DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS TAVASZI JUDIT

DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS

TAVASZI JUDIT

KESZTHELY 2012

1

PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR ÁLLAT- ÉS AGRÁRKÖRNYEZET-TUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA

Iskolavezető: Dr. habil. Anda Angéla az MTA doktora

Témavezető: Dr. Budai Péter

MEZŐGAZDASÁGI VEGYI ANYAGOK IRRITATÍV HATÁSAINAK IN VITRO TOXIKOLÓGIAI VIZSGÁLATA DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS

Készítette: Tavaszi Judit

KESZTHELY 2012

2

MEZŐGAZDASÁGI VEGYI ANYAGOK IRRITATÍV HATÁSAINAK IN VITRO TOXIKOLÓGIAI VIZSGÁLATA Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Tavaszi Judit Készült a Pannon Egyetem Állat- és Agrárkörnyezet-tudományi Doktori Iskolája keretében

Témavezető: Dr. Budai Péter Elfogadásra javaslom (igen / nem) …........................ aláírás A jelölt a doktori szigorlaton…......... %-ot ért el

Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: …........................ …................. igen / nem ………………………. aláírás Bíráló neve: …........................ …................. igen / nem ………………………. aláírás

A jelölt az értekezés nyilvános vitáján…..........%-ot ért el Veszprém/Keszthely, …………………………. …………………………. a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minősítése….................................

………………………… az EDT elnöke

3

TARTALOMJEGYZÉK 1. KIVONATOK......................................................................................................................... 6 1.1. MAGYAR NYELVŰ KIVONAT ...........................................................................................................6 1.2. ANGOL NYELVŰ KIVONAT ..............................................................................................................8 1.3. NÉMET NYELVŰ KIVONAT ..............................................................................................................8

2. BEVEZETÉS .......................................................................................................................... 9 3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ................................................................................................. 12 3.1. ALTERNATÍV MÓDSZEREK ............................................................................................................12 3.1.1. In vitro módszerek................................................................................................................................ 13 3.1.2. Alacsonyabb rendű szervezetek felhasználása ..................................................................................... 13 3.1.3. Immunológiai technikák....................................................................................................................... 13 3.1.4. Mennyiségi szerkezet-aktivitás összefüggés analízis............................................................................ 14 3.1.5. Élettani folyamatok matematikai modellezése ..................................................................................... 14 3.1.6. Emberi modellek .................................................................................................................................. 14 3.1.7. Más alternatív módszerek .................................................................................................................... 14

3.2. A SZEMIRRITÁCIÓ VIZSGÁLATA ALTERNATÍV MÓDSZEREKKEL ...................................................15 3.2.1. Embrionált tojás felhasználása ............................................................................................................ 15 3.2.1.1. A madarak embrionális fejlődése ................................................................................................. 15 3.2.1.1.1. A chorioallantois membrán ................................................................................................... 18 3.2.1.2. A tojások előkészítése ................................................................................................................. 23 3.2.1.2.1. A légkamrán keresztüli behatolás.......................................................................................... 23 3.2.1.2.2. Behatolás a tojás egyenlítőjén át .......................................................................................... 25 3.2.1.3. A chorioallantois membrán felhasználása .................................................................................... 27 3.2.2. A chorioallantois membránt felhasználó tesztek .................................................................................. 28 3.2.2.1. Chorioallantoic Membrane Vascular Assay (CAMVA) ............................................................... 28 3.2.2.2. Chorioallantoic Membrane – Trypan blue festés (CAM-TB)....................................................... 29 3.2.2.3. Hen’s Egg Test - Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) ......................................................... 29 3.2.3. A citotoxicitási vizsgálatok alkalmazása.............................................................................................. 29

3.3. A SZEM FELÉPÍTÉSE .....................................................................................................................30

4. ANYAG ÉS MÓDSZER....................................................................................................... 34 4.1. VIZSGÁLATI MÓDSZEREK .............................................................................................................34 4.1.1. HET-CAM teszt .................................................................................................................................... 34 4.1.2. MTT-Assay ........................................................................................................................................... 37 4.1.3. A Draize-féle primer szemirritációs teszt............................................................................................. 39

4.2. VIZSGÁLATI ANYAGOK .................................................................................................................46 4.2.1. A vizsgálatban felhasznált növényvédő szerek ..................................................................................... 46 4.2.1.1. Inszekticidek ................................................................................................................................. 46 4.2.1.2. Herbicidek..................................................................................................................................... 47 4.2.1.3. Fungicidek..................................................................................................................................... 48 4.2.1.4. Tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények.................................................................. 48

5.1. A HET-CAM TESZTBŐL SZÁRMAZÓ EREDMÉNYEK .....................................................................49 5.1.1. Inszekticidek......................................................................................................................................... 49 5.1.2. Herbicidek............................................................................................................................................ 51 5.1.3. Fungicidek ........................................................................................................................................... 53 5.1.4. Tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények ......................................................................... 54

5.2. A CITOTOXICITÁSI VIZSGÁLAT EREDMÉNYEI ...............................................................................56 4

5.2.1. Inszekticidek......................................................................................................................................... 56 5.2.2. Herbicidek............................................................................................................................................ 56 5.2.3. Fungicidek ........................................................................................................................................... 57 5.2.4. Tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények ......................................................................... 58

5.3. A DRAIZE-TESZTBŐL SZÁRMAZÓ EREDMÉNYEK ..........................................................................58 5.3.1. Inszekticidek......................................................................................................................................... 58

6. MEGBESZÉLÉS................................................................................................................... 68 6.1. AZ INSZEKTICIDEK EREDMÉNYEINEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA .........................................................68 6.2. A HERBICIDEK EREDMÉNYEINEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA ................................................................69 6.3. A FUNGICIDEK EREDMÉNYEINEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA ................................................................70 6.4. A TÁPANYAG-VISSZAPÓTLÁSRA ALKALMAZHATÓ KÉSZÍTMÉNYEK EREDMÉNYEINEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA ............................................................................................................................71 6.5. A CITOTOXICITÁSI VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI ..........................................................................72 6.6. A HET-CAM TESZT ÉS A DRAIZE-FÉLE TESZT EREDMÉNYEINEK STATISZTIKAI VIZSGÁLATA....73 6.7. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK ...........................................................................................74

7. ÖSSZEFOGLALÁS.............................................................................................................. 77 8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS............................................................................................... 82 9. IRODALOMJEGYZÉK........................................................................................................ 83 10. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK .............................................................................. 92

5

1. KIVONATOK 1.1. Magyar nyelvű kivonat A szerző a kísérletei során a mezőgazdaságban használt vegyi anyagok irritációs potenciálját vizsgálta az in vitro HET-CAM (Hen’s Egg Test – Chorioallantoic Membrane) teszttel, valamint a Draize-féle in vivo módszerrel. A vegyi anyagokat a vizsgálatok eredményei alapján irritációs kategóriákba sorolta, és a különböző vizsgálattípusokkal kapott eredményeket összevetette.

A kísérletek során a HET-CAM teszt mellett az anyagok irritációs potenciálját in vitro citotoxicitási teszttel is mérte (MTT Assay), melynek eredményeit szintén összehasonlította a HET-CAM és a Draize tesztből származó adatokkal.

Az in vitro HET-CAM teszt a nemzetközi szakirodalmak alapján eddig korlátozott mértékben került alkalmazásra; elfogadása, engedélyezése jelenleg folyamatban van. Az in vitro és in vivo eredmények összevetése alapján próbált további adatokat szolgáltatni arra, hogy a HET-CAM teszt mennyiben tükrözi a jelenleg elfogadott in vivo Draize-féle módszer eredményeit, ezáltal alkalmas lehet-e az élő állaton végzett kísérletek kiváltására. Az in vitro HET-CAM tesztet az Invittox Protocol 47. száma alapján végezte el.

A tyúktojások 10 napi keltetése után a mészhéj és héjmembrán óvatos eltávolítása után a kísérleti anyagokat a megfelelő fejlettségi állapotú chorioallantois membránra cseppentette, és meghatározott ideig figyelemmel követte a membránon bekövetkező elváltozásokat. A megfigyelt változások feljegyzése után a kiértékelést egy számítógépes program alapján végezte el, majd az így kapott irritációs indexeket irritációs kategóriákba sorolta, ami az összehasonlítás alapjául szolgált.

A Draize-féle primer szemirritációs tesztet az OECD 405 guideline irányelvei alapján végezte. A tesztelendő anyagot az állat egyik szemének kötőhártya zsákjába helyezte, a szemeket pár másodpercig óvatosan zárva tartotta, ezután 1, 24, 48, 72 órával, majd 1, ill. 2 héttel a kezelés után a tünetek erősségét feljegyezte. A kiértékelés a módszer által előírt pontozási és klasszifikációs rendszer alapján történt. 6

A vizsgálatokban alkalmazott agrokemikáliák in vitro HET-CAM tesztből származó eredményei jó korrelációt mutattak az in vivo adatokkal. A citotoxicitási vizsgálatokból származó eredményeket az Draize féle primer módszer eredményeivel összevetve szintén jó korrelációt mutattak az in vivo adatokkal. A kísérletben alkalmazott mezőgazdasági vegyi anyagok in vivo és in vitro eredményeinek összehasonlításából és a szakirodalomban fellelhető eredményekből a szerző megállapította, hogy a HET-CAM teszt az in vivo Draize-féle primer szemirritációs vizsgálat elővizsgálataként (pre-screen) alkalmazható, teljes egészében történő kiváltására azonban jelenlegi formában nem alkalmas. Az in vitro HET-CAM teszt fontos eleme lehet azon in vitro tesztrendszernek, amely a jövőben képes lesz az in vivo Draize-féle szemirritációs vizsgálat kiváltására.

7

1.2. Angol nyelvű kivonat

The author examined the irritation potential of 45 different agrochemicals following the worldwide accepted in vivo Draize method (described in OECD 405) and two in vitro methods, the HET-CAM test (Hen’s Egg Test – Chorioallantois Membrane) and the MTTAssay. A comparative screening was performed with the 45 agrochemicals to establish parallel data on the in vitro (HET-CAM test, MTT-Assay) and in vivo (Draize) results.

The thesis provides new data from the in vitro methods used during the experiments, in comparison to the in vivo data. Based on the results, the HET-CAM test or the MTT-Assay as single methods can not replace the Draize rabbit eye test but can be useful components of an in vitro system.

1.3. Német nyelvű kivonat

Die Verfasserin hat im Laufe ihrer Versuche die Irritation von 45 verschiedenen Pflanzenschutz-Mitteln mit 2 in vitro Methoden untersucht. Eine von den meist studiertesten alternativ Methode, der Hühner Ei Test – Chorioallanoic Membrane (HET-CAM), und ein Zell-Giftwirkungs Test, das MTT-Assay waren dabei verwendet worden. Wegen der parallel Ergebnisse von in vitro (HET-CAM, MTT-Assay) und in vivo Untersuchungen. Der Draize Hasen Augen Irritation Test ist auch verrichtet geworden. Die Experimente lieferten neue Daten von den verwendeten alternativ Methoden verglichen mit den in vivo Ergebnissen. Auf Grund dieser Daten, des HET-CAM Test und dem des MTT-Assay sind wertvolle voruntersuchungs- Methoden in verzeichnen von Augen Irritation. Die toxikologischen Tests für Registration von Agrochemikalien, der in vitro HETCAM Test oder MTT-Assay können den in vivo Draize Test nicht ersetzen aber beide können praktische Teile von einem in vitro System sein.

8

2. BEVEZETÉS A Föld növekvő lakossága és a növekvő élelmiszer igények egyre magasabb szintű követelményeket támasztanak a mezőgazdasággal szemben. Az ipar, a települések és a közlekedés térhódítása, valamint a természetvédelem erősödése a rendelkezésre álló területen elérhető hozam növelését követeli meg a mezőgazdaságtól. A fenntartható fejlődés azonban csak az integrált növényvédelem céltudatos alkalmazásával valósítható meg. Ezt az elvet követve a kémiai növényvédelem mellett a fizikai és biológiai védekezés is megjelenik, amely bizonyos mértékben visszaszorítja ugyan, de teljes mértékben nem pótolhatja a vegyszeres beavatkozásokat; a kémiai növényvédelem továbbra is az egyik legfontosabb védekezési eljárás a mezőgazdasági termelésben.

Felmérések szerint a kultúrnövényeket károsító élő szervezetek (gombák, baktériumok, rovarok stb.) napjainkban világszerte átlagosan mintegy 35%-kal csökkentik a mezőgazdasági terméshozamokat. Ebből az állati kártevők, elsősorban a rovarok 14%, a mikroorganizmusok, főleg a gombák 12%, a gyomnövények 9% termésveszteséget okoznak. A növényvédelem feladata, hogy kiküszöbölje ezeket a káros hatásokat és biztonságossá tegye a termelést (Gáborjányi és mtsai, 1995).

A növényvédő szerek azonban a gyakorlati alkalmazás során a nem-célszervezetekre is hatást gyakorolnak, közvetlenül vagy közvetve károsíthatják az élővilágot. A talajba kerülve az ott élő ökoszisztémát, a talajvízbe, felszíni vizekbe jutva a vízi szervezeteket károsíthatják; a táplálékláncban való feldúsulás esetén a végső fogyasztó, az ember is érintetté válhat.

A növényvédő szerekkel foglalkozó ember a munkája során (napi gyakorisággal) kerülhet érintkezésbe a vegyi anyagokkal. A kijuttatás alkalmával a helyi elváltozás (károsodás), az érintett területről való felszívódás után a szisztémás mérgezés esélye is számottevő. A testfelszín vonatkozásában helyi mérgezés során különböző mértékű szem- és bőrkárosodással kell számolnunk. A szembe jutott mérgező anyagok az enyhe, reverzibilis kötőhártya gyulladástól kezdve súlyos és maradandó szemkárosodást, szaruhártyahomályt, sőt vakságot és egyéb életveszélyes károsodást okozhatnak (Bordás, 1971).

9

A mezőgazdasági vegyi anyagok forgalomba hozatalát napjainkban számos toxikológiai vizsgálat előzi meg. Ezek, a készítmények olyan tulajdonságait tárják fel, amelyek a humán egészségkockázat és a természetkárosodás kockázatának jellemzéséhez szükségesek. A szemirritáció mértékének meghatározására jelenleg a Draize-féle, nyúlon végzett tesztből származó eredményeket fogadják el, ezen teszt alapján becsülik az esetleges emberi expozíció során várható szemkárosodást. Mivel a kísérlet az állatra nézve jelentős fájdalommal járhat, több olyan alternatív módszer áll fejlesztés alatt, ami később az in vivo tesztet felválthatja. A primer szemirritáció területén az OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) 1987-ben beleegyezett abba, hogy a jól érvényesített in vitro tesztekből származó adatokat elfogadják az in vivo adatok helyett. A perspektivikus alternatív módszerek közé tartoznak a tyúktojás chorioallantois membránját (CAM) használó in vitro vizsgálati módszerek is (Walum és mtsai, 1992). Mivel a vizsgálat a tesztszervezetre nézve fájdalommal jár, így az erősödő állatvédelmi mozgalmak hatására több olyan alternatív eljárást fejlesztettek ki, amelyek alkalmazásával az in vivo tesztekben használt állatok száma csökkenthető. Az experimentális toxikológia valamennyi szakterületén megjelentek a különböző in vitro, ill. alternatív módszerek, de általánosan elmondható, hogy jelenleg még az in vitro módszerek nem válthatják ki teljes egészében az in vivo kísérleteket.

A HET-CAM (Hen’s Egg Test – Chorioallantois Membrane) teszttel az embrionálódott tyúktojás chorioallantois membránjának (CAM) reakciója alapján jelezhetjük előre a vegyi anyag irritációs potenciálját (Walum és mtsai., 1992). Az aktív vérkeringéssel rendelkező CAM a szemhez hasonlóan reagál a különböző anyagok kémiai károsító hatásaira (Leighton és mtsai., 1985). A HET-CAM tesztet ez idáig elsősorban kozmetikumok, ipari és háztartási vegyi anyagok irritatív potenciáljának meghatározására használták, mezőgazdasági vegyi anyagok tesztelésére kevésbé, így az általam elvégzett vizsgálatok a vegyi anyag típusát illetően hiánypótló jellegűek.

Vizsgálataim során célul tűztem ki a különböző mezőgazdasági vegyi anyagok, növényvédő szerek és tápanyag-visszapótlásra használható készítmények in vitro vizsgálattal történő irritációs potenciáljának meghatározását. A vizsgálati anyagként alkalmazott készítmények kiválasztásánál figyelembe vettem az irodalmi irritációs adatokat, és a nem irritatív vegyületektől az erősen irritatív vegyületekig az irritációs skálának megfelelően vontam be a mezőgazdasági vegyi anyagokat a kísérletekbe.

10

Vizsgálataim során összesen 50, a nem irritatív és irritatív kategóriákba eső mezőgazdasági vegyi anyag irritációs potenciálját vizsgáltam in vitro HET-CAM teszttel és in vivo Draize-féle primer szemirritációs vizsgálattal. 12 vizsgálati anyag esetében in vitro citotoxikológiai vizsgálatot is végeztem, az eredményeket pedig az in vivo módszerrel és a HET-CAM teszttel kapott eredményekhez hasonlítottam. A kiértékelés során arra a kérdésre próbáltam választ adni, hogy az in vitro technikák (HET-CAM teszt és az MTT-Assay) önmagukban vagy tesztrendszer formájában alkalmasak lehetnek-e az in vivo Draize-teszt jövőbeni kiváltására.

11

3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3.1. Alternatív módszerek A mezőgazdasági vegyi anyagok forgalomba hozatalát megelőző toxikológiai vizsgálatokban a szemirritáció meghatározására jelenleg az élő nyulakon elvégzett vizsgálatok eredményeit fogadják el. Az erősödő állatvédő mozgalmak hatására több olyan alternatív módszert is kidolgoztak, amely nem csak csökkentheti az emlős kísérleti állatok számát, hanem esetleg teljes mértékben ki is válthatja ezek felhasználását.

Az állatkísérletek kiváltására, ill. a kísérletben felhasznált állatok számának, szenvedéseinek csökkentésére irányuló törekvések Russel és Burch 1959-es ún 3R szabályánál gyökereznek. A 3R a szabály alapjául szolgáló helyettesítés (Replacement), finomítás (Refinement) és létszámcsökkentés (Reduction) szavak kezdőbetűiből áll. A 3R szabály megjelenése után egyre több olyan módszert próbáltak bevezetni, mely állatvédelmi szempontból pozitívabb megítélésben tüntette fel az engedélyezés folyamán megkövetelt vizsgálatokat.

Alternatív módszernek tekintünk minden olyan kísérleti módszert és eljárást, amely képes az állatkísérleteket helyettesíteni vagy a kísérletben felhasznált állatok számát csökkenteni, illetve a kísérleti körülményeket finomítva a kísérleti állatok szenvedéseit mérsékelni (Nab és mtsai, 1993). Bár az alternatív módszerek alkalmazása főként állatvédelmi okokra vezethető vissza, ezen módszerek számos előnnyel bírnak a hagyományos in vivo tesztekkel szemben. Elterjedésükben az etikai szempontokon felül szerepet játszott a gazdaságos és időtakarékos kivitelezhetőség, de a jó standardizálhatóság is nagy előnyként említhető. Alkalmazásuk általában gyorsabb eredményt ad, a költségeik alacsonyabbak, a kivitelezés egyszerűbb, a körülmények jobban befolyásolhatóak, mint élő állat esetén, ami bizonyos fokú szabványosítást tesz lehetővé. Nem alkalmas azonban hosszabb távú hatás kimutatására; a modellrendszer reakciója nem azonos egy élő szervezet reakciójával (Nab és mtsai, 1993), az élő szervezet komplexitását nem tükrözi.

