MAGYARORSZÁG DÉLALFÖLDI RÉGIÓJÁBAN A LAKOSSÁG HEPATITIS VÍRUS MÁRKEREI; AZ EMBERI VÍRUSOK PERINATÁLIS ÉS/VAGY TRANSZPLACENTÁRIS ÁTVITELE PhD ÉRTEKEZÉS
Szerző: Younes Saleh Ali, M.Sc., M.D.
A Semmelweis Egyetem Általános Orvosi Kar, 1, sz. Kórbonctani és Kísérleti Rákkutató Intézete valamint az Országos Epidemiológiai Központ Virológiai Főosztálya, Budapest Témavezető: Dr. med. habil. Berencsi, György, M.D., Ph.D.
2007
2
ÖSSZEFOGLALÁS MAGYARORSZÁG DÉLALFÖLDI RÉGIÓJÁBAN A LAKOSSÁG HEPATITIS VÍRUS MÁRKEREINEK ELŐFORDULÁSA; AZ EMBERI VÍRUSOK PERINATÁLIS ÉS/VAGY TRANSZPLACENTÁRIS ÁTVITELE 1995-ben Magyarországon országos programot kezdeményeztek a hepatitis B vírus (HBV) perinatális átvitelének a megelőzésére, 2001-ben pedig bevezették a gyermekek kötelező védőoltását. Megvizsgálták a lakosság hepatitis vírus márkereit ezért 2001 előtt gyüjtött vérsavókban az ország délalföldi régiójában. Visgálták a HBV X proteinjének és a specifikus ellenanyagok tulajdonságait és a HBV genotípusait is. Ezaket az adatokat később a megelőző védőoltási programok hatékonyságát lehet majd lemérni. A közelmúltban ellentmondó eredményeket közöltek a vírusok perinatális és transzplacentáris átvitelével kapcsolatban. Ezért egy következetes molekuláris vizsgálatot végeztek, egészséges terhességet követően közvetlenül a kihordási idő végén megindított szülés előtt vett magzatví minták segítségével. A szerológiai eredmények valószinüvé teszik, hogy a megelőző intézkedések lényegesen csökkenteni fogják 20 éven belül a HBV előfordulási gyakoriságát (1 % alá). Megfigyelték, hogy a HB-X antigén és a specifikus ellenanyagok
valószinóleg
immunkomplexeket
képeznek
a
betegek
vérplazmájában hasonlóan más vírusfehérjékhez. Az amnionfolyadék minták egyharmada tartalmazott herpesvírus 4, 5, 6, 7 és 8 DNS-t. Alacsony koncentrációban endotoxint és papillomavírus DNS-t is ki lehetett mutatni a mintákban. Az édesanyák vérében és amnionfolyadékában
3
kimutatott vírusok összehasonlítása azt mutatta, hogy a vírusok megjelenése nem egyidőben történik. A placentán történő áthaladásuk egyenlőtlen. BIBLIOGRÁFIA 1.) Seress I, Younes Ali Saleh, Brojnás J, Berencsi Gy, Nagy-Majtényi L: Serological markers of hepatitis viruses in patients and contacts from a low prevalence population in South Hungary in 1994-2001. Central European J. Occupational and Environmental Medicine 9: 243-252 (2003) 2.) N.Szomor K, Dencs Á., Tóth G, Kovács M. Gábor, Younes SA, Brojnás J, Rusvai E., Berencsi Gy, Takács M: variability of the PreS1/PreS2/S region of hepatitis b virus in Hungary Arch. Virology. 152(4):697-704.(2007) Impact factor: 1.8 . 3.) Younes Saleh Ali, Csire M, Pályi B, Mikala G, Vályi-Nagy I, Cseh I, Benczik M, Jeney Cs, Takács T, Simon É, Fülöp V, Berencsi Gy, Visy M: Endotoxins do not influence transplacental transmision of lymphotropic human herpesviruses and human papillomaviruses into amniotic fluid taken from healthy mothers before parturition in Hungary , Acta microbiol. Immunol. Acad Sci.Hung 54: 279-303 (2007) Impact factor 0 4.) Pal J, Palinkas L, Nyarady Z, Czompoly T, Marczinovits I, Lustyik G, Saleh Ali Y, Berencsi G, Chen R, Varro R, Par A, Nemeth P.: Sandwich type ELISA and a fluorescent cytometric microbead assay for quantitative determination of hepatitis B virus X antigen level in human sera. J Immunol Methods. 306: 183-192 (2005) Impact factor 2,744 5.) Pál J, Nyárády Z, Marczinovits I, Pár A, Younes Saleh Ali, Berencsi Gy, Kvell K, Németh P: Comprehensive regression analysis of hepatitis B virus X antigen level and anti-HBx antibody titer in sera of patients with HBV infection. Pathology Oncology Research. 12: 34-40 (2006) Impact Factor 1.25 6.) Younes A. Saleh, Csire M., Kapusinszky, B., Szomor K., Takács, M., Berencsi Gy.: Heterogeneous pathways of maternal-fetal transmission of human viruses. Pathol. Oncol. Res. (in the press) 2009. Impact factor: 1.27 BEVEZETÉS A hepatitis B vírus (HBV) családon belül történő átvitelét, valamint a nem-parenterális és perinatális átvitelét hamar megfigyelték. A klinikai lefolyást és a betegség idült következményeit sokan leírták és összefoglalták.
