vagy megelõzésére

!HU000004493T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 004 493

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 714958 (22) A bejelentés napja: 2003. 03. 13. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030714958 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1487541 A2 2003. 10. 02. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1487541 B1 2008. 11. 19.

(51) Int. Cl.: A61P 9/10 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 03080104 PCT/EP 03/050061

(30) Elsõbbségi adatok: 02100290 2002. 03. 22.

(73) Jogosultak: Laboratoires Serono SA, 1267 Coinsins, Vaud (CH); Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale, 75654 Paris (FR)

EP

(72) Feltalálók: CHVATCHKO, Yolande, CH-1232 Confignon (CH); TEDGUI, Alain, F-75001 Paris (FR); MALLAT, Ziad, F-78580 Herbeville (FR)

(54)

(74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest

IL–18-inhibitorok alkalmazása periferiális vaszkuláris betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére

(57) Kivonat

HU 004 493 T2

A találmány tárgya IL–18-inhibitor alkalmazása periferiális vaszkuláris betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló gyógyszer elõállítására. A talál-

mány tárgya továbbá IL–18-inhibitor alkalmazása végtag-amputáció megelõzésére.

A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 5 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 004 493 T2

A találmány területe A találmány a vaszkuláris betegségek területén van. Pontosabban a találmány tárgya IL–18-inhibitor alkalmazása periferiális vaszkuláris betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére. A találmány tárgya továbbá IL–18-inhibitor alkalmazása amputáció megelõzésére. A találmány háttere Az interleukin–18 (IL–18) eredetileg interferon¹g (IFN¹g) indukáló faktorként lett ismertetve (Nakamura és munkatársai, 1989). Ez egy korai szignál az 1¹es típusú T¹limfocita segítõ sejt (TH1) válaszok kifejlõdésében. Az IL–18 az IL– 12¹vel, IL–2-vel, antigénekkel, mitogénekkel és valószínûleg további faktorokkal együtt hat az IFN-g-termelésének a beindítására. Az IL–18 elõsegíti továbbá a GM–CSF és IL–2 termelést, lehetõvé teszi az anti–CD3 indukálta T¹sejt-proliferációt, és megnöveli a természetes ölõsejtek („Natural killer cells”) Fas közvetítette sejtpusztítását. Az érett IL–18¹at a prekurzorából az IL–1b átalakító enzim (ICE, kaszpáz¹1) állítja elõ. Az IL–18-receptor legalább két komponensbõl áll, az IL–18R alfa és az IL18R béta komponensbõl, amelyek együttmûködnek a ligandkötés során. Nagy és alacsony affinitású IL–18-kötõhelyeket találtak rágcsáló IL–12 stimulált T¹sejtekben (Yoshimoto és munkatársai, 1998), amely egy többszálú receptorkomplexet sugall. Az eleddig azonosított két receptoralegység mindegyike az IL–1 receptorcsaládba tartozik (Parnet és munkatársai, 1996; Kim és munkatársai, 2001). Az IL–18 jelátvitele tartalmazza az NF¹kB aktiválását (DiDonato és munkatársai, 1997). Az IL–18-receptorkomplex két receptorláncból áll: egy ligandkötõ láncból, amelyet IL–18Ra láncnak neveztek el és egy jelátvivõ láncból, amelyet IL–18Rb láncnak neveztek el. Az IL–18Ralfa láncot eredetileg sejtfelszíni fehérjeként azonosították, amely kötõdik radiológiailag jelölt ILK–18-hoz; a fehérjét tisztították és az aminosavszekvenciája azonosságot mutatott egy korábban ismertetett árva receptorral, amelyet IL–1R-rokon fehérjének (IL–1Rrp) neveztek el (Torigoe és munkatársai, 1997). Nem régiben emberi vizeletbõl izoláltak egy oldható fehérjét, amelynek nagy affinitása van az IL–18-hoz, és a humán és egér cDNS¹ek, valamint a humán gén klónozva lett (Novick és munkatársai, 1999; WO 99/09063 számú nemzetközi közzétételi irat). A fehérjét IL–18-kötõ fehérjének (IL–18BP) nevezték el. Az IL–18BP semelyik ismert IL–18 receptornak sem az extracelluláris doménje, hanem egy kiválasztott, természetesen cirkuláló fehérje. A kiválasztott fehérjék új családjába tartozik, amely tartalmaz számos Pox vírus által kódolt fehérjét (Novick és munkatársai, 1999). A vizeleti, valamint a rekombináns IL–18P specifikusan köti az IL–18¹at nagy affinitással és modulálja az IL–18 biológiai affinitását. Az IL–18BP gént a humán 11q13 kromoszómára lokalizálták, és a 8,3 kb genomikus szekvenciában nem találtak exont, amely a transzmembrándomént kódolja. Egyelõre az emberben az IL–18¹BP négy érési

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

változatát vagy izoformáját azonosították, amelyek alternatív mRNS éréssel jönnek létre. Ezeket IL–18BP a, b, c és d¹nek, amelyek mindegyikének azonos az N¹vége és különbözik a C¹végében (Novick és munkatársai, 1999). Ezek az izoformák különböznek az IL–18-kötõ képességükben. A négy közül az a és c IL–18BP izoformáról ismert, hogy semlegesítõ képességû az IL–18¹ra. A humán IL–18BP izoforma kötõdik a rágcsáló 1L–18-hoz. A periferiális vaszkuláris rendellenességek lehetnek artériásak (elzáródó vagy funkcionális), vénás, kombinált arteriovenosus (például arteriovenosus fisztula), vagy nyiroki. Az elzáródásos arteriális betegség tartalmazza a periferiális arteriális elzáródást és a Buerger-féle betegséget, amelyet neveznek thromboangitis obliterans-nak is. A funkcionális arteriális rendellenesség lehet érgörcsös (Raynaud-jelenség és betegség, akrocianózis) vagy vazodilatációs (erythromelalgia). Lehetnek másodlagosak egy véredény helyi hibájához vagy a szimpatikus idegrendszer aktivitásának zavaraihoz képest vagy kapcsolódhat szerves vaszkuláris betegséghez. A vénás betegségek közé tartozik a vénás trombózis és a kitágult viszér, a kombinált arteriovenosus rendellenességek közé tartozik az arteriovenosus fisztula, és a nyiroki rendellenességek közé tartozik a nyiroködéma és a zsírödéma. A periferiális arteriális elzáródás a végtagok vérellátásának elzáródására utal, általánosan atheroscleroticus plakkokkal (atheromas), és vérrög vagy embólia. A periferiális arteriális elzáródás eredményezhet akut vagy krónikus ischaemiát. Az akut ischaemiát egy felszakadt közeli arterioscleroticus plakk, korábban létezõ arteriosclerosis betegségen akut trombózis, a szív, aorta vagy egyéb nagy vérerek embóliája, vagy leváló verõértágulat okozhatja. A krónikus ischaemiát az atheromas plakk fokozatos növekedése okozza. A vérben lévõ homocisztein hosszan tartó emelkedett szintje, az endotél sejtek károsításával, fogékonnyá tesz az aorta és az ágai, a periferiális artériák, az agyi artériák, és lehet, hogy a szívartériák korai atherosclerosisára. Habár a homocisztein szintek általában megemelkednek más rizikófaktorokhoz kapcsoltan, de módosíthatóak diétával és B¹vitamin kiegészítõkkel. Az artériás elzáródás klinikai tünetei függnek az érintett vérértõl, az elzáródás mértékétõl, attól, hogy milyen gyorsan történt az elzáródás, és attól, hogy a megfelelõ e a párhuzamos áramlás. Az akut elzáródás kórtörténete tartalmazza a hirtelen erõs fájdalom megjelenését, hideg érzetet, bénultságot és fehérséget egy végtagban. A végtag hideg és fehér és hiányoznak a pulzusok az elzáródás utáni részeken. Az akut elzáródás okozhat súlyos ischaemiát, amely szenzoros és motorikus hiányban testesül meg és végül (6–8 óra elteltével) nyomásra az izmok enyhén megkeményednek. A krónikus elzáródás esetén a tünetek a szöveti ischaemia belsõ kifejlõdéséhez kapcsolódnak. A kezdeti tünet az idõszakos sántítás. A sántítás tünetei a fájdalom, fájás, görcs vagy fáradtságérzet, amely a sétálás-

1

HU 004 493 T2

kor jelentkezik. Ezek a leggyakoribb tünetek a lábikrában, de elõfordulhatnak a lábfejben, combban, csípõben vagy a fenékben. Végül az ischaemiás fájdalom elõfordulhat pihenéskor, amely a végtag legtávolabbi részeiben kezdõdik súlyos, nem szûnõ fájdalomként, amely emeléskor erõsödik és gyakran megakadályozza az alvást. Az arteriális elzáródás szintje és az idõszakos sántítás helye szorosan összefügg, például az aortoiliacus betegség gyakran okoz sántítást a fenékben, csípõben és lábszárakban és a combcsonti pulzus lecsökkent vagy hiányzik. A femoropoplitealis betegségben a sántítás jellemzõen a lábszárban van és a combcsont alatt nincs pulzus. A kisérbetegséges páciensekben (például thromboangitis obliterans, diabetes mellitus) a femoropoplitealis pulzus jelen lehet, de nincsenek láb pulzusok. Az érintett láb fehérsége egy-két perces felemelést követõen, amelyet pirosodás követ felfüggesztéskor, segíti az artériás elégtelenség igazolását. A vénás töltõdési idõ a felemelést követõ felfüggesztéskor meghaladja a normális 15 másodperces határt. Hajó disztális pulzusokkal fordulnak elõ a sántítás tünetei, akkor a gerinccsatorna-szûkületet is meg kell fontolni a különbözõ diagnózisban. A súlyosan ischaemiás láb fájdalmas, hideg és gyakran zsibbadt. A krónikus esetekben a bõr száraz lehet és foltos, gyenge köröm- és szõrnövekedéssel. Ahogy súlyosbodik az ischaemia, fekélyesedés jelenhet meg (jellemzõen a lábujjon vagy a sarkon, alkalmakként a lábon), különösen lokális traumát követõen. Általában nincs ödéma, hacsak a páciens nem tartotta a lábát függõ helyzetben a fájdalma csökkentésére, azonban a súlyosan ischaemiás láb lehet atrófiás. A kiterjedtebb elzáródás tönkre teheti a szöveti életképességet, amely nekrózishoz vagy gangrénához vezet. A pirosodásos, fájdalmas és a felfüggesztéskor a láb duzzadásával járó ischaemia utánozhatja a cellulitist vagy a vénás elégtelenséget. Artériás nem invazív vizsgálatok tehetik egyértelmûvé a diagnózist. A periferiális vaszkuláris betegségek közül a Buerger-féle betegség (Thromboangitis obliterans) egy obliteratív betegség, amelyre gyulladásos elváltozások jellemzõek a kis és közepes artériákban és vénákban. A Buerger-féle betegség elõfordul dohányosokban, elsõsorban 20–40 éves férfiaknál. Az eseteknek csupán 5%¹a fordul elõ nõkben. A diagnózis frekvenciája drámaian esett az utóbbi években az arteriosclerosis obliterans-szal szemben ezen betegség klinikai és angiográfiás jellemzõinek jobb megértése miatt. Habár az ok ismeretlen, Buerger-féle betegséget még nem jegyeztek fel nem dohányzókban, amely a dohányzást mutatja elsõdleges etiológiai faktorként, talán késleltetett típusú túlérzékenységként vagy toxikus angitisként. A thromboangitis obliterans lehet egy reakció a dohányra specifikus fenotípusú emberek esetén. A HLA–A9 és a HLA–B5 nagyobb prevalenciája miatt ilyen betegségben szenvedõ személyekben; vagy autoimmun rendellenesség sejtközvetített (I) típusú és (III) típusú humán kollagénre való érzékenységgel, amelyek a vérerek összetevõi.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

