UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI. Přírodovědecká fakulta. Katedra analytické chemie

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta Katedra analytické chemie

Hodnocení antioxidační aktivity drobného ovoce

DIPLOMOVÁ PRÁCE

Autor:

Petra Riedelová

Studijní obor:

Analytická chemie

Vedoucí práce:

RNDr. Jana Skopalová, Ph.D.

Olomouc 2014

Prohlášení: Prohlašuji, ţe jsem tuto práci vypracovala samostatně a veškeré literární prameny a informace, které jsem v práci vyuţila, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury. Souhlasím s tím, ţe práce bude prezenčně zpřístupněna v knihovně Katedry analytické chemie, Přírodovědecké Fakulty, Univerzity Palackého v Olomouci.

V Olomouci dne ...............................

Podpis ...............................

-2-

Poděkování: Mé poděkování patří především paní RNDr. Janě Skopalové, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady a trpělivost, dále panu doc. RNDr. Petru Bartákovi, Ph.D. za časté konzultace a také mému partnerovi, který byl zapojen a pomáhal nejen při sběru vzorků ostruţin.

-3-

Bibliografická identifikace

Jméno a příjmení autora:

Petra Riedelová

Název práce:

Hodnocení antioxidační aktivity drobného ovoce

Typ práce:

Diplomová

Pracoviště:

Katedra analytické chemie

Vedoucí práce:

RNDr. Jana Skopalová, Ph.D

Rok obhajoby práce:

2014

Abstrakt:

Tato práce se zabývá hledáním vhodných postupů pro stanovení celkové antioxidační aktivity ostruţin, sbíraných v regionech střední a severní Moravy a východních Čech. Pouţity byly metody průtoková coulometrie, coulometrická titrace jódem a UV-Vis spektrometrie s barevným indikátorem.

Klíčová slova:

Bobulové ovoce, celková antioxidační aktivita, volné

radikály,

spektrofotometrie. Počet stran:

54

Jazyk:

Český

-4-

elektrochemické

metody,

Bibliographical identification:

Author’s first name and surname:

Petra Riedelová

Title:

Evaluation of Antioxidant Activity of Small Fruits

Department:

Department of Analytical Chemistry

Type of thesis:

Diploma

Supervisor:

RNDr. Jana Skopalová, Ph.D

The year of presentation:

2014

Abstract:

This work is concerned with looking for applicable advancement for determination of total antioxidant activity of blackberry, collected at different places in region of middle and north Moravia

and

east

Bohemia.

Flow-through

coulometry, coulometric titration with iodine and UV-Vis spectrometry with colored indicator are methods which were used. Keywords:

Berry

fruits,

free radicals,

total

elektrochemical

spectrophotometry. Number of pages:

54

Language:

Czech

-5-

antioxidant

activity, methods,

Obsah Úvod .................................................................................................................................................... - 7 Teoretická část .................................................................................................................................... - 8 Přírodní antioxidanty v potravinách .................................................................................................... - 8 Vitamíny.......................................................................................................................................... - 9 Fenoly, fenolové kyseliny a jejich deriváty................................................................................... - 12 Minerální látky .............................................................................................................................. - 14 Základní chemické sloţení bobulového ovoce .................................................................................. - 15 Metody stanovení antioxidační aktivity v potravinách ..................................................................... - 21 Elektroanalytické metody.............................................................................................................. - 21 Voltametrie ................................................................................................................................ - 21 Coulometrie ............................................................................................................................... - 25 HPLC s elektrochemickou detekcí ............................................................................................ - 25 Spektrální metody ......................................................................................................................... - 27 UV-Vis spektrometrie ............................................................................................................... - 27 HPLC s UV-Vis detekcí ............................................................................................................ - 27 Experimentální část ........................................................................................................................... - 28 Chemikálie a přístrojové vybavení ................................................................................................ - 28 Přípravy roztoků ............................................................................................................................ - 29 Vzorky ostruţin ............................................................................................................................. - 30 Postupy stanovení.......................................................................................................................... - 32 Výsledky a diskuze ........................................................................................................................... - 37 Závěr ................................................................................................................................................. - 48 Summary ........................................................................................................................................... - 49 Seznam pouţitých zkratek................................................................................................................. - 50 Seznam pouţité literatury .................................................................................................................. - 51 -

-6-

Úvod Celá řada studií se v posledních letech zaměřila na výzkumy potravin počínající jejich celkovým sloţením, přítomností různých přídatných látek (potravinová aditiva nebo-li E-čka), aţ po jejich nejvhodnější zpracování. Za tu dobu byly metody zdokonaleny, validovány a jsou běţnou součástí řady větších i menších laboratoří. Jedním z mnoha pozitivních účinků někerých látek pro lidský organismus, byla zjištěna jejich schopnost sniţovat aktivitu volných radikálů a tím omezit proces oxidace nebo-li stárnutí. Pomáhají sníţit pravděpodobnost vzniku některých onemocnění a cíleně se přidávají do potravin na prodlouţení jejich trvanlivosti. Volné radikály se v tělě vyskytují jak přirozeně při metabolismu v rámci buněčných procesů, tak uměle vlivem znečištěného ţivotního prostředí, vystavení UV záření nebo jen připálením oběda. Pro neutralizaci těchto radikálů je nejlepší volbou strava plná ovoce a zeleniny, které patří mezi hlavní zdroje vitamínů, minerálů a flavonoidů. Dalšími zdroji jsou luštěniny, ořechy, bylinky, koření, veškeré výluhy nebo odvary z nich připravované a mnoho dalších. Celková antioxidační aktivita (TAA, Total Antioxidant Activity) je souhrnná fyzikálně-chemická vlastnost vzorků, která je podmíněná redoxními aktivitami všech látek v nich přítomných. Ve výsledku a za přesně definovaných podmínek se projevuje redukčním (antioxidačním) účinkem. [1] Můţe být sledována jednak schopnost vzorku eliminovat volné radikály nebo hodnoceny jeho redoxní vlastnosti. [2] Teoretická část této práce je zaměřena na látky s antioxidačními účinky obsaţené v potravinách a sloţení bobulového ovoce, dále na přehled některých metod, pouţívaných ke stanovení TAA se zajímavými výsledky jednotlivých studií. Praktická část byla zaloţena na aproximaci tří metod pro stanovení antioxidační aktivity v ostruţinách, jejich vzájemné korelovatelnosti a porovnání hodnot TAA vzorků ostruţin extrahovanými různými rozpouštědly

-7-

Teoretická část Přírodní antioxidanty v potravinách Antioxidanty se v potravinách vyskytují především přirozeně ve formě vitamínů, barviv, fenolických látek nebo enzymů. Některé však mohou obsahovat přídatné látky s antioxidačními účinky, která se záměrně přidávají do potravin během technologické úpravy za účelem prodlouţení trvanlivosti, zabránění ţluknutí tuků a barevným změnám. Nejčastějšími aditivy s antioxidačními vlastnostmi jsou estery mastných kyselin a askorbové kyseliny, vitamín E, galáty, fenolové látky, siřičitany apod. [3] Seznam povolených antioxidantů (přírodních i syntetických) přidávaných se do potravin a jejich povolená mnoţství jsou dány legislativou podle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1331/2008. Počet publikací na téma antioxidační aktivita jednotlivých látek v potravinách (často také celková antioxidační aktivita) a jejich pozitivní účinek na lidské zdraví za poslední desetiletí stále narůstá. Četnost zájmu o tyto látky byla sledována v publikaci A. Scalberta a spol. [4], který hodnotil počet článků v jednotlivých letech pro časopis The American Journal of Clinical Nutrition. Jejich závěry jsou znázorněny v následujícím grafu (Graf 1). Patrný je rostoucí zájem především o účinky flavonoidů, vitamínu E a v menší míře polyfenolů, dále se celá řada studií věnuje karotenoidům a méně pak vlivu selenu.

Graf 1 Znázornění rostoucího počtu publikací vydaných v letech 1970-2004 v časopise The American Journal of Clinical Nutrition, které se zabývaly antioxidační aktivitou některých látek. [4]

-8-

Vitamíny Z chemického hlediska se jedná o nízkomolekulární organické látky, které jsou často součástí enzymů. V tomto spojení katalyzují biochemické reakce v těle a mají tak fuknci koenzymu. Vitamíny regulují úroveň metabolických pochodů a nedostatek jediného můţe ohrozit fungování celého organismu. [5; 6] Řada lidí si v dnešní době pod pojmem vitamíny ještě stále představí pouze krabičku s tabletami, přitom sama příroda nám dává vše potřebné k udrţení základní fyziologických funkcí. Jedná se o velmi důleţité látky pro ţivot, kterých stačí jen velmi malé mnoţství. Vitamíny jsou neesenciální látky pouze pro mikroorganismy a rostliny, tedy niţší autotrofní organismy, které si je pro svůj ţivot syntetizují z jednoduchých sloučenin samy. Zbylé organismy a jejich metabolické řetězce se během vývoje postupně změnily přijmáním rostlinné stravy. Díky tomu jiţ nedokáţí tvořit tyto důleţité látky a potřebují je přijmat stravou. Pouze některé vitamíny dokáţe produkovat střevní mikroflóra (D, K a částečně i B12). [7] Antioxidační aktivita byla zjištěna u vitamínů A, C a E, jejichţ výskyt, doporučená denní dávka (DDD) a význam pro člověka je uveden v tabulce (Tab 1).