4
A
perinatális
átvitel
megelőzését
rövidesen
javasolták.
A
transzplacentáris átvitellel nem számoltak mert a megelőző intézkedésekkel több mint 99 %-át meg lehetett előzni a perinatális fertőzéseknek. A hazai lakosságban olyan alacsony a tünetmentes hordozó egyének aránya, hogy a HBV transzplacentáris vizsgálatához többszáz gravida amnion folyadékát kellett volna megvizsgálni. Kimutatták,
hogy
egyes
herpesvírusok
és
papillomavírusok
is
átkerülhetnek a méhlepényenfőleg primer fertőzések során. A HIV/AIDS positív asszonyok esetében azonban sikerült bebizonyítani, hogy mind a méhlepényen, mind a szülés során majd szoptatáskor is átkerülhet a vírus a magzatra (újszülöttre). A közelmúltban számos vírus DNS-ét a HBV DNS-t is megtalálták újszülöttek vérében. Ebben az esetben a szülés során bekövetkező fertőzés kizárható, mert idő kell a vírusok vérbe jutásához. Ezért olyan, látensen hordozott vírusok szisztematikus vizsgálatát tervezték
meg,
amelyek
időnként
az
ellenanyagok
jelenlétében
is
reaktiválódni tudnak az édesanya szervezetében. A MUNKA CÉLJAI 1.)
A munka eredeti célja volt a hepatitis vírusok szerológiai szűrése
a délalföldi régióban gyüjtött vérmintákban (Ref. 1). A savómintákat 1993 és 2001 között gyüjtötték és mélyhűtve tárolták. Tekintettel arra, hogy a kötelező védőoltásokat 2001-ben vezették be, az eredmények lehetővé fogják tenni a védőoltások hatékonyságának a lemérésére. 2.)
A HBV-hordozó egyének vérmintái lehetőséget adtak arra, hogy
a vírusok genotípusának a vizsgálatára is alkalmas lesz a vizsgálat. (Ref. 2).
5
3.)
A válogatott vérminták tünetmentes hordozóktól, heveny
megbetegedésben szenvedőktől, és idült májgyulladásban szenvedő betegektől lehetővé tette a Pécsett kidolgozott új módszer segítségével a HBV-X onkogén fehérje és a specifikus ellenanyagok vizsgálatát a Szegeden és Pál József által Pécsett készített rekombinánsok és monoklonális ellenanyagok segíségével (Refs. 3 and 4). 4.)
A HBV vírusátvitel transzplacentáris és perinatális átvitelét eltérő
rendszerben kellett vizsgálni. A kérdésfeltevés a következő volt: “Van-e lehetőség az édesanyáról a magzatra a placentán keresztül történő vírusátvitelre, ha az édesanya csak látens vírushordozó?” Ezért 106 egészséges terhetől amnion folyadék és vérmintákat gyüjtöttünk kizárólag a az időre szülő asszonyoktól, akiknél a kontamináció nélküli mintavételt a mesterséges burokrepesztés megkönnyítette. HÁTTÉR 1.)