A FRAME (Fund for the Replacement of Animal in Medical Experiments) brit szervezet osztályozása alapján az alternatív módszerek 7 kategóriába sorolhatók:

12

3.1.1. In vitro módszerek

A kísérleti állatok helyettesítésére, számának csökkentésére irányulnak az in vitro technikák, ahol a kísérleti anyag toxikológiai jellemzőinek meghatározása nem élő állaton, hanem szerven, szervrendszeren, szöveten stb. történik. Leggyakrabban a sejt- és szövetkultúrákat alkalmazzák. Az élő sejteket, szöveteket laboratóriumi körülmények között, de az élő szervezeten kívüli tenyészközegben tartják életben. A szervek esetén a sejtek és a szerven belüli szövetek közötti kapcsolat megmarad, míg a sejtkultúrákban (sejtszuszpenzió) nincs kapcsolat az egyes sejtek között.

Egyszerűsége és gyorsasága miatt az in vitro tesztekben nem követhető nyomon az élő állat szervezetének immunválasza és regenerációja sem, ami egy valós expozíció esetén bekövetkezhetne.

3.1.2. Alacsonyabb rendű szervezetek felhasználása

Az

alacsonyabb

rendű

szervezeteket

felhasználó

tesztekben

gyakran

alkalmaznak

baktériumokat, gombákat vagy rovarokat. Mutagén hatás megítélésére jelenleg az Escherichia coli triptofán negatív és a Salmonella typhimurinum hisztidin negatív törzseit (Maron és Ames, 1983) használó AMES teszt a legelterjedtebb. Ezen törzsek szervetlen sókat és glükózt tartalmazó táptalajon képtelenek a növekedésre, és így telepek képzésére. Amennyiben a tesztanyag hatására a genetikai állományukban mutáció történik, a táptalajon telepek kifejlődése figyelhető meg (Ames és mtsai., 1975). Egyszerű és gyors kivitelezhetősége miatt széles körben alkalmazzák vegyi anyagok mutagén hatásainak becslésére.

3.1.3. Immunológiai technikák

Immunológiai technikák képezik az alapját több in vitro módszernek. Alkalmazásuk főleg diagnosztikumok tesztelésében, vakcinák kipróbálásában terjedt el. E terület olyan jól ismert technikákat foglal magába, mint a Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), a Hemagglutination Assay (HA) és a Radioimmunassay (RIA). Ezek az in vitro módszerek nagyon érzékenyek, de néhány esetben a specificitás hiánya az antigének vagy az antitestek szétválasztásakor megköveteli az állatkísérletek elvégzését (Nab és mtsai, 1993).

13

3.1.4. Mennyiségi szerkezet-aktivitás összefüggés analízis Bizonyított, hogy a vegyi anyagok molekuláris szerkezete és biológiai aktivitásuk között összefüggés áll fent. Számítógépes program segítségével a biológiai hatás megbecsülhető, de bizonyos paraméterek ismeretében akár új molekulák is tervezhetők. Ezen eljárás alapján csökkenthető az állatokon tesztelt kísérleti anyagok száma (Nab és mtsai, 1993) és felgyorsítható a fejlesztés fázisa.

3.1.5. Élettani folyamatok matematikai modellezése A matematikai egyenletek képesek leírni számos élettani, toxikológiai és biokémiai folyamatot. A számítógépes szimuláció tapasztalati adatokon alapul, így képes lehet az ismert hatások összegzésére, összehasonlításra, és bár a módszer reális kísérleti eredményt adhat, ezek a vizsgálatok csak közelítik a valóságot, így eredményeik csak egyéb (általában in vivo) tesztekből származó adatokkal alátámasztva fogadhatók el (Carson, 1986).

3.1.6. Emberi modellek Bár a toxikológiai vizsgálatok nagyrészt a humán expozíció esetén bekövetkező hatást hivatottak előjelezni – így a legalkalmasabb modell ezen tesztekben az ember lenne –, azonban a humán alanyok kísérletben való alkalmazása jogi és etikai kérdéseket vet fel. A gyógyszerkutatás területén azonban jogszabályok írják elő a humán tesztek elvégzését. A humán tesztek szigorúan ellenőrzött körülmények között, meghatározott kritériumoknak megfelelő önkénteseken zajlanak és az állatkísérletekből nyert adatok értékelése után kezdhetők meg, a minimális kockázat elérése érdekében. Mivel a tesztek eredményeit eleve a célszervezetből nyerik, az extrapoláció kikerülhető (Nab és mtsai, 1993).

3.1.7. Más alternatív módszerek A laboratóriumi állatokon végzett teszteket bizonyos esetekben vágóhídról származó szervek felhasználásával is pótolhatjuk; pl. a Draize-féle primer szemirritációban előírt nyúl helyett használható az izolált marha- (Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants; OECD no. 437) vagy csirkeszem (Isolated

14

Chicken Eye Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants; OECD no. 438). Biokinetikai folyamatok modellezésében alkalmazzák az NMR (Nuclear Magnetic Resonance) eljárást.

3.2. A szemirritáció vizsgálata alternatív módszerekkel A csirkeembrió gyakran szerepel tesztobjektumként a különböző vegyi anyagok toxikus és/vagy teratogén hatásainak in vitro vizsgálataiban. A chorioallantois membrán (CAM) felhasználása a szemirritáció becslésében az 1980-as évekig nyúlik vissza (Leighton és mtsai., 1983, 1985; Luepke, 1985; Parish, 1985). Mivel a membrán egy vérerekkel gazdagon átszőtt szövet, jó modellként szolgálhat az irritáció becslésére: a szemhez hasonlóan reagál a különböző vegyi anyagok károsító hatásaira. Felhasználását könnyíti, hogy a membrán egyszerűen és gyorsan hozzáférhető.

A szemirritáció becslésére két módszer használatos: •

A tesztanyag érintkezési ideje a CAM-mal meghosszabbított, és ennek megfelelően a megfigyelés is hosszabb idejű (Leighton és mtsai., 1983; 1985).

•

A tesztanyag nagyon rövid ideig érintkezik a CAM-mal, és a véredényrendszerben bekövetkező változásokat közvetlenül a kezelés után értékelik (Luepke, 1985).

A kezelés minden esetben a CAM és a tesztanyag érintkezésével zajlik. Az előkészítés, tehát a CAM feltárása a tojáshéjon át történik, általában a légkamrán keresztül, de történhet a tojás egyenlítőjén keresztül is.

3.2.1. Embrionált tojás felhasználása

3.2.1.1. A madarak embrionális fejlődése

A házityúk kelési ideje 21 nap. Az inkubáció alatt, főleg a kezdeti periódusban rendkívül érzékenyen reagál a külső környezeti hatásokra. A keltetés első 9 napján minőségi változások 15

mennek végbe, azaz kialakulnak a szervkezdemények, végtagok. A magzati fejlődés második felét a mennyiségi fejlődés jellemzi, ekkor alakul ki az embrió végleges formája (Bogenfürst, 2004). A keltetés első három napjában az intenzív növekedés figyelhető meg. Az első napon kialakulnak a csíralemezek, a mesoderma és a gerinchúr. A második napon megindul a véredények, a hajszálerek, a szem, az ősvese és a szaglószervek kezdeményeinek fejlődése. A szívkezdemény két része kezd összenőni (Hamilton, 1952). A szívverés a keltetés 30. órájában kezdődik. A harmadik napon az allantois belenő az extraembrionális testüregbe (Zboray, 1991). Fejlődésnek indul az emésztőkészülék és az érzékszervek. Megjelennek a végtagbimbók (a hátsó végtagok és a szárnyak kezdeményei) és a csőr (1. ábra). A negyedik napon alakulnak ki az ivarmirigyek és a vese kezdeményei, a testrészek elkülönülnek. Az amnion körbeveszi az embriót. Az embrió feje az agyvelő gyors fejlődése következtében jelentősen megnő. Az ötödik napon az amnion megtelik folyadékkal, ami az embrió mechanikai védelmét szolgálja. Differenciálódik az első és a hátsó végtag, az ujjak és az agyvelő. A máj fejlődése megindul. A hatodik és a tizedik nap között kialakul az embrió végleges formája. A hetedik naptól megindul az allantoislégzés. A nyolcadik naptól láthatóak a tollkezdemények, és a kilencedik naptól az embrió csibeformát vesz fel. A szív a testüregbe záródik, az embrió a továbbiakban a szik állományával a köldökön keresztül, a vérkeringés útján tart kapcsolatot (Kovács és Fehér, 1966).

16

1. ábra A házityúk embrionális fejlődése A) a keltetés 1. napja,

B) a keltetés 3. napja

(1. csírapajzs, 2. őscsík, 3. érudvar, 4. jégzsinórok, 5. tojásfehérje, 6. héjhártya, 7. mészhéj, 8. légkamra, 9. embrió, 10. szikvérkeringés, 11. sinus terminalis) (Kovács és Fehér, 1966)

A tizenegyedik és tizenkettedik napon az izmok és a törzs erőteljes növekedése jellemző. A chorioallantois membrán (CAM) képessé válik a kalcium szállítására a tojáshéj és az embrió között és így biztosítja a megfelelő növekedést (Dieckert és mtsai, 1992). A tizenharmadik napra az embrióban kifejlődnek a szervek.

A tizennegyedik napon a szemhéjak fejlődése befejeződik. A tizenötödik napon a szájszöglet elszarusodott pereme jelenik meg (2. ábra). A tizenhatodik naptól már a szarukezdemények is felismerhetőek. A tizenhetedik-tizennyolcadik napig az embrionális növekedés dominál, a tizenkilencedik napon a sziktömlő megkezdi a behúzódást a hasüregbe, ami a 20 napon fejeződik be. Ekkor kezdődik meg a köldökzáródás. A huszonegyedik napra a tojáshéj törékenyebbé válik, mert a mész egy része felszívódott és a csontokban rakódott le. A huszadik vagy huszonegyedik napon a fiókák kikelnek a tojásból (Bogenfürst, 2004).

17

2. ábra A tyúk embrionális fejlődése A) a keltetés 9. napján

B) a keltetés 15. napján

(1. magzat, 2. sziktömlő, szikvérkeringés, 3. allantois, magzati vérkeringés, 4. amnion, 5. tojásfehérje, 6. héjhártya, 7. mészhéj, 8. légkamra) (Kovács és Fehér, 1966)

3.2.1.1.1. A chorioallantois membrán A szemirritáció mértékének meghatározására jelenleg a Draize-féle primer szemirritációs tesztből származó adatokat fogadják el. Az 1980-as évektől azonban az állatvédő szervezetek egyre inkább megerősödtek és szót emeltek a Draize-féle tesztben alkalmazott kísérleti nyulak szenvedései ellen. Az erősödő állatvédelmi mozgalmak hatására egyre szélesebb körökben támogatták a Draize-féle szemirritációs vizsgálat új, alternatív módszereinek kifejlesztését (Christian és Diener, 1996).

Talsma és mtsai (1988) írták le, hogy a Draize-féle teszt által megkövetelt 6 nyúl állatlétszámának 3-ra csökkentése nem eredményezi az in vivo teszt megbízhatóságának csökkenését. Seabaugh és mtsai (1993) a szemen helyi anesztetikumok felhasználását javasolták a kísérleti nyulak fájdalmainak csökkentésére. 18

1993-ban Lambert és mtsai a Draize-féle teszt által előírt kezelési koncentrációk tized részét alkalmazták a vegyi anyagok szemirritációs potenciáljának meghatározására; ez volt a Low Volume Eye Test, LVET. A kapott eredmények nagyon jó korrelációt mutattak a primer teszt eredményeivel.

A kutatások főirányát azonban olyan in vitro tesztek kifejlesztése jelentette, amelyek alkalmasak lehetnek az in vivo Draize-féle teszt kiváltására. A perspektivikus alternatív módszerek a következő csoportokba sorolhatók: •

nyúl és szarvasmarha szemmel vagy szemrészekkel végzett vizsgálatok,

•

citotoxicitási vizsgálatok,

•

chorioallantois membránt felhasználó vizsgálatok,

•

biokémiai vizsgálatok (Walum és mtsai, 1992).

A chorioallantois membránt már hosszabb ideje alkalmazzák a biológiai kutatások különböző területein, a virológiai-, bakteriológiai- és tumorkutatásban (Beveridge és Burnet, 1946) is. A csirkeembriót, mint tesztobjektumot gyakran alkalmazzák a különböző vegyi anyagok toxikus és teratogén hatásának becslésére (Verrett és mtsai, 1980; Fisher és Schoenwolf, 1983). A vegyi anyagok által okozott elváltozások kimutatására Leighton és mtsai (1985) a tyúktojás chorioallantois membránját használták. A CAM-ot a keltetés 14. napján kezelték különböző háztartási vegyi anyagokkal (Zwilling-technika), amit egy 10 mm átmérőjű teflon gyűrűbe helyeztek. A makroszkopikus reakciókat a keltetés 17. napján értékelték, majd szövettani vizsgálathoz mintát vettek a CAM kezelt területéről. A szövettani vizsgálat eredményei jó korrelációt mutattak a makroszkópos elváltozásokkal. Az in vitro vizsgálatból és a Draize-féle primer szemirritációs tesztből származó eredményeiket összehasonlították; a chorioallantois membránt használó in vitro teszt eredményei jó korrelációt mutattak az in vivo adatokkal.

Luepke és Kemper 1986-ban fejlesztették ki a HET-CAM (Hen’s Egg Test – Chorioallantoic Membrane) tesztet. A módszerrel 190 különböző vegyi anyagot és készítményt vizsgáltak. Az in vitro tesztből származó eredmények jól korreláltak az in vivo Draize tesztből származó eredményekkel.

A

vizsgálatokat

1987-ben

elektronmikroszkópos

kiértékeléssel

is

kiegészítették. A szerzők a HET-CAM tesztet alkalmasnak találták arra, hogy a kísérletekben

19

felhasznált állatok számát csökkentsék, azonban említik, hogy a módszer teljes egészében nem képes az emlős tesztek felváltására, alkalmas lehet viszont ismert irritációs potenciálú referencia anyagok használatát, és a válaszreakciók értékelését segítő leíró jellegű standard reakciókat bemutató fotóatlaszok alkalmazását.

Lawrence és mtsai (1990) 34, ipari és kozmetikai vegyi anyag irritációs potenciálját vizsgálták a Luepke által kifejlesztett HET-CAM teszttel. A tesztekhez 10 napos embrionálódott tyúktojás chorioallantois membránját használták fel, és 20 másodperces expozíciót követően kiöblítették a vizsgálati anyagokat. A kezelést követően a membránt 5 percig figyelték meg és értékelték a lízis és a vérzések kialakulását. Az in vitro és in vivo eredmények összehasonlításakor a különböző kémiai karakterű anyagokat együttesen értékelve korlátozott mértékű korrelációt állapítottak meg.

Van Erp és Weterings (1990) elővizsgálati módszerként egy in vitro tesztrendszert dolgoztak ki, mely a szaruhártya károsodásainak vizsgálatára az izolált szarvasmarha szemet (BE) használja a szaruhártyahomály mértékének megállapítására. A kötőhártya károsodások vizsgálata a tyúktojás chorioallantois membránján (CAM) történik. A két in vitro tesztből álló tesztrendszer a BECAM módszer. Közel 150 vizsgált vegyi anyag eredményeit figyelembe véve, az in vitro és in vivo eredmények 95%-ban egyeztek. A szerzők megállapították, hogy a BECAM vizsgálati módszerrel nem vagy enyhén irritatívnak minősített anyagokat nem kell veszélyt jelző címkékkel ellátni, míg irritatívabb anyagoknál csökkentett állatlétszámú emlős tesztek elvégzésével nyerhetőek további irritációs adatok az EGK (Európai Gazdasági Közösség) által megkövetelt címkézéshez. Blein és mtsai (1991) 40, különböző természtű vegyi anyag vizsgálatát végezték el a HETCAM teszttel. Megállapították, hogy bizonyos, általában színes és zavaros vizsgálati anyagok esetében az in vitro HET-CAM teszttel az irritáció nem határozható meg.

Bruner és mtsai (1991) 17 háztartási vegyi anyag irritációs vizsgálatát végezték el az in vitro BECAM tesztrendszerrel. Az in vitro és az in vivo eredmények összehasonlítása során gyenge korrelációt figyeltek meg.

Rougier és mtsai (1992) nedvesítő szerek és kozmetikai termékek irritációs potenciálját határozták meg HET-CAM teszttel. Az eredmények összehasonlítása alapján az in vitro

20

eredmények nagyon jó korrelációt (r = 0,96) mutattak a Draize-féle tesztből származó in vivo irritációs adatokkal.

Bagley és mtsai (1992, 1994) öt különböző in vitro tesztet alkalmazva - köztük a HET-CAM tesztet - háztartási vegyi anyagok irritációs potenciálját határozták meg. Öt különböző laboratórium között végzett összehasonlító vizsgálat eredményeként a CAM-ot használó kísérleti módszerek kitűnő reprodukálhatóságát figyelték meg. A vizsgálati eredmények összehasonlítását követően a HET-CAM teszt esetében megállapították, hogy in vitro eredmények jó korrelációt (HET-CAM teszt r = 0,77) mutatnak in vivo adatokkal.

Spielmann és mtsai (1993) a HET-CAM teszttel nagyon jó eredményeket kaptak a szemirritáció vizsgálatára javasolt in vitro módszerekkel végzett laborvizsgálatokban. A szerzők megállapították, hogy az általuk elvégzett vizsgálatok az in vitro HET-CAM teszt jövőbeni felhasználhatóságát jelzik a primer szemirritáció vizsgálatára, alternatív módszerként.

Ohno és mtsai (1995) beszámoltak a japán egészségügyi hatóságok által a Draize-féle in vivo teszt alternatíváiként szóba jöhető módszerekkel elvégzett összehasonlító vizsgálatok eredményeiről. meghatározott

A

vizsgálatokban

variabilitás

résztvevő

szempontjából

a

laboratóriumok HET-CAM

közötti

teszttel

eredményekből

kapták

a

legjobb

eredményeket. Budai és mtsai 2000-ben a HET-CAM tesztet hisztológiai vizsgálattal egészítették ki. Az in vitro és in vivo eredmények összehasonlítása során a HET-CAM tesztből származó adatok jó korrelációt mutattak az in vivo adatokkal.

Sina és mtsai 1995-ben 37 szintetikus gyógyszer intermedier irritációs potenciálját határozták meg 7 féle különböző in vitro vizsgálattal. Ezen in vitro tesztek között szerepelt egy chorioallantois membránt felhasználó in vitro vizsgálati módszer, a CAMVA (Chorioallantoic Membrane Vascular Assay). Az in vitro és in vivo tesztek eredményeinek összehasonlításakor a chorioallantois membránt használó CAMVA módszerből származó adatok jó korrelációt mutattak az in vivo adatokkal.