Az atherosclerosis-szal szemben a Buerger-féle betegség nem érint a szívkoszorúereket. A betegség a kicsi és a közepes méretû artériákat érinti és gyakran szegmentált mintázatban a végtagok felszíni vénáit. Ritkábban elõrehaladott betegség esetén a test többi részén levõ erek is érintettek. A patológiás megjelenés a következõ: nonsupparativ panarteritis vagy panphlebitis trombózissal az érintett erekben. Az endotél sejtek proliferációja és az intima rétegbe történõ beszûrõdése limfocitákkal az akut sérülésnél történik, de a belsõ elasztikus lamina érintetlen. Trombus szervezõdik és késõbb nem teljesen rekanalizál. A tápközeg jól megõrzõdik, de lehetnek infiltrálódott fibroblasztok. Mivel az adventitia általában jobban infiltrálva van fibroblasztokkal, a régebbi sérülések periarteriális fibrózist mutatnak, amely szintén érintheti a mellette levõ vénát és ideget. A tünetek és jelek megegyeznek az arteriális iszkémiáéval és a felületi thrombophlebitis-szel. A megjelenés fokozatos, amely a felsõ és alsó végtagok a legtávolabbi vérereivel kezdõdik és proximálisan halad elõre, majd distalis gangraenában csúcsosodik ki. A páciens panaszkodhat hideg érzetre, zsibbadtságra, bizsergésre vagy égetõ érzésre a betegség objektív bizonyítéka elõtt. Gyakori a Raynaud-jelenség. Az idõszakos sántítás az érintett végtagban fordul elõ (általában a lábfej ívében vagy a lábban, de ritkán kézben, karban vagy combban). A súlyosabb iszkémiával állandó a fájdalom, például a gangrénás szakasz elõtt és ulceratioval vagy gangrénával. Gyakran a túlzott szinpatikus idegi aktivitás hideg érzetben, erõs izzadásban és az érintett végtag megkékülésében nyilvánul meg, amelyet valószínûleg a súlyos állandó fájdalom okoz. Az ischaemiás ulceratio és gangréna, általában egy vagy több ujj esetén, elõfordulhat a betegség korai szakaszában, de nem akut módon. Nem invazív vizsgálatok a véráram és ¹nyomás súlyos csökkenését mutatják az érintett lábujjakban, lábfejben és ujjakban. A betegség proximális irányban halad elõre. Egy további periferiális vaszkuláris betegség a periferiális arteriális betegség, amelynek során páciensekben az alsóvégtagi periferiális arteriális betegség (PAD) elõrehaladhat súlyos végtag veszélyeztetõ iszkémiává. Az ischaemiás nyugalmi fájdalom, a nem gyógyuló ulceratiok és a gangréna mindegyike a rosszabbodás elõjelei. Ezen páciensek esetében nagy a végtag elvesztésének a kockázata. A súlyos végtagischaemia gyors észlelése és értékelése, amelyet hatásos revascularisatio követ, szükséges a végtag megmentéséhez és a teljes egészség megõrzéséhez. A krónikus kritikus végtagischaemia az arteriális elzáródásos betegség, leggyakrabban atherosclerosis, végeredménye. A magas vérnyomáshoz, magas koleszterinszinthez, dohányzáshoz és diabéteszhez kapcsolódó atherosclerosis mellett a krónikus kritikus végtagischaemia kevésbé gyakori okai közé tartozik a Buerger-féle betegség, vagy a thromboangitis obliterans és az arteritis néhány formája. A krónikus kritikus végtagischaemia kifejlõdéséhez általában szükséges számos arteriális elzáródási hely,

1

HU 004 493 T2

amelyek súlyosan lecsökkenti a véráramot a szövetekhez. A kritikus szöveti ischaemia klinikailag nyugalmi fájdalomban, nem gyógyuló sérülésekben (a sebgyógyulás megnövekedett metabolikus szükségletei miatt) vagy szöveti nekrózisban (gangrénában) nyilvánul meg. Az ischaemiás nyugalmi fájdalmat klasszikusan égetõ fájdalomként ismertetik, amely a talp elsõ részében és a lábujjakban jelentkezik, amely rosszabbodik éjszaka, amikor a páciens ágyban van. Az ischaemiás nyugalmi fájdalom a lábba lokalizál, ahol a szövetek a legtávolabb vannak a szívtõl és disztálisak az artériás elzáródásoktól. A nem gyógyuló sebek általában a láb traumák területén találhatóak, amelyeket nem kényelmes cipõk vagy sérülések okoztak. Egy sérülést általánosan nem gyógyulónak tekintünk, ha nem válaszol egy 4–12 hetes megõrzõ terápia próbára, mint amilyen a rendszeres sebkötés csere, a sérülés elkerülése, a fertõzés kezelése és a nekrotikus szövet tisztítása. A gangréna általában a lábujjakon található. Akkor fejlõdik ki, ha a vérellátás olyan alacsony, hogy spontán nekrózis fordul elõ a leggyengébben átáramoltatott szövetekben. Miközben a gondosan megtervezett konzervatív terápia elõnyös lehet számos kritikus végtagischaemiás páciens esetében, a betegségük súlyos természete a mûtéti beavatkozás megfontolásához vezethet. A sebészeti beavatkozások közé tartozik a revscularisatio és az amputáció. Amennyiben a páciens aláveti magát a revascularisationak és elfogadható mûtétre, akkor gyakran végeznek arteriográfiát a revascularisatio további értékelésére és tervezésére. Néhány központban, mágneses rezonancia angiográfiát alkalmaznak alternatív vagy kiegészítõ vizsgálatként az arteriográfia mellett, hogy minimalizálják a festéknek való kitettséget. A végtag megõrzése revascularisatioval gazdaságos, jobb életminõséghez vezet a legtöbb páciens esetében és alacsonyabb mûtét alatti morbiditással és mortalitással társul, mint az amputáció. A végtag megõrzés kell, hogy legyen a cél a legtöbb krónikus kritikus végtagischaemiás páciens esetében. A revascularisatio megvalósíthatóságát az arteriográfiás eredmények határozzák meg, valamint a bypass conduit elérhetõsége. Az angioplastica vagy a stent elhelyezés, vagy mindkettõ a legsikeresebb a rövid proximális léziók esetén, mint amilyenek azok, amelyek a sántításos páciensekben vannak, de nem valószínû, hogy az egyetlen szükséges kezelés a kritikus végtagischaemia esetén, az arteriális elzáródásos betegség többszintû természete miatt. Az ideális bypass-conduit a saphenous véna, de a további conduitok közé tartoznak a kisebb saphenous vénák, a kar vénák vagy a protézisconduit. A legtöbb mûtéti sorozatban a lábszár artériák hároméves bypass átjárhatóság mértéke a protézises bypass esetén 40 százaléktól a saphenous véna bypassok 85 százalékáig terjed. Összehasonlításként a hagyományos terápia vizsgálatai 25–49 százalék sikerességi arányt mutattak a nem gyógyuló sérülések esetén és 50–80 százalékos javulási arányt az ischaemiás nyugalmi fájdalom javulásában.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

2

Bizonyos páciensek esetében indikálható az elsõdleges amputáció, mint amilyenek azok a páciensek, amelyeknek kiterjedt szöveti nekrózisuk, életveszélyes fertõzésük vagy sérülésük van, amely nem megfelelõ a revascularizatiora. A döntés, hogy a páciens állapotát követjük figyelmes megfigyeléssel és konzervatív kezeléssel vagy ravascularizatiot vagy amputációt végzünk, a mûtéthez kapcsolódó kockázatok és elõnyök és a konzervatív kezelés gondos meghatározásától függ. Még fontosabban az elérhetõ lehetõségek invazivitásának vagy megfelelõségének a páciens általi értelmezésétõl függ. Még azok a páciensek sem tarthatják megfelelõnek az amputációt, amelyek nem képesek sétálni az állapotuk miatt vagy nem minden páciens motivált eléggé az amputációt követõ rehabilitációhoz szükséges munka elvégzésére. Amennyiben megvan a döntés az amputációról, akkor az amputáció mértéke olyan kell, hogy legyen, amelynek a legnagyobb valószínûségû a gyógyulása, miközben megadja a páciensnek a funkcionális rehabilitáció maximális esélyét. A krónikus kritikus végtagischaemia diagnózisa tartalmazza a nyugalmi fájdalmat, a nem gyógyuló sérüléseket és gangrénát. Az ischaemiás nyugalmi fájdalmat jellemzõen égetõ fájdalomként írják le a lábboltozatban vagy a disztális lábfejben, amely akkor jelentkezik, ha a páciens fekszik, de enyhül, ha a páciens visszatér egy olyan pozícióban, amikor a láb alá van támasztva. A kritikus végtagischaemia diagnózisát támogató objektív hemodinamikus paraméterek közé tartozik a 0,4 vagy ennél kisebb boka-kar érték, 50 Hgmm vagy kisebb boka szisztolés nyomás, vagy a 30 Hgmm vagy ennél kisebb lábujj szisztolés nyomás. A beavatkozás tartalmazhat konzervatív terápiát, ravascularizatiót vagy amputációt. A progresszív gangréna, gyorsan növekvõ sérülések vagy a folytonos ischaemiás nyugalmi fájdalom veszélyt jelenthet a végtagra és a revascularizatio szükségességét sugallja a gátló mûtéti kockázatok nélküli páciensekben. Általában szükségesek bypass graftok az arteriális szûkület többszintû és disztális természete miatt a kritikus végtagischaemia esetén. A diabéteszes pácienseknek az egyéb páciensekhez képest nagyobb valószínûséggel lesz olyan disztális betegségük, amely kevésbé megfelelõ a bypass gratolásra. Az amputációval összehasonlítva a revascularizatio gazdaságosabb és jobb mûtét alatti morbiditáshoz és mortalitáshoz kapcsolódik. A végtag megõrzés kell, hogy legyen a cél a legtöbb krónikus kritikus végtagischaemiás páciens esetében. Jelenleg a periferiális vaszkuláris betegségek legfõbb kezelései közé tartoznak az invazív kezelések, mint az páros végtag amputáció angiplastiája. Az olyan gyógyszerek azonosítása, amelyek elõsegítik a perifériás neovascularizatiot anélkül, hogy növelnék az atheroscleriticus plakk elõrehaladását a terápia egy fontos célja ebben az orvosi területben.

