Vaszkularizációt befolyásoló tényezők vizsgálata emberi melanómában Doktori értekezés
Dr. Kiss Judit Semmelweis Egyetem Patológiai tudományok Doktori Iskola Programvezető: Prof. Kopper László
Témavezető: Prof. Tímár József, Országos Onkológiai Intézet Szigorlati bizottság: Prof. Kerényi Tibor Dr. Kiss András PhD Dr. Orosz Zsolt PhD Hivatalos bírálók: Dr. Döme Balázs PhD Dr. Tőkés Anna Mária PhD
Budapest 2007
1 Tartalomjegyzék 1
TARTALOMJEGYZÉK
1
2
BEVEZETÉS
4
A bőr melanómája
4
2.1.1
Etiológia és incidencia Magyarországon
4
2.1.2
A malignus melanóma patológiai típusai
5
2.1.3
A primer daganat lokális terjedése
6
2.1.4
A prognózis megítélése
7
A melanóma-asszociált antigének
7
2.2.1
Tumorspecifikus antigének
8
2.2.2
Melanocita-differenciációs antigének
8
2.2.3
Mutáns vagy kórosan expresszálódó antigének
8
2.1
2.2
2.3
A melanómák immunogenicitása; az infiltráló sejtek és a melanóma kapcsolata
8
2.3.1
T-sejtek
8
2.3.2
Dendritikus sejtek
10
2.3.3
Makrofágok
10
2.3.4
B-sejtek
11
2.3.5
Természetes ölősejtek (NK-sejtek)
12
2.3.6
Hízósejtek
12
2.3.7
Neutrofil granulociták
12
2.3.8
Eozinofil granulociták
13
2.4
A melanóma vaszkularizációja
13
2.5
Immunsejtek és vaszkularizáció
15
2.5.1
T-sejtek
15
2.5.2
Dendritikus sejtek
15
2.5.3
Makrofágok
16
2.5.4
Hízósejtek
16
2.5.5
Neutrofil granulociták
17
Angiogenezisgátlás lehetőségei
17
2.6.1
17
2.6
Angioszuppresszív szerek
1
2.7
2.6.2
Vaszkulárisan célzott szerek
18
2.6.3
Hipoxia elleni szerek
18
2.6.4
Az angiogenezist gátló szerek hatásossága melanómában
18
Hyperforin
19
3
CÉLKITŰZÉSEINK
20
4
ANYAG ÉS MÓDSZER
21
Emberi melanómák mikrovaszkuláris denzitásának és infiltráló sejtjeinek vizsgálata
21
4.1.1
Melanómás betegek
21
4.1.2
Az infiltráló sejtek és az erek immunhisztokémiai kimutatása a
4.1
4.2
5 5.1
melanóma-mintákban
23
4.1.3
Az immunreakció kiértékelése
24
4.1.4
Statisztikai analízis
26
A hyperforin tumor- és endotélsejt-ellenes hatásának vizsgálata
26
4.2.1
Hyperforin és citotoxikus gyógyszerek
26
4.2.2
Sejtvonalak
26
4.2.3
Proliferációs tesztek
27
4.2.4
Az apoptózis fotometriás meghatározása
27
4.2.5
Citotoxicitási teszt
28
4.2.6
In vitro kapillárisképződés vizsgálata
28
4.2.7
A daganat növekedésének in vivo vizsgálata
28
4.2.8
Az apoptózis in vivo detektálása
28
4.2.9
A kapillárisdenzitás in vivo meghatározása a patkányból származó tumorszöveten
29
4.2.10
VEGF meghatározása a sejtkultúra felülúszójában
29
EREDMÉNYEK
30
Emberi melanómák mikrovaszkuláris denzitásának és infiltráló sejtjeinek vizsgálata
30
5.1.1
A makrofág, a T-sejtes és a dendritikus sejtes infiltráció változása a klinikai paraméterekkel
30
5.1.2
A primer melanóma érdenzitása
36
5.1.3
A mikrovaszkuláris denzitás és az immunsejtes infiltrátum kapcsolata
37
2
5.2
6 6.1
A hyperforin tumor- és endotélsejt-ellenes hatásának vizsgálata
39
5.2.1
A hyperforin hatása a daganatsejtekre in vitro
39
5.2.2
A hyperforin daganatellenes hatása in vivo
41
5.2.3
A hyperforin apoptózist indukál a daganatokban in vivo
41
5.2.4
A hyperforin hatása az endotélsejtek proliferációjára
43
5.2.5
A hyperforin hatása az endotélhálóképzésre in vitro
46
5.2.6
A hyperforin gátolja a tumor-indukált angiogenezist in vivo
47
5.2.7
A hyperforin hatása a daganatsejtek VEGF-termelésére
49
DISZKUSSZIÓ
50
Az infiltráló sejtek, a mikrovaszkuláris denzitás és a két paraméter közötti összefüggés vizsgálata emberi melanómában
50
6.1.1
6.2
A makrofág, a T-sejtes és a dendritikus sejtes infiltráció változása a klinikai paraméterekkel
50
6.1.2
A primer melanóma érdenzitása
51
6.1.3
A mikrovaszkuláris denzitás és az immunsejtes infiltrátum kapcsolata
52
A hyperforin melanóma ellenes és angiogenezist gátló hatása
55
7
KÖVETKEZTETÉSEK
60
8
ÖSSZEFOGLALÁS
61
9
SUMMARY
62
10
IRODALOMJEGYZÉK
63
11
A DISSZERTÁCIÓ TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK 81
12
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
82
3
2 Bevezetés 2.1 A bőr melanómája 2.1.1 Etiológia és incidencia Magyarországon A
szervezet
különböző
szöveteiben
jelenlévő
melanociták
malignus
transzformációjának következtében melanóma alakulhat ki. Ez megtörténhet a melanociter névuszon belül vagy attól függetlenül is. A malignizáció egyik oka a bőrt ért intenzív UV-sugárzás. Fokozottan veszélyeztetettek a világos bőrű egyének, akik kevesebb melanin pigmenttel rendelkeznek. Ennek legszélsőségesebb esete az albinizmus, ahol a melanin pigment teljesen hiányzik a tirozináz enzim defektusa miatt. Az akrolentiginózus és mukózális melanómák kialakulásában azonban nem játszik szerepet az UV sugárzás. Ezeknél a típusoknál feltehetően a hipoxia (Bedogni és Powell 2006), szöveti faktorok, a melanin és prekurzor molekulái, vírusok, valamint a melaninhoz kötődő gyógyszerek és toxinok okozzák a malignus transzformációt (Ragnarsson-Olding 2004). Megfigyelték, hogy a diszplasztikus névusz-szindrómában szenvedő betegeknél és a transzplantáción átesettek körében gyakrabban alakul ki melanoma malignum (MM) (Hammer és mtsai 2005, Leveque és mtsai 2000). Xeroderma pigmentózumban a DNS-repair hiánya vezet bazalióma, laphámrák, valamint melanóma kialakulásához (Poblete-Gutierrez és mtsai 2006). Több gén mutációja, deléciója vagy amplifikációja is előfordulhat melanómában: INK4a/p16 (Castellano és Parmiani 1999), CDK4, MLM, NF1, β-CAT, N-ras (Fujita és mtsai 1999), Ki-ras, p53 (Ragnarsson-Olding 2004), c-myc (Glatz-Krieger és mtsai 2006), BRAF kináz és c-kit (Willmore-Payne és mtsai 2005), MCR1 (Fargnoli és mtsai 2006). A familiárisan kialakuló melanómák esetében az INK4a/p16 (Castellano és Parmiani 1999) és a CDK4 (Fujita és mtsai 1999) gén hibáját, valamint az MCR1 gén specifikus variánsait (Fargnoli és mtsai 2006) írták le. A melanóma különböző patológiai típusainak eltérő klinikai viselkedését valamint a betegenként különböző kórlefolyást is részben a megjelenő génhibák heterogenitása okozza (Glatz-Krieger és mtsai 2006). Magyarországon
a
melanómás
megbetegedések
incidenciája
fokozatosan
emelkedik. Míg 2001-ben a Nemzeti Rákregiszternek bejelentett melanómás esetek 4
száma 1553 volt, ez a szám 2004-re 1939-re emelkedett (Otto és Kásler 2005). Ezek az adatok is a prevenció valamint a kutatás fontosságát emelik ki.
2.1.2 A malignus melanóma patológiai típusai
Szuperficiálisan terjedő melanóma Kezdetben rendszerint 8-10 mm átmérőjű, élesen határolt, kerek vagy ovális, enyhén kiemelkedő szélű, de egyébként egészében felszínes folyamat látható. A tumor először horizontálisan növekszik (horizontális növekedési fázis), és később körülírtan papula, csomó jelenik meg a vertikális növekedés (vertikális növekedési fázis) eredményeképpen. A kután melanómák 50%-a tartozik ebbe a típusba (Dobozy és mtsai 1998). Noduláris melanóma A bőrnívóból kiemelkedik. A folyamat általában gyors és az anamnézis emiatt rövid. A tumor mindig élesen elkülönül a környezetétől és rendszerint nincs regressziós jel. A malignus melanómák kb. 20-30%-a ilyen típusú (Dobozy és mtsai 1998). Lentigo maligna melanóma Elsősorban idős nőbetegeken jelenik meg lentigo maligna talaján. A leggyakoribb előfordulás az arc, ahol a különböző színű, több cm átmérőjű, éles szélű foltban egy kis fekete csomó vagy infiltráció alakulhat ki. A prognózis nem kedvező. A folyamat horizontális terjedést mutat kezdetben, majd a vertikális növekedési fázis során a mélybe terjed, időnként az idegek lefutását követve. A melanómák kb. 10%-a sorolható ebbe a csoportba (Dobozy és mtsai 1998). Mukózális lentiginózus melanóma Az erősebben pigmentált egyének nyálkahártyáján gyakrabban fordul elő. Prognózisa igen rossz, mivel felfedezéskor már sokszor előrehaladt a folyamat. Különösen az anorectalis nyálkahártyán megjelenő melanóma ad hamar és több irányba áttétet. A melanómák kb. 5%-a alakul ki a nyálkahártyán (Dobozy és mtsai 1998).
5
Akrolentiginózus melanóma Tenyéren, talpon, kéz- és lábujjon, klinikailag lentigo maligna-szerű folyamatból indul ki. Előfordulhat a periungualis vagy subungualis területen a körömlemez destrukcióját, hiperpigmentációját okozva. Viszonylag gyors a mélybe való terjedése. Ez a forma kb. 4%-ban fordul elő. Gyakoribb a sötét bőrű egyének között (Dobozy és mtsai 1998). Dezmoplasztikus és neurotróp melanóma Főleg a fej-nyaki régióban helyezkedik el. Jellemző rá a mély invázió, a gyakori lokális recidíva és a neurotropizmus. Ezek a melanómák többnyire amelanotikusak. Szövettani differenciáldiagnózisukat elősegíti S-100β-pozitivitásuk. A desmoplasticus melanómák 50%-ában nincs epidermális komponens. A melanómák kb. 1%-a tartozik ebbe a csoportba (DeVita és mtsai 1997).
2.1.3 A primer daganat lokális terjedése Növekedési és progressziós sajátosságai alapján a horizontális és vertikális fázist lehet elkülöníteni: A horizontális növekedési fázis A melanómasejtek az elváltozás perifériáján szaporodnak, tehát horizontálisan terjed a daganat. Az epidermisben a daganatsejtek elszórtan, az epidermis-dermis határon kis sejtfészkekbe rendeződve helyezkednek el. Fontos kiemelni, hogy ebben a fázisban a melanómák ritkán adnak metasztázist (DeVita és mtsai 1997). A vertikális növekedési fázis A daganat néhány pontján fokális mitotikus aktivitás figyelhető meg. Ennek következtében a metasztatikus csomókhoz hasonló nodulusok figyelhetők meg, melyek a dermis mélyebb rétegei felé növekednek. Ezek a sejtek általában agresszívebben osztódnak, mint a radiális növekedési fázis melanocitái (DeVita és mtsai 1997).
6
2.1.4 A prognózis megítélése A melanómák prognózisának megítélésében a bőr szemcsés sejtes rétegétől a tumor alapjáig mért legnagyobb tumorvastagságnak van nagy jelentősége. Az 1,00 mmes vagy ennél vékonyabb melanómákban a metasztázis kialakulásának valószínűsége kicsiny (88%-os 10 éves túlélés), míg a 4 mm vagy ennél vastagabb tumor esetében erre az esély kifejezetten nagy (54%-os 10 éves túlélés). Ulceráció esetén az említett 10 éves túlélési százalékok rosszabbak: 83% ill. 32% (Balch és mtsai 2001). A melanóma akkor a legjobb prognózisú, ha a végtagokra lokalizálódik. Kivételt képeznek a talpon elhelyezkedő és a subungualis melanómák. Rosszabb az 5 éves túlélés a törzsi és feji lokalizáció esetében (Dobozy és mtsai 1998). A nemi eltérés vonatkozásában fontos kiemelni, hogy a nőknek nagyobb a túlélési esélyük a férfiakhoz viszonyítva. Ez kapcsolatban áll azzal a ténnyel is, hogy a férfi betegeknél nagyobb százalékban fordul elő a prognosztikailag hátrányosabb lokalizációjú törzsi melanóma, valamint a nők melanómája általában vékonyabb a kezelésbevétel idején (Kemény és mtsai 1998). A melanóma eltérő kórlefolyását a melanómasejtekben is kimutatott ösztrogén receptor β, progeszteron receptor vagy androgén receptor által közvetített hormonhatás is magyarázhatja (Kanda és Watanabe 2001). A melanómában gyakran megfigyelhető regresszió megítélése ellentmondásos (Prehn 1996, Ronan és mtsai 1987). A primer tumor mellett kialakult progresszió alapjául azok a sejtek szolgálnak, melyek megmenekülnek a tumorpusztító immunológiai mechanizmusoktól. A regressziós területeken a melanómasejteket élesen körülhatárolt limfocitacsík övezi. Ezen a területen fokális melanómasejt-hiány keletkezik, és helyettük a pigmentet tartalmazó fagociták tűnnek fel. A gyulladásos folyamat csökkenésével a limfocitás infiltrátum helyét fibrotikus szövet foglalja el erekkel, melanofágokkal (Barnhill és Levy 1993).
2.2 A melanóma-asszociált antigének Számos olyan melanóma-asszociált antigént leírtak, melyek MHC I ill. II molekulákon történő prezentálás után CD8+ ill. CD4+ tumorinfiltráló limfocitákat stimulálva citolízist vagy tumorspecifikus citokintermelést idézhetnek elő. Ezen 7
antigének T-sejt-determináns peptidjeinek megismerése új immunterápiai stratégiák alkalmazására nyújt eddig nem remélt lehetőségeket. Az eddig megismert antigének három fő csoportba sorolhatók:
2.2.1 Tumorspecifikus antigének MAGE-1, 2, 3; BAGE, GAGE-1, PRAME, NY-ESO-1 Ezek az antigének számos daganatban, valamint a testisben és a placentában expresszálódnak.
Alacsony
immunogenitásuk
valószínűleg
stabil
másodlagos
fehérjestruktúrájuknak köszönhető, ugyanis ha az antigénfeldolgozás során nem történik meg a fehérje hasítása, az MHC I molekulák nem tudják az antigént tálalni a citotoxikus T-limfociták számára (Kirkin és mtsai 1998).
2.2.2 Melanocita-differenciációs antigének gp100, MelanA/MART-1, tirozináz, TRP-1/gp75, TRP-2 Ezek az antigének a melanómasejteken kívül a melanocitákban is megtalálhatók kisebb mennyiségben. Mivel ezek melanoszómális, „saját” fehérjék, immuntolerancia alakulhat ki velük szemben (Kirkin és mtsai 1998).
2.2.3 Mutáns vagy kórosan expresszálódó antigének MUM-1, β-katenin, p15, CDK 4, gp100-in4, N-acetilglükózaminiltranszferáz V Ezen gének mutációja vagy kóros expressziója egyrészt funkcióváltozást hoz létre a melanómasejtekben, másrészt viszont a tumorsejtek immunogenitását növelheti (Kirkin és mtsai 1998).
2.3 A melanómák immunogenicitása; az infiltráló sejtek és a melanóma kapcsolata 2.3.1 T-sejtek A melanóma egyike a dokumentálhatóan immunogén emberi daganatoknak. Autológ tumorsejtek elpusztítására képes, specifikus CD8+ és tumorspecifikus CD4+ sejtek izolálhatók melanómákat infiltráló limfocitákból (Pisarra és mtsai 1999). Mind a CD8+-, mind pedig a CD4+ limfociták aktiválása legalább két szignált igényel: az 8
antigénprezentáló sejtek MHC molekulái által prezentált antigénpeptid kölcsönhatását a T-sejt antigénspecifikus receptorával, valamint egy ún. kostimulációs szignált, melyet a kostimulációs molekuláknak a T-sejtek felszínén található receptorokhoz való kapcsolódása hoz létre. Az aktiváció után a citotoxikus T-sejtek elpusztítják a daganatsejteket, a helper T-sejtek pedig citokinek termelésével, illetve CD40L-CD40 interakción keresztül segítik elő a hatékony tumorellenes immunválasz kialakulását (Straten és mtsai 1999). Ez a T-sejtes immunválasz azonban többnyire nem képes megfékezni a daganatok
növekedését. Számos mechanizmust leírtak, melyek
magyarázatul szolgálhatnak: a melanóma-asszociált antigének vagy az MHC I molekulák down-regulációja a daganatsejtek felszínén; az antigénpeptidek nem elégséges prezentációja; a kostimuláció hiánya; a daganat mikrokörnyezetében termelődött immunszuppresszív citokinek (Marincola és mtsai 2000). A melanómasejtek képesek a daganatellenes T-sejtekben klonális anergiát indukálni in vitro és in vivo (Becker és mtsai 1993, Lee és mtsai 1999). Számos közlemény látott napvilágot, melyek a jelentős T-sejtes infiltrációt melanómában kedvező prognózissal hozták összefüggésbe (Clark és mtsai 1989, Clemente és mtsai 1996, Sondergaard és Schou 1985), de akadtak olyanok is, melyek nem találtak szignifikáns összefüggést a betegek túlélésével (Barnhill és mtsai 1996, Larsen és Grude 1979, Thorn és mtsai 1994). Munkacsoportunk megfigyelései szerint a CD3+ és CD8+ sejtek denzitása a tumorvastagsággal nem változott szignifikánsan sem intratumorálisan, sem pedig peritumorálisan. A melanóma vastagságával párhuzamosan viszont csökkenő tendenciát mutatott a CD25+ és az intratumorális OX40+ aktivált T-sejtek száma. A szervi áttétet adó melanómák csoportjában kevesebb peritumorális CD3+ és CD8+ T-sejt (határérték szignifikancia) és szignifikánsan alacsonyabb számú peritumorális CD25+ és OX40+ Tsejt volt kimutatható, mint az áttétet nem adó, illetve csak nyirokcsomó-metasztázist adó melanómák körében. Ugyanakkor összefüggés volt kimutatható az aktivált T-sejtek magas peritumorális denzitása és a betegek hosszabb túlélése között (Ladányi és mtsai 2004).
9
2.3.2 Dendritikus sejtek A dendritikus sejtek a hemopoietikus őssejtekből származnak, és differenciálódás után antigént prezentálnak felszínükön MHC-molekulához kötötten a T-sejtek számára. A dendritikus sejtek megtalálhatók mind a limfoid, mind pedig az extralimfatikus szervekben (Wright-Browne és mtsai 1997). A Langerhans-sejtek az epidermis mieloid eredetű dendritikus sejtjei. Intracitoplazmatikus organellumai, a Birbeck-granulumok és a CD1a, Langerin és E-kadherin expressziója jellemzi őket. Kiemelkedő szerepük van a hám és a nyálkahártya immunvédekezésében. Az ugyancsak mieloid prekurzorokból származó intersticiális dendritikus sejtek XIIIa faktor-, CD1b-, CD1c- és részben CD1apozitívak (Udey 2004). A plazmacitoid dendritikus sejtek limfoid eredetűek (Shortman és Liu 2002, Vandenabeele és Wu 1999); IL-3Rα-t (CD123) és BDCA-2-t (CD303) expresszálnak, és vírusinfekció hatására I-es típusú interferont szekretálnak (Facchetti és mtsai 2003, Siegal és mtsai 1999). A dendritikus sejtek képesek a daganat-asszociált antigének felvételére, processzálására és prezentációjára. Ezek a tumort infiltráló dendritikus sejtek azonban gyakran nem hordozzák felszínükön a kostimulációs molekulákat és nem képesek a Tsejtek hatékony stimulációjára (Chaux és mtsai 1996, Enk és mtsai 1997). A daganatszövet által termelt vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF), interleukin-10 (IL-10) és transzformáló növekedési faktor-β (TGF-β) megakadályozhatja a dendritikus sejtek érését és apoptózisukat indukálhatja (Esche és mtsai 1999, Gabrilovich és mtsai 1996, Geissmann és mtsai 1999, Steinbrink és mtsai 1999). Több tanulmány is leírta azt a megfigyelést, hogy az epidermisben és dermisben lévő Langerhans-sejtek denzitása csökken a melanóma progressziója során; azonban ennek prognosztikus jelentőségével nem foglalkoztak (Bröcker és mtsai 1988, Stene és mtsai 1988, Toriyama és mtsai 1993).