A Brit Állatvédelmi Törvény (1986) szerint azon embriók, amelyek az embrionális fejlődés félidejét elérték magasabb rendű kísérleti állatnak tekintendők, azaz azon vizsgálati módszerek, amelyek ilyen korú embriókat használnak fel már in vivo tesztek. A német szabályozók szerint a tojás 10 napos koráig élelmiszer kategóriába tartozik, így azok a 21

vizsgálati módszerek (pl. HET-CAM teszt), amelyek 10 napos korú tojást használnak az in vivo tesztek alternatív metodikáinak minősülnek. A német hatóságok elfogadják a chorioallantois membránt felhasználó in vitro módszerek felhasználását az erősen irritatív anyagok (R41: Súlyos szemkárosodást okozhat) meghatározására. A nem irritatív (R36: Szemizgató hatású) anyagok esetén az in vitro eredményeket, in vivo tesztekből származó eredményekkel is meg kell erősíteni.

Christian és Diener (1996) a perspektivikus in vitro módszerek és az in vivo tesztek közötti összehasonlító vizsgálatok eredményeit mutatták be.

Debbasch és mtsai (2005) 12 kozmetikai tisztítót (make-up lemosót) teszteltek HET-CAM, Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) és Corneal Epithelial Cell Line tesztekkel. A HET-CAM tesztről megállapították, hogy a szemen jelentkező klinikai tüneteket nem képes kimutatni. A kereskedelmi forgalomban elérhető, nem irritatív kozmetikumokat irritatívnak mutatja, ami azonban a kozmetikum összetételével összefüggésben lehet.

A CAM-ot használták irritáció meghatározására Lagarto és mtsai 2005-ben. Huszonegy tesztanyagot, köztük vegyszereket és kozmetikumokat teszteltek, a membránkárosodást trypan blue alkalmazásával mérték fel. A kapott eredmények jó korrelációt mutattak az in vivo tesztből származó eredményekkel.

Vinardell és Mitjans 2005-ben ipari és laboratóriumi vegyszereket vizsgált a CAM-on. A módszert elővizsgálati módszerként javasolják. Kishore és mtsai (2008) mikrobiocidet, mezőgazdasági fungicideket és növekedésszabályzót teszteltek a CAM-on. A kapott eredményeket in vivo tesztből származó irodalmi adatokkal vetették össze és jó korrelációt állapítottak meg.

Ying és mtsai (2010) öt tesztből álló tesztrendszert dolgoztak ki, melynek a HET-CAM teszt is eleme lett a szintén chorioallantois membránt használó Chorioallantoic Membrane – Trypan Blue Staining (CAM-TBS) mellett. A tesztrendszerben citotoxicitási vizsgálat is szerepel. Az öt módszert használva 16 vegyi anyagot vizsgáltak, néhányat több koncentrációban is. A szerzők a tesztrendszer megbízhatóságáról és reprodukálhatóságáról számoltak be.

22

A chorioallantois membránt felhasználó tesztek (HET-CAM, CAMVA) is azon in vitro módszerek közé tartoznak, amelyek önmagukban nem, de más in vitro módszerekkel kombinálva, in vitro tesztrendszerként felhasználhatók a szemirritációs potenciál meghatározására (Budai és Várnagy, 2000; Budai és mtsai, 2004). A vérerekkel és kapillárisokkal átszőtt CAM vérérrendszerében bekövetkező változások jól modellezik azokat a károsodásokat, amelyek a kémiai irritáció hatására alakulnak ki a szem kötőhártyáján. Fő hátrányainak egyike a kiértékelés szubjektív természete. 3.2.1.2. A tojások előkészítése 3.2.1.2.1. A légkamrán keresztüli behatolás

A chorioallantois membrán (CAM) a keltetés 10. napjára fejlődik ki. Amikor a CAM kifejlődött, a tojás héját a légkamra fölött ollóval vagy csipesszel eltávolítják, a héjhártyát óvatosan elmozdítják, és ekkor feltárul a CAM. Az így előkészített tojás (3-4. ábra) már alkalmas a kezelésre (Luepke, 1985). A módszer előnye, hogy egyszerűen kivitelezhető, az elváltozások könnyen követhetők; ezért kísérleteimben a légkamrán keresztüli behatolást alkalmaztam.

3. ábra A légkamrán keresztüli behatolás

23

4. ábra A kezelésre előkészített CAM

24

3.2.1.2.2. Behatolás a tojás egyenlítőjén át

Kilyukasztott membrán módszer

A keltetés 14. napján egy-egy lyukat fúrnak a tojás egyenlítői síkjában és a légkamra felett. A légkamrából a levegőt vákuum segítségével távolítják el. Az egyenlítői síkon ablakot vágnak, hogy a chorioallantois membrán kezelése elvégezhető legyen (5. ábra). Az ablakot öntapadó szalaggal, a lyukat pedig valamilyen kocsonyás anyaggal fedik le (Lawrence, 1987).

5. ábra Kilyukasztott membrán módszer

25

Zwilling-technika

Az inkubáció 3. napján kis lyukat fúrnak a mészhéjon, a tojás hegyes végén. Az albuminból 2 ml-t eltávolítanak fecskendő és egy tű segítségével, majd a nyílást fedik. Az egyenlítői síkban ablakot vágnak a mészhéjon a kilyukasztott membrán módszerben ismertetett módon, majd öntapadó szalaggal fedik. A tojást ezek után visszahelyezik az inkubátorba (6. ábra). A CAM az albumin redukált szintjén fejlődik, a kezelést és az értékelést az ablakon keresztül végzik (Zwilling, 1959).

6. ábra A Zwilling-technika

26

3.2.1.3. A chorioallantois membrán felhasználása A chorioallantois membrán felépítése a 7. ábrán látható.

7. ábra A CAM szerkezete

Az inkubáció 11. napja után a chorioallantois három rétegű. A külső réteg a héjhártyával érintkező ectodermalis eredetű hámréteg. A középső réteg embrionális kötőszövet, a mesenchyma, amely a somato- és a splanchnopleurából fejlődik. A belső réteg az entodermából származó allantois-hám (7. ábra) (Fáncsi és Fehér, 1978).

27

Chorion (membrana serosa)

A chorion alkotja az ectodermalis eredetű külső, héjhártyával érintkező réteget. Két rétegű hámja kötőhámsejtekből áll. A külső hámsejtréteg, lap vagy alacsony köbhámsejtekből épül fel. A belső - mesenchyma felőli - a réteg magas köbhámsejtekből áll. A kapillárisok mind a két hámréteg, mind a külső hámréteg és a héjhártya között megtalálhatók. Ez utóbbiak tág öblöket, sinusokat képeznek (Fáncsi és Fehér, 1978).

Mesenchyma

A chorioallantois kialakulásakor a somato- és a splanchnopleura összeolvadásából fejlődik a mesenchyma-réteg, amely csillag alakú, hosszú, nyúlványos sejtekből áll. A mesenchyma héjhártya felöli rétegében szűk és vékonyfalú, az allantois közelében tágabb erek haladnak. (Fáncsi és Fehér, 1978).

Allantois

Az allantois egyrétegű laphámsejtekből áll. Az allantois hámsejteknek a tömlő ürege felé eső felületén rövid, vaskos nyúlványok, bolyhok és invaginatiók találhatók (Fáncsi és Fehér, 1978).

3.2.2. A chorioallantois membránt felhasználó tesztek

3.2.2.1. Chorioallantoic Membrane Vascular Assay (CAMVA) A CAMVA tesztet Leighton és mtsai alkalmazták először 1985-ben, majd Bagley és mtsai 1989-ben és 1991-ben fejlesztették tovább. Elsősorban a kozmetikaiparban használják irritáció becslésére. Alkalmazása főleg az Amerikai Egyesült Államokban terjedt el. A módszer a lehetséges irritációt jelzi előre a csirke embrió chorioallantois membránjának érrendszeri károsodásai alapján. A keltetés 4. napján kis ablakot vágnak az embrionálódott tojás héján, és egy kis mennyiségű albumint eltávolítanak, azért hogy a CAM megfelelő fejlődése biztosítva legyen. A nyílást ezután lezárják, és a tojást további 6 napig keltetik. A chorioallantois membrán a 10. napra éri 28

el a megfelelő fejlettségi állapotot (Bagley és mtsai, 1992, 1994). A 10. napon a vizsgálni kívánt anyagot közvetlenül a CAM-ra juttatják. 30 perccel később az érrendszeri elváltozások (vérzés, hyperaemia, vér nélküli erek) vizsgálhatók. A kísérlet végpontjának a tesztanyag azon koncentrációja tekinthető, ami a kezelt tojások 50%-án okoz érrendszeri elváltozást.

3.2.2.2. Chorioallantoic Membrane – Trypan blue festés (CAM-TB) A CAM-TB (Itagaki és mtsai, 1995) a Japán Egészségügyi Minisztérium “Studies on the test methods to evaluate the safety of new ingredients of cosmetics” (Ohno és mtsai., 1999) című programjának részeként vált ismertté, bár a módszert 1991-ben Hagino és mtsai már alkalmazták (Hagino és mtsai 1991, 1993). A trypan blue festés célja eredetileg egy olyan eljárás kifejlesztése volt, ami csökkenti a HETCAM teszt szubjektivitásából eredő esetleges hibalehetőséget, és egy objektívebb eredményt ad. A technika lényege, hogy a CAM által megkötött trypan blue festék mennyiségéből a CAM tényleges károsodására lehet következtetni. A módszert széles körben alkalmazzák a membránkárosodás és az élő sejtek mennyiségének meghatározására (Hagino és mtsai, 1999). Hátránya, hogy a színes anyagok a festést, mint a kísérlet végpontját zavarhatják (Ohno és mtsai, 1999).

3.2.2.3. Hen’s Egg Test - Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) Jelen kísérletekben a HET-CAM tesztet alkalmaztam. Részletes leírása az Anyag és módszer c. fejezetben megtalálható.

3.2.3. A citotoxicitási vizsgálatok alkalmazása

A citotoxicitási vizsgálatokat széles körben alkalmazzák a vegyi anyagok élő szervezetre gyakorolt toxikus hatásainak vizsgálatára. Károsító hatásra a sejtek reagálhatnak: •

nekrózissal, amelynek során a membrán-integritásukat elveszítve, lysis következtében gyors pusztulás figyelhető meg. A sejt tartalma az intercelluláris térbe ürül.

•

apoptózissal (programozott sejthalál).

29

Citotoxicitási vizsgálatokat általában a gyógyszeriparban végezhetnek egy adott anyag tesztelésére, pl. rákellenes gyógyszerek kifejlesztésénél, ahol cél a gyors, specifikus sejtpusztító hatás vizsgálata. A teszt másik felhasználási irányvonala a nem-kívánt (magas) citotoxicitással rendelkező anyagok kiszűrése. Az MTT Assay során a mitokondrium-függő reakcióban keletkező színes formazán mennyiségét mérik, amire nézve a sejtmembrán impermeabilis. A kimutatható formazán mennyisége alapján az élő sejtek aránya kiszámolható (Invittox Protocol No. 17.). A tetrazolium sót (3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)) a sejtek felveszik és egy mitokondrium-függő reakcióban formazánná alakítják. Mivel ez a végtermék a sejtmembránon képtelen átjutni, ezért a sejtben felhalmozódik. A sejtek feloldásával a formazán szabaddá válik, mennyisége az élő sejtek számával arányos, és kolorimetriás módszerrel meghatározható. A vizsgálat a kezelés után életben maradt sejtek mennyiségének meghatározásán alapul. A 24 órás inkubáció alatt a sejtek egyszer osztódnak és a mikroteszt lemez vájatainak falához tapadnak. Ezután a sejtek tápoldatát vizsgálati anyagot is tartalmazó friss oldatra cserélik. Újabb 24 óra múlva 2 óra inkubáció történik MTT-oldattal, melynek során az élő sejtek a vízoldható tetrazólium sóból vízoldhatatlan formazán kristályokat metabolizálnak. A formazán kristályok feloldása

után

az

oldat

adszorbancia

spektruma

megváltozik,

a

fényelnyelés

spectrophotometerrel mérhető, kontrollhoz viszonyított eltérése pedig az élő sejtek számának változásával arányos.

3.3. A szem felépítése A szem a gerinces állatoknál a csontos szemüregben helyezkedik el, amely a külső fizikai behatásokkal szemben védi a szemet. A szem védelmét látja el a szemhéj, a szempilla és a kötőhártya is.

A szemgolyó falát három hártya adja, melyen belül a szemgolyó magja, a szemcsarnokok, a szemlencse és az üvegtest foglalnak helyet (Szentágothai és Réthelyi, 1985). A külső hártya hátulsó része a tülökhártya (sclera), elülső 1/5-öd része pedig a szaruhártya (cornea), mely elvékonyodó részét limbus corneae-nek nevezik. Bár a szaruhártyában nincsenek erek, ennek közelében a felső felületen koszorúszerű vénafonat a plexus venosus sclerae található. A szem felépítése a 8. ábrán látható. 30

8. ábra A szem felépítése

A szaruhártya a szemgolyó külső felülete, amely a külső környezetből érkező hatásoknak leginkább ki van téve. Ezáltal egy külső, mechanikai és kémiai barrierként szolgál: védelmet biztosít a szem mélyebben fekvő szöveteinek. A nagyjából fél milliméter vastagságú, gazdag beidegzésű szaruhártya 5 részből tevődik össze: a felületi epitheliumból, a Bowman membránból, a stroma-ból, a Descemet membránból és az endotheliumból. A stroma a teljes corneavastagság 85-90%-át adja. Rendezett kollagén rostokból épül fel, amelyek a szaruhártya átláthatóságáért felelősek. A kollagén mátrixban keratociták és fibroblaszt-szerű sejtek találhatók, amik a cornea homeosztázisának fenntartásához nélkülözhetetlen anyagokat termelnek. Az endothelium egy sor poligonális, lapos sejtből áll; feladata a víz elvonása a stroma-ból, így a kollagén mátrix állandóságának biztosítása (Huhtala és mtsai, 2008). 31

A középső hártya festékes kötőszöveti sejteket, idegi és simaizom elemeket, sűrű érhálózatot is tartalmaz, a tülökhártyától a corneosclerális határon - tehát a külső hártya elülső és hátulsó részének találkozásánál – válik külön és a szemgolyó belseje felé fordulva a szivárványhártyát vagy iris-t alkotja. Ennek közepén a fényre szűkülő nyílás, a pupilla helyezkedik el. A legbelső hártyát ideghártyának vagy retina-nak nevezzük.

A szemgolyó vérellátását három érrendszer adja, az ideghártyához térő retinális, az érhártyát ellátó ciliaris és az episcleralis - conjuctivalis érrendszer (9. ábra). Külső (mechanikai, kémiai) inger hatására vagy pedig gyulladásos állapotban az erek kitágulnak (Fehér, 1989).

A szemen megfigyelhető irritáció a szem felépítéséből adódóan több régiót érinthet. Általában először a legkülső réteg, a cornea sérül, de erősebb irritáció, vagy korrozív természetű anyag hatására a szem mélyebben fekvő rétegei is károsodhatnak (Kiss, 1997); az érintett terület sérülésének reverzibilitása függ a sérülés mélységétől (Eskes és mtsai, 2005). Maurer és mtsai 2002-ben leírták, hogy a kezelés utáni első órákban megfigyelhető cornea-károsodásból a szemirritáció mértéke és tartóssága becsülhető.

Hámszöveti jellege miatt a corneát és conjunctivát károsító vegyületek hatásmechanizmusa hasonló, mint bőrirritáció esetén, viszont a következmények súlyosabbak: a cornea fénytörésének minimális változása is gátolja a normális szemműködést, és mivel a corneában nem találhatók kapilláris erek, így a gyulladás az alatta található iris és érhártya gazdag érhálózatát érinti.

32

9. ábra A szem érrendszere

33

4. ANYAG ÉS MÓDSZER 4.1. Vizsgálati módszerek

4.1.1. HET-CAM teszt

A vizsgálatokhoz Shaver Rusticbro tenyésztojásokat alkalmaztam, amelyeket a sármelléki Goldavis Kft. keltető üzeme biztosított. A Shaver Rusticbro jó termékenységi mutatókkal rendelkezik, a tojások kelési aránya magas. A tojásokat Ragus inkubátorban, 37

o

C

hőmérsékleten, 60-70%-os relatív páratartalom mellett 10 napig keltettem, mivel a chorioallantois membrán ekkorra éri el a megfelelő fejlettségi állapotot. Nyolc napig naponta forgattam, hogy az embrió letapadását elkerüljem. A 9. napon, lámpázást követően a hibásakat eltávolítottam, és a tojást a tompa végével felfelé helyeztem vissza a keltetőbe, ami a CAM 10. napi hozzáférhetőségét segítette elő. (10. ábra).

10. ábra Kezelésre előkészített CAM

34

11. ábra Lízis és vérzés a CAM-on

A módszert az Invittox Protocol 47. száma (1990) írja le. A CAM-on bekövetkező változások (érlízis, vérzés, koaguláció) alapján az irritáció mértéke becsülhető, számítógépes program segítségével számszerűsíthető, és a kapott számszerű érték alapján irritációs kategóriába sorolható.

A kísérletekhez a következő eszközöket és vegyszereket használtam fel:

Eszközszükséglet: - Ragus keltetőgép: optimális hőmérséklet 37,5 0C (± 0,5) relatív páratartalom 62,5% (± 7,5%), - átvilágító lámpa, - csipesz, olló, - pipetták, szemcseppentők, - stopperóra, - számítógép megfelelő értékelő programmal. 35

Vegyszerszükséglet: - 0,9%-os NaCl, - 1%-os SDS (Na-lauril szulfát), - 0,1 M NaOH.

A tojásokat a keltetés 10. napján dolgoztam fel. Ekkorra az embrionálódott tyúktojás chorioallantois membránja már kifejlődött, kezelésre alkalmas. A CAM-on vérzés, véredény lízis vagy koaguláció figyelhető meg. Az elváltozásokat és azok időpontját (másodpercben) jegyzőkönyvben rögzítettem.

Az értékelés számítógépes program segítségével történt, a következő algoritmus alapján (Invittox Protocol 47, 1990):

301-secH 301-secL 301-secC RI = ────── x 5 + ────── x 7 + ────── x 9 300 300 300 ahol: H: vérzés, L: érlízis, C: koaguláció, RI: irritációs index, sec: indulási idő másodpercben Az egyes vegyi anyagok vizsgálatából származó eredmények átlagát a képletbe helyettesíve, az irritációs indexeket meghatároztam. A számítógépes program algoritmusa alapján kapott irritációs indexeket az 1. táblázat alapján irritációs kategóriákba soroltam.

1. táblázat A HET-CAM teszt irritációs indexekhez tartozó irritációs kategóriái

Irritációs index

Irritációs kategória

0-0,9

Nem irritatív

1-4,9

Gyengén irritatív

5-8,9

Közepesen irritatív

9-21

Erősen irritatív

36

4.1.2. MTT-Assay

A módszerrel 12 mezőgazdasági vegyi anyagot vizsgáltam. A felhasznált anyagok: Actellic 50 EC, Confidor 200 SL, Match 050 EC, Alirox 80 EC, Clinic 480 SL, Glialka 480 Plus, Targa Super 5 EC, TrendTM, Previcur 607 SL, Systhane 12 E, Silwet L-77 és Substral. A vizsgálatot „Vero”, afrikai zöldmajom vese epithelsejteken (ECACC No: 84113001) végeztem, amelyeket 24 órával a vizsgálat megkezdése előtt az előzőleg elkészített szuszpenzióban (Hank-oldat), megfelelő

hígításban mikroteszt lemez vájataiba vittem. A

sejtek tenyésztő médiuma 10% szérumot és antibiotikumot (penicillin 5 ug/ml és sztreptomocin 25 µg/ml) tartalmazott. A sejtek 24 óra alatt egyszer osztódnak és a vájatok falához tapadnak.

