UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra Organické chemie Katedra biofyziky
DIPLOMOVÁ PRÁCE Studium interakce DNA s novým bifunkčním, protinádorově účinným komplexem platiny obsahujícím neplanární bicyklický a alifatický ligand.
Autor:
Martin Mozolík, Bc.
Studijní program:
N1407 – Chemie
Studijní obor:
Bioorganická chemie
Typ studia:
Prezenční
Vedoucí práce:
Prof. RNDr. Jana Kašpárková, Ph.D.
Konzultant práce:
Mgr. Adam Šimáček
Termín a místo odevzdání práce:
2. 5. 2013, Olomouc
1
Rád bych poděkoval své školitelce Prof. RNDr. Janě Kašpárkové, Ph.D. za smysluplné a efektivní vedení, mnoţství cenných rad a za trpělivost, kterou mi věnovala a které mě naučila. Taky bych ji chtěl poděkovat za to, ţe mi ukázala, ţe selský rozum je mnohokrát účinnější neţ ty nejlepší vzorce, poučky a pravidla. Dále bych chtěl poděkovat Mgr. Jitce Prachařové a Mgr. Tereze Muchové za pomoc a cenné rady při experimentech.
2
Já, Martin Mozolík, prohlašuji, ţe jsem tuto diplomovou práci vypracoval samostatně pod odborným dohledem Prof. RNDr. Jany Kašpárkové, Ph.D. a veškerou pouţitou literaturu jsem uvedl na konci práce. Souhlasím s tím, aby má práce byla zpřístupněna v knihovně Katedry organické chemie a v knihovně Katedry biofyziky, Přírodovědecké fakulty, Univerzity Palackého v Olomouci.
V Olomouci dne 26. 4. 2013
.................................
3
Bibliografická identifikace:
Jméno a příjmení autora:
Martin Mozolík, Bc.
Název práce:
Studium bifunkčním, komplexem
DNA
s novým
protinádorově
účinným
interakce platiny
obsahujícím
neplanární bicyklický a alifatický ligand. Typ práce:
Diplomová
Pracoviště:
Katedra
biofyziky,
Přírodovědecká
fakulta, Univerzita Palackého Olomouc Vedoucí práce:
Prof. RNDr. Jana Kašpárková, Ph.D.
Rok obhajoby práce:
2013
Abstrakt: Zvyšující se incidence nádorových onemocnění pohání výzkum nových látek a testování jejich vlastností jako potenciální protinádorová léčiva. Cytostatické komplexy platiny se osvědčily jako účinná chemoterapeutika, ale poměrně rychlý vývoj rezistence a mnoho neţádoucích účinků tlačí na vývoj efektivnějších léčiv z této kategorie. Byl proto vyvinut nový druh konjugátů platinového komplexu s inhibitorem histonových deacetyláz, které mají potenciál stát se léčivy další generace. Pro další pokrok je ale potřeba změřit jejich DNAvazebné schopnosti a popsat strukturní změny dvoušroubovice pomocí fyzikálních a chemických metod.
Klíčová slova:
platina, komplex, DNA, vazba, inhibitor histonové deacetylázy
Počet stran:
73
Jazyk:
Čeština
4
Bibliographical identification:
Author’s first name and surname:
Martin Mozolík, Bc.
Title:
Studies of DNA interactions with a new bifunctinal anticancer platinum complex containing
nonplanar
bicyclic
and
aliphatic ligands. Type of thesis:
Diploma
Department:
Department of biophysics, Faculty of science, Palacky University Olomouc, Czech Republic
Supervisor:
Prof. RNDr. Jana Kašpárková, Ph.D.
The year of presentation:
2013
Abstract: Progressive incidence of neoplastic diseases urges the research of new compounds along with testing of their qualities as potential anticancer drugs. Cytostatic platinum complexes have been approved as potent chemotherapeutics, but cellular resistance and a lot of adverse effects push the development of more effective therapeutics from this category. New kind of platinum complex with histone deacetylase inhibitor conjugates were developed, able to become a next generation medicaments. For further advancement in research, measurement of DNA binding properties and description of structural changes on helix are needed to be done by physical and chemical methods.
Keywords:
platinum,
complex,
DNA,
binding,
histone deacetylase inhibitor Number of pages:
73
Language:
Czech
5
OBSAH
1. SEZNAM ZKRATEK ........................................................................................................................... 8 2. ÚVOD .................................................................................................................................................. 9 3. TEORETICKÁ ČÁST ........................................................................................................................ 10 3.1. PROTINÁDOROVĚ ÚČINNÉ KOMPLEXY PLATINY ................................................................................ 10 3.2. MECHANISMUS CYTOSTATICKÉHO ÚČINKU PLATINOVÝCH KOMPLEXŮ ................................................ 11 3.2.1 Cílové místo působení platinových cytostatik ...................................................................... 11 3.2.2 Princip vazby platinových komplexů na DNA ....................................................................... 12 3.2.3 Změny struktury DNA způsobené adukty platinových komplexů ......................................... 14 3.2.4 Vznik buněčné rezistence na komplexy platiny .................................................................... 17 3.3. REAKCE BUŇKY NA CYTOSTATICKÉ KOMPLEXY PLATINY ................................................................... 18 3.3.1 High Mobility Group proteiny ................................................................................................ 18 3.3.2 Nukleotidová excizní oprava ................................................................................................ 20 3.3.3 Mechanizmus buněčné smrti vyvolán platinovými komplexy ............................................... 23 3.4. NOVÉ TRENDY VE VÝVOJI PROTINÁDOROVÝCH LÉČIV ZALOŢENÝCH NA KOMPLEXECH PLATINY ............ 24 3.4.1 Současný stav ...................................................................................................................... 24 3.4.2 Deriváty cisplatiny ................................................................................................................ 26 3.4.3 Deriváty Transplatiny ............................................................................................................ 27 3.4.4 Polynukleární komplexy platiny ............................................................................................ 28 3.5. HISTONOVÉ DEACETYLÁZY A JEJICH FUNKCE .................................................................................. 30 3.5.1 Inhibitory histonových deacetyláz a možnosti jejich použití v protinádorové terapii ............ 31 4. CÍL PRÁCE ....................................................................................................................................... 33 5. MATERIÁL A METODY .................................................................................................................... 34 5.1. POUŢITÉ CHEMIKÁLIE .................................................................................................................... 34 5.2. POUŢITÉ ROZTOKY A PUFRY........................................................................................................... 35 5.2.1 Roztoky cis-diammindichloroplatiny a NBA-OH-VPA........................................................... 35 5.2.2 Elektrolyt pro diferenční pulzní polarografii (DPP) ............................................................... 35
6
5.2.3 Roztoky pro neutrální gelovou elektroforézu ........................................................................ 35 5.2.4 Roztoky pro alkalickou denaturační elektroforézu ............................................................... 36 5.2.5 Elektroforetické gely ............................................................................................................. 37 5.2.6 Barvící roztok pro elektroforetické gely ................................................................................ 37 5.2.7 Roztok pro měření fluorescence ethidium bromidu.............................................................. 37 5.3. METODY ....................................................................................................................................... 38 5.3.1 Modifikace DNA komplexy platiny ........................................................................................ 38 5.3.2 Dialýza .................................................................................................................................. 38 5.3.3 Stanovení vazby komplexů platiny k DNA ........................................................................... 39 5.3.4 Elektroforéza v nativním agarózovém gelu .......................................................................... 39 5.3.5 Elektroforéza v alkalickém denaturačním agarózovém gelu ................................................ 39 5.3.6 Linearizace plazmidové DNA ............................................................................................... 40 5.3.7 Deproteinace a přesrážení plazmidové DNA ....................................................................... 40 5.3.8 Zjištění množství meziřetězcových můstků .......................................................................... 41 5.3.9 Reakce s thiomočovinou ...................................................................................................... 41 5.3.10 Rozvíjení plazmidové DNA ................................................................................................. 42 5.3.11 Zhášení fluorescence ethidium bromidu ............................................................................ 43 5.3.12 Měření teploty tání .............................................................................................................. 43 6. VÝSLEDKY ....................................................................................................................................... 44 6.1. VAZBA KOMPLEXU NA TELECÍ THYMOVOU DNA ............................................................................... 44 6.2. MEZIŘETĚZCOVÉ MŮSTKY .............................................................................................................. 48 6.3. REAKCE S THIOMOČOVINOU........................................................................................................... 50 6.4. ROZVÍJENÍ PLAZMIDOVÉ DNA ........................................................................................................ 52 6.5. ZHÁŠENÍ FLUORESCENCE ETHIDIUM BROMIDU ................................................................................. 54 6.6. ANALÝZA KŘIVEK TÁNÍ ................................................................................................................... 56 6.7. SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ ...................................................................................................................... 59 7. DISKUZE ........................................................................................................................................... 60 8. ZÁVĚR .............................................................................................................................................. 62 9. ABECEDNÍ SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ............................................................................... 63
7
1. SEZNAM ZKRATEK
AAS – atomová absorpční spektroskope ATP – adenozíntrifosfát Cisplatina – cis-diammindichloroplatnatý komplex DNA – deoxyribonukleová kyselina DPP – diferenční pulzní polarografie E. coli – Escherichia coli EC číslo – číslo klasifikující enzymy (Enzyme Commision number) EDTA – kyselina ethylendiamintetraoctová GSH – glutathion HDAC – histonové deacetylázy HMG – třída proteinů (high mobility group) IAC – vnitrořetězcový můstek (intrastrand crosslink) IEC – meziřetězcový můstek (interstrand crosslink) NAD+ – nikotínamidadeníndinukleotid NER – nukleotidová excizní oprava (nucleotide excision repair) Pb – pár bází rb – mnoţství platinového komplexu navázaného na DNA (bound) ri – molekulární poměr volného komplexu platiny k počtu nukleotidů DNA (initial) RNA – ribonukleová kyselina Tm – teplota tání (melting temperature) Transplatina – trans-diammindichloroplatnatý komplex tt-DNA – telecí thymová deoxyribonukleová kyselina UV – ultrafialové záření VIS – oblast viditelného světla v elektromagnetickém spektru 8
2. ÚVOD
Nádorová onemocnění jsou stále častější příčinou úmrtnosti. Příčiny spočívají jednak v narůstající incidenci, jednak v pozdějším záchytu příznaků nádorových onemocnění. Podstatou nádorového bujení je porušení rovnováhy mezi přírůstkem nových buněk dělením a úbytkem starých buněk buněčnou smrtí. Tato nerovnováha můţe být způsobena fyzikálními, chemickými nebo biologickými činiteli, jako jsou například ionizující záření, karcinogeny
nebo
chromozomové
zlomy.
Vzhledem
na
vzrůstající
výskyt
tohoto
onemocnění, stoupá snaha o nalezení účinné a zároveň šetrné a levné léčby. Současné léčebné postupy kladou důraz na konkrétní typ nádorového onemocnění a aplikují kombinovanou a personalizovanou medicínu. Samotná léčba se skládá z chirurgie, radioterapie a chemoterapie. Chirurgické vyjmutí nádoru je nejlepším řešením, ačkoli málokdy pouţitelným z důvodů velikosti, umístění či výskytu metastáz. Kombinace radioterapie a chemoterapie je proto nejčastější forma léčby, kdy se přesně cílený svazek ionizujícího záření kombinuje s protinádorovými léky. V poslední době se začíná vyuţívat i biologická léčba nádorových onemocnění, která k odstranění nádorů vyuţívá prvky a procesy imunitního systému zasaţeného organismu. Mezi nejvýznamnější protinádorová léčiva patří i komplexy platiny. Jiţ od objevu cytostatických účinků prvního z nich v roce 1965, cis-[Pt(NH3)2(Cl)2] známého pod jménem cisplatina, se tato oblast chemie mohutně rozvíjí. Komplexy platiny zastavují buněčné dělení narušením struktury α-helixu DNA pomocí kovalentní vazby na nukleotidy, preferenčně guanin. Těmito kovalentními vazbami v jednom nebo mezi dvěma vlákny DNA je moţno docílit buněčnou smrt skrz aktivaci DNA-reparačních mechanismů buňky. Cisplatina je dodnes základní kámen chemoterapii v léčbě mnohých nádorů, ačkoli má mnoho závaţných neţádoucích účinků a často dochází k relapsu rezistentního nádoru. Nejen výše uvedené důvody motivují vědce k snaze vyvinout komplexy platiny s lepšími farmakologickými a toxikologickými vlastnostmi. Na účinnost sloučenin mají zásadní vliv obměny anorganických i organických ligandů či změna koordinačního čísla. Neţ se však látka dostane do klinického zkoušení, je potřeba dokázat, ţe konkrétní látka je skutečně účinnější a bezpečnější neţ její předchůdci.
9
3. TEORETICKÁ ČÁST
3.1. Protinádorově účinné komplexy platiny
První popsaný komplex platiny s protinádorovými účinky byl cis-diammindichloroplatnatý komplex, cis-[PtCl2(NH3)2], dnes známý pod názvem cisplatina (obr. 1), který byl syntetizován jiţ roku 1844(Peyrone, 1844). Dlouho byl znám pod názvem Peyronova sůl. O jeho cytostatické a protinádorové aktivitě se nevědělo aţ do roku 1965, kdy doktor Barnett Rosenberg se svým týmem z Michiganské Státní University objevili, ţe elektrolýza roztoku chloridu amonného za pouţití platinových elektrod produkovala ve vodě rozpustný platinový komplex, který přesto, ţe potlačoval dělení bakterie Escherichia coli, současně neinhiboval její růst, který pokračoval v podobě vláken aţ do třísetnásobku obvyklé délky této bakterie(Rosenberg
et al.,1965)
. Jako původce tohoto jevu byl označen oktahedrální platinový
komplex cis-[PtCl4(NH3)2], kde měla platina oxidační číslo IV. Později byl objeven komplex s planárním uspořádáním a platinou v oxidačním čísle II, cis-[PtCl2(NH3)2], který byl ještě účinnější v podpoře vláknitého nárůstu E. coli(Rosenberg et al.,1967). O dva roky později bylo zjištěno, ţe druhý jmenovaný komplex (cisplatina) je také vysoce účinný při zmenšování sarkomů u krys(Rosenberg
et al.,1969)
. Potvrzení tohoto objevu a rozšíření
testů na další linie rakovinných buněčných kultur stálo na počátku lékařských aplikací cisplatiny. Cisplatina byla schválena FDA (Food and Drug Administration) jako léčivo na rakovinu vaječníků a varlat v prosinci 1978(Carpenter, 2010) Její stereoisomer transplatina (obr. 1), trans-[PtCl2(NH3)2], nevykazuje podobnou farmakologickou aktivitu(Drobník,
Horáček, 1973)
. Předpokládá se, ţe je to v důsledku rychlé
deaktivace sloučeniny v těle ještě před dosaţením vazebného místa na DNA. Transplatina je i přesto toxická a léčiva s obsahem cisplatiny musí být testována na její přítomnost(Woollins J.D., Woollins A., Rosenberg, 1983)
.
Cisplatina se stala důleţitou součástí chemoterapie a byla indikována na mnohé další typy nádorů, například nádory plic, močového měchýře nebo lymfomů, myelomů a melanomů. Nepřetrţité pouţívání cisplatiny však záhy ukázalo, ţe její pouţití je značně omezeno jak její vysokou toxicitou, projevující se jako závaţné vedlejší účinky, tak poměrně rychlým vznikem rezistence.
10
Obr.1: Strukturní vzorec cisplatiny (vlevo) a Transplatiny (vpravo).
