- IgM - Antitestek aktiválják a monocyta/macrophag rendszert (extravazális hemolízis)- IgG - ADCC (antitest dependens celluláris citotoxicitás): az antitestek opszonizálják a sejtet, és aktiválják az Fc receptorral rendelkez citotoxikus sejteket (monocyta/macrophag, granulocyta, NK-sejt). 33
Vércsoport szerológia Az immunológia egyik ága, mely a vércsoport antigénekkel és az általuk kiváltott immunválasz in vivo és in vitro megnyilvánulásaival foglalkozik.
34
Antigén – antitest reakció in vitro
●
Agglutináció !!!
●
Hemolízis
●
Abszorpció
●
Elúció
35
Agglutináció
Agglutináció alatt a korpuszkuláris antigének ellenanyagokkal történő kapcsolódásakor létrejövő összecsapódást értjük. E tekintetben az antigént agglutinogénnek, az ellenanyagot pedig agglutininnek nevezzük.
36
Agglutináció fázisai 1. Specifikus fázis:
2. Aspecifikus fázis:
Ag-At kötődés
Immunkomplexek
kialakulása
összekapcsolódása, térrács kialakulása
37
Komplett és inkomplett hemagglutáció - IgM: ag-at reakció, rácsszerkezet látható agglutináció - IgG:ag-at reakció kialakul, de a szuszpenzió homogén, térrács nem alakul ki, mivel az IgG 2 karja között kicsi a távolság és a térrács kialakulásához 2 különböző epitóphoz kell kapcsolódni Megoldás az AHG!
38
Agglutinációt befolyásoló tényezők ●
Reakcióhő - hideg típusú antitestek (0-4°C) - meleg típusú antitestek (37°C)
●
Reakcióidő - antigén antitest kötődéshez szükséges idő - függ a vércsoporttól, módszertől, vizsgálati technikától
●
Antigén – antitest arány A vizsgálatokban az antitest túlsúly kívánatos
39
Agglutinációt befolyásoló tényezők ●
Közeg - komplett agglutinin – fiz. Só - inkomplett agglutinin - LISS (alacsony ionerejű oldat) - albumin - enzimkezelés (papain, bromelin) - AHG (Coombs)
40
Agglutinációt befolyásoló tényezők ●
Fiziológiás sós közegben az IgM ellenanyagok agglutinálnak
●
Az IgG ellenanyagok kötődnek az antigénhez, de nem agglutinálnak.
●
ABO rendszer és hideg antitest vizsgálat 41
Agglutinációt befolyásoló tényezők LISS= low ionic strengh solution Hatása: •
növeli a sejt felszint (a sejt
megduzzad) •
csökkenti az elektromos
kettős réteget •
közelebb hozza a sejteket
•
szabaddá tesz antigéneket
•
gyorsitja az antitestek
kötődeset 42
Agglutinációt befolyásoló tényezők Proteolitikus enzimek • papain • bromelin Hatás: • csökkentik a felszin negativ töltését • szabaddá tesznek antigéneket (Rh, Kidd) • Elroncsolnak antigéneket (Duffy, MNS) ELLENANYAGSZŰRÉS
43
Agglutinációt befolyásoló tényezők A vizsgált vérminta kora A vvs-ek agglutinabilitása idővel csökken •
a szobahőmérsékleten tárolt vérminta 24
óráig •
hűtőben tárolt nativ vérminta 48-72 óráig
A szerológiai vizsgálatok alapja a megfelelően levett és címkézett vérminta!!! A vizsgált egyén kora, állapota •
Idős korban az agglutinabilitás csökken
•
Bizonyos betegségekben csökken vagy nő 44
Vércsoport szerológia Szerológiai szempontból fontosabb antitestek: ●
IgG, IgM, ritkán IgA
45
Antitestek jellemzői ●
Megjelenés szerint - természetes antitestek - immunantitestek
●
Savóban való jelenlét alapján - reguláris antitestek - irreguláris antitestek
●
Hőoptimum alapján - hideg antitest - meleg antitest 46
DAT ●
Direkt Antiglobulin Teszt – Direkt Coombs – DC
●
Immunantitestek kimutatása sokáig sikertelen volt
●
In vivo, már a szervezetben kialakult antitesttel való fedettség kimutatására szolgál
●
ABO azonos transzfúziók – szövődmény továbbra is
●
Inkomplett antitestek kimutatása Anti-humán-globulinnal!
47
DAT ●
AHG lehet: - polispecifikus – több osztály ellen (anti-IgG és anti-C3D)
- monospecifikus – egy fajta immunglobulin vagy komplement frakció
48
DAT
49
DAT pozitivitás okai ●
Transzfúziós szövődmény (alloantitest) Transzfúzió előtti minta DAT -, utáni pedig DAT++++ - transzfúziós szöv.