Másnap a tápoldatot kiöntöttem, és friss tápoldatra cseréltem (10. ábra), amely 10%-ban (v/v%) a vizsgálati anyag különböző mértékben hígított oldatát tartalmazta. A 24 órás expozíció után 2 órán át 1 mg/ml MTT oldattal inkubáltam a sejteket, majd a keletkezett formazán kristályokat metanollal oldottam. Az oldat fényelnyelését 570 és 630 nm hullámhosszon mértem. Az élő sejtek száma az (OD570 – OD630) értékkel arányos. Az azonos hígítások fényelnyelési adataiból (3 mérés) átlagot számoltam, majd ezt a kezeletlen sejtek (24 mérés) átlagához viszonyítva kiszámítottam a %-os sejtpusztulást. A vizsgálati minták minden hígításával három párhuzamos mérést végeztem. Kontrollként kezeletlen sejteket használtam. Citotoxikus hatásnak értékeltem, ha a kezelt sejtek fényelnyelési átlaga alacsonyabb volt, mint a kezeletlen sejtek fényelnyelési átlaga.

37

12. ábra A sejtek kezelése

Eszközszükséglet:

-

96 vájattal rendelkező mikroteszt lemez

-

Easy Reader 400 spektrofotométer

-

automata lemezrázó

Vegyszerszükséglet:

-

3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT-oldat)

-

KCl

-

KH2PO4

-

NaCl

-

NaHCO3

-

Na2PO4*7H2O

-

Etanol

38

A kezelt oldat fényelnyelését a kezeletlenhez viszonyítva, az élő sejtek %-os aránya meghatározható:

a kezelt sejtek abszorbanciája ___________________________

x100

a kontroll sejtek abszorbanciája

4.1.3. A Draize-féle primer szemirritációs teszt

A Draize-féle primer bőr- és szemirritációs teszteket egyaránt nyúlon végzik. Az új-zélandi fehér nyúl középnagy testű fajta, szőre fehér, szemei pirosak. Kifejlettkori testtömege 4,5-5,5 kg. Fejlődése gyors, a takarmányhasznosítása kiváló, így 8 hetes korára elérheti az 1,8-2,0 kgot (Holdas, 1976).

A klasszikus Draize-féle szemirritációs vizsgálatot a 405-ös számú OECD Guideline (2002) alapján végeztem el. A kísérletben minden vegyi anyag esetén 2 vagy 3 új-zélandi fehér nyulat használtam fel. A nyulak egyik oldali szemét kezeltem, a kezeletlen szem kontrollként szolgált, ezért kontroll csoport beállítása nem szükséges (önkontrollos teszt). Az egyedileg elhelyezett állatok számára 22-25 ºC-ot, 50-70%-os relatív páratartalmat és napi 12 óra mesterséges megvilágítást biztosítottam. Takarmányként egységes nyúltápot és csapvizet kaptak ad libitum. A kísérleti anyagot főzőpohárban készítettem elő, és szemcseppentővel az egyik szem kötőhártyazsákjába 0,1 ml vizsgálati anyagot helyeztem, majd a kezelést követő 1 óra, 1, 2, 3 és 7 nap után értékeltem a szem hártyáin jelentkező elváltozásokat (Draize és mtsai, 1944) (13. ábra). A szem különböző hártyáin jelentkező elváltozások külön kerültek értékelésre (2. táblázat).

39

13. ábra A kezelt szem

40

2. táblázat Draize-féle értékelő pontozás

Pont

I. Kötőhártya (Conjunctiva)

A. Vérbőség

Az erek a normálist meghaladóan, határozottabban láthatók

1

Kifejezettebb, sötétebb, karmazsinvörös szín

2

Diffúz, sötétvörös szín

3

B. Duzzadás

Enyhe duzzadás, beleértve a pislogóhártyát is

1

Szemhéjak részleges kifordulásával

2

Félig zárt, duzzadt szemhéjak

3

Teljesen zárt, duzzadt szemhéjak

4

C. Váladékképződés Normálist meghaladó mennyiség

1

A szemhéjak széle nedves

2

A szemhéjak környéke is nedves

3

Értékelés: ( A + B + C ) x 2

Max.: 20 pont

41

II. Szaruhártya (Cornea)

A. Homály mértéke Elszórt, diffúz homály, a szivárványhártya világosan látható

1

A homályban átlátszó területek, a szivárványhártya részletei

2

csak homályosan láthatók Opálos homály, a szivárványhártya részletei nem láthatók

3

Intenzív opálos, a szivárványhártya láthatatlan

4

B. Homály területe 1/4 rész vagy kisebb

1

2/4 résznél kisebb, de 1/4 résznél nagyobb

2

3/4 résznél kisebb, de 1/2 résznél nagyobb

3

Teljes felszín, 3/4 résznél nagyobb

4

Értékelés: A x B x 5

Max.: 80 pont

III. Szivárványhártya (Iris)

A. Elváltozások Vérbő, redőzöttebb írisz, szaruhártya belövellt, az írisz fényre még enyhén reagál

1

Vérzés, fényre nem reagál

2

Értékelés: A x 5

Max.: 10 pont

Végső pontszám: I + II + III = 20 + 80 + 10 = 110 pont

42

Az elváltozásokhoz értékelő pontokat rendeltem, majd ezeket összesítve, Kay és Calandra módszere alapján (Maximum Mean Total Score – MMTS, Kay J. H. and Calandra J. C., 1962) (3. táblázat) határoztam meg az irritációs indexet.

43

3. táblázat Maximum Mean Total Score – MMTS

MAXIMUM ÁTLAG PONTSZÁM

TÜNETEK FENNÁLLÁSA Csop. átl. pont 24 óránál = 0

OSZTÁLYOZÁS Nem irritatív

0.0-0.5

(1)

Gyakorlatilag nem irritatív (2)

Csop. átl. pont 24 óránál > 0 Csop. átl. pont 24 óránál = 0

Gyakorlatilag nem irritatív (2)

0.5-2.5 Csop. átl. pont 24 óránál > 0

Minimálisan irritatív

(3)

Minimálisan irritatív

(3)

Enyhén irritatív

(4)

Enyhén irritatív

(4)

Közepesen irritatív

(5)

Az egyedi pontszámok több, mint fele a 7. napon 10 vagy kevesebb

Közepesen irritatív

(5)

Az egyedi pontszámok több, mint fele a 7. napon 10 < de egy esetben sem 30 <

Közepesen irritatív

(5)

Az egyedi pontszámok több, mint fele a 7. napon 10 < és 30 pont felett is lehet

Erősen irritatív

(6)

Erősen irritatív

(6)

Csop. átl. pont 48 óránál = 0 2.5-15 Csop. átl. pont 48 óránál > 0 Csop. átl. pont 72 óránál = 0 15-25 Csop. átl. pont 72 óránál > 0

25-50

Csop. átl. pont a 7 napon 20 vagy kevesebb

Csop. átl. pont a 7 napon 20 <

44

3. táblázat folytatása MAXIMUM ÁTLAG PONTSZÁM

TÜNETEK FENNÁLLÁSA

Az egyedi pontszámok több, mint fele a 7. napon 30 vagy kevesebb Csop. átl. pont a 7 napon 50-80 40 vagy kevesebb

OSZTÁLYOZÁS

Erősen irritatív

(6)

Az egyedi pontszámok több, mint fele a 7. napon 30 < de egy esetben sem 60 <

Erősen irritatív

(6)

Az egyedi pontszámok több, mint fele a 7. napon 30 <, és 60 pont felett is lehet

Nagyon erősen irritatív (7)

Csop. átl. pont a 7 napon Nagyon erősen irritatív (7) 40 <

Az egyedi pontszámok több, mint fele a 7. napon 60 vagy kevesebb Csop. átl. pont a 7 napon 80-100 80 vagy kevesebb

Nagyon erősen irritatív (7)

Az egyedi pontszámok több, mint fele a 7. napon 60 < de egy esetben sem 100 <

Nagyon erősen irritatív (7)

Az egyedi pontszámok több, mint fele a 7. napon 60 <, és 100 pont felett is lehet

Extrém irritatív

(8)

Extrém irritatív

(8)

Csop. átl. pont a 7 napon 80 < Csop. átl. pont a 7. napon 80 vagy kevesebb

Nagyon erősen irritatív (7)

100-110 Csop. átl. pont a 7. napon 80 <

Extrém irritatív

45

(8)

4.2. Vizsgálati anyagok

A kísérletben gyomirtó (herbicid), rovarirtó (inszekticid), gombairtó (fungicid) készítmények, valamint adalékanyagok, tapadásfokozók, levéltrágyák kerültek felhasználásra. A kísérleti anyagokat mind a HET-CAM tesztben, mind a Draize-féle primer szemirritáció során 100%os töménységben alkalmaztam. Amennyiben az in vivo tesztben egy órával a kezelés után erős irritációt figyeltem meg, a kezelést a második és harmadik állaton nem végeztem el. 4.2.1. A vizsgálatban felhasznált növényvédő szerek

4.2.1.1. Inszekticidek (4. táblázat)

Tesztanyag

4. táblázat A vizsgált inszekticidek Hatóanyag LD50(mg/ttkg)

Actellic 50 EC

pirimifosz-metil

1522-1732

irritatív

Agrol Plus

fehér olaj

5000<

irritatív

Chinmetrin 25 EC

béta-cipermetrin

2060

enyhén irritatív

Irritáció

imidakloprid, Confidor 200 SL

N-metil-2pirrolidon

2000<

irritatív

Fendona 2 EC

alfa-cipermetrin

600

enyhén irritatív

Kohinor 200 SL

imidakloprid

~ 2500

irritatív

Match 050 EC

lufenuron

3100<

irritatív

Mospilan 3 EC

acetamprid

2000-2146

irritatív

Omite 57 E

propargit

2788

erős irritatív, irreverzibilis

Pyrinex 48 EC

chlorpyrifos

508

enyhén irritatív

Sherpa

cipermetrin

2000

enyhén irritatív

Sumi-Alpha 5 EC

észfenvalerát

399

irritatív

Talstar 10 EC

bifentrin

520

nem irritatív

Thionex 35 EC

endoszulfán

0,07 ml/ttkg

nem irritatív

Unifosz 50 EC

diklórfosz

56-80

enyhe irritatív

Zolone 350 EC

phosalone

2000<

közepesen irritatív

46

4.2.1.2. Herbicidek (5. táblázat) 5. táblázat A vizsgált herbicidek

Tesztanyag

LD50

Hatóanyag

(mg/ttkg)

Irritáció

linuron, N-(3,4-diklór-fenil)N'-metoxi-N'-metilkarbamid

Afalon Dispersion

4480

irritatív

Alirox 80 EC

s-ethyl dipropylthiocarbamate

-

enyhe irritatív

Clinic 480 SL

glifozát izopropilaminsó

2000<

enyhe irritatív

Dezormon

2,4diklórfenoxiecetsav

2000

irritatív

Falcon 460 EC

spiroxamin, tebuconazol, triadimenol

500-1000

nem irritatív

Fozát 480

glifozát

200-2000

enyhe irritatív

Glialka 480 Plus

glifozát – izopropilaminsó

5000<

irritatív

Kapazin

glifozát – izopropilaminsó

10.000<

enyhe irritatív

Medallon Premium

glifozát

>5000

enyhe irritatív

Perenal

haloxyfop-R methyl ester

2000<

irritatív

Proponit 720 EC

propizoklór

3425

enyhe irritatív

Stomp 330 EC

pendimethalin

3148

nem irritatív

Targa Super 5 EC

quizalofop-P-etil

2551–2728

irritatív

Totril

ioxynil

324

Enyhén irritatív

TrendTM

izodecil-acetát*

2493

irritatív

*Trend Biztonságtechnikai adatlap

47

4.2.1.3. Fungicidek (6. táblázat) 6. táblázat A vizsgált fungicidek

LD50

Irritáció

Tesztanyag

Hatóanyag

Alfa-solo

difenokonazol

3129

nem irritatív

Charisma 207 EC

oxazolidinedione, triazol

1885

nem irritatív

Contaf

hexakonazol

2189-6071

enyhe irritatív

Folicur Solo

tebukonazol

200-2000

nem irritatív

Previcur 607 SL

propamokarb

5000<

enyhe irritatív

Rubigan 12 EC

fenarimol

1040-1250

enyhe irritatív

Systhane 12 E

myclobutanil, cyclohexanon

2800

közepes irritatív

Talendo

proquinazid

2000<

súlyos szemkárosodást okozhat

Topas 100 EC

penkonazol

2574

irritatív

(mg/ttkg)

4.2.1.4. Tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények (7. táblázat) 7. táblázat A vizsgált tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények

Tesztanyag

LD50 (mg/ttkg)

Irritáció

Atonik

5000<

Nagyon enyhén irritatív

Compo

-

-

Fito Horm

-

-

Folisol W

-

-

Genezis

-

-

Jolovit

-

-

Nonit

10.400-11200 µl/kg

irritatív

Silwet L-77

-

-

Substral*

-

irritatív

Wuxal

5000<

-

*Tápoldat szobanövényekre

48

5. EREDMÉNYEK, ÉRTÉKELÉS 5.1. A HET-CAM tesztből származó eredmények A tesztanyagot a tyúktojás chorioallantois membránjára csöppentettem, majd a megfigyelt vérzések és véredény lízisek időpontját feljegyeztem. Ezen értékek alapján a számítógépes algoritmussal irritációs indexet számoltam.

5.1.1. Inszekticidek

ACTELLIC 50 EC – Erősen irritatív A membránon 30–65 másodpercen belül véredénylízist, 58–136 másodpercen belül vérzést figyeltem meg. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 9.3.

AGROL PLUS – Gyengén irritatív A membránon 9-20 másodpercen belül vérzést figyeltem meg. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 4.8.

CHINMETRIN 25 EC – Erősen irritatív A membránon 3–10 másodpercen belül véredénylízist, 7–16 másodpercen belül vérzést tapasztaltam. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 11.7.

CONFIDOR 200 SL – Gyengén irritatív A membránon 3-9 másodpercen belül vérzés indult meg. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 4.92.

FENDONA 2 EC – Erősen irritatív A membránon 6–12 másodpercen belül véredénylízis, 14–28 másodpercen belül vérzés látszott. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 11.48.

49

KOHINOR 200 SL – Erősen irritatív 6–11 másodpercen belül véredénylízis, 55–85 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 10.64.

MATCH 050 EC – Erősen irritatív 2–8 másodpercen belül véredénylízist, 6–11 másodpercen belül vérzést figyeltem meg. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 11.7.

MOSPILAN 3 EC – Erősen irritatív A kezelést követő 4–8 másodpercen belül véredénylízis, 13–35 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A 11.53-as irritációs index alapján az inszekticid erősen irritatív.

OMITE 57 E – Erősen irritatív A membránon 20–43 másodpercen belül véredénylízis, 37–100 másodpercen belül vérzés látszott. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 10.21.

PYRINEX 48 EC – Közepesen irritatív A membránon 29–55 másodpercen belül véredénylízist, 120–165 másodpercen belül vérzést tapasztaltam. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 8.67.

SHERPA – Erősen irritatív A kezelést követő 8–22 másodpercen belül véredénylízis, 28–50 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A 11-es irritációs index alapján az inszekticid erősen irritatív.

SUMI-ALPHA 5 EC – Erősen irritatív A kezelést követő 15–28 másodpercen belül véredénylízis, 30–72 másodpercen belül vérzést tapasztaltam. A 10.8-as irritációs index alapján a vizsgálati anyag erősen irritatív.

TALSTAR 10 EC – Erősen irritatív A membránon 4–7 másodpercen belül véredénylízis, 6–15 másodpercen belül vérzés látszott. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 11.7.

50

THIONEX 35 EC – Gyengén irritatív A membránon 11-23 másodpercen belül vérzés indult meg. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 4.75.

UNIFOSZ 50 EC – Gyengén irritatív A membránon 2-10 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 4.94.

ZOLONE 350 EC – Gyengén irritatív A kezelést követő 6–18 másodpercen belül vérzést tapasztaltam. A 4.81-es irritációs index alapján a vizsgálati anyag gyengén irritatív.

5.1.2. Herbicidek

AFALON DISPERSION – Erősen irritatív A kezelést követő 8–13 másodpercen belül véredénylízis, 15–43 másodpercen belül vérzést tapasztaltam. A 11.45-ös irritációs index alapján a vizsgálati anyag erősen irritatív.

ALIROX 80 EC – Erősen irritatív A kezelés után 23–46 másodperccel a membránon lízis jelentkezett, majd 82–115 másodpercnél vérzés indult meg. Az Alirox 80 EC in vitro HET-CAM teszttel meghatározott irritációs indexe 9.655.

CLINIC 480 SL – Erősen irritatív A membránon 2–7 másodpercen belül véredénylízis, 7–19 másodpercen belül vérzés látszott. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 11.74.

DEZORMON – Erősen irritatív A membránon 2–10 másodpercen belül véredénylízis, 30–51 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 10.80.

51

FALCON 460 EC – Erősen irritatív A membránon 3–6 másodpercen belül véredénylízis, 5–13 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 11.77.

FOZÁT 480 – Gyengén irritatív A kezelést követő 2–7 másodpercen belül vérzést tapasztaltam. A 4.94-es irritációs index alapján a vizsgálati anyag gyengén irritatív.

GLIALKA 480 PLUS – Erősen irritatív A kezelést követő 4–10 másodpercen belül véredénylízis, 12–51 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A 11.43– as irritációs index alapján a herbicid erősen irritatív.

KAPAZIN – Erősen irritatív A kezelést követő 3–7 másodpercen belül véredénylízis, 8–15 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A 11.72-es irritációs index alapján a kísérleti anyag erősen irritatív.

MEDALLON PREMIUM – Erősen irritatív A membránon 4–8 másodpercen belül véredénylízis, 9–18 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 11.68.

PERENAL – Erősen irritatív A membránon 16–43 másodpercen belül véredénylízis, 45–82 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 10.36.

PROPONIT 720 EC – Erősen irritatív A kezelést követő 20–39 másodpercen belül véredénylízis, 40–80 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A 10.44-es irritációs index alapján a kísérleti anyag erősen irritatív.

52

STOMP 330 EC – Közepesen irritatív A membránon 51–82 másodpercen belül véredénylízis, 105–146 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 8.46.

TARGA SUPER 5 EC – Erősen irritatív A chorioallantois membránon 4–6 másodpercen belül véredénylízis, 8–14 másodpercen belül vérzés látszott. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 11.70.

TOTRIL – Erősen irritatív A kezelés után 37–51 másodperccel a membránon lízis jelentkezett, majd 106–147 másodpercnél vérzés indult meg. A tesztanyag irritációs indexe 9.10. TRENDTM – Erősen irritatív A kezelést követő 3–10 másodpercen belül véredénylízis, 9–21 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A 11.66-os irritációs index alapján a kísérleti anyag erősen irritatív.