A találmány összefoglalása A találmány azon a felismerésen alapszik, hogy az 60 IL–18-inhibitora serkenti a neovascularizatiot kísérleti 4

1

HU 004 493 T2

állatmodellben periferiális ischaemia kiváltását követõen. A neovascularizatio a VEGF/Akt szignalizáció aktiválódásához kapcsolódóan történt és kapcsolódott hozzá a csontvelõ endotél õssejt mobilizáció és differenciáció növekedése. Ezen eredmények alapján megadtunk új terápiás megközelítéseket periferiális vaszkuláris betegségek megelõzésére vagy kezelésére, amelyekhez szükséges neo- vagy revascularizatio. A találmány tárgya tehát IL–18-inhibitor alkalmazása a módosított igénypontokban definiált módon. Az ábrák rövid ismertetése 1. ábra: A) Jobb ischaemiás és a bal nem ischaemiás hátsóvégtag reprezentatív mikroangiográfiája, 3 és 28 nappal a lábszárartéria-elzáródását követõen egerekben. B) pcDNA3-mlL18BP (IL–18BP) vagy az üres plazmiddal (Kontroll) 3 vagy 28 napig kezelt egerek ischaemiás/nem ischaemiás angiográf értéke. Az értékek átlag±SEM, n=7 csoportonként. **p<0,01 a kontrollegerekhez viszonyítva. 2. ábra: A) Ischaemia-indukált változások a hátsóvégtag véráramban, in vivo megfigyelve lézer Doppler átáramoltatási képalkotással pcDNA3-mIL18BP (IL–18 BP) vagy üres plazmiddal (Kontroll) kezelt egerekben. A színkódolt képeken a normális átáramlást piros jelöli és az ischaemiás hátsóvégtag jelentõs véráramcsökkenését kék szín jelöli. B) A véráram kvanitatív értékelése, amelyet a véráram arányaként adtunk meg az ischaemiás hátsóvégtagban a nem ischaemiáshoz képest. Az értékek átlag±SEM, n=7 csoportonként. **p<0,01 a kontrollegerekhez viszonyítva. 3. ábra: A) A VEGF fehérjetartalom reprezentatív Western-blot eredménye nem ischaemiás és ischaemiás lábban, 28 nappal a lábszárartéria-elzáródást követõen. B) A VEGF fehérjeszintek protein kvanitatív értékelése, amelyet a fehérjetartalom arányaként adtunk meg az ischaemiás hátsóvégtagban a nem ischaemiáshoz képest. Az értékek átlag±SEM, n=7 csoportonként. **p<0,01 a nem ischaemiás kontrollhoz viszonyítva és †p<0,05 az ischaemiás kontrollhoz viszonyítva. 4. ábra: A) A foszfo-AKT fehérjetartalom reprezentatív Western-blot eredménye nem ischaemiás és ischaemiás lábban, 28 nappal a lábszárartéria-elzáródást követõen. B) A foszfo-Akt fehérjeszintek protein kvanitatív értékelése, amelyet a fehérjetartalom arányaként adtunk meg az ischaemiás hátsóvégtagban a nem ischaemiáshoz képest. Az értékek átlag±SEM, n=7 csoportonként. *p<0,05, **p<0,01 a nem ischaemiás kontrollhoz viszonyítva

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

és †p<0,05 az ischaemiás kontrollhoz viszonyítva. 5. ábra: A) Lábszár artéria elkötés nélküli egerek csontvelõjébõl izolált EPC¹k (endothelialis õssejtek) reprezentatív képei (Vélt) és pcDNA3-mIL18BP (IL–18BP) vagy üres plazmiddal (Kontroll) kezelt egerek esetében. Az EPC-ket adherens sejtekként jellemeztük kettõs pozitív festéssel az AcLDL-Dil és a von-Willebrand faktorra (vWF) B) A pcDNA3-mIL18BP vagy üres plazmiddal kezelt egerek kettõs pozitív sejtjeinek mennyiségi meghatározása. Az értékek átlag±SEM, n=5 csoportonként. ***p<0,001 a kontrollegerekhez viszonyítva, †p<0,05 a lábszár artéria elzárás nélküli egerekhez viszonyítva (Vélt). A találmány részletes ismertetése A találmány azon a felismerésen alapul, hogy az IL–18-inhibitorok jelentõsen növelik az ischaemiát követõ angiogenezist végtagischaemiát követõen, anélkül, hogy befolyásolnák az érsûrûséget a nem ischaemiás végtagban egy in vivo rágcsáló betegségmodell esetén. Ezért a találmány új terápiás megközelítést ad a periferiális vaszkuláris betegségek kezelésére vagy megelõzésére, amelyek esetében szükséges a szöveti átáramlás. A találmány tárgya tehát IL–18-inhibitor alkalmazása periferiális vaszkuláris betegség kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló gyógyszer elõállítására. A „megelõzés” kifejezés a találmány szerinti értelemben nem csak egy bizonyos hatás teljes megakadályozására vonatkozik, hanem a betegséget megelõzõen vagy a korai elõrehaladása esetén a hatás bármilyen részleges vagy lényeges megelõzésre, csillapításra, kisebbítésére, csökkentésére vagy eltüntetésére. A „kezelés” kifejezés a találmány szerinti értelemben a betegség prognózisára kifejtett bármilyen elõnyös hatásra utal, amely tartalmazza a betegség megjelenését követõ patológiás elõrehaladás csillapítását, kisebbítését, csökkentését vagy eltüntetését. A „periferiális vaszkuláris betegség” kifejezés a találmány szerinti értelemben olyan betegségekre vagy rendellenességekre utal, amelyek érintik a végtagok artériáit, vénáit, nyirokereit. A periferiális vaszkuláris rendellenességek lehetnek arteriálisak (elzáródás vagy funkcionális), vénásak, kombinált arteriovénás (például arteriovénás fisztula), vagy nyirok eredetûek. Az elzáródásos arteriális betegség tartalmazza a periferiális arteriális elzáródást és a thromboangitis obliteranst. A funkcionális arteriális rendellenességek lehetnek vasospasticusak (Raynaud-jelenség és ¹betegség, acrocianozis) vagy vazodilatorikusak (erythromegalia). Lehetnek másodlagosak is a vérereknek egy lokális sérülése esetén, vagy a szimpatikus idegrendszeri aktivitások zavarai esetén, vagy kapcsolódhat organikus vaszkuláris betegséghez. A vénás betegségek közé tartozik a vénás trombózis és a vénás varicosa, a kombinált arteriovénás betegségek közé tartozik az arteriovénás

1

HU 004 493 T2

fisztula, és a nyirokrendszeri rendellenességek közé tartozik a nyiroködéma és a zsírödéma. Szándékunk szerint a periferiális vaszkuláris betegség kifejezés tartalmazza a fenti „A találmány háttere” részben ismertetett összes orvosi indikációt, betegséget, rendellenességet vagy tünetet. Az „IL–18-inhibitor” kifejezés a találmány szerinti értelemben bármilyen az IL–18-termelést és/vagy hatást oly módon moduláló molekulára utal, hogy az IL–18-termelés és/vagy hatás csillapodik, csökken, vagy részlegesen, lényegében vagy teljesen megelõzésre kerül vagy gátlódik. A termelés inhibitora lehet bármely molekula, amely negatívan hat az IL–18 szintézisére, feldolgozására vagy érésére. A találmány szerinti megfontolásra kerülõ inhibitorok például az IL–18 interleukin génexpressziójának szuppresszorai, az IL–18 mRNS transzkripcióját meggátló vagy csökkentõ antiszensz mRNS¹ek vagy amelyek az mRNS lebomlásához vezetnek, a megfelelõ feltekeredést lehetetlenné tevõ fehérjék, vagy az IL–18-kiválasztás részleges vagy teljes meggátlása, a megszintetizált IL–18¹at lebontó proteázok, a pro-IL–18¹at az érett IL–18¹cá hasító proteázok inhibitorai, mint amilyenek a kaszpz¹1 inhibitorai és a hasonlók. Az IL–18-inhibitora lehet például egy IL–18-antagonista. Az antagonisták vagy megkötik vagy elzárják az IL–18 molekulát elégséges affinitással és specifikusággal, hogy részben vagy lényegében semlegesítsék az IL–18¹at vagy az IL–18 kötõhely(ek)et, amelyek felelõsek az IL–18 és a ligandjai (mint például receptorai) egymáshoz kötõdéséért. Egy antagonista gátolhatja az IL–18 szignalizációs útvonalát is, amely a sejteken belül aktiválódik, ha az IL–18 kötõdik a receptorához. Az IL–18 hatásának inhibitorai lehetnek oldható IL–18-receptorok vagy a receptorokat utánzó molekulák, vagy az IL–18-receptorokat blokkoló vegyületek, vagy IL–18-antitestek, mint amilyenek a poliklonális vagy monoklonális antitestek, vagy bármilyen további vegyület vagy molekula, amely meggátolja az IL–18nak és a céljainak a kötõdését, ezáltal eltûntetve vagy megelõzve az IL–18 által közvetített intra- vagy extracelluláris reakciókat. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a periferiális vaszkuláris betegség periferiális arteriális betegség. A „periferiális arteriális betegség” egy olyan rendellenesség, amely tartalmazza az artériák beszûkülését bárhol a karok és az aorta és a lábak artériái között. Az elõrehaladása lehet hirtelen vagy fokozatos és általában ischaemiát eredményez (az ér által ellátott területre lecsökkent oxigénjuttatás). Elõnyösen a jelen találmánynak megfelelõen, a periferiális arteriális betegség az alsóvégtagokat érinti. A periferiális arteriális betegség vagy elzáródás lehet krónikus vagy akut. A periferiális arteriális betegség gyakran kapcsolódik sántításhoz. Tehát a találmány tárgya továbbá IL–18-inhibitor alkalmazása sántítás kezelésére és/vagy megelõzésére. A sántítás a lábban lévõ fájdalom, különösen a lábszár-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 6

2

ban, amely jön és megy és ezzel bicegést okoz. A sántítást jellemzõen sétálás közben érezzük és enyhül a pihenés során. Ezért gyakran nevezik szakaszos sántaságnak. A sántaság fájdalmának az általánosan szakaszos természete az idõlegesen nem megfelelõ oxigénellátás következménye a láb izmaiban. A gyenge oxigénellátás az artériák beszûkülésének vagy elzáródásának a következménye, amely artériák látják el a lábat vérrel. Ez korlátozza az oxigénellátást a láb izmaiban és különösen akkor érzõdik, ha ezen izmok oxigénigénye megemelkedik a mozgással vagy sétálással. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a periferiális vaszkuláris betegség a Thromboangitis Obliterans (Buerger-féle betegség). A „Buerger-féle betegség” egy obliteratív betegség, amelyre jellemzõek a gyulladásos elváltozások a kis- és közepes méretû artériákban és vénákban, amely gyakran fordul elõ dohányosokban, különösen 20–40 éves férfiakban. A betegség érinti a kis- és közepes méretû artériákat és gyakran szakaszos mintázatban a végtagok felszíni vénáit. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint a periferiális vaszkuláris betegség periferiális ischaemia, különösen végtagischaemia. Az „ischaemia” a vérellátás hiánya, amely általánosan vérerek elzáródásának vagy traumájának következménye. A „periferiális ischaemia” különösen a végtagok iszkémiájára utal, azaz a karokéra vagy a lábakéra, amely a megfelelõ végtagszövetben az oxigénellátás hiányához vezet. A találmány egy még további elõnyös megvalósítási módja szerint a végtagischaemia kritikus végtagischaemia. A „kritikus végtagischaemia” egy olyan állapot, amelyben a végtag vérellátása olyan rossz, hogy veszélyezteti a túlélését. A nyugalmi fájdalom, ulceració vagy gangréna jelenléte kritikus végtagischaemia indikációja. A gangréna egy olyan kifejezés, amelyet az elhalt szövet ismertetésére alkalmaznak, és gyakran fordul elõ végtagischaemia eredményeként vagy azzal kombinációban. Az ischaemiás fekélyt gyakran a nem megfelelõ vérellátás okozza. A kritikus végtagischaemia, ideértve a gangrénát vagy fekélyeket, esetén szükséges a revaszkularizáció a végtag amputációjának megakadályozása érdekében. Ennek következtében a találmány tárgya továbbá IL–16 inhibitorok alkalmazása gangréna és fekélyek kezelésére és/vagy megelõzésére. A periferiális vaszkuláris betegség, különösen a periferiális ischaemia végsõ következménye lehet az érintett végtag amputációja, részletezve az érintett alsóvégtagé vagy lábfejé. A revaszkularizáció a véráramlás visszatéréséhez vezet az érintett szövetben és így segíti a gyógyulási folyamatot. Tehát a találmány tárgya továbbá IL–18-inhibitor alkalmazása végtagok, különösen alsóvégtag, lábfej vagy lábujj(ak) amputációjának megelõzésére szolgáló gyógyszer elõállítására. Az IL–18-inhibitor a következõk közül választott: kaszpáz¹1 (ICE) inhibitorai, IL–18 elleni antitestek, az IL–18-receptorok bármely alegysége elleni antitestek,