2.3.3 Makrofágok A daganatok számos olyan citokint és kemokint termelnek, melyek a mikrokörnyezetükbe “csalogatják” a makrofágokat. Ilyen funkciója van a monocitakemotaktikus protein-1-nek (MCP-1), monocita-kolóniastimuláló faktornak (M-CSF) és a VEGF-nek. Az egészséges vagy gyulladásos szövetekben lévő makrofágokkal szemben a
10
tumor-asszociált makrofágok azonban csökkent daganatsejt-ellenes citotoxikus hatással, eltérő citokintermeléssel, elégtelen antigénprezentáló képességgel és – prosztaglandin E2 (PGE2) termelésük révén – a helper T-sejteket gátló hatással rendelkeznek. Ezt a jelenséget a daganatsejtek IL-4-, IL-6-, IL-10-, TGF-β1- és PGE2-termelésével magyarázzák (Bingle és mtsai 2002, Elgert és mtsai 1998). Továbbá a makrofágok képesek proteázok, növekedési faktorok (pl. epidermális növekedési faktor (EGF), vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF), bázikus fibroblaszt-növekedési faktor (bFGF)) valamint angiogén citokinek (pl. bFGF, VEGF, IL-1, IL-8) szekréciójára is (Mantovani és mtsai 1992, Sunderkötter és mtsai 1994). A makrofágok prognosztikus szerepével melanóma esetében kevés tanulmány foglalkozott. Torisu és mtsai a primer melanóma vastagságának növekedésével párhuzamosan a makrofágdenzitás emelkedését tapasztalták (Torisu és mtsai 2000). Egy másik kutatócsoport rövidebb túlélést észlelt a fokozott makrofáginfiltrációt mutató uveális melanómák csoportjában (Makitie és mtsai 2001).
2.3.4 B-sejtek A B-sejteknek a melanóma elleni immunválaszban játszott szerepéről kevés ismeret áll rendelkezésünkre, mivel a melanómák B-sejtes infiltrációja igen heterogén. A tumorok egy részében azonban jelentős B-sejtes ill. plazmasejtes infiltráció figyelhető meg, és ezt összefüggésbe hozták a nyirokcsomó-metasztázisok kialakulásával (Aklilu és mtsai 2004). Egy másik munkacsoport is kedvezőtlenebb prognózisúnak találta a sűrű peritumorális plazamasejtes infiltrációval rendelkező melanómákat (Hornstein és Weidner 1972). Ellenanyag-termelésük és antigénprezentáló képességük révén elvileg részt vehetnek a daganatellenes immunválaszban, viszont leírták T-sejt-toleranciát indukáló hatásukat is a CD40 szignál elmaradásakor (Buhlmann és mtsai 1995). Inoue és mtsai hatékonyabb melanómasejt-eliminációt észleltek azoknál az egereknél, melyek nem rendelkeztek B-sejttel. Ezt az IL-10-termelés csökkenésével magyarázták (Inoue és mtsai 2006). Egy klinikai vizsgálat során 6 melanómás betegnél rituximabbal (anti-CD20) depletálták a keringő B-sejteket, azonban nem észleltek objektív javulást (Aklilu és mtsai 2004).
11
2.3.5 Természetes ölősejtek (NK-sejtek) A primer kután melanómák NK-sejt-infiltrációjával foglalkozó vizsgálattal nem találkoztam az irodalom áttekintése során. Csupán egy kutatócsoport foglalkozott az okuláris melanómák NK-sejt-denzitásával; ők csekély NK-sejtes infiltrációról számoltak be, és ennek prognosztikus relevanciáját nem vizsgálták (Tobal és mtsai 1993). Az NKsejtek perforin- illetve halálreceptor-közvetített citotoxicitással lennének képesek a daganatsejtek elpusztítására (Smyth és mtsai 2002). Az utóbbi időben kimutatták, hogy a dendritikus sejtek aktiválására is képesek, és ezáltal erősítik a T-sejtes daganatellenes immunválaszt (Kalinski és mtsai 2005). Az NK-sejtek működését a tumorsejtek és a makrofágok által termelt immunszuppresszív citokinek (pl. TGF-β) gátolhatják (Aso és mtsai 1992, Bellone és mtsai 1995).
2.3.6 Hízósejtek A hízósejtek a természetes és az adaptív immunválaszban egyaránt részt vesznek, továbbá az allergiás reakciók fő effektor sejtjei. Több vizsgálat is kimutatta, hogy kután melanómában a hízósejtdenzitás magasabb, mint naevusban (Schadendorf és mtsai 1995, Tóth-Jakatics és mtsai 2000). A fokozott hízósejtes infiltráció negatív prognosztikus jelentőségét is leírták melanómában (Ribatti és mtsai 2003, Tóth-Jakatics és mtsai 2000); ugyanakkor egy másik kutatócsoport nem talált összefüggést a hízósejtdenzitás és a metasztázisok kialakulása között (Schadendorf és mtsai 1995).
2.3.7 Neutrofil granulociták A neutrofil granulociták többféle mechanizmussal is elősegíthetik a daganat ellenes immunválasz kialakulását: az aktivált neutrofilek a tumorsejteket reaktív oxigén gyökök felszabadításával destruálhatják; a felszabaduló daganatsejtantigéneket a dendritikus sejtek fagocitálni tudják; valamint gyulladásos citokinek és kemokinek termelésével stimulálhatják a többi immunsejtet. A GM-CSF és a TNF-α stimulálja a neutrofilek fagocitózisát és degranulációját (Dissemond és mtsai 2003). GM-CSF alapú melanóma ellenes immunterápiás protokollok jelenleg is folynak (Elias és mtsai 2005). Ugyanakkor kimutatták, hogy a melanómasejtek nagy mennyiségű IL-8-at termelnek (Singh és mtsai 1994), és ez a citokin a neutrofil granulocitákat a tumor 12
környezetébe vonzza (De Larco és mtsai 2004). A neutrofilek MMP-9-et, heparanázt, szulfatázt szekretálnak, és ezáltal az extracelluláris márixot (ECM) hidrolizálni képesek, elősegítve a daganatsejtek terjedését. A folyamat során növekedési faktorok szabadulnak fel, mely támogatja a tumor növekedést. A neutrofilek által termelt reaktív oxigén gyökök, különösen a hidroklórsav (HOCl) aktiválni képes az MMP-2-t, az MMP-7-et, az MMP-8-at és az MMP-9-et; növeli a daganatsejtekben a mutációs rátát; valamint NF-κB aktiváción keresztül antiapoptotikus faktorok (Bcl-2 és Bcl-xL) transzkripcióját indukálja (De Larco és mtsai 2004). Az ulceráció negatív prognosztikus jelentősége ismert primer melanómában (Grande Sarpa és mtsai 2006). A nekrózis területén nagy mennyiségű neutrofil granulocita is megtalálható, melyek a fent említett mechanizmusokkal elősegíthetik a tumor progresszióját (Van Coillie és mtsai 2001).
2.3.8 Eozinofil granulociták Az eozinofil granulociták citotoxikus anyagok termelésével – pl. fő bázikus protein (MBP), tumor nekrózis faktor-α (TNF-α), TGF-β -, valamint más effektor sejtek aktiválásával járulhatnak hozzá a daganatok elleni védekezéshez. Egér B16-F10 melanómasejtek sc. adását követően a daganat korai eozinofil sejtes infiltrációját figyelték meg egérben, különösen a nekrotikus területeken (Cormier és mtsai 2006). Rekombináns humán granulocita-makrofág-kolóniastimuláló faktor- (GM-CSF) terápiát követően a szérum eozinofil granulocita-szintjének emelkedését írták le (Murray és mtsai 1996).
2.4 A melanóma vaszkularizációja A daganatok erezettsége meghatározó szerepet tölt be a tumornövekedésben, invázióban és metasztázisképzésben. A daganatok vérellátásának hatféle mechanizmusát ismerjük. A tumor-indukált neoangiogenezis során a daganat normális szöveti kapillárisok
stimulálása
révén
új
kapillárisnövedékeket
indukál,
melyek
a
daganatszövetbe növekedve létrehozzák a daganatot ellátó ereket. Az angiogén stimulust a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) mellett a transzformáló növekedési faktor-β (TGF-β), a tumor nekrózis faktor-α (TNF-α), a bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bFGF), és a trombocita eredetű növekedési faktor (PDGF) biztosítja ebben az 13
esetben. A posztnatális vaszkulogenezis folyamán a daganatok VEGF és stróma eredetű faktor (SDF) segítségével mobilizálják a csontvelői endotél-progenitorsejteket. Ezek az éretlen endotélsejtek a daganatban lévő mikrokapillárisokba épülnek be (Döme és mtsai 2007). Az utóbbi időben fedezték fel, hogy a CD11c+ dendritikus sejtek, a TIE-2+ monociták, +
a +
CD45+/VEGFR2+ +
tumor-asszociált
strómasejtek
valamint
a
+
CD45 /CD11b /CXCR4 / VEGFR1 keringő hemopoietikus sejtek is képesek a tumor mikroérhálózatába beépülni (Bertolini és mtsai 2006).
Az érinkorporáció során a
daganat bekebelezi a meglévő kiérett kapillárisokat. Ebben a modellben a döntő citokin nem a VEGF, hanem az erek túlélését elősegítő angiopoietin1 (ANG1). Az intusszuszceptív mikrovaszkuláris növekedés azt a mechanizmust takarja, amely esetében a hálózat kialakulása új kötőszöveti lemezek közbeiktatása révén jön létre az erek lumenében. Itt a vezető citokinek a PDGF, az angiopoetinek, a TGF-β és az ephrinek. A glomeruloid angiogenezis során érgomolyagok jönnek létre, melyek körül különböző vastagságú bazális membránt és csekély pericitaborítást lehet kimutatni. A vaszkuláris mimikri azt jelenti, hogy a daganatban tumorsejt által határolt csatornák keletkeznek, melyek kapcsolatban állnak a kapillárisokkal. Ilyenkor a daganatsejtek endotél karaktert vesznek fel endoteliális gének expressziója által (Döme és mtsai 2007). Munkacsoportunk
megfigyelése
szerint
a
melanóma
peritumorális
neoangiogenezist indukál, de ezek az erek nem nőnek be a tumorszövetbe, hanem ahogy a daganat növekszik, inkorporálja az erek egy részét a tumor körüli érhálózatból. A tumor mikrokörnyezetében intratumorálisan azonban csupán a kapillárisok egy része marad életképes (Döme és mtsai 2002). A melanómasejtek ugyanakkor vaszkuláris mimikrire is képesek (Döme és mtsai 2007), valamint a glomeruloid mikrovaszkuláris proliferációt is leírták melanómában (Straume és Akslen 2003). A mikrovaszkuláris denzitás (MVD) és a prognózis összefüggését illetően az irodalmi adatok igen ellentmondásosak. Számos kutatócsoport a rosszabb prognózis előjelének találta a primer kután melanómák erősebb vaszkularizációját (Depasquale és Thompson 2005, Kashani-Sabet és mtsai 2002, Marcoval és mtsai 1997, Straume és mtsai 1999). Mások viszont nem találtak összefüggést a fenti két tényező között, sőt voltak akik a vaszkularizáció pozitív prognosztikus szerepéről is beszámoltak (Busam és mtsai 1995, Ilmonen és mtsai 1999). Dadras és mtsai – LYVE-1 (specifikus nyirokér marker) és 14
CD31 (nyirok- és vérér marker) kettős jelölést használva – kimutatták, hogy az korai nyirokcsomó áttétet adó primer melanómák szignifikánsan több és nagyobb nyirokereket tartalmaznak intratumorálisan és peritumorálisan, mint a nem metasztatizálók. A vérerek denzitásában viszont nem találtak különbséget a két csoport között. Továbbá megállapították, hogy a magas intratumorális nyirokérdenzitás rövidebb betegségmentes túléléssel járt együtt (Dadras és mtsai 2003). Ezzel szemben Straume és mtsai 175 melanómás beteg szövetmintáját LYVE-1 ellenes markerrel megvizsgálva azt tapasztalták, hogy az emelkedett nyirokérdenzitás hosszabb túléléssel függött össze (Straume és mtsai 2003).
2.5 Immunsejtek és vaszkularizáció Az angiogenezis folymatát a daganat- és strómasejtek által termelt angiogén (pl. VEGF, bFGF, PDGF) és anti-angiogén (pl. angiostatin, endostatin, IFNγ) citokinek aránya szabályozza. A tumor vaszkularizációjának kialakításában feltehetően szerepet játszik a malignus sejtek és az infiltráló sejtek közötti interakció is. Mivel a tumort infiltráló sejtek többsége a keringésből származik, lehetséges hogy a peri- és az intratumorális erek denzitása összefügg a melanómát infiltráló sejtekkel. Mivel a strómasejtek számos angiogén faktort termelnek, még inkább elképzelhető ez a feltevés.
2.5.1 T-sejtek Gyakran a T-sejtek képezik a melanómát infiltráló immunsejtek többségét. Qin és mtsai leírták, hogy egérmodellben a CD8+ T-sejtek által termelt interferon-γ (IFN-γ) a tumor angiogenezisét gátolja (Qin és mtsai 2003). Ugyanakkor mások beszámolnak a tumorinfiltráló T-sejtek VEGF- és mátrix metalloproteináz-9- (MMP-9) termeléséről is (Owen és mtsai 2003). Továbbá a normál T-sejtek MMP-9 termelése VEGF hatására fokozódik (Owen és mtsai 2003). A daganatsejtek felhasználhatják a limfociták által szekretált proteázokat és angiogén faktorokat az extracelluláris mátrix lebontásához, az érképzéshez továbbá az áttétképzéshez.
2.5.2 Dendritikus sejtek Az utóbbi időben számos tanulmány utalt arra, hogy a VEGF gátolja a dendritikus sejtek érését és funkcióját a nukleáris faktor- κB (NF-κB) aktiváció gátlásával; valamint a 15
VEGF-expresszió fordítottan aránylott a dendritikus sejtek denzitásával számos daganattípusban (Gabrilovich és mtsai 1996, Inoshima és mtsai 2002, Saito és mtsai 1998). Dikov és mtsainak vizsgálatai szerint a dendritikus sejtek érésének gátlása VEGFR1-en keresztül valósul meg (Dikov és mtsai2005). Feltehetően tehát a VEGF nem csak az angiogenezist segíti elő, hanem a helyi immunválaszt is gátolja. Ováriumkarcinómában leírták, hogy a plazmocitoid dendritikus sejtek in vivo a daganat angiogenezisét elősegítő TNF-α és IL-8 termelésére képesek, míg a myeloid dendritikus sejtek IL-12 szekretálásával az érképződést gátolják (Curiel és mtsai 2004). Ugyanakkor beszámoltak arról is, hogy a CD11c+ myeloid prekurzor dendritikus sejtek endoteliális- valamint dendritikussejt-markerek expressziójára is képesek, és összekapcsolódva ereket tudnak létrehozni (Coukos és mtsai 2005). Conejo-Garcia és mtsai írták le ennek a folyamatnak a szabályozását: a prekurzor dendritikus sejteket βdefenzinek vonzzák a tumor területére, majd ezek a sejtek VEGF-A hatására endoteliális géneket expresszálnak, és beépülnek a tumor érhálózatába. Ebben az esetben a VEGF-A a VEGFR2-höz kötődik (Conejo-Garcia és mtsai 2004).
2.5.3 Makrofágok A melanómát infiltráló makrofágok számos angiogén citokin termelésére képesek, beleértve a VEGF-et, a bFGF-et, a TGF-α-t, vérlemezke eredetű endotélsejt-növekedési faktor/timidin foszforilázt (PDECGF/TP) és az IL-8-at (Koch és mtsai 1992, Madtes és mtsai 1988, Sunderkötter és mtsai 1994). A makrofágok az extracelluláris mátrix átalakítására is képesek lebontó enzimek termelése által (Ono és mtsai 1999). A makrofágok TNF-α és IL-1α szekretálásával is hozzájárulhatnak a melanóma vaszkularizációjához (Torisu és mtsai 2000). Számos daganattípusban összefüggést mutattak ki az MVD és a makrofáginfiltráció között (Hanada és mtsai 2000, Leek és mtsai 1996, Peng és mtsai 2005, Torisu és mtsai 2000). Ugyanakkor mások ezt a kapcsolatot nem igazolták (Davidson és mtsai 1999, Lackner és mtsai 2004, Varney és mtsai 2005).
2.5.4 Hízósejtek A hízósejteknek az angiogenezisben betöltött szerepére utal melanómában, hogy összefüggést találtak az MVD és a VEGF-pozitív hízósejtek sűrűsége között. A vizsgálat 16
szerint az áttétet képző melanómák csoportjában mind a masztocitadenzitás, mind pedig az MVD szignifikánsan magasabb volt, mint az áttétet nem képező daganatok körében (Tóth-Jakatics és mtsai 2000). A hízósejtek száma és az MVD közötti korrelációt hepatocelluláris karcinóma, veserák és tüdődaganat esetén is kimutatták (Müller és mtsai 1998, Tomita és mtsai 2000, Tuna és mtsai 2006).
2.5.5 Neutrofil granulociták Mivel a melanómák nagy mennyiségű granulocita kemotaktikus protein-2-t (GCP-2) és IL-8-at termelnek, sok tumor-asszociált neutrofilt tartalmaznak (Singh és mtsai 1994, Van Coillie és mtsai 2001). A neutrofil granulociták az ECM hidrolízise által lehetővé teszik az endotél sejtek migrációját, valamint bFGF felszabadításával a tumor vaszkularizációt is elősegítik (De Larco és mtsai 2004).
2.6 Angiogenezisgátlás lehetőségei 2.6.1 Angioszuppresszív szerek 8 csoportja létezik: az első az endoteliális mitogének (VEGF, bFGF) termelődését gátló szerek csoportja (pl. interferon, IL-12); a második a VEGF inhibitorai (bevacizumab); a harmadik csoportba az egyéb mitogéninhibitorok tartoznak (pl. angiosztatin, endosztatin, thalidomid); a negyedik csoport az endoteliális mitogének receptorainak gátlói (pl. a VEGFR2 gátló IMC-ICII); az ötödik csoportba az endotélsejtek VEGF-receptor-kináz gátlói tartoznak (pl. sorafenib, sunitinib); a hatodik csoport tagjai az endoteliális adhéziós receptorokat (integrin) gátolják (pl. Vitaxin, TNF); a hetedik csoportot az MMP-inhibitorok alkotják (pl. Neovastat, marimastat) (Döme és mtsai 2007). A nyolcadik csoportot a ciklooxigenáz-2 (COX-2) inhibitorok (pl. celecoxib) alkotják. A COX-2 gátlók angiogenezist gátló hatása igen összetett, mivel azon túl, hogy a COX-2, a VEGF, a bFGF és az Ang-2 szintjét csökkenti a tumorsejtekben és endotélsejtekben (Zuo és mtsai 2006), a daganat ereinek CXCR4- és PDGFRβ expresszióját is szabályozza (Lee és mtsai 2006). Továbbá a csökkent PGE2 termelés következtében a COX-2 inhibitorok a Bcl-2 szabályozáson keresztül az endotél és tumorsejtek apoptózisát is okozhatják (Klenke és mtsai 2006).
17
2.6.2 Vaszkulárisan célzott szerek Az érhálózatot megbontó anyagoknak három csoportja ismert: az első csoportba az éradhéziós molekulák elleni antitestek tartoznak (pl. Anti-VCAM-1-TF); a második csoportot az endotél-specifikus ligand-blokkolók alkotják (pl. VEGF-DT); a harmadik csoportban pedig a kis molekulatömegű gátlószerek találhatók (pl. CA4P), melyek a tubulint, az endotélsejtek citoszkeletonját célozzák meg (Döme és mtsai 2007).
2.6.3 Hipoxia elleni szerek Ezek kifejlesztésének elvi alapja az volt, hogy a daganatok angiogén fenotípusának kialakulásában jelentős szerepe van a daganatban kialakuló hipoxiának (Le és mtsai 2004). Három nagy csoportjuk van: az egyik a (hipoxia-indukált faktor) HIF1 elleni szerek (pl. rapamycin); a második csoportot az anémia ellenes szerek alkotják (pl. erythropoietin); a harmadik csoport különböző támadáspontú, indirekten ható szereket tartalmaz (pl. 2-metoxiösztradiol, topotecan) (Döme és mtsai 2007).
