UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Fakulta přírodovědecká Katedra fyzikální chemie

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Fakulta přírodovědecká Katedra fyzikální chemie

CHEMILUMINISCENČNÍ DETEKCE KREVNÍCH STOP – FALEŠNĚ POZITIVNÍ VÝSLEDKY

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Vedoucí práce:

Mgr. Martina Bancířová, Dr.

Vypracovala:

Eva Ratajová

Studijní obor:

Management v chemii Olomouc 2012

Bibliografická identifikace: Jméno a příjmení autora:

Eva Ratajová

Název práce:

Chemiluminiscenční detekce krevních stop - falešně pozitivní výsledky

Typ práce:

Bakalářská

Pracoviště:

Katedra fyzikální chemie

Vedoucí práce:


Rok obhajoby práce:

2012

Abstrakt:

Chemiluminiscence

luminolu

je

jednou

z nejpoužívanějších metod k forenzní detekci krevních stop. Práce zjišťuje, jak se liší intenzita chemiluminiscence pro hemoglobin (krevní stopa) a hemoglobin maskovaný desinfekčním prostředkem po nástřiku detekční směsi Bluestar® nebo Weber v roztoku a na suchý vzorek (24 hod po nanesení) - falešně pozitivní výsledky. Detekce byla provedena u vzorků hemoglobinu 1:100,

1:1000,

1:10000,

o zředění 1:10,

1:100000,

1:1000000.

Desinfekční prostředky byly aplikovány v nezředěné formě a o zředění 1:10, 1:100, 1:1000. K měření byl využit Fluoroskan Ascent FL. Klíčová slova:

luminol, chemiluminiscence, Bluestar®, Weber, detekce krevních stop, chlornan sodný

Počet stran:

56

Počet příloh:

0

Jazyk:

čeština

Bibliographical identification: Author’s first name and surname:

Eva Ratajová

Title:

Chemiluminescent blood stain detection – false positive results

Department:

Department of Physical Chemistry

Type of thesis:

Bachelor

Supervisor:


The year of presentation:

2012

Abstract:

Chemiluminescence of luminol is one of the most common methods in the forensic detection of the blood stains. The aim of thesis is to find out how the

chemiluminescent

intensities

differ

for

haemoglobin (blood stain) and haemoglobin covered by the disinfectant after the injection of the detection mixture Bluestar® or Weber in the solution and 24 hours after application – false positive results. The detection was done for the samples of haemoglobin diluted 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000, 1:1000000. The disinfectants were applied both undiluted, and diluted (1:10, 1:100, 1:1000). Fluoroskan

Ascent

FL

was

used

for

the

measurement.

Keywords:

luminol, chemiluminescence, Bluestar®, Weber, blood stain detection, sodium hypochlorite

Number of pages:

56

Number of appendices:

0

Language:

Czech

Prohlašuji, že jsem předloženou bakalářskou práci vypracovala samostatně za použití citované literatury. V Olomouci dne

……………………………

Poděkování Moje poděkování patří vedoucí mé bakalářské práce Mgr. Bancířové Martině, Dr za odborné vedení, připomínky a za pomoc při tvorbě této práce. Také bych chtěla poděkovat svým rodičům za jejich podporu při mém studiu.

OBSAH 1. ÚVOD .................................................................................................................................... 5 2. TEORETICKÁ ČÁST ......................................................................................................... 6 2.1. Luminiscence ................................................................................................................... 6 2.2. Chemiluminiscence ......................................................................................................... 7 2.3. Luminol ........................................................................................................................... 9 2.4. Hemoglobin ................................................................................................................... 12 2.5. Využití luminolu při detekci krevních stop ................................................................... 13 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................. 17 3.1. Cíl experimentální práce ................................................................................................ 17 3.2. Materiál a metody ......................................................................................................... 17 4. VÝSLEDKY A DISKUZE ................................................................................................. 23 4.1. Detekce hemoglobinu .................................................................................................... 23 4.2. Detekce desinfekčních prostředků ................................................................................. 26 4.3. Detekce hemoglobinu maskovaného desinfekčním prostředkem ................................. 31 5. ZÁVĚR ................................................................................................................................ 48 6. SUMMARY ......................................................................................................................... 51

1. ÚVOD Emisi

světla

vznikající

na

základě

určité

chemické

reakce

nazýváme

chemiluminiscence. Chemická látka, která po smíchání s vhodným oxidačním činidlem vykazuje chemiluminiscenci, je luminol. Chemiluminiscence luminolu je využívána ve forenzní chemii k detekci krevních stop. Pokud krevní stopu postříkáme detekční směsí obsahující luminol dojde ke vzniku viditelného modrého světla - chemiluminiscence. Probíhající děj je založen na reakci mezi chemickými látkami - luminolem, který se smíchá s roztokem

obsahující

vodíku a luminol

jsou

peroxid hlavními

vodíku

a

roztokem

komponenty

obsahující

chemické

reakce,

hydroxid. aby

ale

Peroxid došlo

k chemiluminiscenci, musí být reakce katalyzována. V případě krevních důkazů slouží jako katalyzátor železo obsažené v hemoglobinu. Jiným katalyzátorem ovlivňujícím reakci může být sloučenina se silnými oxidačními účinky. Mezi tyto sloučeniny řadíme např. chlornan sodný, manganistan draselný a jód. Tyto sloučeniny se vyskytují běžně v domácnostech ve formě čisticích prostředků, antiseptik, chemických a dezinfekčních roztoků. Čisticí prostředky obsahující tyto silně oxidační látky mohou tedy způsobovat falešně pozitivní výsledky při detekci krevních stop. V této práci budou detekovány za pomoci komerční sady Bluestar® Forensic latent bloodstain reagent (dále uváděn jako Bluestar®) a detekční směsi Weber vzorky hemoglobinu, vzorky desinfekčních prostředků a vzorky hemoglobinu smíchané se čtyřmi desinfekčními prostředky, které obsahují chlornan sodný. Bude sledován vliv desinfekčních prostředků na detekci hemoglobinu po nástřiku Bluestar® a detekční směsi Weber do roztoku a do jamky se vzorkem zaschlým 24 hodin. Výsledné ovlivnění detekce hemoglobinu za účasti desinfekčních a čistících prostředků může být rozdílné, v závislosti na složení, zředění desinfekčních prostředků a koncentraci chlornanu sodného. Dále bude posouzeno v jaké míře se liší samotné intenzity CL pro hemoglobin a hemoglobin maskovaný desinfekčním prostředkem.

5

2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1. Luminiscence Většina molekul látek, které absorbují energii v ultrafialové nebo viditelné oblasti, ji předávají při kolizích ostatním částicím. Řada analyticky významných látek ztrácí tímto způsobem jen část energie a zbytek emituje jako luminiscenční záření. Má-li dojít k luminiscenci, musí molekula nejprve přejít do excitovaného stavu absorpcí záření vhodné vlnové délky. Absorpcí energie může jeden z párových elektronů molekulového orbitalu (zpravidla jeden z elektronu π orbitalu) přejít do prvého excitovaného elektronového singletového stavu S1, ve kterém se jeho výsledný spinový moment nezměnil. Takto excitovaná molekula má zpravidla velmi krátkou dobu života (10-7 až 10-8 s). Přijatou energii pak může předat jiným částicím např. srážkami (nezářivý přechod). Jestliže je však stav S1 relativně stabilní, mohou excitované molekuly přecházet zpět do základního elektronového stavu S0 složitějším mechanizmem. Excitovaná molekula přejde nezářivým přechodem (tzv. vibrační relaxací) na nejnižší, základní vibrační hladinu excitovaného singletového stavu S1. Poté může dojít k fotonové emisi v ultrafialové nebo viditelné části spektra, tj. k fluorescenci, kdy se elektrony vracejí do různých vibračních podhladin základního singletového stavu S0. V jiných případech přejdou elektrony mezisystémovým přechodem (nezářivý přechod) z nejnižšího singletního vibračního stavu S1 na vyšší vibrační hladinu excitovaného tripletového stavu T1, kdy v systému existují dva elektrony se stejným spinem. Protože molekula bude mít nadbytek vibrační energie, přejde nejprve deaktivačním nezářivým přechodem do základního vibračního stavu T1. Tento stav má dlouhou dobu života, neboť přechod

do

S0

je

spinově

zakázaný

a

proto

přechod

elektronu

z tohoto

stavu zpět do základního singletového stavu S0 (do jeho různých vibračních podhladin) tzv. fosforescencí bude velmi závislý na experimentálních podmínkách1. Na obrázku 1 je znázorněn Jablonského diagram, který slouží k popisu zářivých a nezářivých přechodů v molekule při luminiscenci.

6

Obrázek 1: Jablonského diagram

K popisu energetických hladin a přechodů slouží Jablonského diagram. C - chemiluminiscence, F - fluorescence, P - fosforescence, CD - kolizní deaktivace, IC vnitřní konverze, ISC - mezisystémové křížení, S0 - základní singletový stav, S1,S2 excitovaný singletový stav, T1,T2 excitovaný tripletový stav 2.1.1. Dělení luminiscence Rozlišujeme různé druhy luminiscence podle toho, jakým faktorem je způsobena. Emise světla

látkou

může

být

způsobena

světlem

(fotoluminiscence),

chemicky

(chemiluminiscence), teplem (termoluminiscence), zvukem (sonoluminiscence), mechanicky (mechanoluminiscence), organismy),

bioluminiscence

elektrickým

polem

(chemiluminiscence (elektroluminiscence),

produkovaná jaderným

živými zářením

(radioluminiscence)2.

