UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ 500 05 Hradec Králové, Heyrovského 1203, Česká republika, http://www.faf.cuni.cz tel. +420495067111, fax +420495518002
Katedra biologických a lékařských věd
Přehled práce na nálevnících z hlediska výuky a výzkumu v České Republice (bakalářská práce)
Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Jiří Hochmann, CSc. Vedoucí katedry: PharmDr. Petr Jílek, CSc.
Hradec Králové 2010
Turková Monika
1
Prohlášení Prohlašuji, ţe bakalářskou práci na téma „Přehled práce na nálevnících z hlediska výuky a výzkumu v České Republice“ jsem vypracovala samostatně za vyuţití odborné literatury a rad a nápadů svého školitele MUDr. Jiřího Hochmanna, CSc.
V Hradci Králové 20. srpna 2010 ….……………………
2
Poděkování Ráda bych poděkovala MUDr. Jiřímu Hochmannovi, CSc., vedoucímu mé bakalářské práce, za jeho podporu, trpělivost, cenné rady a připomínky při vzniku této bakalářské práce a také za veškerý čas, který mi během této práce věnoval. Dále bych ráda poděkovala Ing. Zuzaně Müllerové za její ochotu a poskytnutí materiálu (chemikálie, kultura paramecií).
3
1
ÚVOD .......................................................................................... 9
2
TEORETICKÁ ČÁST ................................................................. 10 2.1
Charakteristika prvoků ...................................................... 10
2.2
Morfologie prvoků ............................................................. 10
2.3
Dráţdivost prvoků a pohybové reakce .............................. 11
2.4
Rozmnoţování prvoků ...................................................... 12
2.5
Potrava prvoků .................................................................. 14
2.6
Systém prvoků .................................................................. 15
2.6.1
Nálevníci ....................................................................................... 16
2.6.2
Parazitičtí prvoci ......................................................................... 177
2.6.2.1
2.7
3
Nemoci způsobené prvoky ........................................................ 17
Praktická cvičení z biologie v roce 1963 ........................... 18
2.7.1
Mikrofotografie .............................................................................. 19
2.7.2
Mikrokinematogafie ...................................................................... 20
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST......................................................... 21 3.1 3.1.1
3.2 3.2.1
3.3 3.3.1
Materiál a metody ............................................................. 21 Laboratorní sklo, chemikálie a přístroje ........................................ 21
Kultivace nálevníků ........................................................... 21 Zrnková kultura ............................................................................. 21
Fotografování pomocí mobilního telefonu ......................... 23 Tvorba videosekvencí pomocí mobilního telefonu ........................ 24
3.3.2 Fotografování a tvorba videosekvencí pomocí digitálního fotoaparátu ................................................................................................ 24
3.4 Výpočet výsledné koncentrace testované látky působící na paramecia ................................................................................... 25 3.5
Experimentální ovlivňování paramecií .............................. 26
4
3.5.1
Chování neovlivněných paramecií: ............................................... 26
3.5.1.1
Na podloţním sklíčku ................................................................. 26
3.5.1.2
Na přikrytém podloţním sklíčku ................................................. 26
3.5.2
Galvanotaxe (reakce na elektrický proud) .................................... 26
3.5.3
Chemotaxe (reakce na podněty chemické) .................................. 27
3.5.4
Termotaxe (reakce na podněty tepelné) ....................................... 27
3.5.5
Reakce na zvýšenou salinitu prostředí ......................................... 28
3.5.6
Pokus na nadměrnou pinocytózu ................................................. 28
3.5.7
Fotodynamický efekt..................................................................... 29
3.5.8
Působení UV světla ...................................................................... 29
3.5.9
Působení etanolu.......................................................................... 29
3.5.10 Vitální barvení............................................................................... 30 3.5.11 Postvitální barvení ........................................................................ 30
Výsledky............................................................................ 31
3.6 3.6.1
Kvalita mikrofotografií ................................................................... 31
3.6.2
Porovnání mikroskopů .................................................................. 31
3.6.2.1
Mikroskop č. 1 ............................................................................ 32
3.6.2.2
Mikroskop č. 2 ............................................................................ 33
3.6.2.3
Mikroskop č. 3 ............................................................................ 33
3.6.3
Chování neovlivněných paramecií ................................................ 34
3.6.3.1
Na podloţním sklíčku ................................................................. 34
3.6.3.2
Na přikrytém podloţním sklíčku ................................................. 34
3.6.4
Galvanotaxe (reakce na elektrický proud) .................................... 35
3.6.5
Termotaxe (reakce na podněty tepelné) ....................................... 36
3.6.6
Pokus na nadměrnou pinocytózu ................................................. 36
3.6.7
Chemotaxe ................................................................................... 37
3.6.8
Reakce na zvýšenou salinitu prostředí ......................................... 37
3.6.9
Fotodynamický efekt..................................................................... 37
3.6.10 Působení UV světla ...................................................................... 38 3.6.11 Působení etanolu.......................................................................... 38 3.6.12 Vitální barvení............................................................................... 38 3.6.13 Postvitální barvení ........................................................................ 38
5
4
DISKUSE ................................................................................... 39
5
ZÁVĚR ...................................................................................... 41
6
SEZNAM LITERATURY ............................................................ 42
7
PŘÍLOHA ................................................................................... 44
6
Souhrn Tato bakalářská práce můţe slouţit jako odborná příručka jak pro studenty, tak pro jejich učitele při praktických cvičeních z obecné biologie. Snaţili jsme se studentům určitým způsobem obohatit jejich výuku v tomto předmětu, a to zejména při fotografování objektů v mikroskopu za pouţití mobilního telefonu, který je dnes kaţdodenní součástí ţivota studentů. Vlastně to byli studenti, kteří iniciovali tento nápad. V této bakalářské práci jsme pouze tento nápad ověřili a snaţili jsme se ho nějakým způsobem vylepšit (např. jednoduché připevnění na mikroskop). V tomto uspořádání lze filmovat i krátké videosekvence. Ověřili jsme i moţnost vyuţití digitálního fotoaparátu jako účinné náhrady za mobilní telefon. Dále jsme se studentům snaţili přinést nějaké detailnější informace týkající se modelového organismu, který je při praktických cvičeních pouţíván – Trepka velká (Paramecium caudatum). Jedná se např. o chování a změny tvaru tohoto organismu po intoxikaci, nebo i bez vlivu jakékoliv látky. I kdyţ jsou tyto organismy velice citlivé na působení vnějších podmínek, tak např. na samotném podloţním sklíčku přeţijí aţ 35 minut. V této bakalářské práci jsme prováděli pokusy, které jsou běţné na praktických cvičeních z biologie, ale snaţili jsme se je dělat do větších detailů, tak aby mohly zároveň slouţit i jako pomůcka pro učitele.
7
Summary This thesis can serve as a training manual for both, students and their teacher during the practical exercises on General Biology. We tried to enrich the teaching of students in some way in this course, especially at photography of objects under a microscope using a mobile phone, which is now a part of everyday life of students. Actually, there were even some students in our school who initiated this idea. We have only verified this idea in this work and we tried to improve it in some way (eg simple attachment to the microscope). It is possible also to film short movies in this arrangement. We verified the possibility of the use of a digital camera as an effective substitute for mobile phone. Furthermore, we have tried to bring for the students some detailed information on the model organism - Paramecium caudatum (Paramecium caudatum) which is used in practical exercises. The behavior and shape changes of the organism after intoxication, or even without the influence of any substance are some examples. Although these organisms are very sensitive to external conditions – they are able survive on the slide to 35 minutes. In this work, we performed the experiments, which are common in the practical lessons of biology, but we tried to do it in more details, so that they could serve also as a tool for teachers.
8
1 ÚVOD Nálevníci zaujímají zvláštní postavení mezi organismy. Jejich tělo je sloţené jen z jediné buňky a přesto je schopno projevů, se kterými se setkáváme u organismů mnohobuněčných, které mají specializované orgány pro jednotlivé ţivotní funkce. Jejich tělo je snadno přístupné pozorování za ţiva i na preparátech vhodně fixovaných a zbarvených. Z nálevníků je to nejčastěji Trepka velká (Paramecium caudatum), která je díky své velikosti a stavbě těla a snadné kultivaci vhodným modelovým organismem pro demonstraci organel. Tento experimentální organismus je pouţíván i zde na farmaceutické fakultě při praktických cvičeních z obecné biologie, kde se studenti při pohledu do mikroskopu snaţí tuţkou zachytit morfologické změny na těle Paramecia po působení testované látky či podnětu (Klusoňová, Lenčo 2007), (Jírovec 1953). Fotografování mobilním telefonem, jako nápad usnadnit si práci, ale zároveň zajímavým způsobem obohatit výuku iniciovali zahraniční studenti, kdyţ pomocí mobilního telefonu přiloţeného na okulár mikroskopu fotografovali Paramecia a jiné objekty v mikroskopu. Tento nápad podpořil Dr. Hochmann a vznikla tak přednáška zahraničního studenta na studentské vědecké konferenci (Ktenas 2008). Zkušenosti s tímto pedagogickým přístupem, pak byly prezentovány na sjezdu Biologické společnosti (Hochmann 2008). V návaznosti na to byla vypsána témata bakalářských prací s tímto zaměřením. Cílem této bakalářské práce je provádět metody praktického cvičení z obecné biologie s těmito organismy, naučit se je fotografovat a získávat krátké videosekvence a pokusit se navrhnout obohacení výuky v tomto předmětu.