5.1.3. Fungicidek

ALFA-SOLO – Gyengén irritatív A kezelést követő 10–35 másodpercen belül vérzést tapasztaltam. A 4.65-es irritációs index alapján a vizsgálati anyag gyengén irritatív.

CHARISMA 207 EC – Gyengén irritatív A kezelés után 6–16 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A 4.02-es irritációs index alapján a vizsgálati anyag gyengén irritatív.

CONTAF – Gyengén irritatív A membránon 11-30 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 4.74.

53

FOLICUR SOLO – Erősen irritatív A chorioallantois membránon 6–10 másodpercen belül véredénylízis, 6–31 másodpercen belül vérzés látszott. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 11.60.

PREVICUR 607 SL – Gyengén irritatív A membránon 12-25 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 4.70.

RUBIGAN 12 EC – Gyengén irritatív A membránon 7-14 másodpercen belül vérzést tapasztaltam. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 4.83.

SYSTHANE 12 E – Erősen irritatív A kezelést követő 5–15 másodpercen belül véredénylízis, 11–35 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A 11.50-es irritációs index alapján a kísérleti anyag erősen irritatív.

TALENDO – Gyengén irritatív A membránon 6-19 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 4.81.

TOPAS 100 EC – Erősen irritatív A chorioallantois membránon 5–10 másodpercen belül véredénylízis, 13–38 másodpercen belül vérzés látszott. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 11.55.

5.1.4. Tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények

ATONIK – Gyengén irritatív A membránon 40-80 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 3.99.

54

COMPO – Gyengén irritatív A membránon 24-65 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 4.38.

FITO HORM – Gyengén irritatív A kezelés után 11–55 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A 4.50-es irritációs index alapján a vizsgálati anyag gyengén irritatív.

FOLISOL W – Gyengén irritatív A kezelés után 10–33 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A 4.60-es irritációs index alapján a vizsgálati anyag gyengén irritatív.

GENEZIS – Gyengén irritatív A membránon 25-60 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 4.00.

JOLOVIT – Gyengén irritatív A membránon 24-38 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 4.50.

NONIT – Erősen irritatív A kezelést követő 3–7 másodpercen belül véredénylízis, 7–15 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A 11.70-es irritációs index alapján a kísérleti anyag erősen irritatív.

SILWET L-77 – Erősen irritatív A kezelést követő 2–7 másodpercen belül véredénylízis, 7–16 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A 11.75-ös irritációs index alapján a kísérleti anyag erősen irritatív.

SUBSTRAL – Gyengén irritatív A membránon 8-19 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A számítógépes program által számított értékek alapján a tesztanyag irritációs indexe 4.80.

55

WUXAL – Erősen irritatív A kezelést követő 7–15 másodpercen belül véredénylízis, 12–35 másodpercen belül vérzés jelentkezett. A 11.49-es irritációs index alapján a kísérleti anyag erősen irritatív.

5.2. A citotoxicitási vizsgálat eredményei

5.2.1. Inszekticidek

ACTELLIC 50 EC A sejtpusztulás az alkalmazott hígítások mindegyikében 50% felett volt. (LC50 < 0,078 ml/l).

Hígítás mértéke 10x 20x 40x 80x 160x 320x 640x 1.280x Sejtpusztulás mértéke 83% 96% 97% 97% 96% 94% 81% 55% CONFIDOR 200 SL A tesztanyag 10, 20, 40 és 80-szoros hígításban a sejtek több, mint 50%-át pusztította el, 160szoros hígításban azonban sejtpusztulás nem történt. Az LC50 érték 1,25–0,625 ml/l között van.

Hígítás mértéke 10x 20x 40x 80x 160x 320x 640x 1.280x Sejtpusztulás mértéke 98% 98% 98% 93% 0% 0% 0% 0% MATCH 050 EC A sejtpusztulás az alkalmazott hígítások mindegyikében 50% felett volt, tehát az LC50 < 0,078 ml/l. Hígítás mértéke 10x 20x 40x 80x 160x 320x 640x 1.280x Sejtpusztulás mértéke 96% 97% 98% 97% 97% 97% 97% 97%

5.2.2. Herbicidek

ALIROX 80 EC A tesztanyag 1.280-szoros hígításakor a sejtek 50%-a pusztult el, tehát az LC50 ~ 0,078 ml/l. Hígítás mértéke 10x 20x 40x 80x 160x 320x 640x 1.280x Sejtpusztulás mértéke 98% 98% 98% 98% 98% 98% 81% 50% 56

CLINIC 480 SL A sejtpusztulás az alkalmazott hígítások mindegyikében 50% felett volt, tehát az LC50 < 0,078 ml/l. Hígítás mértéke 10x 20x 40x 80x 160x 320x 640x 1.280x Sejtpusztulás mértéke 98% 96% 97% 97% 96% 95% 97% 97% GLIALKA 480 PLUS A sejtpusztulás az alkalmazott hígítások mindegyikében 50% felett volt, tehát az LC50 < 0,078 ml/l. Hígítás mértéke 10x 20x 40x 80x 160x 320x 640x 1.280x Sejtpusztulás mértéke 98% 96% 98% 98% 98% 98% 97% 97% TARGA SUPER 5 EC A sejtpusztulás az alkalmazott hígítások mindegyikében 50% felett volt, tehát az LC50 < 0,078 ml/l. Hígítás mértéke Sejtpusztulás mértéke

10x 20x 40x 80x 160x 320x 640x 1.280x 86% 97% 96% 96% 96% 97% 96% 97%

TRENDTM A sejtpusztulás az alkalmazott hígítások mindegyikében 50% felett volt, tehát az LC50 < 0,078 ml/l. Hígítás mértéke 10x 20x 40x 80x 160x 320x 640x 1.280x Sejtpusztulás mértéke 98% 98% 98% 98% 98% 98% 97% 97%

5.2.3. Fungicidek

PREVICUR 607 SL A tesztanyag 10, 20, 40, 80 és 160-szoros hígításban a sejtek több mint 50%-át pusztította el, 640-szeres és 1280-szoros hígításban azonban sejtpusztulás nem történt. Az LC50 érték 0,3125 és 0,625 ml/l között van.

Hígítás mértéke 10x 20x 40x 80x 160x 320x 640x 1.280x Sejtpusztulás mértéke 98% 99% 99% 95% 67% 40% 0% 0%

57

SYSTHANE 12 E A sejtpusztulás az alkalmazott hígítások mindegyikében 50% felett volt, tehát az LC50 < 0,078 ml/l. Hígítás mértéke 10x 20x 40x 80x 160x 320x 640x 1.280x Sejtpusztulás mértéke 98% 98% 98% 98% 98% 98% 96% 87%

5.2.4. Tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények

SILWET L-77 A sejtpusztulás az alkalmazott hígítások mindegyikében 50% felett volt, tehát az LC50 < 0,078 ml/l. Hígítás mértéke 10x 20x 40x 80x 160x 320x 640x 1.280x Sejtpusztulás mértéke 96% 97% 98% 98% 98% 98% 96% 97% SUBSTRAL A tesztanyag 10, 20 és 40 -szeres hígításban a sejtek több mint 50%-át pusztította el, 80-szoros és a feletti hígításban azonban sejtpusztulás nem történt. Az LC50 érték 1,25 és 2,50 ml/l között van. Hígítás mértéke 10x 20x 40x 80x 160x 320x 640x 1.280x Sejtpusztulás mértéke 98% 92% 60% 0% 0% 0% 0% 0%

5.3. A Draize-tesztből származó eredmények 5.3.1. Inszekticidek

ACTELLIC 50 EC – (6) Erősen irritatív A kezelést követően az első 4 napban közepes erősségű kötőhártya vérbőséget és duzzanatot, erős váladékozást figyeltem meg. Az írisz gyulladása 1 és 24 órával a kezelés után volt látható, de a 4. napra regenerálódott. Az első naptól közepes erősségű szaruhártyahomály jelentkezett, ami egy hét alatt felszívódott. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 53,67) a kezelés után 48 órával figyeltem meg.

58

AGROL PLUS – (4) Enyhén irritatív A kötőhártyán közepes/erős elváltozások jelentkeztek, a szaruhártyán nem figyeltem meg elváltozást. Az állatok 72 óra alatt újra tünetmentessé váltak. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 15,33) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

CHINMETRIN 25 EC – (7) Nagyon erősen irritatív Erős vérbőséget, duzzanatot és váladékozást figyeltem meg a kötőhártyán a kezelést követően. A 24 órás megfigyelésnél már írisz és szaruhártya tünetek is jelentkeztek, amelyek a megfigyelési periódus végéig fennálltak. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 69,00) a kezelés után 1 héttel figyeltem meg, a besoroláshoz azonban a 72. órában megfigyelt 63,00 pontszámot vettem figyelembe.

CONFIDOR 200 SL – (5) Közepesen irritatív A kezelés után enyhe/közepes conjunctiva tünetek jelentkeztek. Négy napon belül minden állat tünetmentes volt. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 12,67) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

FENDONA 2 EC – (5) Közepesen irritatív A kezelés utáni első 4 napban közepes/erős conjunctiva tünetek alakultak ki, az egy hetes megfigyelési időpontban azonban minden állat tünetmentes volt. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 17,33) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

KOHINOR 200 SL – (5) Közepesen irritatív A kezelés után kialakult közepes kötőhártya tünetek az egy hetes megfigyeléskor is fennálltak, a szaruhártya tünetek azonban 72 órán belül regenerálódtak. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 22,50) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

MATCH 050 EC – (8) Extrém irritatív A kezelés után 1 órával erős conjunctiva és cornea tünetek jelentkeztek és az írisz gyulladása is megfigyelhető volt. A tünetek nem szűntek a megfigyelési periódus alatt. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 85,00) a kezelés után 72 órával figyeltem meg.

59

MOSPILAN 3 EC – (6) Erősen irritatív Kezelés után erős conjunctiva tünetek jelentkeztek, amelyek a kísérlet alatt végig megmaradtak. Az írisz gyulladása a 4. napra elmúlt. A corneahomály nem szűnt meg a megfigyelési periódus alatt. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 74,00) a kezelés után 72 órával figyeltem meg.

OMITE 57 E – (8) Extrém irritatív Az atka- és rovarölő szerrel történt kezelés után 7 napon keresztül súlyos kötőhártyatünetek jelentkeztek. Az írisz 24 órával a kezelés után begyulladt, és a kísérlet végéig nem regenerálódott. Egy állat az első megfigyelési időpontban, 2 állat a 24 órás megfigyelésnél erős corneahomályt produkált, ami a kísérlet teljes időtartama alatt fennállt. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 85,00) a kezelés után 48 órával figyeltem meg.

PYRINEX 48 EC – (5) Közepesen irritatív Közepes erősségű conjunctiva tünetek és gyenge írisz tünet jelentkezett az első megfigyelési időpontban, viszont minden állat tünetmentes volt 24 órával a kezelés után. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 23,00) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

SHERPA – (5) Közepesen irritatív A kezelés után kialakult közepes kötőhártya tünetek az egy hetes megfigyeléskor is fennálltak, a szaruhártya tünetek azonban ez idő alatt regenerálódtak. A kezelés utáni 1-3. napon írisz tüneteket figyeltem meg. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 35,67) a kezelés után 72 órával láttam.

SUMI-ALPHA 5 EC – (7) Nagyon erősen irritatív Közepes/erős kötőhártya elváltozásokat figyeltem meg a kezelés után. Írisz tünet 24 óránál jelentkezett. Az első napi megfigyeléskor a szaruhártyán közepes erősségű homályt figyeltem meg, ami a megfigyelés végéig fennállt. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 74,00) a kezelés után 72 órával figyeltem meg.

60

TALSTAR 10 EC – (6) Erősen irritatív Egy órával a kezelés után erős tünetek jelentkeztek a kötőhártyán. Huszonnégy órával később megjelentek az írisz és a szaruhártya elváltozásai is, amelyek a megfigyelés teljes ideje alatt fennálltak és erősödtek. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 87,67) a kezelés után 1 héttel figyeltem meg, a besoroláshoz a 72 óránál megfigyelt 43,67-es átlagpontszámot vettem figyelembe.

THIONEX 35 EC – (5) Közepesen irritatív A kezelés közepes/erős tüneteket váltott ki a kötőhártyán. Ezek a tünetek egy hét után enyhültek, de teljesen nem szűntek meg. Írisz tünetek egy állaton alakultak ki és a 4. napra regenerálódtak. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 17.00) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

UNIFOSZ 50 EC – (5) Közepesen irritatív Gyenge vérbőség, közepes váladékozás és erős duzzanat volt látható a kezelés után. Az írisz egy órán belül változott, azonban 2 napon belül regenerálódott. A tünetek egy héten belül nem szűntek meg teljesen. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 19,00) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

ZOLONE 350 EC – (6) Erősen irritatív A kezelés utáni első megfigyeléskor erős conjunctiva és gyenge cornea tünetek látszottak. A szaruhártyahomály a 2-3. napig erősödött. A kezelés utáni napon írisz tünetek is jelentkeztek. Minden elváltozás jelen volt az egy hetes megfigyeléskor is. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 57,00) a kezelés után 48 órával figyeltem meg.

5.3.2. Herbicidek

AFALON DISPERSION – (4) Enyhén irritatív Gyenge/közepes tüneteket (vérbőség, duzzanat, váladékozás) figyeltem meg a kötőhártyán. Szaruhártya és írisz tünet nem jelentkezett. Egy hét alatt az állatok tünetmentesek voltak. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 7,33) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

61

ALIROX 80 EC – (5) Közepesen irritatív Közepes kötőhártya- és gyenge szaruhártya tünetek jelentkeztek a kezelés után, amelyek egy héttel a kezelés után javultak, de nem szűntek meg. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 34,33) a kezelés után 72 órával figyeltem meg.

CLINIC 480 SL – (7) Nagyon erősen irritatív Kezelés után közepes/erős vérbőség, duzzanat és váladékozás jelentkezett. Egy állatnál 1 órán belül, 2 nyúlnál 24 óra elteltével megjelent a szaruhártya homály, valamint az írisz elváltozása is megfigyelhető volt. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 56,67) a kezelés után 1 héttel figyeltem meg, a besoroláshoz a 72 óránál feljegyzett 49,67-es átlagpontszámot vettem figyelembe.

DEZORMON – (7) Nagyon erősen irritatív A kezelés után erős vérbőséget, duzzanatot és váladékozást figyeltem meg, valamint megjelent a szaruhártyahomály és az íriszen is elváltozás látszott. A tünetek a 2. napig erősödtek, és 1 héten belül jelentősen nem enyhültek. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 57,00) a kezelés után 48 órával figyeltem meg.

FALCON 460 EC – (6) Erősen irritatív Közepes/erős conjunctiva tünetek jelentkeztek 1 órával a kezelés után, amelyek a kísérlet teljes ideje alatt fennálltak. Az első megfigyelési időpontban gyenge corneahomály látszott az állatokon, ami azonban az első naptól erősödött és később íriszelváltozással társult. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 38,00) a kezelés után 72 órával figyeltem meg.

FOZÁT 480 – (4) Enyhén irritatív A kezelés után a kötőhártyán enyhe vérbőség és duzzanat, valamint közepes váladékozás jelentkezett. 3 napon belül az összes állat regenerálódott. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 13,00) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

62

GLIALKA 480 PLUS – (6) Erősen irritatív A kezelés után 1 órával erős vérbőséget, váladékozást és duzzanatot figyeltem meg a kötőhártyán. Huszonnégy órával később már szaruhártyahomály és írisz-tünetek is láthatók voltak. Az állatok nem regenerálódtak egy héten belül. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 33,67) a kezelés után 72 órával figyeltem meg.

KAPAZIN – (3) Minimálisan irritatív A kezelés után 1 és 24 órával, közepes/gyenge kötőhártya-tünetek jelentkeztek. Az állatok 48 órán belül tünetmentesek voltak. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 15,00) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

MEDALLON PREMIUM – (4) Enyhén irritatív A kezeléstől számított 2 napon belül enyhe/közepes vérbőség, duzzanat és váladékozás látszott az állatok kötőhártyáján. A 3. napon minden állat tünetmentes volt. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 16,67) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

PERENAL – (5) Közepesen irritatív Gyenge/közepes kötőhártya tünetek jelentkeztek a kezelés utáni első 3 napban. Íriszgyulladás az első 2 napban jelentkezett, a 2. napon enyhe szaruhártyahomályt is megfigyeltem. Az elváltozások a 7. napon már nem voltak láthatók. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 36,00) a kezelés után 48 órával figyeltem meg.

PROPONIT 720 EC – (5) Közepesen irritatív Közepes vérbőséget, erős duzzanatot és váladékozást váltott ki a kezelés. A 2. és 3. kezelt állatnál már az egy órás megfigyelésnél szaruhártya-tüneteket tapasztaltam. A corneahomály maximum 2-es erősségű volt és a szem kisebb területére terjedt ki. Gyulladt íriszt figyeltem meg a 24. órától kezdve a kísérlet végéig. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 37,00) a kezelés után 48 órával figyeltem meg.

STOMP 330 EC – (5) Közepesen irritatív A kezelést követően az első 4 napban közepes erősségű vérbőséget és duzzanatot, erős váladékozást figyeltem meg. Az írisz gyulladása a 3. naptól volt látható. Az első naptól közepes erősségű szaruhártyahomály jelentkezett, ami a kísérlet végéig fennállt. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 40,67) a kezelés után 48 órával figyeltem meg. 63

TARGA SUPER 5 EC – (7) Nagyon erősen irritatív Erős conjunctiva tünetek jelentkeztek 1 órával a kezelés után, amelyek a kísérlet teljes ideje alatt javulás nélkül fennálltak. Az első megfigyelési időpontban gyenge corneahomály látszott az állatokon, ami azonban az első naptól erősödött és a 24. órától írisz-elváltozással társult. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 69,00) a kezelés után 72 órával figyeltem meg.

TOTRIL – (6) Erősen irritatív A határozott conjunctiva tünetek, mint vérbőség, váladékképződés és duzzanat a kezelés utáni 7. napig megfigyelhetők voltak. Az írisz a harmadik naptól a megfigyelési periódus végéig gyulladt volt. Közepes erősségű szaruhártyahomályt figyeltem meg a kísérlet 3. napján, ami a megfigyelés alatt végig fennállt. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 54,33) a kezelés után 72 órával figyeltem meg. TRENDTM – (7) Nagyon erősen irritatív Közepes/erős conjunctiva tünetek jelentkeztek 1 órával a kezelés után, amik a kísérlet teljes ideje alatt javulás nélkül fennálltak. Az első megfigyelési időpontban gyenge corneahomály látszott az állatokon, ami azonban az első naptól erősödött és a 24. órától írisz-elváltozással társult. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 64,00) a kezelés után 48 órával figyeltem meg.

5.3.3. Fungicidek

ALFA-SOLO – (7) Nagyon erősen irritatív A kezelés után egy órával a kötőhártyán erős vérbőség, duzzanat és váladék jelentkezett, a corneán pedig homály alakult ki, ami a kezelést követő napokon erősödött. Huszonnégy órán belül írisz-tüneteket figyeltem meg, ami a kísérlet végéig nem regenerálódott. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 54,00) a kezelés után 72 órával figyeltem meg.