3.2. Mechanismus cytostatického účinku platinových komplexů
3.2.1 Cílové místo působení platinových cytostatik
Při objevu nové biologicky účinné látky, která můţe být pouţita jako léčivo, je potřebné zjistit přesný mechanismus jejího účinku. Bylo experimentálně zjištěno, ţe dominantní cílová struktura pro platinová cytostatika je DNA, na kterou se váţou koordinační vazbou a mění její strukturu tak, ţe danou molekulu DNA jiţ není moţné replikovat buněčným aparátem. Toto poškození můţe být tak značné, ţe i přes všechny opravné mechanismy vede k aktivaci proapoptotických signálních drah a k buněčné smrti(Matsumoto, Tsuchida, Kawamoto, 1997). Experimenty ukázaly, ţe komplexy platiny se váţou i na jiné buněčné struktury neţ DNA, například k proteinům(Robins,
1982)
, membránám(Speelmans
et al., 1996)
a dokonce mohou narušit
(Köpf-Maier, Mühlhausen, 1992)
i cytoskelet buňky
. Byly studovány i efekty platinových komplexů na
rychlost syntézy DNA, RNA či proteinů, které ukázaly, ţe platinové komplexy významně inhibují jenom syntézu DNA(Harder, Rosenberg, 1970). Další studie kvantifikovaly navázané mnoţství platinových komplexů na tyto makromolekuly. Při pouţití cisplatiny byly zjištěny následující poměry: Na jednu molekulu DNA připadalo 22 navázaných atomů platiny, kdeţto 1 atom platiny se navázal na jednu molekulu mRNA, 1 atom na 30 molekul rRNA, 1 atom na 1500 molekul tRNA a 1 atom na 1500 molekul proteinů(Pascoe, Roberts, 1974). Fakt, ţe DNA je skutečně hlavní cílovou molekulou pro platinové komplexy podporuje i studie, kde bylo zjištěno, ţe buňky s mutovanými či deficientními geny pro proteiny zapojené do nukleotidové excisní opravy (NER) byly více citlivé k účinkům platinových komplexů(Beck,
Brubaker, 1973)
. Hlavní
farmakologické interakce cisplatiny s buňkou jsou zobrazeny na obr. 2.
11
Obr. 2: Schéma hlavních farmakologických interakcí cisplatiny s buňkou(Arnesano, Natile, 2009).
3.2.2 Princip vazby platinových komplexů na DNA
Schopnost komplexů platiny způsobit buněčnou smrt je podmíněna vznikem koordinační vazby k bázím v DNA a vytvořením různých typy kovalentních můstků. Například, nejčastěji zkoumaný komplex platiny, cisplatina, se přednostně váţe na DNA můstkem, který spojuje dvě bezprostředně sousedící báze v jednom řetězci DNA, přednostně nukleotidy guaninu(Hemminki, Ludlum, 1984). Cisplatina je neutrální, čtvercově planární koordinační sloučenina platiny, která je v oxidačním čísle II. Má koordinační číslo 4, na centrálním atomu platiny jsou tedy navázány 4 ligandy – dva chlóry a dvě ammino skupiny v cis geometrii. Vazba ammino skupin je velmi silná, kdeţto chlóry jsou snadno odstupující ligandy. Při hydrolýze cisplatiny vzniká velice reaktivní nabitý platinový komplex [Pt(NH3)2ClH2O]+, který dále můţe reagovat s nukleotidy DNA. Následně je i druhý chloridový aniont poměrně rychle nahrazen vodou a ustanoví se dynamická rovnováha mezi hydrolyzovanou a nehydrolyzovanou formou sloučeniny(Trzaska,
2005)
. Tato rovnováha můţe být ovlivněna koncentrací chloridových iontů 12
v roztoku. Podobný proces nastává i u jiných platinových komplexů, které taktéţ obsahují různé stabilní i labilní ligandy, nabité i nenabité. Při hydrolýze jsou ty labilní nabité nahrazeny vodou a vznikají velice reaktivní nabité komplexy, které se dále váţí na nukleotidy v DNA(Coban, Yildiz, Sengul, 2013). Většina platinových komplexů na trhu se aplikuje nitroţilně. V porovnání s buněčným cytosolem je v krvi vysoká koncentrace chloridových aniontů (přibliţně 100mM, v buňce přibliţně 4mM) a proto záporně nabité ligandy hydrolyzují v krvi pomalu. Jakmile platinové komplexy proniknou do buňky, záporně nabité ligandy jsou rychle hydrolyzovány a reaktivita komplexu vzroste. Pro cisplatinu je poločas této reakce dvě hodiny od substituce prvního chloridového aniontu vodou(Johnson,
Hoeschele, Rahn, 1980)
. Molekula vody je také velmi snadno
odstupující ligand. Je moţné říct, ţe platinové komplexy víceméně preferují vazbu na dusík na pozici 7 purinových nukleotidů z důvodu jeho snadné alkylace. Kromě monofunkčních aduktů mohou vznikat i bifunkční, případně polyfunkční adukty, pokud jsou v blízkosti monofunkčního aduktu další vhodná vazebná místa. Tyto místa mohou být na jednom řetězci DNA nebo na vícerých,
rozlišujeme
tedy
můstky
vnitrořetězcové
a meziřetězcové (IEC – interstrand crossing)
(Mattern et al., 1982)
(IAC
–
intrastrand
crossing)
. Četnost výskytu jednotlivých typů
můstků v DNA a jejich vzájemné poměry jsou důleţité charakteristiky kaţdé cytostatické sloučeniny platiny. Pro cisplatinu platí, ţe nejčastěji se vyskytujícím aduktem je kovalentní propojení sousedních guaninů na jednom vlákně DNA: 1,2-d(GG) IAC můstek, kterého četnost je víc neţ 65%. Druhý nejčastější je můstek 1,2-d(AG) IAC, kterého zastoupení je 25%. Dále je v 5-10% pozorován 1,3-d(GG) IAC můstek, tedy propojení dvou guaninů na jednom vlákně DNA ob jednu bázi. Meziřetězcový můstek 5’-d(GC).5’-d(GC) se vyskytuje pouze v 5% všech případů(Eastman,
1983)
. Byly popsány i případy můstků váţící jedno vlákno
(Masters, Köberle, 2003)
DNA a protein nebo glutathion
.
Na reaktivitu, moţnosti tvorby různých můstků v DNA a ostatní vlastnosti platinových komplexů má kromě samotných ligandů vliv i jejich vzájemné postavení, tedy isomerie. Učebnicovým příkladem je porovnání vazebných vlastností cisplatiny a tansplatiny. Transplatina má stejné ligandy jako cisplatina v uspořádání trans. Je klinicky neúčinná a nepouţívá se jako léčivo. Bylo prokázáno, ţe Transplatina reaguje s dusíkem purinů na pozici 7 a s dusíkem cytosinů na pozici 3 a 50 % jejich aduktů je monofunkčních(Ţákovská et al., 1998)
. Vnitrořetězcové můstky jsou vytvářeny hlavně mezi dvěma guaniny nebo mezi
guaninem a cytosinem ob jednu bázi. Meziřetězcové můstky vznikají mezi komplementárními guaniny a cytosiny a tvoří jen 12 % všech aduktů(Brabec, Leng, 1993).
13
3.2.3 Změny struktury DNA způsobené adukty platinových komplexů
Navázání platinových cytostatik na DNA výrazným způsobem mění strukturu DNA a tyto změny byly podrobně studovány fyzikálními i chemickými metodami. K nejvýraznějším konformačním změnám DNA dochází při navázání platinového komplexu na báze co nejblíţe u sebe na jednom vlákně. Vazebné pnutí výrazně vzroste a energeticky znevýhodní mnoho konformací. Molekula DNA se pak snaţí vykompenzovat tento stav, čímţ dochází k její distorzi a jiným změnám konformace. Vzniklá distorze je obvykle tak velká, ţe zastavuje replikaci DNA v buňce, coţ je proces nezbytný pro další dělení bez výrazných chromozomových aberací. Dané změny mohou být kvalitativně popsány na příkladu cisplatiny. Zjistilo se, ţe největší vliv na konformaci DNA mají vnitrořetězcové můstky 1,2-d(GG) nebo 1,2-d(AG). Tyto adukty výrazným způsobem ovlivňují strukturní a další fyzikální vlastnosti DNA. Způsobují ohyb celé molekuly DNA k velkému ţlábku a ohyb podélné osy DNA o 26-50° mezi platinovanými puriny, taktéţ lokálně rozvíjejí dvoušroubovici o 9 – 11°. Také dochází k narušení některých vodíkových vazeb mezi páry nukleotidů G – C v důsledku rozšíření malého ţlábku DNA naproti aduktu. Můţe být pozorována i globální distorze molekuly DNA v rozsahu 4-5 párů bazí. Zajímavostí je, ţe takto modifikovaná DNA vykazuje některé charakteristické znaky helikální struktury typu A(Poklar et al., 1996). Meziřetězcové můstky vznikají přednostně mezi protějšími guaniny v sekvenci 5’-d(GC).5’-d(GC). s komplementárními
Modifikované cytosiny.
guaniny
Tyto
nejsou
cytosiny
jsou
schopny
vytvořit
vytlačeny
mimo
vodíkové
vazby
dvoušroubovice
a neinteragují s ostatními nukleotidy. Distorze v místě vzniku meziřetězcového můstku má rozsah nejméně 4 páry bází a rotace DNA je v tomto místě změněna z pravotočivé na levotočivou. Dochází k rozvíjení DNA o 76 - 80° a k ohybu o 20 - 40° k malému ţlábku(Huang et al., 1995)
.
14
Můstek 1,3-d(GG) IAC ohýbá osu DNA helixu k velkému ţlábku o zhruba 30° a dochází k lokálnímu rozvinutí DNA o přibliţně 6°. V místě vazby je DNA zdenaturovaná a flexibilní(Teuben et al., 1999). Všechny popsané typy můstků jsou zobrazeny na obrázcích (obr. 3 a 4).
Obr. 3: Schematické znázornění různých typů aduktů cisplatiny na DNA(Masters, Köberle, 2003).
15
Obr. 4: Schematické znázornění různých typů můstků, které tvoří cisplatina s DNA(EstebanFernández et al., 2010)
. 16
3.2.4 Vznik buněčné rezistence na komplexy platiny
Mezi podstatné nevýhody platinových komplexů patří kromě závaţných neţádoucích účinků i rezistence nádorů. Některé typy nádorů jsou k platinovým komplexům rezistentní od počátku, jiné tuto vlastnost získají aţ během léčby. Léková rezistence je komplexní, vícesloţkový kompenzační mechanismus, kterým se buňka brání poškození. V této oblasti je ještě mnohé, co je potřeba objasnit, no v případě platinových komplexů se předpokládají čtyři hlavní mechanismy, které mohou stát za vznikem rezistence: (1) Sníţená absorpce a koncentrace léčiva v buňce, (2) zvýšení koncentrace intracelulárních thiolů, (3) zvýšená oprava DNA a/nebo (4) zvýšená tolerance lézí v DNA(de
Graeff, Slebos, Rodenhuis, 1988)
. Podle novějších zjištění jsou u cisplatiny preferovány
mechanismy 1,2 a 3, tedy sníţení koncentrace léčiva v buňce, zvýšení koncentrace intracelulárních thiolů a zvýšená schopnost opravy DNA(Brabec, Kašpárková, 2003). S rostoucí koncentrací buněčných thiolů se zvyšuje pravděpodobnost vzniku rezistence na komplexy platiny(Meijer
et al., 1992)
. Nejčastěji se vyskytující intracelulární thiol je glutathion
(γ-glutamylcysteinylglycin, GSH) a jeho normální fyziologická koncentrace je 0,5 – 10 mM(Pastore et al., 2001). Glutathion je antioxidant, nukleofil a donor elektronů, který chrání buněčné struktury před volnými radikály a peroxidy, reaguje s mnohými xenobiotiky, zvyšuje jejich hydrofilitu a usnadňuje jejich vylučování(Pompella et al., 2003). Není proto překvapením, ţe reaguje i s komplexy platiny, konkrétně s cisplatinou v molekulovém poměru 2:1 a následně je tato sloučenina aktivně vyexportována ven z buňky za pomoci ATP – dependentní proteinové pumpy. Bylo zjištěno, ţe glutathion také podporuje mechanismus nukleotidové excisní opravy,
pomáhá
a polymerázy α(Lai
udrţovat et al., 1989)
dostatečné
mnoţství
prekurzorů
pro
syntézu
DNA
a sniţuje pravděpodobnost vzniku bifunkčních aduktů, čím
dochází k sníţení terapeutického účinku léčiva(Eastman, 1987). Nezanedbatelnou roli při vzniku rezistence k platinovým komplexům hrají také metalothioneiny. Jedná se o poměrně malé proteiny (molekulová hmotnost 500 aţ 14000 Daltonů), bohaté na aminokyselinu cystein. Nacházejí se hlavně na membráně Golgiho aparátu a jsou schopny vázat fyziologické (Zn, Cu, Se) i xenobiotické (Cd, Hg, Ag, As, Pt) kationty kovů(Chu, 1994). Schéma zobrazující některé principy lékové rezistence na cisplatinu je na obr. 5.
17
Obr. 5: Některé mechanismy lékové rezistence k cisplatině(Shahzad,
Lopez-Berestein, Sood, 2009)
.
Vliv glutathionu, ATP-dependentních proteinových pump (A), nukleotidové excisní opravy (B) Poly ADP-ribóza polymerázy (PARP) (C), defektní Aurora Kinázy (D) a antiapoptotocké signalizaci z extracelulární matrix (E).
3.3. Reakce buňky na cytostatické komplexy platiny
Kaţdý krok interakce platinových komplexů s buněčnými mechanismy byl intenzivně studován. Bylo zjištěno, ţe terapeutické cíle a farmakologické účinky cytostatik na bázi platiny jsou víceré a odpověď buňky na poškození je multisystémová, zahrnující vícero signálních drah(Basu, Krishnamurthy, 2010).
3.3.1 High Mobility Group proteiny
High Mobility Group (HMG) je skupina chromozomálních proteinů, které se zúčastňují transkripce, replikace rekombinace a oprav DNA. Jsou také známy pod názvem „Stavební transkripční faktory“ díky jejich specifickým interakcím s jinými proteiny a DNA.(Rajeswari,
Jain,
2002)
.
18
HMG proteiny se dělí na tři skupiny (HMGA, HMGB a HMGN) podle charakteristické vazebné domény. Tyto domény se skládají ze tří α-helixů a nekovalentně se váţou do malého ţlábku DNA, co způsobí ohyb a lokální rozvinutí dvoušroubovice. Vazba HMG proteinu na DNA je dále stabilizována interkalací aminokyselinového řetězce. Bylo zjištěno, ţe HMG proteiny se specificky váţí na DNA modifikovanou platinovými komplexy. Podle typu a počtu HMG domén mohou být HMG proteiny rozděleny do dvou skupin. První skupina HMG proteinů je strukturně specifická, tedy rozpoznává specifické struktury DNA, na které se váţe.
Druhá skupina je sekvenčně specifická, váţe se jenom
k specifickým sekvencím na DNA(Kartalou, Essigmann, 2001). Některé HMG proteiny selektivně rozpoznávají narušení struktury DNA klinicky účinnými komplexy platiny. Na DNA modifikovanou Transplatinou nebo dienplatinou ([Pt(dien)Cl]Cl) se proteiny s HMG doménou neváţou. Jejich vazba je selektivní na můstky 1,2-d(GG) a 1,2d(AG), no můstky 1,3-d(GG) nejsou rozpoznány(Pil, Lippard, 1992). Interakce s HMG proteiny významně zvyšují terapeutickou účinnost platinových komplexů. Existuje vícero hypotéz pro vysvětlení tohoto jevu. „Stínící“ hypotéza předpokládá, ţe vazba HMG proteinu na adukt platiny tento adukt stabilizuje a odstíní před specificky se váţícími proteiny a tím se zabrání účinné opravě poškozeného úseku DNA. Jak jiţ bylo popsáno, HMG proteiny jsou důleţité transkripční faktory, které se účastní mnoha buněčných procesů zahrnujících operace s DNA. „Titrační“ hypotéza předpokládá vyšší afinitu HMG proteinů k vazbě na platinový adukt neţ na jejich přirozené vazebné místo a tedy sníţení jejich koncentrace v cytosolu. Následný nedostatek HMG proteinů pro přesnou regulaci transkripce můţe narušit základní buněčné děje(McA’Nulty, Lippard, 1995). Jeden z modelů reakce buňky na poškození DNA platinovými komplexy za účasti reparačních proteinů je na obr. 6.