2.2. Chemiluminiscence Z historického hlediska byla chemiluminiscence objevena na základě náhodného pozorování. První zaznamenaná chemiluminiscence byla pozorována kolem r. 1600 v Bologni, kdy amatérský alchymista Vincencio Casciarolo roztavil těžké cihly v domnění, že získá extrakt drahých kovů. Tyto cihly po kalcinaci s uhlíkem a vystavení dennímu světlu produkovaly červené světlo viditelné ve tmě. Pro tento jev se zachoval název Boloňský kámen3. Pro chemiluminiscenční reakci musí být splněny tři základní požadavky:

7

1. Při reakci musí vznikat dostatek energie, aby došlo k excitaci elektronů. Proto musí být reakce exotermní a obvykle je to oxidace. 2. Musí existovat způsob jak tuto energii usměrnit do excitace elektronů. Jestliže se chemická energie ztrácí ve formě tepla jako obvykle, pak se chemiluminiscence neobjevuje. 3. Excitovaný produkt musí být schopný ztrácet svoji energii buď ve formě fotonu, nebo ji převádět na fluoreskující sloučeniny. Přímá emise fotonu z excitovaného produktu obvykle poskytuje krátké záblesky světla, zatímco přenos energie na fluoreskující sloučeniny se většinou projevuje jako dlouhodobá (měřitelná v minutách) světelná emise4. 2.2.1. Dělení chemiluminiscence Chemiluminiscenci dělíme na přímou a nepřímou. Přímá chemiluminiscence je znázorněna v rovnici č. 1: A + B → [I*] → Produkty + hν

(1)

kde A a B jsou reaktanty a [I*] je excitovaný přechodný stav. V mnoha případech je [I*] neúčinný zářič a jeho energie může být předána jiné molekule, která je schopna přijmout excitační energii. Tuto chemiluminiscenci označujeme jako nepřímou (jinak označovanou jako sensitizovanou) a je znázorněna v rovnici č. 2 jako: A + B → [I*] + F → [F*] → F + hν

(2)

Intenzita chemiluminiscence je závislá na rychlosti reakce a účinnosti generování excitovaných stavů. Tento děj popisuje kvantový výtěžek, ФCL, který je definován jako: ФCL = celkové množství emitovaných fotonů / celkové množství absorbovaných fotonů. ФCL je závislý na třech faktorech: na skupině excitovaných produktů ФEX, na skupině reagujících molekul následující správnou chemickou reakci ФR, a na fluorescenčním kvantovém výtěžku ФF. Kvantový výtěžek je definován jako poměr počtu vzniklých a zaniklých částic v porovnání s počtem molů absorbovaných kvant záření. Tuto závislost kvantového výtěžku na faktorech popisuje rovnice č. 3. ФCL = ФEX. ФR. ФF

8

(3)

U většiny analytických metod se měří intenzita chemiluminiscence, která je závislá na účinnosti a rychlosti reakce a je popsána níže v rovnici č. 4: ICL = ФCL (dC/dt)

(4)

kde dC/dt je rychlost reakce. Výtěžek a barva chemiluminiscence jsou ovlivňovány prostředím, v jakém reakce probíhá. Reakce probíhající v bipolárních nebo středně silných aprotických rozpouštědlech v přítomnosti

oxidačního

činidla,

katalyzátoru

a

luminolu

dávají

za

vznik

kyselině 3 aminoftalové, která se nachází v excitovaném stavu a do základního se dostane uvolněním energie v podobě viditelného světla5.

2.3. Luminol Poprvé tuto sloučeninu syntetizoval v r. 1908 německý vědec Schmitz6. V roce 1928 Albrecht poprvé popsal roli luminolu v chemiluminiscenčních reakcích7. Forenzní vědec Specht, popsal roli heminu, železo obsahující derivát hemu, který v reakci s luminolem poskytuje chemickou reakci a přišel tak na potenciální aplikaci luminolu v detekci krevních stop8. Proesher a Moody objasnili chemickou strukturu a reakce luminolu, správně předpověděli keto enol tautomerizaci luminolu v alkalických a kyselých roztocích. Přišli také na to, že i po opakovaném nanesení roztoku luminolu na krevní stopy dochází k chemiluminiscenci9. McGrath stanovil citlivost luminolu na biologické roztoky a to zejména na krev10. Grodsky navrhl směs nazývanou jako Luminol I tvořenou luminolem, uhličitanem sodným, perboritanem sodným a destilovanou vodou. CL směs Luminol I byla jednou z nejpoužívanějších CL směsí používanou vyšetřovateli k detekci krevních stop na místě činu11. Weber navrhl zlepšení, kdy luminol, hydroxid sodný nebo hydroxid draselný a peroxid vodíku jsou rozpuštěny v destilované vodě12. Od těchto raných studií luminolu se stále objevují další pokusy k objasnění reakčního mechanismu, s hlavním přispěním Merényho a jeho spolupracovníků v 90. letech, kteří popsali chemiluminiscenci, excitaci a emitory při chemiluminiscenci luminolu 13. 9

Thornton a Maloney14 shrnuli chemii luminolu z forenzního hlediska v r. 1985, avšak většina jejich argumentů pocházela z Merényho práce15. Luminol je jedním z celosvětově nejpoužívanějším chemiluminiscenčním činidlem, které má využití v analytické a molekulární biologii. Je používán jako základní látka v detekci krevních stop5. 2.3.1. Chemické a fyzikální vlastnosti luminolu Luminol je citlivý na světlo a přítomnost kovových kationtů, většinou je stabilní v rozmezí 8-12 h16. Ve vodném roztoku se nachází v plně protonizované formě, v bazickém roztoku disociuje na monoanion (LH-) a dianion (L2-). Přehled chemických a fyzikálních vlastností luminolu je uveden v následující tabulce (Tabulka 1). 5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazin-dione, název

o-aminoftalazinhydrazid, 3-aminoftalát hydrazid, o-aminoftalid hydrazid

molekulový a strukturní vzorec C8H7N3O2 barva

bíložlutá

bod tání

319-320 °C

molární hmotnost

177,16 g.mol-1

pKa2

15,1 Rozpustný ve vodě při pokojové teplotě a

rozpustnost

koncentraci nižší než 0,1g /100ml Rozpustný v organických rozpouštědlech Výbušný v přítomnosti hořlavých látek, stálý

obecné vlastnosti

za pokojové teploty, citlivý na světlo, v přítomnosti oxidačních látek vzniká emise světla, amfoterní charakter Výpary vzniklé hořením mohou obsahovat

toxicita

toxické látky, nebyly prokázány žádné chronické účinky na člověka

Tabulka 1: Přehled chemických a fyzikálních vlastností luminolu17

10

2.3.2. Chemiluminiscence luminolu Chemiluminiscence luminolu probíhá v několika krocích a je ovlivněna mnoha faktory jako jsou pH, teplota, reaktivní formy chemických látek, které mohou reagovat s luminolem, kovové kationty a hydroxidové ionty. K reaktivním formám chemických látek patří např. halogeny, ozon, anion peroxodisíranu, manganistany, které mají vysoké oxidační účinky. Luminol je v zásaditých roztocích deprotonizován na monodianion a dianion. Deprotonizovaný luminol může být oxidován ferryl porfinovým radikálem nebo také hydroxy ferryl porfinem, čímž dojde ke vzniku diazochinonu. Následně pak dojde k nukleofilní adici hydroperoxidu nebo superoxidového radikálu vzniklého deprotonací peroxidu vodíku na diazochinon. Tato reakce poskytne klíčový meziprodukt α-hydroxyperoxid, jehož vazby jsou velmi slabé. Dojde k reorganizaci molekuly za odštěpení dusíku a ke vzniku 3-aminoftalové kyseliny, která se nachází v excitovaném stavu. Nastane přechod z excitované hladiny na základní hladinu a přebytečná energie je vyzářena v podobě modrého světla o vlnové délce 420 až 455 nm5.

Obrázek 2: Schéma chemiluminiscence luminolu

11

2.4. Hemoglobin

Obrázek 3: Hemová skupina

Hemoglobin je molekula nacházející se v erytrocytech všech obratlovců a bezobratlých. Slouží k přenosu kyslíku v těle, a je také zodpovědný za červenou barvu krve5. Molekula hemoglobinu je tetramer obsahující čtyři globuliny a na ně navázané hemy, z nichž každý sestává z modifikovaného porfyrinového kruhu s navázaným železem (Fe2+). Porfyriny mají za základ porfinový kruh, vzniklý spojením čtyř pyrrolových kruhů. Skupina hemu je znázorněna na obrázku 3, obrázek 4 znázorňuje hemoglobin. Molekula kyslíku se váže na železnatý ion bez jakékoli změny redoxního čísla. Hem se může změnit na hematin, kde je železo v oxidačním stavu III18. Železnaté ionty jsou vázané ve středu porfinového kruhu ve formě koordinačně vázané vazby. Páté koordinační místo je obsazeno histidinem a šesté koordinační místo kyslíkem, vázat se ale mohou i jiné ligandy. V těle člověka je hemoglobin chráněn před denaturací zapouzdřením do červených krvinek a železnatý ion je udržován v základním stavu pomocí enzymatických a neenzymatických procesů. Jakmile se krev nachází mimo organismus, nastává řada degradačních procesů, ve kterých u většiny erytrocytů dojde k hemolýze a u molekul dochází k oxidačně-redukčním reakcím a k hydrolýze. Dojde k degradaci polypeptidické části hemoglobinu a zanikne koordinační vazba mezi histidinem a železem. Nastane spontánní oxidace železa z Fe2+ na Fe3+. V alkalickém prostředí jsou ionty Fe3+ koordinovány s OHskupinou. Tímto procesem vznikne hematin, který obsahuje spíše železité ionty než železné a kyslík je nahrazen hydroxylovou skupinou. 12

Při reakci luminolu a krve je železitá skupina hemu schopna katalyzovat jak rozklad peroxidu vodíku, tak i oxidaci luminolu. K tomuto ději dojde díky oxidaci hydroxy-železitého porfinu na hydroxy-ferylový radikál za odštěpení dvou elektronů5. Hemoglobin je určován v objemové jednotce krve, tedy Hb v erytrocytech i plazmě. Hb je udáván v g/litr nebo v g/100 ml. Hb norma se v lidském těle pohybuje od 125 – 160 g/litr.