64

CHARISMA 207 EC – (4) Enyhén irritatív A kezelés utáni első két napban gyenge/közepes erősségű conjunctiva tünetek jelentkeztek. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 10,00) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

CONTAF – (5) Közepesen irritatív Kezelés után közepes/erős conjunctivatünetek jelentkeztek, később enyhe corneahomály is megfigyelhető volt, ami a 7. napra teljesen regenerálódott. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 23,00) a kezelés után 24 órával figyeltem meg.

FOLICUR SOLO – (6) Erősen irritatív A kezelés után egy órával a kötőhártyán erős vérbőség, duzzanat és váladék jelentkezett, a corneán pedig homály alakult ki. Írisz-tüneteket nem figyeltem meg. Az elváltozások a kísérlet végéig nem regenerálódtak. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 30,67) a kezelés után 72 órával figyeltem meg.

PREVICUR 607 SL – (3) Minimálisan irritatív A gyenge kötőhártya-tünetek maximum 1 napig álltak fenn. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 14,00) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

RUBIGAN 12 EC – (6) Erősen irritatív A gombairtó az első megfigyelési időpontban erős conjunctivatüneteket okozott, melyek az első 3 napban keveset enyhültek. Gyenge/közepes homály és írisz-elváltozás szintén megfigyelhető volt. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 53,00) a kezelés után 72 órával figyeltem meg.

SYSTHANE 12 E – (7) Nagyon erősen irritatív A gombaölővel történt kezelés után erős kötőhártya és írisz tünetek jelentkeztek, valamint közepes erősségű homály jelentkezett a kezelt nyulak szaruhártyáján. A tünetek csak kis mértékben enyhültek az első 7 napban. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 81,00) a kezelés után 1 héttel figyeltem meg, az értékelés alapjául a 82 óránál feljegyzett 78,33-as átlagpontszám szolgált.

65

TALENDO – (5) Közepesen irritatív A kezelés után jelentkező, közepes erősségű vérbőség, duzzadás és az erősebb váladékképződés a megfigyelési periódus végére enyhült. Több megfigyelési időpontban megfigyelhető szaruhártyahomályt mindössze 1 állat produkált. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 17,67) a kezelés után 24 órával figyeltem meg.

TOPAS 100 EC – (6) Erősen irritatív Kezelés után súlyos vérbőséget, duzzanatot és váladékozást figyeltem meg. Az íriszen 24 órás megfigyeléskor jegyeztem fel az elváltozást, ami a megfigyelési periódus végéig fennállt, csakúgy, mint a közepes erősségű szaruhártyahomály. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 75,00) a kezelés után 48 órával figyeltem meg.

5.3.4. Tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények

ATONIK – (3) Minimálisan irritatív A kezelés után 1 és 24 órával enyhe kötőhártya tüneteket figyeltem meg. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 11,00) a kezelés után 1 órával jegyeztem fel.

COMPO – (3) Minimálisan irritatív A Compo-val történt kezelés után 1 órával az állatok szemén enyhe vérbőség, duzzanat és váladékozás látszott. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 6,00) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

FITO HORM – (3) Minimálisan irritatív A kezelés után 24 órával egy állat enyhe vérbőséget produkált. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 0,67) a kezelés után 24 órával figyeltem meg.

FOLISOL W – (4) Enyhén irritatív A tesztanyag az első megfigyelési időpontban enyhe vérbőséget, duzzanatot és váladékozást okozott a kísérleti állatok szemén. A tünetek enyhültek és a 3. napon minden állat tünetmentes volt. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 10,00) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

66

GENEZIS – (3) Minimálisan irritatív A kezelés utáni első órától a 2. napig enyhe conjunctiva-tünetek jelentkeztek. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 2,00) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

JOLOVIT – (3) Minimálisan irritatív A kezelés utáni első órától a 2. napig enyhe conjunctiva-tünetek jelentkeztek. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 11,00) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

NONIT – (8) Extrém irritatív A gyenge vérbőség mellett erős duzzanatot és váladékozást figyeltem meg; az írisz begyulladt, az eleinte közepes erősségű homály pedig erősödött a megfigyelési idő végéig. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 63,67) a kezelés után 72 órával figyeltem meg.

SILWET L-77 – (7) Nagyon erősen irritatív A kezelés utáni első órától erős vérbőség, duzzanat és váladékozás jelentkezett a kötőhártyán, és a tünetek a megfigyelési időszak végéig fennálltak. Az írisz és cornea-elváltozások szintén az első órában jelentek meg, és a kísérlet végéig erősödtek. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 70,67) a kezelés után 1 héttel figyeltem meg, a kiértékeléshez a 72 óránál feljegyzett 65,33-as átlagpontszámot vettem alapul.

SUBSTRAL – (3) Minimálisan irritatív A kezelés után egy órával közepes erősségű vérbőséget és enyhe duzzanatot figyeltem meg. Huszonnégy óra alatt az összes kezelt állat tünetmentes volt. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 4,67) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

WUXAL – (3) Minimálisan irritatív A kezelés után egy és 24 órával enyhe vérbőséget, váladékot és enyhe duzzanatot figyeltem meg. Negyvennyolc óra alatt az összes kezelt állat tünetmentes volt. A legerősebb tüneteket (Maximum Mean Total Score = 9,00) a kezelés után 1 órával figyeltem meg.

67

6. MEGBESZÉLÉS 6.1. Az inszekticidek eredményeinek összehasonlítása Az inszekticidekkel folytatott vizsgálatok eredményeit a 8. táblázat tartalmazza. Összesen 16 rovarirtó került tesztelésre, ezek közül 9 esetben (56.2%), az Actellic 50 EC, az Agrol Plus, a Chinmetrin 25 EC, a Match 050 EC, a Mospilan 3 EC, az Omite 57 E, a Pyrinex 48 EC, a Sumi-Alpha 5 EC és a Talstar 10 EC esetében egyezik az in vitro HET-CAM tesztből és az in vivo Draize tesztből kapott eredmény. Három tesztanyag (18.8%), a Fendona 2 EC, a Kohinor 200 SL és a Sherpa esetében pedig erősebb irritáció mutatkozott az in vitro teszt során, míg a Confidor 200 SL, a Thionex 35 EC, az Unifosz 50 EC és a Zolone 350 EC tesztelésekor (25%) a HET-CAM teszt gyengébb irritációt mutatott az in vivo teszt eredményénél. 8. táblázat Az inszekticidek eredményei Kísérleti anyag

Eredmény a Draize-tesztből

Eredmény a HET-CAM tesztből

Erős (6)

Erős

Enyhe (4)

Gyenge

Nagyon erős (7)

Erős

Confidor 200 SL*

Közepes (5)

Gyenge

Fendona 2 EC**

Közepes (5)

Erős

Kohinor 200 SL**

Közepes (5)

Erős

Match 050 EC

Extrém (8)

Erős

Mospilan 3 EC

Erős (6)

Erős

Omite 57 E

Extrém (8)

Erős

Pyrinex 48 EC**

Közepes (5)

Közepes

Sherpa**

Közepes (5)

Erős

Nagyon erős (7)

Erős

Erős (6)

Erős

Thionex 35 EC*

Közepes (5)

Gyenge

Unifosz 50 EC*

Közepes (5)

Gyenge

Zolone 350 EC*

Erős (6)

Gyenge

Actellic 50 EC Agrol Plus Chinmetrin 25 EC

Sumi-Alpha 5 EC Talstar 10 EC

*In vivo tesztben erősebb irritáció ** In vitro tesztben erősebb irritáció 68

6.2. A herbicidek eredményeinek összehasonlítása A 15 vizsgált herbicidből 9, a Clinic 480 SL, a Dezormon, a Falcon 460 EC, a Fozát 480, a Glialka 480 Plus, a Stomp 330 EC, a Targa Super 5 EC, a Totril és a TrendTM mutatott azonos eredményt (60%) az in vitro HET-CAM és az in vivo Draize-teszt során. Hat esetben (40%): az Afalon Dispersion, az Alirox 80 EC, a Kapazin, a Medallon Premium, a Perenal és a Proponit 720 EC esetében az in vitro HET-CAM teszt a kémiai irritációt erősebbnek értékelte (9. táblázat). 9. táblázat A herbicidek eredményei Eredmény a Draize-tesztből

Eredmény a HET-CAM tesztből

Enyhe (4)

Erős

Közepes (5)

Erős

Clinic 480 SL

Nagyon erős (7)

Erős

Dezormon

Nagyon erős (7)

Erős

Erős (6)

Erős

Enyhe (4)

Gyenge

Erős (6)

Erős

Minimális (3)

Erős

Enyhe (4)

Erős

Perenal**

Közepes (5)

Erős

Proponit 720 EC**

Közepes (5)

Erős

Stomp 330 EC

Közepes (5)

Közepes

Nagyon erős (7)

Erős

Erős (6)

Erős

Nagyon erős (7)

Erős

Kísérleti anyag Afalon Dispersion** Alirox 80 EC**

Falcon 460 EC Fozát 480 Glialka480 Plus Kapazin** Medallon Premium**

Targa Super 5 EC Totril TrendTM

**In vitro teszben erősebb irritáció

69

6.3. A fungicidek eredményeinek összehasonlítása A fungicidekkel folytatott vizsgálatok eredményeit a 10. táblázat tartalmazza. Összesen 9 folyékony gombaölő szert vizsgáltam, ezek közül a Charisma 207 EC, a Folicur Solo, a Previcur 607 SL, a Systhane 12 E és a Topas 100 EC esetében (55.6%) egyeznek az in vitro HET-CAM és az in vivo Draize tesztekből kapott eredmények. Az Alpha-Solo, a Contaf, a Rubigan 12 EC és a Talendo tesztelése során (44,4%) az in vitro HET-CAM teszt eredményei gyengébb irritációt mutattak az in vivo Draize tesztben megfigyelt eredménynél.

10. táblázat A fungicidek eredményei Kísérleti anyag

Eredmény a Draize-tesztből

Eredmény a HET-CAM tesztből

Nagyon erős (7)

Gyenge

Enyhe (4)

Gyenge

Közepes (5)

Gyenge

Erős (6)

Erős

Previcur 607 SL

Minimális (3)

Gyenge

Rubigan 12 EC*

Erős (6)

Gyenge

Nagyon erős (7)

Erős

Közepes (5)

Gyenge

Erős (6)

Erős

Alfa-Solo Charisma 207 EC Contaf* Folicur Solo

Systhane 12 E Talendo* Topas 100 EC

*In vivo tesztben erősebb irritáció

70

6.4. A tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények eredményeinek összehasonlítása A tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítményekkel folytatott vizsgálatok eredményei a 11. táblázatban láthatók. Összesen 10 készítményt használtam fel; az in vitro HET-CAM és az in vivo Draize tesztből kapott eredmény 9 esetben (90%), az Atonik, a Compo, a Fito Horm, a Folisol W, a Genezis, Jolovit, Nonit, Silwet L-77 és a Substral esetén egyezik. A Wuxal (10%) tesztelésekor az in vitro HET-CAM teszt erősebb irritációt mutatott, mint az in vivo teszt.

11. táblázat A tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények eredményei Eredmény a Draize-tesztből

Eredmény a HET-CAM tesztből

Atonik

Minimális (3)

Gyenge

Compo

Minimális (3)

Gyenge

Fito Horm

Minimális (3)

Gyenge

Folisol W

Enyhe (4)

Gyenge

Genezis

Minimális (3)

Gyenge

Jolovit

Minimális (3)

Gyenge

Nonit

Extrém (8)

Erős

Nagyon erős (7)

Erős

Substral

Minimális (3)

Gyenge

Wuxal**

Minimális (3)

Erős

Kísérleti anyag

Silwet L-77

**In vitro teszben erősebb irritáció

71

6.5. A citotoxicitási vizsgálatok eredményei A citotoxicitási vizsgálatok során 12 mezőgadasági vegyi anyag teszteléséből kaptam értékelhető eredményt. Az in vivo Draize teszt során erősen irritatívnak mutatkozó kísérleti anyagok: az Actellic 50 EC, a Clinic 480 SL, a Glialka 480 Plus, a Match 050 EC, a Silwet L77, Systhane 12 E, Targa Super 5 EC és a TrendTM az alkalmazott legnagyobb, 1280-szoros hígításban is elpusztította a kezelt sejtek több, mint 50%-át (LC50 < 0,78 ml/l). Az Alirox 80 EC és a Confidor 200 SL az in vivo tesztben közepesen irritatívnak bizonyult, míg az MTTAssay során a Confidor 160-szoros hígításban már nem okozott sejtpusztulást, az Alirox 80 EC pedig 1280-szoros hígításban a sejtek 50%-át pusztította el. A Previcur 607 SL és a Substral a Draize teszt alapján minimálisan irritatív, a citotoxicitási tesztben a Previcur 640, a Substral 80-szoros hígításban már nem okozott sejtpusztulást. Az erősebb irritációs potenciállal rendelkező vegyi anyagok még nagyobb hígításban is magasabb arányú sejtpusztulást okoznak. A gyengén irritatív kísérleti anyagok esetén 80szoros, a közepesen irritatív peszticideknél az 1280-szoros hígításban már nem figyeltem meg sejtpusztulást. Az Alirox 80 EC az 1280-szoros hígításban a kezelt sejtek pontosan 50%-át pusztította el. Az in vivo Draize teszt során erős irritációt mutató anyagok mindegyike a kezelt sejtek több, mint 50%-át pusztította el az 1280-szoros hígításban. Az MTT vizsgálatban alkalmazott kísérleti anyagok LC50 értéke a 12. táblázatban látható. 12. táblázat A citotoxicitási vizsgálatok eredményei Kísérleti anyag

Eredmény a Draize-tesztből

Actellic 50 EC Alirox 80 EC Clinic 480 Confidor 200 SL Glialka 480 Plus Match 050 EC Previcur 607 SL Silwet L-77 Substral Systhane 12 E Targa Super 10 EC TrendTM

Erős (6) Közepes (5) Nagyon erős (7) Közepes (5) Erős (6) Extrém (8) Minimális (3) Nagyon erős (7) Minimális (3) Nagyon erős (7) Nagyon erős (7) Nagyon erős (7)

72

Eredmény az MTT-Assay-ből (LCC50, ml/l) < 0,078 ~ 0,078 < 0,078 1,25–0,625 < 0,078 < 0,078 0,625 – 0,3125 < 0,078 2,50–1,25 < 0,078 < 0,078 < 0,078

6.6. A HET-CAM teszt és a Draize-féle teszt eredményeinek statisztikai vizsgálata Az in vitro HET-CAM tesztből és az in vivo Draize-féle primer szemirritációs tesztből származó eredmények statisztikai összehasonlítását a Pearson-féle (Pearson, 1901) korrelációs vizsgálattal végeztem.

Az 50 kísérleti anyag eredményeinek összehasonlításakor a Pearson-féle korrelációs együttható értéke r = 0,526248, ami egy közepes erősségű, pozitív irányú korrelációnak felel meg.

A Student-féle t-próbát 50 változóval, 95%-os valószínűségre alkalmaztam, ahol t számított értéke 4,28769, táblázat szerinti értéke pedig 2,0105. Mivel a számított érték magasabb a táblázat értékénél, ezért a kapcsolat bizonyított.

73

6.7. Következtetések és javaslatok A perspektivikus alternatív módszerek közé tartoznak a tyúktojás chorioallantois membránját (CAM) használó in vitro vizsgálati módszerek (Walum és mtsai, 1992), köztük a HET-CAM teszt. A HET-CAM teszt megfelel az in vitro módszerekkel szemben általánosan támasztott követelményeknek. Olcsóbb és gyorsabb, mint a hagyományos Draize-féle primer szemirritációs vizsgálat, az eredményei jól reprodukálhatóak, az érzékenysége pedig kiemelkedő. A vizsgálatban tesztobjektumként tyúktojást használ, ezáltal a kísérletekben felhasznált emlős állatok száma jelentősen csökkenthető. A módszer széleskörű elterjedése az emlősállatok mellőzését is maga után vonhatná a kísérleti toxikológia ezen területén. Hátránya azonban a kiértékelés szubjektív természete, valamint a tény, hogy bizonyos (pl. szilárd és színes) anyagok vizsgálata ezzel a módszerrel körülményes, így ezen anyagok fizikai-kémiai tulajdonságai befolyásolhatják az eredmények kiértékelését.

A HET-CAM teszt alkalmazhatóságának fizikai korlátai a színes és szilárd anyagok alkalmazásakor jelentkeznek. A színes, átlátszatlan anyagok a membránt elfedik, megszínezik, ami a chorioallantois membránon kialakuló elváltozások értékelést nehezíti vagy akár lehetetlenné is teheti. Blein és mtsai (1991) jó eredményeket kaptak a 10%-os koncentrációjú vizsgálati anyagok in vitro HET-CAM teszttel végzett vizsgálatai során. Az eredeti, Luepke által kidolgozott módszerben (1986) az oldhatatlan anyagokat 20 másodperces expozíciós időt követően leöblítik a CAM felületéről, és 300 másodperces megfigyelési időt alkalmazva értékelik a jelentkező elváltozásokat. Ezt az eljárást Van Erp és Weterings, (1990), Lawrence és mtsai, (1990), Kojima és mtsai (1995) is alkalmazták. A kiöblítés azonban önmagában is membránkárosító lehet, így az eredmények megbízhatósága megkérdőjelezhető. További hátrányként jelentkezhet még az egyébként is jellemző nagyfokú szubjektivitás, amely a CAM-on jelentkező elváltozások értékelésénél tapasztalható. A különböző kémiai karakterű vegyi anyagok (ipari és háztartási vegyi anyagok, kozmetikai készítmények, gyógyszerek) in vitro HET-CAM teszttel meghatározott irritációs eredményei általában jó korrelációt mutatnak az in vivo eredményekkel (Leighton és mtsai, 1985; Luepke és Kemper, 1986, Luepke és Wallat, 1987; Van Erp és Weterings, 1990; Blein és mtsai, 1991; Rougier és mtsai, 1992; Bagley és mtsai, 1992, 1994; Spielmann és mtsai, 74

1993, 1996; Sina és mtsai, 1995; Christian és Diener, 1996). Lawrence és mtsai (1990), valamint Bruner és mtsai (1991) azonban a vizsgálataikban nagyobb eltérésekről számoltak be az in vitro és az in vivo eredmények között. Az OECD 405 guideline 2011-ben felülvizsgált és elfogadott változata lépcsőzetes vizsgálati stratégiát ír elő, melyben az in vivo vizsgálatot in vitro és/vagy ex vivo vizsgálat előzi meg (www.oecd.org). A vizsgálataim során alkalmazott növényvédő szerek esetében elmondható, hogy az in vitro HET-CAM teszt és a Draize-féle in vivo tesztek eredményei jól korrelálnak egymással, tehát a módszer használható agrokemikáliák irritációs potenciáljának meghatározására. Ahol az in vivo eredmények nem egyeztek az in vitro eredményekkel (38%), a HETCAM teszt nagyrészt erősebb irritációt értékelt (20%), amely a kísérleti módszer nagyfokú érzékenységével magyarázható. Ezen fokozott érzékenység az emberi egészségkockázat meghatározásánál előnyös lehet, figyelembe véve a legrosszabb eset (worst case) alapú megközelítést. Kilenc kísérleti anyag (18%) mutatott erősebb irritációt a Draize-teszt során, mint a HET-CAM tesztben, ezek közül 5 inszekticid (10%), 4 fungicid (8%) fungicid készítmény. Ez a jelenség valószínűleg az agrokemikáliák késleltetett hatása miatt lehet, amit csak hosszabb expozíció által fejtenek ki. A német hatóságok 1992-től elfogadják a chorioallantois membránt felhasználó in vitro módszerek felhasználását az erősen irritatív anyagok (R 41) meghatározására (Balls és mtsai, 1999). Az általam mezőgazdasági vegyi anyagokkal elvégzett kísérletek in vivo és in vitro eredményeinek összehasonlítása és a nemzetközi szakirodalomban található hasonló jellegű eredmények alapján a HET-CAM teszt jelenleg nem alkalmas az in vivo Draize-féle primer szemirritációs vizsgálat kiváltására; jelen formájában pre-screen módszerként javasolható, így a felhasznált emlős kísérleti állatok számának csökkentésére alkalmas. Célszerű lenne a vizsgálatot további mezőgazdasági vegyi anyagokkal elvégezni, és az eredményeket az in vivo tesztben

megállapított

irritációs

potenciállal

összevetni,

továbbá

javaslom

szilárd

halmazállapotú kemikáliák vizsgálatát ezen módszerrel. A MTT citotoxicitási vizsgálatból származó eredmények azt mutatják, hogy a vizsgálati módszer alkalmas lehet agrokemikáliák irritációs potenciáljának becslésére. További vizsgálatok elvégzése mindenképpen javasolt, mivel az általam vizsgált mezőgazdasági vegyi anyagok száma (12) alapján csak előzetes következtetések vonhatóak le, de az összehasonlító eredmények alapján (11 kísérleti anyag esetében (92%) azonos in vivo és in vitro irritációs 75

potenciálok) mindenképpen indokolt további kísérleti anyagok ezen módszerrel való vizsgálata. Az in vitro MTT-Assay alkalmazásával továbbá vizsgálható lenne azon szilárd anyagok irritációs potenciálja, ami a HET-CAM teszttel még körülményesen értékelhető. A kettő in vitro technika együttes alkalmazásával a valós irritáció alábecsülésének az esélye vizsgálataim során csökkent, ezért javaslom további anyagok vizsgálatát mindkét módszerrel. Érdemes lenne további alternatív módszereket a HET-CAM teszttel és a citotoxicitási vizsgálattal egyidejűleg alkalmazni, így az esetleges hibalehetőséget minimálisra csökkenteni.