19
Obr. 6: Jeden z modelů nezdařené opravy DNA po navázání proteinů s HMG doménou na adukty platinových komplexů na DNA. Poté, co jsou rozpoznány platinové adukty na původním vlákně DNA reparačními proteiny, pokusí se o opravu poškození v novém vlákně. Jelikoţ s platinovým aduktem není komplementární ţádný nukleotid, začíná marná snaha o opravu, která opakováním způsobí mnoho zlomů v obou vláknách DNA. Toto poškození můţe vést aţ k zastavení buněčného cyklu a apoptóze (dráha A). Alternativní moţností je zastavení buněčného cyklu přímo reparačními proteiny skrz aktivaci signalizačních drah JNK a c-Abl, coţ můţe taky vést k apoptóze (dráha B)(Kartalou, Essigmann, 2001).
3.3.2 Nukleotidová excizní oprava
Nukleotidová excisní oprava (nucleotide excision repair – NER) je důleţitý reparační systém pro zachování integrity genomu. Mutace v genech, které kódují proteiny účastnící se NER, jsou příčinou dysfunkce celého systému nukleotidové excisní opravy a projeví se jako závaţná genetická onemocněníRapin,
2013)
. Bylo experimentálně prokázáno, ţe nukleotidová
excisní oprava je dominantní forma opravy DNA při poškození adukty platinových
20
komplexů(Chu, 1994). NER se uplatňuje i při poškození DNA jinými mutagenními látkami a také při poškození DNA UV zářením. Bakterie E.coli je modelovým organismem pro studium NER. U eukaryot a potaţmo i u člověka je mechanismus NER z principu stejný, liší se jen odlišnými druhy proteinů a jejich mnoţstvím, které se tohoto procesu účastní. Konkrétní interakce jednotlivých proteinů jsou předmětem dalšího studia(Krasikova et al., 2013). Všeobecně by se dal mechanismus NER u všech organismů popsat těmito body: 1. Rozpoznání aduktu na DNA a aktivace příslušných signálních drah 2. Postupné navazování jednotlivých proteinů na poškozené místo 3. Vyštípení krátkého úseku vlákna DNA, na kterém je adukt 4. Syntéza nového vlákna podle nepoškozeného komplementárního řetězce pomocí DNA polymerázy 5. Ligace nově nesyntetizovaného vlákna, obnovení integrity DNA a disociace reparačního aparátu Názorný průběh nukleotidové excisní opravy je zobrazen na obr. 7.
21
Obr. 7: Mechanismus nukleotidové excisní opravy. Buňka rozpoznává konkrétní poškození podle toho, jestli je DNA transkripčně čitelná (mechanismus nalevo) nebo ne (mechanismus napravo). Po rozpoznání poškození je oprava provedena stejným způsobem, přičemţ výsledkem je plná obnova původní sekvence nukleotidů(Fuss, Cooper, 2006).
22
3.3.3 Mechanizmus buněčné smrti vyvolán platinovými komplexy
Je všeobecně přijímáno, ţe poškození DNA a následná indukce apoptózy můţe být primárním cytotoxickým mechanismem účinků platinových komplexů, jako i ostatních protinádorových léčiv, která se váţou na DNA(Fisher et al., 1994). Iniciace, transdukce a exekuce řízené buněčné smrti je poměrně dlouhý a komplikovaný proces, s kterým mohou mít ne zcela funkční buňky problémy. Platinové komplexy většinou reagují nespecificky a interagují kromě DNA i s jinými molekulami v buňce. Je proto vhodné uvaţovat i o poškození proteinů jako o moţném spouštěči apoptózy(Pérez,
1998)
. Je dokonce
moţné, ţe poškození platinovými komplexy můţe spustit apoptózu na začátku exekuční fáze přímou interakcí s kaspázami. Táto moţnost iniciace apoptózy uţ byla popsána při likvidaci buněk cytotoxickými T-lymfocyty(Golstein, Ojcius, Young, 1991). Ačkoli jsou apoptóza a nekróza velice odlišné formy buněčné smrti, mohou nastat současně v jedné populaci buněčné linie vystavené stejnému stresovému faktoru(Zhan
et al.,
1999)
. Oba typy buněčné smrti byly pozorovány ve stejné populaci buněk vystavené
cisplatině(Pestell
et al., 2000)
. V tomto pohledu můţeme předpokládat, ţe apoptóza a nekróza
ohraničují interval moţností buněčné smrti. Její konkrétní podoba pak závisí na vícero faktorech, jako například dostupnost energie či metabolická kondice buňky(Leist
et al., 1997)
.
Některé buňky mohou zemřít způsobem nedokončené apoptózy. Bylo pozorováno, ţe smrt populace
leukemické nádorové
linie
L1210
vyvolaná
cisplatinou
byla
důsledkem
nedokonalého apoptotického programu, který postrádal některé morfologické a biochemické charakteristiky typické pro apoptózu(Segal-Bendirdjian, Jacquemin-Sablon, 1995). Ve vysokých koncentracích mohou platinové komplexy reagovat i s molekulami zapojenými do energetického metabolismu (např. s ATP) a s proteiny přímo i nepřímo zapojeny do procesu apoptózy (např. p53, Bax, Bcl-2, kaspázy), coţ vede k nekróze. Tuto teorii podporuje přímé pozorování populace keratinocytů rezistentních vůči cisplatině, která byla transformována onkogenem H-ras a vystavena vysoké koncentraci cisplatiny (312 µM). Vyvinuli se u ní charakteristické znaky nekrotické buněčné smrti(Pérez et al., 1999). Vzhledem na úroveň buněčného poškození způsobeného komplexy platiny, můţe být navozena i nekrotická buněčná smrt a to buď přímo nebo jako důsledek nedokončeného apoptotického procesu. Čím dál, tím víc důkazů podporuje teorii, ţe buněčná smrt navozena komplexy platiny není čistě klasická apoptóza, přičemţ závisí hlavně na dávce léčiva a stavu buňky(Gonzalez et al., 2001).
23
3.4. Nové trendy ve vývoji protinádorových léčiv založených na komplexech platiny
3.4.1 Současný stav
Za posledních 30 let se do klinických zkoušek dostalo dalších 23 cytotoxických platinových komplexů, přičemţ jen dvě z nich se dostaly na mezinárodní trh (Karboplatina a Oxaliplatina, obr. 8 a 9) a další 3 na lokální trhy (Nedaplatina, Lobaplatina a Heptaplatina, obr. 10, 11 a 12). Dnes je na tomto poli výzkumu i napříč velice slibným výsledkům více neúspěchů neţ úspěchů. Tento trend se ale můţe změnit, protoţe protinádorová léčiva na bázi komplexů přechodných kovů ještě nejsou dostatečně probádána a tato skupina látek ještě má čím překvapit(Wheate et al., 2010). Experimentálně
bylo
prokázáno,
ţe
komplexy,
které
se
podobají
v struktuře
a charakteristice odstupujících skupin budou mít podobné farmakologické vlastnosti, jako i spektrum indikací. Proto třeba hledat takové komplexy platiny, které se budou výrazněji lišit od těch starších. U takových sloučenin bude moţno očekávat i zcela odlišné biologické účinky a tedy i moţnosti vyuţití v léčbě nádorových onemocnění(Kašpárková, Brabec, 2001). Příkladem nadějné látky je Satraplatina (obr. 13), která je v současnosti ve stádiu klinického zkoušení. Satraplatina má velkou výhodu oproti jiným platinovým komplexům, protoţe můţe být zatím jako jediná podávána orálně(Choy,
Park, Yao, 2008)
. Všechna ostatní
protinádorová léčiva na trhu zaloţená na komplexech platiny musí být podávána injekčně. Další vývoj je zaloţen i na komplexech jiných přechodných kovů neţ platiny, například cínu v oxidačním čísle IVAffan et al., 2012) iridia(Hearn et al., 2013) nebo ruthenia(Brabec, Nováková, 2006),(Küster et al., 2012)
.
Obr. 8: Strukturní vzorec Karboplatiny
24
Obr. 9: Strukturní vzorec Oxaliplatiny
Obr. 10: Strukturní vzorec Nedaplatiny
Obr. 11: Strukturní vzorec Lobaplatiny
Obr. 12: Strukturní vzorec Heptaplatiny 25
Obr. 13: Strukturní vzorec Satraplatiny
3.4.2 Deriváty cisplatiny
3.4.2.1 Karboplatina
K nejpouţívanějším analogům cisplatiny patři Karboplatina. Jedná se o cis-diammin-(1,1cyklobutandikarboxylato)platnatý komplex. Odstupující skupina je karboxylátový ligand, který ve vodě disociuje pomaleji neţ chlór v případě cisplatiny. Podobnost s cisplatinou je i v případě aduktů na DNA, Karboplatina má ale odlišnou preferenci tvorby můstků(Blommaert et al., 1995)
. Její afinita vazby k DNA roste v buňkách, které mají vyšší koncentraci nukleofilů,
např. buňky nádoru prsu(Natarajan, Malathi, Holler, 1999). Karboplatina je méně toxická neţ cisplatina, no je to způsobeno jen její pomalejší hydrolýzou.
3.4.2.2 Oxaliplatina
Oxaliplatina
je
dalším
analogem
cisplatiny.
Je
to
(1,2-diammincyklohexan-
(oxalato))platnatý komplex. Je účinná i na nádory tlustého střeva, obzvláště v kombinaci s 5fluorouracilem a Leucovorinem(Lévi et al., 1994).
26
3.4.2.3 Ostatní deriváty cisplatiny
Další moţnost ovlivnění farmakologické aktivity derivátů cisplatiny je změna nosiče. Cílem je navrhnout multifunkční molekulu, která vykazuje novou farmakologickou aktivitu(Brabec, Kašpárková, 2002).
3.4.3 Deriváty Transplatiny
Změnou ligandů byla docílena změna cytotoxické aktivity. Některé z těchto derivátů jsou účinné i v nádorových buňkách rezistentních k cisplatině. Strukturní vzorce vybraných zástupců jsou zobrazeny na obr. 14. Deriváty Transplatiny s protinádorovou aktivitou mohou být rozděleny do čtyř kategorii(Brabec, Kašpárková, 2002):
1. Analoga s obecným vzorcem trans-[PtCl2(E-iminoether)2] 2. Analoga s obecným vzorcem trans-[PtCl2(NH3)(L)], kde L je planární aminový ligand, např. chinolin nebo thiazol 3. Analoga s asymetrickými alifatickými ligandy 4. Ostatní trans-deriváty platiny
3.4.3.1 Analoga s iminoetherem
Tyto analoga se mají jednu z amonných skupin nahrazenou iminoetherovým ligandem. Daná záměna má za následek změnu kinetiky vazby k DNA jako i strukturu a stabilitu aduktů a na rozdíl od transplatiny, vytváří se nedenaturační změny v struktuře DNA(Vrána,
Brabec,
Kleinwächter, 1986)
. Iminoetherová analoga reagují přednostně s guaninem a vytváří spíše
monofunkční adukty, především po delší inkubaci komplexu s DNA(Brabec
et al., 1996)
. Velmi
zajímavým zjištěním je schopnost komplexu trans-[PtCl2(E-iminoether)2] zastavovat syntézu RNA na stejných místech jako cisplatina i přes to, ţe vytváří především monofunkční adukty, které u cisplatiny na zastavení syntézy RNA nestačí, je potřeba bifunkční adukt(Ţaludová
et al.,
1997)
.
27
3.4.3.2 Analoga s planárním aminovým ligandem
Podobně jako u předchozí kategorie, tyto analoga mají jednu z amonných skupin nahrazenou planárním amonným ligandem. Touhle záměnou bylo dosaţeno lepší interakce s DNA díky vícerým vlivům velkého planárního aminového ligandu. Výsledky experimentů dokázali, ţe jednoduchá záměna ligandu můţe významné změnit chemické vlastnosti původně farmakologicky neúčinného platinového komplexu a účinek monofunkčních aduktů takto upravených sloučenin můţe být stejně efektivní jako účinek bifunkčních aduktů cisplatiny(Ţákovská et al., 1998; Brabec et al., 2000).
Obr.
14:
Strukturní
vzorce
vybraných
zástupců
derivátů
Transplatiny.
A
trans-
[PtCl2(NH3)(thiazol)], B trans-[PtCl2(NH3)(chinolin)], C trans-[PtCl2(E-iminoether)2], D trans[PtCl2(E-iminoether)].
3.4.4 Polynukleární komplexy platiny
Jedná se o sloučeniny s vícerými atomy platiny, které jsou spojeny přes amonné skupiny různě dlouhými řetězci. Tyto sloučeniny tvoří jiné typy aduktů neţ mononukleární komplexy. 28
S vazebnými místy daleko od sebe vytvářejí tzv. „můstky delšího dosahu“, které spojují báze oddělené od sebe několika dalšími páry bází. Mezi nejčastěji vznikající můstky patří ty, které vznikají mezi bázemi komplementárních řetězců DNA. Experimenty ukazují, ţe polynukleární komplexy platiny jsou účinnější neţ cisplatina(Billecke et al., 2006). Například vícejaderný komplex BBR 3464 vykazuje protinádorovou aktivitu při koncentracích desetkrát niţších, neţ jsou klinicky efektivní koncentrace cisplatiny. Potvrdil se také předpoklad, ţe nový komplex je aktivní i v řadě nádorových buněk rezistentních vůči cisplatině, včetně buněk s mutovaným genem pro známý tumor supresorový protein p53. Je tedy moţno očekávat klinické indikace na jiné spektrum nádorů, neţ mají komplexy s jedním atomem platiny(Zehnulová et al., 2001; Kašpárková et al., 2002)
. Vybraní zástupci této skupiny jsou na obr. 15.
Obr. 15: Strukturní vzorce vybraných zástupců polynukleárních komplexů platiny(Billecke
et al.,
2006)
.
29
3.5. Histonové deacetylázy a jejich funkce
Histonové deacetylázy (často označovány zkratkou HDAC) jsou enzymy (EC číslo 3.5.1), které odštěpují acetylové skupiny (-COCH3) z aminokyseliny ε-N-acetyl lyzinu. Tyto aminokyseliny jsou součástí proteinových podjednotek histonů a jejich deacetylací se zvyšuje míra kondenzace DNA (Obr. 16). Tento systém kondenzace a rozvolňování struktury DNA prostřednictvím acetylace a deacetylace histonů je důleţitý mechanismus regulace genové
exprese.
Hyperacetylovaný
chromatin
je
transkripčně
aktivní,
kdeţto
hypoacetylovaný chromatin je transkripčně tichý. Kaţdý histon má ocásek (histone tail), který je normálně kladně nabitý díky dusíkatým skupinám lyzinu a argininu. Tyto pozitivní náboje pomáhají histonovým ocáskům interagovat se záporně nabitými fosfáty, které tvoří kostru DNA. Acetylací se z aminů stanou amidy, kladný náboj se sníţí a tím klesne schopnost histonů vázat se k DNA. Histonové deacetylázy jsou někdy nazývány i lyzinové deacetylázy, protoţe mezi jejich cíle nepatří jenom proteinové podjednotky histonů(Choudhary et al., 2009). Tyto enzymy jsou fylogeneticky dobře konzervované a dělí se do čtyř skupin podle funkce a podobnosti jejich DNA sekvencí. Skupiny I a II jsou „klasické“ histonové deacetylázy, kterých funkce je inhibována trichostatinem A, kdeţto skupina III je NAD + dependentní a trichostatin A na ní nemá efekt. Homology těchto tří skupin můţeme najít i u kvasinek (Saccharomyces cerevisiae), kde Rpd3 odpovídá skupině I, hda1 skupině II a Sir2 skupině III(Sengupta, Seto, 2004). Skupina IV zahrnuje atypické enzymy, které jsou ostatním podobné jenom DNA sekvencí. Všechny histonové deacetylázy kromě skupiny III obsahují dvojmocný atom Zinku (Zn2+), jsou tedy známy i pod názvem Zn-dependentní(Marks, Xu, 2009). Trichostatin A je organická látka s antibiotickými a fungicidními účinky, která je schopná selektivně inhibovat třídu I a II savčích histonových deacetyláz s hodnotami IC50 kolem 20 nM(Maier et al., 2009). Její vzorec je na obr. 17. Víceré studie zjistily, ţe histonové deacetylázy se zúčastňují v mnoha regulačních dráhách ţivých organismů a jejich nesprávná funkce či absence mohou být příčinou váţných chorob i smrti. V prefrontálním kortexu osob trpících schizofrenií byla zjištěna zvýšená exprese histonové deacetylázy typu 1(Sharma,
Grayson, Gavin, 2008)
. Studie na myších zjistila, ţe
některé histonové deacetylázy se navzájem ovlivňují a aţ 7% myších genů bylo deregulováno při nepřítomnosti histonové deacetylázy typu 1(Zupkovitz et al., 2006). Histonové deacetylázy neregulují transkripci genů jenom modifikací histonů a struktury chromatinu, i kdyţ studie naznačují, ţe toto je jejich primární činnost. Funkce, aktivita a stabilita proteinů můţe být kontrolována i post-translačními modifikacemi. Bylo zjištěno, ţe histonové deacetylázy interagují i s velkou škálou nehistonových proteinů, z kterých 30
významnou část tvoří transkripční faktory a pomocné regulátory(Glozak
et. al., 2005)
. Proto se
o histonových deacetylázách uvaţuje jako o moţných cílech pro terapii nádorových onemocnění(Marks et al., 2001).