2.5. Využití luminolu při detekci krevních stop Luminol při reakcí s hemoglobinem v krvi poskytuje světelnou emisi. Této reakce se využívá při vyšetřování trestných činů při důkazu krevních stop. Již od počátku 20. století byla vynalezena řada postupů a látek k detekci krevních stop. Jako nejúčinnější látka, mající nejlepší detekční limity, specifitu a citlivost se ukázal luminol. K důkazu krevních stop nastříkáme luminol na analyzovanou plochu. Celý děj musí probíhat ve tmě. Při interpretaci výsledků musíme brát ohled na fyzikální a chemickou strukturu podkladu a možnosti výskytu jiných látek, které mohou ovlivnit detekci. Ke dvěma základním CL směsím, které se liší složením základních oxidantů, patří Weberova a Grodského metoda19. Obě tyto metody mají své výhody a nevýhody19. Dnes jsou tyto metody na ústupu a nejvíce je využívána komerční sada Bluestar® 20. 2.5.1. Weberova detekční směs – Luminol II Weber vycházel z poznatků Grodského, který smíchal perboritan sodný, luminol, krev a uhličitan sodný. Ukázalo se, že přidáním perboritanu sodného je reakce značně nestabilní, a proto Weber inovoval tuto reakci nahrazením perboritanu sodného peroxidem vodíku a uhličitan sodný nahradil hydroxidem sodným21. 2.5.2. Bluestar® Forensic latent bloodstain reagent Intenzita jasu u Bluestar forenzního testu by měla být vyšší než za použití běžných detekčních směsí obsahujících luminol. Vykazuje déle trvající chemiluminiscenci, nemá také vliv na strukturu DNA, při jeho použití není zapotřebí naprosté tmy a dosahuje větší spolehlivosti a citlivosti. Bluestar forenzní test je účinný až po dobu 72 hodin a i po opakovaném nanesení má reakce stejný efekt. Složení přípravku Bluestar® je na bázi 13

luminolu. Výhodou použití sady Bluestar® je velmi snadná příprava, kdy se tablety rozpustí v destilované vodě, s takto připraveným roztokem se dá pracovat i po řadu dní. S trochou praxe umožňuje rozpoznat rozdíl mezi krví a falešnými pozitivními výsledky na základě rozdílné barvy, trvání a průběhu luminiscence20. 2.5.3. Faktory ovlivňující použití luminolu Použití je poměrně jednoduché, ale výsledek ovlivňují další faktory: stáří krve, vlastnosti povrchu, na kterém byla krev nalezena, a možné další složky nacházející se na analyzovaném povrchu. Povrchy lze rozdělit do dvou skupin na savé a nesavé. Savé materiály zahrnují podklady s nepravidelnými porézními povrchy, jako je dřevěné obložení, stěny a intersticiální mezery mezi dlaždicemi nebo dřevěné předměty, které vzhledem k rýhám nebo prasklinám na povrchu jsou schopny udržet krev i po intenzivním drhnutí a na dlouhou dobu. Do této skupiny povrchů patří i povrchy s mnohem většími sacími vlastnostmi jako jsou koberce, kožené oděvy, textilní oděvy, deky, atd. Savé materiály představují poměrně snadné povrchy k analýze, protože udržují nerozloženou krev i po mnoho let a poskytují intenzivní reakci s luminolem. Nesavé podklady jako je sklo, linoleum, kov a dlaždice vykazují daleko více problémů při detekci. U těchto povrchů lze snadno smýt veškerou krev a nedojde tak prakticky k žádné reakci s luminolem5. 2.5.3.1. Vliv interferujících částic Řada domácích a průmyslových látek mohou způsobit falešné pozitivní výsledky a ovlivnit tak detekci krevních stop. To může být způsobeno katalytickou aktivitou, redoxními vlastnostmi, nebo jejich chemickou reaktivitou s luminolem nebo s železem v krvi. Interferující částice se mohou nacházet v běžně se vyskytujících materiálech, jako jsou půdy, detergenty, bělidla, koberce, kovové předměty, nářadí, plastové panely, dřevo a zelenina. Nicméně s většinou těchto látek se v praxi nepotkáme. Výjimkou jsou třísloviny obsažené ve dřevě. Nejproblematičtější látky jsou ty, které vyvolávají také chemiluminiscenci a poskytují tak falešné pozitivní výsledky. Tyto látky se dělí do tří skupin: látky vykazující peroxidázovou aktivitu sloučeniny s vysokou oxidační kapacitou k luminolu 14

sloučeniny složitých chemických látek s nedefinovanou afinitou k luminolu První skupina zahrnuje anorganické nebo bioanorganické látky. Ty zapříčiňují oxidaci luminolu a jsou hojně obsaženy například v rostlinách. Patří sem volné kovové ionty (Fe, Mn, Ni, Cr), biologické komplexy mezi kovovými ionty a organickými složkami, enzymy řadící se k oxidoreduktázám jako např. křenová peroxidása5. Do druhé skupiny řadíme sloučeniny se silnými oxidačními účinky. S největší pravděpodobností se na místě činu můžou nacházet nejrůznější bělidla a čisticí prostředky obsahující chlornany (ClO−)22. Chlornany jsou silná oxidační činidla a byly používány k oxidaci luminolu za vzniku chemiluminiscence23. Chemiluminiscence vzniklá reakcí chlornanů s luminolem se časem snižuje, chlornany jsou nestálé a postupně se odpařují z povrchu24,25. Studie Creamera ukazuje, že chlornany ztrácejí schopnost reagovat s luminolem po 16 hod, měření probíhalo bez účasti hemoglobinu24. Eliminovat rušivé účinky chlornanů lze i za pomocí použití Grodského roztoku obsahující glycin při pH 12. Při této vysoké hodnotě pH reagují chlornany rychleji s glycinem než s luminolem22. Další možností jak eliminovat účinek chlornanů je přidání aminů do roztoku luminolu. Aminy rychle reagují s chlornany a takto vzniklé chloraminy nezpůsobují chemiluminiscenci. Aminy mírně snižují chemiluminiscenci krve, ale i tak má reakce dostatečnou CL intenzitu26. Roztok chlornanu sodného je znám jako bělidlo a používá se k dezinfekci. U většiny běžných desinfekčních prostředků, které jsou volně prodejné, je obsah chlornanu sodného do 10%. Ke stabilizaci v roztoku slouží hydroxid sodný. Při reakci s kyselinami může dojít ke vzniku plynného chloru. Při reakci s peroxidem vodíku dochází k bouřlivé reakci za vzniku kyslíku, reakce je uvedena níže27. H2O2(aq) + NaOCl(aq) → NaCl(aq) + H2O(l) + O2(g)

(5)

Obecně mají chlornany žíravé vlastnosti a jsou nebezpečné pro životní prostředí, proto se jejich použití při výrobě čisticích prostředků omezuje27. K největším výrobcům desinfečních prostředků u nás patří firma Bochemie sídlící v Bohumíně. Firma byla založena roku 1904 a v dnešní době zaměstnává 730 pracovníků. 15

Mezi jejich nejznámější výrobek patří SAVO. V této práci byly využívány desinfekční prostředky Savo Original a Savo proti plísním od firmy Bochemie s obsahem chlornanu sodného méně než 5% 28. Do třetí skupiny patří látky, u nichž kvůli jejich komplikovanému složení není přesně známý vliv na chemiluminiscenci. Patří sem např. různé oleje, laky, část automobilových pásů a sedadel nebo lepidla5.

16

3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1. Cíl experimentální práce Práce zjišťuje, jak se liší intenzita chemiluminiscence pro hemoglobin (krevní stopa) a hemoglobin maskovaný desinfekčním prostředkem po nástřiku detekční směsi Bluestar® nebo Weber v roztoku a na suchý vzorek (24 hod po nanesení) - falešně pozitivní výsledky. Dále práce stanovuje vliv desinfekčních prostředků obsahujících chlornan sodný na detekci hemoglobinu v roztoku a 24 hod po nanesení.