Magyarországon a hepatitis B hordozó édesanyáktól született
újszülöttek megelőző passzív-aktiv védőoltását 1995-ben vezették be országosan. Kétezerben a szeroepidemiológiai vizsgálatok eredményesek voltak. Kiderült, hogy a kezelt csecsemők kevesebb mint 1 %-a maradt HBV hordozó. Az új védőoltási rendszer szerint a kötelező védőoltások bevezetése iskolás
korban
2001-ben
kezdődött
meg.
A
hatékonyság
majdani
értékeléséhez szükség volt korábbi savóminták vizsgálatára, amit a délalföldi adminisztrativ régióban sikerült végrehajtani. A HBV genotípusok vizsgálatán kívül ki kellett probálni egy új szerológiai tesztek alkalmazhatóságát a HBV X-onkogén fehérjéjének és a specifikus ellenanyagoknak kimutatására.
6
2.)
Néhai D.Tóth Ferenc egy sorozat értékes közleményben közölte
Debrecenből, hogy a human syncytiotrophoblast sejtek explantátumait meg lehet fertőzni különböző vírusokkal: human cytomegalovírussal (HCMV), . Epstein-Barr vírussal (EBV), Human T-sejtes leukemia-lymphoma vírus 1-es típusával (HTLV-I), humán immunodeficiencia vírus 1-gyel (HIV1) és a humán herpesvirus 6-tal (HHV6). A különböző vírusokkal végzett együttes fertőzés serkentette és gyorsíntotta legalább az egyik vírus szaporodását. Az interleukin 6 és 8,
a tumor nekrosis faktor α és a
transzformáló növekedési faktor β is fokozta a HIV-1 és HCMV szaporodását syncytiotrophoblast tenyészeteken. A különböző herpesvírusok sejt-receptor molekuláit ki lehetett mutatni különböző embrionális szövetek sejtmembránján is (CD21, CD46, CD98, ICAM-I és integrinek) az embrionális fejlődés különböző szakaszaiban. Disintegrinhez hasonló
domének
fontos
szerepet
játszanak a
syncytiotrophoblast kialakulásában. Jelen vannak azonban a herpesvírusok gB glikoproteidjeiben is a vírusburok és a gazdasejt hártya fuziójának a befejeződését biztosítva Az anyai monocyták és makrofágok közvetlen kontaktusa a syncytiotrophoblastokkal fedett mikrobolyhokkal lehetővé teszik anyai limfociták átjutását a magzati szövetekbe. Ez egy eddig ismeretlen úton lehetőséget teremt a sejtek által látensen hordozott herpesvírusok átjutását a placenta magzati eredetű sejtjeibe, ahol a vírusok reaktiválódása lehetőséget ad a magzati szövetek megfertőződésére, amit az anyai ellenanyagok nem tudnak megakadályozni.
7
Endotoxinok
és
cytokinek
valamint
a
koinfekciók
szintén
megkönnyíthetik a vírusok átjutását akár anyai ellenanyagok jelenlétében is. A HBV-hordozó édesanyákat nem lehetett vizsgálni, ezért egészséges terheseket vizsgáltak a komplikáció mentes kihordott terhességek végén abból a célból, hogy a limphotrop herpesvírusok és papillomavírusok átjutnak-e a magzatvízbe. ANYAGOK és MÓDSZEREK A vérsavókat számos klinikai laboratórium mintáinak maradékából gyüjtötték. Az idült tünetmentes HBV-hordozók vérsavóit a szülészetek küldték be szűrővizsgálat céljából. Az amnion folyadék mintákat különös gonddal vették, nehogy a hüvelyváladékban lévő vírusok szennyezzék a mintákat. Minden mintát - 20 o
C hőmérsékleten tároltak. A hepatitis vírus márkerek kimutatásához a szerologiai vizsgálatokat
kereskedelmi ELISA (EIA) reagenskészletekkel végezték A HB-X antigén és HB-X-specifikus ellenanyagok kimutatása szendvics típusú és indirekt ELISA módszerrel történt amelyet Szegeden és Pécsett dolgoztak ki (Pál et al. 2005 and 2006). A HBV DNS genotípusait a PCR termékek nukleotidsorrend vizsgálatával állapították meg (Szomor et al. 2006). A herpesvírusok DNS-ét “nested PCR-rel” mutatták ki (Csire et al. 2006). A papillomavirus DNS-t a GenoID cég által kifejlesztett módszerrel vizsgálták (Jeney et al., 2007) a tipizálásra pedig nukleotid sorrend vizsgálat szolgált. Az endotoxin szemikvantitativ mérését Limulus (LAL) teszttel végezte az akkreditált laboratórium.