1

HU 004 493 T2

az IL–18 szignalizációs útvonal inhibitorai, az IL–18 olyan agonistái, amelyek kompetícióban vannak az IL–18-cal és blokkolják az IL–18-receptort és IL–18kötõ fehérjék, izoformáik, muteineik, fuzionált fehérjéik, funkcionális származékaik, aktív részleteik vagy cirkulárisan permutált származékaik, amelyek gátolják az IL–18 biológiai aktivitását. Az „IL–18-kötõ fehérjék” kifejezés a leírás szerinti értelemben szinonimája az „IL–18-kötõ fehérje” vagy „IL–18BP” kifejezésnek. Tartalmazza az IL–18 fehérjéket, ahogy azokat Novick és munkatársai definiálták a WO 99/09063 számú nemzetközi közzétételi iratban, ideértve az IL–18-kötõ fehérjék érési változatait és/vagy izoformáit, ahogy ezeket Kim és munkatársai, 2000, definiálták, amelyek kötõdnek az IL–18-hoz. Különösen alkalmasak a humán a és c IL–18BP izoformák a találmánynak megfelelõen. A találmány szerint alkalmas fehérjék lehetnek glikozilezettek vagy nem glikozilezettek, származhatnak természetes forrásból, mint amilyen a vizelet, vagy elõnyösebben rekombináns módon lehetnek elõállítva. A rekombináns expresszió elvégezhetõ prokarióta expressziós rendszerekben, mint amilyen az E. coli, vagy eukariótákban, elõnyösen emlõs expressziós rendszerekben. Az emlõs fehérjék expressziójára különösen alkalmas sejtvonal kínai aranyhörcsög ovárium („Chinese Hamster Ovary”, CHO) sejtvonal. A leírás szerinti értelemben a „muteinek” kifejezés az IL–18BP analógjaira utal, vagy virális IL–18BP analógjaira, amelyben a természetes IL–18BP vagy a virális IL–18BP egy vagy több aminosava különbözõ aminosavra van cserélve, vagy törölve van, vagy egy vagy több aminosav hozzá van adva az IL–18BP, vagy az IL–18BP természetes szekvenciájához, anélkül, hogy jelentõs mértékben megváltozna az eredményül kapott termékek aktivitása a vad típusú IL–18BP-hez vagy a virális IL–18BP-hez képest. Ezek a muteinek ismert szintézissel és/vagy hely-irányított mutagenezis eljárásokkal vannak elõállítva, vagy bármilyen egyéb erre alkalmas eljárással. A találmánynak megfelelõ muteinek közé tartoznak a nukleinsav, mint amilyenek az olyan DNS vagy RNS által kódolt fehérjék, amely DNS vagy RNS hibridizálódik IL–18BP¹t vagy virális IL–18BP¹t kódoló DNS-hez vagy RNS-hez, ahogy ezt a WO 99/09063 számú nemzetközi közzétételi irat ismerteti, sztringens körülmények között. A „sztringens körülmény” olyan hibridizációs és az ezt követõ mosási körülményekre utal, amelyeket az átlagos szakember „sztringensnek” nevez. Lásd Ausubel és munkatársai, Current Protocols in Molecular Biology, lentsupra, Interscience, N. Y., §§6.3 és 6.4 (1987, 1992), és Sambrook és munkatársai, lent. Korlátozás nélkül a szigorú körülmények példái közé tartoznak a vizsgált hibrid számított Tm értéke alatt 12–20 °C történõ mosási körülmények például a következõben 2×SSC és 0,5% SDS 5 percig, 2×SSC és 0,1% SDS 15 percig; 0,1×SSC és 0,5% SDS 37 °C¹on 30–60 percig és ezt követõen 0,1×SSC és 0,5% SDS 68 °C¹on 30–60 percig. A szakterület átlagos képességû szakemberei számára egyértelmû, hogy a sztrin-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 7

2

gensségi feltételek függnek a DNS-szekvenciák, oligonukleotidpróbák (mint a 10–40 bázisosak) vagy kevert oligonukleotidpróbák hosszától is. Ha kevert próbák vannak alkalmazva, akkor elõnyös tetrametilammónium-klorid (TMAC) alkalmazása az SSC helyett. Lásd alább Ausubel. Bármilyen ilyen muteinnnek elõnyösen az aminosavszekvenciája az IL–18BP vagy a virális IL–18BP elégséges duplikációja, mint amilyenek azok, amelyeknek az IL–18BP-vel összemérhetõ aktivitásuk van. Az IL–18BP egy aktivitása az IL–18 kötõképessége. Mindaddig, amíg a muteinnek lényeges IL–18-kötõ aktivitása van, addig alkalmazható az IL–18 tisztítására, mint például affinitáskromatográfia alkalmazásával, és így az IL–18BP-hez hasonló aktivitásúnak tekinthetõek. Tehát meghatározható, hogy bármely adott muteinnnek lényegében azonos aktivitása van, mint az IL–18BP-nek, rutinszerû kísérletek elvégzésével, amely tartalmazza muteinnek, például egy egyszerû szendvics kompetíciónak való alávetésével annak a meghatározását, hogy kötõdik¹e megfelelõen jelölt IL–18-hoz, mint amilyen a radioimmunvizsgálat vagy az ELISA vizsgálat. Bármely ilyen muteinnek legalább 40% azonossága vagy homológiája van vagy az IL–18BP-vel vagy egy virálisan kódolt IL–18BP-vel, ahogy ezt a WO 99/09063 számú nemzetközi közzétételi irat definiálja. Elõnyösebben legalább 50%, legalább 60%, legalább 70%, legalább 80% vagy legelõnyösebben legalább 90% azonossága vagy homológiája van hozzájuk. Az IL–18BP polipeptidek vagy a virális IL–18BP¹k muteinjei, amelyek alkalmazhatóak a találmánynak megfelelõen, vagy az ezeket kódoló nukleinsavak egy véges készletét tartalmazzák lényegében megfelelõ szekvenciáknak, mint szubsztitúciós peptideknek vagy polinukleotidoknak, amelyek rutinszerûen elõállíthatóak átlagos képességû szakember által, el nem várható mennyiségû kísérlet elvégzése nélkül, az itt bemutatott kitanításokon és iránymutatásokon alapulva. A találmánynak megfelelõen a muteinekben lévõ változások azok, amelyeket „konzervatív” szubsztitúcióként ismerünk. Az IL–18BP polipeptidek vagy fehérjék vagy a virális IL–18BP¹k konzervatív szubsztitúciói tartalmazhatnak egy olyan csoporton belüli szinonim aminosavat, amelyek lényegében hasonló fizikokémiai tulajdonságúak, hogy a csoport tagjai közötti szubsztitúció megõrzi a molekula biológiai funkcióját (Grantham, 1974). Egyértelmû, hogy aminosavak inzerciója és deléciója szintén elvégezhetõ a fent definiált szekvenciákban, anélkül, hogy módosulna a funkciójuk, különösen ha az inzerciók vagy deléciók csak néhány aminosavat érintenek, például kevesebbet, mint harmincat, és elõnyösebben kevesebbet, mint tízet, és nem távolítanak el vagy nem helyeznek át olyan aminosavakat, amelyek kritikusak a funkcionális konformációhoz, például cisztein aminosavakat. Az ilyen deléciókkal és/vagy inzerciókkal elõállított fehérjék és muteinek a jelen találmány látókörén belül esnek. Elõnyösen a szinonim aminosavak azok, amelyeket az 1. táblázatban definiáltunk. Elõnyösebben a szino-

1

HU 004 493 T2

nim aminosavak azok, amelyeket a 2. táblázatban definiáltunk; és legelõnyösebben a szinonim aminosavak azok, amelyeket a 3. táblázatban definiáltunk. 1. táblázat Elõnyös szinonim aminosavcsoportok Aminosav

Szinonim csoport

Ser

Ser, Thr, Gly, Asn

Arg

Arg, Gln, Lys, Glu, His

Leu

Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Pro

Gly, Ala, Thr, Pro

Thr

Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr

Ala

Gly, Thr, Pro, Ala

Val

Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val

Gly

Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

Ile

Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile

Phe

Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe

Tyr

Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr

Cys

Ser, Thr, Cys

His

Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His

Gln

Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln

Asn

Gln, Asp, Ser, Asn

Lys

Glu, Gln, His, Arg, Lys

Asp

Glu, Asn, Asp

Glu

Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu

Met

Phe, Ile, Val, Leu, Met

Trp

Trp

2. táblázat Elõnyösebb szinonim aminosavcsoportok Aminosav

Szinonim csoport

Ser

Ser

Arg

His, Lys, Arg

Leu

Leu, Ile, Phe, Met

Pro

Ala, Pro

Thr

Thr

Ala

Pro, Ala

Val

Val, Met, Ile

Gly

Gly

Ile

Ile, Met, Phe, Val, Leu

Phe

Met, Tyr, Ile, Leu, Phe

Tyr

Phe, Tyr

Cys

Cys, Ser

His

His, Gln, Arg

Gln

Glu, Gln, His

Asn

Asp, Asn

Lys

Lys, Arg

Asp

Asp, Asn

5

2

Aminosav

Szinonim csoport

Glu

Glu, Gln

Met

Met, Phe, Ile, Val, Leu

Trp

Trp

3. táblázat Leglõnyösebb szinonim aminosavcsoportok 10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 8

Aminosav

Szinonim csoport

Ser

Ser

Arg

Arg

Leu

Leu, Ile, Met

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Ala

Val

Val

Gly

Gly

Ile

Ile, Met, Leu

Phe

Phe

Tyr

Tyr

Cys

Cys, Ser

His

His

Gln

Gln

Asn

Asn

Lys

Lys

Asp

Asp

Glu

Glu

Met

Met, Ile, Leu

Trp

Met

Az IL–18BP polipeptidek vagy proteinek vagy a virális IL–18BP¹k muteineinek elõállítására alkalmazható fehérjékben történõ aminosavszubsztitúció létrehozásának példái, amelyek alkalmazhatóak a találmány megvalósítása során tartalmaznak bármilyen ismert eljárási lépést, mint például amelyeket Mark és munkatársai 4959314, 4588585 és 4737462 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmai; Koths és munkatársai 5116943 számú, Namen és munkatársai 4965195 számú; Chong és munkatársai 4879111 számú; és Lee és munkatársai 5017691 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalma ismertet; és a 4909548 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban ismertetett lizinszubsztituált fehérjék (Shaw és munkatársai). A „fuzionált fehérje” kifejezés olyan polipeptidre utal, amely tartalmaz IL–18BP¹t, vagy virális IL–18BP¹t, vagy ezek muteinjét vagy fragmensét, egy másik fehérjéhez fuzionáltan, amelynek például megnövekedett a tartózkodási ideje a testfolyadékokban. Egy IL–18BP vagy egy virális IL–18BP, ezek szerint egy másik fehérjéhez, polipeptidhez vagy hasonlóhoz fuzionáltatható, például immunglobulinhoz vagy fragmenséhez.