9
2 TEORETICKÁ ČÁST
2.1 Charakteristika prvoků Historie: Poněvadţ téměř všichni prvoci jsou organismy mikroskopických rozměrů, mohli být pozorováni teprve po vynálezu vhodného zvětšovacího přístroje. Objevitelem jednobuněčných organismů a tedy otcem protozoologie byl Holanďan Antony van Leeuwenhoek (1632-1723). Byl prvým, kdo pozoroval, nakreslil a popsal prvoky (hlavně nálevníky) (Hausmann 2003). Prvoci
jsou
jednobuněčné,
eukaryotní
organismy.
Jsou
schopni
uskutečňovat samostatně všechny ţivotní funkce, protoţe mají plně vyvinuté membránové systémy a vytváří buněčné organely. Tím se liší od buněk prokaryontních (Chroust 1998).
2.2 Morfologie prvoků Buňky prvoků jsou charakterizovány cytoplazmatickou membránou, která obaluje buňku a vytváří prostředí pro buněčné organely a jejich činnost. Je zpravidla bezbarvá. Bývá rozlišena na vnější a homogenní ektoplazmu a vnitřní řidší entoplazmu. Bičíkovci, nálevníci a výtrusovci mají tělo ve zvláštní tuţší blance pelikule. Ţivotní pochody v těle prvoka (např. pohyb, dráţdivost, rozmnoţování) zajišťují specializované organely. (Jelínek 1998) Rozlišujeme: Organely opory a ochrany – např. pelikula bičíkovců, schránky kořenonoţců. Ochranným zařízením mnohých druhů prvoků jsou cysty, které prvoci vytvářejí za nepříznivých ţivotních podmínek (sucho, mráz, nedostatek potravy). Encystace umoţňuje jejich přeţití. Organely pohybové – např. panoţky kořenonoţců, bičíky bičíkovců a brvy nálevníků Organely trávicí – trávicí vakuolu, příp. buněčná ústa, buněčnou řiť, vytvářejí všichni prvoci ţivící se heterotrofně organickými látkami.
10
Organely vylučovací a osmoregulační – např. pulzující vakuola. U sladkovodních
prvoků
odstraňuje
vodu,
pronikající
do
těla
prvoka
z hypotonického sladkovodního prostředí. Uvnitř těla tak udrţuje stálý osmotický tlak (krásnoočko, trepka) Organely smyslové – umoţňují reakci prvoků na podněty přicházející z vnějšího prostředí. Krásnoočko má k vnímání světla uzpůsobený mimořádně citlivý okrsek cytoplazmy – stigma. Neuromotorický aparát trepky koordinuje pohyb brv (Jelínek 1998).
Obr. č. 1: Schématická kresba organel paramecia (Gymnázium Přerov 2010)
2.3 Dráţdivost prvoků a pohybové reakce Pohyb prvoků je zajišťován nejjednoduššími organelami. Panoţky (pseudopodie) jsou tvořeny výběţky cytoplazmy na různých místech těla buňky. Mohou mít různý tvar, široké lobopodie nebo úzké filopodie, příp. rozvětvené
11
rhizopodie. Trvalými organelami pohybu jsou dále bičíky (flagella), příp. jemné řasinky cilie. Bičíky vystupují v buňce z bazálního tělíska – kinetozomu. Některé bičíky mohou být trvale spojeny s buněčnými membránami a vytváří tak undulující membránu – významný orgán pohybu, táhnoucí se podél části nebo celé délky prvoka. Někteří parazitičtí prvoci se pohybují tzv. klouzavý pohybem, jehoţ mechanismus není dosud přesně znám (Chroust 1998). Prvoci podobně jako jiné organismy, reagují na změny podmínek vnějšího prostředí. U nálevníků slouţí brvy k vnímání podnětů chemických a dotykových. Nejnápadnějšími reakcemi u prvoků jsou reakce pohybové (taxe), které se projevují změnami v rychlosti nebo směru pohybu. Jimi se mohou prvoci vyrovnat se změnami okolních podmínek tím, ţe se vzdalují z dosahu vlivů, které na ně svou kvalitou nebo kvantitou působí nepříznivě a vyhledávají taková místa, v nichţ podmínky odpovídají poměrům, jimţ je jejich organismus přizpůsoben. Povaha reakce závisí na intenzitě a povaze podnětů. Podnět slabší intenzity vyvolává odpověď pozitivní: prvok se obrací a pohybuje se směrem ke zdroji podnětu, kdeţto podnět silnější má za následek reakci negativní, tj. obrácení a pohyb od ohniska podnětu (Jírovec 1953).
2.4 Rozmnoţování prvoků Pro prvoky je běţnější rozmnoţování nepohlavní. Buňka mateřská se při něm dělí na dvě buňky dceřiné, které časem dorostou. Např. bičíkovci dělením podélným,
nálevníci
dělením
příčným,
rournatky
pučením,
výtrusovci
schizogonií (rozdělením mateřské buňky na větší počet buněk dceřiných). Střídá-li schizogonii rozmnoţování pohlavní, vytvářejí se po splynutí spory. Nepohlavním rozpadem spor (sporogonií) vznikají infekční stadia, napadající nové hostitele. Dírkonošci a mříţovci střídají pohlavní a pohlavní rozmnoţování. Pohlavní rozmnoţování prvoků je méně obvyklé, je fylogeneticky mladší. Jeho klíčový význam spočívá ve zvýšení ţivotaschopnosti nově vzniklých jedinců. Po oplození prvoků dochází k dočasnému zastavení vývoje (zpravidla k encystaci). Rozlišujeme dva typy pohlavního rozmnoţování prvoků: kopulaci (je známa u bičíkovců, kořenonoţců a výtrusovců) a konjugaci, typickou pro nálevníky. Při kopulaci splývají dva jedinci, představující pohlavní buňky. Při konjugaci, která je v ţivočišné říši zcela zvláštním způsobem pohlavního
12
rozmnoţování
nálevníků,
dochází
pouze
k částečné
výměně
hmoty
mikronukleů. Trepka je typicky dvojjaderným ţivočichem. Makronukleus má funkci vegetativní (tvorba mRNA pro syntézu trávicích enzymů), mikronukleus má funkci rozmnoţovací. Trepka se nejčastěji mnoţí příčným dělením, ale i pohlavně konjugací. Konjuganti se k sobě přiloţí buněčnými ústy. Po rozpadu makronukleu se v kaţdém konjugantovi dvarát rozdělí mikronukleus. Vzniknou z něj čtyři jádra, z nichţ tři degenerují a jádro nejbliţší buněčným ústům se redukčně rozdělí na menší haploidní jádro migratorní s funkcí samčí a větší, rovněţ haploidní, jádro stacionární s funkcí samičí. Migratorní jádra se s částí cytoplazmy přelijí do partnerského konjuganta a splynou s jeho stacionárním jádrem v synkaryon. Poté se konjugaci rozestoupí. Následují tři za sebou jdoucí jaderná dělení, z nichţ vzniknou 4 mikronukly
a 4 makronukly. Makronukly zůstávají, 3
mikronukly degenerují a čtvrtý se mitoticky rozdělí. V zápětí dochází k příčnému dělení exkonjugantů (tedy jedinců, kteří se předtím zúčastnili konjugace). Kaţdý z nich pak obsahuje dva makronukly a jeden mikronukleus. Proces dělení mikronukleu a následné dělení buňky se znovu opakuje. Výsledkem konjugace jsou 4 plus a 4 noví ţivotaschopní jedinci (Jelínek 1998).
Obr. č. 2: Schéma sexuálních procesů paramecia (Jelínek 1998)
13
1 - dvě trepky se k sobě přiblíţí ústními poli 2,2´- rozpad makronukleu a vznik 4 mikronukleů 3- tři mikronukly zanikají, čtvrtý se dělí na jádro stacionární a migratorní 4- výměna migratorních jader 5- splynutí stacionárního jádra s vyměněným jádrem migratorním 6- vznik vícejaderného synkaryonu 7- oddálení (vznik exkonjugátů) 8- pokračující vývoj jader
2.5 Potrava prvoků Prvoci mají schopnost vyuţít různých potravních zdrojů. Můţeme si u nich povšimnout různých potravních vztahů k jiným organismům. Všechny autotrofní rostliny jsou díky fotosyntéze schopné přetvářet anorganické ţiviny na organické látky svých těl. Produkují organické látky, a proto jsou stejně jako fotosyntetizující krásnoočka, sinice a řasy označovány jako producenti. Ti prvoci, kteří se ţiví sinicemi a řasami, můţeme povaţovat za konzumenty 1. řádu (jsou to vlastně býloţraví prvoci). Jiní prvoci, jako je např. mrskavka nebo řada rournatek, se ţiví heterotrofními organismy. Jsou vyloţenými dravci (predátory) a poţírají jiné prvoky. Mají charakter konzumentů 2. řádu. Samotní prvoci jsou sloţkou potravy některých mnohobuněčných organismů, např. ryb. Prvoci se ovšem ţiví také částečkami organické hmoty. Ty pocházejí z odumřelých rostlin a jiných ţivočichů. Prvoci tyto částečky tráví a rozkládají na jednodušší organické látky, popř. na látky anorganické. Nacházejí se tedy na úplně opačném konci koloběhu látek v přírodě neţ autotrofní rostliny. Organické látky naopak rozkládají, a mohou být proto řazeni k reducentům. Tito prvoci ţivící se hnijícími organickými látkami mají obrovský význam. Nejen ţe mohou půdě navracet ţiviny, ale podílejí se i na čištění vod. Z hlediska potravní strategie je také označujeme jako saprofágy. Charakteristickými saprofágy je např. celá řada bičíkovců rodu bodo a nálevníci. Jednotlivé druhy mohou být přizpůsobeny prostředí s různým stupněm hnití. Můţeme říci, ţe jsou vlastně potravními specialisty na různě shnilé organické
14
látky. Na této skutečnosti je zaloţena jedna z metod hodnocení čistoty vod, kdy podle zastoupení druhů můţeme určit její stupeň saprobity. Hodnocení saprobity vod je jednou z metod, kdy prvoky vyuţíváme jako bioindikátory stupně znečištění vod (mnoţství trepek je přímo úměrné stupni znečištění). Svými potravními nároky na prostředí, ve kterém ţijí, indikují jeho kvalitu. Některé druhy prvoků (např. měňavka střevní) se ţiví odpadními látkami ve střevě obratlovců, aniţ by jim prospívaly či škodily. Můţeme je povaţovat za komenzální prvoky. Naopak brvitky ve střevě termitů nebo bachořci v ţaludku přeţvýkavců svým hostitelům jednoznačně prospívají. Jejich hostitelé zajišťují přísun celulózy a oni ji štěpí na stravitelné sacharidy. Jde o vzájemně prospěšný vztah. Brvitky a bachořci jsou prvoci symbiotičtí (Papáček 2000).