Tab. 1 Vitamín

Souhrn vlastností, zdrojů a fyziologických funkcí vitamínů s antioxidační aktivitou. [5] Název

DDD [mg/den]

Fyziologický význam

Zdroj

Příznaky z nedostatku (Hypovitaminóza)

A

Účinná sloţka zrakového Šeroslepost, loupání Axeroftol Rybí tuk, mléko, pigmentu, podporuje správný kůţe, zpomalený (Retinol), 0,8 – 1,2 játra, mrkev, listová vývoj buněk sliznic, kostí tělesný růst, rohovatění karotenoidy zelenina, margarín a krvetvorby kůţe a sliznic

E

Tokoferoly

C

15 – 30

Ţivočišné tuky, rostlinné oleje, obilné klíčky

Ovoce, listová L-Askorbová 60 – 200 zelenina, citrusové kyselina plody, šípky, byliny

Zamezuje hromadění škodlivých látek, správný průběh těhotenství

Ţaludeční potíţe, průjmy, ukládání tuků do jater

Potřebný pro metabolismus aminokyselin, podporuje tvorbu protilátek, sniţuje krevní cholesterol

Náchylnost k infekcím, únava, vypadávání zubů, kurděje

-9-

Vitamín C Jedná se o nejdůleţitějšího zástupce vitamínů s antioxidačními účinky. Většina ţivočichů je schopna si tento vitamín syntetizovat sama, výjimku tvoří lidé, lidoopové, netopýři a morčata, kteří jsou odkázáni na potravinové zdroje. Obsah vitamínu v některých rostlinách či plodech, je závislý na vegetačních podmínkách během růstu, stupni zralosti, způsobu zpracování po sklizni a mnoha dalších faktorech. Askorbová kyselina (Ascorbic Acid, AA) a její deriváty, při reakci s volnými radikály, brzdí řetězovou autooxidaci a účinně tak působí jako antioxidant. Reakci kyseliny s peroxylovým radikálem lze schematicky znázornit následující rovnicí: H2A + R-O-O• → HA• + R-O-OH (H2A = askorbová kyselina; R-O-O• = hydrogenperoxylový radikál; HA• = askorbylradikál; R-O-OH = hydroperoxid)

Vzniklý askorbylradikál není schopen vyvolat další řetězovou reakci a disproporcionuje na askorbovou a dehydroaskorbovou kyselinu. Obecně je askorbová kyselina účinnějším antioxidantem, pouţije-li se v kombinaci s tokoferoly. Ty reagují přednostně s volnými radikály lipidů a vzniklé radikály tokoferolů jsou na fázovém rozhraní voda-tuk redukovány zpět na tokoferoly a askorbovou kyselinu. [5; 6] V souvislosti s antioxidační aktivitou byl sledován kooperující efekt vitamínů C, E (α-tokoferolu)

a

β-karotenu

Chromatography) a zároveň

metodou

studovány

HPLC

všechny

faktory

(High

Performance

ovlivňující

proces

Liquid zhášení

volných radikálů. Askorbová kyselina hraje roli ve vodné fázi, zatímco α-tokoferol a β-karoten v lipofilní. Na Obr. 1 je uvedeno pravděpodobné schéma probíhajících reakcí vitamínů v daném prostředí a jejich synergický efekt je blíţe popsán v samotné studii. [8]

- 10 -

Obr. 1 Pravděpodobné schéma inhibice oxidace membrány a lipoproteinu s nízkou hustotu pomocí kombinace β-karotenu (B), vitamínu C (C) a vitamínu E (E) [8] LH – lipid, L• – radikál lipidu, LO2• – lipidový peroxylradikál, LOOH – lipidový hydrogenperoxid, B• – radikál β-karotenu, BO2• – peroxylradikál β-karotenu, BOOH – hydrogenperoxid β-karotenu, E• – radikál vitamínu E, C• – radikál vitamínu C.

Vitamín A Jako základní aktivní látka této skupiny vitamínů je all-trans-retinol neboli axeroftol. Jedná se o isoprenoid s pěti konjugovanými dvojnými vazbami a tzv. β-jonovým cyklem. V potravinách je doprovázen řadou analogů, které se liší právě tímto cyklem nebo postranním řetězcem. Hlavním provitamínem A s antikarcinogenními vlatnostmi je β-karoten, obsaţený zejména v listové zelenině, jako je špenát a zelí. Je součástí kontrolních mechanismů likvidujících volné radikály. Příkladem můţe být reakce s hydroperoxidovým radikálem, který je zachycen konjugovaným polyenovým systémem a vznikají tak relativně stabilní radikály β-karotenu stabilizované rezonancí: [5]

R-O-O• + β-karoten → R-O-O-β-karoten• (R-O-O• = hydrogenperoxylový radikál; R-O-O-β-karoten• = radikál β-karotenu)

Cirkulace vitamínu A v lidské plasmě je sprostředkována retinolem, vázaným na specifický transportní protein (Retinol-Binding Protein, RBP). [9] Bylo také zjištěno, ţe sníţená hodnota zinku v těle vede ke sníţení syntézy RBP, který je dopravcem vitamínu A z jater do krve. [10] Izolace a struktura tohoto komplexu je předmětem zájmu řady studií.

- 11 -

Při hledání funcí β-laktoglobulinu byla zjištěna jeho velká podobnost se strukturou a schopností vázat retinol jako RBP. Jejich struktury jsou znázorněny na obrázku (Obr. 2 a; b). [11]

a)

b)

a) Retinol vázající protein (RBP); b) Struktura β-laktoglobulinu s navázaným retinolem [11]

Obr. 2

Vitamín E Nejvýznamnějším lipofilním antioxidantem je vitamín E (především α-tokoferol). Tokoferoly reagují s celou řadou volných radikálů. Autooxidaci lipidů inhibují tak, ţe reagují s peroxylovými (hydroperoxylovými) radikály lipidů za vzniku hydroperoxylů a radikálů tokoferolů. [5]

Fenoly, fenolové kyseliny a jejich deriváty

Základní strukturu fenolových kyselin a jejich derivátů tvoří kyseliny benzoová a skořicová spolu se svými deriváty. Jsou součástí všech rostlinných materiálů a některé se - 12 -

vyskytují v kouři během uzení potravin (např. kyselina salicylová). Aktivita těchto látek závisí na počtu hydroxylových skupin v molekule a příklady jejich struktur spolu s výskytem uvádí následující tabulka (Tab. 2).

Struktury fenolových antioxidantů [5]

Tab. 2 Skupina

Příklad

H

Jednoduché fenoly

Výskyt

Struktura O OH

Salicylaldehyd

Pohanka Majoránka, oregano, šalvěj, rozmarýna, obiloviny

OH

Estery

HO

Rosmarinová kyselina

COOH

OH

O HO O

O CH 2OH

Glykosidy

O-synapoil-β-Dglukopyranosa

OH

OH

HO

OCH 3

OH

O

Amidy

Kapsaicinol

Klíčky semen brukvovitých rostlin

OCH 3 O

O

H3CO

OH CH3

NH

HO

Sezamová semena, tepelná úprava potravin

OH

Lignany

Chilli papriky

CH3

O

Sesamol

O O

Kurkuminoidy

Diarylpentanoid kurkumy

H3CO

Oddenky kurkumy

R

HO

OH OH OH

Flavonoidy

HO

Kvercetin

Ovoce a zelenina

O

OH OH

O

Skupina flavonoidů zahrnuje celou řadu látek jako jsou antokyany, flavonoly, flavony, flavanony a řadu dalších. Jedná se o sekundární metabolity, vyskytují se ve všech částech rostlin, kde tvoří barevné pigmenty. Mimo jejich antioxidačních vlastností mají funkci ochrany rostliny před UV-zářením, útoky hmyzu, dále jsou zapojeny do fotosenzibilace a přenosu energie, určují pohlaví, funkci hormonů v rostlině a řadu dalších. [12] Nejrozmanitější

podskupinou

pigmentů

jsou

antokyany

s

barevným

rozsahem

od červené po fialovou a modrou. Obsah těchto látek se během různých vývojových stupních

- 13 -

výrazně liší. Ukázkou můţe být stanovení antokyanů postupného vývoje plodu chilli papričky a květu Brunfelsia Calycina, měřené metodou HPLC s UV-Vis detekcí, které je znázorněné na následujícím obrázku (Obr. 3). [13]

Obr. 3 Degradace antokyanů během vývoje plodu čilli papričky (A) a květu Brunfelsia Calycina od rozevření pupenu po odpadnutí (B), metoda HPLC s UV-Vis detekcí [13]

Minerální látky Minerální látky, obsaţené v potravinách interagují nejen s vodou a přítomnými organickými látkami, ale i navzájem mezi sebou. Tyto interakce pak ovlivňují biologickou vyuţitelnost prvků ve stravě. Během zpracování potraviny jsou minerální látky stabilní, mohou vytvořit jiné sloučeniny nebo přejít do vody ve které je potravina připravována a často slévána (obsah podílu dané látky tak můţe klesnout aţ na polovinu). Jedná se především o mikroprvky jako jsou zinek, mangan, měd a selen. Antioxidační aktivita fenolů souvisí s reakcí s minerálními látkami. Jako příklad je uveden vznik komplexů flavonolů obsahující měďnaté ionty, které patří ke ţlutým pigmentům rostlin a velmi účinným přirozeným antioxidantům: [5]

Cu2+

O

OH O

O

O

- H+

O

O O

Cu+

- 14 -

+

O

Cu

Základní chemické složení bobulového ovoce Drobné ovoce je všeobecně známo nejen svými organoleptickými vlastnostmi jako jsou sladká chuť, ovocné aroma nebo jejich výrazná barva, ale také příznivými účinky na lidské zdraví. Za tyto vlastnosti jsou odpovědné různé chemické sloučeniny, jejichţ sloţení je velice proměnlivé a závisí na druhu ovoce, místa sběru, času nebo podmínkách při skladování. Jsou dobrým zdrojem vitamínů, minerálních látek a řady dalších, uvedených v následujících odstavcích. Mezi zástupce drobného ovoce patří borůvky, ostruţiny, maliny, jahody, rybíz, bezinky a řada dalších. Následující tabulka (Tab. 3) uvádí nutriční sloţení borůvek, ostruţin a malin měřené institutem U.S. Department of Agriculture Nutrient Database. Bobulové ovoce obecně obsahuje málo kalorií, hodně vlákniny a sacharidů, dále pouze malé mnoţství tuků a proteinů. [14]