3.2. Materiál a metody 3.2.1. Chemikálie Název

Vzorec

M [g/mol]

Výrobce

luminol

C8H7N3O2

177,16

Sigma - Aldrich

peroxid vodíku 3%

H2O2

34,01

Fluka

hydroxid sodný

NaOH

40,00

Lachner

64 000,00

Sigma - Aldrich

lyofilizovaný prášek hemoglobinu Bluestar® Forensic latent

Bluestar

bloodstain reagent Tabulka 2: Seznam použitých chemikálií

Dezinfekční prostředky: Název přípravku:

Savo proti plísním - SPP

Výrobce:

Bochemie s.r.o., Bohumín, Česká republika

Složky přípravku:

voda, chlornan sodný 47 g/kg, hydroxid sodný, chlorid sodný, poly (oxy-1,2-ethanediyl), alfasulfo-omega-(dodecyloxy), sodná sůl

Koncentrace zásobního roztoku:

chlornan sodný 47 g/kg

17

Název přípravku:

Savo original - SO

Výrobce:

Bochemie s.r.o., Bohumín, Česká republika


voda, chlornan sodný 50 g/kg, hydroxid sodný, chlorid sodný



Název přípravku:

WC net energy gel - WN

Výrobce:

Bolton Czechia, spol. s r. o., Česká republika


chlornan sodný 50-150 g/kg, hydroxid sodný, alkyl dimethylamin oxid


chlornan sodný 50-150 g/kg

Název přípravku:

Real gel chlorax - RL

Výrobce:

Zenit, spol. s r.o., Česká republika


laurylsulfát sodný, chlornan sodný 150 g/kg, lauryl dimethylamin oxid, hydroxid sodný



3.2.2. Detekční směsi Weberův roztok Navážíme 8 g hydroxidu sodného (NaOH) a rozpustíme v 0,5 l destilované vody. Získáme 0,4 N roztok. (zásobní roztok A). 10 ml 30% peroxidu vodíku (H2O2) a přidáme jej k 0,49 l destilované vody. Získáme 0,176 M roztok (zásobní roztok B). Navážíme 0,354 g luminolu a necháme rozpustit v 0,0625 l 0,4 N hydroxidu sodného. Získáme roztok o celkovém objemu 0,5 l (0,004 M). (zásobní roztok C). Tyto tři zásobní roztoky skladujeme ve skleněných nebo plastikových nádobách při 4 °C, mimo dosah přímého světla. Testovací roztok připravíme smísením 0,01 l z každého ze tří zásobních roztoků s 0,07 l destilované vody. Získáme 0,1 l pracovního roztoku, který byl ihned použit k měření. Mezi jednotlivými měřeními byl roztok uchováván v lednici při teplotě 4 C5.

18

Bluestar® Forensic latent bloodstain reagent Balení Bluestar obsahuje 8 párů tablet k přípravě 8x125 ml detekčního roztoku. Nejlepších výsledků dosahuje do tří hodin po přípravě. Detekční směs se připraví rozpuštěním bílé a béžové tablety ve125 ml destilované vody. Roztok byl uchováván v lednici při teplotě 4 C. 3.2.3. Přístrojové vybavení Fluoroskan Ascent FL Fluoroskan Ascent FL je mikrodestičkový fluorometr od firmy Thermo Fisher Scientific. Fluoroskan Ascent je vybaven fluorometrickou i luminometrickou detekční technologií. Získaná data byla zpracována pomocí softwaru Fluoroskan Ascent a následně zpracována v tabulkovém procesoru MS Excel. Oblast spektra pro luminiscenční detekci je 270 – 670 nm, detektorem je PMT (photomultiplier tube). Přístroj provádí měření v jednotkách RLU (Relative Light Unit) a umožňuje regulaci teploty v rozsahu: RT +3°C až 45°C. Přístroj je využíván pro měření: teplotních závislostí, antioxidačních vlastností, molekulárních interakcí. Je schopen detekovat ATP (buněčnou, bakteriální), cytotoxicitu a proliferaci buněk.

Obrázek 6: Fluoroskan Ascent FL

19

3.2.4. Pracovní postup měření Všechna měření byla prováděna v mikrotitračních destičkách o 96 jamkách a měřena v přístroji Fluoroskan Ascent FL. Parametry a podmínky pro dané měření byly nastaveny pomocí softwaru Ascent. Teplota byla nastavena na 25 °C (detekce vzorků při pokojové teplotě). Byla měřena změna intenzity v jedné jamce po dobu 1 minuty, jeden bod byl integrován po dobu 20 ns. Jako maximální měřitelná hodnota přístrojem Fluoroskan Ascent FL byla zadána hodnota 6000 RLU. Na začátku měření byl proveden nástřik detekční směsi Weber nebo Bluestar o objemu 50 µl, a to do roztoku a na zaschlé vzorky tří sledovaných systémů (hemoglobin, desinfekční

prostředky,

hemoglobin

a

desinfekční

prostředky)

následně

byl

proveden opakovaný nástřik o objemu 50 µl u vzorků hemoglobinu a desinfekčních prostředků. Měření probíhalo při 25 °C. Suché vzorky byly měřeny 24 hod po nanesení. Každý vzorek byl změřen třikrát a hodnota uvedená do grafu odpovídá průměru těchto tří hodnot. V grafu hlavní vodorovná osa odpovídá zředění, hlavní svislá osa znázorňuje intenzitu CL (RLU) a hloubková osa zobrazuje čas (s). Hemoglobin byl postupně ředěn pomocí destilované vody v poměru 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10 000, 1:100 000, 1:1000 000. Desinfekční prostředek byl měřen nezředěný, a poté byl ředěn destilovanou vodou v poměru 1:10, 1:100, 1: 1000. Jednotlivé vzorky byly přeneseny do jamek mikrotitrační destičky po 50 µl. Chybové úsečky Ke znázornění potenciální velikosti chyby v datové řadě slouží chybové úsečky. Na grafu 1 jsou znázorněny tři datové řady, které odpovídají třem měření téhož vzorku (M1, M2, M3) z nichž byl vypočítán průměr, který je v grafu uveden jako datová řada P. Typ chybové hodnoty byl nastaven na 10 %. Vzhledem k velkému počtu grafů je uveden pouze jeden vzorový příklad chybových úseček.

20

Graf 1: Potenciální velikost chyby

3.2.4.1. Úprava vzorků Hemoglobin V krvi dospělého člověka se obsah hemoglobinu pohybuje v rozmezí 125 – 160 g/l29. Při přípravě zásobního roztoku hemoglobinu bylo počítáno s hodnotou 160 g/l. Roztok hemoglobinu byl připraven rozpuštěním 1,28 g hemoglobinu v 8 ml destilované vody. Takto získaný roztok hemoglobinu byl postupně ředěn destilovanou vodou pomocí mikropipet v poměru 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10 000, 1:100 000, 1:1000 000. Do mikrotitrační destičky byl hemoglobin o zředění 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10 000, 1:100 000, 1:1000 000 napipetován o objemu 50 µl a to do 18 jamek. Vždy tři jamky o stejné hodnotě zředění. Mokré a suché vzorky hemoglobinu byly postupně detekovány pomocí detekční směsi Weber a Bluestar® s nástřikem 50 µl. Detekce probíhala s opakovaným nástřikem detekčního činidla o objemu 50 µl. Vzorky byly měřeny v roztoku a zaschlé po dobu 24 hod při pokojové teplotě. Desinfekční prostředky Vzorky čtyř desinfekčních prostředků byly měřeny v nezředěné formě a dále byly připraveny vzorky ředěním destilovanou vodou v poměru 1:10, 1:100 a 1:1000 o objemu 50 µl. Vzorky desinfekčních prostředků o objemu 50 µl byly přeneseny do 12 jamek

21

mikrotitrační destičky. Dále byl proveden nástřik detekční směsi Weber nebo Bluestar o objemu 50 µl. Po dokončení měření byl proveden opakovaný nástřik detekční směsi o objemu 50 µl. Tento postup byl rovněž použit u suchých vzorků. Vzorky byly měřeny v roztoku a zaschlé po dobu 24 hod při pokojové teplotě. Hemoglobin a desinfekční prostředky Do 6 řad o 3 jamkách mikrotitrační destičky byly přeneseny vzorky hemoglobinu o zředění A -1:10, B -1:100, C - 1:1000, D -1:10 000, E - 1:100 000 a F - 1:1000 000 a o objemu 50 µl. Ke každému zředění hemoglobinu byl přidán desinfekční prostředek nezředěný a o zředění 1:10, 1:100 a 1:1000 o objemu 50 µl. Dále byl proveden nástřik detekční směsi Weber nebo Bluestar

o objemu 50 µl. Tento postup byl rovněž použit u

suchých vzorků. V případě dalších tří desinfekčních prostředků byl postup měření stejný. Pro jednotlivá zředění hemoglobinu jsou uvedeny zkratky. Písmena označená hvězdičkou značí vzorek ve formě roztoku. Písmena neoznačená hvězdičkou značí suchý vzorek. Označení vzorků hemoglobinu Suchý vzorek

Zředění

hemoglobinu

hemoglobinu

A

1:10

*A

B

1:100

*B

C

1:1000

*C

D

1:10 000

*D

E

1:100 000

*E

F

1:1000 000

*F

Roztok hemoglobinu

Tabulka 3: Zkratky použité pro jednotlivá zředění hemoglobinu

22

4. VÝSLEDKY A DISKUZE 4.1. Detekce hemoglobinu Po nástřiku detekční směsi Weber a Bluestar

do roztoku obsahujícího hemoglobin

o zředění 1:10 byl patrný v obou případech pokles intenzity CL. U hemoglobinu o zředění 1:100, 1:1000 po nástřiku obou detekčních směsí byla intenzita CL stejná a přesahovala hodnot 6000 RLU po celou dobu měření. U hemoglobinu o zředění 1:10 000 až 1:1000 000 byl naměřen rozdíl mezi detekční směsí Weber a Bluestar intenzita CL po nástřiku Bluestar detekční směsi u hemoglobinu o zředění 1:10 000 o 55% nižší, u hemoglobinu o zředění 1:100 000 o 97% nižší a u hemoglobinu o zředění 1:1000 000 o 98% nižší než u stejných vzorků po nástřiku detekční směsi Weber. Po nástřiku detekční směsi Weber a Bluestar

do suchého vzorku byl patrný rozdíl

v intenzitě CL už od zředění hemoglobinu 1:10. Po 1 minutě měření byla intenzita CL po nástřiku Bluestar u hemoglobinu o zředění 1:100 o 13% nižší a u hemoglobinu o zředění 1:1000 o 55% nižší, u hemoglobinu o zředění 1:10 000 o 70% nižší, u hemoglobinu o zředění 1:100 000 o 52% nižší a u hemoglobinu o zředění 1:1000 000 o 53% nižší než u stejných vzorků po nástřiku detekční směsi Weber. Pokud porovnáváme intenzitu CL po nástřiku detekční směsi do roztoku a u suchých vzorků, po 1 minutě měření je patrný pokles hodnot RLU u všech suchých vzorků. U Bluestar

průměru ke snížení intenzity CL o 66% a u detekční

směsi Weber došlo v průměru ke snížení intenzity CL o 71% oproti vzorkům v roztoku. Při provedení opakovaného nástřiku detekční směsi Weber a Bluestar měřených vzorků hemoglobinu ke značnému poklesu intenzity CL. Na grafech

2 - 5 je znázorněna závislost chemiluminiscenční intenzity na čase

po nástřiku detekční směsi Weber a Bluestar

do roztoku hemoglobinu (*A, *B, *C, *D, *E,

*F) a do suchého vzorku hemoglobinu (A, B, C, D, E, F). Pro jednotlivá zředění hemoglobinu jsou uvedeny zkratky. Písmena označená hvězdičkou značí vzorek ve formě roztoku. Písmena neoznačená hvězdičkou značí suchý vzorek. Ředění hemoglobinu a označení je uvedeno v tabulce 3.

23

Graf 2: Detekce hemoglobinu - I. nástřik

Na grafu 2 je znázorněna závislost intenzity CL na čase po nástřiku detekční směsi Bluestar do roztoku hemoglobinu (*A, *B, *C, *D, *E, *F) a do suchého vzorku hemoglobinu (A, B, C, D, E, F). Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

Graf 3: Detekce hemoglobinu - II. nástřik

Na grafu 3 je znázorněna závislost intenzity CL na čase po opakovaném nástřiku detekční směsi Bluestar

do roztoku hemoglobinu (*A, *B, *C, *D, *E, *F) a do suchého vzorku

hemoglobinu (A, B, C, D, E, F). Ředění hemoglobinu viz tabulka 3. 24

Graf 4: Detekce hemoglobinu - I. nástřik

Na grafu 4 je znázorněna závislost intenzity CL na čase po nástřiku detekční směsi Weber do roztoku hemoglobinu (*A, *B, *C, *D, *E, *F) a do suchého vzorku hemoglobinu (A, B, C, D, E, F). Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

Graf 5: Detekce hemoglobinu - II. nástřik

Na grafu 5 je znázorněna závislost intenzity CL na čase po opakovaném nástřiku detekční směsi Weber do roztoku hemoglobinu (*A, *B, *C, *D, *E, *F) a do suchého vzorku hemoglobinu (A, B, C, D, E, F). Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

25

4.2. Detekce desinfekčních prostředků Výsledky ukazují vysokou intenzitu CL na počátku reakce přesahující hodnoty 6000 RLU u většiny vzorků a rychlý průběh vyhasínání s použitím detekční směsi Weber i Bluestar . Při opakovaném nástřiku byl naměřen u všech vzorků pokles intenzity CL. Intenzita CL nezředěného suchého vzorku Real gelu chlorax po nástřiku detekční směsi Bluestar

a Weber dosahovala vyšších hodnot, po 1 minutě měření byla intenzita CL 449

RLU po nástřiku detekční směsi Bluestar

(graf 14) a 685 RLU po nástřiku detekční směsi

Weber (graf 16). Intenzita CL roztoku WC net energy gel o zředění 1:1000 po nástřiku detekční směsi Weber dosahovala po 1 minutě měření 574 RLU (graf 20). Intenzita CL roztoku Sava original o zředění 1:1000 po nástřiku detekční směsi Weber dosahovala po 1 minutě měření 648 RLU (graf 8). Pokud jsou porovnány intenzity CL hemoglobinu a desinfekčních prostředků po nástřiku detekční směsi Weber i Bluestar

je vidět jiný průběh intenzity CL v závislosti

na čase. U hemoglobinu se intenzity CL liší v závislosti na zředění hemoglobinu. Nejvyšší intenzity CL byly naměřeny u hemoglobinu o zředění 1:10, 1:100, 1:1000. U jednotlivých zředění hemoglobinu je vidět z grafů plynulý průběh intenzity CL, intenzita CL je měřitelná i v čase detekce 60 s. V případě detekce desinfekčních prostředků se intenzity CL ve většině případů neliší v závislosti na zředění desinfekčního prostředku. Na počátku reakce byly naměřeny hodnoty přesahující 6000 RLU u většiny vzorků. Intenzita CL nebyla ve většině případů měřitelná po 30 s detekce, intenzita CL poté dosahovala nulových hodnot. Na grafech 6 - 21 je znázorněna závislost intenzity CL na čase po nástřiku detekční směsi Weber a Bluestar

– Sava

original, Sava proti plísním, Real gelu chlorax a WC net energy gelu. Pro jednotlivé desinfekční prostředky jsou uvedeny zkratky. Písmena označená hvězdičkou značí vzorek ve formě roztoku. Písmena neoznačená hvězdičkou značí suchý vzorek.

26

Savo original (SO)

Graf 6: Detekce SO - I. nástřik

Graf 7: Detekce SO - II. nástřik

Závislost intenzity CL na čase po nástřiku detekční směsi Bluestar

do roztoku Sava original

(*SO, *1:10 SO, *1:100 SO, *1:1000 SO) a do suchého vzorku Sava original (SO, 1:10 SO, 1:100 SO, 1:1000 SO) (graf 6) a po opakovaném nástřiku detekční směsi Bluestar

Graf 8: Detekce SO - I. nástřik

(graf 7).

Graf 9: Detekce SO – II. nástřik

Závislost intenzity CL na čase po nástřiku detekční směsi Weber do roztoku Sava original (*SO, *1:10 SO, *1:100 SO, *1:1000 SO) a do suchého vzorku Sava original (SO, 1:10 SO, 1:100 SO, 1:1000 SO) (graf 8) a po opakovaném nástřiku detekční směsi Weber (graf 9).

27

Savo proti plísním (SPP)

Graf 10: Detekce SPP - I. nástřik

Graf 11: Detekce SPP - II. nástřik


do roztoku Sava proti

plísním (*SPP, *1:10 SPP, *1:100 SPP, *1:1000 SPP) a do suchého vzorku Sava proti plísním (SPP, 1:10 SPP, 1:100 SPP, 1:1000 SPP) (graf 10) a po opakovaném nástřiku detekční směsi Bluestar

(graf 11).

Graf 12: Detekce SPP - I. nástřik

Graf 13: Detekce SPP - II. nástřik

Závislost intenzity CL na čase po nástřiku detekční směsi Weber do roztoku Sava proti plísním (*SPP, *1:10 SPP, *1:100 SPP, *1:1000 SPP) a do suchého vzorku Sava proti plísním (SPP, 1:10 SPP, 1:100 SPP, 1:1000 SPP) (graf 12) a po opakovaném nástřiku detekční směsi Weber (graf 13). 28

Real gel chlorax (RL)

Graf 14: Detekce RL - I. nástřik

Graf 15: Detekce RL - II. nástřik


do roztoku Real gelu

chlorax (*RL, *1:10 RL, *1:100 RL, *1:1000 RL) a do suchého vzorku Real gelu chlorax (RL, 1:10 RL, 1:100 RL, 1:1000 RL) (graf 14) a po opakovaném nástřiku detekční směsi Bluestar (graf 15).

Graf 16: Detekce RL - I. nástřik

Graf 16: Detekce RL - II. nástřik

Závislost intenzity CL na čase po nástřiku detekční směsi Weber do roztoku Real gelu chlorax (*RL, *1:10 RL, *1:100 RL, *1:1000 RL) a do suchého vzorku Real gelu chlorax (RL, 1:10 RL, 1:100 RL, 1:1000 RL) (graf 16) a po opakovaném nástřiku detekční směsi Weber (graf 17). 29

WC net energy gel (WN)

Graf 18: Detekce WN - I. nástřik

Graf 19: Detekce WN - II. nástřik


do roztoku WC netu

(*WN, *1:10 WN, *1:100 WN, *1:1000 WN) a do suchého vzorku WC netu (WN, 1:10 WN, 1:100 WN, 1:1000 WN) (graf 18) a po opakovaném nástřiku detekční směsi Bluestar

(graf

19).