2.6.4 Az angiogenezist gátló szerek hatásossága melanómában A TNF izolált végtagperfúzióban adva, különösen melfalánnal kombinálva, megnöveli az érendotélium permeabilitását az αvβ3 integrin gátlásával, majd szelektíven elpusztítja az angiogén endotélsejteket. Ez igen hatásos (80-90%-os az objektív válaszráta melfalánnal együtt adva), azonban nagy kockázata van a szöveti nekrózisnak (Lejeune és mtsai 2006). Mivel melanómában az érinkorporáció központi jelentőségű a tumor vérellátásában, a meglévő erek endotéljének megbontása valóban ésszerű targetnek tűnik. Intratumorálisan adott, IL-12-t kódoló plazmid DNS adását követően a melanómás betegek harmadánál (9-ből 3 esetben) tapasztaltak klinikai választ. A melanómák immunhisztokémiai vizsgálata ezeknél az eseteknél a vaszkularizáció és a limfocita infiltráció csökkenését mutatta (Heinzerling és mtsai 2005). A többi klinikailag kipróbált angiogenezist gátló szer (thalidomid, semaxanib, sorafenib, marimastat, topotecan, Vitaxin ) melanómában sajnos nem váltotta be a hozzá fűzött reményeket (Eisen és mtsai 2006, Kraut és mtsai 1997, Kuenen és mtsai 2003, Quirt és mtsai 2002, Reiriz és mtsai 2004, Tucker 2006). Semaxanib és thalidomid kombinált adásakor is csak a betegek 20%-a javult a kezelés hatására, további 40%-uk pedig 2-10 hónapig nem progrediált (Mita és mtsai 2007). 18
2.7 Hyperforin Az orbáncfű (Hypericum perforatum) a hypericaceae növény család tagja. A népi gyógyászatban gyakran használják az orbáncfű olajos kivonatát égések és bőrsérülések gyógyítására (Roth 1990). Az utóbbi időben enyhe- és középsúlyos depresszió kezelésére is alkalmazzák neurotranszmitter reuptake-inhibitor hatása miatt (Müller és mtsai 1998). Az orbáncfű egyik aktív hatóanyaga a hyperforin (Bystrov és mtsai 1975). A hyperforin egy acilfloroglucinol típusú vegyület, mely lipofil, izoprén láncokkal szubsztituált floroglucinol vázból áll (1. ábra). Ez egy természetes antibiotikum, mely hatékonyan gátolja számos gram-pozitív baktérium osztódását, beleértve a meticillin-rezisztens Staphylococcus aureust is (Schempp és mtsai 1999). A hyperforin dózis-dependens módon gátolta a fitohemagglutininnel stimulált limfociták proliferációját (Schempp és mtsai 2000). Antibakteriális és gyulladáscsökkentő hatásának köszönhetően enyhe- és középsúlyos atópiás dermatitisz kezelésében jó eredményeket értek el a hyperforintartalmú krém alkalmazásakor (Schempp és mtsai 2003). Kimutatták, hogy a hyperforin direkt módon gátolja mind a ciklooxigenáz-1 (COX-1), mind pedig az 5-lipoxigenáz (5LOX) aktivitását (Albert és mtsai 2002). H3C
CH 3
OH CH 3
O H3C
- -- CH 3
----
--
CH 3
O
--
---- O --
CH 3 CH 3
CH 3 H3C
1. ábra
CH 3
A hyperforin kémiai szerkezete (M = 536,79).
19
3 Célkitűzéseink 1. Melanómát infiltráló sejtek vizsgálata a daganat progressziója szempontjából. 2. A mikrovaszkuláris denzitás és a tumorinfiltráló sejtek közötti összefüggés vizsgálata primer kután melanómában. 3. A hyperforin lehetséges antitumorális és angiogenezist gátló hatásainak vizsgálata in vitro és in vivo modellrendszerekben.
20
4 Anyag és módszer 4.1 Emberi melanómák mikrovaszkuláris denzitásának és infiltráló sejtjeinek vizsgálata 4.1.1 Melanómás betegek 52 primer kután malignus melanómában szenvedő beteg archivált szövettani mintáit vizsgáltuk. A melanómák műtéti eltávolítása 1980 és 2000 között történt a Semmelweis Egyetem Bőr-Nemikórtani és Bőronkológiai Klinikán, valamint az Országos Onkológiai Intézetben. A tanulmányt mindkét intézmény etikai bizottsága jóváhagyta. A betegek daganatellenes terápiában nem részesültek a műtét előtt. A minták klinikai ás patológiai jellemzői az 1. táblázatban láthatók. Az invázió Clark szerinti mélysége II-V, a Breslow index pedig 1,1-9,9 mm között volt. A tumorvastagság alapján, az Amerikai Egyesített Rákbizottság ajánlásához igazodva (Balch és mtsai 2001), három kategóriába soroltuk a mintákat (1,01-2,0 mm, 2,01-4,0 mm, >4 mm). Az 5 éves követési periódus alatti progresszió szerint nem metasztatizáló, nyirokcsomó-metasztázist adó valamint szervi metasztázist képző csoportokba osztottuk a betegeket. A követési idő alatt 19 betegnél nem alakult ki áttét, 8 páciensnél csupán nyirokcsomó-metasztázis képződött, azonban 25 betegnél a melanóma távoli áttétet adott. A nem metasztatizáló és a nyirokcsomóáttétet adó csoportokban 100%-os volt az 5 éves túlélés, viszont a disszeminált betegek közül csak egy páciens túlélése haladta meg az 5 évet (62 hónap); mindegyikük halála a melanómával állt összefüggésben. A vizsgálat során kizártuk a klinikai vagy szövettani regressziót mutató eseteket (1. táblázat). A dendritikus sejtek vizsgálatánál 82 primer kután malignus melanómában szenvedő beteg archivált szövettani mintáit vizsgáltuk. A követési idő alatt 38 betegnél nem alakult ki áttét, 13 páciensnél csupán nyirokcsomó-metasztázis képződött, azonban 31 betegnél a melanóma távoli áttétet adott. A nem metasztatizáló és a nyirokcsomóáttétet adó csoportokban 100%-os volt az 5 éves túlélés, viszont a disszeminált betegek közül csak két páciens túlélése haladta meg az 5 évet (62 és 72 hónap) (2. táblázat).
21
Betegcsoport
Összes beteg
Nem metasztatikus
Nycs-metasztázis
Szervi metasztázis
Nem Férfi Nő
52 24 28
19 8 11
8 4 4
25 12 13
0 0 0
Lokalizáció Végtagi Törzsi Fej
52 21 29 2
19 8 11 0
8 3 5 0
25 10 13 2
0 0 0 0
Típus SSM NM ALM LMM
52 30 19 2 1
19 11 7 1 0
8 4 3 1 0
25 15 9 0 1
0 0 0 0 0
Daganatvastagság (mm) 1,01-2,0 2,01-4,0 >4,0
52 13 23 16
19 5 9 5
8 3 3 2
25 5 11 9
0 0 0 0
Ulceráció Volt Nem volt
52 35 17
19 11 8
8 5 3
25 19 6
0 0 0
5-éves túlélés
28 / 52 (54%)
19 / 19 (100%)
8 /
8 (100%)
1 / 25 (4%)
1. táblázat Beteg- és daganatjellemzők Nycs-metasztázis: csak nyirokcsomó-metasztázis jelent meg az 5 éves követési idő alatt, SSM: szuperficiálisan terjedő melanóma; NM: noduláris melanóma; ALM: akrolentiginózus melanóma; LMM: lentigo maligna melanóma
22
Daganatvastagság
Összes beteg
≤ 1,0 mm
1,01-2,0 mm
2,01-4,0 mm
>4,0 mm
Kor ≤ 50 > 50
38 44
11 7
8 6
10 19
9 12
Nem Férfi Nő
34 48
5 13
6 8
12 17
11 10
Lokalizáció Végtagi Törzsi Fej
32 44 6
7 10 1
7 6 1
10 18 1
8 10 3
Típus SSM NM ALM LMM
52 27 2 1
18 -
12 1 1
15 13 1 -
7 14 -
Metasztázis Nem metasztatikus Nycs-metasztázis Szervi metasztázis
38 13 31
16 2 -
5 3 6
10 4 15
7 4 10
Ulceráció Volt Nem volt
37 45
1 17
5 9
16 13
15 6
53 / 82 (65%)
18 / 18 (100%)
5-éves túlélés
10 / 14 (71%) 14 / 29 (48%) 11 / 21 (52%)
2. táblázat Beteg- és daganatjellemzők a dendritikus sejtek vizsgálatánál Nycs-metasztázis: csak nyirokcsomó-metasztázis jelent meg az 5 éves követési idő alatt, SSM: szuperficiálisan terjedő melanóma; NM: noduláris melanóma; ALM: akrolentiginózus melanóma; LMM: lentigo maligna melanóma
4.1.2 Az infiltráló sejtek és az erek immunhisztokémiai kimutatása a melanóma-mintákban A vizsgálathoz formalin-fixált, paraffinba ágyazott kután melanóma-mintákból származó, 3 μm-es metszeteket használtunk. A deparaffinált metszeteken mikrohullámos antigénfeltárást követően az endogén peroxidáz-aktivitást metanolban hígított 3%-os hidrogén-peroxiddal (H2O2) blokkoltuk. A nem specifikus kötőhelyek gátlása 3%-os borjú szérumalbuminnal történt. Negatív kontrollként egér IgG1-et (Sigma, St. Louis, USA), primer ellenanyagként poliklonális CD3-ellenes (1:100-as hígítás), illetve monoklonális CD8-ellenes (1:100-as hígítás), CD20-ellenes (1:100-as hígítás), CD34ellenes (1:50-es hígítás), CD68-ellenes (1:100-as hígítás) (DakoCytomation, Glostrup, 23
Dánia),
CD1a-ellenes
és
anti-DC-LAMP
(Coulter-Immunotech,
Marseilles,
Franciaország) antitestet használtunk. Ezt követően a másodlagos antitesttel (biotinilált anti-egér/anti-nyúl), majd pedig sztreptavidin-peroxidázzal inkubáltuk a metszeteket (LSAB2
System,
HRP;
DakoCytomation).
Az
antitest
kötődését
3-amino-9-
etilkarbazollal tettük láthatóvá (AEC; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, USA), majd hematoxilinnel háttérfestést végeztünk.
4.1.3 Az immunreakció kiértékelése A metszetek kiértékelése 200x-os nagyítás mellett történt 0,25 mm2-es, 10x10 db négyzetből álló négyzetrács felhasználásával. Két személy végezte a számolást (Kiss Judit és Ladányi Andrea), a klinikai adatok előzetes ismerete nélkül. Az endotélsejtek jelölése CD34-ellenes antitesttel történt, így nem csak a vérereket, hanem a nyirokerek egy részét is jelöltük (Fiedler és mtsai 2006). Különálló kapillárisnak tekintettünk minden olyan vörösen festődő endotélsejt-csoportot, mely egyértelműen elkülönült a környező kiserektől, daganatsejtektől és egyéb kötőszöveti elemektől (2.a és b ábra). Az érlumen hiánya nem volt kizáró tényező a számolásnál, ezért előfordulhatott, hogy az esetlegesen jelenlévő csontvelői eredetű CD34+ endotél progenitorokat vagy tumor őssejteket is számításba vettük. A CD34+ erek számolása során kiválasztottuk a három legsűrűbben erezett területet intratumorálisan és peritumorálisan. Intratumorálisan a daganat teljes területét, peritumorálisan pedig a melanóma sejtfészkek közvetlen környezetét (szélét és alapját) vizsgáltuk. Öt-öt random módon választott mezőn határoztuk meg a melanómát infiltráló intratumorális, valamint a melanóma körüli peritumorális CD3-, CD8-, CD20pozitív limfociták, CD1a-pozitív dendritikus sejtek és CD68-pozitív makrofágok számát (2.c-f ábra), majd az 1 mm2-re eső sejtsűrűséget kiszámoltuk.
24
2. ábra
A
B
C
D
E
F Az erek és az infiltráló sejtek jelölése immunhisztokémiai módszerrel kután melanómában. Peritumorális (A) és intratumorális (B) erek jelölése CD34 markerrel (vörös szín). C: a T limfociták azonosítása a peritumorális infiltrátumban CD3 markerrel (vörös). Megjegyzés: a peritumorális infiltrátum többségét Tsejtek alkotják. D: a B-sejtek azonosítása CD20 markerrel a melanóma peritumorális infiltrátumában (vörös). E: a peritumorális makrofágok azonosítása CD68 markerrel melanómában (citoplazmatikus vörös jel) F: a dendritikus sejtek jelölése a peritumorális infiltrátumban CD1a markerrel (vörös). Vonal = 100 μm.
25
4.1.4 Statisztikai analízis A különböző csoportok sejtdenzitásának statisztikai összehasonlítása MannWhitney U-teszttel és Kruskal-Wallis-teszttel történt. A mikrovaszkuláris denzitás és az infiltráló sejtek közötti összefüggést Spearman-féle rangkorrelációs teszttel határoztuk meg. A statisztikai számításokat BMDP Statisztikai Szoftvercsomaggal végeztük.
4.2 A hyperforin tumor- és endotélsejt-ellenes hatásának vizsgálata 4.2.1 Hyperforin és citotoxikus gyógyszerek A hyperforint a Hypericum perforatumból vonták ki (Flavex, Rehlingen, Németország).
A
CO2-kivonatot
1:10
arányban
összekeverték
metanollal,
lecentrifugálták, lepárolták, majd kromatografálták. A szárított reziduum hyperforintartalma
meghaladta
a
90%-ot.
A
vegyületet
metanolban
feloldották,
barna
üvegtartályokba lepárolták, és -30oC-on, folyékony nitrogén környezetben tárolták. Ismételt analitikai vizsgálatok a hyperforin maximum 0,5%-os csökkenését igazolták 6 hónap alatt. A paclitaxel a Tocris cégtől (Tocris Cookson, MO, USA), a camptothecin és a vincristin a Sigmától (Sigma, München) származott. A citotoxikus gyógyszereket dimetil-szulfoxidban (DMSO) oldottuk fel, melyet foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) hígítottunk tovább. A végső koncentrációt a tápoldatban történt hígítással értük el. A maximális DMSO-koncentráció 1% volt.
4.2.2 Sejtvonalak A következő sejtvonalakat használtuk: A-431 humán laphámkarcinóma, HT-144, MV3, 1F6, SB1 és SB3 humán melanóma, Jurkat humán akut T-sejtes leukémia, MCF-7 és MDA-MB-468 humán emlő-adenokarcinóma, SK-OV-3 humán ováriumkarcinóma, MAT-Lu és AT-2.1 patkány prosztatakarcinóma, AR42J és ARIP patkány hasnyálmirigykarcinóma, RG2 patkány glioblasztóma, BDX2 patkány fibroszarkóma, MT-450 patkány emlő-adenokarcinóma. Az MCF-7 kivételével a sejtvonalakat 10% fötális borjúszérummal (FCS), 1% Lglutaminnal és 1% penicillin/streptomycinnel kiegészített RPMI médiumban (Gibco, Eggenstein, Németország) tenyésztettük. Az MCF-7 sejteket 0,1 mM nem esszenciális aminosavval, 1 mM nátrium-piruváttal, 10% FCS-sel, 1% L-glutaminnal és 1%
26
penicillin/streptomycinnel kiegészített Dulbecco tápoldatban (Gibco) tenyésztettük párás környezetben (5% CO2, 37oC). A humán dermális mikrovaszkuláris endotélsejteket (PromoCell, Heidelberg, Németország) 5% FCS-sel, epidermális növekedési faktorral (10 ng/ml), hidrokortizonnal (1 µg/ml), amfotericin B-vel (50 ng/ml) és gentamicinnel (50 µg/ml) kiegészített endotélsejt-tápoldatban (PromoCell) tenyésztettük. Az endotélsejteket kollagén-1-gyel bevont tenyésztőedényben és petricsészében (BioCoatTM, BD Biosciences, Heidelberg, Németország) tenyésztettük.
4.2.3 Proliferációs tesztek Az adherens sejteket tripszin/etilén-diamin-tetraecetsavval (EDTA) (Gibco) gyűjtöttük össze. A sejteket kétszer átmostuk PBS-sel, reszuszpendáltuk a médiumban, majd 96-lyukú mikrotiter lemezeken (Costar, Cambridge, USA) tenyésztettük tovább (1x105 sejt/ml). A hyperforin (2,5-90 µg/ml), ill. a camptothecin, vincristin és paclitaxel (0,0001-1,0 µg/ml) adását követően a sejteket 24 órán át inkubáltuk. Az osztódó sejtek 5bróm-2’-dezoxiuridin- (BrdU) felvételét kolorimetriás BrdU sejtproliferációs enzimkapcsolt immunoszorbens esszével (ELISA) (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Németország) mértük.
4.2.4 Az apoptózis fotometriás meghatározása A sejteket (1x104 sejt/ml) a fent leírt módon hyperforinnal kezeltük 24 órán át. Ezt követően az apoptotikus sejtek arányát ELISA-val (Cell Death Detection ELISAPLUS, Roche Molecular Biochemicals) határoztuk meg. A teszt a sejtlizátumok citoplazmatikus frakciójában detektálja a mono- és oligonukleoszómákat anti-hiszton és peroxidázkapcsolt anti-DNS antitestekkel. A nukleoszómák mennyiségét 405 nm-en fotometriásan határozza meg az immunkomplexek peroxidázaktivitása alapján. Az adatok három külön kísérlet átlagából származnak.
27
4.2.5 Citotoxicitási teszt 24 órával a hyperforin adása után az endotélsejtek membránjának permeabilitását a sejtek tejsav-dehidrogenáz- (LDH) kibocsátásának mérésével határoztuk meg. Az LDHt a médiumban egy kapcsolt enzimatikus reakcióval mértük (Cobas Mira Plus, Roche, Grenzach, Németország). Az adatok három független kísérlet átlagából származnak.
4.2.6 In vitro kapillárisképződés vizsgálata Az in vitro angiogenezis vizsgálatához ECMatrix gélt (Chemicon) használtunk. A gélt egy TILL-PhotonicsTM videomikroszkóp 37oC-ra felfűtött inkubációs kamrájába helyeztük. A médiumban szuszpendált endotélsejteket (2x105) a gélre helyeztük 5 µg/ml hyperforinnal és anélkül. A videomikroszkóppal 10 másodpercenként 12 órán keresztül felvételeket készítettünk. A kapillárisképződés mértékét szemikvantitatívan értékeltük.
4.2.7 A daganat növekedésének in vivo vizsgálata Nőstény Wistar patkányokat PBS-ben szuszpendált 5x105 db MT-450 sejttel oltottak be szubkután. A gyógyszeres kezelést 15 nappal később kezdték meg. 8 állat 100 µL 1 mg/ml koncentrációjú hyperforin-oldatot, 8 állat 100 µL 1 mg/ml koncentrációjú paclitaxelt, 8 kontroll állat pedig 100 µL 10%-os DMSO-oldatot kapott peritumorálisan. Az állatokat két hétig kezelték naponta sc. A daganatokat minden harmadik nap lemérték mikrométer kaliperrel. A harmincadik napon az állatokat leölték, és a tumorokat fagyasztott nitrogénben gyorsfagyasztották. Az állatkísérletet jóváhagyta a helyi Etikai Bizottság.
4.2.8 Az apoptózis in vivo detektálása Az apoptózis in vivo detektálása ApopDetect Plus peroxidáz kit (Qbiogene, Heidelberg, Németország) felhasználásával történt a használati utasítás szerint. A módszer lényege: a digoxigenin-nukleotiddal jelölt DNS-fragmensekhez egy peroxidázriporter molekulához kötött anti-digoxigenin antitest kapcsolódik. Peroxidáz hatására az apoptotikus DNS-fragmensek helyén barna szín jelenik meg. Az apoptózis mértékének meghatározásakor négy daganatból származó metszeten három random módon választott mezőn számoltuk a pozitívan festődött sejtmagok százalékos arányát 400x-os nagyításnál Zeiss Axioszkóppal. 28
4.2.9 A kapillárisdenzitás in vivo meghatározása a patkányból származó tumorszöveten A hyperforinnal vagy oldószerrel kezelt csoportból random módon két-két daganatot választottunk, majd minden egyes tumorból három-három 5 µm-es fagyasztott metszetet patkány CD31 elleni antitesttel jelöltünk (TLD-3A12, PharMingen, San Diego, USA). A elsődleges antitest specifikus kötődését sztreptavidin biotin kit (LSABTM, DakoCytomation, Carpinteria, USA) segítségével mutattuk ki. Az érdenzitást Weidner leírása szerint határoztuk meg (Weidner 1995). A CD31-pozitív kiserek számát 200x-os nagyításnál határoztuk meg a tumorstroma három legnagyobb érdenzitású területén hot spot módszerrel.
4.2.10 VEGF meghatározása a sejtkultúra felülúszójában Az MT-450 sejteket (1x105/ mL) 24 órán át hyperforinnal inkubáltuk. A felülúszók VEGF-koncentrációját ELISA-val határoztuk meg (human VEGF quantikine ELISA, R&D Systems, Wiesbaden, Németország).