Az általam vizsgált mezőgazdasági vegyi anyagok közül a HET-CAM teszt 25%-ban becsülte alá az irritációt az inszekticidek esetében, és 44%-ban a fungicidek tesztelése során. Az in vivo tesztekben ezen anyagok hosszan fennálló tüneteket okoztak. Érdemes lenne megvizsgálni az adott kemikáliák hatásmechanizmusát, és a HET-CAM tesztben hasonló típusú vegyületek által okozott elváltozásokat megfigyelni, így a későbbiekben az irritáció alábecsülésének az esélye csökkenhetne. Javaslom továbbá ugyanezen anyagok MTT-Assay-vel való vizsgálatát is.

76

7. ÖSSZEFOGLALÁS

A növényvédő szerek használata még napjainkban is szükséges a mezőgazdasági termelés megfelelő működése érdekében. A gyakorlati alkalmazás során azonban a peszticidek a nem-célszervezetekre is hatást gyakorolnak, közvetlenül vagy közvetve károsíthatják az élővilágot. A talajba kerülve az ott élő ökoszisztémát, a talajvízbe, felszíni vizekbe jutva a vízi szervezeteket károsíthatják; a táplálékláncban való feldúsulás esetén a végső fogyasztó, az ember is érintetté válhat. A növényvédő szerekkel foglalkozó ember a munkája során (napi gyakorisággal) kerülhet érintkezésbe a vegyi anyagokkal. A kijuttatás alkalmával a helyi elváltozás, esetleg felszívódás után a szisztémás mérgezés esélye is számottevő. A testfelszín vonatkozásában különböző mértékű szem- és bőrkárosodással kell számolnunk. A szembe jutott mérgező anyagok az enyhe, reverzibilis kötőhártya-gyulladástól kezdve súlyos és maradandó szemkárosodást, szaruhártyahomályt, sőt vakságot és egyéb életveszélyes károsodást okozhatnak (Bordás, 1971). A szemre gyakorolt kémiai irritációs hatásokat jelenleg a Draize-féle módszer szerint, kísérleti nyúlon vizsgálják. Mivel a kísérlet az állatra nézve jelentős fájdalommal járhat, több olyan alterntív és in vitro módszer áll fejlesztés alatt, ami később az in vivo tesztet felválthatja. A primer szemirritáció területén az OECD 1987-ben beleegyezett abba, hogy a jól érvényesített in vitro tesztekből származó adatokat elfogadják az in vivo adatok helyett. A perspektivikus alternatív módszerek közé tartoznak a tyúktojás chorioallantois membránját (CAM) használó in vitro vizsgálati módszerek is. Kísérleteimben mezőgazdasági vegyi anyagok irritációs potenciálját vizsgáltam az in vitro HET-CAM teszttel, valamint néhány anyagot citotoxicitási viszgálatnak vetettem alá. A nemzetközi szakirodalmak alapján a CAM-t használó vizsgálati módszereket ez idáig kozmetikumok, ipari és háztartási vegyi anyagok irritatív potenciáljának meghatározására használták fel, a tesztelt agrokemikáliák száma még alacsony. A vizsgálataim eredményei így újnak tekintendőek. Vizsgálataim során összesen 50, a nem irritatív és irritatív kategóriákba eső mezőgazdasági vegyi anyag irritációs potenciálját vizsgáltam in vitro HET-CAM teszttel és in

77

vivo Draize-féle primer szemirritációs vizsgálattal. A citotoxicitási vizsgálatban 12 vizsgálati anyagot teszteltem. Az in vitro HET-CAM tesztet az Invittox Protocol 47. száma alapján végeztem el. A kísérlet elvégzésekor mindegyik vizsgálati anyagot 100%-os koncentrációban alkalmaztam. A tojásokat 70%-os páratartalom mellett 37 oC-on keltettem, 9 napon át napi gyakorisággal forgattam, hogy elkerüljem az embrió letapadását. A 10. napon, lámpázás után a hibás tojásokat eltávolítottam, majd előkészítés után a chorioallantois membránra cseppentettem a vizsgálati anyagokat. A kezelést minden esetben 4 alkalommal, 6 ismétlésben végeztem el. A CAM-on jelentkező elváltozásokat és a változások megjelenési időpontjait másodpercekben rögzítettem, majd ezekből irritációs indexeket számoltam. A citotoxikológiai vizsgálatot az Invittox Protocol 17. száma alapján, 12 tesztanyaggal, afrikai zöldmajom vese epithelsejteken végeztem, amelyeket 24 órával a vizsgálat megkezdése előtt megfelelő szuszpenzióban mikroteszt lemez vájataiba vittem. Másnap a sejtek tápoldatát friss, 10% vizsgálati mintát tartalmazó tápoldatra cseréltem. A 24 órás expozíció után 2 órán át 1 mg/ml MTT-oldattal inkubáltam a sejteket, majd a keletkezett formazán kristályokat metanollal oldottam. Az oldat fényelnyelését 570 és 630 nm hullámhosszon mértem. Az élő sejtek száma az (OD570–OD630) értékkel arányos. Kontrollként kezeletlen sejteket használtam. Az in vivo Draize-féle primer szemirritációs vizsgálatot összehasonlító szándékkal végeztem el az OECD 405 Guideline alapján. A kísérletben új-zélandi fehér nyulat használtam. A bal oldali szem kötőhártyazsákjába 0,1 mL kísérleti anyagot juttattam, majd az elváltozásokat 1, 24, 48, 72 óra múlva, valamint egy héttel a kezelés után értékeltem. A vizsgálatba vont mezőgazdasági vegyi anyagoknak az in vitro HET-CAM és az in vivo Draize-féle tesztekkel meghatározott irritációs indexeit és irritációs potenciáljait a 13. táblázat tartalmazza.

78

13. táblázat Az in vivo és in vitro eredmények összehasonlítása

Eredmény a Draize-tesztből

Eredmény a HET-CAM tesztből

Eredmény az MTT-Assay-ből

Erős

Erős

Erős

Enyhe

Gyenge

-

Chinmetrin 25 EC

Nagyon erős

Erős

-

Confidor 200 SL

Közepes

Gyenge

Közepes

Fendona 2 EC

Közepes

Erős

-

Kohinor 200 SL

Közepes

Erős

-

Match 050 EC

Extrém

Erős

Erős

Mospilan 3 EC

Erős

Erős

-

Omite 57 E

Extrém

Erős

-

Pyrinex 48 EC

Közepes

Gyenge

-

Sherpa

Közepes

Erős

-

Nagyon erős

Erős

-

Talstar 10 EC

Erős

Erős

-

Thionex 35 EC

Közepes

Gyenge

-

Unifosz 50 EC

Közepes

Gyenge

-

Zolone 350 EC

Erős

Gyenge

-

Enyhe

Erős

-

Alirox 80 EC

Közepes

Erős

Közepes

Clinic 480 SL

Nagyon erős

Erős

Erős

Dezormon

Nagyon erős

Erős

-

Erős

Erős

-

Enyhe

Gyenge

-

Erős

Erős

Erős

Minimális

Erős

-

Enyhe

Erős

-

Perenal

Közepes

Erős

-

Proponit 720 EC

Közepes

Erős

-

Kísérleti anyag Actellic 50 EC Agrol Plus

Sumi-Alpha 5 EC

Afalon Dispersion

Falcon 460 EC Fozát 480 Glialka 480 Plus Kapazin Medallon Premium

79

13. táblázat folytatása

Közepes

Eredmény a HET-CAM tesztből Közepes

Nagyon erős

Erős

Erős

Erős

Erős

-

Nagyon erős

Erős

Erős

Nagyon erős

Gyenge

-

Enyhe

Gyenge

-

Közepes

Gyenge

-

Erős

Erős

-

Previcur 607 SL

Minimális

Gyenge

Közepes

Rubigan 12 EC

Erős

Gyenge

-

Systhane 12 E

Nagyon erős

Erős

Erős

Közepes

Gyenge

-

Erős

Erős

-

Atonik

Minimális

Gyenge

-

Compo

Minimális

Gyenge

-

Fito Horm

Minimális

Gyenge

-

Folisol W

Enyhe

Gyenge

-

Genezis

Minimális

Gyenge

-

Jolovit

Minimális

Gyenge

-

Nonit

Extrém

Erős

-

Nagyon erős

Erős

Erős

Substral

Minimális

Gyenge

Gyenge

Wuxal

Minimális

Erős

-

Kísérleti anyag Stomp 330 EC Targa Super 5 EC Totril Trend

TM

Alfa-Solo Charisma 207 EC Contaf Folicur Solo

Talendo Topas 100 EC

Silwet L-77

Eredmény a Draize-tesztből

Eredmény az MTT-Assay-ből -

A HET-CAM teszt in vitro módszerként megfelel azoknak a követelményeknek, amelyeket az in vitro kísérleti módszerekkel szemben általában támasztanak. Olcsóbb és gyorsabb, mint a hagyományos in vivo primer szemirritációs vizsgálat, érzékenysége nagy, az eredményei jól reprodukálhatóak. Tesztobjektumként tyúktojást használ, ezáltal az emlős kísérleti állatok felhasználása jelentősen csökkenthető. Hátrányai közé tartozik a szubjektivitás és a tény, hogy

80

a kísérleti anyagok fizikai és kémiai tulajdonságai befolyásolhatják az eredmények kiértékelését. Az általam végzett vizsgálatok eredményei alapján elmondható, hogy az in vitro HETCAM tesztből kapott eredmények és a Draize-féle in vivo eredmények nagy arányban egyeznek, eltérés esetén pedig az in vitro módszer pozitív tévedése látható, amely nagyfokú érzékenységéből ered. A HET-CAM teszt, mint elővizsgálati módszer így alkalmas lehet növényvédő szerek irritatív potenciáljának meghatározására. Az összehasonlító vizsgálatok esetében az in vitro eredmények jó korrelációt (r = 0,530644) mutatnak az in vivo adatokkal. A HET-CAM teszt alkalmazhatósági korlátai elsősorban azon mezőgazdasági és egyéb vegyi anyagok tesztelésekor jelentkeznek, amelyek fizikai és kémiai tulajdonságuknál (színes, nagy sűrűségű anyagok) fogva elfedik a membránt, és így akadályozzák a CAM-on a kezelés hatására kialakuló elváltozások megfigyelését és értékelését. Megoldást jelenthet ezen tömény állapotban átlátszatlan, illetve színes vegyi anyagok vizsgálata során a tízszeres hígítású koncentrációk alkalmazása. A kísérletbe vont mezőgazdasági vegyi anyagok in vivo és in vitro eredményeinek összehasonlításából és a szakirodalomban található hasonló jellegű vizsgálatok (Budai, 1995, 1997, 1998, 2002; Budai és Várnagy, 2002) eredményei alapján a HET-CAM teszt nem alkalmas az in vivo Draize-féle primer szemirritációs vizsgálat teljes egészében történő kiváltására. A teszt jelen formájában, mint szemirritációs elővizsgálati módszer javasolható, így alkalmazásával csökkenthető a kísérletekben felhasznált emlős állatok száma. Az MTT citotoxicitási vizsgálatból származó eredmények azt mutatják, hogy a vizsgálati módszer alkalmas lehet agrokemikáliák irritációs potenciáljának becslésére. További vizsgálatok elvégzése mindenképpen javasolt, mivel az általam vizsgált mezőgazdasági vegyi anyagok száma alapján csak előzetes következtetések vonhatóak le, de az eredmények alapján mindenképpen indokolt további kísérleti anyagok ezen módszerrel való vizsgálata. Az in vitro HET-CAM teszt fontos eleme lehet azon in vitro tesztrendszernek, amely a jövőben képes lesz az in vivo Draize-féle primer szemirritációs vizsgálat kiváltására.

81

8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Budai Péter egyetemi docensnek, aki kutatási munkám irányításán túl hasznos elméleti tanácsaival és gyakorlati észrevételeivel járult hozzá doktori értekezésem elkészítéséhez.

Szeretném megköszönni a kísérleti munka alatt, valamint a disszertáció elkészítésében nyújtott önzetlen segítségét Dr. Várnagy László egyetemi tanárnak, Dr. Szabó Ritának, Dr. Juhász Évának, Dr. Fejes Sándornak, Kormos Éva PhD hallgatónak és Tarsoly Gáborné laboránsnak.

Köszönettel tartozom Dr. Pálovics Ágnesnek, aki a citotoxicitási vizsgálatok elvégzésében és értékelésében nyújtott nélkülözhetetlen segítséget.

Végül és legfőképpen köszönettel tartozom Szüleimnek és mindazoknak, akik támogattak és bíztattak.

82

9. IRODALOMJEGYZÉK AMES, N.B., MCCANN, J., YAMASAKI, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella /Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Research, 31: 347-364

BAGLEY D.M., KONG B.M., DESALVA S.J. (1989). Assessing the eye irritation potential of surfactant-based materialsusing the chorioallantoic membrane vascular assay (CAMVA). AM Goldberg (Ed.): Alternative methods in toxicology series - Symposium on in vitro toxicology: new directions. Mary Ann Liebert, Inc., New York; 7; 265-272.

BAGLEY D.M., RIZVI P.Y., KONG B.M., SALVA S.J. (1991). Factors affecting use of the hens egg chorioallantoic membrane as a model for predicting eye irritation potential.; Journal of toxicology / Cutaneous and ocular toxicology; 10; 95-104.

BAGLEY, D.M., BRUNER, L.H., DE SILVA, O. (1992): An evaluation of five potential alternatives in vitro to the rabbit eye irritation test in vivo. Toxicol In Vitro. 6. 4. 275284.

BAGLEY, D.M., WATERS, D., AND KONG, B.M. (1994). Development of a 10-day chorioallantoic membrane vascular assay as an alternative to the Draize rabbit eye irritation test. Food and Chemical. Toxicology. 33(12):1155-1160.

BAGLEY, D.M., BOOMAN, K.A., BRUNNER, L.H. (1994a): The SDA Alternatives Program Phase III.: comparison of in vitro data with animal eye irritation data on solvents, surfactants, oxidizing agent, and prototype cleaning products. J. Toxicol. Cutan Ocular Toxicol. 13. 2. 127-155.

BALLS, M., BERG, N., BRUNER L.H., CURREN, R.D., DE SILVA, O., EARL, L.K., ESDAILE, D.J., FENTEM, J.H., LIEBSCH, M., OHNO, Y., PRINSEN, M.K., SPIELMAN, H., WORTH, A.P. (1999): Eye irritation testing: The way forward. ATLA. 27. 53-77.

83

BEVERIDGE, W. I. B., BURNET, F.M. (1946). The cultivation of viruses and rickettsiae in the chick embryo. Medical Research Council, Special Report Seres No. 256, London.

BLEIN, O., ADOLPHET, M., LAKHDAR, B., CAMBAR, J., GUBANSKI, G., CASTELLI, D., CONTIE, C., HUBERT, F., LATRILLE, F., MASSON, P., CLOUZEAU, J., LE BIGOT, J.F., DE SILVA, O., DOSSOU, K.G. (1991): Correlation and validation of alternative methods to the Draize eye irritation test (OPAL Project). Toxic. In Vitro. 5. 5/6. 555-557.

BOGENFÜRST F. (2004): A keltetés kézikönyve. Gazda Kiadó. Budapest. 42-63. old.

BORDÁS S. (1971): A növényvédő szer mérgezés elsősegélynyújtása. Mezőgazdasági és Élelmezésügyi Minisztérium. Budapest, 1971. 21.

BRUNER, L.H., DENVER, J.K., ROBERTS, D.A., PARKER, R.D. (1991): Evaluation of seven in vitro alternatives for ocular safety testing. Fund. Appl. Toxicol. 17. 136-149.

BUDAI P., FÁNCSI T., VÁRNAGY L., FEJES S.: Effects of irritative pesticides and a technical component on tissue structure of CAM. Georgikon for Agric., 2002. 13. 87-96.

BUDAI P., KISS ZS.I., SOMLYAY I.M., VÁRNAGY L.: ln vitro irritancy test on hen’s eggs with some pesticide components. Med. Fac. Landbouww. Univ. Gent, 1998. 63/2a. 315 319.

BUDAI P., VÁRNAGY L., SOMLYAY I., VARGA T.: Ocular irritation study of some pesticides in HE'I'-CAM test. Med.. Fac. Landbouww. Univ. Gent, 1997. 62/2a. 265 268.

BUDAI P., SOMLYAY I., VÁRNAGY L., VARGA T.: Comparison of in vitro (HE'I'-CAM) and in vivo (Draize) irritation tests using different pesticides. Med. Fac. Landbouww. Univ. Gent,1995. 60/2b. 593 - 597.

BUDAI P., VÁRNAGY L.: In vitro ocular irritation toxicity study of some pesticides. Acta Vet Hung., 2000. 48. 221-228. 84

BUDAI P., FÁNCSI T., VÁRNAGY L.: Histological examination of CAM treated with irritative pesticides. Proceedings of the 6th Meeting of the Central and Eastern European Section of SECOTOX. Central Eur. J. Publ. Hlth, 2000. 8. 68.