1

HU 004 493 T2

A leírás szerinti értelemben a „funkcionális származék” olyan IL–18BP¹k vagy virális IL–18BP, és muteineik és fuzionált fehérjéik, származékaira utal, amelyek olyan funkciós csoportokból lettek elõállítva, amelyek aminosavak oldalláncain fordulnak elõ az N¹ vagy C¹terminális csoportokon, szakterületen ismert eljárásokkal, és a találmányhoz tartoznak mindaddig, amíg gyógyászatilag elfogadhatóak, azaz nem teszik tönkre egy olyan fehérje aktivitását, amely lényegében hasonló az IL–18BP, vagy a virális IL–18BP¹k aktivitásához, és nem adnak toxikus tulajdonságot az õket tartalmazó készítményeknek. Ezen származékok közé tartozhatnak például a polietilénglikol oldalláncok, amelyek elfedhetnek antigén jellegû helyeket és megnövelhetik az IL–18BP vagy a virális IL–18BP tartózkodását a testfolyadékokban. A további származékok közé tartoznak a karboxilcsoportok alifás észterei, a karboxilcsoportok amidjai ammóniával vagy elsõdleges vagy másodlagos aminokkal történõ reagáltatásával, az acil részekkel (például alkanoil- vagy karbonsav-aroil-csoportok) kialakított aminosavval szabad aminocsoportjainak N¹acil-származékai vagy acilrészekkel kialakított szabad hidroxilcsoportok (például a szeril vagy treoninil aminosavak) O¹acilszármazékai. Az IL–18BP vagy a virális IL–18BP, muteineik és fuzionált fehérjéik „aktív részei” a találmány szerint lefedi a fehérjemolekulának önmagának vagy a hozzákapcsolt társított molekulával vagy aminosavval együttesen a polipeptidláncának bármilyen fragmensét vagy prekurzorát, amely hozzákapcsolt molekula vagy aminosav például cukor vagy foszfát-aminosav, vagy a fehérjemolekula vagy a cukor-aminosavak önmagukkal alkotott aggregátumai, feltéve, hogy az említett résznek lényegében hasonló aktivitása van az IL–18BPhez. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint az IL–18-inhibitor egy IL–18 vagy a receptora, az IL–18R elleni antitest. Az IL–18R bármely alegysége elleni antitest, amely alegységet IL–18Ranak és b¹nak neveznek alkalmazható a találmány megvalósítása során. A találmány szerinti antitest lehet poliklonális vagy monoklonális, kiméra, humanizált, vagy akár teljesen humán. A rekombináns antitestekre és a fragmenseikre jellemzõ a nagy affinitású kötõdésük az IL–18-hoz vagy az IL–18R-hez in vivo és az alacsony toxikusság. A találmány szerinti alkalmazható antitestekre jellemzõ, hogy képesek páciensek kezelésére elégséges ideig, hogy a patológiás állapot vagy a patológiás állapothoz tartozó bármilyen tünet vagy tünetcsoport jól vagy kitûnõ mértékben csökkenjen vagy enyhüljön, és alacsony a toxikusságuk. Semlegesítõ antitestek könnyen elõállíthatóak állatokban, mint amilyenek a nyulak, kecskék vagy egerek IL–18 vagy IL–18Ra vagy b immunizálásával. Az immunizált egerek különösen alkalmasak B¹sejt-forrásként hibridómák elõállítására, amelyek viszont tenyészthetõek nagy mennyiségû anti-IL–18 monoklonális antitestek nagy mennyiségeinek az elõállítására.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 9

2

A kiméra antitestek olyan immunglobulin-molekulák, amelyekre kettõ vagy több szegmens vagy rész jellemzõ, amelyek különbözõ állatfajokból származnak. Általánosan a kiméra antitest variábilis régiója nem ember emlõsbõl származik, mint amilyen a rágcsáló monoklonális antitest, és az állandó immunglobulin régió humán immunglobulin-molekulából származik. Elõnyösen mindkét régiónak és a kombinációnak is alacsony az immunogenitása, ahogy ez rutinszerûen meghatározható (Elliott és munkatársai, 1994). A humanizált antitestek olyan immunglobulin-molekulák, amelyek genetikai tervezési eljárásokkal lettek elõállítva, amelyekben a rágcsáló állandó régiók a humán megfelelõjükre vannak cserélve, miközben megtartják a rágcsáló antigénkötõ régiókat. Az eredményül kapott egér-humán kiméra antitest elõnyösen lecsökkent immunogenitású és javított farmakokinetikájú emberekben (Knight és munkatársai). Tehát egy további elõnyös megvalósítási mód szerint az IL–18 vagy IL–18R antitest humanizált antitest. A humanizált IL–18 antitestek elõnyös példáit ismerteti például az EP 0974600 számú európai szabadalmi bejelentés. Egy még további elõnyös megvalósítási mód szerint az antitest teljesen humán. A humán antitestek elõállítására szolgáló eljárást ismertet részletesen például a WO 00/76310, WO 99/53049 számú nemzetközi közzétételi irat, a 6162963 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom és az 53336100 számú ausztrál szabadalom. A teljesen humán antitestek elõállítására szolgáló egyik eljárás az egér humorális immunrendszer „humanizálásából” áll, azaz olyan egértörzsek elõállításából, amelyek képesek humán Ig elõállítására (Xenoegerek), a humán immunglobulin (Ig) lókuszok egérbe történõ bevitele révén, amelyben az endogén Ig gének inaktiválva lettek. Az Ig lókuszook komplexek mind a fizikai szerkezetük, mind a gén újrarendezõdésük és az expressziós folyamatuk tekintetében, amelyek szükségesek széles spektrumú immunválasz elõállítására. Az antitest diverzitást elsõsorban az Ig lókuszokon jelen levõ különbözõ V, D és J gének kombinatorikus átrendezõdése hozza létre. Ezek a lókuszok tartalmazzák továbbá az elszórt szabályozóelemeket is, amelyek szabályozzák az antitestexpressziót, allélikus kizárást, osztályváltást és affinitás érést. A nem átrendezõdött humán Ig transzgének bevitele az egerekben bemutatta, hogy az egér rekombinációs gépezet kompatibilis a humán génekkel. Továbbá az antigénspecifikus különbözõ izotípusú hu¹mAbs-eket kiválasztó hibridómák állíthatóak elõ Xenoegér antigénes immunizálásával. Teljesen humán antitestek és eljárások az elõállításukra ismertek a szakterületen [Mendez és munkatársai (1997); Buggemann és munkatársai (1991); Tomizuka és munkatársai (2000); WO 98/24893 számú nemzetközi közzétételi irat]. A találmány egy nagyon elõnyös megvalósítási módja szerint az IL–18-inhibitor egy IL–18BP, vagy ennek izoformája, muteine, fuzionált fehérjéje, funkcionális származéka, aktív része vagy cirkulárisan permutált származéka. Ezek az izoformák, muteinek, fuzionált fe-

1

HU 004 493 T2

hérjék vagy funkcionális származékok megtartják az IL–18BP biológiai aktivitását, különösen az IL–18-hoz való kötõdést, és elõnyösen esszenciálisan legalább az IL–18BP-hez hasonló aktivitásuk van. Ideális esetben az ilyen fehérjéknek javított biológiai hatásuk van a nem módosított IL–18BP-hez képest. Az elõnyös aktív részeknek olyan aktivitásuk van, amely jobb, mint az IL–18BP aktivitása, vagy amelyeknek további elõnyeik vannak, mint a jobb stabilitás vagy az alacsonyabb toxikusság vagy immunogenitás, vagy könnyebb õket elõállítani nagy mennyiségekben, vagy könnyebb õket tisztítani. Az IL–18BP és az érési variánsainak/izoformáinak a szekvenciái vehetõek Novick és munkatársai WO 99/09063 számú nemzetközi közzétételi iratából (1999), valamint Kim és munkatársaitói (2000). Az IL–18BP funkcionális származékai konjugálva lehetnek polimerekhez annak érdekében, hogy javítsák a fehérje tulajdonságait, mint amilyen a stabilitás, féléletidõ, biológiai elérhetõség, a humán test általi tolerancia, vagy az immunogenitás. Ezen cél eléréséhez az IL–18¹BP kapcsolható például Polietilénglikolhoz (PEG). A PEGilezés elvégezhetõ ismert eljárásokkal, amelyek például a WO 92/13095 számú nemzetközi közzétételi iratban lettek ismertetve. Ezért a találmány egy megvalósítási módja szerint az IL–18-inhibitorok, az IL–18BP¹k PEGilezve vannak. A találmány egy további megvalósítási módja szerint az IL–18-inhibitor tartalmaz immunglobulinfúziót, azaz az IL–18-inhibitor egy fúziós fehérje, amely tartalmazza IL–18-kötõ fehérje részét vagy egészét, amely immunglobulin részéhez vagy egészéhez van fuzionálva. Az immunglobulinfúziós fehérjék elõállítására szolgáló eljárások jól ismertek, mint amilyeneket ismertet például a WO 01/03737 számú nemzetközi közzétételi irat. Szakember számára egyértelmû, hogy az eredményül kapott találmány szerinti fúziós fehérje megtartja az IL–18BP biológiai aktivitását, különösen az IL–18 kötését. A fúzió lehet közvetlen, vagy egy rövid összekötõpeptiden keresztüli, amely lehet akár 1–3 aminosav rövidségû vagy hosszabb, például 13–20 aminosav hosszúságú. Az összekötõpeptid lehet például E¹F¹M (Glu-Phe-Met) szekvenciájú, vagy egy 13 aminosavas összekötõpeptid, amelynek a szekvenciája tartalmazza a következõt Glu-Phe-Gly-AlaGly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met az IL–18BP szekvencia és az immunglobulinszekvencia között. Az eredményül kapott fuziósfehérjének javított tulajdonságai vannak, mint amilyen a megnövelt tartózkodási érték a testfolyadékokban (féléletidõ), megnövelt specifikus aktivitás, megnövelt expressziós színt, vagy könnyített a fúziósfehérje tisztítása. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint az IL–18BP egy Ig molekula állandó régiójához van fuzionálva. Elõnyösen a nehéz lánc régiókhoz van fuzionálva, mint amilyenek például a humán IgG1-nek vagy IgG2-nek a CH2 és CH3 doménjei. Az IL–18BP¹t és egy immunglobulin részt tartalmazó specifikus fuziósfehérjék elõállítása ismertetve van például a WO 99/09063 számú nemzetközi közzétételi iratban. Az Ig molekulák egyéb