29
5 Eredmények 5.1 Emberi melanómák mikrovaszkuláris denzitásának és infiltráló sejtjeinek vizsgálata 5.1.1 A makrofág, a T-sejtes és a dendritikus sejtes infiltráció változása a klinikai paraméterekkel A továbbiakban a makrofágok, a T-sejtek, és a dendritikus sejtek denzitásának esetleges összefüggését vizsgáltuk a betegek- és a daganatok paramétereivel, mivel ezek a sejttípusok gyakori összetevői a melanómák infiltrátumának, és jelentős összefüggést mutattak a vaszkularizációval. Az intratumorális és peritumorális CD68+ makrofágok denzitása szignifikánsan magasabb volt a 2 mm-nél vastagabb melanómákban, mint a vékonyabbakban (3. táblázat). A makrofáginfiltrációban nem volt szignifikáns különbség a 2,01-4,0 mm-es és a >4,0 mm-es csoport között. Az intratumorális makrofágok sűrűsége alacsonyabb volt a nők csoportjában, mint a férfiakéban. A lokalizáció, a szövettani típus (SSM vs. NM), az ulceráció és a prognózis nem volt szignifikáns hatással a makrofáginfiltrációra. Az intratumorális és peritumorális T-sejtes infiltrációt nem befolyásolta a daganatvastagság, a lokalizáció, a szövettani típus és a betegek neme. Az ulcerált daganatok
azonban
intratumorálisan
alacsonyabb
CD3+
T-limfocita-sűrűséget,
peritumorálisan pedig kisebb CD8+ T-sejt-denzitást mutattak (nem szignifikáns) (4. táblázat). Az intratumorális és peritumorális CD3+ T-sejtek denzitása alacsonyabb volt a szervi metasztázist adó melanómák csoportjában, mint az áttétet nem képezőkében (határérték szignifikancia p=0,0903 ill. p=0,0659) (4. táblázat). Hasonló összefüggést találtunk a peritumorális CD8+ T-sejtek esetében is (határérték szignifikancia p=0,0947). Munkacsoportunk megfigyelése szerint a CD1a+ és a DC-LAMP+ érett dendritikus sejtek denzitása a tumorvastagsággal párhuzamosan csökkent (3. ábra). Az áttétet nem adó melanómák csoportjában szignifikánsan magasabb volt a dendritikus sejtek peritumorális sűrűsége, mint a metasztatizálók körében. Ez a különbség azonban eltűnt, amikor az 1 mm-nél vastagabb daganatokat vizsgáltuk. Ez arra utal, hogy a Langerhanssejtek jelenléte elsősorban a tumorvastagság függvénye. Ugyanakkor az érett dendritikus
30
sejtek magas peritumorális denzitása hosszabb túléléssel járt együtt. A Langerhans-sejtek denzitása szignifikánsan korrelált a CD25+ és OX40+ aktivált limfociták számával (p<0,001). A legjobb prognózisúak azok az esetek voltak, melyeknél sűrű dendritikus sejtes- és aktivált T-sejtes infiltráció volt megfigyelhető (4. ábra) (Ladányi és mtsai 2007).
31
Betegcsoport
Esetszám
CD68+ makrofágok Intratumorális Peritumorális Átlag ± SD p Átlag ± SD p
Nem Férfi Nő
24 27
209,6 ± 156,4 132,0 ± 136,0 0,0527
1
403,2 ± 309,6 447,2 ± 230,4 0,3854
1
Lokalizáció Végtag Törzs és fej
20 31
169,2 ± 149,6 166,4 ± 152,0 0,8663
1
416,4 ± 281,2 433,2 ± 264,8 0,8319
1
Típus SSM NM
29 19
154,8 ± 152,4 198,4 ± 153,2 0,2688
1
388,0 ± 256,4 497,6 ± 290,0 0,2420
1
Daganatvastagság (mm) 1,01-2,0 2,01-4,0 >4,0
12 23 16
88,0 ± 138,4 188,0 ± 136,4 199,6 ± 161,6 0,0259
Metasztázis Nem metasztatikus Nycs-metasztázis Szervi metasztázis
18 8 25
188,0 ± 164,0 72,8 ± 48,8 0,1264 184,0 ± 152,8 0,9797
Ulceráció Van Nincs
35 16
162,0 ± 147,6 179,6 ± 157,6 0,7314
1
438,0 ± 296,4 401,2 ± 201,2 0,8710
1
5-éves túlélés Igen Nem
27 24
146,8 ± 148,0 192,0 ± 151,2 0,1921
1
439,2 ± 265,2 412,4 ± 277,6 0,5334
1
2
3 3
258,8 ± 196,0 486,0 ± 286,0 467,6 ± 250,8 0,0520 472,0 ± 267,2 419,6 ± 242,8 0,7389 396,4 ± 283,2 0,2898
2
3 3
3. táblázat A makrofágdenzitás változása a betegek és daganatok jellemzőinek függvényében. Az adatok az 1 mm2-re eső makrofágok számát adják meg. Az ALM (2) és LMM (1) esetek nem szerepelnek. SSM: szuperficiálisan terjedő melanóma; NM: noduláris melanóma; ALM: akrolentiginózus melanóma; LMM: lentigo maligna melanóma. 1Mann-Whitney U-teszt, 2Kruskal-Wallis teszt, 3 Mann-Whitney U-teszt, a nem metasztatikus csoporthoz viszonyítva.
32
Betegcsoport
Esetszám
CD3+ T sejtek Intratumorális Peritumorális Átlag ± SD p Átlag ± SD p
Nem Férfi Nő
22 26
110,4 ± 122,4 73,6 ± 78,8 0,6929
1
780,8 ± 587,6 797,2 ± 536,0 0,7096
1
Lokalizáció Végtag Törzs és fej
18 30
78,4 ± 82,4 97,6 ± 112,4 0,5928
1
657,2 ± 425,6 869,2 ± 612,0 0,3067
1
Típus SSM NM
29 16
78,8 ± 86,8 110,8 ± 119,2 0,6596
1
745,6 ± 583,2 898,8 ± 541,2 0,2860
1
Daganatvastagság (mm) 1,01-2,0 2,01-4,0 >4,0
13 20 15
96,0 ± 100,4 82,8 ± 115,2 96,0 ± 88,8 0,5017
Metasztázis Nem metasztatikus Nycs-metasztázis Szervi metasztázis
18 7 23
112,0 ± 108,8 99,2 ± 101,2 0,9276 70,8 ± 96,8 0,0903
Ulceráció Van Nincs
32 16
76,4 ± 93,2 118,0 ± 114,8 0,0972
1
732,0 ± 478,4 906,0 ± 684,0 0,3937
1
5-éves túlélés Igen Nem
26 22
104,4 ± 104,8 74,0 ± 97,6 0,1515
1
920,4 ± 616,8 635,6 ± 434,8 0,1111
1
2
3 3
766,8 ± 701,6 795,2 ± 512,0 802,8 ± 503,6 0,8254 1000,0 ± 642,0 748,0 ± 595,2 0,3968 638,0 ± 424,8 0,0659
2
3 3
4. táblázat A T-sejtek denzitásának változása a betegek és a daganatok jellemzőinek függvényében. Az adatok az 1 mm2-re eső CD3-pozitív T-sejtek számát mutatják. Az ALM (2) és LMM (1) esetek nem szerepelnek. SSM: szuperficiálisan terjedő melanóma; NM: noduláris melanóma; ALM: akrolentiginózus melanóma; LMM: lentigo maligna melanóma. 1Mann-Whitney U-teszt; 2Kruskal-Wallis teszt; 3Mann-Whitney U-teszt, a nem metasztatikus csoporthoz viszonyítva.
33
a 160 140
Sejt/mm
2
120 100 80 60 40
r = 0.4729
20 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Daganatvastagság (mm)
Sejt/mm
2
b 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
r = 0.5212 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Daganatvastagság (mm)
c 140 120
Sejt/mm
2
100 80 60 40
r = 0.5427
20 0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Daganatvastagság (mm)
3. ábra
Az intratumorális CD1a+ (a), a peritumorális CD1a+ (b) és a DC-LAMP+ (c) dendritikus sejtek sűrűsége és a daganatvastagság közötti korreláció. Minden egyes pont egy-egy beteg daganatát reprezentálja. r: korrelációs koefficiens.
34
periCD1a+magas periCD1a+alacsony 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
p=0,0610 0
10
20
30
40
50
DC-LAMP+magas DC-LAMP+alacsony
b
Túlélési arány
Túlélési arány
a
1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
p=0,0195
60
0
10
20
Hónap
CD1a+alacsony/CD25+magas CD1a+magas/CD25+alacsony
CD1a+alacsony/OX40+magas CD1a+magas/OX40+alacsony CD1a+alacsony/OX40+alacsony 0,9
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6 0,5 0,4 0,3
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2
p=0,0243
0,1
p=0,0308
0,1
0,0
0,0 0
10
20
30
40
50
60
0
10
20
Hónap
DC-LAMP+magas/CD25+alacsony
0,9
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6 0,5 0,4 0,3
DC-LAMP+alacsony/OX40+alacsony
1,0
Túlélési arány
Túlélési arány
60
DC-LAMP+magas/OX40+alacsony
0,9
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2
p=0,0490
0,1
50
DC-LAMP+alacsony/OX40+magas
f
DC-LAMP+alacsony/CD25+alacsny
0,2
40
DC-LAMP+magas/OX40+magas
DC-LAMP+alacsony/CD25+magas
1,0
30
Hónap
DC-LAMP+magas/CD25+magas
e
p=0,0424
0,1
0,0
0,0 0
10
20
30
40
50
60
0
Hónap
4. ábra
60
1,0
Túlélési arány
Túlélési arány
d
0,9
0,2
50
CD1a+magas/OX40+magas
CD1a+alacsony/CD25+alacsony
1,0
40
Hónap
CD1a+magas/CD25+magas
c
30
10
20
30
40
50
60
Hónap
Melanómás betegek Kaplan-Meier túlélési görbéi a dendritikus sejtek peritumorális denzitásának függvényében. 35
5.1.2 A primer melanóma érdenzitása Az intermedier vastagságú (2,01-4,0 mm) melanómák intratumorális érsűrűsége meghaladta a másik két vastagsági kategóriáét, bár a különbségek statisztikailag nem voltak szignifikánsak (5. táblázat). A peritumorális MVD több mint kétszerese volt az intratumorálisénak, megerősítve kutatócsoportunk korábbi adatait (Döme és mtsai 2002). A peritumorális kiserek száma a tumorvastagsággal párhuzamosan emelkedő, statisztikailag nem szignifikáns tendenciát mutatott. Az MVD nem különbözött szignifikánsan a lokalizáció, a szövettani típus (SSM vs. NM), a metasztázisképzés és az ulceráció függvényében. Ugyanakkor a férfiak esetében az intratumorális MVD szignifikánsan magasabb volt, mint a nőknél (5. táblázat).
36
Betegcsoport
Esetszám
CD34+ erek Intratumorális Peritumorális Átlag ± SD p Átlag ± SD p
Nem Férfi Nő
24 28
97,6 ± 76,8 ±
33,6 34,4 0,0303
1
202,0 ± 78,8 216,0 ± 106,0 0,8114
1
Lokalizáció Végtag Törzs és fej
21 31
84,4 ± 87,6 ±
31,6 38,0 0,8302
1
207,6 ± 210,4 ±
88,0 98,8 0,9331
1
Típus SSM NM
30 19
79,6 ± 94,4 ±
30,0 41,2 0,2032
1
201,2 ± 86,4 221,6 ± 112,0 0,7195
1
Daganatvastagság (mm) 1,01-2,0 2,01-4,0 >4,0
13 23 16
75,6 ± 97,2 ± 79,6 ±
39,6 36,0 27,6 0,1593
Metasztázis Nem metasztatikus Nycs-metasztázis Szervi metasztázis
19 8 25
89,6 ± 77,2 ± 86,8 ±
44,0 26,0 0,3955 31,2 0,6187
Ulceráció Van Nincs
35 17
90,8 ± 77,2 ±
36,8 30,8 0,2013
1
216,8 ± 194,4 ±
96,8 87,6 0,4182
1
5-éves túlélés Igen Nem
28 24
86,4 ± 86,4 ±
38,8 32,0 0,8688
1
215,2 ± 107,2 202,8 ± 76,8 0,8472
1
2
3 3
174,0 ± 216,0 ± 228,8 ±
83,2 98,8 92,0 0,2437
220,3 ± 118,4 208,0 ± 88,4 0,9154 201,6 ± 75,2 0,8497
2
3 3
5. táblázat Az MVD változása a betegek és a daganatok jellemzőinek függvényében. Az adatok az 1 mm2-re eső erek számát mutatják. Az ALM (2) és LM (1) esetek nem szerepelnek. SSM: szuperficiálisan terjedő melanóma; NM: noduláris melanóma; ALM: akrolentiginózus melanóma; LMM: lentigo maligna melanóma. 1Mann-Whitney U-teszt, 2Kruskal-Wallis teszt, 3MannWhitney U-teszt, a nem metasztatikus csoporthoz viszonyítva.
5.1.3 A mikrovaszkuláris denzitás és az immunsejtes infiltrátum kapcsolata Az MVD és az infiltráló sejtek közötti korrelációt a tumorvastagság- és a metasztázisképzés alapján kialakított csoportokban külön-külön vizsgáltuk. Az egyes sejttípusokat megvizsgálva azt az eredményt kaptuk, hogy az intratumorális infiltrátum
37
egyik
csoportban
sem
mutatott
szignifikáns
összefüggést
Peritumorálisan, az egész betegpopulációt vizsgálva, a CD3
+
az
érdenzitással.
T-sejtek sűrűségénél
találtunk szignifikáns korrelációt a mikrovaszkuláris denzitással (6. táblázat). Ez az összefüggés erősebb volt a legnagyobb vastagsági kategóriában (>4,0 mm) valamint a nyirokcsomó- és szervi áttétet adó daganatok csoportjában. A peritumorális CD8+ Tsejtek sűrűsége az MVD-vel a 4 mm-nél vastagabb és a szervi metasztázist adó melanómák csoportjában mutatott szignifikáns korrelációt (6. táblázat). A szervi áttétes csoportot megvizsgálva azt az eredményt kaptuk, hogy a 4 mm-nél vastagabb tumoroknál észlelt erős korreláció miatt szignifikáns az összefüggés a CD3+ ill. CD8+ T sejtek és az MVD között a távoli metasztázist adó csoportban. További összefüggést találtunk a 4,0 mm-nél vastagabb melanómáknál a makrofágdenzitással, valamint a szervi áttétet adó melanómák esetében a B-sejtek és a dendritikus sejtek számával. A dendritkus sejtek denzitása az MVD-vel a 2-4 mm-es melanómák csoportjában is szignifikáns korrelációt mutatott. Ezzel szemben a vékonyabb (1,01-2,0 mm) és a metasztázist nem adó tumorok esetében semmilyen, vagy negatív korrelációt találtunk az MVD és az infiltráló sejtek denzitása között. Sejttípus marker
Esetszám
Összes tumor Daganatvastagság (mm) 1,01-2,0 2,01-4,0 >4,0 Metasztázis Nem metasztatikus Nycs-metasztázis Szervi metasztázis
CD3
52
0,2950
13 23 16
-0,1209 0,0451 0,7643
19 8 25
0,0857 0,7143 0,5209
a
CD8
CD20
CD68
CD1a
-0,0900
0,1305
0,1570
0,1910
-0,0559 0,0215 0,3500
0,1748 -0,3104 0,5794
-0,0769 0,5791 0,3712
-0,3024 0,0000 0,4213
0,0237 0,4524 0,1350
-0,6573 -0,0110 0,7758
d
-0,2181 0,0952 0,5011
a c
c
d
b
a
b
-0,2021 0,3713 0,4344
6. táblázat Az MVD és a peritumorálisan elhelyezkedő infiltráló sejtek denzitása közötti korreláció. Spearman-féle rangkorrelációs koefficiensek; ap<0,05, bp<0,02, cp<0,01, d p<0,001
38
c
a
5.2 A hyperforin tumor- és endotélsejt-ellenes hatásának vizsgálata 5.2.1 A hyperforin hatása a daganatsejtekre in vitro 10 humán és 7 patkány sejtvonalon hasonlítottuk össze a hyperforin proliferációt gátló hatását a camptothecin, vincristin és paclitaxel daganatellenes hatásával. A sejtek proliferációját BrdU-teszttel vizsgáltuk. A hyperforin a fibroszarkóma (BDX2) sejtvonal kivételével az összes sejt proliferációját hatékonyan gátolta. A melanóma sejtek osztódását — a többi sejtvonalhoz képest — a hyperforin közepesen gátolta. Ugyanakkor számos sejtvonal rezisztens volt a többi citosztatikummal szemben. Az 1%-os DMSO-val történt inkubáció nem befolyásolta a sejtek osztódását. (7. táblázat) Sejtek
Hyperforin (µg/ml)
Vincristin (µg/ml)
SB1P (Melanóma) SB3P (Melanóma) MV3 (Melanóma) 1F6 (Melanóma) HT144 (Melanóma) Jurkat (T-sejtes leukémia) MT450 (Emlőrák, patkány) MCF7 (Emlőrák) MDA-MB-468 (Emlőrák) SK-OV-3 (Ováriumrák, p53-) A431 (Laphámrák) MatLu (Prosztatarák, patkány) AT2.1 (Prosztatarák, patkány) AR42J (Pankreászrák, patkány) ARIP (Pankreászrák, patkány) RG2 (Glioblasztóma, patkány) BDX2 (Fibroszarkóma, patkány)
4, 4, 2, 4, 6 6, 1, 1, 2 3 4, 9 1, 1, 2, 2, 40
1 0, >1 0, 0, 0, 0, 0, 0, >1 >1 >1 >1 >1 0, >1 0,
5 5 5 5 5 5 5
5 9 4 2 5
008 007 008 0001 0007 01 08
1 2
Taxol (µg/ml) 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1 0, >1 >1 >1 0, >1 0, >1 >1
Camptothecin (µg/ml)
04 5 05 1 008 008 008 4
1 5
7. táblázat A hyperforin proliferációt gátló hatása összehasonlítva a camptothecin, vincristin és paclitaxel daganatellenes hatásával in vitro. Az eredmények az 50%-os gátló koncentrációt mutatják. A kísérletben használt hyperforinkoncentráció 2,5-80 µg/ml volt; az utóbbi három szert 0,0001-1,0 µg/ml koncentrációban adtuk és 24 órán át inkubáltuk a sejteket. A sejtek proliferációját a BrdU-felvétel meghatározásával vizsgáltuk.
39
0, 0, 0, 0. 0, 0, 0, >1 0, >1 >1 >1 >1 >1 0, >1 >1
8 3 08 2 05 006 007 3
04
A hyperforin esetleges apoptózist indukáló hatását kolorimetriás ELISA-val határoztuk meg hat tumorsejtvonalon. A 5. ábrán látható a DNS-fragmentáció dózisfüggő növekedése mindegyik sejtvonalon. A hyperforin apoptózist indukáló hatása a melanómán átlagon felüli a többi tumorsejtvonalhoz képest.
500
MT450 MCF-7 MB-468
400
HT144 A431
300 Abszorpció [405 nm] x 103
Jurkat
200 100 0 0
2,5
5
10
20
40
80
Hyperforin (μg/ml)
5. ábra
A DNS-fragmentáció dózisfüggő növekedése hyperforinkezelés után. Sejtvonalak: A-431, humán laphám karcinóma; HT-144, humán melanóma; Jurkat, humán akut T-sejtes leukémia; MCF-7, humán emlő adenokarcinóma; MDA-MB-468 humán emlő adenokarcinóma; MT-450, patkány emlő adenokarcinóma. Az apoptotikus sejtek arányát ELISA-val (Cell Death Detection ELISAPLUS, Roche) határoztuk meg. A teszt a sejtlizátumok citoplazmatikus frakciójában detektálja a mono- és oligonukleoszómákat anti-hiszton és peroxidáz-kapcsolt anti-DNS antitestekkel. A nukleoszómák mennyiségét 405 nm-en fotometriásan határozzák meg az immunkomplexek peroxidázaktivitása alapján. Az adatok három külön kísérlet átlagából származnak
40
5.2.2 A hyperforin daganatellenes hatása in vivo A nőstény Wistar patkányokba szubkután adott MT-450 emlőráksejtekből származó tumor növekedését a hyperforin a paclitaxelhez hasonló mértékben gátolta toxicitás nélkül (6. ábra). 5000
Kontroll Hyperforin Paclitaxel
4000 Tumortérfogat (mm3)
3000
Kezelés kezdete
2000 1000 0 14
16
18
20
22
24
26
28
30
A tumor beadása óta eltelt napok
6. ábra
A hyperforin gátolja a daganat növekedését in vivo. Nőstény Wistar patkányokat szubkután PBS-ben szuszpendált 5x105 MT450 sejttel oltottak be. A gyógyszeres kezelést 15 nappal később kezdték meg. Az állatok 100 µL 1,07 mg/ mL koncentrációjú hyperforin-oldatot (n=8) vagy oldószert (n=8) kaptak peritumorálisan két hétig. A daganatokat mikrométer kaliperrrel mérték meg a kezelés végén. Az oszlopok 8 patkányból származó daganat átlagát ± SD mutatja.