Obr. 16: Různé úrovně sbalení eukaryotické DNA(Wheeler, 2001).
.
Obr. 17: Strukturní vzorec Trichostatinu A.
3.5.1 Inhibitory histonových deacetyláz a moţnosti jejich pouţití v protinádorové terapii
Tyto látky se uţ dlouho pouţívají v psychiatrii a neurologii jako stabilizátory nálady a antiepileptika, například kyselina valproová (obr. 18). Mezi jejich další indikace patří i léčba neurodegenerativních poruch a nádorových onemocnění(Hahnen
et
al.,
2008)
. Velký počet
strukturně odlišných inhibitorů histonových deacetyláz vykazuje silnou protinádorovou aktivitu a současně nízkou toxicitou in vivo ve zvířecích modelech. Léky Vorinostat (Zolinza) (obr. 19) a Romidepsin (Istodax) (obr. 20) byly nedávno schváleny pro léčbu koţního T-lymfomu(Mann
et al., 2007), (Bertino, Otterson, 2011)
. Předpokládá se, ţe účinek těchto látek spočívá
v epigenetickém působení na genovou expresi(Monneret, 2007). 31
Inhibitory histonových deacetyláz indukují akumulaci hyperacetylovaných nukleozomů v mnoha regionech chromatinu, no ovlivňují expresi jen malého počtu genů. Nadměrná acetylace vede k aktivaci některých transkripčních faktorů, jako například proteinu p53. Inhibitory histonových deacetyláz mají vliv i na nehistonové proteiny a mohou měnit jejich aktivitu skrz ovlivnění jejich acetylace. Výzkum ukázal, ţe tyto inhibitory mohou měnit i inkubační dobu některých virů a reaktivovat je (například latentní infekce lidským herpesvirem-6)(Arbuckle, Medveczky, 2011). V současnosti se histonové deacetylázy zkoumají jako chemosenzitizéry pro cytotoxickou a radiační terapii, jako i ve spojení s DNA alkylačními inhibitory, ke kterým se řadí mechanismem účinku i protinádorově účinné platinové komplexy(Batty, Malouf, Issa, 2009).
Obr. 18: Strukturní vzorec kyseliny valproové.
Obr. 19: Strukturní vzorec Vorinostatu.
Obr. 20: Strukturní vzorec Romidepsinu. 32
4. CÍL PRÁCE
V teoretické části byly popsány různé typy platinových komplexů s protinádorovými účinky, jejich vývoj a funkce histonových deacetyláz jako moţných cílů pro protinádorovou terapii. V současnosti je se zvýšeným zájmem studováno spojení histonových deacetyláz s alkylačními protinádorovými léčivy z důvodu vyšší protinádorové účinnosti těchto látek při současně niţších neţádoucích účincích. Ve spolupráci s Katedrou medicinální chemie a přírodních produktů Hebrejské univerzity v Jeruzalémě byl vyvinut nový platinový komplex pracovně označen jako NBA-OH-VPA, který spadá do výše zmíněné kategorie alkylačních léčiv konjugovaných s inhibitorem histonových deacetyláz (obr. 21). Cílem diplomové práce bylo zkoumat interakce DNA se studovaným komplexem platiny se zaměřením na mechanizmus působení, korelovat získaná data s dostupnými údaji o cytotoxicitě v lidských nádorových buňkách a ze získaných dat vyvodit závěr o vztahu mezi vlivem studovaného komplexu na strukturu DNA a jeho biologickou aktivitou. Při zjišťování těchto dat byly pouţity chemické a fyzikální metody: diferenční pulzní polarografie (DPP) UV spektrofotometrie atomová absorpční spektrometrie (AAS) fluorimetrie gelová elektroforéza
Obr. 21: Strukturní vzorec platinového komplexu konjugovaného s inhibitorem histonové deacetylázy pracovně nazván NBA-OH-VPA.
33
5. MATERIÁL A METODY
5.1. Použité chemikálie
Všechny pouţité chemikálie byly p. a. čistoty. Při všech experimentech byla pouţita deionizovaná voda Milli-Q čistoty. Komplex NBA-OH-VPA byl získán z Katedry medicinální chemie a přírodních produktů Hebrejské univerzity v Jeruzalémě, Izrael. Cisplatina byla zakoupena od firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). DNA z telecího thymu (42% GC párů, molekulová hmotnost přibliţně 20 000 kDa) byla izolována postupem popsaným v článku(Brabec,
Paleček, 1976)
. Plazmid pSP73 (2464 pb) byl
zakoupen od firmy Promega (Fitchburg, WI, USA). Plazmid pUC19, restrikční endonukleáza EcoRI a příslušné pufry byly zakoupeny od firmy New England Biolabs, Inc. (Ipswich, MA, USA). Chloristan sodný hydrát, chlorid sodný, hydroxid sodný, roztok formaldehydu, hydrazin monohydrát, kyselina sírová, Tris(hydroxymethyl)aminomethan hydrochlorid (TRIS-HCl), Tris(hydroxymethyl)aminomethan acetát (TRIS acetát), kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA), ethidium bromid a thiomočovina byly zakoupeny od firmy Sigma-Aldrich. Agaróza byla zakoupena od firmy SERVA Electrophoresis GmbH (Heidelberg, Nemecko).
34
5.2. Použité roztoky a pufry
5.2.1 Roztoky cis-diammindichloroplatiny a NBA-OH-VPA
Pevná naváţka se nechala rozpustit v deionizované vodě za mírného třepání po dobu minimálně 48h bez přístupu světla. Výsledná koncentrace byla změřena na AAS.
5.2.2 Elektrolyt pro diferenční pulzní polarografii (DPP)
100 ml elektrolytu:
41 ml deionizované vody 4 ml 98% kyseliny sírové (celková koncentrace H2SO4 c = 0,675 M) Rozdělit na dva alikvoty Do prvního 2,5 ml 0,8% roztok formaldehydu (celková koncentrace formaldehydu c = 20 mM) Do druhého 2,5 ml 0,08% roztok hydrazinu (celková koncentrace hydrazinu c = 2 mM) Alikvoty smíchat Doplnit deionizovanou vodou do 100 ml
5.2.3 Roztoky pro neutrální gelovou elektroforézu
1000 ml 1x TAE pufru:
7,25 g Tris – acetátu (celková koncentrace c = 0,04 M) 292 mg EDTA (celková koncentrace c = 1 mM) Doplnit deionizovanou vodou do 1000 ml
Nanášecí pufr:
40% roztok sacharózy (w/v) 0,25% roztok Bromfenolové modři (v/v) 35
100 mM Tris báze pH 7,8
5.2.4 Roztoky pro alkalickou denaturační elektroforézu
100 ml 4 M roztoku NaCl:
23,38 g NaCl Doplnit deionizovanou vodou do 100 ml
100 ml 0,5 M roztoku NaOH:
2,00 g NaOH Doplnit deionizovanou vodou do 100 ml
1000 ml 0,5 M roztoku EDTA:
186,10 g EDTA 800 ml deionizované vody Upravit na pH 8,5 10 mM NaOH Doplnit deionizovanou vodou do 1000 ml
1000 ml alkalického pufru:
1,20 g NaOH (výsledná koncentrace c = 0,03 M) 292 mg EDTA Doplnit deionizovanou vodou do 1000 ml
6x koncentrovaný nanášecí roztok:
40% roztok sacharózy (w/v) 0,25% roztok Bromfenolové modři (v/v)
100ml 10x TE pufru:
1,58 g Tris-HCl (celková koncentrace c = 0,01 M) 292 mg EDTA (celková koncentrace c = 1 mM) Doplnit deionizovanou vodou do 100 ml pH 7,8
36
5.2.5 Elektroforetické gely
1% neutrální agarosový gel:
1 g agarózy 100 ml TAE pufru Směs rozvařit v mikrovlnné troubě Po mírném ochlazení aplikovat do nosiče
1% agarosový gel pro alkalickou denaturační elektroforézu: 1 g agarózy 100 ml deionizované vody Směs rozvařit v mikrovlnné troubě Po rozpuštění agarózy a mírném ochlazení přidat 175 mg NaCl (výsledná koncentrace c = 0,03 M) 29 mg EDTA (výsledná koncentrace c = 1 mM) Gel vyţaduje tuhnutí v délce minimálně 2 hodiny
5.2.6 Barvící roztok pro elektroforetické gely 7,5 µl roztoku ethidium bromidu (c = 10 g/l) 200 ml deionizované vody (odbarvení v čisté deionizované vodě)
5.2.7 Roztok pro měření fluorescence ethidium bromidu
Roztok byl namíchán vţdy těsně před měřením do 50 ml kyvety obalené alobalem (stínění). 17,4 ml deionizované vody 2,6 ml 4 M roztoku NaCl 82 µl roztoku ethidium bromidu (c = 10 g/l) (ke kaţdému vzorku byl přidán 1 ml roztoku) 37
5.3. Metody
5.3.1 Modifikace DNA komplexy platiny
DNA z telecího thymu (tt-DNA) nebo plazmidu byla inkubována s komplexy platiny v 10 mM roztoku chloristanu sodného (NaClO4) při 37°C po dobu 24 hodin bez přístupu světla. Po inkubaci byly vzorky dialyzovány do vhodného média, které bylo dle potřeby vyměňováno. Po dialýze byl odebrán alikvot ze vzorků ke stanovení stupně modifikace pomocí AAS. Molekulární poměr volného komplexu platiny k počtu nukleotidů DNA se nazývá ri (initial) a vypočítá se podle vzorce
kde nPt je látkové mnoţství platiny, nDNA je látkové mnoţství DNA, cPt,i je koncentrace zásobního roztoku daného komplexu platiny, VPt,i je objem roztoku komplexu, cDNA,i je koncentrace DNA v reakci a VDNA,i je objem roztoku DNA. Stupeň modifikace rb (bound) je definován jako počet atomů platiny skutečně navázaných na jednu bázi DNA.
5.3.2 Dialýza
Dialyzační membrána o délce zhruba 7 cm byla ponořena do deionizované vody a v mikrovlnné troubě přivedena k varu. S následným propláchnutím deionizovanou vodou a výměnou vody se tento proces opakoval celkem třikrát. Po finálním propláchnutí byly membrány opatřeny spodní tlačkou, vzorky napipetovány do dialyzační membrány a membrána uzavřena horní tlačkou. Pak byly dialyzovány minimálně 4 hodiny s opakovanou výměnou média za čerstvé při laboratorní teplotě. Dialyzačním médiem byla nejčastěji deionizovaná voda, ale i 10 mM roztok NaClO 4 či 0,1 M roztok NaCl. V případě většího počtu vzorků se výměna dialyzačních médii urychlila.
38
5.3.3 Stanovení vazby komplexů platiny k DNA
Tt-DNA byla inkubována se studovanými komplexy v prostředí 10 mM NaClO4 na hodnotu ri = 0,05 při 37°C po dobu 24 hodin. Kinetika vazby komplexů platiny byla stanovena pomocí diferenční pulzní polarografie podle postupu uvedeného v článku(Kim
et al., 1990)
na
přístroji EG&C PARC Electrochemical analyzer, Model 384B. Bylo stanovováno mnoţství volné platiny (komplexu) v roztoku. V daných časových intervalech byly z reakční směsi odebírány vzorky a měřeny na přístroji. Sloţení elektrolytu bylo popsáno v kapitole Pouţité roztoky a pufry. Vazba studovaných komplexů na DNA byla ověřena i dalším způsobem. Vzorky tt-DNA byly inkubovány se studovanými komplexy v prostředí 10 mM NaClO4 při 37°C po dobu 24 hodin na hodnoty ri = 0,02 aţ 0,1 bez přístupu světla. Poté byly vzorky dialyzovány oproti 10 mM NaClO4 při laboratorní teplotě za účelem odstranění nenavázaných komplexů platiny. Koncentrace platiny v dialyzovaných i nedialyzovaných vzorcích byla změřena pomocí AAS.
5.3.4 Elektroforéza v nativním agarózovém gelu
Nativní elektroforéza probíhala v 1% agarosovém gelu, který byl připraven podle postupu popsaného v kapitole Pouţité roztoky a pufry. Připravený roztok agarózy byl rovnoměrně nalit do připraveného nosiče s hřebínkem umístěného na rovné ploše a pomocí špičky do mikropipety byly odstraněny vzduchové bubliny. Po ztuhnutí a vytaţení hřebínku byl gel v elektroforetické vaně zalit pufrem 1x TAE. K nepipetovaným vzorkům byl přidán nanášecí pufr a následně bylo zapojeno stejnosměrné napětí o velikosti 35 V. Elektroforéza běţela tak dlouho, aby čelo vzorků doputovalo aspoň do dvou třetin délky gelu. Poté byl slit pufr a gel přenesen do barvící vany, kde byl zalit barvícím roztokem s ethidium bromidem při mírném míchání na třepačce po dobu 20 minut. Po obarvení následovalo odbarvení pro sníţení fluorescence pozadí v destilované vodě za stejných podmínek. Výsledek elektroforézy byl pozorován na UV transiluminátoru a vyfotografován.
5.3.5 Elektroforéza v alkalickém denaturačním agarózovém gelu
Pro alkalickou denaturační elektroforézu byl opět pouţit 1% agarosový gel, kterého příprava a sloţení je popsáno v kapitole Pouţité roztoky a pufry. Po přípravě byl gel nalit do 39
připraveného nosiče s hřebínkem umístěného na rovné ploše a pomocí špičky do mikropipety byly odstraněny vzduchové bubliny. Gel vyţaduje minimálně dvouhodinovou dobu tuhnutí. Po ztuhnutí byl gel zalit alkalickým pufrem a následně byly napipetovány vzorky a nanášecí roztok. Elektroforéza probíhala při stejnosměrném proudu o velikosti 45 V po dobu, neţ čelo dosáhlo dvou třetin délky gelu. Následovalo slití pufru, barvení, odbarvení a vyfotografování na UV transiluminátoru jako u elektroforézy v nativním agarózovém gelu.
5.3.6 Linearizace plazmidové DNA
Plazmidová DNA byla linearizována pomocí restrikční endonukleázy EcoRI v příslušném pufru po dobu 2 hodin při 37°C bez přístupu světla. Kontrola linearizace byla provedena nativní agarózovou elektroforézou.