Graf 20: Detekce WN - I. nástřik

Graf 21: Detekce WN - II. nástřik

Závislost intenzity CL na čase po nástřiku detekční směsi Weber do roztoku WC netu (*WN, *1:10 WN, *1:100 WN, *1:1000 WN) a do suchého vzorku WC netu (WN, 1:10 WN, 1:100 WN, 1:1000 WN) (graf 20) a po opakovaném nástřiku detekční směsi Weber (graf 21).

30

4.3. Detekce hemoglobinu maskovaného desinfekčním prostředkem Krevní stopy, které jsou zředěné více jak 1:1000 se stávají neviditelné. Právě v těchto případech a v případech, kdy krevní stopy jsou zaschlé, se nejvíce k jejich detekci využívá detekční směsi Weber a Bluestar . Pokud na místě činu dojde k omytí krevních stop desinfekčními prostředky může dojít ke špatné interpretaci výsledků. Do jaké míry a jak dlouhou dobu mohou desinfekční prostředky obsahující chlornan sodný ovlivnit detekci hemoglobinu je zobrazeno na následujících grafech 22 - 53. Vliv desinfekčních prostředků na detekci hemoglobinu byl zjevný ve všech případech. Nejpatrnější vliv měly desinfekční prostředky u zředění hemoglobinu nad 1:100, kdy se snižuje koncentrace hemoglobinu a samotná intenzita CL po nástřiku detekční směsi Weber a Bluestar

do roztoku a do suchého vzorku hemoglobinu klesá. V těchto případech byly

naměřeny hodnoty přesahující 6000 RLU na počátku reakce a došlo k rychlému vyhasínání. V případě některých suchých vzorků došlo navíc k poklesu intenzity CL po nástřiku detekční směsi Weber i Bluestar , která byla nejvíce patrná u vzorků obsahující hemoglobin s desinfekčním prostředkem o zředění 1:1000. U hemoglobinu o zředění 1:10 a 1:100, který je ve směsi s desinfekčním prostředkem o zředění 1:10, 1:100 a 1:1000 se v některých případech projevuje podobný průběh chemiluminiscence jako při detekci samotného hemoglobinu. Patrný rozdíl mezi detekční směsí Weber a Bluestar® při detekci hemoglobinu maskovaného desinfekčním prostředkem nebyl zaznamenán. Sloupce označené písmeny *A, *B, *C, *D, *E, *F a A, B, C, D, E, F mající červenou barvu, znázorňují hemoglobin.

31

4.3.1. Detekce hemoglobinu maskovaného Savem original

Graf 22: Detekce hemoglobinu maskovaného Savem original

Na grafu 22 je znázorněn vliv Sava original na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do roztoku se směsí hemoglobinu *A a *SO, do roztoku se směsí hemoglobinu *B a *SO, do roztoku se směsí hemoglobinu *C a *SO. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 23 je znázorněn vliv Sava original na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do roztoku se směsí hemoglobinu *D a *SO, do roztoku se směsí hemoglobinu *E a *SO, do roztoku se směsí hemoglobinu *F a *SO. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3. 32


Na grafu 24 je znázorněn vliv Sava original na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu A a SO, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu B a SO, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu C a SO. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 25 je znázorněn vliv Sava original na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu D a SO, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu E a SO, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu F a SO. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

33


Na grafu 26 je znázorněn vliv Sava original na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do roztoku se směsí hemoglobinu *A a *SO, do roztoku se směsí hemoglobinu *B a *SO, do roztoku se směsí hemoglobinu *C a *SO. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 27 je znázorněn vliv Sava original na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do roztoku se směsí hemoglobinu *D a *SO, do roztoku se směsí hemoglobinu *E a *SO, do roztoku se směsí hemoglobinu *F a *SO. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

34


Na grafu 28 je znázorněn vliv Sava original na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu A a SO, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu B a SO, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu C a SO. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 29 je znázorněn vliv Sava original na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu D a SO, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu E a SO, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu F a SO. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

35

4.3.2. Detekce hemoglobinu maskovaného Savem proti plísním

Graf 30: Detekce hemoglobinu maskovaného Savem proti plísním

Na grafu 30 je znázorněn vliv Sava proti plísním na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do roztoku se směsí hemoglobinu *A a *SPP, do roztoku se směsí hemoglobinu *B a *SPP, do roztoku se směsí hemoglobinu *C a *SPP. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 31 je znázorněn vliv Sava proti plísním na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do roztoku se směsí hemoglobinu *D a *SPP, do roztoku se směsí hemoglobinu *E a *SPP, do roztoku se směsí hemoglobinu *F a *SPP. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3. 36


Na grafu 32 je znázorněn vliv Sava proti plísním na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu A a SPP, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu B a SPP, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu C a SPP. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 33 je znázorněn vliv Sava proti plísním na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu D a SPP, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu E a SPP, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu F a SPP. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

37


Na grafu 34 je znázorněn vliv Sava proti plísním na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do roztoku se směsí hemoglobinu *A a *SPP, do roztoku se směsí hemoglobinu *B a *SPP, do roztoku se směsí hemoglobinu *C a *SPP. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 35 je znázorněn vliv Sava proti plísním na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do roztoku se směsí hemoglobinu *D a *SPP, do roztoku se směsí hemoglobinu *E a *SPP, do roztoku se směsí hemoglobinu *F a *SPP. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

38


Na grafu 36 je znázorněn vliv Sava proti plísním na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu A a SPP, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu B a SPP, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu C a SPP. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 37 je znázorněn vliv Sava proti plísním na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu D a SPP, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu E a SPP, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu F a SPP. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

39

4.3.3. Detekce hemoglobinu maskovaného Real gelem chlorax

Graf 38: Detekce hemoglobinu maskovaného Real gelem chlorax

Na grafu 38 je znázorněn vliv Real gelu chlorax na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do roztoku se směsí hemoglobinu *A a *RL, do roztoku se směsí hemoglobinu *B a * RL, do roztoku se směsí hemoglobinu *C a * RL. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 39 je znázorněn vliv Real gelu chlorax na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do roztoku se směsí hemoglobinu *D a *RL, do roztoku se směsí hemoglobinu *E a * RL, do roztoku se směsí hemoglobinu *F a * RL. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3. 40


Na grafu 40 je znázorněn vliv Real gelu chlorax na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu A a RL, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu B a RL, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu C a RL. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 41 je znázorněn vliv Real gelu chlorax na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu D a RL, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu E a RL, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu F a RL. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

41


Na grafu 42 je znázorněn vliv Real gelu chlorax na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do roztoku se směsí hemoglobinu *A a *RL, do roztoku se směsí hemoglobinu *B a * RL, do roztoku se směsí hemoglobinu *C a * RL. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 43 je znázorněn vliv Real gelu chlorax na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do roztoku se směsí hemoglobinu *D a *RL, do roztoku se směsí hemoglobinu *E a * RL, do roztoku se směsí hemoglobinu *F a * RL. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

42


Na grafu 44 je znázorněn vliv Real gelu chlorax na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu A a RL, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu B a RL, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu C a RL. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 45 je znázorněn vliv Real gelu chlorax na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu D a RL, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu E a RL, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu F a RL. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

43

4.3.4. Detekce hemoglobinu maskovaného WC net energy gelem

Graf 46: Detekce hemoglobinu maskovaného WC net energy gelem

Na grafu 46 je znázorněn vliv WC net energy gelu na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do roztoku se směsí hemoglobinu *A a *WN, do roztoku se směsí hemoglobinu *B a * WN, do roztoku se směsí hemoglobinu *C a * WN. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 47 je znázorněn vliv WC net energy gelu na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do roztoku se směsí hemoglobinu *D a *WN, do roztoku se směsí hemoglobinu *E a * WN, do roztoku se směsí hemoglobinu *F a * WN. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3. 44


Na grafu 48 je znázorněn vliv WC net energy gelu na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu A a WN, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu B a WN, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu C a WN. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 49 je znázorněn vliv WC net energy gelu na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Bluestar® do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu D a WN, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu E a WN, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu F a WN. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

45


Na grafu 50 je znázorněn vliv WC net energy gelu na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do roztoku se směsí hemoglobinu *A a *WN, do roztoku se směsí hemoglobinu *B a * WN, do roztoku se směsí hemoglobinu *C a * WN. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 51 je znázorněn vliv WC net energy gelu na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do roztoku se směsí hemoglobinu *D a *WN, do roztoku se směsí hemoglobinu *E a * WN, do roztoku se směsí hemoglobinu *F a * WN. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

46


Na grafu 52 je znázorněn vliv WC net energy gelu na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu A a WN, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu B a WN, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu C a WN. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.


Na grafu 53 je znázorněn vliv WC net energy gelu na intenzitu CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu A a WN, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu B a WN, do jamky se zaschlou směsí hemoglobinu C a WN. Ředění hemoglobinu viz tabulka 3.

47

Na základě výsledků je možné stanovit, jak se liší intenzity CL pro hemoglobin, desinfekční prostředek a hemoglobin maskovaný desinfekčním prostředkem. Výsledky této práce jsou znázorněny na grafech 2 – 53. Detekce hemoglobinu byla prováděna pomocí detekční směsi Weber a Bluestar® na vzorcích hemoglobinu o zředění 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10 000, 1:100 000 a 1:1000 000. Intenzity CL při detekci hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber a Bluestar® měly rovnoměrný charakter, docházelo k postupnému generování reaktivních forem působících na luminol a u všech vzorků hemoglobinu byla intenzita CL měřitelná i v čase detekce 60 s. Se snižující koncentrací hemoglobinu docházelo ke snížení intenzity CL v závislosti na čase. U zaschlých vzorků došlo ke snížení intenzity CL. Po 1 minutě detekce byla intenzita CL po nástřiku Bluestar® o 70% nižší, u hemoglobinu o zředění 1:100 000 o 52% nižší a u hemoglobinu o zředění 1:1000 000 o 53% nižší než u stejných vzorků po nástřiku detekční směsí Weber. V další fázi experimentu byly detekovány desinfekční prostředky obsahujících chlornan sodný, Savo original, Savo proti plísním, Real gel chlorax a WC net energy gel. Desinfekční prostředky byly aplikovány v nezředěné formě a o zředění 1:10, 1:100 a 1:1000, dále proběhl nástřik detekční směsi Weber a Bluestar® do roztoku nebo do suchého vzorku. Téměř u všech desinfekčních prostředků byly naměřeny shodné výsledky, a to přesah 6000 RLU na počátku reakce a následný rychlý průběh vyhasínání. Ve většině případu nebyla intenzita CL měřitelná po 30 s detekce. Nejvyšší hodnota intenzity CL po nástřiku detekční směsi Weber byla naměřena po 1 minutě detekce u nezředěného suchého vzorku Real gelu, a to 685 RLU. Podle studie Creamera došlo k vypaření chlornanů po 16 hod od nanesení24. V této studii u většiny vzorků nedošlo k vypaření ani po 24 hod od nanesení vzorku. Rychlost vypařování mohla být ovlivněna nedostatečným větráním a na přitažlivých silách působících mezi částicemi desinfekčního prostředku. V závěrečné fázi experimentu byl pozorován vliv desinfekčních prostředků na intenzitu CL při detekci hemoglobinu. V systému hemoglobin – desinfekční prostředek došlo po nástřiku detekční směsi Weber a Bluestar® do roztoku a do suchého vzorku ve většině případů k přesahu 6000 RLU na počátku reakce a následným rychlým vyhasínáním. Desinfekční prostředky měly rušivý vliv na detekci hemoglobinu. Nejmenší vliv desinfekčních prostředků na intenzitu CL při detekci roztoku hemoglobinu byl naměřen u hemoglobinu o zředění 1:10, 1:100. 48

5. ZÁVĚR Práce zjišťuje, jak se liší intenzita chemiluminiscence pro hemoglobin (krevní stopa) a hemoglobin maskovaný desinfekčním prostředkem po nástřiku detekční směsi Bluestar® nebo Weber v roztoku a na suchý vzorek (24 hod po nanesení) - falešně pozitivní výsledky. Dále zjistit působení desinfekčních prostředků na detekci hemoglobinu v roztoku a ve vzorku 24 hod po nanesení. Byly připraveny vzorky hemoglobinu o zředění 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10 000, 1:100 000 a 1:1000 000 a vzorky desinfekčních prostředků Savo original, Savo proti plísním, Real gel chlorax a WC net energy gel. Desinfekční prostředky byly aplikovány v nezředěné formě a o zředění 1:10, 1:100 a 1:1000, tyto zředění byla zvolena z důvodů největší pravděpodobnosti výskytu těchto zředění na místě činu. Proběhl nástřik detekční směsi Weber nebo Bluestar® do roztoku nebo do suchého vzorku hemoglobinu nebo desinfekčního prostředku. Všechna měření probíhala pomocí přístroje Fluoroskan Ascent FL. Maximální hodnota detekovatelná přístrojem Fluoroskan Ascent FL byla hodnota 6000 RLU. V první fázi měření byly testovány jednotlivé katalyzátory. Intenzity CL detekčních směsí se liší v závislosti na použitém katalyzátoru rozkládající peroxid vodíku, v případě detekce hemoglobinu – železo a v případě desinfekčních prostředku – chlornan. V případě detekce desinfekčních prostředků dochází ke generování reaktivních forem kyslíku (singletního kyslíku) působících na luminol a intenzita CL dosahovala po nástřiku detekční směsi Weber nebo Bluestar® hodnot přesahující 6000 RLU u většiny vzorků. Intenzita CL nebyla ve většině případů měřitelná po 30 s detekce, intenzita CL poté dosahovala nulových hodnot. U detekce hemoglobinu po nástřiku detekční směsi Weber nebo Bluestar® docházelo k postupnému generování reaktivních forem kyslíku (radikálových forem) působících na luminol a u všech vzorků hemoglobinu byla intenzita CL měřitelná i po 60 s detekce. V další fázi bakalářské práce byla sledována kooperace dvou katalyzátorů působících na detekční směs Weber nebo Bluestar®. K jednotlivým zředěním hemoglobinu byl aplikován desinfekční prostředek nezředěný a o zředění 1:10, 1:100 a 1:1000. Při detekci vzorku obsahující hemoglobin maskovaný desinfekčním prostředkem po nástřiku detekční směsi Weber nebo Bluestar® měla reakce podobný průběh intenzity CL jako při detekci samotného desinfekčního prostředku a nelze tedy jasně určit přítomnost hemoglobinu. Reakce se projevovala přesahem 6000 RLU na počátku reakce a následným rychlým vyhasínáním, ve většině případu nebyla intenzita CL měřitelná po 30 s detekce. U některých vzorků 49

hemoglobinu o zředění 1:10, 1:100, který je maskovaný desinfekčním prostředkem o zředění 1:10, 1:100 a 1:1000 byla naměřená intenzita CL po nástřiku detekční směsi Weber nebo Bluestar® podobná jako při detekci samotného hemoglobinu. Podle studie Creamera došlo k vypaření chlornanů po 16 hod od nanesení24, v této studii vliv chlornanu sodného na intenzitu CL při detekci hemoglobinu přetrvává i po dobu 24 hod, v některých případech došlo u suchých vzorků hemoglobinu maskovaného desinfekčním prostředkem ke snížení intenzity CL na počátku reakce z přesahu 6000 RLU až na nulovou hodnotu. Snížení intenzity CL detekční směsi oproti vzorkům v roztoku bylo naměřeno u zaschlých vzorků Sava original, Sava proti plísním, Real gelu chlorax o zředění 1:1000 s hemoglobinem o zředění 1:1000, 1:10 000, 1:100 000 a 1:1000 000 po nástřiku detekční směsi Bluestar®. Dále byl tento jev naměřen u Sava proti plísním o zředění 1:100 a 1:1000 s hemoglobinem o zředění 1:100 a u Real gelu chlorax o zředění 1:100 a 1:10 s hemoglobinem o zředění 1:1000 a 1:1000 000 po nástřiku detekční směsi Bluestar®. Po nástřiku detekční směsi Weber bylo snížení intenzity CL naměřeno u Sava original o zředění 1:1000 s hemoglobinem o zředění 1:1000, 1:10 000, 1:100 000 a 1:1000 000, u Sava proti plísním o zředění 1:1000 s hemoglobinem o zředění 1:100 a 1:1000 a u Real gelu chlorax o zředění 1:100 s hemoglobinem o zředění 1:10 000, 1:100 000 a 1:1000 000. Ze získaných výsledků je vidět, že chlornan sodný obsažený v desinfekčních prostředcích znemožňuje správnou detekci hemoglobinu a způsobuje falešně pozitivní výsledky.

50

6. SUMMARY The forensic luminol test involves the emission of luminol chemiluminescence (CL) in the presence of haemoglobin. It is used at crime scenes as a presumptive test for blood. The major advantage of the luminol test is its high sensitivity - it can detect nanogram traces of blood that are invisible to the naked eye - which makes it up to 20 times more sensitive than any other blood detection test. The limitation with luminol and other blood detection tests is their lack of selectivity. Substances other than blood can catalyse the CL reaction that is the central component of the luminol test. One commonly reported interfering catalyst is sodium hypochlorite solution (bleach), a common ingredient in the majority of cleaning agents around most homes and industries. This thesis tried to determine the effect on the luminol test when an attempt is made to clean bloodstained tiles with a known interfering catalyst (bleach). The aim of thesis is to find out how the chemiluminescent intensities differ for haemoglobin (blood stain) and haemoglobin covered by the disinfectant after the injection of the detection mixture Bluestar® or Weber in the solution and 24 hours after application – false positive results. The thesis also tried to find out if the disinfectants affect the detection of haemoglobin in the solution and in the sample 24 hours after application. Four samples of haemoglobin and samples of disinfectants Savo original, Savo proti plísním, Real gel chlorax and WC net energy gel were prepared. The samples of haemoglobin were diluted 10, 1:100, 1:1000, 1:10 000, 1:100 000 and 1:1000 000. The disinfectants were applied both undiluted and diluted 1:10, 1:100 and 1:1000 – the dilution was chosen because the appearance of thus diluted samples at the crime scene was the most probace and recommended dilutions of disinfectants are indicated on the packaging. The detection mixtures Weber and Bluestar® were injected into the solution or injected on the dry samples of haemoglobin and disinfectants. The measurement was done by Fluoroskan Ascent FL. The maximum value detectable by device Fluoroskan Ascent FL was the value of 6000 RLU. In the first phase individual catalysts were tested. CL intensities of the detection mixtures differ in dependence on the catalysts that decompose hydrogen peroxide – in case of the detection of haemoglobin it was iron, with disinfectants it was hypochlorite. In case of the detection of disinfectants there was generation of reactive oxygen (mostly singlet oxygen) forms that affect luminol, and the CL intensity after injection the detection mixtures Weber and Bluestar® was more than 6000 RLU in most samples. The CL intensity was not, in most cases, measurable after 30 seconds of detection – the intensity reached zero value. When 51

detecting haemoglobin after injection the detection mixtures Weber and Bluestar® there was a generation of reactive oxygen forms (radical forms) that affect luminol, and the CL intensity was measurable even after 60 seconds detection time in all the haemoglobin samples. In the next part of the thesis the cooperation of two catalysts affecting the detection mixtures Weber and Bluestar® was monitored. The disinfectants undiluted and diluted 1:10, 1:100 and 1:1000 was added to samples of haemoglobin. While examining the sample of haemoglobin covered by disinfectant after spraying the detection mixtures Weber and Bluestar® it was found out that the reaction had similar progress of CL intensity to the detection of only the disinfectant. Consequently, it is not possible to clearly identify presence of hemoglobin. At the beginning of the reaction the value exceeded 6000 RLU, but afterwads it quickly decreased. In most cases the CL intensity was not measurable after 30 seconds detection time. In some samples of haemoglobin diluted 1:10, 1:100 and covered by the disinfectants Savo original, Savo proti plísním, Real gel chlorax and WC net energy gel diluted 1:10, 1:100 and 1:1000, after injection the detection mixtures Weber and Bluestar®, the CL intensity was similar to detection of only haemoglobin. According to Creamer’s study hypochlorites evaporated after 16 hours after application24. In this study the influence of sodium hypochlorite lasts up to 24 hours. The CL intensity with some dry samples of haemoglobin covered by disinfectants at the beginning of the reaction was decreasing from more than 6000 RLU to zero. Decrease of the CL intensity of the detection mixture, compared to the samples in solution, was measured in dry samples of Savo original, Savo proti plísním, Real gel chlorax (diluted 1:1000) with haemoglobin, that was diluted 1:1000, 1:10 000, 1:100 000 and 1:1000 000, after injection the detection mixture Bluestar®. This effect was also measured in the samples of Savo proti plísním (diluted 1:100 a 1:1000) with haemoglobin (diluted 1:100), and Real gel chlorax (diluted 1:100 and 1:10) with haemoglobin (diluted 1:1000 and 1:1000 000) after spraying the detection mixture Bluestar®. After injection the detection mixture Weber the reduction of CL intensity was measure in Savo original (diluted 1:1000) with haemoglobin (diluted 1:1000, 1:10 000, 1:100 000 and 1:1000 000), Savo proti plísním (diluted 1:1000) with haemoglobin (diluted 1:100 and 1:1000), and in the samples of Real gel chlorax, diluted 1:100, with haemoglobin (diluted 1:10 000, 1:100 000 and 1:1000 000). From the obtained results it is evident that sodium hypochlorite contained in the disinfectants prevents the right detection of haemoglobin and causes false positive results.

52

Seznam použité literatury 1. Němcová I., Čermáková L., Rychlovský P.: Spektrometrické analytické metody I., Karolinum, Praha 2004 2. Otyepka M., Otyepková E., Základy fyzikálně chemických metod [online]. cit. 28.8. 2011. Dostupné na WWW: http://fch.upol.cz/skripta/zfcm_pred/index.html

3. Garcia–Campana A. M, Baeyens Willy R. G: Chemiluminescence in analytical chemistry, Taylor & Francis Inc, New York 2001 4. Štern P.: Základy instrumentální analýzy v klinické biochemiii [online]. cit. 28.8. 2011. Dostupné na WWW: http://www1.lf1.cuni.cz/~kocna/biochem/text11.htm

5. Barni F., Lewis S. W., Berti A., Miskelly M. G., Lago G.: Forensic application of the luminol reaction as a presumptive test for latent blood detection, Talanta journal (2007), Vol. 72, Issue: 3, Pages: 896-913

6. Schmitz A.: Uber des hydrazyde der trimensinsaure und der hemimellitsaure, Inaug. Dissert., Heidelberg 1913 7. Albrecht H. O.: Chemiluminescence of hydrazide amino acid phthalic, Zeitschrift für Physikalische Chemie (1928), Vol. 136, Pages 321–330

8. Specht W.: The Chemiluminescense of Hemin as a means of finding and recognizing blood traces of forensic importace, Angewandte Chemie (1937), Vol. 50, Pages 155–157

9. Proescher F., Moody A. M.: Detection of blood by means of chemiluminescence, Journal of Laboratory and Clinical Medicine (1939), Vol. 24, Pages 1183–1189

10. McGrath J.: Chemical Luminescence Test for Blood, British Medical Journal (1942), Vol. 2, Pages 156-157 53

11. Grodsky M., Wright K., Kirk P. L.: Simplified preliminary blood testing An Improved Technique and a comparative Study of Methods, The Journal of Criminal Law (1951), Vol. 42, Issue 1, Pages 95-104

12. Weber K.: The application of chemiluminescence of luminol in the presence of blood, Deutsche Zeitschrift fur die gesamte gerichtliche Medizin. 57 (1966), Pages 410–423

13. Merenyi G., Lind J., Eriksen T. E.: Luminol chemiluminescence: chemistry, excitation, emitter. Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence (1990), Vol. 5, Issue: 1, Pages: 53-56 14. Thornton J. I., Maloney R. S.: The chemistry of the luminol reaction – where to from here?, California Association of Criminalists Newsletter (1985), Pages 9–16

15. Lind J., Merenyi G., Eriksen T. E.: Chemiluminescence Mechanism of Cyclic Hydrazide as Such as Luminol in Aqueous solutions, Journal of the American chemical society (1982), Vol. 105, Issue: 26, Pages: 7655-7661

16. Stott R. A. W., Kricka L. J.: Bioluminescence and chemiluminescence., International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence., Wiley, Chichester 1987

17. The

National

Toxicology

Program

[online].

cit.

28.8.

2011.

Dostupné na

WWW:http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/htdocs/Chem_Background/ExSumPdf/Luminol.pdf 18. Bader H. J., Rothweil M.: Forenzní chemie [online]. cit. 28.8. 2011. Dostupné na WWW: http://web.natur.cuni.cz/~kudch/main/JPD3/forenznichemie.pdf

19. Nilson A.: The forensic luminol test for blood - unwanted interference and the effect on subsequent analysis, The Swedish National Laboratory of Forensic Science, Linköping 2006

54

20. Blum L. J., Esperança P., Rocquefelte S.: A new high-performance reagent and procedurefor latent bloodstain detection based on luminol chemiluminiscence, Journal of the Forensic Science Society (2006) Vol. 39, Issue: 3, Pages: 81-100

21. Dilbeck L.: Use of Bluestar Forensic in Lieu of Luminol at Crime Scenes, Journal of Forensic Identification (2006), Vol. 56, Issue: 5, Pages: 706-720

22. Kent E. J. M., Douglas A. Elliot, Miskelly G. M.: Inhibition of Bleach-Induced Luminol Chemiluminescence, Journal of forensic sciences (2003) Vol. 48, Issue: 1, Pages: 64-67

23. Francis P. S., Barnett N. W., Lewis, S. W., Lim K. F.: Hypohalites and related oxidants as chemiluminiscence reagens, Journal of Luminescence (2004) Vol.15, Issue:2, Pages: 94 – 115 24. Creamer J. I., Quickenden T. I., Crichton L. B., Robert P., Ruhayel R. A.: Attempted cleaning of bloodstains and its effect on the forensic luminol test, Journal of Luminescence (2005), Vol. 20, Issue: 6, Pages: 411-413

25. Creamer J. I, Quickenden T. I., Robertson P.: A comprehensive experimental study of industrial,domestic and environmental interferences with theforensic luminol test for blood, Journal of Luminescence (2003), 18:193–198

26. King R., Miskelly G. M.: The inhibition by amines and amino acids of bleach induced luminol chemiluminescence during forensic screening for blood, Talanta journal (2005) Vol. 67, Issue: 2, Pages: 345-353 27. Kameníček J., Šindelář Z., Pastorek R., Kašpárek F.: Anorganická chemie, Univerzita Palackého v Olomouci 2006 28. Bochemie [online]. cit. 2.1. 2012. Dostupné na WWW: http://www.bochemie.cz/ 29. Winston R., Parker S.: Lidské tělo, Knižní klub, Praha 2007

55

Seznam použitých zkratek

CL

chemiluminiscence

RLU

relative light unit

*SPP

roztok Sava original

*SPP

roztok Sava proti plísním

*WN

roztok Real gelu chlorax

*WN

roztok WC net energy gelu

SPP

suchý vzorek Sava original

SPP

suchý vzorek Sava proti plísním

WN

suchý vzorek Real gelu chlorax

WN

suchý vzorek WC net energy gelu

*A

roztok hemoglobinu o zředění 1:10

*B


*C


*D

roztok hemoglobinu o zředění 1:10 000

*E


*F


A

suchý vzorek hemoglobinu o zředění 1:10

B


C


D

suchý vzorek hemoglobinu o zředění 1:10 000

E


F


56

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Fakulta přírodovědecká Katedra fyzikální chemie

Recommend Documents