Nutriční sloţení některých druhů bobulového ovoce ve 100 g čerstvého ovoce [14]

Tab. 3

Voda (g) Energie (kcal) Proteiny (g) Vláknina (g) Celkové lipidy (g) Celkové sacharidy (g) Popel (g)

Borůvky 84,2 57 0,74 2,4 0,33 14,5 0,24

Ostruţiny 88,2 43 1,39 5,3 0,49 9,61 0,37

Maliny 85,8 52 1,2 6,5 0,65 11,9 0,46

Jahody 90,95 32 0,67 2,0 0,3 7,68 0,4

Sacharidy Celkovou chuť i aroma ovoce ovlivňuje sloţení a koncentrace rozpustných cukrů (sacharosa, glukosa a fruktosa) ve vztahu s organickými kyselinami a aromatickými těkavými látkami. Ovoce je třeba sklízet zralé, kvůli vyváţenosti sladké chuti k jeho kyselosti a trpkosti. Obsah cukru v plodech závisí na stupni zralosti a mění se i během jeho skladování. [14]

- 15 -

Nejvýznamnější reakcí probíhající při skladování a zpracování je reakce s aminokyselinami, tzv. Millardova reakce (neenzymové hnědnutí). [15] Sacharidy mají nejen organoleptické vlastnosti, ale na základě stanovení jejich obsahu jsou zaloţeny testy autenticity různých ovocných šťáv. U řady dodavatelů je bohuţel běţnou praxí jejich ředění vodou nebo jinými, levnějšími dţusy. Z tohoto důvodu vznikla evropská organizace, zabývající se standardizací kvality výroby a autenticity šťáv (Association of the Industry of Juices and Nectars from Fruits and Vegetables of the European Union; AIJN), která uvádí tolerovaná mnoţství různých komponent (např. sacharidů). Autenticita vybraných druhů dţusu byla stanovována pomocí kvantifikace sacharidů enzymatickou metodou Lublinskými vědci. [16]

Organické kyseliny Obsah cukru v bobulovém ovoci je vyváţený přítomností několika dominantních organických kyselin. Jedná se především o kyselinu citronovou a jablečnou, dále fenolové kyseliny, které předávají hořkou a trpkou chuť. Organické kyseliny také pomáhají stabilizovat kyselinu askorbovou a antokyany a prodluţují trvanlivost čerstvě zpracovaných plodů. [14] Obsahy vybraných flavonoidů, fenolických kyselin a jejich poměrná zastoupení v 19-ti druzích bobulového ovoce, byly cílem studie finských vědců. Obsah jednotlivých látek byl srovnáván se standardy (např. kampferol, quercectin a myricetin, kyseliny kávová, p-kumarová, felurová a řada dalších) a stanovení proběhlo metodou HPLC s UV-Vis detekcí. Koncentrace jednotlivých stanovovaných látek jsou uvedeny podrobněji ve výsledcích studie, zde je znázorněno pouze procentuální zastoupení fenolických sloučenin v bobulovém ovoci (Graf 2). [17]

- 16 -

Poměrné zastoupení fenolových látek v 19-ti druzích bobulového ovoce [17]

Graf 2

Enzymy Přítomnost různých enzymů hydroláz a oxidáz můţe způsobit podstatné zhoršení kvality zahrnující ztrátu barvy a struktury a tvorby neţádoucích hnědých pigmentů. Hnědnutí je způsobené enzymy jako polyfenol-oxidasa nebo peroxidasa, které jsou často zpočátku maskovány tmavou červenou barvou antokyanů. Tyto enzymy katalyzují oxidaci o-difenolů, které nakonec polymerují na látky s hnědým zbarvením. [14]

Pigmenty Jedním z typických rysů většiny bobulového ovoce je jeho rudá, modrá nebo fialová barva způsobená anthokyany. Vizuální vnímání barvy čerstvého a zpracovaného ovoce je pro spotřebitele prvním faktorem poukazujícím na jeho kvalitu. Barva je ovlivněna stupněm zralosti při sklízení nebo degradačními reakcemi zahrnujícími enzymatické reakce, pH, přítomnost askorbové kyseliny nebo tepelnou degradací. [18] Jednotlivé antokyaninové pigmenty v 51 vzorcích ostruţin byly stanovovány metodou HPLC s UV-Vis detekcí na univerzitě v Oreganu. [19] V následujícím grafu (Graf 3) je uveden příklad výsledného

- 17 -

chromatogramu. Další látky odpovědné za barevnost jsou karotenoidy jako je např. lutein nebo β-karoten.

Graf 3 HPLC chromatogram antokyanů v ostruţinách; 1 = kyanidin-3-glukosid; 2 = kyanidin-3rutinosid; 3 = kyanidin-3-xylosid; 4 = kyanidin-3-malonylglukosid; 5 = kyanidin-3-dioxalylglukosid [19]

Vitamíny a minerály Obsah a různorodost vitamínů a minerálních látek jsou často základem k propagaci zvýšení denního přijmu ovoce a zeleniny. V následujících tabulkách (Tab. 4 a 5) jsou uvedeny obsahy těchto látek v některých bobulovinách, naměřené institutem U.S. Department of Agriculture Nutrient Database [14]

Tab. 4

Vitamíny obsaţené v některých druzích bobulového ovoce ve 100 g čerstvého ovoce [14]

Askorbová kyselina [mg] Thiamin [mg] Riboflavin [mg] Niacin [mg] Pantothenová kyselina [mg] Vitamín B6 [mg] Kyselina listová [μg] Vitamín A [IU] Celkový obsah tokoferolů [mg] Vitamín K [μg]

Borůvky 9,7 0,04 0,04 0,42 0,12 0,05 6 54 0,97 19,3

Ostruţiny 21 0,02 0,03 0,65 0,28 0,03 25 214 3,45 19,3

- 18 -

Maliny 26,2 0,03 0,04 0,6 0,33 0,06 21 33 3,36 7,8

Jahody 58,8 0,024 0,022 0,386 0,125 0,047 24 12 0,39 2,2

Minerální látky obsaţené v některých druzích bobulového ovoce ve 100 g čerstvého ovoce [14]

Tab. 5

Vápník [mg] Ţelezo [mg] Hořčík [mg] Fosfor [mg] Draslík [mg] Sodík [mg] Zinek [mg] Měď [mg] Mangan [mg] Selen [mg]

Borůvky 6 0,28 6 12 77 1 0,16 0,06 0,34 0,1

Ostruţiny 29 0,62 20 22 162 1 0,53 0,17 0,65 0,4

Maliny 25 0,69 22 29 151 1 0,42 0,09 0,67 0,02

Jahody 16 0,42 13 23 153 1 0,14 0,048 0,386 0,4

Vonné látky Z chemického hlediska se jedná o organické látky jako jsou alkoholy, estery, ketony, uhlovodíky, niţší mastné kyseliny, terpeny a řada dalších. Pro zachování aromatických látek je potřeba během zpracování ovoce postupovat opatrně, jelikoţ při zahřívání aromatické látky těkají, příp. oxidují. Dále se mohou uvolňovat do vodné fáze a vyprchat nevhodným sušením nebo zahušťováním. V bobulovém a jádrovém ovoci převaţují karbonylové sloučeniny a estery. [20] V následujících grafech (Graf 4) jsou ukázána hmotnostní spektra aromatických látek obsaţených v listech a plodech ostruţiníku. Některé aromatické látky, jako jsou 2-heptanol (pík 8), kyselina octová (pík 12), benzyl alkohol (pík 33), kyselina skořicová (pík 50) a řada dalších, se vyskytují v obou částech rostlin. Zbylé aromatické komponenty jsou specifické pro danou část rostliny. Identifikace a částečná kvantifikace jsou uvedeny v samotné studii. [21]

- 19 -

Graf 4 Aromatické komponenty vyskytující se v listech a plodech ostruţiníku (Rubus laciniata L.), pouţitá metoda byla kapilární plynová chromatografie s hmotnostním spektrometrem [21]

Třísloviny Třísloviny nebo-li taniny dodávají ovoci trpkou a svíravou chuť. Jsou to rostlinné látky, které mohou být hydrolyzované (estery kyseliny galové) nebo kondenzované (polymery některých flavonoidních látek), vázané na sacharidy a jiné makromolekuly. [22] Řada látek, patřících do této skupiny, byla zmiňována v předchozích kapitolách.

- 20 -

Metody stanovení antioxidační aktivity v potravinách Elektroanalytické metody Do této kategorie patří celá řada metod, pomocí kterých lze stanovit celkovou antioxidační aktivitu vhodně upraveného vzorku. Jedná se o metody zaloţené na redoxní reakci, probíhající v elektrochemickém článku dle rovnice:

, kde Ox je oxidovaná forma a Red redukovaná forma elektroaktivní látky a n je počet elektronů e, vyměněných na elektrodě.

Podrobnější popis elektroanalytických metod

je uveden v odborných knihách. [23; 24] V následujících kapitolách jsou uvedeny metody pouţité ke stanovení celkové antioxidační aktivity v potravinách, zaloţené na redoxní reakci, kde elektrochemickým článkem prochází elektrický proud.