8
EREDMÉNYEK és MEGBESZÉLÉS 1.)
A heveny
hepatitis markerek vizsgálata kiderítette, hogy az
eltérő korcsoportokat eltérő arányban károsították a klasszikus hepatitis vírusok (I. Táblázat). A legfiatalabb korcsoport kivételével valamennyi korcsoportban a heveny hepatitis A gyakorisága volt a legalacsonyabb. A heveny és idült HBV megbetegedések száma 40 éves kor alatt volt a legmagasabb. A HCV pozitív betegek száma nőtt az életkorral. A megelőző védőoltások hatására a 20 éves korig várhatóan 1 % alá fog csökkenni egy évtizeden belül (Seress et al. 2003). I. táblázat. Az akut vagy aktív májgyulladás vírus márkerek megoszlása (%) 583 fertőzött betegben Korcsoport (év)
0-19 év
20-39 év
40-59 év
> 60 év
Összesen
Anti-HAV-IgM %
34.9
13.7
8.1
6.3
13.0 (76)
HbsAG %
57.1
62.9
30.2
21.1
45.1 (263)
Anti-HCV %
7.9
23.4
61.7
72.4
41.9 (244)
Total
99.9
100
100
99.8
100 (583)
Meglepő módon valamennyi HBsAg-pozitív savóban mind a heveny, mind a krónikus valamint a tünetmentes hordozók savóiban is anti-HB-X IgG volt kimutatható (II. táblázat). Az X-antigén töménysége is magasabb volt a kimutathatóság alsó határánál (62.5 ng/ml) 38 savó kivételével, amelyeket krónikus hepatitiszes betegektől vettek (Pál et al, 2005 and 2006). II táblázat. A HB-X protein átlagos koncentrációja (ng/ml) és a HBX-specifikus IgG és IgM relatív mennyisége a betegek három vizsgált csoportjában Betegcsoport Akut hepatitis (14) Chronikus hepatitis (80)
X-Ag Ng/ml 300 370* 9
IgG OD420 0.700 0.800
IgM OD420 0.450 0.500
Tünetmentes hordozó (12) 100 0.450 0.310 * A kimutathatóság legkisebb mennyisége 62.5 ng/ml volt. Az X-protein mennyisége 38 beteg esetében, akik idült májgyulladásban szenvedtek, nem érte el a kimutathatóság szintjét. IgM-et sikerült kimutatni a tünetmentes hordozó egyének egy részének savójában is. Ez arra utalt, hogy sejtpusztulás az ő májukban is előfordul. Az idült májgyulladásban szenvedő betegekben magas ellenanyag koncentrációk fordultak elő keringő vagy kimutatható antigének nélkül. Ez arra enged következtetni, hogy az immunkomplexekben precipitálódtak az antigének az ellenanyag-túlsúly miatt. Ez a viselkedés hasonlít a HBsAg és HBeAg tulajdonságaihoz amelyek szintén immunkomplexekben, olykor az ablak periódusban kimutathatatlan immunkomplexekben vannak csak jelen. A HBV genotípusok “A” és “D” genotípusnak bizonyultak a délalföldi régióban is (Szomor et al. 2006). 2.)
A burokrepesztés előtt közvetlenül vett amnion folyadék minták
endotoxin vizsgálata meglepő eredményeket hozott. Az 50 vizsgált mintából 15-ben volt mérhető mennyiségű endotoxin (0.03 – 3.0 Endotoxin U/ml). Ezek a koncentrációk azonban igen alacsonyak. A parenterális védőoltásban (pl. influenza) az FDA által engedélyezett töménységnek kevesebb mint 1/33ad része. Ez lehet az oka, hogy az endotoxin jelenlétének nem volt hatása a vírusok megjelenésére és a magzatok fejlődésére. Herpesvírus DNS-t 106 amnion folyadékból 26 esetben sikerült kimutatni. A szüléssel egyidőben vett 104 vérmintából 12 esetben sikerült herpesvírust kimutatni. Ki kell hangsúlyozni, hogy két kivétellel vagy csak az amnionfolyadékban, vagy csak a vérmintában sikerült DNS-t kimutatni a vírusok azonban különbözőek voltak ezekben a mintákban, valószinütlenné téve a szennyeződés lehetőségét.
10
A herpesvírus DNS vagy az amnion folyadék felülúszójában, vagy a sejtes üledékében volt jelen a legtöbb esetben. Kivételt képezett a HCMV, mert ez három mintában jelen volt a felülúszóban is és az üledékben is. Ezeket a mintákat csillag (*) jelöli a III. Táblázatban. Az a tény, hogy a vérmintákban alacsonyabb volt a vírusok előfordulása mint a magzatvízben azt mutatja, hogy a vírus reaktíválódás vagy korábban következett be az édesanyában majd megszünt a vizsgálat idejére, vagy pedig valóban a magzati szövetekbe jutott limfocitákban reaktíválódtak a vírusok. A vírusik valószinüleg úgy kerültek az üledékbe, hogy korábban reaktiválódtak és a magzat megitta, belélegezte, majd a vizelettel és a meconiummal újból kiürítette azokat. A HHV6 és 8 (vastag számok a III. táblázatban) valószinüleg közvetlenül a szülés előtt reaktiválódtak vagy a placentán történő átjutásuk időigényes volt. Ez eredményezte, hogy a magzatvíz/vér hányados szignifikáns eltlérést mutatott a másik 3 vírushoz viszonyítva (Pearson Chisquare test: p < 0.001). III. táblázat. A vírus DNS megoszlása a magzatvíz felülúszókban, üledékekben és a vérmintákban. Vírusok
Magzatvíz felülúszó
Magzatvíz sejtes üledéke
HCMV HHV7 EBV HHV6 HHV8 Total
1+3* 0 1 0 5 7+3*
5+3* 8 3 1 0 17+3*
Magzatvízben lévő vírusok száma 9+3* 8 4 1 5 27+3*
Vérben talált vírusok száma 1 1 1 3 7 13
A human papillomavírusokat (HPV) 96 magzatvíz mintában vizsgálták és 8-at találtak pozitívnak. Az eredményeket az 1. ábrán nyilak mutatják. Fel vannak tüntetve a korábban magyar betegekből kimutatott genotípusok is. Az
11
eredmények azt mutatják, hogy a daganatokban és hüvelyváladékban talált típusok eltérnek a magzatvízben kimutatott típusoktól. Ez újabb bizony arra, hogy a magzatvíz eredmények nem szennyeződés következményei, hiszen a korábbi eredmények alapján a HPV16 teszi ki a genotípusok több mint felét. Ezt a típust pedig a magzatvízben egyáltalán nem lehetett kimutatni. KÖVETKEZTETÉSEK 1.)
A munka első része jellemezte a hepatitis vírus fertőzött egyének
gyakoriságát a délalföldi régióban a kötelező HBV védőoltások bevezetése előtti időben. Kipróbáltak egy ój szerológiai módszert a HB-X antigén és a specifikus ellenanyagok kimutatására.
300 250 200 150
Adatsor1
100 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 42,45, 51, 52, 53, 54,55, 56, 58,59, 61, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 73, 84, X
*
*
*
*
*
*
2x18 1x39 1x45 2x58 1x62 2xLR+ 1. ábra. HPV genotípusok amelyeket magyar betegekben mutattak ki. A magzatvízben talált genotíusokat csillagok jelölik. 2.)
A magzatvizek szisztematikus virológiai vizsgálata kimutatta, hogy
limfotróp herpesvírusok, papillomavírusok és endotoxin hatolhat át a méhlepényen a szülés előtt, különböző gyakorisággal. Ennek azonban semmilyen káros következményét nem lehetett kimutatni a magzat fejlődésére. References Csire M, Mikala G, Pető M, Jánosi J, Juhász A, Tordai A, Jákó J, Domján G, Dolgos J, Berencsi G, Vályi-Nagy I (2006) Detection of four lymphotropic 12
herpesviruses in Hungarian patients with multiple myeloma and lymphoma. FEMS Immunol Med Microbiol (accepted for publication) Jeney Cs, Takács T, Sebe A, Schaff S (2007) Detection and typing of 46 genital human papillomaviruses by the L1F/L1R primer system based multiplex PCR and hybridisation. (Patent pending; J. Virol. Methods, in the press)
13