5.2.3 A hyperforin apoptózist indukál a daganatokban in vivo A nőstény Wistar patkányokból származó emlőrák apoptotikus sejtjeinek jelölése a hyperforinnal kezelt daganatoknál több apoptotikus sejtet mutatott a kontrollhoz képest. (58% vs. 2%, p<0,05) (7. ábra)
41
A: Oldószer
Hyperforin
40x
100x
100x
B:
*
80 70 60
Apoptotikus sejtek %-os aránya
50 40 30 20 10 0
Oldószer
7. ábra
Hyperforin
A hyperforin in vivo az MT-450 daganatsejtekben apoptózist indukál. A: Felül a kontroll, alul a hyperforinnal kezelt tumor metszete látható. B: A hyperforin által in vivo létrehozott apoptózis mennyiségi meghatározása. Négy daganat metszetén három random módon választott mezőn 400x-os nagyítás mellett meghatároztuk a TUNEL-pozitív (barna színű) apoptotikus sejtek százalékos arányát. *p < 0,05 az oldószerrel kezelt állatokkal ANOVA-val összehasonlítva.
42
5.2.4 A hyperforin hatása az endotélsejtek proliferációjára Az endotélsejtek osztódását a sejtek DNS-ének BrdU-felvételével határoztuk meg. A hyperforin dózisfüggően gátolta az endotélsejtek proliferációját in vitro; 2 µg/ml-es 50%-os gátló koncentrációval (8.A ábra). A Cell Death Detection ELISAPLUS kolorimetriás esszé nem mutatott apoptózist a hyperforinnal kezelt endotélsejtek vizsgálatakor (8.B ábra). Az apoptózis teszt hibájának kizárása céljából megvizsgáltuk a camptothecin endotélre gyakorolt hatását. A camptothecin dózisdependens módon gátolta az endotélsejtek proliferációját (9. ábra), és apotózist indukált (10. ábra). A hyperforinkezelés esetleges toxikus hatását a felülúszóban lévő intracelluláris LDHfelszabadulás mérésével detektáltuk (8.C ábra).
43
A: 0 ,7 0 ,6 0 ,5 0 ,4
Abszorpció (A370-A492)
0 ,3 0 ,2 0 ,1 0 ,0 0
1
2
3
Hyperforin (µg/ml)
4
5
B: 0 ,0 5 0 ,0 4 0 ,0 3
Apoptózis (A405-A490)
0 ,0 2 0 ,0 1 0 ,0 0 0
1
2
3
4
3
4
Hyperforin (µg/ml)
5
C: 2 0 ,0 1 7 ,5 1 5 ,0 1 2 ,5
LDH felszabadulás (U/l)
1 0 ,0 7 ,5 5 ,0 2 ,5 0 ,0 0
1
2
5
H y p e rfo rin (µ g /m l)
8. ábra
A hyperforin hatása a HDMEC sejtek proliferációjára, LDH felszabadulására, és az oligonukleoszóma-képződésre. A: Proliferációs BrdU-esszé. A sejtproliferáció dózisdependens gátlása 24 órával a hyperforinkezelés után. B: Az apoptotikus oligonukleoszómák mennyisége nem növekedett 24 órával a hyperforinkezelés után. A sejtlizátumok oligonukleoszómatartalmát „cell death detection ELISA”-val határoztuk meg. C: A felülúszóban található LDH mennyiségének meghatározása. A hyperforin nem okoz citotoxikus membránkárosodást. Az adatok három független kísérlet középértéke ± SD.
44
0,45 0,40 0,35 0,30
Abszorpció (A370-A492)
0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0
0,0001
0,001
0,01
0,1
1
Camptothecin (µg/ml)
9. ábra
A camptothecin dózisdependens módon gátolta az endotélsejtek proliferációját Proliferációs BrdU-esszé. A sejtproliferáció dózisdependens gátlása 24 órával a camptothecinkezelés után.
0,18 0,16 0,14 0,12
Apoptózis (A405-A490)
0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0
0,0001
0,001
0,01
0,1
1
Camptothecin (µg/ml)
10. ábra
Az apoptotikus oligonukleoszómák mennyiségének dózisfüggő emelkedése az endotélsejtekben a camptothecin hozzáadása után 24 órával. Az apoptotikus sejtek arányát ELISA-val (Cell Death Detection ELISAPLUS, Roche) határoztuk meg. A teszt a sejtlizátumok citoplazmatikus frakciójában detektálja a mono- és oligonukleoszómákat anti-hiszton és peroxidázkapcsolt anti-DNS antitestekkel. A nukleoszómák mennyiségét 405 nm-en fotometriásan határozzák meg az immunkomplexek peroxidázaktivitása alapján.
45
5.2.5 A hyperforin hatása az endotélhálóképzésre in vitro Az endotélsejtek kisérképzését bazálmembrán-fehérjéből álló mátrixgélen vizsgáltuk videomikroszkóp alatt. Az endotélsejtek tubulusképzését megakadályozta az endotélsejt-tápoldathoz adott 5 µg/ml hyperforin. A mikroszkópos felvételeken látható, hogy a hyperforin a HDMEC sejtek morfológiáját (11. ábra), intercelluláris adhézióját és motilitását nem változtatta meg. A:
B:
11. ábra
A hyperforin in vitro gátolja a tubulusképződést. A HDMEC sejteket egy komplex extracelluláris matrixon (ECMatrix™) tenyésztettük hyperforin nélkül (A) és 5 µg/mL hyperforinnal (B). A mikrotubulus-képződést videomikroszkóp segítségével monitoroztuk három független kísérlet során. 12 órán át 10 másodpercenként készült felvétel.
46
5.2.6 A hyperforin gátolja a tumor-indukált angiogenezist in vivo A nőstény Wistar patkányokból származó 30 napos (15 napig hyperforinnal kezelt) szubkután emlőrákokból fagyasztott metszetek készültek. A tumor stroma területén CD31-ellenes antitestekkel jelöltük a kapillárisokat, majd hot spot módszerrel, 200x-os nagyításnál számoltuk a kapillárisokat. A kapillárisok száma szignifikánsan kisebb volt a hyperforinnal kezelt állatok daganataiban a kontroll csoporthoz képest (p < 0,05) (12. ábra).
47
A:
B: 100 80 Kapillárisok száma 60 látómezőnként
*
40 20 0
Oldószer
12. ábra
Hyperforin
A hyperforin gátolja a daganat vaszkularizációját in vivo. Nőstény Wistar patkányokat szubkután 5x105 MT-450 patkány emlő tumorsejttel oltottak be. A gyógyszeres kezelést 15 nappal később kezdték meg. Az állatok 100 µl 1,07 mg/ mL koncentrációjú hyperforin-oldatot (n=8) vagy oldószert (n=8) kaptak peritumorálisan két hétig. Négy tumor fagyasztott metszetén megfestettük a CD31-pozitív endotélsejteket, és minden metszeten három random módon választott mezőt értékeltünk. A: Bal oldalon a kontroll, jobb oldalon a hyperforinnal kezelt tumor metszete látható (200x). B: Az in vivo kapillárisdenzitás mennyiségi meghatározása. Négy daganat metszetén, a tumor stroma területén, a három legnagyobb érdenzitást mutató mezőn 200x-os nagyítás mellett meghatároztuk a CD31-pozitív kapillárisok számát. *p < 0,05 az oldószerrel kezelt állatokkal ANOVA-val összehasonlítva.
48
5.2.7 A hyperforin hatása a daganatsejtek VEGF-termelésére Megvizsgáltuk, vajon a hyperforin angiogenezist gátló képessége összefüggésben áll-e az endotél- vagy a daganatsejtek VEGF-szekréciójának gátlásával. A hyperforin nem befolyásolta a HDMEC sejtek autokrin VEGF-elválasztását (nem közölt adat; Dr. Christoph Schempp). Az in vivo kísérletben is használt MT-450 patkány emlőkarcinómasejteket in vitro hyperforinnal inkubáltuk, és a felülúszóban mértük a sejtek VEGFszekrécióját. A HDMEC sejtekkel szemben, az MT-450 sejtek VEGF-termelését a hyperforin dózisdependens módon gátolta (13. ábra). Ez arra utal, hogy a hyperforin az angiogenezist részben a daganatok VEGF-szekréciójának csökkentésével gátolja. Ugyanakkor a hyperforin koncentráció emelkedésével párhuzamosan csökkenő daganatsejtszám is közrejátszik a VEGF koncentráció csökkenésében.
50 40 30
VEGF (pg/ml)
20 10 0 0
5
10
20
40
80
Hyperforin (µg/ml)
13. ábra
A hyperforin dózisfüggő módon gátolta az MT-450 sejtek VEGFtermelését. Az MT-450 emlőkarcinóma-sejteket in vitro 24 órán át hyperforinnal inkubáltuk, és a felülúszóban mértük a sejtek VEGF-szekrécióját. Az értékek két független kísérlet eredményének átlagából származnak ± standard deviáció.
49
6 Diszkusszió 6.1 Az infiltráló sejtek, a mikrovaszkuláris denzitás és a két paraméter közötti összefüggés vizsgálata emberi melanómában 6.1.1 A makrofág, a T-sejtes és a dendritikus sejtes infiltráció változása a klinikai paraméterekkel A melanómát az elméleti kutatási eredmények és a klinikai gyakorlati tapasztalatok alapján erősen immunogén tumornak tartjuk. A melanómás betegekben kimutatott melanóma-asszociált antigének, az antigéneket prezentáló dendritikus sejtek és makrofágok, valamint az antigéneket felismerő T limfociták létezése arra utal, hogy immunreakció létre tud jönni. A sűrű immunsejtes infiltrátum mellett tapasztalt gyakori tumorprogresszió azonban arra enged következtetni, hogy az immunrendszer sok esetben mégsem képes kontrollálni a melanóma növekedését. Számos mechanizmust leírtak, melyek magyarázatul szolgálhatnak: a melanóma-asszociált antigének vagy az MHC I molekulák down-regulációja a daganatsejtek felszínén; az antigénpeptidek nem elégséges prezentációja; a kostimuláció hiánya; a daganat mikrokörnyezetében termelődött immunszuppresszív citokinek (pl. IL- 10, TNF, TGF-β, VEGF) (Marincola és mtsai 2000). Vizsgálataink szerint az intratumorális és peritumorális makrofágdenzitás a 2 mmnél
vastagabb
tumorok
csoportjában
szignifikánsan
magasabb
volt,
mint
a
vékonyabbakban. Ez megerősíti két másik munkacsoport megfigyelését is, akik ugyancsak sűrűbb makrofág infiltrációt találtak a vastagabb melanómákban (Bröcker és mtsai 1988, Torisu és mtsai 2000). Az intratumorális makrofágok sűrűsége magasabb volt a férfiak körében. Erre magyarázatul szolgálhat, hogy az ösztrogén számos szövetféleségben gátolja az MCP-1-expressziót és a makrofáginfiltrációt (Arici és mtsai 1999, Seli és mtsai 2002). A lokalizáció, a szövettani típus (SSM vs. NM), az ulceráció és a prognózis nem volt szignifikáns hatással a makrofáginfiltrációra. Az intratumorális és peritumorális T-sejtes infiltrációt nem befolyásolta a daganatvastagság, a lokalizáció, a szövettani típus és a betegek neme. Az ulcerált daganatok
azonban
intratumorálisan
alacsonyabb
CD3+
T-limfocita-sűrűséget,
peritumorálisan pedig kisebb CD8+ T-sejt-denzitást mutattak (nem szignifikáns) Az 50
intratumorális és peritumorális CD3+ T-sejtek denzitása alacsonyabb volt a szervi metasztázist adó melanómák csoportjában, mint az áttétet nem képezőkében (határérték szignifikancia p=0,0903 ill. p=0,0659). Hasonló összefüggést találtunk a peritumorális CD8+ T-sejtek esetében is (határérték szignifikancia p=0,0947). A CD1a+ és DC-LAMP+ érett dendritikus sejtek prognosztikus jelentőségével is foglalkoztunk. A peritumorális és intratumorális CD1a+ dendritikus sejtek- valamint a peritumorális DC-LAMP+ érett dendritikus sejtek denzitása inverz korrelációt mutatott a melanómák vastagságával (Ladányi és mtsai 2007). A CD1a+ dendritikus sejtek vonatkozásában más kutatócsoportok is hasonló eredményt kaptak, azonban ennek prognosztikus jelentőségével nem foglalkoztak (Bröcker és mtsai 1988, Stene és mtsai 1988, Toriyama és mtsai 1993). Tudomásunk szerint a DC-LAMP+ érett dendritikus sejtek denzitásáról és prognosztikus jelentőségéről melanómában még nem jelent meg közlemény. A dendritikus sejtek funkcionális aktivitására utalhat, hogy szignifikáns összefüggést találtunk a dendritikus sejtek és az aktivált T sejtek denzitása között. Ennek az immunválasznak köszönhető feltehetően az a megfigyelésünk, hogy a szervi metasztázist adó melanómákra alacsonyabb peritumorális dendritikus sejt denzitás volt jellemző. A sűrű DC-LAMP+ érett dendritikus sejt infiltráció hosszabb túléléssel járt együtt; ennek pozitív prognosztikus jelentőségét egy- és többváltozós analízissel is alátámasztottuk. A legjobb prognózisúak azok az esetek voltak, melyeknél sűrű dendritikus sejtes- és aktivált T-sejtes infiltráció volt megfigyelhető (Ladányi és mtsai 2007).
6.1.2 A primer melanóma érdenzitása Vizsgálatunk
eredménye
szerint, amíg
a peritumorális kisérdenzitás a
melanómavastagsággal párhuzamosan emelkedő tendenciát mutatott, a legsűrűbb intratumorális vaszkularizációt az intermedier vastagságú (2,01-4,0 mm) melanómák csoportjában találtuk. Ugyanakkor az intratumorális és peritumorális mikrovaszkuláris denzitás nem változott a metasztázisképzés függvényében. A melanómák lokalizációja, ulceráltsága és szövettani típusa (SSM vs. NM) sem befolyásolta a vaszkularizációt. Ezek a megfigyelések megerősítik korábbi adatainkat és mások eredményeit, mely szerint a
51
peritumorális mikrovaszkuláris denzitás nem függ össze a melanóma klinikopatológiai paramétereivel (Döme és mtsai 2002). Korábbi vizsgálatunk azonban szignifikáns összefüggést talált a centrális intratumorális érdenzitás és a melanóma szervi metasztázisképzése között (Döme és mtsai 2002). Jelenlegi tanulmányunkban azonban a korábbitól eltérő módon a legvaszkularizáltabb területeket vizsgáltuk, mivel elsősorban ezeken a helyeken vártunk korrelációt az infiltráló sejtekkel.
6.1.3 A mikrovaszkuláris denzitás és az immunsejtes infiltrátum kapcsolata Az angiogenezis folymatát a daganat- és strómasejtek által termelt angiogén (pl. VEGF, bFGF, PDGF) és anti-angiogén (pl. angiostatin, endostatin, IFNγ) citokinek aránya szabályozza. A tumor vaszkularizációjának kialakításában feltehetően szerepet játszik a malignus sejtek és az infiltráló sejtek közötti interakció is. Mivel a tumort infiltráló sejtek többsége a keringésből származik, lehetséges hogy a peri- és az intratumorális erek denzitása összefügg a melanómát infiltráló sejtekkel. Mivel a strómasejtek számos angiogén faktort termelnek, még inkább elképzelhető ez a feltevés. Az angiogenezis és a makrofáginfiltráció közötti kapcsolat daganatokban még nem egészen egyértelmű. Néhány közlemény a két tényező összefüggéséről számol be (Ono és mtsai 1999, Torisu és mtsai 2000), azonban mások ezt nem erősítették meg (Varney és mtsai 2005). Vizsgálataink szerint csupán a 4 mm-nél vastagabb melanómák körében volt összefüggés a peritumorális érdenzitás és a makrofáginfiltráció között. Eredményeink arra utalnak, hogy a makrofágok inkább a magas rizikójú melanómák vaszkularizációját befolyásolják. Leek és mtsai szerint a monociták folyamatosan vándorolnak be a daganatokba, és a hipoxiás területeken felhalmozódnak. Itt angiogén citokinek (TNF-α, IL-1α és VEGF) termelésével képesek az érképződés indukálására (Leek és mtsai 1996, Lewis és Murdoch 2005). Melanóma esetében peritumorálisan fokozhatják az angiogenezist, intratumorálisan pedig elősegíthetik az inkorporált erek túlélését (Döme és mtsai 2002). Mivel a melanómák limfocita-infiltrációja központi fontosságú a tumorellenes immunválaszban, ezért vizsgáltuk a T-sejtek vaszkularizációban betöltött szerepét is. Az összes vastagsági kategóriát együtt vizsgálva szignifikáns összefüggést találtunk a peritumorális mikrovaszkuláris denzitás és a peritumorális CD3+ T-sejtek száma között. A
52
korreláció kifejezettebb volt a 4,0 mm-nél vastagabb- és a szervi metasztázist képző melanómák csoportjában. A szervi áttétes csoportot megvizsgálva azonban azt az eredményt kaptuk, hogy a csupán a 4 mm-nél vastagabb tumorok alcsoportjában észlelhető szignifikáns korreláció. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy a daganatvastagsággal párhuzamosan emelkedő peritumorális érdenzitás egyre több T-sejt extravazációját teszi lehetővé a melanóma területén. Ezek a T sejtek részt vehetnek a tumorellenes immunválaszban, azonban angiogén citokinek termelésével elősegíthetik a melanóma vaszkularizációját és ezáltal hematogén áttétképzését. Owen és mtsai megfigyelték, hogy emlőrákos egerekben a tumor-infiltráló limfocitákban az MMP-9-expresszió és a VEGF-termelés emelkedik. Elképzelhető, hogy a T-sejtekből származó MMP-9 elősegíti az extracelluláris mátrix lebontását; a VEGF pedig az angiogenezist stimulálja (Owen és mtsai 2003). Egy másik munkacsoport pedig VEGF mRNS-t expresszáló T-sejtekről számol be prosztata- és hólyagkarcinómában. Leírták, hogy a T-sejtek VEGF-termelése hypoxia hatására fokozódik (Freeman és mtsai 1995). Számos tanulmány igazolta, hogy a daganat által termelt VEGF gátolja a dendritikus sejtek érését és funkcióját, valamint a VEGF-expresszió fordítottan aránylott a dendritikus sejtek denzitásával számos daganattípusban (Gabrilovich és mtsai 1996, Inoshima és mtsai 2002, Saito és mtsai 1998). Feltehetően tehát a VEGF nem csak az angiogenezist segíti elő, hanem a helyi immunválaszt is gátolja. Ezért volt meglepő, hogy a peritumorális dendritikus sejtek denzitása szignifikáns összefüggést mutatott az MVDvel a 2-4 mm-es melanómák és a szervi metasztázist képző melanómák alcsoportjában. Bár kutatócsoportunk a melanómasejtek és az immunsejtek VEGF expresszióját nem vizsgálta, Riboldi és mtsainak megfigyelése magyarázatul szolgálhat. Ők ugyanis leírták, hogy azok a mieloid dendritikus sejtek, melyeket érésük során kalcitriollal, PGE2-vel és IL-10-el kezeltek, VEGF-et termeltek in vitro és in vivo, valamint IL-12 termelésük csökkent (Riboldi és mtsai 2005). A daganatok mikrokörnyezetében viszont nagy mennyiségben kimutatható mind a PGE2, mind pedig az IL-10 (Bingle és mtsai 2002, Elgert és mtsai 1998).