BUDAI P., VÁRNAGY L.: Növényvédő szerek in vitro (HET CAM) és in vivo (Draize) összehasonlító szemirritációs vizsgálata. Növényvédelem, 2002. 38. 389 –395.

BUDAI P., VÁRNAGY L., SOMLYAY I., KULCSÁR SZABÓ Z.: Irritative effects of some pesticides and a technical component on tissue structure of the chorioallantoic membrane. Comm. Agr. Appl. Biol. Sci., Ghent Univ., 2004. 69/4. 807-809.

CARSON, E. R. (1986): The role of mathematical models. ATLA. 13. 4. 295-299.

CHRISTIAN, M.S., DIENER, R. (1996): Soaps and detergents: Alternatives to animal eye irritation tests. Journal of the American College of toxicology. 15. 1-44.

DEBBASCH, C., EBENHAHN, C., DAMI, N., PERICOI, M., VAN DEN BERGHE, C., COTTIN, M., NOHYNEK, G.J. (2005): Eye irritation of low-irritant cosmetic formulations: correlation of in vitro results with clinical data and product composition. Food Chem Toxicol. 2005. 43. (1): 155-165.

DIECKERT, J.W., DIECKERT, M.C., CREGER, C.R. (1992): The avian shell membrane pecialized extracellular matrix: implications for differentiation of the chorioallantoic membrane. SAAS Bulletin: Biochem. and Biotech., 5, 30-37.

DRAIZE, J., WOODARD, G., CALVERY, H. (1944): Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 82. 377-390.

ESKES, C., BESSOU, S., BRUNER, L., CURREN, R., HARBELL, J., JONES, P., KREILING, R., LIEBSCH, M., MCNAMEE, P., PAPE, W., PRINSEN, M.K., SEIDLE,

85

T., VANPARYS, P., WORTH, A., ZUANG, V. (2005). ECVAM Report: Subgroup 3. Eye Irritation. ATLA – Alternatives to Laboratory Animals 33 (Supplement 1), 47-81.

FÁNCSI T., FEHÉR GY. (1978): A chorioallantois-membrán (CAM) szerkezetváltozása a keltetés során, csirkében. Magy. Áo. Lapja. 6. 403-407.

FEHÉR GY. (1989): Háziállatok tájanatómiája. Mezőgazdasági Kiadó. Budapest, 1989. 57-58.

FISHER, M., SCHOENWOLF, G. C. (1983). The use of early chick embryos in experimental embryology and teratology: improvements in standard procedures. Teratology. 27. 65.

GÁBORJÁNYI R., KŐMÍVES T., KIRÁLY Z. (1995): A fenntartható mezőgazdaság növényvédelme. Növényvédelem, 31. 2. 49-53.

HAGINO S., ITAGAKI H., KATO S., KOBAYASHI T., TANAKA M. (1991). Quantitative evaluation to predict the eye irritancy of chemicals: Modification of chorioallantoic membrane test by using trypan blue. Toxicology in Vitro 5, 301-304.

HAGINO S., ITAGAKI H., KATO S., KOBAYASHI T. (1993). Further evaluation of the quantitative chorioallantoic membrane test using trypan blue stain to predict the eye irritancy of chemicals. Toxicology in Vitro 7, 35-39.

HAGINO S., KINOSHITA S., TANI N., NAKAMURA T., ONO N., KONISHI K., IIMURA H., KOJIMA H., OHNO Y. (1999). Interlaboratory validation of in vitro eye irritation tests for cosmetic ingredients. (2) Chorioallantoic membrane (CAM) test.; Toxicology in vitro; 13(1); 99-113.

HAMILTON, H.L. (1952): Lillie’s development of the chick. Holt, Rinehart and Winston, Inc., New York, 1952. 272-291.

HOLDAS,

S.

(1976).

Házinyúltenyésztés.

In:

Mezőgazdasági Kiadó. Budapest, 1976. 343.

86

Horn,

A.

(szerk.).

Állattenyésztés.

HUHTALA, A., SALMINEN, L., TÄHTI, H., UUSITALO, H. (2008). Corneal Models for the Toxicity Testing of Drugs and Drug Releasing Materials. Topics in Multifunctional Biomaterials and Devices, Ed. N Ashammakhi 2008.m

Invittox Protocol Number 47. HET-CAM test 1990. Invittox Protocol Number 17. MTT ASSAY 1990.

ITAGAKI H., HAGINO S., KATO S. (1995) CAM-TBS test.; Invittox Protocol; 108.

KAY, J.H., CALANDRA, J.C. (1962): Interpretation of eye irritation tests. J. Soc. Cos. Chem. 13:281-289.

KISHORE, A.S., SUREKHA, P.A., SEKHAR P.V.R., SRINIVAS, A., P. BALAKRISHNA MURTHY (2008): Hen Egg Chorioallantoic Membrane Bioassay: An In Vitro Alternative to Draize Eye irritation Test for Pesticide Screening. International Journal of Toxicology 2008 27: 449.

KISS I. (1997): Szervek és szervrendszerek toxikológiája. In: Kiss, I. (szerk.): Toxikológia. Veszprémi Egyetemi Kiadó. Veszprém, 1997. 54-55.

KOJIMA, H., HANAMURA, A., MIYAMOTO, S., SATO, A., KONISHI, H., YOSHIMURA, I. (1995): Evaluation of seven alternative assays on the main ingredients in cosmetics as predictors of Draize eye irritation scores. Toxic. In Vitro. 9. 3. 333-340.

KOVÁCS GY., FEHÉR GY. (1966): Fejlődéstan. Mezőgazdasági Kiadó. Budapest, 1966. 140-149.

LAGARTO, A., VEGA, R., GUERRA, I., GONZÁLEZ, R. (2005): In vitro quantitative determination of ophthalmic irritancy by the chorioallantoic membrane test with trypan blue staining as alternative to eye irritation test. Toxicology in Vitro 20 (2006) 699-702.

LAMBERT, L.A., CHAMBERS, W.A., GREEN, S. (1993): The use of low-volume dosing in the eye irritation test. Food Chem. Toxicol. 31. 2. 99-103.

87

LAWRENCE, R.S. (1987): The chorioallantoic membrane in irritancy testing. In: Atterwill, C.K., Steele, C.E.(eds): In vitro methods in toxicology. Cambridge University Press., Cambridge 1987. 263-278.

LAWRENCE, R.S., ACKROYD, D.M., WILLIAMS, D.L. (1990): The chorioallantoic membrane in the prediction of eye irritation potential. Toxic. In Vitro. 4. 4/5. 321-323.

LEIGHTON, J., NASSAUER, J., TCHAO, R., VERDONE, J. (1983): Development of a procedure using the chick egg as an alternative to the Draize rabbit test. In: Goldberg, A. M. (ed.): Alternative Methods in Toxicology. 1. Mary Ann Liebert. New York 1983. 163-177.

LEIGHTON, J., NASSAUER, J., TCHAO, R. (1985): The chick embryo in toxicology: an alternative to the rabbit eye. Fd. Chem. Toxic. 23. 2. 293-298.

LUEPKE, N.P. (1985): Hen’s egg chorioallantoic membrane test for irritation potential. Fd. Chem. Toxic. 23. 2. 287-291.

LUEPKE, N.P., KEMPER, F.H. (1986): The HET-CAM test: an alternative to the Draize eye test. Fd. Chem. Toxic. 24. 495-496.

LUEPKE, N.P., WALLAT, S. (1987): HET-CAM – Reproducibility studies. Alternative methods in toxicology. 5. 353-363.

MARON, M. D., AMES, B. N. (1983). Revised Method for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Research, 113: 173-215.

MAURER J.K., PARKER R.D., JESTER J.V. (2002). Extent Of Initial Corneal Injury as the Mechanistic Basis for Ocular Irritation: Key Findings and Recommendations for the Development of Alternative Assays. Regulatory Toxicology and Pharmacology 36. 106-117. MILDRED, S. C., DIENER R. M. (1996): Soaps and Detergents: Alternatives to Animal Eye Irritation Tests.International Journal of Toxicology. 1996, vol. 15 no.1. 1-44. 88

NAB,

J.,

BALLS,

M.,

HENDRIKSEN,

C.F.M.

(1993):

Alternatives

to

animal

experimentation. In: Van Zutphen, L.F.M., Baumans, V., Beynen, A.C. (eds): Principles of laboratory animal science. Elsevier, Amsterdam, 1993. 319-333.

OCSKÓ Z., ERDŐS GY. (szerk.) (1999): Növényvédő szerek, termésnövelő anyagok II. Agrinex BT. Budapest, 1999. 206. 264.

OECD Guideline for Testing of Chemicals no. 405. Acute Eye Irritation/Corrosion. Adopted 24th April 2002.

OECD Guideline for Testing of Chemicals no. 437. Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants. Adopted 08th September 2009.

OECD Guideline for Testing of Chemicals no. 438. Isolated Chicken Eye Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants. Adopted 08th September 2009.

OHNO, Y., KANEKO, T., KOBAYASHI, T., INOUE, T., KUROIWA, Y., YOSHIDA, T., MOMMA, J., HAYASHI, M., AKIYAMA, J., ATSUMI, T., CHIBA, K., ENDO, T., FUJJI, A., KAKISHIMA, H., KOJIMA, H., MASAMOTO, K., MASUDA, M., MATSUKAWA, S., OHKOSHI, K., OKADA, J., SAKAMOTO, K., TAKANO, K., TAKANAKA A. (1995): First-phase interlaboratory validation of the in vitro eye irritation tests for cosmetic ingredients. I. Overview, organization and results of the validation study. AATEX 3. 123-136.

OHNO Y., KANEKO T., INOUE T., MORIKAWA Y., YOSHIDA T., FUJI A., MASUDA M., OHNO T., HAYASHI M., MOMMA J., UCHIYAMA T., CHIBA K., IKEDA N., IMANASHI Y., ITAKAGAKI H. (1999). Interlaboratory validation of the 23 in vitro eye irritation tests for cosmetic ingredients. (1) Overview of the validation study and Draize scores for the evaluation of the tests.; Toxicology in vitro; 13(1); 73-98.

PARISH, W.E. (1985): Ability of in vitro (corneal injury - eye organ - and chorioallantoic membrane) tests to represent histopathological features of acute eye inflammantion. Fd. Chem. Toxicol. 24. 2. 215-227. 89

PEARSON, K. (1901). On lines of points in space and planes of closest fit to systems. Phil. Mag. 559-572.

ROUGIER, A., COTTIN, M., DE SILVA, O. (1992): In vitro methods: their relevance and complementary in ocular safety assesment. Lens Eye Tox. Res. 9. 3,4. 229-245.

RUSSEL, W.M.S., BURCH, R.L. (1959): The principles of humane experimental technique. Methouen, London, 1959.

SEABAUGH, V.M., CHAMBERS, W.A., GREEN, S., GUPTA, K.C., HILL, R.N., HURLEY, P.M., LAMBERT, L.A., LEE, C.C., LEE, J.K., LIU, P.T., LOWTHER, D.K., ROBERTS, C.D., SPRINGER, J.A., WILCOX, N.L. (1993): Use of ophthalmic topical anesthetics. Food Chem. Toxicol. 31. 2. 95-98.

SINA, J.F., GALER, D.M., SUSSMAN, R.G., GAUTHERON, P.D., SARGENT, E.V., LEONG, B., SHAH, P.V., CURREN, R.D., MILLER, K. (1995):. A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fund. Appl. Toxicol. 26. 20-31.

SPIELMANN, H., LIEBSCH, M., GERNER, I., KALWEIT, S., WIRNSBERGER, T. (1993): Results of the German validation project of alternatives to the Draize eye test (Abstract). In: Goldberg, A. M. (ed): Alternative methods in toxicology. 9. Mary Ann Liebert, New York, 1993. 243.

SPIELMANN, H., LIEBSH, M., KALWEIT, S., MOLDENHAUER, F., WIRNSBERGER, T., HOLZHÜTTER, H.G., SCHNEIDER, B., GLASER, S., GERNER, I., PAPE, W.J.W., KREILING, R., KRAUSER, K., MILTENBURGER, H.G., STEILING, W., LUEPKE, N.P., MULLER, N., KREUZER, H., MURMANN, P., SPENGLER, J., BERTRAMNEIS, E., SIEGEMUND, B., WIEBEL, F.J. (1996): Results of a validation study in Germany on two in vitro alternatives to the Draize eye irritation test, the HET-CAM test and the 3T3-NRU cytotoxicity test. ATLA, 24. 741-858.

SZENTÁGOTHAI J., RÉTHELYI M. (1985): Funkcionális anatómia. Medicina Könyvkiadó. Budapest, 1985. 90

TALSMA, D.M., LEACH, C.L., HATOUM, N.S., GIBBONS, R.D., ROGER, J.C., GARVIN, P.J. (1988): Reducing the number of rabbits in the Draize irritancy test: a statistical analysis of 155 studies conducted over 6 years. Fund. Appl. Toxicol. 10. 146-153.

The Agrochemicals Handbook (1991): Third Edittion, Royal Society Of Chemistry, Cambridge. England. Trend Biztonságtechnikai adatlap, Du pont de Nemours (France) S. A.

VAN ERP, Y.H.M., WETERINGS, P.J.J.M. (1990): Eye irritancy screening for classification of chemicals. Toxic.in Vitro. 4, 4/5. 267-269.

VERRETT, M.J., SCOTT, W.F., REYNALDO, E.F., ALTERMAN, E.K., THOMAS, C.A. (1980). Toxicity and teratogenicity of food additive chemicals in the developing chicken embryo. Toxicol. and App. Pharmacol. 56. 265.

VINARDELL, M.P., MITJANS, M. (2005): The chorioallantoic membrane test as a model to predict the potential human eye irritation induced by commonly used laboratory solvents. Toxicology in Vitro 20 (2006) 1066-1070.

WALUM, E., BALLS, M. et al. (1992): ECITTS: An integrated approach to the application of in vitro test systems to the hazard assessment of chemicals. ATLA. 20. 416.

www.oecd.org/dataoecd/11/50/48850793.pdf

YING, Y., XINGFEN, Y., WENGAI, Z., JINHENG, C., JINYU, X., GUANGYU, Y., XIAOHUA, T., XIAOPING, X., XIKUN, X., JUNMING, H., XIANG, G. (2010): Combined In Vitro Tests as an Alternative ti In Vivo Eye Irritation Tests. ATLA 38. 303-314.

ZBORAY G. (1991): Embriológia. ELTE egyetemi jegyzet. Budapest 1991. 105-108.

ZWILLING, E. (1959): A modified chorioallantoic grafting procedure. Transplantation Bulletin. 6. 115.

91

10. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK

1. Elsőként végeztem el a következő mezőgazdasági vegyi anyagok irritatív potenciáljának meghatározását az in vitro HET-CAM teszttel:

Inszekticidek: • ACTELLIC 50 EC: erősen irritatív • AGROL PLUS: gyengén irritatív • CHINMETRIN 25 EC: erősen irritatív • CONFIDOR 200 SL: gyengén irritatív • FENDONA 2 EC: erősen irritatív • KOHINOR 200 SL: erősen irritatív • MATCH 050 EC: erősen irritatív • MOSPILAN 3 EC: erősen irritatív • OMITE 57 E: erősen irritatív • PYRINEX 48 EC: gyengén irritatív • SHERPA: erősen irritatív • SUMI-ALPHA 5 EC: erősen irritatív • TALSTAR 10 EC: erősen irritatív • THIONEX 35 EC: gyengén irritatív • UNIFOSZ 50 EC: gyengén irritatív • ZOLONE 350 EC: gyengén irritatív

92

Herbicidek: • AFALON DISPERSION: erősen irritatív • ALIROX 80 EC: erősen irritatív • CLINIC 480 SL: erősen irritatív • DEZORMON: erősen irritatív • FALCON 460 EC: erősen irritatív • FOZÁT 480: gyengén irritatív • GLIALKA 480 PLUS: erősen irritatív • KAPAZIN: erősen irritatív • MEDALLON PREMIUM: erősen irritatív • PERENAL: erősen irritatív • PROPONIT 720 EC: erősen irritatív • STOMP 330 EC: közepesen irritatív • TARGA SUPER 5 EC: erősen irritatív • TOTRIL: erősen irritatív • TRENDTM: erősen irritatív

Fungicidek: • ALFA-SOLO: gyengén irritatív • CHARISMA 207 EC: gyengén irritatív • CONTAF: gyengén irritatív • FOLICUR SOLO: erősen irritatív

93

• PREVICUR 607 SL: gyengén irritatív • RUBIGAN 12 EC: gyengén irritatív • SYSTHANE 12 E: erősen irritatív • TALENDO: gyengén irritatív • TOPAS 100 EC: erősen irritatív

Tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények: • ATONIK: gyengén irritatív • COMPO: gyengén irritatív • FITO HORM: gyengén irritatív • FOLISOL W: gyengén irritatív • GENEZIS: gyengén irritatív • JOLOVIT: gyengén irritatív • NONIT: erősen irritatív • SILWET L-77: erősen irritatív • SUBSTRAL: gyengén irritatív • WUXAL: erősen irritatív

94

2. Elsőként végeztem el a következő mezőgazdasági vegyi anyagok irritatív potenciáljának meghatározását az in vitro MTT-Assay-vel: Inszekticidek: • ACTELLIC 50 EC: erősen irritatív • CONFIDOR 200 SL: közepesen irritatív • MATCH 050 EC: erősen irritatív

Herbicidek: • ALIROX 80 EC: közepesen irritatív • CLINIC 480 SL: erősen irritatív • GLIALKA 480 PLUS: erősen irritatív • TARGA SUPER 5 EC: erősen irritatív • TRENDTM: erősen irritatív

Fungicidek: • PREVICUR 607 SL: közepesen irritatív • SYSTHANE 12 E: erősen irritatív

Tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények: • SILWET L-77: erősen irritatív • SUBSTRAL: gyengén irritatív

95

3. Az in vitro tesztekből (HET-CAM, MTT-Assay) és az in vivo Draize tesztből származó eredmények összehasonlítása alapján az in vitro HET-CAM teszt és az MTT-Assay is alkalmas mezőgazdasági vegyi anyagok irritatív tulajdonságainak vizsgálatára.

4. Az általam, mezőgazdasági vegyi anyagokkal elvégzett in vitro HET-CAM teszt és MTT-Assay eredményei alapján a két alternatív módszer külön-külön is alkalmas elővizsgálati módszerként különböző vegyi anyagok irritatív hatásainak vizsgálatára.

5. Bár a HET-CAM teszt eredményei jó korrelációt mutatnak a Draize-teszt eredményeivel, a módszer önállóan alkalmazva nem használható a növényvédőszerek engedélyezése során előírt kockázatbecslési eljárásban.

6. Bár az MTT-Assay eredményei jó korrelációt mutatnak a Draize-teszt eredményeivel, a módszer önállóan alkalmazva nem használható a növényvédőszerek engedélyezése során előírt kockázatbecslési eljárásban.

7. A két in vitro módszer, a HET-CAM teszt és az MTT-Assay együttesen alkalmazva jól kiegészítik egymást, így jobban közelítik a valós, in vivo Draize tesztből származó eredményeket. A két módszer használatával és további alternatív módszerek bevonásával a jövőben potenciális helyettesítő tesztrendszer fejleszthető.

96