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 10

2

izoformái szintén megfelelõek a találmány szerinti fuziósfehérjék elõállítására, mint amilyen Ig izoforma az IgG2 vagy IgG4, vagy egyéb Ig osztályok, mint az IgM vagy IgA, például. A fúziósfehérjék lehetnek monomerek vagy multimerek, hetero- vagy homomultimerek. A találmány egy még további megvalósítási módja szerint az IL–18-inhibitor kombinációban van alkalmazva egy vagy több a találmány szerinti klinikai állapotokban aktív molekulával mint amilyenek a vazodilatátorok, Ca¹blokkolók, aszpirin, béta-blokkolók és a hasonlók. A TNF-antagonisták például alkalmazhatóak IL–18-inhibitorral kombináltan a találmánynak megfelelõen. A TNF-antagonisták számos módon fejtik ki a hatásukat. Elõször antagonisták tudnak magához a TNF-molekulához kötõdni és elzárni elégséges affinitással és specifikussággal, hogy részlegesen vagy lényegesen semlegesítsék azokat a TNF-epitópokat vagy a TNFreceptor kötõdésért felelõs TNF-epitópokat (a továbbiakban „elzáró antagonistáknak” nevezzük õket). Egy elzáró antagonista lehet például egy TNF elleni antitest. Alternatív megvalósítási mód szerint a TNF-antagonista gátolhatja a TNF szignalizációs útvonalat, amelyet a sejtfelszíni receptorok aktiválnak a TNF kötõdést követõen (a továbbiakban „szignalizációs antagonistáknak” nevezzük õket). Az antagonisták mindkét csoportja alkalmas önmagában vagy együttesen IL–18-inhibitorral kombinációban periferiális vaszkuláris betegség terápiájára vagy megelõzésére. A TNF-antagonisták könnyen azonosíthatóak és értékelhetõek az anti-TNF¹re kifejtett aktivitásukra való rutin szûrési eljárásokkal fogékony sejtvonalakban in vitro, például humán B¹sejtekben, amelyekben a TNFproliferációt és immunglobulin kiválasztást okoz. A vizsgálati eljárás TNF-kiszereléseket tartalmaz a jelölt antagonista különbözõ hígításainál például 0,1–100-szoros moláris mennyiségû TNF van alkalmazva a vizsgálatban és TNF nélküli vagy csak antagonistát tartalmazó kontrollok (Tucci és munkatársai, 1992). Az elõnyös TNF-antagonisták az elzáró antagonisták a találmány megvalósítási módjaiban. Az elzáró antagonisták között, azok a polipeptidek elõnyösek, amelyek megkötik nagy affinitással a TNF¹et és kis immunogenitásúak. Az oldható TNF-receptor-molekulák és a TNF-semlegesítõ antitestei különösen elõnyösek. Például az oldható TNF¹RI és TNF-RII alkalmasak a találmány megvalósítására. Ezen receptorok csonkolt formái, amelyek tartalmazzák a receptorok extracelluláris doménjeit vagy funkcionális származékaikat, különösen elõnyös találmány szerinti antagonisták. Az (I) típusú és (II) típusú csonkolt oldható TNF-receptorokat ismertet például az EP 914431 számú európai szabadalom. A TNF-receptorok csonkolt formái oldhatóak és ki lettek mutatva vizeletben és vérben 30 kDA és 40 kDa TNF-gátló kötõfehérjeként, amelyeket rendre TBPI-nek és TBPII-nek neveznek (Engelmann és munkatársai, 1990). Az IL–18-inhibitor és a TNF-antagonista egyide-

1

HU 004 493 T2

jû, egymás utáni vagy elkülönülõ alkalmazása elõnyös a találmány szerint. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint a humán oldható TNF¹RI (TBPI) a TNF-antagonista van a találmány szerinti alkalmazva. A természetes és a rekombináns oldható TNF-receptor-molekulák és a termelésükre alkalmas eljárások lettek ismertetve az EP 308378, EP 398327 és EP 433900 számú európai szabadalmakban. A receptormolekula származékai, fragmensei, régiói és biológiailag aktív részei funkcionálisan hasonlítanak a receptormolekulákra szintén alkalmazhatóak a találmány szerinti. A receptormolekula ilyen biológiailag aktív ekvivalense vagy származéka a polipeptid olyan részére vagy a receptormolekulát kódoló szekvencia olyan részére utal, amely megfelelõ méretû és képes kötõdni a TNF-hez olyan affinitással, hogy a membránkötött TNF-receptor gátolva és blokkolva van. Az IL–18-inhibitor alkalmazható a TNF-inhibitorral egyidejû, egymás utáni vagy elkülönülõ módon. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint az IL–18-inhibitor körülbelül 0,01–100 mg/kg vagy körülbelül 1–10 mg/kg vagy 2–5 mg/kg mennyiségben van alkalmazva. A találmány szerinti IL–18-inhibitor elõnyösen szisztematikusan van beadva, és elõnyösebben szubkután vagy intramuscularis módon. Beadható naponta, vagy minden másnaponta. A fenntartott kibocsátású kiszerelések lehetõvé teszik a ritkább beadást, mint amilyen például a heti beadás. A találmány tárgya továbbá expressziós vektor alkalmazása, amely tartalmazza IL–18-inhibitor kódoló szekvenciáját periferiális vaszkuláris betegség megelõzésére és/vagy kezelésére. Tehát megfontolás részét képezi egy génterápiás megközelítés az IL–18-inhibitor célba juttatására, arra a helyre ahol szükséges. Perifériális vaszkuláris betegség kezelése/megelõzése érdekében az IL–18-inhibitor szekvenciáját tartalmazó vektor például közvetlenül beinjekciózható a beteg szövetbe, ezáltal elkerülhetõek a génterápiás vektorok szisztémás beadással járó gondok, mint amilyen a vektorok kihígulása, a célsejtek vagy szövetek elérése vagy célzása és a mellékhatások. A találmány részét képezi továbbá vektor alkalmazása egy sejtben IL–18-inhibitor endogén termelésének indukálására és/vagy fokozására, amely sejt rendesen csendes IL–18-inhibitor expressziójára, vagy amely nem elégséges mennyiségben expresszál inhibitort. A vektor tartalmazhat a sejtben mûködõképes szabályozószekvenciákat, amelyek szükségesek az IL–18-inhibitor expressziójához. Az ilyen szabályozószekvenciák lehetnek például promoterek, enhanszerek. A szabályozószekvencia ezután bevihetõ a genom megfelelõ lókuszába homológ rekombinációval, tehát a szabályozószekvencia és a gén mûködõképes összekapcsolásával, amely gén expresszióját szükséges indukálni vagy fokozni. Az eljárást általában nevezik „Endogén génaktiválásnak” (EGA), és ismertetik például a WO 91/09955 számú nemzetközi közzétételi iratban.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 11

2

Szakember számára érthetõ, hogy lehetséges az IL–18 expresszió lekapcsolása közvetlenül, IL–18-inhibitor alkalmazása nélkül ugyanezzel az eljárással. Ehhez egy negatív szabályozóelemet, például egy csendesítõelemet lehet bevinni az IL–18 génlókuszába, amely az IL–18 expresszió leszabályozásához és megelõzéséhez vezet. Szakember számára érthetõ, hogy az IL–18 expresszió ilyen leszabályozása vagy csendesítése ugyanolyan hatású, mint az IL–18-inhibitor alkalmazása betegség megelõzésére vagy kezelésére. A találmány tárgya továbbá olyan sejt alkalmazása, amely genetikailag módosítva van, hogy termeljen IL–18-inhibitort, periferiális vaszkuláris betegség kezelésére és/vagy megelõzésére. A találmány szerinti értelemben alkalmazott IL–18inhibitor elõnyösen beadható gyógyászati készítményként, adott esetben kombinációban terápiásan hatásos mennyiségû TNF-inhibitorral vagy egyéb gyógyszerrel, amely hatásos periferiális vaszkuláris betegség kezelésében vagy megelõzésében. Az IL–18BP és az izoformái, muteinjei, fuzionált fehérjéi, funkcionális származékai, aktív részei vagy cirkulárisan permutált származékai, ahogy azokat fent ismertettük az elõnyös hatóanyagok a gyógyászati készítményekben. A „gyógyászatilag elfogadható” definíciója szándékunk szerint magában foglal bármilyen hordozót, amely nem interferál a hatóanyag biológiai aktivitásának hatásosságával és amely nem toxikus a gazda számára, amelynek beadásra kerül. Például parenterális beadásra a hatóanyag fehérje(k) kiszerelhetõek egységdózis formában injekciózásra olyan hordozókban, mint a sóoldat, dextrózoldat, szérumalbumin és Ringer-oldat. A találmány szerinti gyógyászati készítmény hatóanyagai beadhatóak egy egyednek számos módon. A beadási módok közé tartozik az intradermális, transzdermális (például lassú kibocsátású kiszerelésekben), intramuszkuláris, intraperitoneális, intravénás, szubkután, orális, intracarniális, epidurális, topikális és intranazális beadás. Bármilyen más terápiásan hatásos beadási mód alkalmazható, például epitél vagy endotél szöveteken keresztüli abszorpció vagy génterápiával, melynek során a hatóanyagot kódoló DNS-molekula kerül beadásra páciensnek (például egy vektor révén), amely a hatóanyag expresszióját és a kiválasztását váltja ki in vivo. Továbbá a találmány szerinti fehérjék beadhatóak egyéb biológiai hatóanyagok összetevõkkel, mint amilyenek a gyógyszerészetileg elfogadható felületaktív anyagok, excipiensek, hordozók, diluensek és vivõszerek. A parenterális beadásra (azaz intravénás, szubkután, intramuszkuláris) a hatóanyag fehérj(ék) kiszerelhetõek oldatként, szuszpenzióként, emulzióként vagy liofilezett porként a gyógyászatilag elfogadható parenterális vivõanyaggal kapcsoltan (például víz, sóoldat dextrózoldat) és adalékokkal, amelyek fenntartják az izotonikusságot (például mannit) vagy kémiai stabilitást (például tartósítószerek és pufferek). A kiszerelést közönségesen alkalmazott eljárásokkal lehet sterilezni.

1

HU 004 493 T2

A találmány szerinti hatóanyag fehérjék biológiai elérhetõsége szintén javítható konjugálási eljárások alkalmazásával, amelyek növelik a molekula féléletidejét a humán testben, például a molekula polietilénglikolhoz történõ kapcsolásával, ahogy ez ismertetésre kerül a WO 92/13095 számú nemzetközi közzétételi iratban. A hatóanyag fehérjék terápiásan hatásos mennyiségei számos változó függvénye, ideértve az antagonista típusát, az antagonista affinitását az IL–18¹ra, az antagonista által mutatott bármilyen maradék citotoxikusság, a beadás módja, a páciens klinikai állapota (ideértve az IL–18-aktivitás endogén nem toxikus szintjének fenntartásának elõnyösségét). A „terápiásan hatásos mennyiség” olyan, hogy amikor beadásra kerül az IL–18-inhibitor, akkor az IL–18 biológiai aktivitásának gátlását eredményezi. Az egyednek egyszeres vagy többszörös dózisban beadott dózis számos faktortól fog függeni, amelyek közé tartoznak az IL–18-inhibitor farmakokinetikai tulajdonságai, a beadás módja, a páciens állapota és jellemzõi (nem, kor, testtömeg, egészségi állapot, méret), a tünetek mértéke, egyidejû kezelések, a kezelés gyakorisága és a kívánt hatás. A megalapozott dózistartományok beállítása és manipulálása szakember képességeit nem haladja meg, valamint az in vivo és in vitro eljárások egyedben az IL–18 gátlásának meghatározására szolgál. A találmány szerint az IL–18-inhibitor körülbelül 0,001–100 mg/kg vagy körülbelül 0,01–10 mg/kg testtömegre vetített mennyiségben vagy körülbelül 0,1–5 mg/kg testtömeg vagy körülbelül 1–3 mg/kg testtömeg vagy körülbelül 2 mg/kg testtömeg mennyiségben van alkalmazva. A találmány szerinti elõnyös beadási mód a szubkután beadás. Elõnyös továbbá az intramuszkuláris beadás a találmány szerint. Az IL–18-inhibitor közvetlenül a hatásának helyére történõ bejuttatásához elõnyös továbbá a topikális beadás. További megvalósítási módok szerint az IL–18-inhibitor naponta vagy másnaponta kerül beadásra. A napi dózisok általában megosztott dózisokként vagy fenntartott kibocsátású formában kerülnek beadásra a megfelelõ eredmények elérésére. A második vagy késõbbi beadások elvégezhetõek azonos dózisban, kisebb vagy nagyobb dózisban a kezdeti vagy a megelõzõ dózishoz képest, amely az egyednek lett beadva. Egy második vagy követõ beadás beadható a betegség alatt, elõtt vagy megjelenésekor. A találmány szerint az IL–18-inhibitor beadható megelõzõ módon vagy terápiásan egy egyednek további terápiás rezsimek vagy hatóanyagok (például többgyógyszeres rezsimek) beadása elõtt, után vagy azokkal egyidejûleg, terápiásan hatásos mennyiségben, különösen TNF-inhibitorral és/vagy egyéb vaszkuláris védõ hatóanyaggal. Az egyéb hatóanyagokkal egyidejûleg beadott hatóanyagok beadhatóak ugyanabban vagy egy különbözõ készítményben. A találmány tárgya továbbá eljárás gyógyászati készítmény elõállítására, amely tartalmazza IL–18-inhibitor hatásos mennyiségének és/vagy TNF-antagonistá-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 12