Voltametrie Voltametrické metody se dostávají do popředí nejen díky nízkým peněţním nákladům na pořízení a celkový provoz, ale i moţnosti jejich miniaturizace, rychlosti analýzy, snadné automatizovatelnosti nebo schopnosti souběţného stanovení více látek s dostatečně velkým rozdílem redoxních potenciálů. Jedním z příkladů moderního vyuţití je konstrukce elektronického jazyka s mnohokanálovými elektrodami, které simulují lidský jazyk a jeho receptory chuti. [25] Schématické zapojení je uvedeno na obrázku (Obr. 4). Je určen k detekci látek způsobující určitou chuť potravin a některé z nich jsou uvedeny v následující tabulce (Tab. 6). Elektronický jazyk byl pouţit na ovocné dţusy, mléko, minerální vodu, kávu, čaj nebo víno [26; 27]

- 21 -

Obr. 4 Schéma zapojení voltametrického elektronického jazyka [25]

Soupis některých látek odpovědných za danou chuť potraviny [26]

Tab. 6 Příchuť Sladká Kyselá Slaná Hořký Umami

Látky způsobující danou příchuť Cukry, aminokyseliny, alkoholy Kyseliny octová, citronová aj. Stolní sůl Chinin, kofein, aspirin, nikotin Glutaman sodný

Cyklická voltametrie

Nejvíce studovanou látou v potravinách s antioxidačními vlastnostmi je vitamín C. Korejští vědci se proto snaţili najít další způsob modifikace voltametrické metody, kde hydrotermálním procesem připravili nanočástice oxidu thulitého. Kromě zkoumání struktury a morfologie optickými

metodami, byla provedena elektroforetická depozice nanočástic

Tm2O3 na cín dopovaný oxidem inditým (Indium-Tin-Oxide, ITO) na skleněné podloţce (Obr. 5 A). Takto připravený povrch elektrody byl pouţit k elektro-oxidaci askorbové kyseliny a průběh sledován pomocí cyklické voltametrie. Záznam voltamogramu spolu s kalibrační křivkou je znázorněn na Obr. 5 B a C. [28] Výsledky této studie nabízí novou platformu pro aplikaci kovů vzácných zemin na rychlou a přesnou analýzu askorbové kyseliny.

- 22 -

Obr. 5 (A) Ukázka mechanismu elektrokatalytické oxidace askorbové kyseliny na dehydroaskorbát na Tm2O3/ITO elektrodě; (B) Cyklický voltamogram Tm2O3/ITO elektrody v 0,1M fosfátovém pufru (pH=7) s rozdílnými koncentracemi askorbové kyseliny (0,2 – 8,0 mM); (C) Kalibační křivka askorbové kyseliny, měřená na Tm2O3/ITO elektrodě. [28]

Cyklická voltametrie byla vyuţita také pro stanovení kapsaicinu obsaţeného v chilli papričkách na univerzitě v Manchesteru [29] nebo fenolových látek s antioxidačními účinky v komerčních vzorcích potravin. [30]

Diferenčně pulsní voltametrie

V pulsních metodách je proud měřen po přesně definovaný čas a existuje několik modifikací lišících se způsobem vzniku a tvarem potenciálových pulsů vkládaných na elektrodu. Během diferenčně pulsní voltametrie (Differential Pulse Voltammetry, DPV) je na potenciál, který se lineárně mění s časem, vkládán napětový pulz. Výhodnější je pouţití rtuťových elektrod neţ elektrod z tuhých materiálů. Tato metoda se pak nazývá diferenčně pulsní polarografie (Diferential Pulse Polarography, DPP) a pulsy se vkládají na Hg-kapku těsně před koncem její doby. [24] Metoda DPV byla vyuţita nejen pro stanovení antioxidační aktivity ovocných dţusů [31], ale například i ke stanovení celkové antioxidační aktivity vybraných vzorků koření (Graf 5). Anodickou oxidací rtuti za přítomnosti peroxidu vodíku vzniká hydroperoxidový radikál, který reaguje s antioxidanty přítomnými ve vzorku. K porovnání

- 23 -

TAA byly vybrány oregáno, tymián, skořice, hřebíček a muškátový oříšek. Předmětem studie bylo také nalezení nejvíce zastoupených antioxidantů v koření pomocí řady standardů (Tab. 7) a vzhledem k obtíţné separaci některých látek byla jako pomocná metoda zvolena UV-Vis spektrometrie. [32]

Graf 5:

Závislost procenta zhášení na rostoucí koncentraci (objemu) vodných extraktů koření

s přídavkem 5.10-4 M H2O2 meřené DPV. Procento zhášení uvádí, o kolik procent se liší vzorek koření bez přídavku od vzorku s přídavkem H2O2. [32]

Tab. 7 Hlavní antioxidanty nalezené v koření pomocí řady standardů, metodou DPV a UV-Vis spektrometrie [32] Koření Oregano

Tymián

Skořice

Hlavní antioxidanty p-cymen thymol karvakrol p-cymen linalool thymol β-karyophylen cinnamaldehyd eugenol

Koření

Hlavní antioxidanty

Hřebíček

β-karyophylen eugenol acetyleugenol α-pinen β-pinen sabinene terpinen-4-ol

Muškátový oříšek

- 24 -

Coulometrie Coulometrické metody se vyuţívají ke stanovení TAA

ve vhodně upravených

roztocích piva, čaje [33], ovoce nebo i zeleniny. Poslední novinkou je přenosný coulometrický analyzátor PCA, vhodný ke stanovení vitamínu C v různých potravinách. [34] Vyuţívá principy průtokové elektrochemie a coulometrických titrací. Přístroj je vhodný pro manipulaci v terénu, má jednoduchou obsluhu, relativně nízkou cenu a provozní náklady. [35] Na obrázku níţe (Obr. 6) je ukázka coulometrického analyzátoru PCA.

Obr. 6

Přenosný coulometrický analyzátor PCA, Istran [35]

HPLC s elektrochemickou detekcí

Velmi přesná a citlivá metoda na detekci elektroaktivních látek je vysokoúčinná kapalinová chromatografie s ampérometrickým nebo coulochemickým detektorem. Látku je moţno charakterizovat nejen retenčním časem, ale i potenciálem oxidace. [2] Záznam chromatochramu na reverzní fázi s coulochemickou detekcí pro extrakty jahod je znázorněn níţe (Graf 6). Identifikace píků byla provedena pomocí série standardů počínaje askorbovou kyselinou, glutathionem, gallovou kyselinou aţ po - 25 -

quercetin a kampferol, eluující se aţ po 70-té minutě. Vzhledem k velkému mnoţství dat byl vybrán pouze záznam samotného chromatogramu. Identifikace a kvantifikace látek je uvedena v samotné studii, jejíţ cílem bylo ukázat vhodnost metody pro simultánní stanovení antioxidantů v ovoci a zelenině. [36] Elektrochemická detekce je obecně vhodná pro barevné látky, které by mohly při špatně zvolených podmínkách interferovat a zkreslovat tak výsledky.

Graf 6 Pětikanálový chromatogram vodného extraktu jahod (pro potenciály 140, 210, 490, 700 a 770 mV) [36]

- 26 -

Spektrální metody Ke spektrální analýze jsou pouţívány postupy zaloţené na přímé reakci s radikály (zhášení a vychytávání) nebo reakci s přechodnými kovy. Tyto látky poskytují barevnou změnu v závislosti na obsahu antioxidantů přítomných ve stanovovaném vzorku.

UV-Vis spektrometrie Vzhledem k tom, ţe UV-Vis spektrometr je v dnešní době běţnou součástí kaţdé laboratoře, není divu, ţe je tento způsob detekce často pouţívána pro kvantifikaci barevné změny roztoků. Nejvíce pouţívaným barevným indikátorem je radikál DPPH. Byl vyuţit nejen při stanovení TAA vzorků hub [37], bobulového ovoce [38; 39; 40], kávových zrn [41] a čajových extraktů [42], ale i při sledování závislosti TAA na tepelných procesech v bobulovém ovoci. [43] Další moţností stanovení s UV-Vis detekcí je zhášení volného kation-radikálu ABTS•+

[2,2´-azinobis(3-ethyl-2,3-dihydrobenzothiazol-6-sulfonát)],

jehoţ

optimální

absorbance odpovídá 734 nm. Pouţit byl např. při stanovení TAA různých bylin [44] nebo jahodové šťávy. [45] Některé studie se zabývaly také porovnáním různých barevných indikátorů. Byly srovnávány radikál DPPH•, kation-radikál ABTS•+ a FRAP (Ferric Reducting Antioxidant Potential) při stanovení TAA extraktů guavy. [46]

HPLC s UV-Vis detekcí

Výhodou této metody je především moţnost vyuţití gradientové eluce látek a jejich následná UV-Vis detekce. Pro stanovení TAA je potřeba vyuţití barevného indikátoru. S pouţitím kation-radikálu ABTS•+ byla stanovována antioxidační aktivita 112-ti tradičních čínských rostli [47], ostruţin [48] a některých druhů červeného ovoce. [49] Radikál DPPH byl vyuţit např. při stanovení TAA bobulového ovoce v Chille [50] nebo brazilských jahod. [51] - 27 -

Experimentální část Cílem této práce bylo nejprve vybrat vhodné analytické metody a upravit je tak, aby byly pouţitelné pro stanovení celkové antioxidační aktivity ostruţin. Zvolenými metodami byly průtoková coulometrie, coulometrická titrace jódem a UV-Vis spektrometrie. Byla hledána vhodná hodnota pH elektrolytu a sledována míra pasivace elektrody u metody průtokové coulometrie, dále ředění extraktu z drobného ovoce, vhodný rozsah koncentrací kalibračních roztoků standardu askorbové kyseliny a její stabilita v čase. Pro spektrální metodu bylo nutné zjistit vhodný poměr methanolu a vody v roztocích DPPH a kyseliny askorbové ve vztahu k linearitě kalibračních závislostí. Závěr obsahoval zjištění opakovatelnosti extrakce do různých rozpouštědel a statistické zhodnocení korelovatelnosti dat.

Chemikálie a přístrojové vybavení V následujících tabulkách je uveden souhrn pouţitých látek pro stanovení celkové antioxidační aktivity ostruţin a přehled pouţitých měřících přístrojů a zařízení (Tab. 8 a 9).

Tab. 8

Seznam pouţitých chemikálií, jejich dodavatel, výrobní šarţe a čistota Název

Vzorec

Askorbová kyselina

C6H8O6

Fluka, Biochemika

2000662

Syntetický radikál DPPH Hydroxid sodný Hydrogenfosforečnan sodný Chlorid draselný Jodid draselný

C18H12N5O6 NaOH

Sigma, Life Science Lachner

217-591-8 311560906

Ultračistá (> 99,5 %) p.a. p.a.

