Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
PROPAGASI VIRUS INFECTIOUS LARYNGO TRACHEITIS (ILT) PADA JARINGAN SELAPIS CHICKEN EMBRYO FIBROBLAST (CEF) MASITOH DAN HANIFAH ARIYANI Balai Penelitian Veteriner, X. RE. Martadinata 30 PO. Box 151, Bogor
RINGKASAN
Perbanyakkan (Propagasi) virus telah berhasil dilakukan pada jaringan selapis Chicken Embryo Fibroblast (CEF) umur I hari yang menimbulkan efek sitopatik (CPE) . Dengan adanya CPE, bukan saja pertumbuhan virus akan sangat mudah untuk diamati, juga kandungan virus ILT secara kuantitatip akan mudah untuk dihitung. Jaringan selapis CEF telah banyak digunakan, diantaranya untuk perbanyakan virus unggas dan titrasi virus . Dalam kajian ini telah berhasil ditumbuhkembangkan virus ILT asal isolat lokal dengan kode BGR-6 yang kemudian dilakukan titrasi virus . Propagasi virus ILT pada jaringan selapis CEF menunjukkan hasil bahwa virus ILT dapat menimbulkan CPE setelah 3 hari paska Infeksi (3 dpi) dan CPE dapat mencapai 80% setelah 5 hari paska Infeksi (5 dpi) . Selanjutnya, titrasi virus pada jaringan selapis CEF menunjukkan bahwa titer virus ILT mencapai 10 60 TCID 50/0,1 mL atau 10"' TCID 50/mL . Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa virus ILT dapat ditumbuhkan padajaringan selapis CEF umur I hari dan menghasilkan titer virus ILT yang cukup tinggi . Kata Kunci : ILT, TCID 50 , Titrasi, CEF, CPE . PENDAHULUAN Infectious laryngotracheitis (ILT) merupakan penyakit pernapasan yang bersipat akut dan sangat menular pada unggas (HANSON DAN BAGUST, 1991 ) disebabkan oleh Gallid herpevirus-I (BAGUST et al., 1997), yang termasuk famili sub famili Herpesviridae dan Alphaherpesvirinae (BAGUST et al., 2000). Serangan penyakit ini dapat menyebabkan gangguan pernapasan berat yang disertai muntah darah, penurunan berat badan, penurunan produksi telur dan bahkan dapat menyebabkan kematian (HUGHES et al., Virus ini mengandung 1987) . Dioxyribonucleid Acid (DNA) berutas ganda, berbentuk Ikosahedral mempunyai Envelope dengan ukuran 195-250 nm dan hanya memiliki satu serotipe . Nucleocapsid dari Gallid herpesvirus berdiameter 80- 100 nm yang disusun oleh 162 capsomer (BAGUST et al ., 1997) . Salah satu cara dalam penanggulangan penyebaran penyakit ILT yaitu dengan melakukan program vaksinasi terutama dilakukan pada daerah sekitar tempat terjadinya kasus penyakit ILT . Hal tersebut mengingat vaksin ILT merupakan vaksin yang aktif, sehingga pemakaiannya harus hari-hari karena dapat menyebabkan
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
virus ILT akan kembali (reverse) ke sifat yaitu virulent yang dapat asalnya membahayakan bagi kelangsungan hidup unggas . Hingga sangat ini, vaksin ILT masih diimpor dari luar negeri, maka upaya isolasi dan penumbuhkembangan isolat lokal virus ILT sangat diperlukan . Virus ILT dapat ditumbuhkan pads jaringan embryo ayam tertunas seperti Chicken Embryo Liver (CeLi) (HUGHES AND JONES, 1988), Chicken Embryo 1980), Kidney (CEK) (CHANG et al., Chicken Kidney (CK) (VAN KAMEN AND SPADBROW, 1976), Chicken Embryo Fibroblast (CEF) (01B, 1998) dan Chorio Allantoic Membrane (CAM) telur ayam berembryo umur 10-12 hari (JORDAN, 1980 ; SAEPULLOH, 2004) . Infeksi virus ILT pads CeLi, CEK, CK dan CEF akan menimbulkan CPE pads kultur jaringan tersebut yang biasanya terjadi setelah 2 - 3 hari paska Infeksi . Sedangkan Infeksi virus ILT pads CAM akan memperlihatkan lesi berwarna putih berupa pocks yang kekuning-kuningan di sekitar membran allantois (SAEPULLOH AND ROVIRA, 2003 ; SAEPULLOH, 2004) . Diantara ke empat kultur jaringan asal embryo ayam tertunas tersebut, maka sel CeLi merupakan yang paling sensitif untuk propagasi virus ILT (HUGHES AND JONES, 1988) . Sedangkan