2

nak az elkeverését gyógyászatilag elfogadható hordozóval. Ismertettük a periferiális vaszkuláris betegség egy kezelési eljárása, amely tartalmazza IL–18-inhibitor gyógyászatilag hatásos mennyiségének a beadását, adott esetben TNF-antagonista gyógyászatilag hatásos mennyiségével kombináltan erre szükséget mutató páciensnek. Most, hogy teljesen ismertettük a találmányt szakember elfogadja, hogy ugyanez végrehajtható ekvivalens paraméterek, koncentrációk és körülmények széles tartományán belül, anélkül, hogy eltávolodnánk a találmány szellemétõl és oltalmi körétõl és el nem várható kísérletezés nélkül. Az ismert eljárásokra, hagyományos eljárási lépésekre, ismert eljárásokra vagy hagyományos eljárásokra való hivatkozás semmilyen mértékben sem annak az elismerése, hogy az itt ismertetett találmány szempontja, leírása vagy megvalósítási módja ismertetésre, kitanítva vagy sugallva lett volna a releváns szakterületen. Az elõzõ leírása a specifikus megvalósítási módoknak teljesen felfedik a találmány általános természetét, amelyet mások szakember tudását alkalmazva tudnak (az itt hivatkozott szakirodalom tartalmával), egyszerûen módosítani és/vagy adaptálni különbözõ alkalmazásokra, mint amilyenek a specifikus megvalósítási módok, el nem várható kísérletezés nélkül, a találmány általános koncepcióját el nem hagyva. Ezért az ilyen adaptációk és módosítások szándékaink szerint az ismertetett megvalósítási módok ekvivalenciáinak értelmén és tartományán belül vannak, az itt bemutatott kitanítás és iránymutatás alapján. Meg kell érteni, hogy az alkalmazott terminológia és frazeológia célja a leírás és nem a korlátozás, hogy a leírás terminológiája és frazeológiája értelmezhetõ legyen szakember számára az itt bemutatott kitanítások és iránymutatások fényében az átlagos szakember tudásával kombinálva. 1. példa: Az IL–18 gátlása csökkenti a periferiális ischaemiát Módszerek: A hátsóvégtag-ischaemia bevitele Hím C57BL/6J egereken (Iffa Creddo, Lyon, Franciaország) mûtétet végeztünk, hogy unilaterális hátsóvégtag-ischaemiát váltsunk ki. Az állatokat izoflurán belélegeztetéssel altattuk el. A ligatúrát a jobb lábszárartérián végeztük, 0,5 cm¹re proximálisan a saphenous és a popliteal artériák elágazásától. Az egereket (csoportonként 7 állat) ezt követõen specifikus patogénmentes körülmények között tartottuk 3 vagy 28 napig. Az IL–18BP-nek az ischaemia-indukálta angiogenezisben betöltött szerepének vizsgálatára, egy csoport egeret 60 mg rágcsáló IL–18BP expressziós plazmiddal, pcDNA3-mIL18BP injektáltunk mindkét tibialis cranialis izomba, ahogy ezt korábban ismertették (Mallat és munkatársai, 2001). A kontrollegerek azonos dózisú üres kontroll plazmiddal lettek injekciózva. Transzkután elektromos pulzusokat (8 darab 200 V/cm¹es négyzethullám pulzus, 20 ms idõtartam, 2 Hz) vittünk be

1

HU 004 493 T2

PS¹15 elektropulzátorral (Genetronics) két rozsdamentes elektróda alkalmazásával, amelyeket 4,2–5,3 mm¹re helyeztünk egymástól a láb mindegyik oldalára. Azért alkalmaztuk ezt a stratégiát, mert errõl korábban kimutatták, hogy növeli az IL–18BP plazmaszinteket, csökkenti a plazmabeli IL–18-aktivitást és gátolja atherosclerotikus plakk kialakulását és fejlõdését (Mallat és munkatársai, 2001). Az angiogenezis kvantifikálása Mikroangiográfia Az érsûrûséget nagy felbontóképességû mikroangigráfiával határoztuk meg a kezelési idõszak végén, ahogy azt korábban ismertették (Silvestre és munkatársai, 2000; Silvestre és munkatársai, 2001). Röviden, egereket altattunk (izoflurán belélegeztetés) és kontrasztanyagot (bárium-szulfát, 1 g/ml) injekcióztunk egy katéteren keresztül az abdominalis aortába. A képeket (állatonként hármat) digitális röntgensugárzóval készítettük, amelyet úgy szereltünk össze, hogy teljes képet adjon a hátsó végtagokról. Az érsûrûséget képenkénti azon pixelek százalékaként adtuk meg, amelyek a meghatározási terület erei által voltak lefedve. A meghatározási területet a ligatúrának a lábszár artérián lévõ helyével a térd, a lábszár vége és a láb külsõ végével határoltuk be. Kapillárissûrûség Mikroangiográfiás vizsgálatot végeztünk a kapillárissûrûségek meghatározásával ischaemiás és nem ischaemiás izmokon, ahogy ezt korábban ismertették (Silvestre és munkatársai, 2000; Silvestre és munkatársai, 2001). Fagyasztott szöveti metszeteket inkubáltunk (7 mm) CD31 elleni patkány monoklonális antitesttel (20 mg/ml, Pharmingen) a kapillárisok azonosítására. Az immunofestékeket avidin-biotin tormaperoxidázos elõhívó rendszer alkalmazásával tettük láthatóvá (Vectastain ABC kit elite, Vector Laboratories). A kapillárissûrûséget véletlenszerûen kiválasztott területeken számoltuk ki egy meghatározott területen belül a Histolab szoftver alkalmazásával (Microvision). Lézer-doppler átáramlásos képalkotás Azért, hogy funkcionális bizonyítékot adjunk az ischaemia által kiváltott változásokra a vaszkularizációban Lézer-doppler átáramlásos képalkotásos kísérleteket végeztünk korábban ismertetett módon (Silvestre és munkatársai, 2000; Silvestre és munkatársai, 2001). Röviden, a felesleges szõrzetet eltávolítottuk szõrtelenítõkrémmel a végtagról a képalkotást megelõzõen, és az egereket egy fûthetõ lemezre helyeztük 37 °C¹ra, hogy minimalizáljuk a hõmérséklet-változást. Azonban, a változások figyelembe vételére, amelyek közé tartozott a közömbös fény és hõmérséklet, a kiszámolt átáramlást az ischaemiás és nem ischaemiás láb arányaként fejeztük ki. Statisztikai elemzés Az eredményeket átlag±SEM értékekként adtuk meg. Egyirányú ANOVA varianciaanalízist alkalmaz-

5

2

tunk az egyes paraméterek összehasonlítására. Post hoc Bonferonni t¹teszt összehasonlításokat végeztünk, hogy azonosítsuk, hogy mely csoportkülönbségek felelõsek a szignifikáns teljes ANOVA-ért. A p<0,05 értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Eredmények Mikronagiográfia A 3. napon nem változtak az ischaemiás/nem is10 chaemiás láb angiográfiás érték arányok semelyik csoportban sem (1. ábra). Ezzel szemben a 28. napon az angiográfiás érték 1,6-szeres növekedést mutatott az IL–18BP-vel kezelt egerekben a kontrollegerekhez képest (p<0,01). 15 Kapillárissûrûség A mikroangiográfiás adatokat CD31¹es festés követõ kapillárissûrûség vizsgálattal igazoltuk. A 28. napon az ischaemiás láb kapillárissûrûsége a kontrollegerek20 ben alacsonyabb volt, mint a nem ischaemiás lábé (415±31 szemben a 688±42 ér/mm2, p<0,01). Azonban az IL–18BP kezelt egerek ischaemiás lábának a kapillárissûrûsége szignifikánsan nagyobb volt (1,4-szeres növekedés), mint a kontrollegereké (588±48 szemben 25 a 415±31 ér/mm2, p<0,01) és nem különbözött a nem ischaemiás lábban megfigyelt szinttõl. Lézer-doppler átáramlásos képalkotás A mikroangiográfiás és kapillárissûrûség-mérése30 ket összekapcsoltuk a vérátáramlásban bekövetkezõ változásokkal. A hátsóvégtag véráram helyreállás lejátszódott mind a kezelt, mind a nem kezelt egerekben. Azonban az IL–18BP kezelt egerekben nyilvánvaló volt a nagyobb véráramlás növekedés (lábfej átáramlás) a 35 28. napra a kontrollállatokhoz képest (1,5-szörös, p<0,01, 2. ábra) 2. példa: A VEGF, foszfo-Akt és eNOS fehérjeszintek szabályozása Módszer 40 Meghatároztuk a VEGF, foszfo-Akt és eNOS (endotél nitrogén-oxid szintáz fehérje) expresszióját Western-blottal ischaemiás és nem ischaemiás lábakban, ahogy azt korábban ismertették (Silvestre és munka45 társai, 2000; Silvestre és munkatársai, 2001). Eredmények VEGF. A 3. napon nem figyeltünk meg változásokat a VEGF fehérje szintjében az ischaemiás és a nem is50 chaemiás lábak között semelyik csoportban sem. A 28. napon a kontrollegerekben a VEGF fehérje szintje növekedett az ischaemiás lábban, ha a nem ischaemiás lábhoz hasonlítottuk, de ez nem ért el statisztikailag szignifikáns szintet. Ezzel szemben az ischaemiás láb 55 VEGF fehérje szintje láthatóan megnövekedett 120%kal IL–18BP-vel kezelt egerekben a kontrollokhoz viszonyítva (p<0,05) (3. ábra). Foszfo-Akt. A 3. napon a foszfo-Akt szint nem változott az ischaemiás és nem ischaemiás hátsó végta60 gokban bármilyen is volt a kezelés. A 28. napon a kont13