Na2HPO4

Penta

230307FE

p.a.

KCl KI

Lachner Penta Kapaliny Fluka, Analytical Penta Moravský lihovar, Kojetín

314861106 1402150212B

p.a. p.a.

Kyselina fosforečná H3PO4 Methanol CH4O Ethanol C2H6O p.a. - pro analysis; denat. - denaturovaný

Dodavatel Pevné látky

- 28 -

Šarže

Čistota

2316332 p.a. (85%) 18100713A p.a. 95% denat.methanolem

Seznam přístrojového vybavení

Tab. 9

Přístroj Průtokový coulometr Potenciostat OH-405 Voltmetr Spektrofotometr Analytické váhy pH-metr Centrifuga Ultrazvuk

Název EcaFlow 120 GLP OH-405 Ises LAMBDA 25 UVIS Váhy KERN ALS 220-4 pH-metr 720 SET/SenTiX Centrifuge EPPENDORF 5702 Čistička ultrazvuková SONIC6

Výrobce Istran, Bratislava Radelkis, Budapešť, Maďarsko Radelkis, Budapešť, Maďarsko Perkin Elmer, USA Kern&Sohn, Balingen, Německo WTW, Weilheim, Německo Eppendorf, Hamburg, Německo Polsonic, Varšava, Polsko

Dále byly pouţity automatické pipety Eppendorf research, demineralizovaná voda z přístroje Aqual (Brno) a magnetická míchačka.

Přípravy roztoků Fosfátový pufr Do litrové odměrné baňky bylo odpipetováno 6,76 ml 85% H3PO4 a doplněno po rysku destilovanou vodou. Takto připravený 0,1mol/l roztok kyseliny fosforečné byl dále titrován 0,2 mol/l roztokem hydroxidu sodného (5,24 ml 50% NaOH na 500 ml destilované vody) na pH = 3. Připravený pufr byl pouţit na ředění vzorků a také jako elektrolyt pro průtokovou coulometrii.

Kalibrační roztoky Standard askorbové kyseliny byl naváţen na analytických vahách s analytickou přesností, kvantitativně převeden do odměrné baňky, rozpuštěn a doplněn destilovanou vodou po rysku na koncentraci 10 g/l. Takto připravený zásobní roztok byl dále ředěn destilovanou vodou na koncentrace 0,4; 0,3; 0,2; 0,1; 0,08 g/l.

- 29 -

Barevný indikátor DPPH Na přípravu 0,001 mol/l roztoku DPPH bylo naváţeno 39,5 mg pevné látky, rozpuštěno v několika militrech methanolu pomocí ultrazvuku, dále převedeno do 100 ml odměrné baňky a methanolem doplněno po rysku. Indikátor byl přidáván do všech vzorků měřených spektrofotometricky.

40% ethanol V odměrném válci bylo odměřeno 40 ml 95% ethanolu, převedeno do 100 ml odměrné baňky a doplněno destilovanou vodou po rysku.

Činidla jodometrické titrace Ke stanovení byl připraven 0,5 mol/l roztok jodidu draselného (16,6 g na 200 ml dest.vody), 0,2 mol/l roztok hydrogenfosforečnanu sodného (5,68 g/ 200 ml dest.vody) a 0,1 mol/l roztok chloridu draselného (0,7455 g/100 ml dest.vody).

Vzorky ostružin Ke stanovení antioxidační aktivity bylo vybráno 7 vzorků ostruţin, sbíraných na různých místech ČR, v regionech střední a severní Moravy a východních Čech, v období jejich zralosti. Mapa míst sběru je uvedena na obrázku (Obr. 7) a seznam s místy a daty sběru je uveden v následující tabulce (Tab. 10). Na přípravu extraktu z ostruţin bylo navaţováno 2,5 g zmraţených plodů a homogenizováno s 25 ml rozpouštědla. Jako rozpouštědla byla pouţita fosfátový pufr, destilovaná voda, methanol a 40% ethanol. Po homogenizaci byly vzorky centrifugovány

- 30 -

a následně zfiltrovány (Obr. 8). Z filtrátu bylo odebráno 10 ml do odměrné baňky a doplněno do 100 ml elektrolytem.

Tab. 10

Seznam míst a data sběru ostruţin

Místo: Hrubá Voda Litomyšl Hranice Dolní Bečva Libava Pohledy Ostrava

Obr. 7

Datum: 29.7.2013 14.9.2013 30.8.2013 31.7.2013 8.9.2013 10.8.2013 11.8.2013

Mapa s označením míst sběru ostruţin

Obr. 8 Obrázek vlevo – extrakty ostruţin připravené v různých extrakčních činidlech po centrifugaci; Obrázek vpravo – filtrace odstředěných vzorků

- 31 -

Postupy stanovení

Průtoková coulometrie Stanovení TAA bylo prováděno na elektrochemickém průtokovém coulometru (Obr. 9). Jádrem průtokového coulometru je jeho měřící cela, která se skládá z pracovní porézní uhlíkové elektrody (E56 C), referentní nasycené argentchloridové a pomocné platinové elektrody. Průtok je zajištěn peristaltickým čerpadlem, který teflonovými hadičkami přivádí elektrolyt nebo vzorek do měřící cely. Vyhodnocení bylo prováděno v programu EcaFlow Autosamper. Paramentry nastavení coulometru jsou uvedeny v tabulce (Tab. 11). K vyhodnocení celkové antioxidační aktivity byla pouţita metoda kalibrační křivky. Známé parametry výpočtu bylo moţno zadat do nastavení programu a výsledné hodnoty v poţadovaných jednotkách tak odečítat z počítače. Celková antioxidační aktivita byla vztaţena na koncentraci askorbové kyseliny. Nejprve byly proměřeny kalibrační roztoky AA a následovaly vzorky extraktů ostruţin v jednotlivých rozpouštědlech. Kaţdé měření bylo opakováno 5-krát.

Tab.11

Parametry nastavení průtokového coulometru ke stanovení TAA

Potenciál

Rozpouštění Objem Průtok Průtok během oxidace

Estart: 0 mV Estop: 900 mV Regenerace: -750 mV Istrip: 100 μA Max.čas: 600 s Vzorek: 3 ml Pozadí: 3 ml 5 - 6 ml/min Vypnutý

- 32 -

Obr. 9

Průtokový coulometr EcaFlow (Istran, Bratislava)

Coulometrická titrace jodem Zdrojem stejnosměrného proudu byl potenciostat OH-405, k němuţ byla připojena soustava dvou generačních Pt-elektrod (Obr. 10). Hodnota generačního proudu byla nastavena na 5 mA. Potenciometrická indikace bodu ekvivalence byla provedena pomocí modulu voltmetru v sestavě ISES, ke kterému byla připojena platinová indikační elektroda a nasycená kalomelové elektroda jako referentní. Body ekvivalence na titrační křivce byly vyhodnoceny programem WIN-ISES. Coulometrická titrace je stejně jako průtoková coulometrie zaloţena na Faradayových zákonech a výpočty byly prováděny dle následující rovnice:

M – molární hmotnost (176,12 g.mol-1); z – počet vyměňovaných elektronů při elektrodovém ději (2 e-); F – Faradayova konstanta (96458,31 C.mol-1); I – elektrický proud (5 mA); t – čas odečtený v bodu ekvivalence [s].

Výsledné hodnoty byly přepočteny na počet gramů askorbové kyseliny na 100 g váhy maţeného ovoce. Do anodové části coulometrické nádobky bylo odpipetováno 10 ml 0,5 mol/l roztoku KI, 10 ml 0,2 mol/l roztoku Na2HPO4, 30 ml destilované vody a 1 ml vzorku. Katodová část

- 33 -

nádobky byla doplněna na stejnou úroveň hladiny 0,1M KCl, aby nedocházelo k neţádoucí difúzi roztoků oddělených fritou. Měření probíhalo v míchaném roztoku.

Obr. 10

Zařízení pro coulometrickou titraci, školní experimentální systém

UV-Vis spektrometrie Měření absorbance bylo uskutečněno na UV-Vis spektrometru (Obr. 11) se softwarovým vybavením Wavelenght verze 2.85.04. Pouţitá vlnová délka byla 517 nm a k měření byly pouţity křemenné kyvety o tloušťce 1 cm. Detekce je zaloţena na průchodu světla, o určité vlnové délce, prostředím dle následující rovnice: Aλ = c.ελ.d A – absorbance pro danou vlnovou délku, c – koncentrace [mol.l-1], ε – molární absorpční koeficient pro danou vlnovou délku [l.mol.cm-1], d – tloušťka kyvety [cm]

Vzhedem k barevnosti extraktů z ostruţin a radikálu DPPH byly výsledné hodnoty absorbancí odečítány a přepočteny na procento zhášení dle následující rovnice: [49] A [%] = [(ADPPH – AVzorku) / ADPPH] . 100

- 34 -

Výsledné hodnoty byly přepočteny na počet gramů askorbové kyseliny na 100 g váhy maţeného ovoce. Sada kalibračních roztoků askorbové kyseliny byla připravována následujícím způsobem: ze zásobního roztoku AA byl odpipetován vypočtený objem, na 1 ml zředěn extrakčním činidlem a do 10 ml odměrné baňky doplněn methanolem. Vznikla tak kalibrační řada se stejným poměrem fází 1:9 extrakční činidlo:methanol. Vzorky extraktů z ostruţin byly po 1 ml odpipetovány do 10 ml odměrných baněk a extrakčním činidlem doplněny po rysku. Připravené roztoky byly dále míseny methanolickým roztokem barevného indikátoru DPPH v poměru: 2,7 ml methanolu, 300 μl DPPH a 10 μl vzorku. [49] Jako slepý pokus byly pouţity 3 ml methanolu. Hodnota absorbance byla měřena také pro roztok 2,7 ml methanolu s 300 μl DPPH pro odečtění jeho absorbance od měřených vzorků. Všechny vzorky byly pečlivě promíchány a půl hodiny ponechány inkubovat na tmavém místě. Následně byla proměřena absorbance všech kalibračních roztoků i vzorků extraktů z ostruţin.

Obr. 11

UV-Vis spektrometr Lambda 25 (Perkin Elmer, USA)

- 35 -

Opakovatelnost extrakce

Byla pouţita čtyři různá extrakční činidla: voda, fosfátový pufr o pH 3, methanol a 40% (v/v) vodný roztok ethanolu. Kaţdým činidlem bylo extrahováno vţdy 6 naváţek (po 1 g) jednoho vzorku ostruţin (Ostrava). Celková antioxidační aktivita byla stanovena metodou průtoková coulometrie. Výsledky jsou diskutoványv následující kapitole.

- 36 -

Výsledky a diskuze

Volba vhodného elektrolytu Pro zajištění vodivého prostředí u metody průtoková coulometrie je potřeba vhodného elektrolytu. Byla sledována časová stabilita odezvy askorbové kyseliny o koncentraci 50 μmol/l v různých prostředí o kyselém pH. Standard AA byl připraven do fosfátového pufru (pH=3), citrátového pufru (pH= 3) a octanového pufru (pH=4,5). Naměřené hodnoty spolu se směrodatnými odchylkami jsou uvedeny v tabulce (Tab. 12) a v grafu (Graf 7) jsou znázorněny závislosti signálu na čase.

Tab. 12 Plocha chronopotenciometrického signálu 50 μmol/l askorbové kyseliny (přepočítaná na koncentraci kyseliny) ve třech elektrolytech zaznamenaná v různých časových intervalech od přípravy roztoku Čas [min] 30 60 90 120 180 240 300 360

Fosfátový pufr (pH=3) [μmol/l] Průměr RSD 48,53 0,48 47,74 0,42 49,25 0,36 48,75 0,38 47,12 0,34 46,38 0,61 46,60 0,31 47,05 0,30

Citrátový pufr (pH=3) [μmol/l] Průměr RSD 47,19 1,70 40,12 0,34 41,83 1,63 39,66 1,15 43,36 2,22 43,16 1,99 39,27 1,40 33,59 0,80

- 37 -

Octanový pufr (pH=4,5) [μmol/l] Průměr RSD 49,73 0,30 45,38 0,16 40,12 0,64 36,59 1,34 25,32 0,70 19,11 0,48 11,07 0,17 7,89 0,55

Graf 7 coulometrie.

Graf závislosti odezvy askorbové kyseliny o koncentraci 50 μmol/l na čase; metoda průtoková

Z uvedených výsledků je patrné, ţe v prostředí octanového pufru o pH 4,5 docházelo k poměrně rychlému poklesu signálu AA zřejmě v důsledku její oxidace vzdušným kyslíkem. Naopak časově nejstabilnější odezvu poskytovala AA v prostředí fosfátového pufru o pH 3. Proto bylo toto prostředí vybráno pro měření TAA ostruţinových extraktů.

Pasivace elektrody Na průtokovém coulometru bylo provedeno opakované meření 100-krát ředěného vzorku ostruţin. Mezi jednotlivými měřeními zředěného extraktu se měřila odezva standardu askorbové kyseliny o koncentraci 50 μmol/l. V tabulce (Tab. 13) a grafu (Graf 8) jsou uvedeny výsledky měření odezvy AA a TAA ostruţinového extraktu. Hodnota TAA je vyjádřena jako molární koncentrace kyseliny askorbové, která poskytuje stejnou odezvu jako zředěný extrakt. Bylo zjišťováno, zda ostruţiny obsahují látky, které se mohou adsorbovat na povrch elektrody a sniţovat tak její odezvu.

Tab. 13 Měření 1 2 3

Naměřená data pro zjištění pasivace elektrody Ostružiny [μmol/l] TAA RSD 15,20 0,39 15,76 1,06 15,71 1,11

Askorbová kyselina [μmol/l] TAA RSD 47,74 1,81 46,81 1,48 46,96 0,53

- 38 -

4 5 6 7 8 9 10

Graf 8

14,38 15,04 16,64 16,62 15,01 15,79 15,88

0,75 0,69 1,37 0,58 1,80 0,92 0,61

48,68 48,03 49,65 46,59 47,23 46,10 47,69

0,12 0,67 0,55 1,74 2,54 1,62 0,84

Odezva askorbové kyseliny [μmol/l] mezi vzorky 100-krát ředěných ostruţin

Z uvedených výsledů lze pozorovat, ţe odezva askorbové kyseliny po změření extraktů z ostruţin, je poměrně stabilní. Rozdíly směrodatných odchylek se výrazně neliší a nebyla pozorována pasivace elektrody, tedy pokles signálu měřených vzorků.

Kalibrační řada s přídavkem DPPH Lineární rozsah DPPH radikálu je omezen pouze pro určitá rozmezí koncentrace. Z tohoto důvodu bylo proměřováno několik kalibračních řad a hledán vhodný poměr ředění. Nejvhodnější postup byl vybrán ze studie Jakobeka. [49] Výsledná kalibrační řada, pouţitá ke stanovení TAA extraktů z ostruţin, je uvedena na následujícím obrázku spolu s grafem a rovnicí regrese (Obr. 12).

- 39 -

Obr. 12

Kalibrační řada askorbové kyseliny s přídavkem DPPH

Antioxidační aktivita ostružin V následujících tabulkách (Tab. 14, 15 a 16) jsou uvedeny číselné hodnoty celkové antioxidační aktivity všech vzorků ostruţin z různých lokalit střední a severní Moravy a východních Čech. Výsledky jsou přepočteny na obsah askorbové kyseliny ve 100 g vzorku. Výsledky TAA jednotlivých metod jsou znázorněny na grafech (Graf 9, 10 a 11). Výsledky byly dále pouţity ke vzájemné korelaci metod.

Tab. 14

TAA vzorků ostruţin, pouţitá metoda průtoková coulometrie

[x mg/100g vzorku ostružin] Dolní Bečva Hrubá Voda Pohledy Litomyšl Hranice Libava Ostrava

Pufr 68,65 259,20 352,51 530,92 473,94 639,43 664,15

Destilovaná voda 55,00 196,38 188,64 221,09 393,55 459,03 448,17

Methanol 53,44 178,91 241,11 359,37 369,94 394,28 381,20

- 40 -

40% Ethanol 83,26 168,45 217,15 354,54 365,35 306,01 403,31

Graf 9

Grafické znázornění TAA vzorků ostruţin, pouţitá metoda průtoková coulometrie

Tab. 15

Hodnoty TAA vzorků ostruţin, pouţitá metoda coulometrická titrace


Graf 10

Pufr 98,79 259,55 169,18 174,19 247,60 232,86 301,05


Methanol 208,01 322,90 180,21 236,42 317,83 141,81 227,06

40% Ethanol 201,76 264,35 213,87 202,51 258,73 221,46 238,48

Grafické znázornění TAA vzorků ostruţin, pouţitá metoda coulometrická titrace

- 41 -

Tab. 16

TAA vzorků ostruţin, pouţitá metoda UV-Vis spektrometrie


Graf 11

Pufr 243,58 684,82 639,30 133,79 639,94 728,86 336,78


Methanol 366,64 574,24 759,91 133,79 610,31 787,87 461,69

40% Ethanol 183,24 495,09 665,50 100,04 633,63 684,04 413,39

Grafické znázornění TAA vzorků ostruţin, pouţitá metoda UV-Vis spektrometrie

- 42 -

Korelační analýza

Statistická analýza byla vyhodnocena programem QCExpert verze 3.3. Červeně označená data korelačních koeficientů v tabulkách, byla programem vyhodnocena jako statisticky významná.

Opakovatelnost extrakce Z analytické praxe je známo, ţe nejistota metod pouţívaných k přípravě analytického vzorku (např. extrakce) bývá větší neţ nejistota samotného měřeníc danou instrumentální technikou. Proto byla sledována opakovatelnost přípravy extraktů z ostruţin. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce (Tab. 17).

Tab. 17 Tabulka průměrných hodnot TAA extraktů ostruţin (Ostrava) a jejich relativní směrodatné odchylky opakovatelnosti extrakce Rozpouštědlo Pufr Voda Methanol 40% Ethanol

Relativní směrodatná odchylka RSD [%] 16,56 16,54 22,15 17,99

Průměrné hodnoty TAA 100-krát zředěných extraktů ostružin [mg/100g] 1,17 0,65 2,92 2,07

1,06

0,68

0,88

0,95

0,85

1,11 3,64 1,43

0,80 1,76 1,64

0,84 1,72 1,37

0,52 1,47 1,05

0,75 1,26 1,16

Exploratorní analýzou dat byla hodnocena opakovatelnost extrakce vzorků ostruţin. Statistický software nenalezl významné odchylky od šikmosti ani špičatosti a normalita byla přijata pro všechna data.

- 43 -

Korelace mezi rozpouštědly Pro porovnání extrahovatelnosti látek do daného rozpouštědla byla provedena jejich vzájemná korelace. V následujících tabulkách (Tab. 18, 19) jsou uvedeny hodnoty Spearmanových a párových korelačních koeficientů. Porovnávána byla TAA ostruţin (viz. Tab. 14, 15 a 16), měřených konkrétní metodou a v rámci metody byla korelována pouţitá rozpouštědla.

Hodnoty Spearmanových korelačních koeficientů

Tab. 18

Pufr:MeOH Průtoková coulometrie Coulometrická titrace UV-Vis spektrometrie

Spearmanův korelační koeficient Pufr:EtOH Pufr:Voda MeOH:EtOH

MeOH:Voda

EtOH:Voda

0,929

0,857

0,893

0,786

0,964

0,750

0,500

0,857

0,571

0,571

0,071

0,607

0,786

0,857

0,857

0,643

0,643

1,000

MeOH:Voda

EtOH:Voda

Hodnoty Párových korelačních koeficientů

Tab. 19

Pufr:MeOH Průtoková coulometrie Coulometrická titrace UV-Vis spektrometrie

Párový korelační koeficient Pufr:EtOH Pufr:Voda MeOH:EtOH

0,970

0,925

0,899

0,955

0,884

0,826

0,357

0,776

0,714

0,747

0,281

0,612

0,983

0,926

0,939

0,918

0,942

0,962

Červeně zvýrazněné hodnoty korelačních koeficientů byly programem QC-Expert vyhodnoceny jako významná data. Nebyly nalezeny velké rozdíly mezi extrakcí do vodné a alkoholové fáze. Nejvyšší hodnoty korelačních koeficientů odpovídaly metodám průtoková coulometrie i UV-Vis spektrometrie, zatím co coulometrická titrace se zdá být méně citlivá na pouţitá extrakční činidla.

- 44 -

Korelace mezi metodami Byla provedena korelační analýza vţdy mezi dvěmi metodami a porovnávány hodnoty Spearmanových a párových korelačních koeficientů (Tab. 20, 21 a 22; Graf 12, 13 a 14). Porovnávána byla TAA ostruţin pro všechna rozpouštědla, měřená různou metodou. Tab. 20 Hodnota Spearmanova a párového korelačního koeficientu při porovnání TAA všech vzorků ostruţin pro metody (A) průtoková coulometrie vs. (B) coulometrická titrace. Spearmanův koeficient A-B 0,330

Graf 12 coulometrie

Párový koeficient A-B 0,391

Korelační graf hodnot TAA mezi metodami (B) coulometrická titrace vs. (A) průtoková

Pouze párový korelační koeficient byl programem označen za statisticky významný. Z testu tedy vyplývá, ţe hodnoty naměřené průtokovou coulometrií a coulometrickou titrací jsou částečně vzájemně korelovatelné, jelikoţ se jedná o metody zaloţené na stejném principu přenosu elektronu.

- 45 -

Tab. 21 Hodnota Spearmanova a párového korelačního koeficientu při porovnání TAA všech vzorků ostruţin pro metody (A) coulometrická titrace vs. (B) UV-Vis spektrometrie. Spearmanův koeficient A-B 0,321

Graf 13 spektrometrie


Korelační graf hodnot TAA mezi metodami (A) coulometrická titrace vs. (B) UV-Vis

Pouze párový korelační koeficient, mezi metodami coulometrická titrace a UV-Vis spektrometrie, byl programem označen za statisticky významný. Z testu tedy vyplývá, ţe naměřené hodnoty jsou částečně vzájemně korelovatelné, vzhledem k podobnosti stanovení TAA pomocí sekundární reakce s činidlem v homogenní fázi.

Tab. 22 Hodnota Spearmanova a párového korelačního koeficientu při porovnání TAA všech vzorků ostruţin pro metody (A) průtoková coulometrie vs. (B) UV-Vis spektrometrie. Spearmanův koeficient A-B 0,100


- 46 -

Graf 14 spektrometrie

Korelační graf hodnot TAA mezi metodami (A) průtoková coulometrie vs. (B) UV-Vis

Spearmanův i párový korelační koeficient byl programem označen za statisticky nevýznamný. Z testu tedy vyplývá, ţe hodnoty naměřené průtokovou coulometrií a UV-Vis spektrometrií nejsou vzájemně korelovatelné. Je to pravděpodobně způsobeno zcela rozdílným principem stanovení celkové antioxidační activity ve vzorku.

- 47 -

Závěr Bobulové ovoce obsahuje celou řadu látek a jejich účinky jsou prospěšné pro lidský organismus. Tato práce byla zaměřena na celkovou antioxidační aktivitu extraktů ostruţin, coţ je souhrnná vlastnost mnoha látek, které byly zmíněny v jednotlivých kapitolách. Praktická část této práce se zabývala optimalizaci a porovnáním metod ke stanovení TAA. Byly zvoleny metody průtoková coulometrie, coulometrická titrace jódem a UV-Vis spektrometrie. Jako standardní látka pro stanovení celkové antioxidační aktivity extraktů ostruţin, byl pouţit roztok askorbové kyseliny vyjádřený jako koncentrace AA ve vzorku. Nejstabilnější odezvu měla AA při měření ve fosfátovém pufru o pH = 3. Problémem elektroanalytickcýh metod při měření vzorků se sloţitými matricemi je adsorpce vysokomolekulárních látek na elektrodu. Tento jev byl pozorován na vzorcích piva [33], u extraktů z ostruţin však pokles signálu sledován nebyl. Pro stanovení TAA spektrální metodou byl zvolen postup mísení uvedený v práci L. Jakobeka [49], který z řady měření byl nejlépe reprodukovatelný. Hodnoty antioxidační activity se liší nejen v závislosti na pouţité metodě a extrakčním činidle, ale především na místě a období sběru. Nejniţší hodnoty TAA byla naměřeny poměrně shodně u ostruţit sbíraných na Dolní Bečvě a Litomyšli, naopak nejvyšší hodnoty byly naměřeny ve vzorcích z Hranic, Libavy a překvapivě v průmyslové oblasti Ostravy. Rozdílné hodnoty antioxidační aktivity (od 50 – 789 mg/100 g mraţeného ovoce) jsou způsobeny především různým datem sběru. V plodech se během jejich růstu rychle mění jejich chemické sloţení a proto mohou být výsledky závislé na kaţdém dni.

- 48 -

Summary

Berry fruit contains many substances which are benefifial for human healt. The aim of this was measure the total antioxidant activity of blackberries extracts, which is sum of many substances, mentioned in the previous chapters. The practice part was concerned with looking for optimal conditions and compared methods for determination of TAA. Methods which were used for study are Flow-through coulometry, coulometric titration by iodine and UV-Vis spectrometry. Ascorbic acid was standard for measure TAA of blueberries extract. The most stable signal of AA is in the phosphate buffer pH = 3. The problem of complex matrix is adsorption high-molecular compounds on the electrode surface. This effect was observed on samples of beer [33], but not in the blackberries. The approach of mixing components is from study of L. Jakobek [49] The values of antioxidant activity are different not only by methods and extract reagents which were used, but especially by the places and the date of collection. The lowest values of TAA were measured in blackberries collected in Dolní Bečva and Litomyšl. The highest values were measured in the extracts from Hranice, Libava and surprisingly from industry area of Ostrava. High values of total antioxidant activity (from 50 – 789 mg/100 g mraţeného ovoce) might be caused by different dates of collection.

- 49 -

Seznam použitých zkratek

AA

Ascorbic acid (Askorbová kyselina)

ABTS

2,2´-azinobis(3-ethyl-2,3-dihydrobenzothiazol-6-sulfonát)

AIJN

Association of the Industry of Juices and Nectars from Fruits and Vegetables of the European Union (Organizace Evropské unie pro průmysl dţusů a nektarů z ovoce a zeleniny)

DDD

Doporučená denní dávka

DPPH

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazylový radikál

DPP

Differential Pulse Polarography (Diferenčně pulzní polarografie)

DPV

Differential Pulse Voltammetry (Diferenčně pulzní voltametrie)

FRAP

Ferric Reducting Antioxidant Potential

HPLC

High-Performance

Liquid

Chromatography

(Vysoko-účinná

chromtografie) PCA

Přenosný coulochemický analyzátor

RBP

Retinol-Binding Protein (Protein vázající retinol)

TAA

Total Antioxidant Activity (Celková antioxidační aktivita)

- 50 -

kapalinová

Seznam použité literatury

1. Martinec M., Zloch Z. : Výživa a potraviny 2; Nutriční hodnoty a antioxidační kapacita biopotravin a standardních potravin. Jejich změny po jednotýdenním skladování. Plzeň : rok 2009. 2. Paulová H., Bochořáková H. a Táborská E. : Metody stanovení antioxidační aktivity přírodních látek in vitro. místo neznámé : Chemické Listy. č. 98 (2004), str.174-179. 3. Hřebíčková Š. : Antioxidanty a volné radikály: rozdělení, jejich kapacita a aktivita. Výživa a potraviny 2 : rok 2009. 4. Scalbert A., Johnson T.I. a Saltmarsh M. : Polyphenols: antioxidants and beyond. The American Journal of Clinical Nutrition : č. 81 (2005), str. 215S - 217S. 5. Velíšek, J. : Chemie potravin 2. Tábor : rok 1999, OSSIS. 6. Mindell E., Mundisová H. _ Nová vitamínová bible. s.l. : 2006. 7. Odstrčil J., Odstrčilová M. : Chemie potravin. Brno : rok 2006, Národní centrum ošetřovatelství a nelékařských zdravotnických oborů. 8. Niki E., Noguchi N., Tsuchihashi H. a Gotoh N. : Interaction Among Vitamin C, Vitamin E and bkaroten. American Society for Clinical Nutrition : 62 (1995), str. 1322S-6S. 9. Kanai M., Raz A. a Goodman D.S. : Retinol-Binding Protein: The Transpotr Protein for Vitamin A in Human Plasma. The Journal of Clinical Investigation : č. 47 (1968), str. 2025 - 2044. 10. Underwood E.J. a Suttle N.F. : The Mineral Nutrition of Livestock. Midlothian, United Kingdom : rok 1981. 11. Papiz M.Z., Sawyer L., Eliopoulos E.E., North A.C.T., Findlay J.B.C., Sivaprasadorao R., Jones T.A., Newcomer M.E. a Kraulis P.J. : The Structure of b-lactoglobulin and Its Similarity to Plasma RetinolBinding Protein. Nature Publishing Group : č. 324 (1986), str. 383 - 385. 12. Cuyckens F., Claeys M. : Mass spectrometry in the structural analysis of flavonoids. Journal of mass spectrometry : č. 39 (2004), str. 461. 13. Oren-Shamir M. : Does anthocyanins degradation play a significant role in determining pigment concentration in plant? Plant Science : č. 177 (2009), str. 310-316. 14. Talcot T. S. : Berry Fruit: Value-Added Products for Health Promotion. s.l. : rok 2007. 15. Velíšek J. : Chemie potravin 1. Tábor : rok 2002, OSSIS.

- 51 -

16. Stój A. a Targooski Z. : Use of Sugar Content Analysis For the Estimation of Berry Juice Authenticity . Polish Journal of Food and Nutrition Sciences : č. 4 (2004), str. 403 - 409. 17. Hakkinen S., Heinonen M., Karenlampi S., Mykkanen H., Ruuskanen a Torronen R. : Screening of Selected Flavonoids and Phenolic Acid in 19 Berries. Food Research International : č. 32 (1999), str. 345-353. 18. Mrkakis P., Livingstone G. E., Fillers G. R. : Quantitativ Aspect of Strawberry Pigment Degradation. Food Research : č. 22 (1957), str. 117 - 130. 19. Fan-Chiang H.J. a Wrolstad E. R. : Anthocyanin Pigment Composition of Blackberries. Journal of Food Science : č. 70 (2005), str. 198 - 202. 20. Valášek P., Rob O. : Analýza potravin - přírodní látky. Zlín : rok 2007, Doplňkové texty k základnímu kurzu, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati. 21. Humpf H. a Schreier P. : Bound Aroma Compounds from the Leaves of Blackberry (Rubus laciniata L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry : č. 39 (1991), str. 1830 - 1832. 22. Kyzlink V. : Teoretické základy konzervace potravin. Bratislava : rok 1988. 23. Zýka J., kolektiv. : Analytická příručka. Praha : rok 1966, Státní nakladatelství technické literatury. 24. Barek J., Opekar F. a Štulík K. : Elektroanalytická chemie. Praha : rok 2005, Univerzita Karlova. 25. Ivarsson P., Krantz-Rülcker C., Winquist F. a Lundström I. : A Voltammetric Electronic Tongue. Chemical Senses : č. 30 (2005), str. i258 - i259. 26. Deisingh K.A., Stone C.D. a Thompson M. Applications of electronic noses and tongues in food analysis. International Journal of Food Science and Technology : č. 39 (2004), str. 587 - 604. 27. Shau-mei Ou A. : Study on Investigating the Sensory Quality of Taiwan Marketed Tea Drinks by Electronic Tongue. Central Thaiwan University of Science and Technology; Diplomová práce : rok 2010. 28. Singh J., Srivastava M., Roychoudhury A., Lee W.D., Lee H.S., Malhotra B.D. : Optical and Electro-catalytic Studies of Nanostructured Thulium Oxide for Vitamin C Detection. Journal of Alloys and Compounds : č.578 (2013), str. 405-412. 29. Randviir P. E., Metters P. J., Stainton J. a Banks E. C. : Electrochemical Impedance Spectroscopy Versus Cyclic Voltammetry for the Electroanalytical Sensing of Capsaicin Utilising Screen Printed Carbon Nanotube Electrode. The Royal Society of Chemistry : č. 10.1039 (2013), str. 1 - 12. 30. Fuente C., Acupa J.A., Vázquez M.D., Tascón M.L. a Btanero S.P. : Voltammetric Determination of the Phenolic Antioxidants 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole and tert-butylhydroquinone at a Polypyrrole Electrode Modified with a Nickel Phthalocyanine Complex. Talanta : č. 49 (1999), str. 441 452.

- 52 -

31. Blasco J.A., González C.M., Escarpa A. : Electrochemical Approach for Discriminating and Measuring Predominant Flavonoids and Phenolic Acid Using Differentioal Pulse Voltammetry: Towards Electrochemical Index of Natural Antioxidants. Analytica Chemica Acta : č. 511 (2004), str. 71 - 81. 32. Palma A., Montoya R. M., Arteaga F. J. a Mellado J. M. R. : Determination of Antioxidant Activity of Spices and Their Active Principles by Differential Pulse Voltammetry. Journal of Agricultural and Food Chemistry : č. 62 (2014), str. 582-589. 33. Riedelová P. : Využití průtokové coulometrie k měření antioxidační aktivity, Bakalářská práce. Univerzita Palackého, Olomouc : rok 2012. 34. Istran. Stanovenie kyseliny askorbovej. Aplikační list : č. 36. 35. Helán V. : Přenosný coulometrický analyzátor. Prospekt firmy Istran : rok 2005. 36. Guo Ch., Cao G., Sofic E. a Prior L. R. : High-Performance Liquid Chromatography Coupled with Coulometric Array Detection of Electroactive Components in Fruit and Vegetables: Relationship to Oxygen Radical Absorbance Capacity . Journal of Agricultural and Food Chemistry : č. 45 (1997), str. 1787-1796. 37. Barros L., Falcao S., Baptista P., Freire C., Vilas-Boas M. a Ferreira C.F.R.I. : Antioxidant Activity of Agaricus sp. Mushrooms by Chemical, Biochemical and Electrochemical Assays. Food Chemistry : č. 111 (2008), str. 61 - 66. 38. Gawron-Gzella A., Dudek-Makuch M. a Matlawska I. : DPPH Radical Scaveging Activity and Phenolic Compound Content in Different Leaf Extracts from Selected Blackberry Species. Acta Biologica Cracoviensia : č. 54/2 (2012), str. 32 - 38. 39. Song Y. a Xu B. : Diffusion Profiles of Health Beneficial Components from Goji Berry (Lyceum barbarum) Marinated in Alcohol and Their Antioxidant Capacities as Affected by Alcohol Concentration and Steeping Time. Foods : č. 2 (2013), str. 32 - 42. 40. Vulid J.J., Tumbas T.V., Savatovid M.S., Dilas M.S., Detkovid S.G. a Čanadanovid-Brunet M.J. : Polyphenolic Content and Antioxidant Activity of the Four Berry Fruits Pomace Extracts. APTEFF : č. 42 (2011), str. 271 - 279. 41. Guanalan G., Myla N. a Balabhaskar R. : In vitro Antioxidant Analysis of Selected Coffee Bean Varieties . Journal of Chemical and Pharmaceutical Research : č. 4 (2012), str. 2126 - 2132. 42. Yen G. a Chen H. : Antioxidant Activity of Various Tea Extracts in Relation to Their Antimutagenicity. Journal of Agricultural and Food Chemistry : č. 43 (1995), str. 27 - 32. 43. Arancibia-Avila P., Namiesnik J., Toledo F., Werner E., Martinez-Ayala L.A., Rocha-Guzmán E.N., Galleos-Infante A.J. a Gorinstein S. : The Influence of Different Time Durrations of Thermal Processing on Berries Quality. Food Control : č. 26 (2012), str. 587 - 593.

- 53 -

44. Zaporozhets A.O., Krushynska A.O., Lipkovska A.N. a Barvinchenko N.V. : A New Test Method for the Evaluation of Total Antioxidant Activity of Herbal Products. Journal of Agricultural and Food Chemistry : č. 52 (2004), str. 21 - 25. 45. Klopotek Y., Otto K. a Bohm V. : Processing Strawberries of Different Product Alters Contents of Vitamin C, Total Phenolic, Total Anthocyanins, and Antioxidant Capacity. Journal of Food Agricultural and Food Chemistry : č. 53 (2005), str. 5640 - 5646. 46. Thaipong K., Boonprakob U., Crosby K., Cisneros-Zevallos L. a Byrne H.D . : Comparison of ABTS, DPPH, FRAP, and ORAC Assays for Estimating Antioxidant Activity from Guava Fruit Extracts. Journal of Food Composition and Analysis : č. 19 (2006), str. 669 - 675. 47. Cai Y., Luo Q., Sun M. a Corke H. : Antioxidant Activity and Phenolic Compounds of 112 Traditional Chinese Medicinal Plants Associated with Anticancer. Life Sciences : č. 74 (2004), str. 2157–2184. 48. Céspedes L.C., Valdez-Morales M., Avila G. J., El-Hafidi M., Alarcón J. a Paredes-López O. : Phytochemical Profile and the Antioxidant Activity of Chilean Wild Black-berry Fruits, Aristotelia Chilensis (Mol) Stuntz (Elaeocarpaceae). Food Chemistry : č. 119 (2010), str. 886 – 895. 49. Jakobek L., Šegura M., Novak I. a Medvidovid-Kosanovid M. : Flavonols, Phenolic Acid, and Antioxidant Activity of Some Red Fruits. Deusche Lebensmittel-Rundschau : č. 103 (2007), str. 369 378. 50. Kahkonen P.M., Heinamaki J.,Ollilainen V. a Heinonen M. : Berry Anthocyanins: Isolation, Identification and Antioxidant Activities. Journal of the Science of Food and Agriculture : č. 83 (2003), str. 1403–1411. 51. Pineli O., Moretti L.C. a Chiarello D.M. : Quality, Bioactive Compounds and Antioxidant Activity of Strawberries Grown in The Brazilian Savannah and Stored at Different Temperatures. Journal of Food, Agriculture & Environment : č. 10 (2012), str. 165 - 171. 52. Pososchi A. M., Danet A. F. a Kaliwski S. Ascorbic Acid Determination in Commercial Fruit JuiceSamples by Cyclic Voltammetry. Romania : Journal of Automated Methods and Management in Chemistry, 2008. 53. Kilmartin P.A., Hsu C. F. Characterisation of Polyphenols in Green, Oolong, and Black Teas, and in Coffee, Using Cyclic Voltammetry. Food Science Programme, Department of Chemistry, The University of Auckland, New Zealand : Food Chemistry, 2003. 501 - 512. 54. Clarke S.F. a Foster J.R. : A History of Blood Glucose Metters and Their Role in Self-Monitoring of Diabetes Mellitus. British Journal of Biomedical Science : č. 69 (2012), str. 83 - 93.

- 54 -

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI. Přírodovědecká fakulta. Katedra analytické chemie

Recommend Documents