5.3.7 Deproteinace a přesráţení plazmidové DNA
Deproteinace byla provedena fenolchloroformovou extrakcí. Ke vzorku byl přidán stejný objem fenolu a chloroformu, směs promíchána na vortexu a centrifugována při 14 000 RPM po dobu 1 minuty. Následně byla odebrána horní, vodní vrstva obsahující DNA, ke které byl přidán stejný objem čistého chloroformu a zopakováno promíchání a centrifugace. Pak byla znovu odebrána horní, vodní vrstva, která byla následně přesráţena. Přesráţení bylo zahájeno přidáním jedné desetiny objemu 3 M roztoku octanu sodného (pH 5,5) ke vzorku. Po důkladném promíchání byl přidán dvojnásobný objem bezvodého ethanolu vychlazeného na -20°C. Po opětovném promíchání byl vzorek umístěn do mrazáku (-20°C) na dobu 30 minut. Poté byla provedena centrifugace za chlazení na 4°C při 14 000 RPM po dobu 30 minut. Supernatant byl opatrně odebrán mikropipetou a k peletě bylo přidáno 200 µl 80% ethanolu ochlazeného na -20°C. Roztok byl opět centrifugován za stejných podmínek po dobu 30 minut. Supernatant byl opět opatrně odebrán mikropipetou a přesráţená DNA byla vysušena za sníţeného tlaku vzduchu v exsikátoru a posléze rozpuštěna v poţadovaném prostředí.
40
5.3.8 Zjištění mnoţství meziřetězcových můstků
Nejprve byla plazmidová DNA (plazmid pSP73) linearizována pomocí restrikční endonukleázy EcoRI. DNA byla deproteinována, přesráţena a rozpuštěna v 10 mM NaClO4. Pomocí UV spektrofotometru byla stanovena přesná koncentrace lineární DNA. Pak proběhla inkubace se studovanými komplexy s různými ri při 37°C po dobu 24 hodin bez přístupu světla. Mnoţství meziřetězcových můstků bylo určeno pomocí elektroforézy v denaturačním alkalickém agarózovém gelu. Elektroforetická metoda pro zjištění počtu meziřetězcových můstků byla popsána v článku(Farrell
et al., 1990)
. Za denaturačních podmínek dochází k rozvolnění vodíkových vazeb
mezi komplementárními bázemi a dvouvláknová DNA (double strand - dsDNA) se dělí na jednotlivá vlákna (single strand - ssDNA), které následně putují gelem mnohem rychleji neţ těţší vlákna DNA spojeny meziřetězcovými můstky, které vznikly po modifikaci platinovými komplexy. Po ukončení elektroforézy byl gel vyfocen a denzitometricky vyhodnocen v programu Aida Image Analyzer, pomocí kterého byly intenzity prouţků odpovídajících ssDNA i dsDNA s meziřetězcovými můstky kvantifikovány. Zastoupení meziřetězcových vazeb %IEC/Pt (počet meziřetězcových vazeb na adukt) se vypočítá podle vztahu
kde rb je stupeň modifikace, 4928 je počet jednotlivých nukleotidů plazmidu a XL je počet meziřetězcových vazeb na jednu molekulu linearizovaného DNA duplexu a je určen pomocí Poissonova rozdělení jako
kde SS (single strand) je frakce molekul putujících na gelu jako DNA bez meziřetězcových vazeb. Výše uvedený vzorec můţe být ovšem pouţit jen tehdy, pokud je intenzita frakce DNA s meziřetězcovými vazbami menší neţ 50%, jinak nejsou splněny podmínky jeho platnosti.
5.3.9 Reakce s thiomočovinou
Cílem reakce s thiomočovinou je charakterizovat adukty komplexu na DNA. Většina bifunkčních komplexů platiny se váţe na DNA dvoukrokovým procesem. Nejprve dochází 41
k tvorbě monofunkčních aduktů s preferencí guaninu, které posléze přecházejí v adukty bifunkční(Brabec et al., 1990). Thiomočovina má schopnost reagovat s monofunkčními adukty a ty pak odstraňovat, no s bifunkčními adukty nereaguje(Eastman, Barry, 1987). Tt-DNA byla inkubována s komplexem NBA-OH-VPA na ri = 0,05 v prostředí 10 mM NaClO4 při 37°C bez přístupu světla. V různých časech (1h, 3h, 7,7h a 24h) od začátku inkubace byly z reakční směsi odebírány 2 stejné alikvoty a reakce v nich zastavována. V první sérii alikvotů to bylo přidáním roztoku NaCl na celkovou koncentraci 0,1 M a umístěním do mrazáku na -20°C. V druhé sérii alikvotů to bylo přidáním roztoku thiomočoviny na celkovou koncentraci 10 mM, 10 minutovou inkubací při teplotě 37°C a následným ochlazením na -20°C v mrazáku. Všechny vzorky byly následně dialyzovány oproti 0,1M roztoku NaCl a následně oproti deionizované vodě. Obsah navázané platiny byl určen pomocí AAS.
5.3.10 Rozvíjení plazmidové DNA
Vzorky s plazmidovou DNA (plazmid pUC19) byly inkubovány se studovaným komplexem NBA-OH-VPA a cisplatinou v prostředí 10 mM NaClO4 při 37°C po dobu 24 hodin bez přístupu světla. Poté byly analyzovány na 1% nativním agarózovém gelu v TAE pufru při laboratorní teplotě. Bylo aplikováno napětí 35 V po dobu, neţ čelo dosáhlo dvou třetin délky gelu. Po obarvení ethidium bromidem a odbarvení byl gel vyfotografován na UV transiluminátoru a vyhodnocen. Elektroforetická mobilita plazmidové DNA závisí na její superhelikální hustotě, tedy na tom, jak moc je kruhová DNA stočená. Čím víc je plazmidová DNA zavinutá, tím je více kompaktní a v gelu migruje rychleji. Relaxovaná forma, nazývána téţ OC (open circle) forma, nemá ţádné superhelikální vinutí a díky své rozvolněné struktuře putuje v gelu nejpomaleji. Pokud je přirozená, negativně zavinutá DNA modifikována komplexem platiny, dochází k lokálnímu rozvolnění její struktury a tedy i ke zpomalení elektroforetické mobility. Kdyţ je dosáhnut bod ekvivalence, obě formy (superhelikální i relaxovaná) putují stejnou rychlostí. Při dalším zvyšování koncentrace komplexu dochází k opětovnému zavíjení v kladném směru a k opětovnému zvyšování mobility. Úhel rozvinutí připadající na jeden adukt Φ je důleţitá informace o účincích cytostatických komplexů. Pro jeho zjištění je potřeba nalézt bod ekvivalence, tedy takový stupeň modifikace (rb), kdy superhelikální i relaxovaná forma migrují společně. Pak je moţné daný úhel vypočítat podle vztahu
42
kde σ je tabelovaná superhelikální hustota pro pouţitý plazmid a rb (c) je stupeň modifikace, při kterém dochází k plnému vykompenzování negativního vinutí plazmidové DNA. Pro výpočet hodnoty Φ studovaného komplexu NBA-OH-VPA byl vyuţit známý úhel cisplatiny, který činí Φ = -13° ± 1°. (σ = -0,05417).
5.3.11 Zhášení fluorescence ethidium bromidu
Měření bylo provedeno na přístroji HITACHI F-4500 Fluorescence Spectrophotometer. Tt-DNA byla modifikována studovanými komplexy a inkubována v prostředí 10 mM NaClO4 při 37°C po dobu 24 hodin. Ke konci inkubace byl namíchán roztok pro měření fluorescence ethidium bromidu popsán v kapitole Pouţité roztoky a pufry. Ke kaţdému vzorku byl těsně před měřením přidán 1ml roztoku a bylo provedeno měření.
5.3.12 Měření teploty tání
Denaturační křivky DNA modifikované studovaným komplexem platiny byly měřeny na UV-VIS spektrofotometru v křemenných kyvetách o optické dráze 1 cm. Měření probíhalo v 10 mM a 100 mM NaClO4. Teplota tání (Tm – melting temperature) byla určena pomocí GraphPad Prism 5 jako první derivace naměřených křivek. Jedná se tedy o takovou teplotu, která odpovídá inflexnímu bodu denaturační křivky.
43
6. VÝSLEDKY
6.1. Vazba komplexu na telecí thymovou DNA
Pomocí diferenční pulzní polarografie byla stanovena kinetika vazby studovaného komplexu NBA-OH-VPA na DNA a porovnána s kinetikou vazby cisplatiny. Měřicí přístroj byl kalibrován zvyšující se koncentrací platinového komplexu (obr. 22). Odpověď přístroje byla vţdy lineární při všech testovaných koncentracích kalibračních roztoků komplexů platiny. Při měření kinetiky byl sledován pokles koncentrace volného komplexu v roztoku s časem a tyto údaje jsou zobrazeny jako procentuální nárůst vázaného komplexu na DNA v čase. Průběh reakce komplexu s DNA je znázorněn na grafu (obr. 23). Pro komplex byl určen čas t50 – čas, kdy je na DNA navázáno právě 50% celkového mnoţství komplexu v reakci. Pro komplex NBA-OH-VPA bylo pomocí dvou měření zjištěno, ţe t50 = 16,2 ± 0,8 minuty. Z celkových pěti měření byly tři zamítnuty z důvodů nepřesnosti (stáří roztoku komplexu – komplex NBA-OHVPA je tak reaktivní, ţe pravděpodobně reaguje sám se sebou za tvorby dimerů). Tento komplex se váţe na DNA mnohem rychleji neţ cisplatina, pro kterou platí, ţe t50 = 120 ± 6 minut(Bancroft, Lepre, Lippard, 1990). Jak vyplývá z grafu měření kinetiky, komplex NBA-OH-VPA se neváţe na DNA ze 100%. Tento výsledek potvrzuje i experiment zjišťující závislost navázaného mnoţství komplexu (rb) na počátečním, teoretickém mnoţství komplexu v reakci (ri). Pro odstranění nenavázaného komplexu ze vzorků byla pouţita dialýza oproti deionizované vodě, pro zjištění obsahu platiny ve vzorcích byla pouţita AAS a pro zjištění koncentrace DNA ve vzorku byla pouţita UV spektrofotometrie. Výsledky byly získány ze dvou měření a jsou uvedeny v tabulkách (Tab. 1 a 2). Závislost rb na ri není lineární a je zobrazena v grafu (obr. 24). Jedno měření bylo zamítnuto z důvodu nepřesnosti.
44
Obr. 22: Graf kalibrace diferenčního pulzního polarografu.
Obr. 23: Graf kinetiky vazby komplexu NBA-OH-VPA na DNA znázorněn jako procentuální nárůst vázaného komplexu na DNA v čase. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku průměru ze dvou měření.
45
Nedialyzované vzorky vzorek (ri) cDNA (mol.l-1) cPt (teor) (mol.l-1) cPt z AAS(mol.l-1)
rb - první měření
rb - druhé měření
rb průměr
0,01
9,9531 . 10-5
9,953 . 10-7
7,245 . 10-7
0,007
0,007
0,007
0,03
1,0250 . 10
-4
3,075 . 10
-6
2,755 . 10
-6
0,027
0,027
0,027
1,0625 . 10
-4
6,375 . 10
-6
5,784 . 10
-6
0,054
0,055
0,055
1,0875 . 10
-4
8,700 . 10
-6
9,142 . 10
-6
0,084
0,084
0,084
1,0813 . 10
-4
1,081 . 10
-5
1,066 . 10
-5
0,099
0,090
0,094
0,06 0,08 0,10
Tab. 1: Závislost rb na ri u nedialyzovaných vzorků (nenavázaný komplex byl přítomen ve vzorcích). cDNA je koncentrace DNA ve vzorku, cPt (teor) je teoretická koncentrace platiny ve vzorku zjištěna výpočtem a cPt z AAS je skutečná koncentrace platiny ve vzorku zjištěna pomocí AAS.
Dialyzované vzorky vzorek (ri) cDNA (mol.l-1) cPt (teor) (mol.l-1) c Pt z AAS(mol.l-1)
rb - první měření
rb - druhé měření
rb průměr
0,01
4,4531 . 10-5
4,453 . 10-7
3,000 . 10-7
0,007
0,007
0,007
0,03
4,7813 . 10
-5
-6
-6
0,023
0,027
0,025
0,06
4,6875 . 10-5
2,813 . 10-6
1,997 . 10-6
0,043
0,050
0,046
0,08
5,8750 . 10
-5
-6
-6
0,056
0,077
0,067
0,10
6,3594 . 10-5
3,535 . 10-6
0,056
0,076
0,066
1,434 . 10 4,700 . 10
6,359 . 10-6
1,090 . 10 3,315 . 10
Tab. 2: Závislost rb na ri u dialyzovaných vzorků. Význam popisků je stejný jako v tabulce 1.
46
Obr. 24: Graf závislosti rb od ri. Symbol ● představuje nedialyzované vzorky, symbol ■ představuje vzorky dialyzované. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku průměru získaného ze dvou měření.
47
6.2. Meziřetězcové můstky
Bifunkční cytostatické komplexy platiny se mohou navázat i na dvě různá vlákna DNA a vytvořit tak meziřetězcový můstek, který je kovalentně propojí. Takto propojena vlákna se v denaturačním elektroforetickém gelu od sebe neoddělí a putují pomaleji neţ jednotlivá vlákna zdenaturované DNA. Tímto
experimentem
meziřetězcové
můstky.
byla
určena
Linearizovaná
schopnost plazmidová
komplexu DNA
byla
NBA-OH-VPA modifikována
tvořit daným
komplexem a analyzována pomocí elektroforézy v alkalickém denaturačním agarózovém gelu (obr. 25). Zastoupení meziřetězcových můstků se vypočítá podle vztahu
kde
,
no výše uvedený vzorec můţe být pouţit jen tehdy, pokud je intenzita frakce DNA s meziřetězcovými vazbami menší neţ 50%, jinak nejsou splněny podmínky jeho platnosti. Dané podmínky dosaţeno nebylo, tudíţ tento vzorec pouţít pro výpočet nemoţno. Zastoupení meziřetězcových můstků bylo tedy vyjádřeno jako poměr frakce DNA s meziřetězcovými vazbami v procentech k celkovému mnoţství komplexu v reakci a porovnáno s cisplatinou (obr. 26).
48
Obr. 25: Negativ fotografie alkalického denaturačního agarózového gelu po elektroforéze linearizované DNA modifikované komplexem NBA-OH-VPA a cisplatinou. Popis drah: 1: kontrola
5: rb = 0,002
2: rb = 0,0005
6: rb = 0,005
3: rb = 0,0008
7: rb = 0,001 - cisplatina
4: rb = 0,001
49
Obr. 26: Graf závislosti frakce DNA s meziřetězcovými vazbami v procentech k celkovému mnoţství komplexu v reakci. Symbol ● představuje dráhy s komplexem NBA-OH-VPA, symbol ■ představuje dráhu s cisplatinou.
Z grafu vyplývá, ţe obsah meziřetězcových můstků v DNA po modifikaci studovaným komplexem je výrazně závislý na rb. Při porovnání stejných hodnot rb studovaného komplexu a cisplatiny můţeme vidět, ţe komplex NBA-OH-VPA je o něco účinnější při tvorbě meziřetězcových můstků neţ cisplatina. Tento experiment byl z časových důvodů proveden pouze jednou, jeho výsledky jsou tudíţ statisticky neprůkazné a jenom orientační.
6.3. Reakce s thiomočovinou
Thiomočovina reaguje s monofunkčními adukty bifunkčních platinových komplexů, no nereaguje s bifunkčními adukty komplexů na DNA. Proto je moţné ji pouţít pro kvantifikaci obou typů aduktů, které tvoří studovaný komplex NBA-OH-VPA. Zastoupení meziřetězcových můstků v různých časech je zobrazeno v grafu (obr. 27). Ze začátku byly thiomočovinou odstraněny téměř všechny adukty. Po třech hodinách bylo bifunkčních aduktů zhruba 15 aţ 20%. Po 24 hodinách tvořil podíl bifunkčních aduktů necelých 50%. Tento výsledek můţe být porovnán například s transplatinou, která vytvoří po
50
24 hodinách 50% bifunkčních aduktů na dsDNA(Ţákovská
et al., 1998)
. Experiment byl proveden
celkem třikrát, jedno měření bylo zamítnuto z důvodu nepřesnosti.
Obr. 27: Graf závislosti počtu meziřetězcových můstků na čase. Počet meziřetězcových můstků je vyjádřen jako poměr bifunkčních aduktů ke všem aduktům na DNA (bifunkčním i monofunkčním). Výsledky byly získány zprůměrováním dvou měření a chybové úsečky představují směrodatnou odchylku.
51
6.4. Rozvíjení plazmidové DNA
Pro zjištění úhlu rozvinutí připadajícího na jeden adukt Φ je potřeba elektroforeticky nalézt bod ekvivalence, tedy takový stupeň modifikace (rb), kdy superhelikální i relaxovaná forma migrují společně. Výsledky tohoto experimentu pro komplex NBA-OH-VPA a cisplatinu jsou na obrázcích (obr. 28 a 29). Studovaný komplex zvyšuje mobilitu relaxované formy DNA díky zkrácení a zhuštění DNA helixu, podobně jako cisplatina(Cohen
et al., 1979)
. Stupeň
modifikace, při kterém superhelikální i relaxovaná forma migrují společně, byl pro NBA-OHVPA stanoven na rb = 0,05 (dráha 6 na obr. 28) a pro cisplatinu na rb = 0,075 (dráhy 8 a 9 na obr. 29). Úhel Φ byl vypočítán podle vztahu
Ze známého úhlu rozvinutí pro cisplatinu, který činí Φ = -13° ± 1°(Keck,
Lippard, 1992)
byla po
dosazení stupně modifikace vypočtena superhelikální hustota pro pouţitý plazmid σ, která činí σ = -0,05417. Po dosazení této hodnoty a stupně modifikace pro studovaný komplex (pro ri = 0,05 bylo pomocí AAS zjištěno rb = 0,041) do stejného vzorce byl vypočítán úhel rozvinutí pro komplex NBA-OH-VPA, který činí Φ = -23,8° ± 1°, co znamená, ţe komplex NBA-OHVPA rozvíjí plazmidovou DNA mnohem víc neţ cisplatina.
52
Obr. 28: Negativ fotografie nativního agarózového gelu pro detekci rozvíjení plazmidové DNA modifikované komplexem NBA-OH-VPA. Popis drah: 1: kontrola
5: ri = 0,04
9: ri = 0,08
2: ri = 0,01
6: ri = 0,05
10: ri = 0,09
3: ri = 0,02
7: ri = 0,06
11: ri = 0,1
4: ri = 0,03
8: ri = 0,07
12: kontrola
Obr. 29: Negativ fotografie nativního agarózového gelu pro detekci rozvíjení plazmidové DNA modifikované cisplatinou. Popis drah: 1: kontrola
5: rb = 0,04
9: rb = 0,08
2: rb = 0,01
6: rb = 0,05
10: rb = 0,09
3: rb = 0,02
7: rb = 0,06
11: rb = 0,1
4: rb = 0,03
8: rb = 0,07
12: kontrola
53
6.5. Zhášení fluorescence ethidium bromidu
Ethidium bromid je interkalační látka, která se běţně pouţívá jako fluorescentní značka pro zviditelnění DNA při gelových elektroforézách. Kdyţ se na ni posvítí UV světlem, oranţově fluoreskuje a po interkalaci do DNA zvýší svou intenzitu fluorescence zhruba dvacetkrát. Po modifikaci DNA komplexy platiny je struktura DNA narušena a ethidium bromid se jiţ nemůţe účinně interkalovat. Interkalaci brání i přítomnost bifunkčních aduktů(Butour,
Macquet,
1977)
. Tento experiment zkoumal vliv modifikace DNA studovaným
komplexem na intenzitu fluorescence, tedy míru narušení klasické dvoušroubovice DNA a porovnání s cisplatinou. Tt-DNA byla modifikována studovaným komplexem NBA-OH-VPA a cisplatinou se stupni modifikace v rozsahu rb = 0,02 – 0,1. Z grafu (obr. 30) vyplývá, ţe závislost poklesu fluorescence ethidium bromidu na stupni modifikace (rb) danými komplexy je lineární, přičemţ komplex NBA-OH-VPA způsobuje výraznější pokles fluorescence, který je způsoben větší distorzí dvoušroubovice DNA a pravděpodobně vyšším zastoupením bifunkčních aduktů. Experiment byl proveden celkem třikrát, jedno měření bylo zamítnuto z důvodu nepřesnosti.
54
Obr. 30: Graf závislosti intenzity fluorescence od stupně modifikace (r b). Symbol ● představuje vzorky s komplexem NBA-OH-VPA, symbol ■ představuje vzorky s cisplatinou. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku průměru získaného ze dvou měření.
55
6.6. Analýza křivek tání
Analýza křivky tání je metoda pro určení disociačních charakteristik dsDNA při zahřívání. Se stoupající teplotou se dvoušroubovice začne disociovat na jednotlivá vlákna, co se projeví zvýšením specifické absorbance. Teplota, při které je 50% DNA zdenaturováno, se nazývá teplota tání. Bylo zjištěno, ţe teplota tání DNA modifikované platinovými komplexy je ovlivněna hlavně třemi faktory(Ţaludová, Kleinwächter, Brabec, 1996): 1. Destabilizací struktury způsobenou distorzemi po navázání komplexu 2. Stabilizací struktury pomocí meziřetězcových můstků 3. Stabilizací struktury pomocí kladného náboje navázaného komplexu platiny V nízké iontové síle se uplatňují všechny tři vlivy, no ve vyšší iontové síle nadbytek sodných iontů vyruší stabilizaci pomocí kladného náboje platiny, projeví se tedy pouze první dva faktory. Křivky tání DNA modifikované studovaným komplexem na stupně modifikace v intervalu rb = 0,02 – 0,08 byly měřeny ve dvou prostředích lišících se různou koncentrací sodných iontů. V jednom byla ponechána původní 10 mM koncentrace Na+ iontů, ve druhém byla koncentrace Na+ iontů upravena přídavkem NaClO4 na výslednou koncentraci 100 mM. Teploty tání byly určeny pomocí GraphPad Prism 5 jako první derivace naměřených křivek (obr. 31). Jejich hodnoty jsou v tabulce (Tab. 3). Z grafu (obr. 32) je patrné, ţe v obou prostředích o různých iontových silách dochází k zvýšení teploty tání (Tm), z čeho vyplývá, ţe komplex NBA-OH-VPA má stabilizující účinek na DNA. V niţší koncentraci sodných iontů stoupá teplota tání významně uţ při nízkém stupni modifikace. Pro porovnání, u cisplatiny dochází ve vyšší i niţší iontové síle k poklesu teploty tání, cisplatina má tedy destabilizační účinek na DNA(Ţaludová,
Kleinwächter, Brabec, 1996)
Výsledky byly získány zprůměrováním tří měření.
56
Obr. 31: Grafy závislostí absorbance na teplotě DNA modifikované komplexem NBA-OHVPA a jejich první derivace podle teploty.
10 mM Na+
100 mM Na+
Vzorek
Tm [°C]
Vzorek
Tm [°C]
kontrola 0,02 0,04 0,06 0,08
67,5 72,6 75,8 76,7 76,7
kontrola 0,02 0,04 0,06 0,08
85,3 86,3 87,1 86,3 85,6
Tabulka 3: Teploty tání DNA modifikované komplexem NBA-OH-VPA s různými rb při nízké i vysoké iontové síle. 57
Obr. 32: Graf závislosti změny teploty tání DNA na stupni modifikace (rb) komplexem NBAOH-VPA. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku průměru získaného ze tří měření.
58
6.7. Shrnutí výsledků
Výsledky prezentované v předchozích kapitolách jsou shrnuty v tabulce 4. Pro porovnání jsou uvedeny také odpovídající hodnoty parametrů pro cisplatinu.
NBA-OH-VPA
Cisplatina
Vazba na DNA (t50)
16,2 ± 0,8 min
120 ± 6 min
Procento meziřetězcových můstků
vyšší neţ 6
6
Úhel rozvinutí Φ
-23,8 ± 1°
-13° ± 1°
Tm – 10 mM Na+
nárůst
pokles
Tm – 100 mM Na+
nárůst
pokles
Tabulka 4: Shrnutí výsledků
59
7. DISKUZE
Konjugáty
alkylačních
látek
a
histonových
deacetyláz
jsou
slibnou
kategorii
protinádorových léčiv. Do této skupiny patří i konjugáty platinových komplexů s histonovými deacetylázami. Velký počet strukturně odlišných inhibitorů histonových deacetyláz vykazuje silnou protinádorovou aktivitu a současně nízkou toxicitou in vivo ve zvířecích modelech. Jedna z nejznámějších a nejdéle pouţívaných látek, která je schopna inhibovat histonové deacetylázy je kyselina valproová, která byla konjugována s cytostatickým platinovým komplexem NBA (II) za vzniku esterové vazby. Daná sloučenina nese pracovní název NBAOH-VPA a vykazuje řadu slibných vlastností pro účinné protinádorové léčivo. Podle zjištěných výsledků je moţné, ţe se tyto konjugáty stanou protinádorovými léčivy další generace ve své kategorii. Farmakologickým cílem platinových komplexů jsou hlavně celulární proteiny a DNA, přičemţ DNA se povaţuje za hlavní místo působení. Histonové deacetylázy účinkují hlavně na proteiny, no skrz ně nepřímo na DNA, protoţe jejich předpokládaný mechanizmus účinku je epigenetický. Zatímco platinové komplexy atakují přímo báze DNA, histonové deacetylázy působí na proteinový aparát, který s DNA manipuluje. Účinek cytostatických komplexů platiny a histonových deacetyláz se tedy můţe vzájemně potencovat a zvýšit tak terapeutickou účinnost. V této diplomové práci byly studovány strukturní vlastnosti DNA po modifikaci novým komplexem platiny s cílem přispět k objasnění mechanizmu jeho biologického účinku. Významné údaje jsou hlavně charakterizace aduktů a popis konformačních změn DNA, které byly vyvolány navázáním studovaného komplexu. První ze zkoumaných vlastností nového komplexu byla jejich schopnost vázat se na DNA. Výsledky ukazují, ţe v porovnání s cisplatinou je vazba komplexu NBA-OH-VPA na DNA nesmírně rychlá, co je jasnou známkou vyšší reaktivity studovaného komplexu. Tento i další experimenty prokázali, ţe daný komplex se na DNA neváţe kvantitativně, ale jenom přibliţně ze 70 aţ 80 procent, přičemţ na procento vazby má vliv stáří roztoku – čím více času uplynulo od rozpuštění, tím méně komplexu se navázalo na DNA. Byl pozorován i
pozitivní
vliv skladování při
-20°C
na vazebnou
schopnost
tohoto komplexu.
Nejpravděpodobnějším vysvětlením pozorovaných skutečností je vzhledem na jeho reaktivitu tvorba dimerů, tedy ţe daný komplex reaguje sám se sebou za vzniku málo reaktivní aţ nereaktivní sloučeniny, která jiţ nemá schopnost jakkoli se vázat na DNA. Další experimenty byly zaměřeny na charakterizaci strukturních změn, které komplex NBA-OH-VPA vazbou na DNA vyvolává a jejich porovnání se strukturními změnami 60
vyvolanými cisplatinou. Výsledky ukazují, ţe navázáním studovaného komplexu na DNA dochází k významnému lokálnímu rozvinutí. Velkost úhlů rozvinutí je závislá na chemické podstatě ligandů v koordinační sféře platiny a na izomerii daného komplexu. Platí, ţe monofunkční adukty obvykle rozvíjejí DNA méně neţ adukty bifunkční a ţe stericky objemnější ligandy po kovalentním navázání komplexu na DNA podporují další rozvíjení díky interakci s DNA. Komplex NBA-OH-VPA rozvíjí DNA velmi silně a způsobuje velkou lokální distorzi, mnohem větší neţ cisplatina. Tento fakt podporuje i experiment zhášení fluorescence ethidium bromidu, pomocí kterého bylo zjištěno, ţe daný komplex NBA-OHVPA způsobuje rychlejší zhášení a tedy i větší distorze DNA při stejném rb, neţ cisplatina. Další údaje získané pomocí gelové denaturační agarózové elektroforézy naznačují, ţe komplex NBA-OH-VPA tvoří více meziřetězcových můstků neţ cisplatina. I zde je zřejmý vliv objemných ligandů na usnadnění a urychlení uzavírání meziřetězcových můstků díky jejich interakci s DNA. I tak ale většina aduktů zůstává monofunkční i po 24 hodinové inkubaci, jak vyplývá z experimentu. Podle experimentu s thiomočovinou, počet bifunkčních aduktů, které tvoří studovaný komplex, není výrazně vyšší neţ u cisplatiny, no bifunkční adukty tohoto komplexu vznikají o něco rychleji. Studovaný komplex má velký stabilizační efekt na DNA, co bylo zjištěno jeho vlivem na teplotu tání, která byla značně zvýšena. K zvýšení teploty tání DNA došlo i v prostředí s vyšší iontovou silou, které vyrušilo vliv kladného náboje platinového komplexu, z čeho můţeme usuzovat, ţe bifunkční meziřetězcové můstky tvořené komplexem NBA-OH-VPA jsou velice silné a stabilní. Schopnost způsobovat výrazné distorze a současně stabilizovat takto modifikovaný DNA duplex je velice zajímavou vlastností, která můţe být klinicky vyuţita. Jak je patrné z tabulky shrnující dosaţené výsledky (tabulka 4), komplex NBA-OH-VPA je potentnější neţ cisplatina ve většině zkoumaných vlastností. Otázkou zůstává, jaký bude účinek tohoto komplexu in vivo ve zvířecích modelech, kde se projeví jeho další vlastnosti a jestli jeho vysoká reaktivita nebude spíš překáţkou vhodné biodostupnosti. V kaţdém případě jsou konjugáty inhibitorů histonové deacetylázy s platinovými cytostatiky slibnými potenciálními protinádorovými léčivy.
61
8. ZÁVĚR
Cílem této diplomové práce bylo zkoumat interakce DNA se studovaným komplexem platiny NBA-OH-VPA se zaměřením na mechanizmus působení, korelovat získaná data s dostupnými údaji o cytotoxicitě v lidských nádorových buňkách a ze získaných dat vyvodit závěr o vztahu mezi vlivem studovaného komplexu na strukturu DNA a jeho biologickou aktivitou. Studovaný komplex se ve většině experimentů ukázal jako potentnější a účinnější neţ cisplatina, s jejímiţ účinky byl srovnáván. Ze všech jeho vlastností vynikají hlavně jeho vysoká reaktivita a vysoká stabilita meziřetězcových můstků, které jsou pravděpodobně podmíněny jeho stericky objemným ligandem. Lze proto předpokládat, ţe daný typ konjugátů inhibitorů histonové deacetylázy s cytostatickými komplexy platiny najde svoje uplatnění v klinické praxi.
62
9. ABECEDNÍ SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
1.
AFFAN, M.A., M.A. SALAM, Fasihuddin B. AHMAD, Fraser WHITE a Hapipah M. ALI. Organotin(IV) complexes of 2-hydroxyacetophenone-N(4)-cyclohexylthiosemicarbazone (H2dact): Synthesis, spectral characterization, crystal structure and biological studies. Inorganica Chimica Acta. 2012, roč. 387, s. 219-225. ISSN 00201693. DOI: 10.1016/j.ica.2012.01.020. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0020169312000217
2.
ARBUCKLE, Jesse H. a Peter G. MEDVECZKY. The molecular biology of human herpesvirus-6 latency and telomere integration. Microbes and Infection. 2011, roč. 13, 89, s. 731-741. DOI: 10.1016/j.micinf.2011.03.006. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S128645791100089X
3.
ARNESANO, Fabio a Giovanni NATILE. Mechanistic insight into the cellular uptake and processing of cisplatin 30 years after its approval by FDA. Coordination Chemistry Reviews. 2009, roč. 253, 15-16, s. 2070-2081. ISSN 00108545. DOI: 10.1016/j.ccr.2009.01.028. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0010854509000174
4.
BANCROFT, Daniel P., Christopher A. LEPRE a Stephen J. LIPPARD. Platinum-195 NMR kinetic and mechanistic studies of cis- and trans-diamminedichloroplatinum(II) binding to DNA. Journal of the American Chemical Society. 1990, roč. 112, č. 19, s. 6860-6871. DOI: 10.1021/ja00175a020. Dostupné z: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00175a020
5.
BASU, Alakananda, Soumya KRISHNAMURTHY. Cellular Responses to CisplatinInduced DNA Damage. Journal of Nucleic Acids. 2010, roč. 2010, s. 1-16. DOI: 10.4061/2010/201367. Dostupné z: http://www.hindawi.com/journals/jna/2010/201367
6.
BATTY, Nicolas, Gabriel G. MALOUF a Jean Pierre J. ISSA. Histone deacetylase inhibitors as anti-neoplastic agents. Cancer Letters. 2009, roč. 280, č. 2, s. 192-200. DOI: 10.1016/j.canlet.2009.03.013. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0304383509001955
7.
BECK, D.J. a R.R. BRUBAKER. Effect of cis-platinum(II)diamminodichloride on wild type and deoxyribonucleic acid repair deficient mutants of Escherichia coli. Journal of bacteriology. 1973, roč. 116, č. 3, 1247-1252.
8.
BERTINO, Erin M a Gregory A OTTERSON. Romidepsin: a novel histone deacetylase inhibitor for cancer. Expert Opinion on Investigational Drugs. 2011, roč. 20, č. 8, s. 11511158. DOI: 10.1517/13543784.2011.594437. Dostupné z: http://informahealthcare.com/doi/abs/10.1517/13543784.2011.594437
63
9.
BILLECKE, Christine, Susan FINNISS, Laura TAHASH, Cathie MILLER, Tom MIKKELSEN, Nicholas P. FARRELL a Oliver BÖGLER. Polynuclear platinum anticancer drugs are more potent than cisplatin and induce cell cycle arrest in glioma. NeuroOncology. 2006, roč. 8, č. 3, s. 215-226. DOI: 10.1215/15228517-2006-004. Dostupné z: http://neuro-oncology.oxfordjournals.org/content/8/3/215.full.pdf+html
10. BLOMMAERT, F.A., H.C. VAN DIJK-KNIJNENBURG, F.J. DIJT, L. DEN ENGELSE, R.A. BAAN, F. BERENDS a A.M. FICHTINGER-SCHEPMAN. Formation of DNA adducts by the anticancer drug carboplatin: different nucleotide sequence preferences in vitro and in cells. Biochemistry. 1995, roč. 34, č. 26, s. 8474-8480. 11. BRABEC, V a O NOVÁKOVÁ. DNA binding mode of ruthenium complexes and relationship to tumor cell toxicity. Drug Resistance Updates. 2006, roč. 9, č. 3, s. 111122. ISSN 13687646. DOI: 10.1016/j.drup.2006.05.002. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S136876460600025 12. BRABEC, V. a E. PALEČEK. Interaction of nucleic acids with electrically charged surfaces.: Conformational changes in double-helical polynucleotides. Biophysical chemistry. 1976, roč. 4, č. 1, s. 79-92. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0301462276800099 13. BRABEC, V. a M. LENG. DNA interstrand cross-links of transdiamminedichloroplatinum(II) are preferentially formed between guanine and complementary cytosine residues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1993, roč. 90, č. 11, s. 5345-5349. 14. BRABEC, V., K. NEPLECHOVÁ, J. KAŠPÁRKOVÁ a N. FARRELL. Steric control of DNA interstrand cross-link sites of trans platinum complexes: specificity can be dictated by planar nonleaving groups. Journal of biological inorganic chemistry. 2000, roč. 5, č. 3, s. 364-368. Dostupné z: http://link.springer.com/article/10.1007/PL00010665 15. BRABEC, V., O. VRÁNA, O. NOVÁKOVÁ, V. KLEINWÄCHTER, F.P. INTINI, M. COLUCCIA a G. NATILE. DNA adducts of antitumor trans-[PtCl2 (E-imino ether)2]. Nucleic acids research. 1996, roč. 24, č. 2, s. 336-341. Dostupné z: http://nar.oxfordjournals.org/content/24/2/336.long 16. BRABEC, Viktor a Jana KAŠPÁRKOVÁ. DNA Interactions of Novel Platinum Anticancer Drugs. Small Molecule DNA and RNA Binders: From Synthesis to Nucleic Acid Complexes (eds M. Demeunynck, C. Bailly and W. D. Wilson), Weinheim, FRG: WileyVCH Verlag GmbH, 2002, s. 178. DOI: 10.1002/3527601783.ch8. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/3527601783.ch8 17. BRABEC, Viktor, Vladimir KLEINWÄCHTER, Jean-Luc BUTOUR a Neil P. JOHNSON. Biophysical studies of the modification of DNA by antitumour platinum coordination complexes. Biophysical Chemistry. 1990, roč. 35, 2-3, s. 129-141. DOI: 10.1016/03014622(90)80003-P. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/030146229080003P
64
18. BUTOUR, Jean-Luc a Jean-Pierre MACQUET. Differentiation of DNA . Platinum Complexes by Fluorescence. The Use of an Intercalating Dye as a Probe. European Journal of Biochemistry. 1977, roč. 78, č. 2, s. 455-463. DOI: 10.1111/j.14321033.1977.tb11758.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.14321033.1977.tb11758.x 19. CARPENTER, Daniel. Reputation and Power: Organizational Image and Pharmaceutical Regulation at the FDA. Princeton: Princeton University Press, 2010. ISBN 9780691141800856. 20. COBAN, Burak, Ufuk YILDIZ a Abdurrahman SENGUL. Synthesis, characterization, and DNA binding of complexes [Pt(bpy)(pip)]2 and [Pt(bpy)(hpip)]2. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry. 2013, roč. 18, č. 4, s. 461-471. ISSN 0949-8257. DOI: 10.1007/s00775-013-0991-7. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s00775-0130991-7 21. COHEN, G., W. BAUER, J. BARTON a S. LIPPARD. Binding of cis- and transdichlorodiammineplatinum(II) to DNA: evidence for unwinding and shortening of the double helix. Science. 1979, roč. 203, č. 4384, s. 1014-1016. DOI: 10.1126/science.370979. Dostupné z: http://www.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126 22. DE GRAEFF, A., R.J. SLEBOS a S. RODENHUIS. Resistance to cisplatin and analogues: mechanisms and potential clinical implications. Cancer chemotherapy and pharmacology. 1988, roč. 22, č. 4, s. 325-332. 23. DROBNIK, Jaroslav a Petr HORÁČEK. Specific biological activity of platinum complexes contribution to the theory of molecular mechanism. Chemico-Biological Interactions. 1973, roč. 7, č. 4, s. 223-229. ISSN 00092797. DOI: 10.1016/0009-2797(73)90025-2. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0009279773900252 24. EASTMAN, A. a M.A. BARRY. Interaction of trans-diamminedichloroplatinum(II) with DNA: formation of monofunctional adducts and their reaction with glutathione. Biochemistry. 1987, roč. 26, č. 12, s. 3303-3307. 25. EASTMAN, A. Cross-linking of glutathione to DNA by cancer chemotherapeutic platinum coordination complexes. Chemico-biological interactions. 1987, roč. 61, č. 3, s. 241-248. 26. EASTMAN, A. Characterization of the adducts produced in DNA by cisdiamminedichloroplatinum(II) and cis-dichloro(ethylenediamine)platinum(II). Biochemistry. 1983, roč. 22, č. 16, s. 3927-3933. 27. ESTEBAN-FERNÁNDEZ, Diego, Estefanía MORENO-GORDALIZA, Benito CAÑAS, María Antonia PALACIOS a María Milagros GÓMEZ-GÓMEZ. Analytical methodologies for metallomics studies of antitumor Pt-containing drugs. Metallomics. 2010, roč. 2, č. 1, s. 19-38. ISSN 1756-5901. DOI: 10.1039/B911438F. Dostupné z: http://xlink.rsc.org/?DOI=b911438f
65
28. FARRELL, N., Y. QU, L. FENG a B. VAN HOUTEN. Comparison of chemical reactivity, cytotoxicity, interstrand cross-linking and DNA sequence specificity of bis(platinum) complexes containing monodentate or bidentate coordination spheres with their monomeric analogues. Biochemistry. 1990, roč. 29, č. 41, s. 9522-9531. 29. FISHER, R.L., J.T. SANUIK, A.J. GANDOLFI a K. BRENDEL. Toxicity of cisplatin and mercuric chloride in human kidney cortical slices. Human & experimental toxicology. 1994, roč. 13, č. 8, s. 517-523. 30. FUSS, Jill O. a Priscilla K. COOPER. DNA Repair: Dynamic Defenders against Cancer and Aging. PLoS Biology. 2006, roč. 4, č. 6, s. 203. ISSN 1544-9173. DOI: 10.1371/journal.pbio.0040203. Dostupné z: http://biology.plosjournals.org/perlserv/?request=get-document 31. GLOZAK, Michele A., Nilanjan SENGUPTA, Xiaohong ZHANG a Edward SETO. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 2005, roč. 363, s. 15-23. DOI: 10.1016/j.gene.2005.09.010. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S037811190500572X 32. GOLSTEIN, P., D.M. OJCIUS a J.D. YOUNG. Cell death mechanisms and the immune system. Immunological reviews. 1991, roč. 121, č. 1, s. 29-65. 33. GONZALEZ, V.M., M.A. FUERTES, C. ALONSO a J.M. PEREZ. Is cisplatin-induced cell death always produced by apoptosis?. Molecular pharmacology. 2001, roč. 59, č. 4, s. 657-663. Dostupné z: http://molpharm.aspetjournals.org/content/59/4/657.long 34. HAHNEN, Eric, Jan HAUKE, Christian TRÄNKLE, Ilker Y EYÜPOGLU, Brunhilde WIRTH a Ingmar BLÜMCKE. Histone deacetylase inhibitors: possible implications for neurodegenerative disorders. Expert Opinion on Investigational Drugs. 2008, roč. 17, č. 2, s. 169-184. DOI: 10.1517/13543784.17.2.169. Dostupné z: http://www.informapharmascience.com/doi/abs/10.1517/13543784.17.2.169 35. HARDER, H.C. a B. ROSENBERG. Inhibitory effects of anti-tumor platinum compounds on DNA, RNA and protein syntheses in mammalian cells in virtro. International journal of cancer. 1970, roč. 6, č. 2, s. 207-216. 36. HEARN, J.M., I. ROMERO-CANELÓN, B. QAMAR, Z. LIU, I. HANDS-PORTMAN a P.J. SADLER. Organometallic Iridium(III) Anticancer Complexes with New Mechanisms of Action: NCI-60 Screening, Mitochondrial Targeting, and Apoptosis. ACS chemical biology. 2013. (Před elektronickou publikací). 37. HEMMINKI, K. a D.B. LUDLUM. Covalent modification of DNA by antineoplastic agents. Journal of the National Cancer Institute. 1984, roč. 73, č. 5, s. 1021-1028. 38. HUANG, H., L. ZHU, B.R. REID, G.P. DROBNY a P.B. HOPKINS. Solution structure of a cisplatin-induced DNA interstrand cross-link. Science. 1995, roč. 270, č. 5243, s. 18421845.
66
39. CHOUDHARY, C., C. KUMAR, F. GNAD, M. L. NIELSEN, M. REHMAN, T. C. WALTHER, J. V. OLSEN a M. MANN. Lysine Acetylation Targets Protein Complexes and Co-Regulates Major Cellular Functions. Science. 2009, roč. 325, č. 5942, s. 834840. DOI: 10.1126/science.1175371. Dostupné z: http://www.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.1175371 40. CHOY, H., C. PARK a M. YAO. Current Status and Future Prospects for Satraplatin, an Oral Platinum Analogue. Clinical Cancer Research. 2008, roč. 14, č. 6, s. 1633-1638. ISSN 1078-0432. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-07-2176. Dostupné z: http://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/doi/10.1158/1078-0432.CCR-07-2176 41. CHU, G. Cellular responses to cisplatin. The roles of DNA-binding proteins and DNA repair. The Journal of biological chemistry. 1994, roč. 269, č. 2, s. 787-790. Dostupné z: http://www.jbc.org/content/269/2/787.long 42. JOHNSON, N.P., J.D. HOESCHELE a R.O. RAHN. Kinetic analysis of the in vitro binding of radioactive cis- and trans-dichlorodiammineplatinum(II) to DNA. Chemicobiological interactions. 1980, roč. 30, č. 2, s. 151-169. 43. KARTALOU, M. a J.M. ESSIGMANN. Recognition of cisplatin adducts by cellular proteins. Mutation research. 2001, roč. 478, 1-2, s. 1-21. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0027510701001427 44. KAŠPÁRKOVÁ, J., J. ZEHNULOVÁ N. FARRELL a V. BRABEC. DNA interstrand crosslinks of the novel antitumor trinuclear platinum complex BBR3464. Conformation, recognition by high mobility group domain proteins, and nucleotide excision repair. The Journal of biological chemistry. 2002, roč. 277, č. 50, s. 48076-48086. Dostupné z: http://www.jbc.org/content/277/50/48076.long 45. KAŠPÁRKOVÁ, Jana a Viktor BRABEC. Platinové komplexy: Od poškození DNA k léčbě rakoviny. Akademický bulletin. 2001, č. 10, s. 12-14. Dostupné z: http://www.scienceworld.cz/neziva-priroda/platinove-komplexy-od-poskozeni-dna-klecbe-rakoviny-4262/ 46. KECK, M.V. a S.J. LIPPARD. Unwinding of supercoiled DNA by platinum ethidium and related complexes. Journal of the American Chemical Society. 1992, roč. 114, č. 9, s. 3386-3390. 47. KIM, Sung D., Oldřich VRÁNA, Vladimír KLEINWÄCHTER, Katsumi NIKI a Viktor BRABEC. Polarographic Determination of Subnanogram Quantities of Free Platinum in Reaction Mixture with Dna. Analytical Letters. 1990, roč. 23, č. 8, s. 1505-1518. DOI: 10.1080/00032719008052504. Dostupné z: http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00032719008052504 48. KÖPF-MAIER, P. a S.K. MÜHLHAUSEN. Changes in the cytoskeleton pattern of tumor cells by cisplatin in vitro. Chemico-biological interactions. 1992, roč. 82, č. 3, s. 295-316.
67
49. KRASIKOVA, Y. S., N. I. RECHKUNOVA, E. A. MALTSEVA, P. E. PESTRYAKOV, I. O. PETRUSEVA, K. SUGASAWA, X. CHEN, J.-H. MIN a O. I. LAVRIK. Comparative Analysis of Interaction of Human and Yeast DNA Damage Recognition Complexes with Damaged DNA in Nucleotide Excision Repair. Journal of Biological Chemistry. 2013, roč. 288, č. 15, s. 10936-10947. ISSN 0021-9258. DOI: 10.1074/jbc.M112.444026. Dostupné z: http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M112.444026 50. KÜSTER, Tatiana, Nadine LENSE, Fabienne BARNA, Andrew HEMPHILL, Markus K. KINDERMANN, Joachim W. HEINICKE a Carsten A. VOCK. A New Promising Application for Highly Cytotoxic Metal Compounds: η6-Areneruthenium(II) Phosphite Complexes for the Treatment of Alveolar Echinococcosis. Journal of Medicinal Chemistry. 2012, roč. 55, č. 9, s. 4178-4188. ISSN 0022-2623. DOI: 10.1021/jm300291a. Dostupné z: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jm300291a 51. LAI, G.M., R.F. OZOLS, R.C. YOUNG a T.C. HAMILTON. Effect of glutathione on DNA repair in cisplatin-resistant human ovarian cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 1989, roč. 81, č. 7, s. 535-539. Dostupné z: http://jnci.oxfordjournals.org/content/81/7/535.long 52. LEIST, M., B. SINGLE, A.F. CASTOLDI, S. KÜHNLE a P. NICOTERA. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. The Journal of experimental medicine. 1997, roč. 185, č. 8, s. 1481-1486. Dostupné z: http://jem.rupress.org/content/185/8/1481.long 53. LÉVI, F.A., R. ZIDANI, J.M. VANNETZEL, B. PERPOINT, C. FOCAN, R. FAGGIUOLO, P. CHOLLET, C. GARUFI, M. ITZHAKI, L. DOGLIOTTI et al. Chronomodulated versus fixed-infusion-rate delivery of ambulatory chemotherapy with oxaliplatin, fluorouracil, and folinic acid (leucovorin) in patients with colorectal cancer metastases: a randomized multi-institutional trial. Journal of the National Cancer Institute. 1994, roč. 86, č. 21, s. 1608-1617. Dostupné z: http://jnci.oxfordjournals.org/content/86/21/1608.long 54. MAIER, Thomas, Thomas BECKERS, Rolf-peter HUMMEL, Martin FETH, Matthias MULLER, Thomas BAR a Jurgen VOLZ. NYCOMED GMBH. Novel Sulphonylpyrroles as Inhibitors of Hdac S Novel Sulphonylpyrroles [patent]. Spojené Státy Americké. 424/85.4, 20090263353. Uděleno 10.22.2009. Zapsáno 09.08.2006. Dostupné z: http://www.freepatentsonline.com/y2009/0263353.html 55. MANN, B. S., J. R. JOHNSON, M. H. COHEN, R. JUSTICE a R. PAZDUR. FDA Approval Summary: Vorinostat for Treatment of Advanced Primary Cutaneous T-Cell Lymphoma. The Oncologist. 2007, roč. 12, č. 10, s. 1247-1252. DOI: 10.1634/theoncologist.12-10-1247. Dostupné z: http://theoncologist.alphamedpress.org/cgi/doi/10.1634/theoncologist.12-10-1247 56. MARKS, P.A. a W.S. XU. Histone deacetylase inhibitors: Potential in cancer therapy. Journal of Cellular Biochemistry. 2009, roč. 107, č. 4, s. 600-608. DOI: 10.1002/jcb.22185. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/jcb.22185
68
57. MARKS, P.A., V.M. RICHON, R. BRESLOW a R.A. RIFKIND. Histone deacetylase inhibitors as new cancer drugs. Current opinion in oncology. 2001, roč. 13, č. 6, s. 477483. 58. MASTERS, John R.W. a Beate KÖBERLE. Curing metastatic cancer: lessons from testicular germ-cell tumours. Nature Reviews Cancer. 2003, roč. 3, č. 7, s. 517-525. ISSN 1474-175x. DOI: 10.1038/nrc1120. Dostupné z: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nrc1120 59. MATSUMOTO,, M., T. TSUCHIDA a K. KAWAMOTO. Cisplatin-induced cell death in human glioma. International Journal of Oncology. 1997, roč. 11, č. 6, s. 1209-1212. Dostupné z: http://www.spandidos-publications.com/ijo/11/6/1209 60. MATTERN, I.E., L. COCCHIARELLA, C.G. VAN KRALINGEN a P.H.M. LOHMAN. Prophage induction and mutagenecity of a series of anti-tumour platinum(II) and platinum(IV) co-ordination complexes. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 1982, roč. 95, 2-3, s. 79-93. ISSN 00275107. DOI: 10.1016/0027-5107(82)90248-2. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0027510782902482 61. MCA’NULTY, M.M. a S.J. LIPPARD. Consequences of HMG-Domain Protein Binding to Cisplatin-Modified DNA. Nucleic Acids and Molecular Biology. 1995, roč. 9, č. 1, s. 264284. Dostupné z: http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-642-79488-9_13 62. MEIJER, C., N.H. MULDER, H. TIMMER-BOSSCHA, W.J. SLUITER, G.J. MEERSMA a E.G. DE VRIES. Relationship of cellular glutathione to the cytotoxicity and resistance of seven platinum compounds. Cancer research. 1992, roč. 52, č. 24, s. 6885-6889. Dostupné z: http://cancerres.aacrjournals.org/content/52/24/6885.long 63. MONNERET, Claude. Histone deacetylase inhibitors for epigenetic therapy of cancer. Anti-Cancer Drugs. 2007, roč. 18, č. 4, s. 363-370. DOI: 10.1097/CAD.0b013e328012a5db. Dostupné z: http://content.wkhealth.com/linkback/openurl?sid=WKPTLP:landingpage 64. NATARAJAN, G., R. MALATHI a E. HOLLER. Increased DNA-binding activity of cis-1,1cyclobutanedicarboxylatodiammineplatinum(II) (carboplatin) in the presence of nucleophiles and human breast cancer MCF-7 cell cytoplasmic extracts: activation theory revisited. Biochemical pharmacology. 1999, roč. 58, č. 10, s. 1625-1629. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006295299002506 65. PASCOE, J.M. a J.J. ROBERTS. Interactions between mammalian cell DNA and inorganic platinum compounds. I. DNA interstrand cross-linking and cytotoxic properties of platinum(II) compounds. Biochemical pharmacology. 1974, roč. 23, č. 9, s. 13591365.
69
66. PASTORE, A., F. PIEMONTE, M. LOCATELLI, A. LO RUSSO, L.M. GAETA, G. TOZZI a G. FEDERICI. Determination of blood total, reduced, and oxidized glutathione in pediatric subjects. Clinical chemistry. 2001, roč. 47, č. 8, s. 1467-1469. Dostupné z: http://www.clinchem.org/content/47/8/1467.long 67. PÉREZ, J.M., A.G. QUIROGA, El. MONTERO, C. ALONSO a C. NAVARRORANNINGER. A cycloplatinated compound of p-isopropylbenzaldehyde thiosemicarbazone and its chloro-bridged derivative induce apoptosis in cis-DDP resistant cells which overexpress the H-ras oncogene. Journal of inorganic biochemistry. 1999, roč. 73, č. 4, s. 235-243. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0162013499000215 68. PÉREZ, R.P. Cellular and molecular determinants of cisplatin resistance. European journal of cancer. 1998, roč. 34, č. 10, s. 1535-1542. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959804998002275 69. PESTELL, K.E., S.M. HOBBS, J.C. TITLEY, L.R. KELLAND a M.I. WALTON. Effect of p53 status on sensitivity to platinum complexes in a human ovarian cancer cell line. Molecular pharmacology. 2000, roč. 57, č. 3, s. 503-511. Dostupné z: http://molpharm.aspetjournals.org/content/57/3/503.long 70. PEYRONE, Michele. Über die Einwirkung des Ammoniaks auf Platinchlorär. Annalen der Chemie und Pharmacie. 1844, roč. 51, č. 1, s. 1-29. ISSN 00754617. DOI: 10.1002/jlac.18440510102. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/jlac.18440510102 71. PIL, P.M. a S.J. LIPPARD. Specific binding of chromosomal protein HMG1 to DNA damaged by the anticancer drug cisplatin. Science. 1992, roč. 256, č. 5054, s. 234-237. Dostupné z: http://www.sciencemag.org/content/256/5054/234.long 72. POKLAR, N., D.S. PILCH, S.J. LIPPARD, E.A. REDDING, S.U. DUNHAM a K.J. BRESLAUER. Influence of cisplatin intrastrand crosslinking on the conformation, thermal stability, and energetics of a 20-mer DNA duplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996, roč. 93, č. 15, s. 7606-7611. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC38793/ 73. POMPELLA, Alfonso, Athanase VISVIKIS, Aldo PAOLICCHI, Vincenzo De TATA a Alessandro F. CASINI. The changing faces of glutathione, a cellular protagonist. Biochemical Pharmacology. 2003, roč. 66, č. 8, s. 1499-1503. ISSN 00062952. DOI: 10.1016/S0006-2952(03)00504-5. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0006295203005045 74. RAJESWARI, Moganty R. a Aklank JAIN. High - mobility - group chromosomal proteins, HMGA1 as potential tumour markers. Current Science. 2002, roč. 82, č. 7. Dostupné z: http://www.iisc.ernet.in/currsci/apr102002/838.pdf
70
75. RAPIN, Isabelle. Disorders of nucleotide excision repair. Handbook of clinical neurology. 2013, roč. 113, č. 1, s. 1637-1650. DOI: 10.1016/B978-0-444-59565-2.00032-0. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/B9780444595652000320 76. ROBINS, A.B. The binding of platinum ethylenediamine dichloride to proteins, in vitro and in vivo. Chemico-biological interactions. 1982, roč. 38, č. 3, s. 349-356. 77. ROSENBERG, B., L. VAN CAMP, E.B. GRIMLEY a A.J. THOMSON. The inhibition of growth or cell division in Escherichia coli by different ionic species of platinum(IV) complexes. The Journal of biological chemistry. 1967, roč. 242, č. 6, s. 1347-1352. Dostupné z: http://www.jbc.org/content/242/6/1347.long 78. ROSENBERG, BARNETT, LORETTA VAN CAMP a THOMAS KRIGAS. Inhibition of Cell Division in Escherichia coli by Electrolysis Products from a Platinum Electrode. Nature. 1965, roč. 205, č. 4972, s. 698-699. ISSN 0028-0836. DOI: 10.1038/205698a0. Dostupné z: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/205698a0 79. ROSENBERG, BARNETT, LORETTA VANCAMP, JAMES E. TROSKO a VIRGINIA H. MANSOUR. Platinum Compounds: a New Class of Potent Antitumour Agents. Nature. 1969, roč. 222, č. 5191, s. 385-386. ISSN 0028-0836. DOI: 10.1038/222385a0. Dostupné z: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/222385a0 80. SEGAL-BENDIRDJIAN, E. a A. JACQUEMIN-SABLON. Cisplatin resistance in a murine leukemia cell line is associated with a defective apoptotic process. Experimental cell research. 1995, roč. 218, č. 1, s. 201-212. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014482785711482 81. SENGUPTA, Nilanjan a Edward SETO. Regulation of histone deacetylase activities. Journal of Cellular Biochemistry. 2004, roč. 93, č. 1, s. 57-67. DOI: 10.1002/jcb.20179. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/jcb.20179 82. SHAHZAD, Mian M.K., Gabriel LOPEZ-BERESTEIN a Anil K. SOOD. Novel strategies for reversing platinum resistance. Drug Resistance Updates. 2009, roč. 12, č. 6, s. 148152. ISSN 13687646. DOI: 10.1016/j.drup.2009.09.001. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1368764609000508 83. SHARMA, Rajiv P., Dennis R. GRAYSON a David P. GAVIN. Histone deactylase 1 expression is increased in the prefrontal cortex of schizophrenia subjects: Analysis of the National Brain Databank microarray collection. Schizophrenia Research. 2008, roč. 98, 1-3, s. 111-117. DOI: 10.1016/j.schres.2007.09.020. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0920996407004288 84. SPEELMANS, G., W.H. SIPS, R.J. GRISEL, R.W. STAFFHORST, A.M. FICHTINGERSCHEPMAN, J. REEDIJK a B. DE KRUIJFF. The interaction of the anti-cancer drug cisplatin with phospholipids is specific for negatively charged phospholipids and takes place at low chloride ion concentration. Biochimica et biophysica acta. 1996, roč. 1283, č. 1, s. 60-66.
71
85. SUCHÁNKOVÁ, Tereza. Interakce nových asymetrických komplexů platiny s azolovými a izopropylaminovými ligandy s DNA: Vztah k biologické aktivitě. Brno, 2008. Dostupné z: http://is.muni.cz/th/101213/prif_m/?lang=cz. Diplomová práce. Masarykova Univerzita Brno. Vedoucí práce doc. RNDr. Jana Kašpárková, Ph.D. 86. ŠTĚPÁNKOVÁ, Jana. Interakce plazmidové DNA s protinádorově aktivními komplexy kovů v buňkách E. coli. Brno, 2007. Dostupné z: http://is.muni.cz/th/78331/prif_m/diplomova_prace_J._Stepankova.pdf. Diplomová práce. Masarykova Univerzita Brno. Vedoucí práce RNDr. Marie Vojtíšková, CSc. 87. TEUBEN, J.M., C. BAUER, A.H. WANG a J. REEDIJK. Solution structure of a DNA duplex containing a cis-diammineplatinum(II) 1,3-d(GTG) intrastrand cross-link, a major adduct in cells treated with the anticancer drug carboplatin. Biochemistry. 1999, roč. 38, č. 38, s. 12305-12312. Dostupné z: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bi9904757 88. TRZASKA, Stephen. Cisplatin. Chemical & Engineering News [online]. 2005, roč. 83, č. 25 [cit. 2013-04-20]. Dostupné z: http://pubs.acs.org/cen/coverstory/83/8325/8325cisplatin.html 89. VRÁNA, O., V. BRABEC a V. KLEINWÄCHTER. Polarographic studies on the conformation of some platinum complexes: relations to anti-tumour activity. Anti-cancer drug design. 1986, roč. 1, č. 2, s. 95-109. 90. WHEATE, Nial J., Shonagh WALKER, Gemma E. CRAIG a Rabbab OUN. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 2010, roč. 39, č. 35, s. 8113-8127. ISSN 1477-9226. DOI: 10.1039/c0dt00292e. Dostupné z: http://xlink.rsc.org/?DOI=c0dt00292e 91. WHEELER, Richard. The major chromatin structures. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001 [cit. 2013-0426]. Dostupné z: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/02/Chromatin_Structures_cs.png 92. WOOLLINS, J.Derek, Ann WOOLLINS a Barnett ROSENBERG. The detection of trace amounts of trans-Pt(NH3)2Cl2 in the presence of cis-Pt(NH3)2Cl2. A high performance liquid chromatographic application of kurnakow's test. Polyhedron. 1983, roč. 2, č. 3, s. 175-178. ISSN 02775387. DOI: 10.1016/S0277-5387(00)83954-6. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0277538700839546 93. ZEHNULOVÁ, J., J. KAŠPÁRKOVÁ, N. FARRELL a V. BRABEC. Conformation, recognition by high mobility group domain proteins, and nucleotide excision repair of DNA intrastrand cross-links of novel antitumor trinuclear platinum complex BBR3464. The Journal of biological chemistry. 2001, roč. 276, č. 25, s. 22191-22199. Dostupné z: http://www.jbc.org/content/276/25/22191.long
72
94. ZHAN, Y., B. VAN DE WATER, Y. WANG a J.L. STEVENS. The roles of caspase-3 and bcl-2 in chemically-induced apoptosis but not necrosis of renal epithelial cells. Oncogene. 1999, roč. 18, č. 47, s. 6505-6512. Dostupné z: http://www.nature.com/onc/journal/v18/n47/full/1203060a.html 95. ZUPKOVITZ, G., J. TISCHLER, M. POSCH, I. SADZAK, K. RAMSAUER, G. EGGER, R. GRAUSENBURGER, N. SCHWEIFER, S. CHIOCCA, T. DECKER a C. SEISER. Negative and Positive Regulation of Gene Expression by Mouse Histone Deacetylase 1. Molecular and Cellular Biology. 2006, roč. 26, č. 21, s. 7913-7928. DOI: 10.1128/ MCB.01220-06. Dostupné z: http://mcb.asm.org/cgi/doi/10.1128/MCB.01220-06 96. ŢÁKOVSKÁ, Alena, Olga NOVÁKOVÁ, Zdenka BALCÁROVÁ, Ulrich BIERBACH, Nicholas FARRELL a Viktor BRABEC. DNA interactions of antitumor trans[PtCl2(NH3)(quinoline)]. European Journal of Biochemistry. 1998, roč. 254, č. 3, s. 547557. ISSN 0014-2956. DOI: 10.1046/j.1432-1327.1998.2540547.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1046/j.1432-1327.1998.2540547.x 97. ŢALUDOVÁ, R., A. ŢÁKOVSKÁ, J. KAŠPÁRKOVA, Z. BALCÁROVÁ, O. VRÁNA, M. COLUCCIA, G. NATILE a V. BRABEC. DNA modifications by antitumor trans-[PtCl2(Eiminoether)2]. Molecular pharmacology. 1997, roč. 52, č. 3, s. 354-361. Dostupné z: http://molpharm.aspetjournals.org/content/52/3/354.long 98. ŢALUDOVÁ, Renata, Vladimír KLEINWÄCHTER a Viktor BRABEC. The effect of ionic strength on melting of DNA modified by platinum(II) complexes. Biophysical Chemistry. 1996, roč. 60, č. 3, s. 135-142. DOI: 10.1016/0301-4622(96)00010-5. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0301462296000105
73