147
Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
untuk menghasilkan titer yang tinggi, maka virus ILT paling baik ditumbuhkan pada CAM dari telur embryo ayam tertunas (JORDAN, 1980), misalnya untuk tujuan pembuatan antigen dalam uji agar gel immunodifussion (AGID) . Untuk menjaga punahnya sumber daya genetik (Genetic resources), maka pemeliharaan mikroorganisma salah satunya adalah virus, mutlak sangat diperlukan . Untuk hal tersebut, diperlukan suatu teknik untuk pemeliharaan virus yang sudah baku sesuai standard OIE . Oleh karena itu, dalam tulisan ini akan dibahas cara menumbuhkan virus ILT (BGR-6) asal isolat lokal yang sebelumnya telah berhasil diisolasi dari Peternakan ayam petelur di Kabupaten Bogor (SAEPULLOH dkk ., 2003) dan telah diuji sifat patogenitas serta immunogenitasnya (INDRIANI dkk ., 2004) . Selanjutnya, untuk mengetahui kandungan virus ILT tersebut, maka dilakukan titrasi dengan menggunakan CEF dimana titer virus ILT dihitung berdasarkan metoda SpearmanKarber (BRIAN AND KANGRO, 1996) .
Propagasi virus
Isolat lokal virus ILT yang digunakan dalam propagasi ini adalah virus ILT kode BGR-6 asal isolat lokal yang diperoleh dari peternakan ayam petelur di daerah Kabupaten Bogor pada tahun 2000 .
Media lama pada pada jaringan selapis CEF yang ditumbuhkan pada flask (25 cm) dibuang, kemudian jaringan selapis CEF tersebut dicuci dengan larutan penyangga Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,2 sebanyak 1-2 kali secara perlahanlahan . Jaringan selapis CEF diinokulasi dengan virus ILT (BGR-6) isolat lokal sebanyak 1 ml . Selanjutnya diabsorbsi pada suhu 370C selama %2-1 jam . Kemudian ditambahkan kedalam flask media Jaringan pemelihara sebanyak 20 ml . selapis yang telah diinokulasi disimpan di inkubator suhu 370 C dengan kandungan CO Z 5%. Pengamatan dilakukan setiap hari hingga mencapai 5 hari dan dilihat perubahan yang terjadi pada jaringan selapis CEF berupa efek sitopatik (CPE) . Jaringan dipanen apabila telah selapis CEF menunjukkan tingkat infeksi mencapai kurang lebih 80% dan ini terjadi setelah 4-5 hari paska infeksi (5 dpi) . Selanjutnya media (supernatant) yang mengandung virus ILT diambil dan dimasukkan kedalam tabung sentrifuge 50 ml . Akhirnya, supernatan disentrifugasi pada 1500 rpm suhu 4°C selama 20 menit untuk menghilangkan jaringan yang mati (debris) . Supernatan diambil dan dipindahkan (aliguote) ke dalam ampul (1,5 ml) serta diberi kode, kemudian disimpan pada suhu -700C untuk Selanjutnya virus tersebut dititrasi dengan menggunakan jaringan selapis jaringan CEF .
Kultur jaringan
Titrasi virus
MATERI DAN METODA Isolat lokal virus ILT
Kultur jaringan yang digunakan adalah jaringan selapis Chiken Embryo Fibroblast (CEF) yang berasal dari embryo telur ayam yang bebas kuman (SPF) umur 10 hari yang diperoleh secara komersial . Media Penumbuh dan Pemelihara Media penumbuh yaitu Dulbeco Modified Eagle Medium, DMEM (GIBCO BRL) yang dilengkapi dengan 10% Foetal Bovine serum (Hyclone Lab .), Penisilin 200 IU/ml (GIBCO), Streptomisin 200 µg/ml (GIBCO), dan Fungison 50 pg/ml (GIBCO) . Sedangkan untuk media pemelihara yaitu media DMEM yang dilengkapi dengan 5% FBS serta antibiotik dan fungsison seperti di alas .
1 48
Virus ILT diencerkan dengan kelipatan 10 yaitu mulai dari 10" sampai dengan 10-8 dengan cara mencampur virus stok 1 bagian dengan 9 bagian media pemelihara serta ditambahkan Penisilin 200 IU/ ml dan Streptomisin 200 gg/ml . Sebanyak 0,1 mL dari masing-masing enceran virus dimasukkan ke dalam jaringan selapis CEF dalam mikroplate 24 lubang (Corning) yang sebelumnya telah dicuci dengan laurtan penyangga PBS pH 7,2 . Setiap enceran virus diinokulasi ke dalam 4 lubang (4 kali ulangan) . Kemudian, Virus diabsropsi pada inkubator suhu 37°C selam ''/a sampai 1 jam . Kedalam setiap lubang ditambahkan media pemelihara
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
sebanyak 1 mL . Akhirnya virus dalam mikroplate 24 lubang diinkubasikan di inkubator suhu 37°C selama 6 hari dan diamati setiap hari terhadap adanya perubahan efek sitopatik (CPE) . Setiap adanya perubahan dicatat sampai hari ke-6, dan kemudian titer virus dihitung sebagai 50% Tissue Culture Infected Dose (TCIDso) berdasarkan metoda Spearman-Karber (BRIAN AND KANGRO, 1996) dengan rumus sebagai berikut :
TCID5o = X + '/z d X + 0.5
d E ri
atau
n E ri
sehingga menghasilkan mis-interpretasi . Sementara itu, pada jaringan selapis CEF yang hanya diinokulasi dengan media (sebagai kontrol) tidak satupun yang menunjukkan infeksi virus ILT, artinya bahwa jaringan CEF tersebut tidak terkontaminasi oleh virus atau media itu sendiri . Pada Gambar 1 ditampilkan jaringan selapis CEF yang tidak diinfeksi oleh virus ILT . Tampak pada jaringan CEF tersebut masih utuh dan bahkan sampai hari ke-6 . Sedangkan pada Gambar 2 menunjukkan CPE yang terjadi pada jaringan CEF setelah 5 hari paska infeksi . Tabel1 .
n dimana : X = Pengenceran tertinggi yang diuji d = log factor pengenceran (dalam hal ini 10) dE ri = Total yang tidak terinfeksi n = jumlah sel yang digunakan pada masing-masing enceran (tetap)
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil propagasi virus ILT pada jaringan selapis CEF ditampilkan pada Tabel 1, Gambar 1 dan Gambar 2 . Pada Tabel 1, CPE tampak setelah 2 hari paska infeksi yang menghasilkan sekitar 10% . Timbulnya CPE pada jaringan selapis CEF sejalan dengan lamanya inkubasi virus tersebut, yaitu semakin lama inkubasi maka semakin banyak persentase CPE yang timbul . Dari tabel tersebut terlihat bahwa pada hari ke-6 paska infeksi semua CEF terinfeksi sehingga tidak satupun jaringan yang tampak hidup . Untuk bahan titrasi, maka sebaiknya pada hari ke-5 paska infeksi yaitu setelah CPE menunjukkan sekitar 80%,' virus harus segera dipanen . Hal tersebut dikarenakan, apabila CPE telah mencapai 100%, maka dikhawatirkan akan menimbulkan toksisitas . Bila suspensi virus telah bercampur dengan toksik yang berasal dari jaringan, maka akan mengganggu pengamatan pada saat titrasi, karena akan sangat sulit membedakan antara jaringan CEF yang terinfeksi oleh virus dengan jaringan yang mati karena toksik,
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
Observasi efek sitopatik (CPE) pada jaringan selapis CEF selama 6 hari paska Infeksi virus ILT isolat lokal . Persetase efek sitopatik (CPE) setelah infeksi virus ILT hari ke-
Inokulum
1 Virus
0
0
Media (kontrol)
0
0
2 01
3 0
4 4 0
0
0
0
6 8 0
100
0
0
Gambar 1 . Jaringan selapis CEF tanpa diinokulasi dengan virus ILT (Normal) . Sementara itu, hasil titrasi virus ILT ditampilkan pada Tabel 2 . Pada tabel tersebut tampak bahwa pada enceran virus 10-5 semua CEF pada keempat lubang terinfeksi semua (4/4), dan pengenceran
149
Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
tertinggi yang masih dapat menimbulkan CPE yaitu terjadi pada enceran virus 10 -6 yang hanya terinfeksi 2 lubang saja (2/4) . Bila dihitung dengan menggunakan metoda Spearman-Karber, maka titer virus tersebut adalah 10 6' 0 TCID 50 /0,1 mL atau 10 70 TCID 50 /mL . Hasil titer virus ILT tersebut cukup tinggi, sehingga virus tersebut dapat digunakan sebagai antigen dalam uji Serum Netralisasi yang hanya menggunakan konsentrasi virus 100 TCID 50 /0,1 mL . Selain itu, dengan titer 10''0 TCID 50/mL, virus ILT dapat digunakan sebagai antigen dalam uji serologik dengan metoda Agar Gel Immunodifussion (AGID) . Perhitungan titer virus dengan menggunakan metoda Spearman-Karber diperoleh hasil yang akurat sebagaimana metoda Reed and Muench (1938) .
Gambar 2 .
Jaringan selapis CEF yang terinfeksi virus ILT isolat lokal (BGR-6) Selelah 5 hari paska infeksi (5 dpi) . Tampak jaringan CEF mengecil dan mati . Sedangkan di bagian lain tampak jaringan telah habis
Titrasi virus di alas sangat penting dilakukan untuk mengetahui kandungan virus . Hat tersebut mengingat titer virus akan turun setelah disimpan lama pada 20°C, sehingga secara periodik perlu di periksa kembali titer virusnya Seandainya virus tersebut turun mendekati titer 10 2 .0 TCID 50 /0,1 mL, maka virus tersebut perlu dipropagasi kembali agar kandungan
1 50
I
virusnya meningkat . Balai Penelitian Veteriner sebagai Laboratorium Rujukan secara Nasional berkewajiban dan sudah merupakan suatu pekeriaan rutin untuk menjaga plasma nutfah dalam hal ini virus tetap stabil dan siap untuk digunakan sebagai bahan diagnostik bilamana sewaktuwaktu diperlukan. Dalam pengerjaan propagasi virus ILT pada jaringan selapis CEF ada beberapa hal yang harus diperhatikan, yaitu : 1) Kontaminasi . Faktor ini seringkali terjadi pada saat inokulasi virus. Oleh karenanya, gunakan selalu peralatan seperti tip, botol media, media yang telah diyakini steril . Media seperti media penumbuh dan media pemelihara harus terlebih dahulu diuji sterilitasnya dalam media Thioglycolate . Jika setelah 4-7 hari media tersebut tidak terkontaminasi, maka media penumbuh clan media pemelihara dapat digunakan untuk propagasi virus ; 2) Pengaturan pH media . Setelah 2-3 hari paska infeksi, biasanya media jaringan CEF seringkali berubah menjadi asam yang ditandai dengan warna medium kekuning-kuningan . Oleh karenanya, perlu peningkatan pH medium dengan penambahan Sodium bicarbonat 7% sebanyak 1-2 tetes per lubang . Dalam pengeriaan titrasi virus ILT, maka yang perlu diperhatikan adalah pada saat pengenceran virus . Dalam mengencerkan virus harus benar-benar homogen dari satu enceran ke enceran lain . Hal ini dikarenakan apabila pengenceran virus belum homogen, akan dihasilkan titer virus lebih tinggi dari titer yang sebenarnya . Selain itu, untuk ketelitian suatu pengujian, maka dalam titrasi virus harus menggunakan minimal 4 ulangan per enceran virus . KESIMPULAN DAN SARAN Berdasarkan uraian di atas, maka virus ILT isolat lokal (BGR-6) dapat beradaptasi dengan baik pada jaringan selapis CEF dengan hasil titer virus yang cukup tinggi yaitu 10" 0 TCID50/mL . Hasil propagasi virus ILT membuktikan bahwa untuk memelihara clan sekaligus melestarikan virus ILT, maka jaringan selapis CEF dapat digunakan dan sangat mudah untuk mengamati pertumbuhan virus
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
ILT dengan melihat adanya efek sitopatik (CPE) pada jaringan CEF tersebut . Dalam pengerjaan propagasi dan titrasi virus ILT perlu diperhatikan faktor penyebab kontaminasi . Untuk mencegah tersebut maka terjadinya kontaminasi perlu penggunaan alat yang steril diperhatikan, bekerja selalu di dalam laminar air flow, dan media penumbuh serta pemelihara harus diuji sterilitasnya terlebih dahulu sebelum digunakan . UCAPAN TERIMAKASIH Penulis mengucapkan terimakasih kepada Bapak Muharam Saepulloh S .Si ., M .Sc atas bimbingannya kepada penulis dalam propagasi dan titrasi virus ILT isolat lokal (BGR-6) . DAFTAR BACAAN 1997 . BAGUST, T .J . AND J .S . GUY . Laryngotracheitis. In : Diasease of edition . B .W . Poultry . 10`h CALNECK, H .J . BARNES, BEARD L .R. Mc DOUGLAS and C .W ., Y .M . SAIR (eds) . Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA . Pp . 527-539 BAGUST, T.J ., R .C . JONES AND J .S . GUY . 2000 . Avian infectious laryngotracheitis. Rev . Sci. Technol. Int. Epiz. 19 :483-492 BRIAN W .J ., AND H .O . KANGRO . 1996 . Virology methods manual . Academic Press, Inc ., San Diego, California . CHANG P .W ., YATES V .J ., DARDIRI A .H ., FRY D .E . 1980 . Some and observations of the propagation of infectious laryngotracheitis virus in tissue culture . Avian Dis ., 25, 484490 . HANSON, L .E . and T .J . BAGUST . 1991 . Larynotracheitis . In : Disease of B . W. Poultry. 9` h editions. Iowa State CALNECK (Eds) . University Press, Ames, USA .pp . 485-495
field material . Avian Pathol ., 17, 295303 . HUGHES, C .S ., R .C . JONES, R .M . GASKELL, F .T.W . JORDAN AND J .M . BRADBURY, 1987 . Demonstration in live chickens of the carrier state in laryngotracheitis virus infectious from latency infected carrier birds . Res. Vet. Sci . 42 :407-410 INDRIANI, R ., H . HAMID, RMA . ADJID, dan M . SAEPULLOH . 2004 . Uji patogenisitas dan immnogenisitas infectious isolat lapng virus laryngotracheitis . JITV, 9(2) : 122-127 Diagnosis of JORDAN F .T.W . 1980 . infectious laryngotracheitis by chick embryo inoculation . J. Comp. Path. 74 :119-128 OIE,
Avian infectious 1996 . laryngotracheitis . In : Manual of Standard for Diagnostic Tests and Vaccines . Third Editions . Paris, France . Pp . 549-554
SAEPULLOH, M ., AND H .G . ROVIRA . 2003 . Isolation and identification of infectious laryngotracheitis virus from outbreaks at Lipa City, Batangas, the Philippines . JIM 8(2) :122-133 Molecular SAEPULLOH, M. 2004 . of infectious characterization laryngotracheitis virus (ILTV) isolates from outbreaks cases at Lipa the City, Batangas Province, Philippines. JITV, 9(1) : 26-36 SAEPULLOH, M ., H . HAMID, DAN DARMINTO. 2003 . Isolasi dan identifikasi isolat virus infectious lapang laryngotracheitis . Pros . Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner . Bogor, 29-30 September 2003 . Puslitbang Peternakan, Bogor. HIm .424-430 VAN KAMMEN A AND SPADBROW P .B ., 1976 . Rapid diagnosis of some avian virus diseases . Avian Dis., 20 : 748751
HUGHES C .S ., and JONES R .C ., 1988 . Comparison of methods of isolation of infectious laryngotracheitis from
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
151