53
A nemi hormonoknak a melanóma vaszkularizációjában betöltött szerepére utalhat, hogy a férfiaknál magasabb intratumorális érdenzitást tapasztaltunk. Az endokrinológiai tényezők melanómára gyakorolt hatását tükrözi az a megfigyelés is, hogy a menopauza előtt álló melanómás nők túlélése jobb, mint a menopauzán átesett nőké valamint a férfiaké (Kemény és mtsai 1998, Miller és Mac Neil 1997). Az irodalomban számos potenciális magyarázat fellelhető a fenti jelenségekre. Leírták, hogy a szteroid hormonok befolyásolják az angiogenezist, valamint koronária artérián és umbilikális vénán kimutatták, hogy az endotélsejtek ösztrogénreceptort expresszálnak (Kim-Schulze és mtsai 1996). Azt is megfigyelték, hogy az ösztradiol ezeknek a sejteknek a proliferációját és migrációját indukálja, apoptózisát pedig gátolja (Spyridopoulos és mtsai 1997, Losordo és Isner 2001). Továbbá leírták, hogy humán endometriumadenokarcinóma sejtekben az ösztrogén NF-κB-aktivációra képes, mely a tumorsejtek IL8-, bFGF- és VEGF-termeléséhez vezet. Ezt a folyamatot vérlemezke aktiváló faktor(PAF) antagonistákkal tudták gátolni (Seo és mtsai 2004). Ugyanakkor a 2-metoxiösztradiol gátolja az endotélsejtek proliferációját és az angiogenezist, valamint számos daganattípusban, beleértve a melanómát is, akadályozza a tumorsejtek osztódását és metasztázisképzését (Dobos és mtsai 2004, Fotsis és mtsai 1994, Pribluda és mtsai 2000). A medroxiprogeszteronról leírták, hogy nyúl szaruhártyában gátolja a melanóma növekedését és vaszkularizációját (Gross és mtsai 1981). Az androgének viszont HIFaktiváción keresztül, a VEGF-termelés serkentésével (Mabjeesh és mtsai 2003) vagy a trombospondin-1 (angiogenezis-inhibitor) szekréciójának gátlásával serkenteni tudják az angiogenezist egészséges és daganatos prosztatában (Colombel és mtsai 2005). Figyelemre méltó, hogy az erezettség és az infiltráló sejtek közötti összefüggést csupán peritumorálisan észleltük, intratumorálisan viszont nem. Ezt az eltérést esetleg az endotélsejtek megváltozott fenotípusával lehet magyarázni. Leírták, hogy a daganatasszociált kiserek endotélsejtjei számos adhéziós molekulát elveszítenek (McDonald és Foss 2002). Munkacsoportunk korábbi közleménye szerint az intratumorális (kooptált) erek endotélsejtjei melanómában fokozatosan elveszítik vaszkuláris adhéziós fehérje(VAP-1) expressziójukat (Forster-Horváth és mtsai 2004). Ez a molekula viszont központi szerepet tölt be a limfocita-endotélsejt interakcióban (Arvilommi és mtsai 1996). Ezek a változások jelentősen hozzájárulhatnak a melanómasejtekkel szembeni 54
immunreakció csökkenéséhez. Ezt támasztja alá az a megfigyelés is, hogy a VAP-1expresszió elvesztése rossz prognózissal járt együtt (Forster-Horváth és mtsai 2004). Az intratumorális immunsejt denzitás és az MVD közötti összefüggés hiánya azzal is magyarázható, hogy melanómában az intratumorális és a peritumorális erek eltérően fejlődnek. Munkacsoportunk korábbi megfigyelése szerint (Döme és mtsai 2002), a melanómán belüli endotélsejt proliferáció az erek dilatációját eredményezi, és nem pedig új erek keletkezését. A peritumorális területen viszont újonnan képződött erek jelennek meg, melyek kialakulását befolyásolhatják az infiltráló sejtek által termelt angiogén citokinek. Az a megfigyelésünk, hogy az MVD számos immunsejt (T- és B-limfocita, makrofág és dendritikus sejt) sűrűségével korrelált a 4 mm-nél vastagabb és a szervi metasztázist adó melanómákban, arra enged következtetni, hogy ez az immun-vaszkuláris hálózat elősegítheti a tumor progresszióját. Ezt támasztja alá az az eredményünk is, mely szerint a sokkal jobb prognózisú 1-2 mm-es melanómák csoportjában nem találtunk összefüggést a peritumorális érdenzitás és az infiltrátum között. Ugyanakkor ennek az összefüggésnek az ismerete talán segít megérteni a többnyire immunsejtek által infiltrált regressziós melanómák sűrűbb vaszkularizáltságát (Barnhill és Levy 1993), melynek prognosztikus jelentősége igen ellentmondásos az irodalom szerint (Prehn 1996, Ronan és mtsai 1987). Amint a disszertációból is kiderül, egyre több adat erősíti meg azt az elméletet, hogy a melanómát infiltráló sejtek azon túl, hogy tumorellenes hatással rendelkeznek, elősegíthetik a progressziót vagy toleranciát idézhetnek elő. Az immunsejtek előnyös tulajdonságainak kiaknázása céljából Rosenberg és mtsai. kidolgoztak egy olyan adoptív sejt transzfert, melynek során az autológ melanóma-reaktív limfociták és az IL-2 beadása előtt a gazdaszervezet limfocitáit ciklofoszfamiddal és fludarabinnal depletálták. Az objektív klinikai válaszráta 51% volt (Dudley és mtsai 2005). Lehet, hogy ez a jövő útja?
6.2 A hyperforin melanóma ellenes és angiogenezist gátló hatása Kutatómunkám másik célja a hyperforin endotélsejt- (humán dermális mikrovaszkuláris endotélsejt) és daganat (elsősorban melanóma) ellenes hatásának vizsgálata volt. Mivel a melanómasejtek kemoterapeutikumokkal és apoptózissal
55
szembeni rezisztenciája igen magas (Soengas és Lowe 2003), az újabb támadáspontú szerek kifejlesztése kiemelten fontos. A rezisztencia egyik meghatározó mechanizmusa, hogy a melanómasejtekben a κB kináz inhibitora konstitutívan aktív, s ez a Bcl-2 géncsalád transzkripcióját szabályozó NF- κB aktivációhoz vezet. Ez a folyamat azt eredményezi, hogy a melanómasejtek elkerülik az apoptózist (Yang és Richmond 2001). A hyperforin – a fibroszarkóma sejtvonal kivételével- hatékonyan gátolta 10 humán- és 7 patkány daganatsejtvonal proliferációját. Az melanóma sejtek osztódását — a többi sejtvonalhoz képest — a hyperforin közepesen gátolta. Mivel a citotoxikus gyógyszerek többsége a tumorsejtek apoptózisát eredményezi, megvizsgáltuk, hogy a hyperforin képes-e apoptózist indukálni a célsejtekben. A hyperforinnal kezelt sejtekben dózisfüggően alakultak ki apoptotikus oligonukleoszómák és az elektronmikroszkópos vizsgálat szerint apoptózisra jellemző elváltozások: a sejtmag kondenzációja, feltöredezése és citoplazmatikus ödéma (Schempp és mtsai 2002). Adataink arra utalnak, hogy a hyperforin az „intrinzik” útvonalon hozza létre a tumorsejtek apoptózisát, mivel a kaszpáz-9-et és kaszpáz-3-at aktiválja. A zVAD.fmk, mely egy általános kaszpáz-inhibitor, megakadályozta a sejtek apoptózisát a hyperforinnal kezelt daganatsejtekben. A
hyperforin
már
30
perccel
a
kezelés
után
a
mitokondrium
membránpotenciáljának megszűnését okozta. Továbbá morfológiai változásokat hozott létre a mitokondriumban 12 órával a kezelés után. Ezzel párhuzamosan a mitokondriumokból citokróm-c-kiáramlást detektáltunk (Schempp és mtsai 2002). Eredményeinket részben megerősítik Hostanska és mtsai megfigyelései is, akik két leukémia- (K562, U937) és egy glioblasztóma (LN229) sejtvonal proliferációjának gátlását tapasztalták hyperforin-kezelést követően. Ők is leírták a kaszpázaktiváció jelentőségét az apoptózis létrejöttében. Érdekes módon az U937 leukémia-sejtvonal apoptózisa során kaszpáz-3- és kaszpáz-9-aktivációt észleltek, a K562 leukémiasejtvonalnál viszont kaszpáz-3- és kaszpáz-8-aktivációt figyeltek meg. Ez utóbbi viszont az „extrinzik” apoptikus útvonal szerepére utal (Hostanska és mtsai 2003). Dona és mtsai a hyperforin diciklohexil-ammóniumsójának hatását vizsgálták. A hyperforin-DCHA apoptózis indukciójával gátolta az egér vastagbélrák- (C-26), melanóma- (B16-LU8) és prosztatakarcinóma- (TRAMP-1), valamint a humán 56
fibroszarkóma- (HT-1080) és neuroblasztóma-sejtek (SK-N-BE) proliferációját. A hyperforin-DCHA gátolta az extracelluláris mátrix lebontásában résztvevő leukocita elasztázt, katepszin G-t, az urokináz-típusú plazminogén-aktivátort és az ERK1-2 (extracelluláris szignál-regulált kináz) gátlásával az MMP-2 és MMP-9 szekréciójának csökkenését hozta létre. A hyperforin-diciklohexilamin (DCHA) a C-26 és a HT-1080 sejtek
kemoinvázióját
80
ill.
54%-ban
gátolta
a
módosított
Boyden-kamra
bazálmembránján. Az in vivo kísérlet során egerekbe iv. vastagbélrák- (C-26) ill. melanóma- (B16-LU8) sejteket juttattak, és az állatok felét hyperforin-DCHA-val kezelték intraperitoneálisan. A kezelés jelentősen csökkentette a tüdő gyulladásos sejt infiltrációját, neovaszkularizációját, valamint a tüdőmetasztázisok számát és méretét (Dona és mtsai 2004). Fontos kiemelni, hogy a hyperforin nem csak in vitro indukálta a daganatsejtek apoptózisát, hanem az MT-450 emlőkarcinóma sejtek proliferációját in vivo is gátolta immunkompetens Wistar patkányokban (Schempp és mtsai 2002). A daganat növekedését a hyperforin a paclitaxellel azonos mértékben gátolta akut toxicitás nélkül. A paclitaxelt széles körben használják az emlőrák kezelésében. A kísérlet során a paclitaxel dózisa tizede volt az állatkísérletek során általában használt dózisnak. Erre azért volt szükség, mert a lipofil hyperforin oldékonysága meglehetősen rossz vizes közegben, ugyanakkor egyenlő koncentrációban szerettük volna adni a két szert. A hyperforin rossz oldékonysága miatt később megtörtént a molekula módosítása. Az aristoforin vizes oldatban a hyperforinhoz viszonyítva lényegesen jobban oldódik és stabilabb is. Az in vitro és az in vivo kísérletek eredményei szerint daganatellenes hatása és alacsony toxicitása megegyezik a hyperforinéval (Gartner és mtsai 2005). Mivel a melanómasejtek ciklooxigenáz-1-et és ciklooxigenáz-2-t expresszálnak (Nicolaou és mtsai 2004), valamint a kísérletes és epidemiológiai adatok a nem szteroid gyulladáscsökkentők melanóma ellenes hatásáról számolnak be (Chiu és mtsai 2005, Harris és mtsai 2005, Ramirez és mtsai 2005), a hyperforin COX-1- és 5-LOX gátló hatása mindenképpen figyelmet érdemel. Elképzelhető, hogy ez a tulajdonság is hozzájárul a melanómasejtek proliferációjának gátlásához. A hyperforin tumor-angiogenezisre gyakorolt hatását in vitro humán dermális mikrovaszkuláris endotélsejteken (HDMEC) vizsgáltuk. A hyperforin dózisfüggő módon 57
gátolta a HDMEC sejtek proliferációját citotoxicitás és apoptózis indukciója nélkül. Az endotélsejtek tubulusképzését bazálmembrán-fehérjékből álló mátrixgélen vizsgáltuk videomikroszkóp alatt. Az endotélsejtek tubulusképzését megakadályozta az endotélsejttápoldathoz adott 5 µg/ml hyperforin. A mikroszkópos felvételeken látható, hogy a hyperforin a HDMEC sejtek morfológiáját, intercelluláris adhézióját és motilitását nem változtatta meg. A hyperforin angiogenezisre gyakorolt hatását in vivo patkány-modellben vizsgáltuk. A hyperforin a Wistar-patkányokba sc. adott MT-450 emlőkarcinóma sejtekből származó tumor növekedését apoptózis indukciójával gátolta, és a daganat neovaszkularizációját csökkentette a tumorstroma CD31-pozitív ereinek in situ festése szerint. Irodalmi adatok utalnak a COX-1- és 5-LOX inhibitorok angiogenezist gátló hatására (Sano és mtsai 2006, Ye és mtsai 2004), így lehetséges, hogy a hyperforin a ciklooxigenáz és a lipoxigenáz gátlásával is csökkenti a tumor vaszkularizációját. Az új kapillárisok létrejöttét angiogenetikus és anti-angiogenetikus faktorok szabályozzák. A daganatok által szekretált angiogenin-1, savas- és bázikus fibroblasztnövekedési faktor valamint a VEGF gyorsítják az angiogenezis folyamatát. Hypoxia hatására megnő a daganatok VEGF-termelése, melynek következtében megnő a vaszkuláris permeabilitás és megkezdődik az új kapillárisok képződése (Detmar és mtsai 1997). A VEGF- és a VEGF-receptor elleni antitestek gátolják a daganatok növekedését, neovaszkularizációját és metasztázisképzését (Drevs és mtsai 2000, Schlaeppi JM és Wood 1999). Ezért megvizsgáltuk, vajon a hyperforin angiogenezist gátló képessége összefüggésben áll-e a daganatok VEGF-szekréciójának gátlásával. Az in vivo kísérletben is használt MT-450 emlőkarcinóma-sejteket in vitro hyperforinnal inkubáltuk, és mértük a sejtek VEGF-szekrécióját. A hyperforin dózisfüggő módon gátolta az MT450 sejtek VEGF-termelését. Elképzelhető, hogy a VEGF szekréciójának csökkenése részben a hyperforin citosztatikus hatásának tulajdonítható. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy a hyperforin amellett, hogy közvetlenül gátolja az endotélsejtek osztódását és kapillárisképzését, a daganatok VEGF-szekréciójának csökkentésével közvetve is akadályozza az angiogenezist. 58
A hyperforin citosztatikus és anti-angiogenetikus hatásával ideális daganatellenes szernek mutatkozik, mely mindenképpen további kutatásokat érdemel. Melanómaellenes hatása is igen biztató, mivel a melanómasejtek apoptózis rezisztenciáját leküzdve képes ezekben a sejtekben is apoptózist indukálni. A hyperforin angiogenezist gátló hatása is előnyös lehet a melanóma kezelésében, bár az eddig kipróbált vaszkularizációt gátló szerek nem voltak hatékonyak a klinikai vizsgálatok szerint. Kiemelném, hogy a hyperforint antidepresszánsként évek óta széles körben használják minimális toxicitással. Legfontosabb mellékhatása, hogy a máj citokróm P-450-rendszerét aktiválja, mely számos gyógyszerrel és citosztatikummal interakciót okozhat. Mivel az orbáncfű Európában, Észak-Amerikában, Ázsiában és Észak-Afrikában nagy mennyiségben megtalálható, a hyperforin előállítása sem korlátozott.
59
7 Következtetések •
Azon megfigyelésünk, hogy az intratumorális és peritumorális CD68+ makrofág denzitás szignifikánsan magasabb volt a 2 mm-nél vastagabb melanómákban, arra utal, hogy ezen sejteknek tumorprogressziót elősegítő szerepük lehet. Ebből a szempontból különösen érdekes, hogy férfiakban volt kimutatható a legnagyobb makrofág infiltráció.
•
A magas érett (DC-LAMP+) dendritikus sejtes infiltráció kedvező prognózis markerének tűnik a bőr melanómájában.
•
Csak peritumorálisan és elsősorban a vastag és áttétes daganatok esetében találtunk összefüggést a melanómák mikroérhálózata és az infiltráló sejtek (T-, B, dendritikus- és makrofág-) denzitása között. Ezen adatok is arra utalhatnak, hogy melanómában elsősorban peritumorálisan történik neoangiogenezis.
•
A
hyperforin
hatékonyan
gátolta
melanómasejtek
és
humán
dermális
mikrovaszkuláris endotélsejtek proliferációját, amely megfigyelések további klinikai fejlesztések alapja lehet.
60
8 Összefoglalás Kutatócsoportunk a mikrovaszkuláris denzitás (MVD) és daganatot infiltráló immunsejtek közötti összefüggést vizsgálta kután melanómában. Kutatómunkám további célja a hyperforin in vitro és in vivo daganat- és endotélsejt-ellenes hatásának vizsgálata volt. A limfocita-szubpopulációk, makrofágok, dendritikus sejtek és CD34+ erek denzitását ötvenkét beteg, 1 mm-nél vastagabb melanóma-mintáján vizsgáltuk immunhisztokémiai módszerrel. 16 humán- és 7 patkány sejtvonalon, valamint humán dermális mikrovaszkuláris endoteliális sejteken tanulmányoztuk a hyperforin proliferációt gátló hatását. Az intratumorális MVD nem mutatott szignifikáns összefüggést az infiltráló sejtekkel. Peritumorálisan, az egész betegpopulációt vizsgálva, a CD3+ T-sejteknél találtunk szignifikáns korrelációt a mikrovaszkuláris denzitással. Ez az összefüggés erősebb volt a legnagyobb vastagsági kategóriában (>4,0 mm) valamint a távoli áttétet adó daganatok csoportjában. Ezekben az alcsoportokban hasonló jelenséget tapasztaltunk a CD8+ T-sejtek vizsgálatakor is. További összefüggést találtunk a 4,0 mm-nél vastagabb melanómáknál a makrofágdenzitással valamint a szervi áttétet adó melanómák esetében a B-sejtek és a dendritikus sejtek sűrűségével. Ugyanakkor az intratumorális MVD és a makrofáginfiltráció szignifikánsan magasabb volt a férfiak csoportjában. A hyperforin gátolta a daganatsejtek proliferációját és apoptózist indukált. A humán dermális mikrovaszkuláris endotélsejtek (HDMEC) proliferációját viszont apoptózis és toxicitás nélkül csökkentette. Továbbá extracelluláris mátrixon a hyperforin megakadályozta a HDMEC sejtek kapillárisképzését. Wistar patkányokban a hyperforin gátolta az emlődaganat (MT-450) növekedését, valamint a tumor vaszkularizációját. Mivel a tumort infiltráló immunsejtek és a vaszkularizáció szimultán változásának klinikai eredményét jelenleg nehéz megmondani, további klinikopatológiai vizsgálatokra van szükség. A kevés mellékhatással rendelkező hyperforin ígéretes daganatellenes és antiangiogenikus szernek tűnik.
61
9 Summary We analyzed the relationship among microvessel density (MVD) and tumor infiltrating cells in cutaneous malignant melanoma. We also studied the effect of hyperforin on tumor- and endothelial cell growth in vitro and in vivo. The density of lymphocyte subpopulations, macrophages, dendritic cells and +
CD34 microvessels was determined by immunohistochemistry in primary tumor samples from fifty-two patients with melanoma thicker than 1 mm. The antiproliferative effect of hyperforin was studied on 16 human- and 7 rat cell lines and on human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC). Intratumoral MVD did not show significant association with infiltration for any of these cell types. In the case of peritumoral reactive cell densities analyzed in the whole patient population, significant correlation was found with CD3+ T-cell density. This association was stronger in melanomas >4.0 mm and in visceral metastatic tumors. In these subgroups similar phenomenon was observed for CD8+ cells. We found significant correlation of MVD with CD68+ macrophage density only in the highest thickness category, and weak associations with B-cell and dendritic cell infiltration in visceral metastatic cases. MVD did not vary significantly in tumors categorized according to thickness, localization, ulceration or histological type. However, both intratumoral MVD and macrophage infiltration were significantly higher in male patients compared to females. Hyperforin inhibited tumor cell proliferation and induced apoptosis. In vitro, hyperforin blocked microvessel formation of HDMEC on a complex extracellular matrix. Furthermore, hyperforin reduced proliferation of HDMEC, without displaying toxic effects or inducing apoptosis. In Wistar rats hyperforin inhibited tumor growth and reduced tumor vascularization. Since the net outcome of the enrichment in tumor-infiltrating host cells and in tumor vascularization cannot be easily predicted, further clinicopathological studies are needed on human skin melanoma patients. Hyperforin holds the promise of being an interesting antineoplastic and antiangiogenic agent with low toxicity.
62
10 Irodalomjegyzék 1.
Aklilu M, Stadler WM, Markiewicz M, Vogelzang NJ, Mahowald M, Johnson M, Gajewski TF. Depletion of normal B cells with rituximab as an adjunct to IL2 therapy for renal cell carcinoma and melanoma. Ann Oncol 15(7): 1109-1114 (2004)
2.
Albert D, Zundorf I, Dingermann T, Muller WE, Steinhilber D, Werz O. Hyperforin is a dual inhibitor of cyclooxygenase-1 and 5-lipoxygenase. Biochem Pharmacol 64: 1767-1775 (2002)
3.
Arici A, Senturk LM, Seli E, Bahtiyar MO, Kim G. Regulation of monocyte chemotactic protein-1 expression in human endometrial stromal cells by estrogen and progesterone. Biol Reprod 61: 85-90 (1999)
4.
Arvilommi AM, Salmi M, Kalimo K, Jalkanen S. Lymphocyte binding to vascular endothelium in inflamed skin revisited: a central role for vascular adhesion protein-1 (VAP-1). Eur J Immunol 26: 825-833 (1996)
5.
Aso H, Tamura K, Yoshie O, Nakamura T, Kikuchi S, Ishida N. Impaired NK response of cancer patients to IFN-alpha but not to IL-2: correlation with serum immunosuppressive acidic protein (IAP) and role of suppressor macrophage. Microbiol Immunol 36(10): 1087-1097 (1992)
6.
Balch CM, Buzaid AC, Soong S-J, Atkins MB, Cascinelli N, Coit DG, Fleming ID, Gerschenwald JE, Houghton A Jr., Kirkwood JM, McMasters KM, Mihm MF, Morton DL, Reintgen DS, Ross MI, Sober A, Thompson JA, and Thompson JF. Final version of the American Joint Committee on Cancer staging system for cutaneous melanoma. J Clin Oncol 19: 3635-3648 (2001)
7.
Barnhill RL, Fine JA, Roush GC, Berwick M. Predicting five-year outcome for patients with cutaneous melanoma in a population-based study. Cancer 78(3): 427-432 (1996)
8.
Barnhill RL, Levy MA. Regressing thin cutaneous malignant melanomas (< or = 1.0 mm) are associated with angiogenesis. Am J Pathol 143: 99-104 (1993)
63
9.
Becker JC, Brabletz T, Czerny C, Termeer C, Bröcker EB. Tumor escape mechanisms from immunosurveillance: induction of unresponsiveness in a specific MHC-restricted CD4+ human T cell clone by the autologous MHC class II+ melanoma. Internat Immunol 5: 1501-1508 (1993)
10.
Bedogni B, Powell MB. Skin hypoxia: a promoting environmental factor in melanomagenesis. Cell Cycl (12): 1258-1261 (2006)
11.
Bellone G, Aste-Amezaga M, Trinchieri G, Rodeck U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol 1;155(3): 1066-1073 (1995)
12.
Bertolini F, Shaked Y, Mancuso P, Kerbel RS. The multifaceted circulating endothelial cell in cancer: towards marker and target identification. Nat Rev Cancer 6(11): 835-845 (2006)
13.
Bingle L, Brown NJ, Lewis CE. The role of tumour-associated macrophages in tumour progression: implications for new anticancer therapies. J Pathol 196(3): 254-265 (2002)
14.
Bröcker EB, Zwadlo G, Holzmann B, Macher E, Sorg C. Inflammatory cell infiltrates in human melanoma at different stages of tumor progression. Int J Cancer 41: 562-567 (1988)
15.
Buhlmann JE, Foy TM, Aruffo A, Crassi KM, Ledbetter JA, Green WR, Xu JC, Shultz LD, Roopesian D, Flavell RA. In the absence of a CD40 signal, B cells are tolerogenic. Immunity 2(6): 645-653 (1995)
16.
Busam KJ, Berwick M, Blessing K, Fandrey K, Kang S, Karaoli T, Fine J, Cochran AJ, White WL, Rivers J et al. Tumor vascularity is not a prognostic factor for malignant melanoma of the skin. Am J Pathol 147: 1049-1056 (1995)
17.
Bystrov NS, Chernov BK, Dobrynin VN, Kolosov MN. The structure of hyperforin. Tetrahedron Lett 32: 2791-2794 (1975)
18.
Castellano M, Parmiani G. Genes involved in melanoma: an overview of INK4a and other loci. Melanoma Res 9(5): 421-432 (1999)
19.
Chaux P, Moutet M, Faivre J, Martin F, Martin M. Inflammatory cells infiltrating human colorectal carcinomas express HLA class II but not B7-1 and B7-2 costimulatory molecules of the T-cell activation. Lab Invest 74: 975-983 (1996) 64
20.
Chiu LC, Tong KF, Ooi VE. Cytostatic and cytotoxic effects of cyclooxygenase inhibitors and their synergy with docosahexaenoic acid
nt he growth of human
skin melanoma A-375 cells. Biomed Pharmacother 59 Suppl 2: S293-297 (2005) 21.
Clark WH Jr, Elder DE, Guerry D 4th, Braitman LE, Trock BJ, Schultz D, Synnestvedt M, Halpern AC. Model predicting survival in stage I melanoma based on tumor progression. J Natl Cancer Inst 81(24): 1893-1904 (1989)
22.
Clemente CG, Mihm MC Jr, Bufalino R, Zurrida S, Collini P, Cascinelli N. Prognostic value of tumor infiltrating lymphocytes in the vertical growth phase of primary cutaneous melanoma. Cancer 77(7): 1303-1310 (1996)
23.
Colombel M, Filleur S, Fournier P, Merle C, Guglielmi J, Courtin A, Degeorges A, Serre CM, Bouvier R, Clezardin P, Cabon F. Androgens repress the expression of the angiogenesis inhibitor thrombospondin-1 in normal and neoplastic prostate. Cancer Res 65: 300-308 (2005)
24.
Conejo-Garcia JR, Benencia F, Courreges MC, Kang E, Mohamed-Hadley A, Buckanovich RJ, Holtz DO, Jenkins A, Na H, Zhang L, Wagner DS, Katsaros D, Caroll R, Coukos G. Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A. Nat Med 10(9): 950-958 (2004)
25.
Cormier SA, Taranova AG, Bedient C, Nguyen T, Protheroe C, Pero R, Dimina D, Ochkur SI, O’Neill K, Colbert D, Lombari TR, Constant S, McGarry MP, Lee JJ, Lee NA. Pivotal Advance: eosinophil infiltration of solid tumors is an early and persistent inflammatory host response. J Leukoc Biol 79(6): 1131-1139 (2006)
26.
Coukos G, Benencia F, Buckanovich RJ, Conejo-Garcia JR. The role of dendritic cell precursors in tumour vasculogenesis. Br J Cancer 92: 1182-1187 (2005)
27.
Curiel TJ, Cheng P, Mottram P, Alvarez X, Moons L, Evdemon-Hogan M, Wei S, Zou L, Kryczek I, Hoyle G, Lackner A, Carmeliet P, Zou W. Dendritic cell subsets differentially regulate angiogenesis in human ovarian cancer. Cancer Res 64: 5535-5538 (2004)
65
28.
Dadras SS, Paul T, Bertoncini J, Brown LF, Muzikansky A, Jackson DG, Ellwanger U, Garbe C, Mihm MC, Detmar M. Tumor lymphangiogenesis: a novel prognostic indicator for cutaneous melanoma metastasis and survival. Am J Pathol 162: 1951-1960 (2003)
29.
Davidson B, Goldberg I, Gotlieb WH, Lerner-Geva L, Ben-Baruch G, Agulansky L, Novikov I, Kopolovic J. Macrophage infiltration and angiogenesis in cervical squamous cell carcinoma — clinicopathologic correlation. Acta Obstet Gynecol Scand 78: 240-244 (1999)
30.
De Larco JE, Wuertz BR, Furcht LT. The potential role of neutrophils in promoting the metastatic phenotype of tumors releasing interleukin-8. Clin Cancer Res 1;10(15): 4895-4900 (2004)
31.
Depasquale I, Thompson WD. Microvessel density for melanoma prognosis. Histopathology 47: 186-194 (2005)
32.
Detmar M, Brown LF, Berse B, Jackman RW, Elicker BM, Dvorak HF, Claffey KP. Hypoxia regulates the expression of vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor (VPF/VEGF) and its receptors in human skin. J Invest Dermatol 108: 263-268 (1997)
33.
DeVita VT, Hellman S, Rosenberg SA. Cancer: Principles and Practice of Oncology 5th Edition, Lippincott-Raven Publishers 1948-1950 (1997)
34.
Dikov MM, Ohm JE, Ray N, Tchekneva EE, Burlison J, Moghanaki D, Nadaf S, Carbone DP. Differential roles of vascular endothelial growth factor receptors 1 and 2 in dendritic cell differentiation. J Immunol 174(1): 215-222 (2005)
35.
Dissemond J, Weimann TK, Schneider LA, Schneeberger A, ScharffetterKochanek K, Goos M, Wagner SN. Activated neutrophils exert antitumor activity against human melanoma cells: reactive oxygen species-induced mechanisms and their modulation by granulocyte-macrophage-colonystimulating factor. J Invest Dermatol 121(4): 936-938 (2003)
36.
Dobos J, Tímár J, Bocsi J, Burián Z, Nagy K, Barna G, Petak I, Ladányi A. In vitro and in vivo antitumor effect of 2-methoxyestradiol on human melanoma. Int J Cancer 112: 771-776 (2004)
66
37.
Dobozy A, Horváth A, Hunyadi J, Schneider I. Bőrgyógyászat. Eklektikon Kiadó és Nyomdai Szolgáltató Kft., Budapest, 262-265 (1998)
38.
Döme B, Hendrix MJ, Paku S, Tóvári J, Timár J. Alternative vascularization mechanisms in cancer: pathology and therapeutic implications. Am J Pathol 170(1): 1-15 (2007)
39.
Döme B, Paku S, Somlai B, Tímár J. Vascularization of cutaneous melanoma involves vessel co-option and has clinical significance. J Pathol 97: 355-362 (2002)
40.
Dona M, Dell’Aica I, Pezzato E, Sartor L, Calabrese F, Della Barbera M, Donella-Deana A, Appendino G, Borsarini A, Caniato R, Garbisa S. Hyperforin inhibits cancer invasion and metastasis. Cancer Res 1;64(17): 6225-6232 (2004)
41.
Drevs J, Hofmann I, Hugenschmidt H, Wittig C, Madjar H, Müller M, Wood J, Martiny-Baron G, Unger C, Marmé D. Effects of PTK787/ZK 222584, a specific inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases on primary tumor, metastasis, vessel density, and blood flow in a murine renal cell carcinoma model. Cancer Res 60: 4819-4824 (2000)
42.
Dudley ME, Wunderlich JR, Yang JC, Sherry RM, Topalian SL, Restifo NP, Royal RE, Kammula U, White DE, Mavroukakis SA, Rogers LJ, Gracia GJ, Jones SA, Mangiameli DP, Pelletier MM, Gea-Banacloche J, Robinson MR, Berman DM, Filie AC, Abati A, Rosenberg SA. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol 23(10): 2346-2357 (2005)
43.
Eisen T, Ahmad T, Flaherty KT, Gore M, Kaye S, Marais R, Gibbens I, Hackett S, James M, Schuchter LM, Nathanson KL, Xia C, Simantov R, Schwartz B, Poulin-Costello M, O’Dwyer PJ, Ratain MJ. Sorafenib in advanced melanoma: a Phase II randomised discontinuation trial analysis. Br J Cancer 95(5): 581-586 (2006)
44.
Elgert KD, Alleva DG, Mullins DW. Tumor-induced immune dysfunction: the macrophage connection. J Leukoc Biol 64(3): 275-290 (1998)
67
45.
Elias EG, Zapas JL, Beam SL, Brown SD. GM-CSF and IL-2 combination as adjuvant therapy in cutaneous melanoma: early results of a phase II clinical trial. Oncology 19(4 Suppl 2): 15-18 (2005)
46.
Enk AH, Jonuleit H, Saloga J, Knop J. Dendritic cells as mediators of tumorinduced tolerance in metastatic melanoma. Int J Cancer 73: 309-316 (1997)
47.
Esche C, Lokshin A, Shurin GV, Gastman BR, Rabinowich H, Watkins SC, Lotze MT, Shurin MR. Tumor’s other immune targets: dendritic cells. J Leukoc Biol 66: 336-344 (1999)
48.
Facchetti F, Vermi W, Mason D, Colonna M. The plasmacytoid monocyte/interferon producing cells. Virchows Arch 443: 703-717 (2003)
49.
Fargnoli MC, Argenziano G, Zalaudek I, Peris K. High- and low-penetrance cutaneous melanoma susceptibility genes. Expert Rev Anticancer Ther 6(5): 657-670 (2006)
50.
Fiedler U, Christian S, Koidl S, Kerjaschki D, Emmett MS, Bates DO, Christofori G, Augustin HG. The sialomucin CD34 is a marker of lymphatic endothelial cells in human tumors. Am J Pathol 168(3): 1045-1053 (2006)
51.
Forster-Horváth C, Döme B, Paku S, Ladányi A, Somlai B, Jalkanen S Tímár J. Loss of vascular adhesion protein-1 expression in intratumoral microvessels of human skin melanoma. Melanoma Res 14: 135-140 (2004)
52.
Fotsis T, Zhang Y, Pepper MS, Adlercreutz H, Montesano R, Nawroth PP, Schweigerer L. The endogenous oestrogen metabolite 2-methoxyoestradiol inhibits angiogenesis and suppresses tumour growth. Nature 368: 237-239 (1994)
53.
Freeman MR, Schneck FX, Gagnon ML, Corless C, Soker S, Niknejad K, Peoples GE, Klagsbrun M. Peripheral blood T lymphocytes and lymphocytes infiltrating human cancers express vascular endothelial growth factor: a potential role for T cells in angiogenesis. Cancer Res 55: 4140-4145 (1995)
68
54.
Fujita M, Norris DA, Yagi H, Walsh P, Morelli JG, Weston WL, Terada N, Bennion SD, Robinson W, Lemon M, Maxwell IH, Yohn JJ. Overexpression of mutant ras in human melanoma increases invasiveness, proliferation and anchorage-independent growth in vitro and induces tumor formation and cachexia in vivo. Melanoma Res 9(3): 279-291 (1999)
55.
Gabrilovich DI, Chen HL, Girgis KR, Cunningham T, Meny GM, Nadaf S, Kavanaugh D, Carbone DP. Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells. Nat Med 2: 1096-1103 (1996)
56.
Gartner M, Müller T, Simon JC, Giannis A, Sleeman JP. Aristoforin, a novel stable derivative of hyperforin, is a potent anticancer agent. Chembiochem 6(1): 171-177 (2005)
57.
Geissmann F, Revy P, Regnault A, Lepelletier Y, Dy M, Brousse N, Amigorena S, Hermine O, Durandy A. TGF-β1 prevents the noncognate maturation of human dendritic Langerhans cells. J Immunol 162: 4567-4575 (1999)
58.
Glatz-Krieger K, Pache M, Tapia C, Fuchs A, Savic S, Glatz D, Mihatsch M, Meyer P. Anatomic site-specific patterns of gene copy number gains in skin, mucosal, and uveal melanomas detected by fluorescence in situ hybridization. Virchows Arch 449(3): 328-333 (2006)
59.
Grande Sarpa H, Reinke K, Shaikh L, Leong SP, Miller JR 3rd, Sagebiel RW, Kashani-Sabet M. Prognostic significance of extent of ulceration in primary cutaneous melanoma. Am J Surg Pathol 30(11): 1396-1400 (2006)
60.
Gross J, Azizkhan RG, Biswas C, Bruns RR, Hsieh DS, Folkman J. Inhibition of tumor growth, vascularization, and collagenolysis in the rabbit cornea by medroxyprogesterone. Proc Natl Acad Sci U S A 78: 1176-1180 (1981)
61.
Hammer H, Toth-Molnar E, Olah J, Dobozy A. Connection between uveal melanoma and dysplastic naevus syndrome. Magy Onkol 49(1): 15-18 (2005)
62.
Hanada T, Nakagawa M, Emoto A, Nomura T, Nasu N, Nomura. Prognostic value of tumor-associated macrophage count in human bladder cancer. Int J Urol 7: 263-269 (2000)
69
63.
Harris RE, Beebe-Donk J, Doss H, Burr Doss D. Aspirin, ibuprofen, and other non-steroidal anti-inflammatory drugs in cancer prevention: a critical review of non-selective COX-2 blockade. Oncol Rep 13(4): 559-583 (2005)
64.
Heinzerling L, Burg G, Dummer R, Maier T, Oberholzer PA, Schultz J, Elzaouk L, Pavlovic J, Moelling K. Intratumoral injection of DNA encoding human interleukin 12 into patients with metastatic melanoma: clinical efficacy. Hum Gene Ther 16(1): 35-48 (2005)
65.
Hornstein OP, Weidner F. Relationship between vascularization, inflammatory infiltration and prognosis in malignant melanoma. Arch Dermatol Forsch 244: 224-230 (1972)
66.
Hostanska K, Reichling J, Bommer S, Weber M, Saller R. Hyperforin, a constituent of St. John’s wort (Hypericum perforatum L.) extract induces apoptosis by triggering activation of caspases and with hypericin synergistically exerts cytotoxicity towards human malignant cell lines. Eur J Pharm Biopharm 56: 121-132 (2003)
67.
Ilmonen S, Kariniemi AL, Vlaykova T, Muhonen T, Pyrhonen S, AskoSeljavaara S. Prognostic value of tumour vascularity in primary melanoma. Melanoma Res 9: 273-278 (1999)
68.
Inoshima N, Nakanishi Y, Minami T, Izumi M, Takayama K, Yoshino I, Hara N. The influence of dendritic cell infiltration and vascular endothelial growth factor expression on the prognosis of non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 8: 3480-3486 (2002)
69.
Inoue S, Leitner WW, Golding B, Scott D. Inhibitory effects of B cells on antitumor immunity. Cancer Res 1;66(15): 7741-7747 (2006)
70.
Kalinski P, Mailliard RB, Giermasz A, Zeh HJ, Basse P, Bartlett DL, Kirkwood JM, Lotze MT, Herberman RB. Natural killer-dendritic cell cross-talk in cancer immunotherapy. Expert Opin Biol Ther 5(10): 1303-1315 (2005)
71.
Kanda N, Watanabe S. 17beta-estradiol, progesterone, and dihydrotestosterone suppress the growth of human melanoma by inhibiting interleukin-8 production. J Invest Dermatol 117(2): 274-283 ( 2001)
70
72.
Kashani-Sabet M, Sagebiel RW, Ferreira CM, Nosrati M, Miller JR 3rd. Tumor vascularity in the prognostic assessment of primary cutaneous melanoma. J Clin Oncol 20: 1826-1831 (2002)
73
Kemény MM, Busch E, Stewart AK, Menck HR. Superior survival of young women with malignant melanoma. Am J Surg 175: 437-444 (1998)
74.
Kim-Schulze S, McGowan KA, Hubchak SC, Cid MC, Martin MB, Kleinman HK, Greene GL, Schnaper HW. Expression of an estrogen receptor by human coronary artery and umbilical vein endothelial cells. Circulation 94: 1402-1407 (1996)
75.
Kirkin AF, Dzhandzhugazyan K, Zeuthen J. Melanoma-associated antigens recognized by cytotoxic T lymphocytes. APMIS 106(7): 665-679 (1998)
76.
Klenke FM, Gebhard MM, Ewerbeck V, Abdollahi A, Huber PE, Sckell A. The selective Cox-2 inhibitor Celecoxib suppresses angiogenesis and growth of secondary bone tumors: an intravital microscopy study in mice. BMC Cancer 6: 9 (2006)
77.
Koch AE, Polverini PJ, Kunkel SL, Harlow LA, DiPietro LA, Elner VM. Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis. Science 258: 1798 (1992)
78.
Kraut EH, Walker MJ, Staubus A, Gochnour D, Balcerzak SP. Phase II trial of topotecan in malignant melanoma. Cancer Invest 15(4): 318-320 (1997)
79.
Kuenen BC, Tabernero J, Baselga J, Cavalli F, Pfanner E, Conte PF, Seeber S, Madhusudan S, Deplanque G, Huisman H, Scigalla P, Hoekman K, Harris AL. Efficacy and toxicity of the angiogenesis inhibitor SU5416 as a single agent in patients with advanced renal cell carcinoma, melanoma, and soft tissue sarcoma. Clin Cancer Res 9(5): 1648-1655 (2003)
80.
Lackner C, Jukic Z, Tsybrovskyy O, Jatzko G, Wette V, Hoefler G, Klimpfinger M, Denk H, Zatloukal K. Prognostic relevance of tumour-associated macrophages and von Willebrand factor-positive microvessels in colorectal cancer. Virchows Arch 445: 160-167 (2004)
71
81.
Ladányi A, Kiss J, Somlai B, Gilde K, Fejős Z, Mohos A, Gaudi I, Tímár J. Density of DC-LAMP+ mature dendritic cells in combination with activated T lymphocytes infiltrating primary cutaneous melanoma is a strong independent prognostic factor. Cancer Immunol Immunother Epub DOI 10.1007/s00262-0070286-3 (2007)
82.
Ladányi A, Somlai B, Gilde K, Fejős Zs, Gaudi I, Tímár J. T-cell activation marker expression on tumor-infiltrating lymphocytes as prognostic factor in cutaneous malignant melanoma. Clin Cancer Res 10(2): 521-530 (2004)
83.
Larsen TE, Grude TH. A retrospective histological study of 669 cases of primary cutaneous malignant melanoma in clinical stage I. The relation of dermal solar elastosis to sex, age and survival of the patient and to localization, histological type and level of invasion of the tumour. Acta Pathol Microbiol Scand 87A(5): 361-366 (1979)
84.
Le QT, Denko NC, Giaccia AJ. Hypoxic gene expression and metastasis. Cancer Metastasis Rev 23(3-4): 293-310 (2004)
85.
Lee A, Frischer J, Serur A, Huang J, Bae JO, Kornfield ZN, Eljuga L, Shawber CJ, Feirt N, Mansukhani M, Stempak D, Baruchel S, Bender JG, Kandel JJ, Yamashiro DJ. Inhibition of cyclooxygenase-2 disrupts tumor vascular mural cell recruitment and survival signaling. Cancer Res 66(8): 4378-4384 (2006)
86.
Lee PP, Yee C, Savage PA, Fong L, Brockstedt D, Weber JS, Johnson D, Swetter S, Thompson J, Greenberg PD, Roederer M, Davis MA. Characterization of circulating T cells specific for tumor-associated antigens in melanoma patients. Nature Med 5: 677-685 (1999)
87.
Leek RD, Lewis CE, Whitehouse R, Greenall M, Clarke J, Harris AL. Association of macrophage infiltration with angiogenesis and prognosis in invasive breast carcinoma. Cancer Res 56: 4625 (1996)
88.
Lejeune FJ, Lienard D, Matter M, Ruegg C. Efficiency of recombinant human TNF in human cancer therapy. Cancer Immun 6: 6 (2006)
72
89.
Leveque L, Dalac S, Dompmartin A, Louvet S, Euvrard S, Catteau B, Hazan M, Schollhamer M, Aubin F, Dreno B, Daguin P, Chevrant-Breton J, Frances C, Bismuth MJ, Tanter Y, Lambert D. Melanoma in organ transplant patients. Ann Dermatol Venereol 127(2): 160-165 (2000)
90.
Lewis C, Murdoch C. Macrophage responses to hypoxia: implications for tumor progression and anti-cancer therapies. Am J Pathol 167(3): 627-635 (2005)
91.
Losordo DW, Isner JM. Estrogen and angiogenesis: a review. Arterioscler Thromb Vasc Biol 21: 6-12 (2001)
92.
Mabjeesh NJ, Willard MT, Frederickson CE, Zhong H, Simons JW. Androgens stimulate hypoxia-inducible factor 1 activation via autocrine loop of tyrosine kinase receptor/phosphatidylinositol 3’-kinase/protein kinase B in prostate cancer cells. Clin Cancer Res 9: 2416-2425 (2003)
93.
Madtes DK, Raines EW, Sakariassen KS, Assoian RK, Sporn MB, Bell GI. Induction of transforming growth factor-alpha in human alveolar macrophages. Cell 53: 285 (1988)
94.
Makitie T, Summanen P, Tarkkanen A, Kivela T. Tumor-infiltrating macrophages (CD68+ cells) and prognosis in malignant uveal melanoma. Invest Ophthalmol Vis Sci 42(7): 1414-1421 (2001)
95.
Mantovani A, Bottazzi B, Colotta F, Sozzani S, Ruco L. The origin and function of tumor-associated macrophages. Immunol Today 13(7): 265-270 (1992)
96.
Marcoval J, Moreno A, Graells J, Vidal A, Escriba JM, Garcia-Ramirez M, Fabra A. Angiogenesis and malignant melanoma. Angiogenesis is related to the development of vertical (tumorigenic) growth phase. J Cutan Pathol 24: 212-218 (1997)
97.
Marincola FM, Jaffee EM, Hicklin DJ, Ferrone S. Escape of human solid tumors from T-cell recognition: molecular mechanisms and functional significance. Adv Immunol 74: 181-273 (2000)
98.
McDonald DM, Foss AJE. Endothelial cells of tumor vessels: abnormal but not absent. Cancer Metastasis Rev 19: 109-120 (2002)
99.
Miller JG, Mac Neil S. Gender and cutaneous melanoma. Br J Dermatol 136: 657-665 (1997) 73
100.
Mita MM, Rowinsky EK, Forero L, Eckhart SG, Izbicka E, Weiss GR, Beeram M, Mita AC, de Bono JS, Tolcher AW, Hammond LA, Simmons P, Berg K, Takimoto C, Patnaik A. A phase II, pharmacokinetic, and biologic study of semaxanib and thalidomide in patients with metastatic melanoma. Cancer Chemother Pharmacol 59(2): 165-174 (2007)
101.
Müller WE, Singer A, Wonnemann M, Hafner U, Rolli M, Schafer C. Hyperforin represents the neurotransmitter reuptake inhibiting constituent of hypericum extract. Pharmacopsychiatry 31: 16-21 (1998)
102.
Murray JL, Kleinerman ES, Jia SF, Rosenblum MG, Eton O, Buzaid A, Legha S, Ross MI, Thompson L, Mujoo K, Rieger PT, Saleh M, Khazaeli MB, VadhanRaj S. Phase Ia/Ib trial of anti-GD2 chimeric monoclonal antibody 14.18 (ch14.18) and recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rhGM-CSF) in metastatic melanoma. J Immunother Emphasis Tumor Immunol 19(3): 206-217 (1996)
103.
Nicolaou A, Estdale SE, Tsatmali M, Herrero DP, Thody AJ. Prostaglandin production by melanocytic cells and the effect of alpha-melanocyte stimulating hormone. FEBS Lett 570(1-3): 223-226 (2004)
104.
Ono M, Torisu H, Fukushi J-I, Nishie A, Kuwano M. Biological implications of macrophage infiltration in human tumor angiogenesis. Cancer Chemother Pharmacol 43: 69-71 (1999)
105.
Otto S, Kásler M. Trends in cancer mortality and morbidity in Hungarian and international statistics. Characteristics and potential outcome of public health screening programs. Magy Onkol 49(2): 99-101, 103-107 (2005)
106.
Owen JL, Iragavarapu-Charyulu V, Gunja-Smith Z, Herbert LM, Grosso JF, Lopez DM. Up-regulation of matrix metalloproteinase-9 in T lymphocytes of mammary tumor bearers: role of vascular endothelial growth factor. J Immunol 171: 4340-4351 (2003)
107.
Peng SH, Deng H, Yang JF, Xie PP, Li C, Li H, Feng DY. Significance and relationship between infiltrating inflammatory cell and tumor angiogenesis in hepatocellular carcinoma tissues. World J Gastroenterol 11: 6521-6524 (2005)
74
108.
Pisarra P, Mortarini R, Salvi S, Anichini A, Parmiani G, Sensi M. High frequency of T cell clonal expansions in primary human melanoma. Involvement of a dominant clonetype in autologous tumor recognition. Cancer Immunol Immunother 48: 39-46 (1999)
109.
Poblete-Gutierrez P, Burgdorf WH, Has C, Berneburg M, Frank J. Hereditary photodermatoses. Hautarzt 57(12): 1067-1082 (2006)
110.
Prehn RT. The paradoxical association of regression with a poor prognosis in melanoma contrasted with a good prognosis in keratoacanthoma. Cancer Res 56: 937-940 (1996)
111.
Pribluda VS, Gubish ER Jr, Lavallee TM, Treston A, Swartz GM, Green SJ. 2Methoxyestradiol: an endogenous antiangiogenic and antiproliferative drug candidate. Cancer Metastasis Rev 19: 173-179 (2000)
112.
Qin Z, Schwartzkopff J, Pradera F, Kammertoens T, Seliger B, Pircher H, Blankenstein T. A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by CD8+ T cells. Cancer Res 63: 4095-4100 (2003)
113.
Quirt I, Bodurth A, Lohmann R, Rusthoven J, Belanger K, Young V, Wainman N, Stewar W, Eisenhauer E; National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group. Phase II study of marimastat (BB-2516) in malignant melanoma: a clinical and tumor biopsy study of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group. Invest New Drugs 20(4): 431-437 (2002)
114.
Ragnarsson-Olding BK. Primary malignant melanoma of the vulva—an aggressive tumor for modeling the genesis of non-UV light-associated melanomas. Acta Oncol 43(5): 421-435 (2004)
115.
Ramirez CC, Ma F, Federman DG, Kirsner RS. Use of cyclooxygenase inhibitors and risk of melanoma in high-risk patients. Dermatol Surg 31: 748-752 (2005)
116.
Reiriz AB, Richter MF, Fernandes S, Cancela AI, Costa TD, Di Leone LP, Schwartsmann G. Phase II study of thalidomide in patients with metastatic malignant melanoma. Melanoma Res 14(6): 527-531 (2004)
75
117.
Ribatti D, Ennas MG, Vacca A, Ferreli F, Nico B, Orru S, Sirigu P. Tumor vascularity and tryptase-positive mast cells correlate with a poor prognosis in melanoma. Eur J Clin Invest 33(5): 420-425 (2003)
118.
Riboldi E, Musso T, Moroni E, Urbinati C, Bernasconi S, Rusnati M, Adorini L, Presta M, Sozzani S. Cutting edge: proangiogenic properties of alternatively activated dendritic cells. J Immunol 175(5): 2788-2792 (2005)
119.
Ronan SG, Eng AM, Briele HA, Shioura NN, Das Gupta TK. Thin malignant melanomas with regression and metastases. Arch Dermatol 123: 1326-1330 (1987)
120.
Roth L. Hypericum – Hypericin. Botanik, Inhaltsstoffe, Wirkungen. Ecomed Arzneipflanzen-Monographie. Ecomed, Németország: Landsberg/Lech (1990)
121.
Saito H, Tsujitani S, Ikeguchi M, Maeta M, Kaibara N. Relationship between the expression of vascular endothelial growth factor and the density of dendritic cells in gastric adenocarcinoma tissue. Br J Cancer 78: 1573-1577 (1998)
122.
Sano H, Noguchi T, Miyajima A, Hashimoto Y, Miyachi H. Anti-angiogenic activity of basic-type, selective cyclooxygenase (COX)-1 inhibitors. Bioorg Med Chem Lett 16(11): 3068-3072 (2006)
123.
Schadendorf D, Kohlmus C, Gawlik C, Suter L, Czarnetzki BM. Mast cells in melanocytic tumours. Arch Dermatol Res 287(5): 452-456 (1995)
124.
Schempp CM, Kirkin V, Simon-Haarhaus B, Kersten A, Kiss J, Termeer CC, Gilb B, Kaufmann T, Borner C, Sleeman JP, Simon JC. Inhibition of tumour cell growth by hyperforin, a novel anticancer drug from St. John’s wort that acts by induction of apoptosis. Oncogene 21: 1242-1250 (2002)
125.
Schempp CM, Pelz K, Wittmer A, Schöpf E, Simon JC. Antibacterial activity of hyperforin from St. John’s wort, against multiresistant Staphylococcus aureus and gram-positive bacteria. Lancet 353: 2129 (1999)
126.
Schempp CM, Windeck T, Hezel S, Simon JC. Topical treatment of atopic dermatitis with St. John’s wort cream – a randomized, placebo controlled, double blind half-side comparison. Phytomedicine Supplement IV: 31-37 (2003)
76
127.
Schempp CM, Winghofer B, Lüdtke R, Simon-Haarhaus B, Schöpf E, Simon JC. Topical application of St. John’s wort (Hypericum perforatum) and of its metabolite hyperforin inhibits the allostimulatory capacity of epidermal cells. Brit J Dermatol 142: 979-984 (2000)
128.
Schlaeppi J-M, Wood JM. Targeting vascular endothelial growth factor (VEGF) for anti-tumor therapy, by anti –VEGF neutralizing monoclonal antibodies or by VEGF receptor tyrosine-kinase inhibitors. Cancer Metast Rev 18: 473-481 (1999)
129.
Seli E, Pehlivan T, Selam B, Garcia-Velasco JA, Arici A. Estradiol downregulates MCP-1 expression in human coronary artery endothelial cells. Fertil Steril 77: 542-547 (2002)
130.
Seo KH, Lee HS, Jung B, Ko HM, Choi JH, Park SJ, Choi IH, Lee HK, Im SY. Estrogen enhances angiogenesis through a pathway involving platelet-activating factor-mediated nuclear factor-kappaB activation. Cancer Res 64: 6482-6488 (2004)
131.
Shortman K, Liu YJ. Mouse and human dendritic cell subtypes. Nat Rev Immunol 21: 151-161 (2002)
132.
Siegal FP, Kadowaki N, Shodell M, Fitzgerald-Bocarsly PA, Shah K, Ho S, Antonenko S, Liu YJ. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science 284: 1835-1837 (1999)
133.
Singh RK, Gutman M, Radinsky R, Bucana CD, Fidler IJ. Expression of interleukin 8 correlates with the metastatic potential of human melanoma cells in nude mice. Cancer Res 15;54(12): 3242-3247 (1994)
134.
Smyth MJ, Hayakawa Y, Takeda K, Yagita H. New aspects of natural-killer-cell surveillance and therapy of cancer. Nat Rev Cancer 2(11): 850-861 (2002)
135.
Soengas MS, Lowe SW. Apoptosis and melanoma chemoresistance. Oncogene 22(20): 3138-3151 (2003)
136.
Sondergaard K, Schou G. Prognostic factors in primary cutaneous malignant melanoma. Am J Dermatopathol 7 Suppl:1-4 (1985)
77
137.
Spyridopoulos I, Sullivan AB, Kearney M, Isner JM, Losordo DW. Estrogenreceptor-mediated inhibition of human endothelial cell apoptosis. Estradiol as a survival factor. Circulation 95: 1505-1514 (1997)
138.
Steinbrink K, Jonuleit H, Müller G, Schuler G, Knop J, Enk AH. Interleukin-10treated human dendritic cells induce a melanoma-antigen-specific anergy in CD8+ T cells resulting in a failure to lyse tumor cells. Blood 93: 1634-1642 (1999)
139.
Stene MA, Babajanians M, Bhuta S, Cochran AJ. Quantitative alterations in cutaneous Langerhans cells during the evolution of malignant melanoma of the skin. J Invest Dermatol 91: 125-128 (1988)
140.
Straten PT, Becker JC, Guldberg P, Zenthen J. In situ T-cells in melanoma. Cancer Immunol Immunother 34: 386-395 (1999)
141.
Straume O, Akslen LA.Increased expression of VEGF-receptors (FLT-1, KDR, NRP-1) and thrombospondin-1 is associated with glomeruloid microvascular proliferation, an aggressive angiogenic phenotype, in malignant melanoma. Angiogenesis 6(4): 295-301 (2003)
142.
Straume O, Jackson DG, Akslen LA. Independent prognostic impact of lymphatic vessel density and presence of low-grade lymphangiogenesis in cutaneous melanoma. Clin Cancer Res 9(1): 250-256 (2003)
143.
Straume O, Salvesen HB, Akslen LA. Angiogenesis is prognostically important in vertical growth phase melanomas. Int J Oncol 15: 595-599 (1999)
144.
Sunderkötter C, Steinbrink K, Goebeler M, Bhardwaj R, Sorg C. Macrophages and angiogenesis. J Leukoc Biol 55: 410-422 (1994)
145.
Thorn M, Ponten F, Bergstrom R, Sparen P, Adami HO. Clinical and histopathologic predictors of survival in patients with malignant melanoma: a population-based study in Sweden. J Natl Cancer Inst 86(10): 761-769 (1994)
146.
Tobal K, Deuble K, McCartney A, Lightman S. Characterization of cellular infiltration in choroidal melanoma. Melanoma Res 3(1): 63-65 (1993)
147.
Tomita M, Matsuzaki Y, Onitsuka T. Effect of mast cells on tumor angiogenesis in lung cancer. Ann Thorac Surg 69: 1686-1690 (2000)
78
148.
Torisu H, Ono M, Kiryu H, Furue M, Ohmoto Y, Nakayama J, Nishioka Y, Sone S, Kuwano M. Macrophage infiltration correlates with tumor stage and angiogenesis in human malignant melanoma: possible involvement of TNFalpha and IL-1alpha. Int J Cancer 85: 182-188 (2000)
149.
Toriyama K, Wen DR, Paul E, Cochran AJ. Variations in the distribution, frequency, and phenotype of Langerhans cells during the evolution of malignant melanoma of the skin. J Invest Dermatol 100: 269-273 (1993)
150.
Tóth-Jakatics R, Jimi S, Takebayashi S, Kawamoto N. Cutaneous malignant melanoma: correlation between neovascularization and peritumor accumulation of mast cells overexpressing vascular endothelial growth factor. Hum Pathol 31(8): 955-960 (2000)
151.
Tucker GC. Integrins: molecular targets in cancer therapy. Curr Oncol Rep 8(2): 96-103 (2006)
152.
Tuna B, Yorukoglu K, Unlu M, Mungan MU, Kirkali Z. Association of mast cells with microvessel density in renal cell carcinomas. Eur Urol 50: 530-534 (2006)
153.
Udey MC. Skin dendritic cells in immunity and autoimmunity. J Investig Dermatol Symp Proc 9: 15-17 (2004)
154.
Van Coillie E, Van Aelst I, Wuyts A, Vercauteren R, Devos R, De Wolf-Peeters C, Van Damme J, Opdenakker G. Tumor angiogenesis induced by granulocyte chemotactic protein-2 as a countercurrent principle. Am J Pathol 159(4): 14051414 (2001)
155.
Vandenabeele S, Wu L. Dendritic cell origins: Puzzles and paradoxes. Immunol Cell Biol 77: 411-419 (1999)
156.
Varney ML, Johansson SL, Singh RK. Tumour-associated macrophage infiltration, neovascularization and aggressiveness in malignant melanoma: role of monocyte chemotactic protein-1 and vascular endothelial growth factor-A. Melanoma Res 15: 417-425 (2005)
157.
Weidner N. Intratumoral microvessel density as a prognostic factor in cancer. Am J Pathol 147: 9-19 (1995)
79
158.
Willmore-Payne C, Holden JA, Tripp S, Layfield LJ. Human malignant melanoma: detection of BRAF- and c-kit-activating mutations by high-resolution amplicon melting analysis. Hum Pathol 36(5): 486-493 (2005)
159.
Wright-Browne V, McClain KL, Talpaz M, Ordonez N, Estrov Z. Physiology and pathophysiology of dendritic cells. Human Pathol 28: 563-579 (1997)
160.
Yang J, Richmond A. Constitutive IκB kinase activity correlates with nuclear factor-κB activation in human melanoma cells. Cancer Res 61: 4901-4909 (2001)
161.
Ye YN, Liu ES, Shin VY, Wu WK, Cho CH. Contributory role of 5lipoxygenase and its association with angiogenesis in the promotion of inflammation-associated colonic tumorigenesis by cigarette smoking. Toxicology 203(1-3): 179-188 (2004)
162.
Zuo CH, Li ZR, Zhou X, Ouyang YZ, Zhou ZY, Zeng L. Inhibitory effects of cyclooxygenase-2 inhibitor celecoxib on growth and angiogenesis of human liver cancer HepG2 cell xenografts in small nude mice. Ai Zheng 25(4): 414-420 (2006)
80
11 A disszertáció témakörében megjelent közlemények
1.
Schempp CM, Kirkin V, Simon-Haarhaus B, Kersten A, Kiss J, Termeer CC, Gilb B, Kaufmann T, Borner C, Sleeman JP, Simon JC. Inhibition of tumour cell growth by hyperforin, a novel anticancer drug from St. John's wort that acts by induction of apoptosis. Oncogene 21(8): 1242-1250 (2002)
2.
Schempp CM1, Kiss J1, Kirkin V, Averbeck M, Simon-Haarhaus B, Kremer B, Termeer CC, Sleeman J, Simon JC. Hyperforin acts as an angiogenesis inhibitor. Planta Med 71(11): 999-1004 (2005) 1
3.
The authors contributed equally to this work
Ladányi A, Kiss J, Somlai B, Gilde K, Fejős Z, Mohos A, Gaudi I, Tímár J. Density of DC-LAMP+ mature dendritic cells in combination with activated T lymphocytes infiltrating primary cutaneous melanoma is a strong independent prognostic factor. Cancer Immunol Immunother PMID: 17279413. Epub 2007 Feb 6 (2007)
4.
Kiss J, Tímár J, Somlai B, Gilde K, Fejős Z, Gaudi I, Ladányi A. Association of microvessel density with infiltrating cells in human cutaneous melanoma. Pathol Oncol Res 13(1): 21-31. Epub 2007 Mar 27 (2007)
81
12 Köszönetnyilvánítás Szeretném megköszönni témavezetőimnek Prof. Tímár Józsefnek, Dr. Ladányi Andreának és Dr. Christoph Schemppnek, hogy PhD-munkám során megfelelő támogatást nyújtottak kutatásaimhoz. Ugyanakkor hálával tartozom Dr. Somlai Beátának, Dr. Gilde Katalinnak, Dr. Fejős Zsuzsannának és Dr. Bánfalvi Teodórának a beteganyaggal
kapcsolatos
információk
rendelkezésemre
bocsátásááért
valamint
onkodermatológiai tapasztalataik átadásáért. Köszönöm Gaudi Istvánnak a statisztikai elemzésben nyújtott segítségét. Az immunhisztokémiai eljárás megtanításában valamint a melanóma-minták lemetszésében nagyon sokat segített Rázsóné Tamási Anna, Piurkó Violetta, Gregor Viktória, Parragné Derecskei Katalin és Sinkáné Ibolya. Freiburgi munkámban sok támogatást nyújtott Birgit Haarhaus valamint a labor többi dolgozója.
82