2.6 Systém prvoků Kmen: Praprvoci (Sarcomastigophora) Nejjednodušší jednobuněčné organismy, které se nacházejí na rozhraní říše rostlin, ţivočichů a hub. Pohybují se bičíky (Bičíkovci) nebo panoţkami (Kořenonožci) Bičíkovci
Podkmen:
–
např.
Trypanosoma
spavičná
(Trypanosoma
gambiense), bičenka poševní (Trichomonas vaginalis), lamblie střevní (Giardia lamblia) Podkmen: Kořenonožci (Sarcodina) – např. měňavky (Amoebina), Krytenky Dírkonošci
(Testacea),
(Foraminifera),
Slunivky
Mříţovci
(Heliozoa),
(Radiolaria) Kmen: Výtrusovci (Apicomplexa) – všichni zástupci tohoto kmene jsou osmotrofní endoparazité, kteří pronikají do buněk svých hostitelů. Např. Kokcidie
jaterní
(Eimeria
stiedae),
Toxoplasma
gondii,
Krvinkovky
(Haemosporina) Kmen: Hmyzomorky (Microspora) – jsou to obvykle parazité členovců Kmen: Výtrusenky (Myxozoa)
15
2.6.1 Nálevníci Kmen: Nálevníci (Ciliophora = řasinky nesoucí) - jsou prvoci s nejsloţitější tělesnou stavbou. Za své české jméno vděčí nálevníci tomu, ţe se jejich aktivní stadia objevují v nálevech připravených ze sena nebo trávy a vody. Objevují se tam proto, ţe do nálevu jsou se senem přenesena zároveň i jejich klidová stadia, cysty, které se ve vodním prostředí opět zaktivují. Pelikula nálevníků je značně silná, tvořená dvojitou membránou. Nese pravidelně rozmístěné pohybové organely, řasinky, které se svou stavbou podobají bičíkům. Svým koordinovaným pohybem umoţňují trepce pohyb vodním prostředím, případně přihánějí potravu. Jejich koordinovanou činnost umoţňuje neuromotorický aparát, tvořený sítí vlákenek, propojujících pod povrchem těla bazální tělíska brv. V pelikule jsou drobné trichocysty. Jsou to váčkovité organely obsahující látky s charakterem buněčných jedů. Při podráţdění svůj obsah „vystřelují" a ten ve vodě tuhne v rosolovité vlákno. Trepka se ţiví bakteriemi a drobnými řasami. Potravu přijímá buněčnými ústy, která pokračují do nitra buňky nálevkovitým buněčným hltanem, do něhoţ je mikroskopická potrava strhávána vířením příústních brv – ústní políčko. Zplodiny látkové přeměny jsou odstraňovány na určitém místě těla – buněčná řiť. Metabolity rozpustné ve vodě jsou odstraňovány dvěma pulsujícími vakuolami, které mají osmoregulační funkci (Papáček 2000), (Jelínek 1998). Nejznámější nálevníci jsou druhy rodu trepka (Paramecium). V přírodě se vyskytují v rybníčcích, tůních, rašeliništích, ale i louţích a příkopech. Dalšími běţnými druhy nálevníků je bobovka (Colpidium) a vejcovka (Glaucoma). Známe i přisedlé nálevníky, jako je např. vířenka (Vorticella) a mrskavka (Stenor) (Papáček 2000).
16
2.6.2 Parazitičtí prvoci Celá čtvrtina dosud známých druhů prvoků dlouhodobě vyuţívá látek z těl mnohobuněčných ţivočichů jako ţivin ke svému prospěchu. Cizopasí a svým hostitelům škodí. Tito parazitičtí prvoci jsou velmi specializovanými organismy. Stejně jako někteří saprofágní prvoci mohou ţít v bezkyslíkatém prostředí. Nemají pulzující vakuoly. Ţijí v izotonickém prostředí. Najdeme je mezi bičíkovci (bičenky, trypanozoma, lamblie), kořenonoţci (měňavka úplavičná) i nálevníky (některé rournatky). Výtrusovci, výtrusenky a hmyzomorky jsou kmeny, které zahrnují výhradně parazitické druhy. Parazitičtí prvoci mají relativně menší šanci nalézt zdroj potravy neţ prvoci ţijící volně. Musí proniknout do těla svého hostitele při náhodné nákaze nebo musí být do jeho těla vpraveni přenašečem. Tuto menší šanci získat potravu a zachovat sled svých potomků si vynahrazují většinou obrovskou rozmnoţovací schopností (Papáček 2000).
2.6.2.1 Nemoci způsobené prvoky U člověka se uplatňují jako parazité střevního traktu (Giardia, střevní měňavky,
střevní kokcidie,
Balantidium),
parazité
urogenitálního
traktu
(Trichomonas vaginalis), parazité CNS (Toxoplasma gondii, náhodné nákazy volně ţijícími měňavkami), krevního a lymfatického systému a k němu náleţejících buněk (africké trypanosomy, leishmanie, Plasmodium, babesie), parazité tkání v nejrůznějších orgánech (Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii aj.) (Bednář 1996). Trypanosoma spavičná (trypanosoma gambiense) – je to parazit vyskytující se v tropech, který způsobuje spavou nemoc. Trypanosoma parazituje v krevní plasmě, lymfě a mozkomíšním moku. Jejím přenašečem je moucha tse-tse. Trypanosoma způsobuje zduření uzlin a stále častěji se opakující horečky. Není- li spavá nemoc léčena, postiţený během několika měsíců umírá naprostým vyčerpáním. Bičenka poševní (Trichomonas vaginalis) – způsobuje nemoc trichomoniázu, která se projevuje úpornými záněty močových cest a hnisavým výtokem z pochvy. Šíří se pohlavním stykem. Přenašeči jsou muţi, i kdyţ sami výše uvedenými příznaky netrpí.
17
Lamblie střevní (Giardia lamblia) – způsobuje horečnaté záněty tenkého střeva Měňavka úplavičná (Entamoeba histolytica) – způsobuje krvavé průjmy a horečky Toxoplasma gondii – je nebezpečná pro těhotné ţeny a vyvíjející se plod. Parazituje zejména v bílých krvinkách. Je přenosná ze zvířat (nejčastěji z koček). Projevuje se dlouhodobými teplotami, zduřením mízních uzlin a únavou Krvinkovky (Haemosporina) – jsou cizopasníci červených krvinek obratlovců, v nichţ se schizogonicky pomnoţí. Ke kopulaci jejích gamet dochází ve slinných ţlázách samiček komára rodu Anopheles. Infekční stadia se při sání dostanou do těla člověka. Napadají červené krvinky, v nichţ se intenzivně schizogonicky mnoţí. V pravidelných intervalech z krvinky vyhřeznou a napadají krvinky další. Do krve uvolněné metabolity způsobují malarické záchvaty, projevující se vysokými horečkami a následnými zimnicemi (Jelínek 1998).
2.7 Praktická cvičení z biologie v roce 1963 Jen pro zajímavost jsme v této bakalářské práci uvedli, jaké moţnosti zaznamenání objektů v mikroskopu měli studenti na praktických cvičeních z biologie, která probíhala podle skript z roku 1963 na Lékařské fakultě v Hradci Králové v porovnání s těmi dnešními na naší Farmaceutické fakultě. Zatímco
na
dnešních
praktických
cvičení
má
student
moţnost
vyfotografovat si obraz v mikroskopu pomocí mobilního telefonu, studenti před 50 ti lety tuto moţnost neměli. Mikroskopické objekty kreslili přímo „od ruky“ nebo mohli vyuţít kreslících přístrojů. To je umoţněno nejčastěji tím, ţe do cesty světelnému paprsku jsou vloţeny dva hranoly, z nichţ jeden zasahuje do poloviny zorného pole tak, ţe současně volnou polovinou pozorujeme objekt. Představitelem tohoto zařízení je kreslící přístroj Abbeův (Obr. č. 3). U tohoto typu přístrojů se promítne obraz preparátu na papír, kde jsou jeho obrysy
18
obkreslovány. To se muselo dít v zatemnělé místnosti. Nejjednodušším zařízením tohoto typu je obyčejný monokulární mikroskop zlomený v kloubu. Do tohoto mikroskopu svítíme silnějším světelným zdrojem při odstraněném zrcátku a obraz promítneme na svislou stěnu. Nebo můţeme promítnout pomocí zrcátka obraz do horizontální polohy na promítací plochu, kde obrysy obkreslíme (Obr. č. 4).
Obr. č. 3: Připevnění malého zrcadla na projektiv (= na okulár) mikroskopu
Obr. č. 4: Připevnění druhého zrcadla k projekci na papír pro kreslení
2.7.1 Mikrofotografie
Pro zobrazení mikroskopických objektů fotografickou cestou se hojně vyuţívalo
mikrofotografie
a
mikrokinematografie.
Tato
metoda
vyuţívá
fotografických komor (Obr. č. 5). Jsou to přístroje, které mají vyjímatelný objektiv, protoţe při mikrofotografii je optika fotografického aparátu nahrazena optikou mikroskopu. Mikrofotografie je umoţněna projekcí mikroskopického obrazu – v dřívějším pojetí – na citlivou vrstvu, tím získáme negativní materiál, který je následně vyvolán pomocí vývojky a ustalovače.
19
Obr. č. 5: Staré mikrofotografické zařízení uvedené ve skriptech z roku 1963
2.7.2 Mikrokinematogafie Princip
je
stejný
a
podstata
spočívá
v tom,
ţe
se
zhotovují
mikrofotografie v určitých časových intervalech např. 6x za minutu. Promítáme-li takto získaný filmový záznam frekvencí např. 24 obrázků za vteřinu, tak děj, který trval ve skutečnosti 40 minut, proběhne na promítací ploše za 10 vteřin. Této metody se vyuţívalo ke sledování pomalu probíhajících dějů (např. buněčné dělení).
20
3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 Materiál a metody 3.1.1 Laboratorní sklo, chemikálie a přístroje Laboratorní sklo: podloţní sklíčka, krycí sklíčka, pipety, zkumavky, kádinky, odměrný válec Chemikálie: glukóza, chlorid sodný, eozin, methylenová modř (Merck), bazický fuchsin (Lachema), etanol, glycerin Přístroje: mikroskop (MEOPTA, Studar H, HUND V300) mobilní telefon s fotoaparátem (Sony Ericsson k550i), digitální fotoaparát (Panasonic DMC – FS62) Ostatní: plochá baterie s elektrodami, čistá kultura nálevníků (Paramecium caudatum), pasterka, pinzeta, kousek ledu, UV lampa, 100W ţárovka, elektrická plotýnka, analytické váhy
3.2 Kultivace nálevníků Nálevníci jsou organismy, které se rychle rozmnoţují a je proto moţné jich získat v krátkém čase dostatečné mnoţství. Můţeme je získat z velmi znečištěné vody, nejlépe z vody, ve které dochází k hnilobným procesům a obsahuje dostatek bakterií – potravy pro nálevníky (znečištěné tůňky, odpadní stoky, malé vodní plochy s hnilobným zápachem). V literatuře najdeme mnoho způsobů, jak pěstovat nálevníky. Zde na fakultě je ke kultivaci pouţívána zrnková kultura (Pedagogická fakulta Brno 2010).
3.2.1 Zrnková kultura Vezmeme zkumavku, přidáme 2 – 3 zrnka pšenice, do 2/3 naplníme tekoucí vodou, uzavřeme vatovým tamponem a dáme vařit do vodní lázně, aţ zrnka zcela prasknou (event. doplníme vodu během vaření). Zároveň dáme
21
vařit do 2 zkumavek pouze vodu (na doplňování při vaření). Po uvaření dáme zkumavky do kádinky s černým papírem a uloţíme do temna při 22 ˚C. Po vychladnutí očkujeme: ze zkumavky s Parameciem přeočkujeme do zkumavky se zrnky pšenice pasterkou s gumovou zátkou, sterilní (oţíhneme nad kahanem a necháme vychladnout). Z 1 zkumavky přeočkujeme asi do 2 zkumavek. Zkumavky označíme datem kultivace, uzavřeme vatovým tamponem (umoţňuje přívod kyslíku, zabraňuje nadměrnému vypařování vody a kontaminaci cizorodými látkami) a uchováváme ve tmě při pokojové tepotě. Prohlíţíme proti lampě a tmavému papíru (vidíme malé bílé tečky – viz obr. č 6). Kontrolujeme asi 2x týdně, protoţe na hladině se tvoří blanka, kterou je nutno odstranit z důvodu přísunu kyslíku. Větší mnoţství roste nejméně měsíc (Müllerová osobní sdělení).
Obr. č. 6: – Zkumavka s paramecii
22
3.3 Fotografování pomocí mobilního telefonu Toto fotografování lze provádět dokonce i bez pouţití jakéhokoliv adaptéru, při pouhém přiloţení objektivu fotografického zařízení mobilního telefonu na okulár mikroskopu. Jestliţe však je potřeba např. eliminovat třes rukou, tak je výhodné pouţít improvizovaný dřevěný adaptér, kterým se mobilní telefon připevní k okuláru. K tomuto uspořádání je potřeba mobilní telefon vybavený fotoaparátem, dále speciální prkénko, které má velikost jako pouţitý mobilní telefon, s otvorem pro okulár mikroskopu (tento otvor musí přesně odpovídat okuláru daného mikroskopu) a obyčejnou gumičku, kterou vše k sobě připevníme (uspořádání podle Dr. Hochmanna – viz obr. č. 7). Nejprve opatrně vyjmeme okulár mikroskopu a vsadíme ho do otvoru ve dřívku. Poté na dřívko poloţíme mobilní telefon, tak aby se okulár mikroskopu a objektiv mobilního telefonu vzájemně překrývali. Vše spojíme obyčejnou gumičkou a nasadíme okulár zpět na mikroskop. V mobilním telefonu si nastavíme reţim pro fotografování a zvolíme zvětšení, které nám bude nejvíce vyhovovat. Na displeji mobilního telefonu se nám zobrazí zorné pole mikroskopu (viz. obr. č. 8). Pokud je třeba doostřímě obraz mikrošroubem mikroskopu a můţeme fotografovat.
Obr. č. 7: Prkénka pro připevnění mobilního telefonu k okuláru (pro různé okuláry)
23
Obr. č. 8: Připevnění mobilního telefonu na prkénko pro zhotovení fotografie nebo videozáznamu
3.3.1 Tvorba videosekvencí pomocí mobilního telefonu Pro tvorbu videosekvencí pouţijeme stejné uspořádání jako pro fotografování. Jedinou změnou je to, ţe na mobilním telefonu si musíme nastavit reţim pro video. Pomocí šroubů na stolku mikroskopu můţeme preparátem libovolně pohybovat a zaznamenávat tak pohyb paramecií.
3.3.2 Fotografování a tvorba videosekvencí pomocí digitálního fotoaparátu Pouţijeme digitální fotoaparát, na kterém si podle potřeby nastavíme reţim pro fotky, nebo pro video. Takto nastavený fotoaparát přiloţíme objektivem přímo na okulár mikroskopu. Na displeji se nám zobrazí zorné pole mikroskopu (viz obr. č. 9), které si podle potřeby doostříme mikrošroubem mikroskopu a na digitálním fotoaparátu si nastavíme zvetšení. Poté pomocí šroubů pohybu na mikroskopu můţeme preparátem libovolně pohybovat a pořizovat fotky nebo videa. Nevýhodou je, ţe musíme digitální fotoaparát drţet v ruce a druhou rukou pohybovat preparátem. Velkou výhodou ale je, ţe na
24
fotoaparátu lze nastavit velké zvetšení a preparát je tak moţné si detailně přiblíţit. Všechny fotografie v této práci byly pořízeny tímto způsobem.
Obr. č 9: Přidrţení digitálního fotoaparátu rukou na okuláru mikroskopu bez jeho fixace na prkénko
3.4 Výpočet výsledné koncentrace testované látky působící na paramecia Koncentrace testované látky není výsledná koncentrace, která na paramecia působí, protoţe se tato koncentrace zředí kapkou vody, ve které jsou paramecia v poměru 1:1 (předpokládá se, ţe kapeme stejné kapky), proto je výsledná koncentrace poloviční. Tímto způsobem jsme postupovali v celé práci a v tabulkách je vţdy uváděna tato přibliţně skutečná koncentrace působící na paramecia.
25
3.5 Experimentální ovlivňování paramecií 3.5.1 Chování neovlivněných paramecií:
3.5.1.1 Na
Na podloţním sklíčku
podloţní
sklíčko
kápneme
kapku
suspenze
s paramecii
a
pozorujeme. Při tomto pokusu sledujeme chování a morfologické změny neovlivněných paramecíí v průběhu času, neţ uhynou. Zjistíme zároveň délku přeţívání bez vlivu jakékoliv látky, coţ nám můţe poslouţit k porovnání s jinými pokusy, u kterých jsme také praktikovali toto uspořádání.
3.5.1.2
Na přikrytém podloţním sklíčku
Na podloţní sklíčko kápneme kapku suspenze s paramecii, kterou přiklopíme podloţním sklíčkem a pozorujeme. Toto uspořádání jsme pouţívali i pro některé pokusy.
3.5.2 Galvanotaxe (reakce na elektrický proud) V návodech na praktická cvičení (Klusoňová, Lenčo 2006) jsou pomocí galvanotaxe demonstrovány pokusy na vliv pH. Jestliţe je napětí z ploché baterie vedeno do opačných okrajů podlouhlé kapky s paramecii, začnou se prvoci pohybovat velmi ţivě k zápornému pólu. Důvodem je, ţe k zápornému pólu jsou přitahovány kladné vodíkové ionty a tím tam vznikne kyselé pH. Toto kyselé pH není pro paramecia tak nebezpečné – na rozdíl od alkalického pH u opačné – tedy kladné elektrody. Alkalické pH je nebezpečné pro buňky všech typů, neboť v něm dochází ke zmýdelnění fosfolipidů v buněčné membráně.
Postup: Podloţní sklíčko vloţíme na pracovní stolek mikroskopu. Na podloţní sklíčko kápneme protáhlou kapku suspenze s paramecii. Do protilehlých konců kapky vloţíme elektrody. Zde se naskytl problém drţet
26
elektrody a zároveň fotografovat. Proto elektrody připevníme na sklíčko pomocí lepících štítků a teprve pak mezi elektrody kápneme paramecia.
3.5.3 Chemotaxe (reakce na podněty chemické) Chemické látky působí na prvoky různým způsobem a povaha tohoto působení závisí jednak na druhu látky, jednak na její koncentraci. Vysoké koncentrace jsou obecně škodlivé a vedou k zániku. Koncentrace niţší, které prvok snáší, na něj mohou působit jako podněty vyvolávající pohybové reakce. Takové reakce označujeme jako chemotaxe. Mohou se projevit pohybem buď ke zdroji podnětu – pozitivní chemotaxe, nebo od něho – negativní chemotaxe. Obvykle látky, které ve slabé koncentraci způsobí pozitivní chemotaxi, vyvolají u stejného organismu ve vysoké koncentraci chemotaxi negativní (Jírovec 1953). V tomto pokusu jsme zvolili jako chemický podnět různé koncentrace glukózy a sledovali jsme pozitivní chemotaxi jako vliv potravních atraktantů. Snaţili jsme se najít nejvyšší koncentraci glukózy, která ještě vyvolá pozitivní chemotaxi.
Postup: Na podloţní sklíčko naneseme kapku kultury nálevníků a do vzdálenosti cca 0,5cm kapku roztoku glukózy vţdy o jiné koncentraci. Obě kapky spojíme struţkou. Pozorujeme při nejmenším zvětšení bez krycího sklíčka.
3.5.4 Termotaxe (reakce na podněty tepelné) V populaci paramecií se nálevníci shromáţdí vţdy v místě optimální teploty, která se blíţí teplotě kultivačního prostředí. Pokud teplotu zvýšíme či sníţíme, nálevníci na tuto změnu určitým způsobem reagují (Hausmann 2003).
Na podloţní sklíčko kápneme dvě kapky suspenze s paramecii v rozmezí asi 0,5cm. Obě kapky spojíme struţkou. Poté ke kraji jedné kapky dáme kousek
27
ledu. Pozorujeme při nejmenším zvětšení bez krycího sklíčka (Pedagogická fakulta Plzeň).
3.5.5 Reakce na zvýšenou salinitu prostředí Nálevnící ţijí ve vodě, která má hodnoty neutrální salinity. Změní-li se tyto podmínky ţivota, okamţitě na ně reagují. Postup: Na podloţní sklo kápneme kapku suspenze s paramecii a vedle druhou kapku vody. Tyto dvě kapky přemostíme lidským vlasem. Ke kapce s paramecii přidáme zrníčko soli (Základní škola Staré Město 2010).
3.5.6 Pokus na nadměrnou pinocytózu Příkladem je chování paramecií v příliš koncentrovaném roztoku glukózy. Tento monosacharid vstupuje do buněk proti koncentračnímu spádu pomocí aktivního transportu. Tím ale zároveň vzniká pro prvoka problém, ţe voda vstupuje do buňky za glukózou – pasivně – po koncentračním spádu – respektive z důvodu rozdílu osmotického tlaku. Mnoţství vody v parameciu tak můţe narůstat natolik, ţe pulzující vakuoly nestačí tuto vodu vylučovat ven z buňky. Buňka se pak nadouvá, zmenšuje své pohybové aktivity a praskne. Během tohoto pokusu pouţíváme známé koncentrace glukózy a definujeme čas, během kterého k těmto jevům dojde. Postup: Na podloţní sklíčko kápneme kapku suspenze s paramecii., na kterou přikápneme kapku glukózy o různé koncentraci. To ale není výsledná koncentrace, která na paramecia působí. Kapka roztoku s glukózou se zředí kapkou, ve které jsou paramecia. Proto např. 20 % roztok glukózy, který kápneme na paramecia musíme vydělit dvěma. Výsledná koncentrace působící na paramecia je tedy 10 %. Sledujeme, jaké morfologické změny na těle paramecia tato koncentrace vyvolá, a jak dlouho v této koncentraci paramecia přeţijí (Klusoňová, Lenčo 2006).
28
3.5.7 Fotodynamický efekt Běţné intenzity a vlnové délky denního světla působí u prvoků jen malé změny, hlavně změny pohybu. Větší účinek mají jen paprsky velké intenzity nebo odlišné a v přírodních poměrech v úvahu nepřicházející vlnové délky – paprsky ultrafialové, rentgenové a gama záření. Viditelné světlo působí větší změny pouze tehdy, jsou-li přítomny buď v prostředí, nebo v těle prvoka látky senzibilizující, působící fotodynamicky (př. eozin, fluorescein) (Jírovec 1953). Postup: Na podloţní sklíčko jsme dali dvě kapky kultury s nálevníky. Do jedné kapky jsme přikápli 0,05 % roztok eosinu. Sklíčko s prvoky jsme vystavili po určitou dobu působení intenzivního záření (100W ţárovka). Snaţili jsme se porovnat, jak působí záření na paramecia s eozinem a bez něj. Pro porovnání jsme ještě jedno podloţní sklíčko s kapkou s nálevníky v roztoku eosinu uloţili do tmy. Preparáty jsme překryli krycím sklíčkem a pozorovali při malém zvětšení. Příprava 0,05 % roztoku eosinu: do 100ml destilované vody nasypte 0,05g práškového eozinu. Vytvořený roztok přefiltrujte (Jírovec 1953, Klusoňová, Lenčo 2006).
3.5.8 Působení UV světla Bylo provedeno ozáření kapky s nálevníky na podloţním sklíčku pomocí UV lampy. Záření jsme nechali působit v časovém rozmezí od 10 vteřin do 15 minut. Sledovali jsme pohyb paramecií popř. změny tvaru a snaţili jsme se zjistit, při jakém čase dojde k zastavení pohybu u 50 % těchto organismů. Postup: na podloţní sklíčko naneseme kapku kultury s paramecii. Sklíčko jsme vystavili po určitou dobu UV záření. Poté jsme preparát pozorovali pod mikroskopem při malém zvětšení (Klusoňová, Lenčo 2006).
3.5.9 Působení etanolu Pro tento pokus jsme pouţili 60 % roztok etanolu, který jsme ředili do různých koncentrací a hledali jsme koncentraci, která uţ nebude pro paramecia toxická.
29
3.5.10
Vitální barvení
Pro vitální barvení jsme pouţili methylenovou modř. Připravili jsme si 5 % roztok metylenové modři a ten jsme postupně ředili vţdy na poloviční koncentraci. Po přikápnutí na paramecia jsme sledovali změny jejich pohybu a hledali jsme nejmenší koncentraci, která ještě způsobí obarvení ţivých pohybujících se paramecií. Postup: Na podloţní sklíčko naneseme kapku kultury nálevníků, do které kápneme kapku roztoku methylenové modři. Přikryjeme krycím sklíčkem a pozorujeme při různém zvětšení. Příprava 5 % roztoku methylenové modři: do 10ml destilované vody nasypeme 0,5g práškové methylenové modři. Rozpuštěný roztok přefiltrujeme (vlastní modifikace postupů ze skript Klusoňová, Lenčo 2006).
3.5.11
Postvitální barvení
Pro postvitální barvení jsme pouţili bazický fuchsin. Tento roztok jsme ředili do různých koncentrací, abychom zjistili, jaká nejmenší koncentrace je ještě schopna způsobit probarvení mrtvých paramecií. Postup: Paramecia v kapce na podloţním sklíčku usmrtíme rychle kapkou etanolu (= fixace). Potom sklíčko vysušíme teplem (např. na elektrické plotýnce) a přidáme kapku roztoku bazického fuchsinu a přiklopíme krycím sklíčkem. Preparát můţeme ještě prosvětlit kapkou glycerinu. Prohlíţíme pod mikroskopem při různých zvětšeních. Příprava bazického fuchsinu: 1 g bazického fuchsinu spolu s 5 g fenolu rozpustíme ve 100 ml absolutního alkoholu a 100 ml destilované vody. Tím získáme koncentrovaný roztok, který přefiltrujeme a ředíme 1:10 destilovanou vodou (jde tedy o roztok – přibliţně o koncentraci 0,05 %ní).
30
3.6 VÝSLEDKY:
3.6.1 Kvalita mikrofotografií Kvalita mikrofotografií záleţí především na správném vycentrování mobilního telefonu na prkénku pro připevnění k okuláru. Jestliţe mobilní telefon fixován k prkénku v nesprávné pozici nebo jestliţe je pouze přidrţován rukou a prkénko
jako
adaptér
není
pouţito
vůbec,
vznikne
často
nesprávně
vycentrovaný snímek (Obr. č. 10). Z něho lze ale udělat výřez – např. jednu buňku, která je reprezentativní – osvětlená rovnoměrně.
Obr. č. 10: Mikrofotografie paramecií při špatném vycentrování prkénka pro připevnění mobilního telefonu k okuláru, nebo kdyţ prkénko není pouţito vůbec a mobilní telefon je pouze přidrţován rukou (zvětšení objektivu 10x)
3.6.2 Porovnání mikroskopů Zvolili jsme si 3 mikroskopy, na kterých jsme porovnávali kvality pořízených fotografií pomocí digitálního fotoaparátu. Vzájemně jsme porovnali, jaké mají výhody a nevýhody.
31
3.6.2.1
Mikroskop č. 1
Obr. č. 11: Mikroskop značky MEOPTA Obr. č. 12: Paramecia pohybující se mezi vlákny vaty fotografovaná mikroskopem značky MEOPTA (zvětšení objektivu 4x) Jedná se o starý typ mikroskopu (viz obr. č. 11), u kterého je zabudováno otočné zrcátko umístěné pod stolkem mikroskopu a je upevněno tak, ţe jím lze natáčet ve všech rovinách a zachytit tak a na objekt vrhnout světelné paprsky z kterékoliv strany. Jako zdroj světla jsme pouţili umělé světlo (100 W ţárovku). Nevýhodou je, ţe ţárovka dává příliš ţluté světlo (viz obr. č. 12), a pokud pouţijeme clonu, kterou světlo můţeme regulovat, budou detaily paramecia ještě hůře viditelné, neţ jsou. Fotografie pořízené tímto způsobem nemají velkou kvalitu a není téměř moţné vyfotografovat jednotlivé organely a další detaily paramecia.
32
3.6.2.2
Mikroskop č. 2
Obr. č. 13: Mikroskop HUND V300 Obr. č 14: Fotografie mikroskopu HUND V300 (zvětšení objektivu 10x) Jedná se o novější typ mikroskopu (HUND V300 – viz obr. č 13). Zorné pole v tomto mikroskopu je bílé a paramecia tak mají kontrastní barvu a lze je dobře detailně pozorovat (viz obr. č. 14). Fotografie v této práci byly zhotoveny právě na tomto mikroskopu.
3.6.2.3
Mikroskop č. 3
Obr. č. 15: Mikroskop Studar H Obr. č. 16: Mikrofotografie paramecií pomocí mikroskopu Studar H (zvětšení objektivu 4x)
33
Stejně jako u předchozího mikroskopu se jedná o novější typ (Studar H – viz obr. č. 15) a lze bez problému pozorovat detaily paramecia. Jedinou odlišností je, ţe zorné pole v mikroskopu je ţluté (viz obr. č. 16).
3.6.3 Chování neovlivněných paramecií 3.6.3.1
Na podloţním sklíčku
Paramecia se pohybují rychlým pohybem, při kterém se otáčí kolem vlastní osy. Kolem 15. minuty je uţ jejich pohyb pomalejší a v důsledku toho, ţe na kapku s paramecii působí přímé světlo mikroskopu, dochází k vysychání preparátu. Kapka se postupně od okrajů zmenšuje a paramecia se hromadí v jejím středu. Postupně tak ubývá i prostoru pro paramecia a ta, která se uţ do středu nevejdou, podlehnou účinku světla (dojde k vysátí vody z paramecia, následné deformaci a degradaci jeho těla na malé částečky). Kolem 35. minuty je uţ celý preparát vysušen. (viz obr. č. 17 - Příloha)
3.6.3.2
Na přikrytém podloţním sklíčku
Paramecia se stejně jako na nepřikrytém podloţním sklíčku pohybují rychlým otáčivým pohybem. Přeţívání je ale v tomto uspořádání kratší, protoţe paramecia přikrytá krycím sklíčkem nemají tolik prostoru pro pohyb a rovněţ zásobení kyslíkem je zde omezené oproti nepřikrytému podloţnímu sklíčku. Pokud se stane, ţe paramecium narazí na nějakou překáţku (vzduchová bublina, prach) vycouvá a odplave jiným směrem. Působení nedostatku prostoru a ţivin a nadbytku tepla a světla na paramecia pozorovaná na přikrytém podloţním sklíčku můţeme vyjádřit v 5-ti následujících fázích (viz obr. č. 18 - Příloha): 1. fáze – rychlý aktivní pohyb, při kterém se zároveň otáčí kolem vlastní osy. 2. fáze – kolem 10. minuty dochází ke zpomalení pohybu 3. fáze - kolem 15. minuty se tvar těla paramecia stává zaoblenější 4. fáze – kolem 20. minuty se na zaobleném těla paramecia vytvoří hrbolek, ze kterého vznikne bublina
34
5. fáze – kolem 25. dochází ke smrti všech paramecií tím způsobem, ţe bubliny na těle paramecia minuty prasknou a dojde k vypuzení vnitřního obsahu a zbytek těla se rozpadne na malé částečky, které se následně rozplynou Zajímavou ukázkou pohybu paramecií je obr č. 12, na kterém můţeme vidět stopy a rychlosti paramecií v prostředí bez jakýchkoliv podnětů (videozáznam snímaný 2,5 vteřiny). Stopy jsou šroubovice a odpovídají maximální vzdálenosti asi 4mm. * = zvrat směru plavání. V našich podmínkách jsme zjistili, ţe takovýto záznam lze zakreslit po přiloţení kancelářského papíru na monitor počítače a posunování průběhu videosekvence myší v dolní části monitoru.
Obr. č. 19: Zakreslení pohybu paramecií na základě videozáznamu (obrázek je převzat z monografie Hausmann 2003)
3.6.4 Galvanotaxe (reakce na elektrický proud) Nejprve pozorujme paramecia v tomto uspořádání pouhým okem, kdy můţeme vidět, ţe po propojení elektrod pomocí pozorované vodní suspenze se paramecia začnou okamţitě stěhovat směrem ke katodě. Při pouţití kapky, která je cca 2,5 cm dlouhá a 1 cm široká, toto přemístění trvá necelých 45 s.
35
Paramecia se shromaţďují kolem katody, ale nedotýkají se jí (přímý kontakt způsobí smrt). Pohybují se v hloučku rychlým otáčivým pohybem. Kolem 5. minuty se paramecia lehce vzdálí od katody, přičemţ jejich tvar těla a pohyb se nemění. V 10. minutě dochází ke zploštění těla a zpomalení pohybu. Postupně ale jejich tělo získává zaoblený tvar a pohyb vykonávají uţ jen na místě a rotují kolem vlastní osy. Ve 20. minutě ustane pohyb u všech a paramecia získají typický tvar těla připomínající citron (oba konce zaobleného těla jsou zúţeny). Toto je chování paramecií v kyselém prostředí a dále na to navazuje otázka, jak by se měnila morfologie a pohyb paramecií, která z dosahu kladné elektrody (tedy z alkalického pH) nemohou uniknout. Toho jsme docílili tak, ţe jsme kápli kapku suspenze s paramecii za kladnou elektrodu, a aby nebyl problém, ţe nám paramecia elektrodu obeplují, přemostili jsme tuto cestu lidským vlasem. Poté jsme mohli pozorovat chování paramecií v alkalickém pH. Paramecia se pohybují velice rychlým otáčivým zmateným pohybem a snaţí se dostat co nejdále z dosahu kladné elektrody. Do 10. minuty dochází ke smrti paramecií, která zploští svůj tvar, zkroutí se a vystřelí trichocysty.
3.6.5 Termotaxe (reakce na podněty tepelné) Přidání kousku ledu ke kapce s paramecii vyvolá jejich šokovou reakci, kdy dochází k výraznému zrychlení jejich pohybu, který je zároveň velmi zmatený a snaţí se dostat z jejího dosahu a přesouvají se do druhé kapky, ve které led není. Po rozpuštění ledu se paramecia opět pohybují mezi oběma kapkami.
3.6.6 Pokus na nadměrnou pinocytózu Glukóza v nízkých koncentracích vyvolává u paramecií pozitivní chemotaxi. Překročení této koncentrace působí na paramecia patologicky. Po přikápnutí glukózy se pohyb paramecia nejprve zrychlí, postupně dojde ke zploštění tvaru těla, zastavení na místě a lýze buňky., Zploštění těla je způsobeno vysáváním vody z jejich těl jako následek hypertonického prostředí,
36
které vyvolá glukóza. V 10 %ní glukóze přeţívají 35 minut. Se vzrůstající koncentrací glukózy se zkracuje doba jejich přeţívání, jak ukazuje tabulka č. 1 Příloha.
3.6.7 Chemotaxe Paramecia se aktivně vplouvají do roztoku s glukózou, dokud není koncentrace příliš vysoká. Je to způsobeno tím, ţe glukóza v nízkých koncentracích
působí
na
paramecia
jako
potravní
atraktant.
Nejvyšší
koncentrace glukózy, která vyvolala pozitivní chemotaxi, měla hodnotu 6 %. Vyšší koncentrace vyvolala chemotaxi negativní a paramecia uţ ke kapce s glukózou nepřiplouvala a zdrţovala se na opačné straně. Vyšší koncentrace má na paramecia patologický vliv, protoţe způsobuje hypertonické prostředí, coţ má za následek vysávání vody z paramecia a zploštění jeho tvaru těla.
3.6.8 Reakce na zvýšenou salinitu prostředí Paramecia se po přidání zrnka soli začínají pomocí vodní cestičky, vytvořené přemostěním lidského vlasu, přesouvat do druhé kapky. Ti nálevníci, kteří se dostanou do přímého kontaktu se zrnkem soli, jsou okamţitě usmrceni. Chlorid sodný způsobuje hypertonické prostředí a dochází k úniku vody z těla paramecia, které ztenčí svůj tvar (viz obr. č. 20 - Příloha).
3.6.9 Fotodynamický efekt Nálevníci jsou organismy, které jsou velice citlivé na působení světla (uchováváme je proto ve tmě). Účinek intenzivního světelného záření, které trvá jen 7 minut, uţ způsobí u paramecií zpomalení jejich pohybu. Při pouţití fotodynamicky aktivní látky tento účinek nastupuje ještě dříve. Pokud nálevníky ovlivněné pouze fotodynamickým barvivem, uloţíme do tmy, jejich ţivotnost se tím výrazně prodlouţí. Detaily jsou uvedeny v tabulce č. 2 - Příloha
37
3.6.10
Působení UV světla
UV záření je pro nálevníky smrtelné. Preparát vystavený UV záření více jak 10sekund uţ vykazuje určité známky ozáření. Se vzrůstající délkou ozáření se jejich pohyb zpomaluje a tvar těla se zmenšuje (snaha zmenšit povrch jako ochrana před zářením). Zjistili jsme, ţe za 60s dojde k zastavení pohybu u poloviny paramecií. Detaily jsou uvedeny v Příloze – v tabulce č. 3.
3.6.11
Působení etanolu
Tato látka se pouţívá jako fixační prostředek buněk. Nálevníci jsou (z hlediska vysokých koncentrací této chemikálie) velmi citlivé organismy, proto velká koncentrace způsobí smrt buňky. Detaily jsou opět uvedeny v Příloze – v tabulce č. 4.
3.6.12
Vitální barvení
Methylenová modř působí na paramecia toxicky. Po přikápnutí barviva dojde k probarvení buňky, přičemţ organely (zejména jádro) jsou zbarveny sytěji (viz obr. č. 22 - Příloha). Postupně dochází ke zpomalení pohybu zastavení a kolem paramecia jsou vidět bubliny, jako následek proběhnuté lýzy buňky. Zbarvení se stává sytější, aţ uţ téměř nelze rozlišit cytoplazmu a organely. Kolem mrtvého paramecia se objevují vystřílené trichocysty jako obrana proti působení toxické látky. Detaily jsou uvedeny v příloze v tabulce č. 5.
3.6.13
Postvitální barvení
Bazický fuchsin způsobuje červené zabarvení mrtvých paramecií a se sniţující koncentrací se zbarvení mění na růţové Nejsytěji je vţdy zbarvena membrána. Cytoplazma a organely jsou světlejší (viz. obr. č. 23, 24 - Příloha). Detaily jsou uvedeny v příloze – v tabulce č. 6.
38
4 DISKUSE
Tato bakalářská práce je zaměřena především na moţnost pouţití mobilního telefonu, nebo běţného rozměrnějšího digitálního fotoaparátu pro fotografování v mikroskopu krátce zacvičenými studenty na prakticích. Ale kromě toho se snaţí ověřit moţnost aplikace vybraných experimentů na paramecia a zhodnotit v těchto podmínkách jejich chování např. jak se mění jejich pohyb a tvar i délka přeţívání. Tyto získané výsledky jsou pouze orientační a slouţí spíše k tomu, aby učitel, který bude tyto experimenty uskutečňovat, věděl přibliţně, např. jak se bude paramecium chovat, a při jaké koncentraci zahyne a nebyl při výuce zaskočen nějakým jevem, který by studentům neuměl vysvětlit. Pokud by tyto výsledky měly poslouţit k výzkumu je potřeba tyto experimenty provést ve větším počtu a získané výsledky porovnat mezi sebou. Snaţili jsme se pouţívat takových experimentů, které by byly snadno proveditelné a dostupné tak i pro výuku na jiných školách. Pokud porovnáme pracnost některých postupů tak u dráţdivosti paramecií je to jednoznačně chemotaxe, kdy jsme museli na analytických vahách odvaţovat přesné mnoţství glukózy a připravovat roztoky o různých koncentracích s cílem se co nejvíce přiblíţit koncentraci, která ještě parameciím vyhovuje. Zjistili jsme, ţe parameciím vyhovuje ještě prostředí o koncentraci 6 %. Tato koncentrace nezpůsobila ţádné změny tvaru a prvoci se ke kapce s glukózou aktivně přibliţovali. Na tento pokus navazoval pokus na pinocytózu, kdy jsme postupně zvyšovali koncentraci glukózy, aţ byla tak vysoká, ţe byla pro paramecia ihned smrtelná. V tomto prostředí se tvar těla paramecií měnil na zúţený. U galvanotaxe a termotaxe se jednalo spíše o orientační pokusy, kde jsme se chtěli dozvědět hrubý odhad, jestli parameciím vyhovuje spíše kyselé
,
nebo zásadité pH, popř. jak se v tomto prostředí chovají a u termotaxe jsme chtěli zjistit, jak budou reagovat na chladné prostředí. Podobný princip měla i
39
reakce na zvýšenou salinitu prostředí. Etanol a formol jsou látky, které mohou slouţit jako fixační prostředek paramecií, zajímalo nás, která koncentrace uţ paramecia neovlivní (pokus s formolem byl uţ testován v bakalářské práci Lenky Popovské). Co se týká účinku záření (fotodynamický efekt, UV záření), jsou tyto experimenty téměř stejně pracné na postup a časově nenáročné, protoţe paramecia jsou organismy citlivé na světlo a hynou během několika minut. Při vitálním barvení jsme ověřili toxicitu methylenové modři, která v niţších koncentracích slouţí k probarvení ţivých paramecií. Naopak pomocí bazického fuchsinu se nám podařilo probarvit těla mrtvých paramecií. Vyuţití mobilního telefonu jako pomůcky k pořizování mikrofotografií by mohlo vést ke zpestření práce s mikroskopem, ovšem překreslování má také své výhody, protoţe si student objekt v mikroskopu lépe zapamatuje. V této bakalářské práci jsem mikrofotografie pořizovala digitálním fotoaparátem a to z toho důvodu, ţe můj mobilní telefon (Sony Ericsson K 550i) disponoval malým zvětšením a bylo tak obtíţné si paramecium přiblíţit. Digitální fotoaparát má sice větší zvětšení, ale není dostupný všem, tak jako mobilní telefon a nelze ho připevnit na objektiv mikroskopu. Kvalita mikrofotografií záleţí především na správném vycentrování objektivu mobilního telefonu a okuláru mikroskopu. Pro tento účel slouţí prkénkový adaptér, který umoţní stálou polohu objektivu na okuláru a umoţní tak pořízení kvalitních snímků. Při praktických cvičeních si student můţe svůj mobilní telefon přidrţovat na okuláru mikroskopu sám pomocí ruky a odpadá tak potřeba pouţití prkénkového adaptéru. Pořizování mikrofotografií tímto způsobem můţe vést ke špatnému vycentrování jako např. na obr. č. 10. Z tohoto snímku, lze vybrat buňku, která je pro nás reprezentativní. Student se proto můţe spokojit i s horší kvalitou mikrofotografie. V dnešní době uţ existují speciální mikroskopy, které jsou pro tento účel vybavené a obsahují zabudovaný fotoaparát i kameru, ty jsou ale finančně náročné, aby si je školy mohly pořídit, a vyuţívají se spíše ve výzkumu.
40
5 ZÁVĚR Ověřili jsme moţnost vyuţití mobilního telefonu se zabudovaným fotoaparátem, ale i digitální fotoaparát pro fotografickou dokumentaci v mikroskopu. Tato metoda by mohla poslouţit pro zpestření výuky na základních i středních a vysokých školách a přispět tak k popularizaci práce studentů s mikroskopem. Pro studenty na praktických cvičeních je proveditelné (i kdyţ málo kvalitní) vyfotografování buněk v mikroskopu mobilním telefonem jeho
přiloţením
na
okulár
bez
jakýchkoliv
pomůcek.
Pro
kvalitnější
mikrofotografii nebo pro zhotovení videozáznamu je nutné pouţít jednoduchý dřevěný adaptér (prkénko s otvorem – a fixace gumičkami). Provedli jsme základní pozorování a pokusy na parameciích, kde bylo cílem
zjistit,
jak
se
organismy
v daném
prostředí
chovají
během
mikroskopování, jak dlouho v něm přeţijí a jak se změní jejich tvar. Nejdelší přeţívání je na nepřikrytém klasickém podloţním sklíčku, kde mají více prostoru, neţ pokud by byla přikryta podloţním sklíčkem. Paramecium je jedním z nejdostupnějších a nejpouţívanějších modelových organismů ve školách pro studium jednobuněčných organismů Pokusy v této bakalářské práci jsou snadno proveditelné a mohou být uskutečněny v podmínkách, které mají minimální laboratorní vybavení. Mohou tak být inspirací pro učitele a některé z nich si můţe student, pokud vlastní obyčejný mikroskop, uskutečnit i sám doma. Výsledky, kterých jsme dosáhli, mohou poslouţit i pro výzkumnou činnost, zabývající se těmito organismy, je ovšem potřeba brát je s jistou rezervou, protoţe abychom získali optimální výsledky, bylo by potřeba je nejprve porovnat ve větším počtu.
41
6 SEZNAM LITERATURY (1) BARTOŠ. F., HLUCHOVSKÝ B., PŮŢA V., SRB. V.: Úvod do praktických cvičení z biologie. 1. vydání, Praha: Státní pedagogické nakladatelství, učební text Lékařské fakulty Karlovy univerzity v Hradci Králové, 1963, 130s., s. 68 – 90 (2) BEDNÁŘ M., FRAŇKOVÁ V., SCHINDLER J., SOUČEK A. – VÁVRA J.: Lékařská mikrobiologie. 1. Vydání - dotisk. Praha 2: Nakladatelství Marvil, 1996, 560s., ISBN - , s. 488 (3) GYMNÁZIUM PŘEROV: Praktické cvičení č. 2, Společenstva prvoků. Gymnázium Jakuba Škody, Přerov, http://www.gjs.cz/vedy-ozemi/Ruda/cviceni/02%20-%20Prvoci.pdf (4) HAUSMANN K. – HULSMANN N.: Protozoologie. 2. Vydání. Praha 2: nakladatelství Akademie věd České Republiky., 2003, 350s., ISBN 80-2000978-7, s. 18, 169, 194, 280
(5) HOCHMANN J.: Exploitation of the telephonic mobile apparatus for photography of education preparations in biology (poster, abstrakt ve sborníku). XIX. Biologické dny Hradec Králové, Říjen 2008. (6) CHROUST K.:Veterinární protozoologie. 5. vydání, Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 1998, 114s., ISBN 80-85114-27-5 s. 9 – 11 (7) JELÍNEK J. – ZICHÁČEK V.: Biologie pro gymnázia. 3. vydání. Olomouc: Nakladatelství Olomouc, 1998, 552s., ISBN 80-7182-070-9. s. 81-86 (8) JÍROVEC O.: Protozoologie. 1. vydání. Praha: Nakladatelství československé akademie věd., 1953, 670s., s. 5 (9) KLUSOŇOVÁ, H. – LENČO, J.: Praktická cvičení a otázky ze základů cytologie a genetiky. 3. vydání. Praha 1: Karolinum, 2006. 60 s. ISBN 80-2461211-9.
42
(10) KTENAS A.: Exploitation of the telephonic mobile apparatus for photography of education preparations in biology (přednáška, abstrakt ve sborníku). XVI. Ročník studentské vědecké konference, Hradec Králové, duben 2008. (11) MÜLLEROVÁ Z.: Osobní sdělení, Univerzita Karlova, farmaceutická fakulta, Hradec Králové, (2010) (12) PAPÁČEK M.: Zoologie. 3. vydání. Praha: Scientia, spol. s. r. o., 2000, 290s. ISBN 80-7183-203-0. s. 24-27. (13) PEDAGOGICKÁ FAKULTA BRNO: Kultury prvoků. Zisk prvoků a příprava živných kultur pro jejich pěstování. [online]. Pedagogická fakulta MU Brno, katedra biologie, [cit. 2010 – 30 - 07]. Dostupné z:
(14) PEDAGOGICKÁ FAKULTA PLZEŇ.: Zoologická cvičení - 2, Protozoologie II. Katedra biologie, Pedagogická fakulta, Západočeská univerzita Plzeň, dostupné v r. 2010 z: www.kbi.zcu.cz/studium/invert/cvic/zopr02.htm (15) POP0VSKÁ L.: Posouzení práce na nálevnících z hlediska toxikologického testování chemických látek, bakalářská práce, Farmaceutická fakulta Hradec Králové, květen 2010 (16) ZÁKLADNÍ ŠKOLA STARÉ MĚSTO.: Laboratorní práce č. 2, Téma: prvoci – nálevníci, Úkol č. 3 : Pozorování nálevníků a jejich reakce na zvýšenou salinitu prostředí. Základní škola Staré Město, okres Uherské Hradiště, dostupné z: www.zsstmesto.cz/new/var/uploads/lp_prvoci.doc
43
7 PŘÍLOHA
Obr č. 17: Paramecia při vysychání preparátu (zvětšení objektivu 4x a 10x)
Obr. č. 20: Hypertonické prostředí
Obr. č. 21 – účinek UV záření
(zvětšení objektivu 4x)
(zvětšení objektivu 10x)
Obr. č. 22: Účinek methylenové modři (zvětšení objektivu 10x)
44
1. fáze – normální tvar (zvětšení objektivu 10x)
2. fáze – zaoblení těla (zvětšení objektivu 10x)
3. fáze – lýza buňky (zvětšení objektivu 45x)
Obr. č. 18: Jednotlivé fáze poškození buňky vlivem prostředí na přikrytém podloţním sklíčku
45
Obr. č. 23: Bazický fuchsin (vyšší koncentrace) (zvětšení objektivu 10x)
Obr. č. 24: Bazický fuchsin (niţší koncentrace) (zvětšení objektivu 10x)
Tabulka č. 1 – Pokus na nadměrnou pinocytózu c [%]
čas přeţití [min]
10
35
20
10
30
5
40
3
50
1
46
Tabulka č. 2 – Fotodynamický efekt čas paramecia s eozinem [min] - oválný tvar těla
3
paramecia bez eosinu - ţádná změna
- pomalejší pohyb paramecia neobarvena
jsou
- nepatrný pohyb, některá - ţádná změna jsou uţ mrtvá
5
- paramecia, u kterých proběhla lýza mají světle růţovou barvu 7
- u všech proběhla lýza - pomalý pohyb buňky a mají světle růţovou barvu
10
- zbarvení je tmavší
20
- všechna mrtvá
- nepatrný pohyb
paramecia - pohyb uţ jen téměř na místě
- světle růţové zbarvení s tmavším jádrem - preparát je kolem okrajů - všichni mrtví vysušen - preparát je kolem okrajů - mrtvá paramecia jsou vysušen zbarvena růţově, jádro je (u paramecií uloţených ve tmavší tmě došlo ke zpomalení pohybu, ale k ţádné změně tvaru)
30
Tabulka č. 3 – Působení UV světla Čas [s] Chování paramecií, morfologické změny 10
- nejeví ţádné známky ozáření
47
20
- pohyb je pomalejší - tvar těla se lehce zaobluje
40
-oblý tvar těla uţ mají všechna paramecia -pohyb je výrazně pomalý
50
-jen nepatrný otáčivý pohyb na místě -některá jsou uţ mrtvá
60
-50% vykazuje nepatrný pohyb a dalších 50% je uţ mrtvých
70
-všechna paramecia jsou mrtvá -oblý tvar těla se mění na kulovitý
Čas [min] 5
10
Chování paramecií, morfologické změny - mrtvá paramecia mají kulovitý tvar, jenţ je u některých na obou koncích zúţený, na těle se tvoří bubliny bubliny a dochází k lýze buňky
-preparát začíná být od okraje vysušený -všechna paramecia mají kulovitý tvar, který je na obou koncích zploštěn (připomínají citron – viz obr. č. 21) -lýza buněk
15
- došlo k vyschnutí celého preparátu
Tabulka č. 4 – působení etanolu c [%]
pohybové a morfologické změny, délka přeţívání
20
- ihned mrtví - tvar těla je kulatý - po proběhnuté lýze buňky můţeme kolem těla paramecia vidět bubliny
48
10
- změny jsou stejné
5
- při této koncentraci přeţilo ca 50% jedinců, ostatní jsou mrtví do 2 minut
3
- všichni ţiví - pohybují se vlnkovitým pohybem - délka přeţívání v této koncentraci je cca 10 minut
Tabulka č. 5 – vitální barvení (methylenová modř) c [%]
morfologické změny, změny pohybu, délka přeţívání
2,5
- všichni mrtví - mají tmavě modré zbarvení, kdy není rozlišitelná cytoplazma od organel - tvar je oblejší - jsou zřetelně vidět vystřílené trichocysty
1,25
- všichni mrtví - jádro je oproti cytoplazmě tmavší, coţ trvá cca 2min., poté se buňka opět celá zalije barvivem - kolem membrány můţeme pozorovat bubliny po proběhnuté lýze buňky
0,62
- všichni mrtví - kolem těla zřetelné bubliny - jádro je sytější, postupně buňka začíná tmavnout (cca 3min) a objevují se vystřílené trichocysty
0,31
- paramecia se pohybují pomalým pohybem, postupně dochází k zastavení pohybu, proběhne lýza a zbarvení buňky je sytější, kolem vystřílené trichocysty - pohyb trvá cca 5min.
0,15
- pomalý pohyb, který má vlnitý charakter - zastavení pohybu cca za 8min.
49
0,07
- paramecia zpočátku nejsou zbarvená, pohyb je normální - postupně buňka tmavne, pohyb se zpomaluje a zastavuje (cca do 10min.)
0,03
- zorné pole i paramecia nejsou zbarvené - cca v 6. minutě se paramecia zbarvují světle modře, přičemţ jádro má sytější barvu - cca v 15. minutě proběhne lýza buňky
0,01
- paramecia se barví velice světle modře - přeţívání v této koncentraci je cca 20 minut
0,008 - tato koncentrace obarví uţ jen mrtvá paramecia 0,004 - při této koncentraci se uţ paramecia neobarví
Tabulka č. 6 – postvitální barvení (bazický fuchsin) c [%]
změny zbarvení
0,025
- paramecia jsou celá zbarvena sytě červeně - nelze rozlišit cytoplazmu a jádro - kolem těla jsou vystřílené trichocysty
0,012
- membrána je zbarvena sytě, cytoplazma a organely jsou světlejší - do 1 minuty celá sytě zbarvená
0,006
- membrána zbarvena růţově, cytoplazma a organely bezbarvé - do 3 minut se celá buňka obarví růţově
0,003
- obarvena je jen membrána - probarvení celé buňky trvá déle (cca 10min.)
0,001
- membrána je nepatrně zbarvena - cytoplazma se neobarví
0,0007
- tato koncentrace uţ mrtvá paramecia neobarví
50
51