●
Terhességi alloimmunizáció Anaemia, sárgaság, magzati elhalás
●
Autoimmun hemolitikus anaemia (autoantitest) Antitest lehet aspecifikus, de gyakori az Rh rendszer elleni antitest
●
Gyógyszer okozta pozitivitás penicillin, fenacetin, cefalosporin, metildopa
●
Passzívan bevitt antitest, aspecifikus reakció 50
IDAT (Indirekt Antiglobulin Teszt) ●
In vitro
●
A savó inkomplett antitestjeinek kimutatása
●
Ellenanyag szűrés és azonosítás
●
Kompatibilitási vizsgálat (keresztpróba)
●
Antigén vizsgálatok (Duffy, Kidd)
51
DAT és IDAT
52
Agglutináció értékelése ●
Pozitív reakció: agglutináció jelenléte, erősségét keresztekkel jelölik (++++ - +) antigén-antitest kötődésre utal
●
●
Negatív reakció: agglutináció hiánya, nincs antigén-antitest kötődés
Kevert mező: - nem csoportazonos vér transzfúzióját követően - hematológiai betegség esetén - chimerizmus
53
Hemolízis ●
●
Az antigén – antitest kötődés olykor hemolízist eredményez, melyet tévedésből negatív reakciónak nézünk. A hemolízis szintén pozitív szerológiai reakció! (körömlakk, "meggyszörp")
●
Hemolítikus vérminta szerológiai vizsgálathoz nem használható!
54
Laboratóriumi metodikák ●
Lemezes módszer - Csempe - Bed side kártya
●
Csöves meghatározás
●
Microplate
●
Gél kártya 55
Laboratóriumi metodikák
56
Laboratóriumi metodikák ●
Bármilyen módszerrel dolgozunk mindig be kell tartani a gyártó utasításait!
●
Használat előtt ellenőrizzük a mintánkat és a használandó reagenseket! (lejárati idő, küllem, megfelelő tárolás)
●
A szerológiában az autokontrollok és a reagens kontrollok használata kötelező!
57
Hibaforrások ●
Technikai hiba – ismétlés
●
Adminisztratív hibák
●
Nem felismert kevert mező, hemolízis
●
Lejárt vagy szennyeződött reagensek
●
Álnegatív reakciók
●
Álpozitív reakciók 58
Kontrollok a szerológiában ●
●
Használatuk biztosítja, hogy a vizsgálatban megjelenő agglutináció vagy annak elmaradása kizárólag antigén – antitest kapcsoltság eredménye. Kontrollok a szerológiában: - agglutinációs vagy autokontroll - reagenskontroll - negatív, illetve pozitív kontroll - különböző quality kontrollok
59
Autoagglutinációs kontrollok ●
Autokontroll alatt a vizsgálni kívánt vörösvérsejt saját savójával adott reakcióját értjük. Használata a fals pozitív eredmény kiszűrését biztosítja.
●
A reakciónak minden esetben negatívnak kell lenni, ellenkező esetben a reagenssel kapott eredmény nem értékelhető.
●
Pozitív az autokontroll, ha: - a vizsgált vvt auto vagy alloantitesttel fedett - a savó sympexis képző tulajdonságú 60
Reagens kontrollok ●
Reagens antitest + adalékok
●
A reagenshez képest a kontroll ugyanolyan összetételű ( kivéve antitest nincs benne)
●
Ált. Antigén kimutatáskor használjuk
●
Reakció esetén az agglutináció nem az antitest és a neki megfelelő antigén kötődésének az eredménye.
●
A vizsgálat nem értékelhető
61
Pozitív - negatív kontroll
●
A szerológiai vizsgálatokban már előzetesen ismert pozitív és negatív tulajdonságú minta alkalmazása
●
Fals eredmények kiszűrése
●
Pl. antigén státusz meghatározásakor
●
Az eredmény akkor elfogadható, ha a pozitív és negatív kontroll is megfelelő eredményt ad
62
Quality kontrollok
●
A laboratórium munkájának minősítő kontroll
●
Lehet belső vagy külső
●
Kiterjedhet készülékre, reagensre, metodikára
63
Sympexis ●
Sympexis – pénztekercs képződés
●
Nem antigén – antitest reakció
●
Fals pozitív eredményt adhat
●
Albumin/globulin arány megváltozik
●
Kóros fehérjék (myeloma, cirrhozis, malignomák)
●
Makromolekulák (dextrán, kontrasztanyag)
●
Fiz. Só hozzáadása és döntögetés
●
Keverni tilos! 64
Köszönöm a figyelmet! 65