1

HU 004 493 T2

rollegerekben a foszfo-Akt fehérje szintje 0,6%-kal megnövekedett az ischaemiás hátsóvégtagban a nem ischaemiáshoz képest (p<0,01). A foszfo-Akt ezen növekedése az ischaemiás lábban megkétszerezõdött az IL–18BP-vel kezelt egerekben (110% növekedés, p<0,05 a kontrollegerek ischaemiás lábával összehasonlítva) (4. ábra). eNOS. A 3. napon az eNOS fehérjetartalom nem változott az ischaemiás (107±8% a 103±24%-kal szemben) és nem ischaemiás lábakban (100±12% a 94±21%-kal szemben) rendre a kontroll és IL–18BP kezelt állatok esetében. A 28. napon a kontrollegerekben az eNOS-szintek 55%-kal növekedtek az ischaemiás lábban a nem ischaemiáshoz képest (rendre 155±8% a 100±24%-kal szemben, p<0,05). Ezt a növekedést nem befolyásolta az IL–18BP kezelés (160±12%, P=0,6 az ischaemiás kontrollal szemben). 3. példa: Az IL–18BP hatása az EPC-kre (endotél õssejtek) Módszerek Áramlási citometria vizsgálat Az EPC-sejtekrõl úgy vélik, hogy irányítják az Scapozitív hematopoetikus õssejteket (Takahashi és munkatársai, 1999). Az Sca–1 EPC markerfehérjét expresszáló mononukleáris sejtek százalékát határoztuk meg ezt követõen áramlási citometriával. Az ischaemia után 7 nappal mononukleáris sejteket izoláltunk periferiális vérbõl (300 ml) és csontvelõbõl az üres pcDNS3 plazmiddal vagy a pcDNS-mIL–18BP plazmiddal kezelt egerekbõl (n=5) csoportonként. A csontvelõsejteket a combcsontok és a lábszárak mosásával állítottuk elõ. A kis sûrûségû mononukleáris sejteket ezt követõen fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) konjugált Sca–1 elleni monoklonális antitestekkel (D7, BD Pharmingen) inkubáltuk. Az izotípus azonos antitestek szolgáltak kontrollként. EPC differenciációs vizsgálat Azonnal az izolálást követõen, 5.106 csontvelõ-eredetû mononukleáris sejtet tenyésztettünk 35 mm¹es sejttenyésztõ edényeken, amelyek plazma vitronektinnel (Sigma) és zselatinnal (0,1%) voltak bevonva és fenntartottuk õket endotél bazális tápközegben (EBM2, Bio whittaker). 4 napos tenyésztést követõen eltávolítottuk a nem adherens sejteket és az adherens sejteken immunkémiai vizsgálatokat végeztünk. Az 1,1’-dioktadecil-3,3,3’,3’-tetrametil-indokarbocianin-jelölt acetilezett kis sûrûségû lipoprotein (AcLDL-Dil) felvétel detektálására a sejteket AcLDL-Dil (Tebu) jelenlétében 37 °C¹on 1 órát inkubáltuk. A sejteket ezt követõen rögzítettük 2%¹os paraformaldehiddel, inkubáltuk elsõdleges nyúl eredetû von-Willbrand faktor (vWF) (DAKO) elleni antitesttel 1 órát, és FITCjelölt monoklonális nyúl elleni IgG-vel (H+L) 30 percet (Coulter). A kétszeresen festett sejtek közül azokat tekintettük EPC-knek, amelyek pozitívak voltak mind az AcLDL-Dil¹re, mind a vWF¹re, és megszámoltuk õket lyukanként. Három független meghatározás értékelte az EPC¹k számát lyukanként három véletlenül kivá-

2

lasztott erõsen festett mezõben. Az eredményeket ezt követõen a mononukleáris sejtek teljes számának százalékaként fejeztük ki. 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 14

Eredmények Az EPC¹k vélhetõen Sca–1 pozitív sejtekbõl erednek (Takahashi és munkatársai 1999). Az Sca–1 pozitív mononukleáris sejtek a periferiális vérben nem változtak az IL–18BP-vel kezelt egerekben a kontrollállatokhoz képest (rendre 31,5±13% a 28,5±13%-kal szemben). Hasonló módon az Sca–1 pozitív mononukleáris sejtek teljes mennyisége, amely csontvelõbõl lett izolálva nem különbözött IL–18BP-vel kezelt és kontrollegerek között (rendre 4,35±0,95% a 5,87±0,22%-kal szemben). Továbbá az IL–18BP kezelés nem befolyásolta a periferiális vér vagy csontvelõ mononukleáris sejtek összes számát (adatokat nem mutatjuk). EPC-ket izoláltunk és tenyésztettünk csontvelõ mononukleáris sejtekbõl és jellemeztük õket kétszeresen festett sejtekként, amelyek pozitívak voltak AcLDLDil¹re és vWF¹re. A kettõsen pozitív festésû sejtek százaléka majdnem detektálhatatlan volt nem ischaemiás állatokban (<5%, n=4). Az ischaemia jelentõs növekedést indukált az AcLDL-Dil és vWF kettõs pozitív festésû sejtek százalékában (483%, p<0,001 a nem ischaemiás állatokkal szemben). Ezt a hatást tovább növelte az IL–18BP kezelés (483% a kontrollok esetében a 852%-kal szemben az IL–18BP-vel kezelt egerek esetében, p<0,001) (5. ábra). Tehát úgy tûnik, hogy az IL–18BP kezelés stimulálja a mononukleáris sejtek differenciálódását EPC-kké és nem növeli a cirkuláló õssejtek számát. Hivatkozások 1. Buggemann et al., Eur. J. Immunol. 21: 1323–1326 (1991). 2. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E. and Karin, M. (1997). Nature 388, 16 514–16 517. 3. Elliott, M. J., Maini, R. N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., and Woody, J. N., 1994, Lancet 344, 1125–1127. 4. Engelmann, H., Novick, D., and Wallach, D., 1990, J. Biol. Chem. 265, 1531–1536. 5. Grantham (1974), Science, 185. 862–864. 6. Kim S. H., Eisenstein M., Reznikov L., Fantuzzi G., Novick D., Rubinstein M., Dinarello C. A. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL–18 binding protein to inhibit IL–18. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 1190–1195. 7. Kim SH et al., J. Immuno. 2001, 166, pp. 148–154. 8. Knight D. M., Trinh H., Le J., Siegel S., Shealy D., McDonough M., Scallon B., Moore M. A., Vilcek J., Daddona P., et al. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody. Mol. Immunol. 1993 Nov. 30: 16 1443–53. 9. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982.

1

HU 004 493 T2

10. Meldrum, D. R., Cleveland, J. C., Jr., Cain, B. S., Meng, X. & Harken, A. H. (1998) Ann Thorac Surg 65, 439–43. 11. Mendez, M. M., Green, L. L., Corvalan, J. R. F., Jia X¹C., Maynard–Currie, E. E., Yang, X¹D., Gallo, M. L., Louie, D. M., Lee, D. V., Erickson, K. L., Luna, J., Roy, C. M¹N, Abderrahim, H., Kirshenbaum, F., Noguchi, M., Smith, D. M., Fukushima, A., Hales, J. F., Finer, M. H., Davis, C. G., Zsebo, K. M. and Jakobovits, A. (1997). „Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice”. Nature Genetics, 15, 146–56. 12. Nakamura, K., Okamura, H., Nagata, K. and Tamura, T. (1989). Infect. Immun. 57, 590–595. 13. Novick, D., Kim, S¹H., Fantuzzi, G., Reznikov, L., Dinarello, C., and Rubinstein, M. (1999). Immunity 10, 127–136. 14. Parnet, P., Garka, K. E., Bonnert, T. P., Dower, S. K., and Sims, J. E. (1996), J. Biol. Chem. 271, 3967–3970. 15. Silvestre, J. S., Mallat Z., Duriez M., Tamarat R., Bureau M. F., Scherman D., Duverger N., Branellec D., Tedgui A., Levy B. I. 2000. Antiangiogenic effect of interleukin–10 in ischemia-induced angiogenesis in mice hindlimb. Circ. Res. 87: 448–452. 16. Silvestre, J. S., Mallat Z., Tamarat R., Duriez M., Tedgui A and Levy BI. 2001. Regulation of Matrix Metalloproteinase activity in ischemic tissue by interleukin–10: Role in ischemia-induced angiogenesis. Circ. Res. 89: 259–264. 17. Takahashi, T., Kalka, C., Masuda, H., Chen, D., Silver, M., Kearney, M., Magner, M., Isner, J. M., Asahara, T. 1999. Ischemia-and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat. Med. 5: 434–438. 18. Torigoe, K., Ushio, S., Okura, T., Kobayashi, S., Taniai, M., Kunikate, T., Murakami, T., Sanou, O., Kojima, H., Fuji, M., Ohta, T., Ikeda, M., Ikegami, H. & Kurimoto, M. (1997) J. Biol. Chem. 272, 25 737–25 742. 19. Tomizuka et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722–727 (2000) 20. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J. Y., Dayer, J. M., and Zubler, R. H., 1992, J. Immunol. 148, 2778–2784. 21. Yoshimoto T., Takeda, K., Tanaka, T., Ohkusu, K., Kashiwamura, S., Okamura, H., Akira, S. and Nakanishi, K. (1998). J. Immunol. 161, 3400–3407.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

55

1. IL–18-inhibitor alkalmazása végtagok periferiális vaszkuláris betegségének kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló gyógyszer elõállítására, ahol az IL–18inhibitor a következõk közül választott: kaszpáz¹1 (ICE)

60 15

2

inhibitora, IL–18 elleni antitest, az IL–18-receptorok bármely alegysége elleni antitest, és IL–18-kötõ fehérje vagy az IL–18-kötõ fehérje IL–18 biológiai aktivitását gátló izoformája, muteine, fuzionált fehérjéje vagy és funkcionális származéka, ahol a mutein egy vagy több konzervatív aminosavszubsztitúciót tartalmaz, a fuzionált fehérje immunglobulin-fúziót tartalmaz, és a funkcionális származék PEGilezve van. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a periferiális vaszkuláris betegség periferiális arteriális betegség. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a periferiális vaszkuláris betegség az alsó végtagok periferiális vaszkuláris betegsége. 4. Bármely korábbi igénypont szerinti alkalmazás, ahol a végtagok periferiális vaszkuláris betegségéhez sántítás társul. 5. Bármely korábbi igénypont szerinti alkalmazás, ahol a periferiális vaszkuláris betegség Buerger-féle betegség (Thromboangitis Obliterans). 6. Bármely korábbi igénypont szerinti alkalmazás, ahol a periferiális vaszkuláris betegség periferiális ischaemia. 7. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a periferiális ischaemia kritikus végtagischaemia. 8. Bármely korábbi igénypont szerinti alkalmazás, ahol a végtagok periferiális vaszkuláris betegségéhez gangréna és/vagy fekély társul. 9. Bármely korábbi igénypont szerinti alkalmazás, ahol a végtagok periferiális vaszkuláris betegségéhez végtag-amputáció társul. 10. Bármely korábbi igénypont szerinti alkalmazás, ahol az IL–18-inhibitor IL–18 elleni antitest. 11. Bármely korábbi igénypont szerinti alkalmazás, ahol az IL–18-inhibitor a IL–18-receptor elleni antitest. 12. Bármely korábbi igénypont szerinti alkalmazás, ahol az IL–18-inhibitor b IL–18-receptor elleni antitest. 13. A 10–12. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az IL–18-antitest humanizált vagy humán antitest. 14. Bármely korábbi igénypont szerinti alkalmazás, ahol az IL–18-inhibitor egy vagy több helyen glikozilált. 15. IL–18-inhibitor kódolószekvenciáját tartalmazó expressziós vektor alkalmazása végtagok periferiális vaszkuláris betegségének kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló gyógyszer elõállítására, ahol az IL–18inhibitor a következõk közül választott: IL–18 elleni antitest, az IL–18-receptorok bármely alegysége elleni antitest, és IL–18-kötõ fehérje vagy az IL–18-kötõ fehérje IL–18 biológiai aktivitását gátló izoformája, muteine, fuzionált fehérjéje vagy és funkcionális származéka, ahol a mutein egy vagy több konzervatív aminosavszubsztitúciót tartalmaz, a fuzionált fehérje immunglobulin-fúziót tartalmaz. 16. IL–18-inhibitornak sejtben történõ endogén termelését indukáló és/vagy elõsegítõ expressziós vektor alkalmazása végtagok periferiális vaszkuláris betegsé-

1

HU 004 493 T2

gének kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló gyógyszer elõállítására, ahol az IL–18-inhibitor a következõk közül választott: IL–18 elleni antitest, az IL–18-receptorok bármely alegysége elleni antitest, és IL–18-kötõ fehérje vagy az IL–18-kötõ fehérje

5

16

2

IL–18 biológiai aktivitását gátló izoformája, muteine, fuzionált fehérjéje vagy és funkcionális származéka, ahol a mutein egy vagy több konzervatív aminosavszubsztitúciót tartalmaz, a fuzionált fehérje immunglobulin-fúziót tartalmaz.

HU 004 493 T2 Int. Cl.: A61P 9/10

17

HU 004 493 T2 Int. Cl.: A61P 9/10

18

HU 004 493 T2 Int. Cl.: A61P 9/10

19

HU 004 493 T2 Int. Cl.: A61P 9/10

20

HU 004 493 T2 Int. Cl.: A61P 9/10

21

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest