UNIVERSITAS INDONESIA

UNIVERSITAS INDONESIA

UJI PENGHAMBATAN SENYAWA 4-[(E)-2-{4-OKSO-3-(4METOKSIFENIL)-KUINAZOLIN-2-IL}VINIL] BENZENSULFONAMIDA TERHADAP AKTIVITAS SIKLOOKSIGENASE-2

SKRIPSI

WIDYA EKA PUTRI 0906601720

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM EKSTENSI DEPARTEMEN FARMASI DEPOK JULI 2012 i

Uji penghambatan..., Widya Eka Putri, FMIPA UI, 2012

UNIVERSITAS INDONESIA

UJI PENGHAMBATAN SENYAWA 4-[(E)-2-{4-OKSO-3-(4METOKSIFENIL)-KUINAZOLIN-2-IL}VINIL] BENZENSULFONAMIDA TERHADAP AKTIVITAS SIKLOOKSIGENASE-2

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

WIDYA EKA PUTRI 0906601720

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM EKSTENSI DEPARTEMEN FARMASI DEPOK JULI 2012 ii


SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIARISME

Saya yang bertanda tangan di bawah ini dengan sebenarnya menyatakan bahwa skripsi ini saya susun tanpa tindakan plagiarisme sesuai dengan peraturan yang berlaku di Universitas Indonesia.

Jika di kemudian hari ternyata saya melakukan plagiarisme, saya akan bertanggung jawab sepenuhnya dan menerima sanksi yang dijatuhkan oleh Universitas Indonesia kepada saya.

Depok, Juli 2012

Widya Eka Putri

iii


HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip maupun yang dirujuk telah saya nyatakan dengan benar

Nama

: Widya Eka Putri

NPM

: 0906601720

Tanda Tangan

:

Tanggal

: 13 Juli 2012

iv


HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh: Nama

: Widya Eka Putri

NPM

: 0906601720

Program Studi

: Farmasi Ekstensi

Judul Proposal

: Uji Penghambatan Senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida terhadap Aktivitas Siklooksigenase-2

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Ekstensi Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia.

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I

: Drs. Hayun, M.Si

(

)

Pembimbing II

: Dr. Arry Yanuar, M.Si

(

)

Penguji I

: Prof. Dr. Yahdiana Harahap, MS., Apt

(

)

Penguji II

: Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.S

(

)

Ditetapkan di

: Depok

Tanggal

: 13 Juli 2012 v


KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas berkat dan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi ini. Skripsi dengan judul uji aktivitas penghambatan senyawa 4-[(E-2-{4okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida

terhadap

siklooksigenase-2 ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Ekstensi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Indonesia. Pada penyelesaian penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis mendapat bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis hendak mengucapkan terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu dan mengarahkan, yaitu kepada: 1. Prof. Dr. Yahdiana Harahap, M.S., Apt selaku Ketua Departemen Farmasi FMIPA UI. 2. Dra. Azizahwati M.S., Apt selaku Ketua Program Sarjana Ekstensi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Indonesia. 3. Drs. Hayun, M. Si., Apt selaku Ketua Laboratorium Analisis Kimia Kuantitatif dan pembimbing yang telah menyediakan waktu, tenaga dan pikiran untuk mengarahkan saya selama proses penelitian hingga penyusunan skripsi ini. 4. Dr. Arry Yanuar, M.Si selaku pembimbing yang telah menyediakan waktu, tenaga dan pikiran untuk mengarahkan saya selama proses penelitian hingga penyusunan skripsi ini. 5. Seluruh Staf pengajar dan pada para karyawan Fakultas Farmasi Universitas Indonesia. 6. Mba Lia Indriana dan Mas Ardi selaku Laboran Laboratorium Analisis Kimia Kuantitatif atas kesempatan yang diberikan kepada saya untuk melakukan sebagian besar penelitian dilaboratorium yang bersangkutan serta atas nasehat dan bantuan yang diberikan. 7. Keluargaku tersayang, yang tidak pernah putus memberikan dukungan moril, kekuatan serta doa untuk penulis selama penelitian berlangsung hingga tersusun skripsi ini. vi


8. Temen-temen seperjuanganku, kakak serta adik kelas atas waktu serta kesediaannya mendengarkan keluhan penulis, bantuan, memberikan saran dan menyemangati penulis selama penelitian berlangsung hingga tersusunnya skripsi ini. 9. Pihak-pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Penulis menuadari penelitian dan penyusunan skripsi ini masih belum sempurna sehingga penulis memohon maaf atas segala kesalahan yang ada. Penulis menerima dengan tangan terbuka segala saran maupun kritik yang bersifat membangun baik bagi penelitian maupun penyusun skripsi ini.

Penulis 2012

vii


HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Indonesia, saya yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama

: Widya Eka Putri

NPM

: 0906601720

Program Studi

: Ekstensi

Departemen

: Farmasi

Fakultas

: Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Jenis karya

: Skripsi

demi pengembangan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk memberikan kepada Universitas Indonesia Hak Bebas Royalti Noneksklusif (Non-exclusive Royalty Free Right) atas karya ilmiah saya yang berjudul: “Uji Penghambatan Senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2il}vinil]benzensulfonamida terhadap Aktivitas Siklooksigenase-2” beserta perangkat yang ada (jika diperlukan). Dengan Hak Bebas Royalti Noneksklusif

ini

Universitas

Indonesia

berhak

menyimpan,

mengahlimedia/formatkan, mengelola dalam bentuk pangkalan data (database), merawat, dan mempublikasikan tugas akhir saya selama tetap mencantumkan nama seaya sebagai penulis/pencipta dan sebagai pemilik Hak Cipta. Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di

: Depok

Pada tanggal : 13 Juli 2012

Yang menyatakan

Widya Eka Putri viii


ABSTRAK

Nama Program Studi Judul

: Widya Eka Putri : Farmasi Ekstensi : Uji Penghambatan Senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida terhadap Aktivitas Siklooksigenase-2.

4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil] Senyawa benzensulfonamida merupakan senyawa baru yang mempunyai kemiripan dengan senyawa diarilheterosiklik, turunan 4(3H)-kuinazolinon yang tersubstitusi oleh gugus sulfonamida (SO2NH2), kebanyakan inhibitor selektif COX-2 merupakan senyawa diarilheterosiklik. Senyawa ini diprediksi mempunyai aktivitas penghambat konversi asam arakidonat menjadi prostaglandin oleh enzim siklooksigenase. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh hasil uji aktivitas penghambatan enzim siklooksigenase-2 terhadap senyawa tersebut dengan menggunakan Kit COX (ovine) inhibitor screening assay. Prostaglandin yang dihasilkan ditentukan dengan metode Enzyme Immunoassay (EIA) dan diukur menggunakan plate reader pada panjang gelombang 415nm. Dari hasil uji didapatkan nilai IC50 senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2il}vinil]benzensulfonamida adalah 16,67 µM. Pengujian juga dilakukan terhadap senyawa pembanding yaitu Asetosal dan Selekoksib dengan hasil yang diperoleh untuk nilai IC 50 Asetosal dan Selekoksib berturut-turut yaitu 24,97 µM dan 0,43 µM.

Kata kunci

: Siklooksigenase-2; Aktivitas penghambatan enzim siklooksigenase-2; 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)Enzyme kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida; Immunoassay (EIA); IC50 Asetosal; IC50 Selekoksib xii + 55 halaman : 20 gambar; 8 tabel; 14 lampiran Daftar referensi : 31 (1985-2011)

ix

Universitas Indonesia


ABSTRACT

Name Study program Title

: Widya Eka Putri : Extension of Pharmacy : Inhibition Test of Compound 4-[(E)-2-{4-oxo-3-(4methoxyphenyl)-quinazolin-2-yl}vinyl] benzensulfonamide of Cyclooxygenase-2 Activity.

4-[(E)-2-{4-oxo-3-(4-methoxyphenyl)-quinazolin-2-yl}vinyl]benzensulfonamide is a new compound that has similarity with diarylheterocyclic, derivative of 4(3H)-quinazolone subtituted by sulfonamide (SO2NH2), Most of COX-2 selective inhibitors is diarylheterocyclic compounds. These compounds predicted has an activity to inhibiting conversion of arachidonic acid into prostaglandin by cyclooxygenase enzyme. This research was designed to obtain inhibitory activity assay of cyclooxygenase enzyme compound 4-[(E)-2-{4-oxo-3-(4methoxyphenyl)-quinazolin-2-yl}vinyl]benzensulfonamide use Kit COX (ovine) inhibitor screening assay. Prostaglandin which produced was determined by Enzyme Immunoassay (EIA) and measured using plate reader at a wavelength of 415 nm. From the test result obtained IC50 of 4-[(E)-2-{4-oxo-3-(4methoxyphenyl)-quinazolin-2-yl}vinyl] benzensulfonamide is 16.67 µM. Tests were also conducted with control, Acetosal and Celecoxib which shows of IC50 for Acetosal and Celecoxib respectively are 24.97 µM and 0.43 µM.

keyword

xii + 55 pages References list

: Cyclooxygenase-2; inhibitory activity of enzyme cyclooxygenase-2; 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida; Enzyme Immunoassay (EIA); IC50 Acetosal; IC50 Celecoxib : 20 pictures; 8 tables; 14 appendixes : 31 (1985-2011)

x



DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ...................................................................................... SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIARISME ................................... HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ......................................... HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ KATA PENGANTAR .................................................................................... HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ............... ABSTRAK ...................................................................................................... ABSTRACT .................................................................................................... DAFTAR ISI ................................................................................................... DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... DAFTAR TABEL .......................................................................................... DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................

ii iii iv v vi viii ix x xi xii xiii xiv

BAB 1. PENDAHULUAN ....................................................................... 1.1. Latar Belakang ............................................................................. 1.2. Tujuan Penelitian ..........................................................................

1 1 3

BAB 2. 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8

TINJAUAN PUSTAKA ............................................................. Enzim ........................................................................................... Siklooksigenase ............................................................................ Inhibitor Selektif Siklooksigenase-2 ............................................. Prostaglandin ................................................................................. Antigen .......................................................................................... Antibodi......................................................................................... Senyawa Pembanding ................................................................... Senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2il} vinil]benzensulfasetamida ............................................................. 2.9 Uji Aktivitas Penghambatan pada Enzim Siklooksigenase........... 2.10 Enzyme Immunoassay. .................................................................. 2.11 EIA Plate Reader ..........................................................................

4 4 6 7 8 10 11 14 16 17 19 22

BAB 3. 3.1 3.2 3.3

METODE PENELITIAN ........................................................... Lokasi dan Waktu Penelitian......................................................... Alat dan Bahan .............................................................................. Cara Kerja .....................................................................................

25 25 25 28

BAB 4. 4.1 4.2

HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................... Uji Aktivitas Penghambatan Siklooksigenase-2 ........................... Analisis/Perhitungan Data .............................................................

32 32 35

BAB 5. 5.1 5.2

KESIMPULAN DAN SARAN ................................................... Kesimpulan.................................................................................... Saran ..............................................................................................

38 38 38

DAFTAR REFERENSI ................................................................................

39

xi



DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Gambar 2.2 Gambar 2.3 Gambar 2.4 Gambar 2.5 Gambar 2.6 Gambar 2.7 Gambar 2.8 Gambar 2.9 Gambar 2.10 Gambar 3.1 Gambar 3.2 Gambar 3.3 Gambar 3.4 Gambar 3.5 Gambar 4.1 Gambar 4.2 Gambar 4.3 Gambar 4.4

Gambar 4.5

Molekul prostaglandin ............................................................. Proses pembentukan prostaglandin dari asam arakidonat ......... Biosintesis prostaglandin .......................................................... Struktur molekul antibodi ......................................................... Rumus struktur Asetosal ........................................................... Rumus strukur Selekoksib ........................................................ Rumus struktur 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)kuinazolin-2-il}vinil] benzensulfonamida ................................ Skema reaksi EIA ...................................................................... Reaksi katalisis dari Asetilkolinesterase ................................... Skema sistem optik EIA Plate Reader ...................................... Alat Plate Reader Biotek ELx808 dan komputer yang dilengkap dengan program Gen 5 ............................................. Alat mikro pipet ....................................................................... 96 Well Plate ............................................................................. Bahan-bahan reaksi inhibisi COX (ovine) ................................ Tabung-tabung pelaksanaan reaksi inhibisi COX ..................... Kurva kalibrasi standar prostaglandin ....................................... Kurva hubungan ln konsentrasi standar asetosal dengan % inhibisi .................................................................................. Kurva hubungan ln konsentrasi standar selekoksib dengan % inhibisi ...................................................................... Kurva hubungan ln konsentrasi 4-[(E)-2-{4-okso-3(4-metoksifenil)-kuinazolin-2il}vinil]benzensulfonamida dengan % inhibisi ...................................................................... Perbandingan IC50 antara selekoksib, asetosal dan sampel senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin2il}vinil]benzensulfonamida .....................................................

xii

8 9 9 12 14 15 16 20 21 24 42 42 43 43 44 45 45 46

46

47



DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Karakteristik Enzim Siklooksigenase-1 dan Siklooksigenase-2 ...... Tabel 4.1 Perbandingan nilai IC50 hasil pengujian dengan penelitian sebelumnya ....................................................................................... Tabel 4.2 Data kurva kalibrasi standar prostaglandin ...................................... Tabel 4.3 Data serapan Blanko, NSB, Bo, IA 100% dan BC .......................... Tabel 4.4 Data ringkasan hasil pengukuran ..................................................... Tabel 4.5 Data uji aktivitas penghambatan oleh Asetosal................................ Tabel 4.6 Data uji aktivitas penghambatan oleh Selekoksib ............................ Tabel 4.7 Data uji aktivitas penghambatan oleh 4-[(E)-2-{4-okso-3(4metoksifenil)-kuinazolin-2il}vinil] benzensulfonamida ...............

xiii

7 37 48 49 50 52 52 53



DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Lampiran 4. Lampiran 5. Lampiran 6. Lampiran 7. Lampiran 8. Lampiran 9. Lampiran 10. Lampiran 11. Lampiran 12. Lampiran 13. Lampiran 14.

Skema isolasi Selekoksib ........................................................... Hasil uji kemurnian Selekoksib ................................................... Pembuatan larutan standar prostaglandin .................................... Format lempeng sumur uji sampel .............................................. Perhitungan penimbangan sampel ............................................... Cara pembuatan larutan inhibitor ................................................ Cara pelaksanaan reaksi COX-2 .................................................. Cara pengenceran reaksi COX-2 ................................................. Cara perhitungan jumlah prostaglandin....................................... Cara perhitungan simpangan deviasi dan koefisien variasi........ Suhu penyimpanan dan waktu stabilitas larutan ......................... Daftar singkatan........................................................................... Sertifikat analisis Asetosal .......................................................... Sertifikasi Kit EIA .......................................................................

xiv

54 55 58 59 60 61 63 64 65 66 67 68 69 70



BAB 1 PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang Obat antiinflamasi non seroid (AINS) adalah salah satu golongan obat

yang banyak digunakan oleh masyarakat. Obat AINS terutama digunakan untuk gejala yang berhubungan dengan osteoarthritis. Indikasi lain meliputi sindroma nyeri, miofasial, gout, demam, dismenore, migran, nyeri perioperatif dan infark miokard sehingga dapat disimpulkan obat AINS memiliki spektrum luas dalam klinis (Harder & An, 2003). Mekanisme aksi obat AINS menginhibisi aktivitas enzim

siklooksigenase

dalam

mengkonversi

asam

arakidonat

menjadi

prostaglandin (PG) di jaringan-jaringan. Prostaglandin bertanggung jawab untuk homeostatis fisiologi tubuh (Corruzi, Verturi & Spaggirari, 2007; Lombardino, 1985). Pada awal tahun 1990-an, ditemukan 2 bentuk siklookgenase (COX) yang disebut dengan COX-1 dan COX-2. Enzim siklooksigenase berperan dalam sintesis prostaglandin. Prostaglandin ini ditemukan pada jaringan yang mengalami inflamasi. Penghambatan COX-1 dan COX-2 akan mengurangi inflamasi dengan menghambat sintesis prostaglandin. Contoh siklooksigenase (COX) inhibitor seperti rofecoxib, celecoxib, dan valdecoxib yang secara selektif menghambat induksi COX-2. Penghambatan yang selektif COX-2 ini selain mengatasi inflamasi dapat juga mengurangi toksisitas terhadap gastrointestinal dan ginjal (Foye, 2006; Zarghi, A., Rao, P.N.P., dan Knaus, E.E, 2007). Hasil studi hubungan struktur-aktivitas (SAR) menyebutkan bahwa kelompok senyawa dengan gugus dasar diarilheterosiklik yang tersubtitusi oleh gugus sulfonamida (SO2NH2) atau metansulfonil (SO2CH3) pada posisi para memiliki potensi terhadap penghambatan COX-2 yang selektif. Inhibitor COX-2 selektif ini efektif secara klinik sebagai anti-inflamasi dengan toksisitas gastrointestinal dan renal lebih rendah, namun sekarang ada bukti yang meyakinkan bahwa inhibitor COX-2 selektif dapat menyebabkan peningkatan kejadian akibat trombotik kardiovaskuler seperti infark miokard (Zarghi, A., Rao, P.N.P., dan Knaus, E.E, 2007). 1



2

Senyawa

4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil]

benzensulfonamida merupakan senyawa yang diperoleh dengan mengkonjugasi 3(4-metoksifenil)-2-metil-4(3,4)-kuinazolinon dengan p-formil-benzensulfonamida dalam asam asetat glasial dengan penambahan natrium asetat anhidrat sebagai katalis (Hudiyono dan Hayun, 2011). Struktur senyawa tersebut mempunyai kemiripan dengan senyawa diarilheterosiklik. Kebanyakan inhibitor selektif COX2 merupakan senyawa diarilheterosiklik (Dannhardt dan Laufer, 2000), sehingga diduga

senyawa


benzensulfonamida tersebut memiliki aktivitas sebagai inhibitor COX-2 (Hayun; M. Hanafi; A. Yanuar; dan S. Hudiyono, 2011). Ada beberapa metode untuk melakukan uji penghambatan suatu senyawa terhadap aktivitas siklooksigenase, antara lain menggunakan malondialdehid (MDA),

N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilendiamin

(TMPD),

darah

manusia

keseluruhan (Whole Human Blood Assay), dan Enzyme Immunoassay (EIA). Dari beberapa cara pengukuran tersebut peneliti menggunakan Enzyme Immunoassay karena cara pengukurannya yang lebih sederhana, sensitif dan selektivitasnya terhadap COX-1 dan COX-2. Enzyme Immunoassay (EIA) adalah immunoassay yang paling sensitif yang dipakai untuk penghitungan secara kuantitatif dengan konsentrasi sangat rendah. Prinsip dari EIA adalah reaksi antigen-antibodi, dapat dideteksi dengan penambahan konjugat dilabel enzim aktif yang bereaksi dengan substrat menghasilkan warna spesifik yang dapat dibaca dengan EIA plate reader pada panjang gelombang tertentu. Uji ini mencakup baik enzim COX-1 maupun COX2, sehingga dapat digunakan untuk melakukan skrining inhibitor-inhibitor isozim spesifik (Cayman Chemicals Inc, Ann Arbor, MI., 2010). Pada penelitian ini dilakukan uji penghambatan senyawa 4-[(E)-2-{4-okso3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida

terhadap

aktivitas

siklooksigenase-2. Percobaan dilakukan dengan variasi konsentrasi senyawa uji untuk mengetahui konsentrasi paling optimal yang dapat menghambat aktivitas enzim COX-2.

Pengukuran aktivitas penghambatan enzim COX-2 dilakukan

menggunakan metode Enzyme Immunoassay (EIA).



3

1.2

Tujuan Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan penghambatan dan

nilai IC50 terhadap aktivitas siklooksigenase-2 dari senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida menggunakan metode Enzyme Immunoassay (EIA).



BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Enzim

2.1.1 Definisi Enzim Enzim adalah katalisis yang efektif, yang mengkatalisis perubahan satu atau lebih senyawa (substrat) menjadi satu atau lebih senyawa lain (produk) meningkatkan laju reaksi setidaknya 106 kali dibandingkan jika tidak dikatalisis. Selain sangat efisien, enzim juga merupakan katalis yang sangat selektif (Murray, Granner dan Rodwell, 2006). Enzim memiliki celah khusus yang disebut dengan sisi aktif. Sisi aktif terdiri dari rantai samping asam amino yang membentuk permukaan tiga dimensi dan sesuai dengan substrat. Bila sisi aktif enzim berikatan dengan substrat, akan terbentuk kompleks enzim-substrat (ES). ES diubah menjadi enzim-produk (EP), kemudian terpecah menjadi enzim dan produk. E + S ⇌ ES → E + P Keterangan: E = enzim, S = substrat, ES = kompleks enzim-substrat, P = produk/ hasil reaksi.

Enzim memiliki spesifisitas atau spesifik dalam bereaksi dengan satu atau beberapa substrat dan hanya mengkatalisis satu macam reaksi kimia. Kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor, antara lain konsentrasi substrat, suhu, pH dan waktu inkubasi (Champe, Harvey, dan Ferrier, 2005). Faktor-faktor tersebut menentukan efektivitas kerja suatu enzim. Apabila faktor pendukung tersebut berada pada kondisi yang optimum, maka kerja enzim juga akan maksimal.

2.1.2 Aktivitas Enzim Analisis kimia menunjukkan bahwa komposisi enzim aktif sama dengan komposisi enzim “inaktif”. Dengan demikian komposisi kimia tidak dapat untuk menunjukkan aktivitas suatu enzim. Aktivitas enzim dapat ditentukan secara kualitatif maupun kuantitatif. Aktivitas kualitatif enzim ditentukan berdasarkan reaksi kimia yang terjadi dengan cara menentukan substrat yang dapat dikatalis 4



5

oleh enzim tersebut. Sedangkan aktivitas kuantitatif enzim ditentukan dengan mengukur laju reaksi yang dikatalisis oleh enzim tersebut yang mengkatalisis reaksi tersebut. Satu unit enzim adalah jumlah enzim yang mampu mengkatalisis µmol substrat permenit pada kondisi tertentu (optimal). Aktivitas spesifik enzim didefinisikan sebagai beberapa unit enzim yang terdapat dalam satu mg protein. Berdasarkan definisi tersebut maka aktivitas spesifik enzim menunjukkan kemurnian suatu enzim, dengan demikian semakin besar aktivitas spesifiknya menunjukkan bahwa kemurnian enzim tersebut semakin tinggi. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain temperatur, pH, kofaktor, inhibitor, dan substrat. a.

Temperatur Peningkatan temperatur akan meningkatkan laju reaksi seperti halnya pada

katalis biasa, tetapi jika kita membicarakan hubungan antara peningkatan temperatur yang memungkinkan struktur enzim yang berupa protein maka ada batas temperatur yang memungkinkan struktur enzim tetap terjaga yaitu temperatur optimum. Di atas temperatur optimum maka struktur enzim akan terganggu dan bahkan bisa rusak (denaturasi) dengan demikian aktivitasnyapun akan menurun. b.

pH Pada umumnya setiap enzim mempunyai aktivitas maksimum pada pH

tertentu. Di atas dan di bawah pH tersebut aktivitas menurun. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim tergantung pada sifat asam basa dari enzim. c.

Inhibitor Inhibitor merupakan zat yang dapat mengurangi aktivitas enzim atau suatu

senyawa yang cenderung menurunkan laju suatu reaksi enzimatik. Aksi inhibitor dapat menyerang enzim maupun kofaktornya. d.

Kofaktor Kofaktor dapat berupa ion logam maupun senyawa organik yang berfungsi

untuk melengkapi struktur enzim sehingga interaksi antara enzim dengan substrat dapat lebih optimum. Kofaktor membantu enzim dalam aktivitasnya, karena bila



6

kekurangan kofaktor akan menghambat aktivitas enzim atau dengan kata lain kofaktor ikut mengatur aktivitas enzim. e.

Substrat Dengan bertambahnya substrat diharapkan kecepatan akan bertambah

sampai tercapai kecepatan maksimum. Dengan bertambahnya konsentrasi substrat, substrat akan menghambat atau menginhibisi pembentukan enzim substrat yang tidak menghasilkan produk (kelebihan substrat akan menginhibisi atau menghambat pembentukan produk). 2.2

Siklooksigenase Siklooksigenase merupakan enzim terikat membran yang telah ditemukan

dalam retikulum endoplasmik dan membran inti. Siklooksigenase terdapat dalam dua bentuk, yaitu siklooksigenase-1 dan siklooksigenase-2. Secara garis besar siklooksigenase-1 (COX-1) esensial dalam pemeliharaan berbagai fungsi dalam kondisi normal di berbagai jaringan khususnya ginjal, saluran cerna dan trombosit (Syarif, 2007). COX-1 diekspresikan pada mukosa lambung. Prostaglandin mukosa yang dihasilkan oleh COX-1 bersifat protektif terhadap kerusakan yang diinduksi asam. Sedangkan siklooksigenase-2 (COX-2) terdeteksi pada daerah yang mengalami peradangan (Coruzzi, Venturi, & Spaggiari, 2007). Contoh siklooksigenase (COX) inhibitor seperti rofecoxib, celecoxib, dan valdecoxib yang secara selektif menghambat induksi COX-2. Penghambatan yang selektif COX-2 ini selain mengatasi inflamasi dapat juga mengurangi toksisitas terhadap gastrointestinal dan ginjal. Namun demikian, pada penelitian lanjutan ditemukan bahwa COX-2 ternyata tidak hanya indusibel melainkan juga konstitutif dan terdapat pada berbagai jaringan. Pada kondisi fisiologis ekspresi konstitutif COX-2 ditemukan pada ginjal, pembuluh darah, paru-paru, tulang, pankreas, sumsum tulang belakang dan selaput lendir lambung (Kartasasmita, 2002). Karakteristik enzim siklooksigenase 1 dan siklooksigenase 2 dapat dilihat pada tabel berikut :



7

Tabel 2.1. Karakteristik Enzim Siklooksigenase-1 dan Siklooksigenase-2 Parameter

Siklooksigenase 1

Siklooksigenase 2

Ukuran gen

22 kb

8,3 kb

Ekson

11

10

Kromosom

9q32-q33,3

Iq25,2-q25,3

mRNA

2,8 kb

4,1 kb

Regulasi mRNA

Konstitusi

Indusible

Induktor

-

Sitokin, LPS

Jumlah asam amino

599

604

Lokasi

Membran inti

Membran inti

Kofaktor

1 mol Heme

1 mol Heme

Tempat pengikatan asam asetil salisilat Spesifisitas substrat

Serin-529

Serin-516

Asam arakidonat, asam linoleat 23 mmol asam arakidonat/ mg/menit

Asam arakodonat, asam linoleat,asam eikosapentenoat 11 mmol asam arakidonat/ mg/menit

Aktivitas

[Sumber: Kartasasmita, R.E. 2002]

2.3

Inhibitor Selektif Siklooksigenase-2 Strategi pertama untuk mengurangi toksisitas obat anti-inflamasi

nonsteroid adalah penghambatan selektif COX-2. Karena semua obat antiinflamasi nonsteroid merupakan inhibitor tidak selektif COX-1 dan COX-2, maka diusahakan membuat senyawa yang dapat menghambat aktivitas COX-2 secara selektif. Secara struktural terdapat beberapa golongan inhibitor selektif COX-2, yaitu: (1) turunan karbosiklis dan heterosiklis yang terikat visinal dengan moieties aril,(2) turunan diaril- atau aril/heteroaril-eter dan –tioeter,(3) turunan cis-stilben, serta(4) keton diaril dan aril/heteroaril. Sampai tahun 2000 telah berhasil disintesis sekitar 500 senyawa inhibitor selektif COX-2 (Dannhardt & Laufer, 2000). Dua dari senyawa tersebut celecoxib dan rofecoxib yang merupakan turunan karbosiklik dan heterosiklik, telah lolos uji klinik dan telah dipasarkan.



8

Pada penanganan pasien-pasien osteo- dan rheumatoidarthritis, inhibitor COX-2 menunjukkan kerja antiradang yang setara dengan obat antiradang bukan steroid klasik tetapi dengan toksisitas lebih ringan pada saluran gastrointestinal (Crofford, L.J.,2000). Namun demikian, dilaporkan pula adanya kecendrungan peningkatan tekanan darah sebagai efek samping inhibitor selektif COX-2.

2.4

Prostaglandin Prostaglandin merupakan lipida yang dibangun oleh 20 atom karbon

pembentuk rantai utamanya. Prostaglandin merupakan lipida yang mengandung gugus hidroksil (OH) diposisi atom C nomor 11 dan C nomor 15, dan memiliki ikatan rangkap pada atom C no 13.

CH3

Gambar 2.1 Molekul Prostaglandin

Saat ini dikenal prostaglandin A sampai I yang dibedakan oleh substituen yang terikat pada cincin siklopentan. Pada manusia, asam arakhidonat (asam 5,8,11,14-Eikosatetraenoat) merupakan prazat terpenting untuk mensintesis prostaglandin (Kartasasmita, 2002). Prostaglandin dihasilkan oleh jaringan yang sedang terluka atau sakit yang disintesis dari asam lemak tak jenuh rantai panjang yaitu asam arakhidonat. Kehadiran obat penghilang rasa sakit seperti aspirin dapat menghambat proses pembentukan molekul ini. Proses pembentukan prostaglandin dari asam arkidonat, ditunjukan oleh persamaan reaksi dibawah ini.



9

CH3

Asam arakidonat

Prostaglandin

Gambar 2.2 Proses Pembentukan Prostaglandin dari asam arakidonat

Terdapat dua jalur utama reaksi-reaksi yang dialami oleh asam arakidonat pada metabolismenya, yaitu jalur siklooksigenase yang bermuara pada prostaglandin, prostasiklin, dan tromboksan serta jalur lipoksigenase yang menghasilkan asam-asam hidroperoksieikosatetraenoat (HPETE) (Kartasasmita, 2002). Trauma/luka pada sel

Gangguan pada membran sel

Fosfolipid

Dihambat kortikosteroid

Fosfolipase Asam arakidonat

Lipoksigenase

Siklooksigenase

Asam Hidroperoksida

Endoperoksid PGG2/PGH

Leukotrin

PgE2, PgF2, PgD2

Tromboksan A2

Prostasiklin

Gambar 2.3 Biosintesis prostaglandin Universitas Indonesia


10

2.5

Antigen Antigen merupakan suatu substansi yang berperan penting dalam sistem

respon imun. Antigen yang seringkali juga disebut dengan imunogen dapat merangsang terbentuknya suatu antibodi yang spesifik. Antigen terdiri dari protein dan polisakarida. Lipid dan asam nukleat juga dapat bersifat antigenik apabila berikatan dengan protein dan asam polisakarida. Senyawa yang bersifat antigenik ini seringkali berasal dari komponen mikroorganisme misalnya dinding sel, selubung sel bakteri atau virus, flagel, fimbria, toksin bakteri dan bagian permukaan dari mikroorganisme (Radji, 2010). Pada setiap antigen terdapat daerah spesifik yang disebut dengan determinan antigenik atau epitop yang dikenali oleh antibodi. Epitop atau determinan antigen adalah bagian antigen yang dapat menginduksi pembentukan antibodi dan dapat diikat dengan spesifik oleh bagian dari antibodi atau oleh reseptor antibodi (Baratawidjaja, 2000). Pada umumnya antigen mempunyai berat molekul lebih dari 10.000. Beberapa substansi asing memiliki berat molekul rendah, tidak bersifat antigenik kecuali terikat dengan protein karier. Senyawa seperti ini disebut dengan hapten (Radji, 2010). Hapten adalah molekul yang dapat bereaksi dengan antibodi tetapi tidak dapat merangsang pembentukan antibodi secara langsung. Yang akhir biasanya berupa bahan kimia dengan berat molekul rendah yang akan beraksi dengan antibodi yang sudah ada (preformed) dan hanya menjadi imunologik bila diikat oleh molekul yang besar yang disebut carrier. Hapten membentuk epitop pada molekul carrier yang dikenal sistem imun dan merangsang pembentukan antibodi (Baratawidjaja, 2000). Hapten adalah determinan antigen dan dapat mengikat antibodi. Contoh hapten ialah berbagai golongan antibiotik dan obat lainnya dengan berat molekul yang rendah. Hapten biasanya dikenal dengan sel B sedangkan carrier oleh sel T. Carrier sering digabung dengan hapten dalam usaha imunisasi (Baratawidjaja, 2000). Sekali antibiotik terhadap hapten ini dapat terbentuk, maka antibodi ini dapat mengikat hapten dan tidak tergantung pada molekul carriernya (Radji, 2010). Universitas Indonesia


11

2.6

Antibodi Antibodi merupakan suatu protein (imunoglobulin) yang dibuat oleh tubuh

sebagai respon terhadap masuknya antigen, dapat mengenali dan mengikat antigen secara spesifik. Oleh sebab itu antibodi dapat membantu proses perusakan dan pemusnahan antigen. Antibodi bersifat sangat spesifik dalam mengenali determinan antigenik dari suatu antigen sehingga apabila suatu mikroorganisme mempunyai beberapa determinan antigenik maka tubuh akan memproduksi beberapa antibodi sesuai dengan jenis epitop yang dimiliki oleh setiap mikroorganisme. Setiap antibodi mempunyai sedikitnya dua situs identik yang dapat berikatan dengan determinan antigenik yang disebut antigen-binding sites. Jumlah dari antigen-binding sites setiap antibodi disebut valensi dari antibodi, misalnya sebagian besar antibodi manusia mempunyai 2 binding sites sehingga disebut dengan antibodi bivalen (Radji, 2010).

2.6.1

Struktur Antibodi Karena antibodi bivalen merupakan struktur antibodi yang paling

sederhana maka antibodi bivalen ini disebut dengan monomer. Struktur dasar antibodi memiliki 4 rantai protein yaitu: dua rantai ringan (light chain = L) dan 2 rantai berat (heavy chain = H) yang identik. Istilah rantai ringan dan berat mengacu pada berat molekul yang relatif dari masing-masing rantai. Setiap rantai ringan dihubungkan dengan rantai berat melalui ikatan sulfida (S-S) membentuk molekul bentuk Y. Dengan membandingkan deretan asam amino dari molekulmolekul antibodi yang berbeda, menunjukkan bahwa spesifikasi antigen-antibodi berada pada dua lengan dari Y. Sementara cabang dari Y menentukan peran antibodi dalam respon imun. Struktur antibodi dapat dilihat pada Gambar 2.4 ini untuk memudahkan dalam membayangkan bentuk antibodi.



12

[Sumber: Sherwood, 1996]

Gambar 2.4 Struktur molekul antibodi

Keterangan : 1. Fab region 2. Fc region 3. Heavy chain 4. Light chain 5. Antigen binding site 6. Hinge region

Molekul imunoglobulin G (IgG) dapat dipecah oleh enzim papain menjadi 3 fragmen yaitu 2 fragmen yang mempunyai susunan yang sama terdiri dari rantai berat (heavy chain) dan rantai ringan (light chain) disebut Fab dan 1 fragmen yang hanya terdiri dari rantai berat (heavy chain) saja disebut Fc. Fragmen Fab (fragment antigen binding) berfungsi mengikat antigen, karena susunan asam amino dibagian ini sangat variabel sesuai dengan variabilitas antigen yang merangsang pembentukannya. Sebaliknya fragmen Fc (fragment crystalable), merupakan fragmen yang konstan tidak mempunyai kemampuan untuk mengikat Universitas Indonesia


13

antigen tetapi dapat bersifat sebagai determinan antigen. Selain itu pepsin juga dapat memecah fragmen Fc menjadi beberapa bagian kecil. Bagian molekul imunoglobulin yang peka terhadap pemecahan oleh kedua enzim tersebut disebut dengan bagian engsel (hinge region) (Sherwood, 1996).

2.6.2

Antibodi Monoklonal Sebelum

ditemukannya

teknologi

antibodi

monoklonal,

antibodi

dahulunya diperoleh dengan cara konvensional yakni mengimunisasi hewan percobaan, mengambil darahnya dan mengisolasi antibodi dalam serum sehingga menghasilkan antibodi poliklonal. Apabila dibutuhkan antibodi dalam jumlah besar maka hewan percobaan yang dibutuhkan juga sangat besar jumlahnya. Selain itu bila diproduksi dalam jumlah besar antibodi poliklonal jumlah antibodi spesifik yang diproduksi juga sangat sedikit, sangat heterogen dan sangat sulit menghilangkan antibodi lain yang tidak diinginkan (Radji, 2010). Maka dari itu dilakukan serangkaian penelitian untuk membuat antibodi spesifik secara in vitro, sehingga dapat diproduksi antibodi spesifik dalam jumlah besar, dan tidak terkontaminasi dengan antibodi lainnya. Antibodi monoklonal merupakan senyawa yang homogen, sangat spesifik dan dapat diproduksi dalam jumlah yang besar sehingga sangat menguntungkan jika digunakan sebagai alat diagnostik. Beberapa jenis kit antibodi monoklonal telah tersedia dipasaran untuk mendeteksi bakteri patogen dan virus, serta untuk uji kehamilan. Antibodi monoklonal dibuat dengan cara penggabungan atau fusi dua jenis sel yaitu sel limfosit B yang memproduksi antibodi dengan sel kanker (sel mieloma) yang dapat hidup dan membelah terus menerus. Antibodi monoklonal merupakan bahan standar yang banyak digunakan dalam laboratorium untuk mengidentifikasi berbagai jenis sel, typing darah dan menegakkan diagnosis berbagai penyakit. Umumnya penentuan antibodi yang diinginkan, dilakukan dengan cara enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) atau radioimmunoassay (RIA). Pemilihan klon hibridoma yang dapat menghasilkan antibodi dan yang kedua adalah memilih sel hibridoma penghasil antibodi monoklonal yang potensial menghasilkan antibodi monoklonal yang tinggi dan stabil (Radji, 2010). Universitas Indonesia


14

2.7

Senyawa pembanding

2.7.1

Asetosal (Farmakope Indonesia, 1995)

[Sumber: Farmakope Indonesia, 1995, telah diolah kembali]

Gambar 2.5 Rumus struktur Asetosal

Rumus molekul

: C9H8O4

Berat molekul

: 180,16

Pemerian

: Hablur putih, umumnya seperti jarum atau serbuk hablur putih; tidak berbau atau berbau lemah. Stabil di udara kering; di udara lembab secara bertahap terhidrolisis menjadi asam salisilat dan asam asetat.

Kelarutan

: Sukar larut dalam air; mudah larut dalam etanol; larut dalam kloroform dan dalam eter.

Pada tahun 1899 asam asetil salisilat sebagai obat anti radang bukan steroid sintetik dengan kerja antiradang yang kuat untuk pertama kalinya digunakan dalam pengobatan simptomatis penyakit rematik. Di samping sebagai obat antiradang, asam asetil salisilat memiliki peranan lain dalam terapi obat yang tidak kalah pentingnya, yaitu sebagai zat penghambat agregasi trombosit. Telah diketahui, bahwa agregasi trombosit diregulasi oleh kesetimbangan produksi prostasiklin (PGI2) dan tromboksan A2 (TXA2). Prostasiklin diproduksi di dalam dan dibebaskan dari sel-sel endotel dinding pembuluh darah, sedangkan tromboksan dibentuk di dalam trombosit. Prostasiklin merupakan vasodilator dan penghambat agregasi trombosit, sebaliknya tromboksan mendorong terjadinya agregasi trombosit (Kartasamita, 2002). Universitas Indonesia


15

2.7.2 Selekoksib (Martindale, 36)

[Sumber: Martindale 36, telah diolah kembali]

Gambar 2.6 Rumus struktur Selekoksib

Rumus molekul

: C17H14F3N3O2S

Berat molekul

: 381,4

Pemerian

: Serbuk berwarna putih, serbuk kristal putih amorf; tidak berbau

Titik lebur

: 160o-164o C

Kelarutan

: Praktis tidak larut air.

Selekoksib merupakan NSAID (anti-inflamasi non steroid) yang dilaporkan selektif menghambat kerja enzim siklooksigenase-2 (COX-2). Suatu obat anti inflamasi non streroid yang bekerja sebagai anti inflamasi, analgesik, dan anti piretik. Mekanisme kerja dari obat ini adalah melalui penghambatan terhadap sintesis prostaglandin, utamanya melalui hambatan pada COX-2. Pada kadar terapeutik tidak akan menghambat COX-1(Pfizer, 2007).



16

2.8

Senyawa


benzensulfonamida (Hudiyono dan Hayun, 2011)

[Sumber: Hudiyono dan Hayun, 2011, telah diolah kembali]

Gambar 2.7 Rumus Struktur 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida

Rumus molekul

: C23H19N3O4S

Berat molekul

: 433,480

Organoleptis

: serbuk berwarna kuning pucat, tidak berbau

Titik lebur

: 228o-229o C

Kelarutan

: mudah

larut

dalam

tetrahidrofuran

dan

dimetilsulfoksida (DMSO); sukar larut dalam asetonitil, etanol dan kloroform; praktis tidak larut dalam air.

Senyawa


benzensulfonamida diperoleh dengan cara mengkondensasi 3-(4-metoksifenil)-2metil-4(3H)-kuinazolinon dengan p-formil-benzensulfonamida dalam pelarut asam asetat glasial, dengan natrium asetat anhidrat sebagai katalis (Hudiyono dan Hayun, 2011). Struktur senyawa tersebut mempunyai kemiripan dengan senyawa diaril heterosiklik. Kebanyakan inhibitor selektif COX-2 merupakan senyawa diaril heterosiklik (Dannhardt dan Laufer, 2000), sehingga diduga senyawa 4-[(E)2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida

tersebut



17

memiliki aktivitas sebagai inhibitor siklooksigenase-2 (Hayun; M. Hanafi; A. Yanuar; dan S. Hudiyono, 2011). Struktur produk hasil reaksi dielusidasi berdasarkan titik lebur, KLT, spektofotometer UV-Vis, data spektra FT-IR, 1HNMR,

13

C-NMR dan sperkta MS (Hayun; M. Hanafi; A. Yanuar.; dan S.

Hudiyono, 2011).

2.9

Uji Aktivitas Penghambatan pada Enzim Siklooksigenase-2 Ada beberapa cara untuk melakukan uji aktivitas penghambatan senyawa

uji terhadap enzim COX, antara lain : 2.9.1 Metode Malondialdehid (MDA) Perubahan

asam

arakidonat

menjadi

Prostaglandin

oleh

enzim

siklooksigenase menghasilkan produk samping malondialdehid (MDA) yang dapat diukur intensitas fluorosensinya. Siklooksigenase tersebut berasal dari keping darah segar manusia. Plasma yang kaya akan keping darah ditambahkan senyawa uji, diinkubasi pada 37oC selama 15 menit, lalu ditambah natrium arakidonat, diinkubasi pada 37oC selama 30 menit, selanjutnya reaksi dihentikan dengan penambahan pereaksi asam tiobarbiturat dan diinkubasi pada 80oC selama 15 menit. Setelah didinginkan campuran disentrifugasi pada 4oC, 3000 rpm selama 15 menit, dan supernatan diukur. intensitas fluorosensinya menggunakan spektrofluorometer pada panjang gelombang eksitasi 534 nm dan emisi 554 nm. Cara uji ini menentukan aktivitas inhibisi senyawa uji pada COX-1 dan COX-2 total. 2.9.2 Metode N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilendiamin (TMPD) Pengukuran perubahan kromogen N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilendiamin (TMPD) selama reduksi PGG2 menjadi PGH2 untuk menentukan aktivitas siklooksigenase dilakukan secara spektrofotometri. Siklooksigenase (COX-2) diperoleh dari plasenta biri-biri. Campuran reaksi yang berisi hematin dan fenol dalam dapar Tris-HCl ( 100 μM, pH 8,1) (sebagai kofaktor) ditambah enzim yang telah diinkubasi dengan pembawa atau dengan larutan senyawa uji dalam dimetilsulfoksid pada suhu 37oC selama 1-10 menit, kemudian ditambahkan larutan segar asam arakidonat dan TMPD dan diukur perubahan serapan pada 611 Universitas Indonesia


18

nm selama 30 detik. Kecepatan reaksi awal (linier selama l.k. 15 detik) diukur, dan kecepatan oksidasi nonspesifik pada saat enzim tidak ada dikurangkan sebelum perhitungan persentase hambatan (Fernandez de Arriba et al., 1999). Cara uji ini menentukan aktivitas penghambatan senyawa uji spesifik COX-2.

2.9.3 Metode Darah Manusia Keseluruhan (Whole Human Blood Assay) Uji aktivitas penghambatan COX-2 yang mengkatalisis produksi PGE2 ditentukan dengan cara sebagai berikut. Sampel-sampel darah manusia segar yang tidak meminum obat AINS selama 14 hari sebelum pengambilan darah, dikumpulkan dalam tabung-tabung berisi heparin (20 U/mL). Kemudian sebanyak 500 μL darah terheparinasi diinkubasi bersama 5 μL larutan senyawa uji dengan berbagai konsentrasi (misalnya, 5 sampai 20 μM) atau pelarut senyawa uji (misalnya, DMSO) atau larutan baku pembanding (misalnya, celecoxib10 μM), dengan ditambahkan atau tidak ditambahkan lipopolisakarida (LPS) (berasal dari E-coli 026:B6) (10 μg/mL) pada suhu 37oC selama 24 jam dengan penggojokan yang lembut untuk menginduksi ekspressi COX-2. Reaksi dihentikan dengan merendam tabung-tabung uji dalam air dingin. Plasma dipisahkan dengan cara sentrifugasi pada suhu 4oC, 13000 rpm selama 10 menit. Sampel-sampel disimpan pada suhu -20oC sampai kadar PGE2 diukur menggunakan kit ELISA spesifik (Fernandez de Arriba et al., 1999; Hassanein, Khalifa, El-Samaloty, El-Rahim, Tha,& Ismail, 2008). Cara uji ini menentukan aktivitas penghambatan senyawa uji spesifik pada COX-2.

2.9.4 Metode Enzyme Immunoassay (EIA) Enzyme Immunoassay (EIA) adalah immunoassay yang paling sensitif yang dapat dipakai untuk penghitungan secara kuantitatif dengan konsentrasi sangat rendah (misalnya, hormone, vitamin, obat terapeutik). Prinsip dari EIA adalah reaksi antigen-antibodi, dapat dideteksi dengan penambahan konjugat dilabel enzim aktif yang bereaksi dengan substrat menghasilkan warna spesifik yang dapat dibaca pada alat kolorimeter/spektrofotometer pada panjang gelombang tertentu.



19

2.10

Enzyme Immunoassay (EIA)

2.10.1 Prinsip EIA Enzyme Immunoassay (EIA) atau biasa dikenal juga dengan ELISA merupakan salah satu teknik uji serologis yang mulai dikenalkan pada tahun 1971 oleh Engvall dan Perlmann. Hasil pengujian EIA dapat dinilai secara kualitatif maupun kuantitatif. Penilaian kualitatif dapat dibaca secara visual melalui perubahan warna yang terjadi dan dibedakan dari kontrol yang tidak berwarna (positif atau negatif). Penilaian secara kuantitatif dilakukan dengan membaca perubahan warna yang terbentuk menggunakan EIA reader. Pengujian EIA memiliki spesifisitas dan sensitifitas yang tinggi. EIA paling banyak digunakan karena sederhana, terpercaya dengan mekanisme yang mudah (Rittenburg, 1990). Pada enzim siklooksigenase (COX) merupakan katalisis pertama biosintesis asam arakidonat menjadi PGH2. Skrining inhibitor COX (ovine) dilakukan secara langsung dengan mengukur PGF2α, dengan cara mereduksi PGH2 dari COX yang dihasilkan dalam reaksi menggunakan timah (II) klorida (SnCl2). Produk prostanoid ini diukur melalui Enzyme Immunoassay (EIA), menggunakan antiserum yang spesifik berikatan dengan kebanyakan senyawa-senyawa prostaglandin.

2.10.2 Pengukuran EIA Pengukuran EIA berdasarkan pada kompetisi antara Prostaglandin (PG) dan suatu konjugat Prostaglandin-asetilkolinesterase (AChE) yang merupakan PG tracer untuk berikatan dengan Prostaglandin antiserum yang jumlahnya terbatas. Karena konsentrasi PG tracer dibuat tetap, sedangkan PG bervariasi, maka jumlah PG tacer yang dapat diikat oleh PG antiserum adalah berbanding terbalik dengan konsentrasi PG di dalam sumur uji. Kompleks antiserum akan berikatan dengan antibodi monoklonal yang telah dimasukkan sebelumnya pada sumur uji. Sumur uji ini kemudian dicuci untuk menghilangkan reagen yang tidak berikatan dan kemudian reagen Ellman’s, yang berisi asetiltiokolin (substrat untuk AChE) dan asam 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzoat), ditambahkan ke sumur uji. Secara skematik digambarkan sebagai berikut:



20

[Sumber : Cayman Chemicals Inc, Ann Arbor, MI., 2010]

Gambar 2.8 Skema reaksi EIA Universitas Indonesia


21

Keterangan: = antibodi antikelinci mencit = protein bloking = PG-tracer = antiserum spesifik = prostaglandin bebas Asetilkolin akan dihidrolisis oleh asetilkolinesterase pada PG tracer yang berikatan pada sumur uji, menghasilkan tiokolin dan asam asetat. Tiokolin selanjutnya bereaksi dengan 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzoat) menjadi asam 5-tio-2nitrobenzoat yang berwarna kuning terang, yang menyerap cahaya sinar tampak dengan kuat pada λ 412 nm (ɛ = 13.600). Secara sistematik digambarkan sebagai berikut: o

Asetiltiokolin Asetiltiokolin Asetilkolinesterase Asetilkolinesterase Tiokolin

5,5’-ditio-bis-(asam 2-nitrobenzoat)

Asam 5-tio-2-nitrobenzoat [Sumber: Cayman Chemicals Inc, Ann Arbor, MI., 2010]

Gambar 2.9 Reaksi katalisis dari Asetilkolinesterase Universitas Indonesia


22

Intensitas warna (besarnya serapan) diukur secara spektrofotometri. Besarnya serapan ini sebanding dengan jumlah PG tracer yang berikatan pada sumur uji, dan berbanding terbalik dengan jumlah PG yang ada dalam sumur reaksi selama inkubasi. Sehingga semakin besar aktivitas inhibitor COX, semakin kecil PG yang diproduksi, maka semakin banyak PG tracer yang diikat pada sumur uji, dan semakin besar intensitas warnanya (Cayman Chemicals Inc, Ann Arbor, MI., 2010). Uji aktivitas penghambatan enzim siklooksigenase dilakukan dengan metode Enzyme Immunoassay (EIA), menggunakan kit uji skrining inhibitor COX (ovine), nomor katalog 560101 dari Cayman Chemical Company (Cayman’s COX (ovine) Inhibitor Screening Assay Kit, catalog No. 560101). Pengujian dilakukan dengan menggunakan plate reader pada panjang gelombang 415nm.

2.11

EIA Plate Reader

2.11.1 Prinsip Plate reader adalah sebuah fotometer yang dirancang untuk mengukur serapan cahaya (Optical Density/OD) dari sampel cairan pada plat mikro. Mempunyai spektrum visible antara 400-700 nm, beberapa diantaranya juga bekerja pada tingkatan yang dekat dengan UV sampai dengan 340 nm. Biasanya mempunyai kisaran linier dari serapan 0 sampai dengan 1,5 dengan resolusi 0,001. Sebagian besar plate reader menggerakkan plat mikro melalui cahaya lampu. Waktu yang dibutuhkan untuk membaca satu plat dengan 96 lubang bervariasi antara 5 sampai dengan beberapa menit (Lim, L., 2012). Plate Reader yang paling sederhana menyediakan data tercetak melalui output yang sensitif terhadap panas. Reader yang paling canggih dapat dihubungkan dengan komputer yang menampilkan perhitungan dengan bervariasi.

2.11.2 Sistem Optik (Aziz, 1999) Sistem optik terdiri dari komponen-komponen : 1. Lampu halogen tungsten Merupakan sumber cahaya yang digunakan.



23

2. Diafragma Diafragma ini akan memotong sorotan cahaya untuk meminimalkan derau elektronik. 3. Lensa kondensor Bagian dari sinar tampak dan sinar dengan panjang gelombang yang lebih panjang akan melewati lensa ini. Sinar UV dan sisa-sisa sinar tampak akan dipantulkan. 4. Filter penyebar Panjang gelombang ditentukan dari filter yang digunakan. 5. Fiber bundle Setelah melalui filter penyebar, sorotan cahaya akan mencapai ujung dari fiber bundle, yang akan membagi cahaya menjadi delapan jalur sinar pararel yang sama dan akan membelokan cahaya tersebut ke atas. 6. Lensa fokus Setelah cahaya dibagi, cahaya akan melalui sebuah sistem fokus dari delapan lensa fokus. 7. Detektor Delapan sorotan cahaya akan melalui dasar dari lubang sel (sumuran) kemudian akan melalui sampel menuju detektor yang akan mengukur intensitas cahaya.



24

7 Plat mikro

6

4 5

3

1 2

[Sumber: Aziz, A. (1999), telah diolah kembali]

Gambar 2.10 Skema Sistem Optik EIA Plate Reader

Keterangan : 1. Lampu halogen tungsten 2. Diafragma 3. Lensa kondensor 4. Filter penyebar 5. Fiber bundle 6. Lensa fokus 7. Detektor



BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1

Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kimia Farmasi Kuantitatif

Departemen Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia, dari bulan Februari sampai Mei 2012.

3.2

Alat dan Bahan

3.2.1 Alat Kit EIA Catalog No.560101; Plate reader (Biotek ELx808); mikro pipet (Eppendrof); timbangan analitik (AND); penangas air (Memmert); orbital shaker (Lab Line); vortex (As one); sentrifuge (Heraeus Sepatech) tabung mikro; rak tabung mikro; rak tabung reaksi; alat gelas.

3.2.2 Bahan Sampel

senyawa

4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-

il}vinil]benzensulfonamida (Hasil sintesis hayun, dkk); senyawa pembanding Asetosal (Shandong Xinhua Pharmaceutical Co., Ltd); senyawa pembanding Selekoksib (hasil isolasi dari kapsul Celebrex-Pfizer); 96 well plate (No. Katalog 400012); dapar reaksi (No.Katalog 460104); COX-2 (ovine) – (No.Katalog 460101); heme (No. Katalog 460102); asam arakhidonat (substrat) – (No.Katalog 460103); air Ultrapure (No.400000 Katalog); KOH 0,1M (No.Katalog 460107); timah(II)klorida

(No.Katalog

260107);

HCl

1M

(No.Katalog

460106);

dimetilsulfoksida (Merck).

3.2.2.1 Pembuatan Larutan Pereaksi 1.

Pembuatan Larutan Dapar Reaksi Dibuat dengan mengencerkan 5 mL dapar reaksi pekat dengan 45 mL air UltraPure.

2.

Pembuatan Larutan Heme Dibuat dengan mengencerkan 100 μL Heme dengan 400 μL dapar reaksi. 25



26

3.

Pembuatan Larutan Asam Arakidonat (Substrat) Pindahkan 50 μL substrat persediaan ini ke vial lain, tambahkan 50 μL KOH, vortex, dan encerkan dengan 400 μL air UltraPure sehingga konsentrasi akhir 10mM.

4.

Asam Hidroklorida 0,1 M Dibuat dengan mengencerkan 500 μL dengan 4,5 mL air UltraPure untuk menghasilkan konsentrasi 0,1 M.

5.

Pembuatan Larutan Timah (II) Klorida Dibuat dengan menambahkan 5 mL HCl 0,1 M HCl dan vortex untuk menghasilkan larutan timah (II) klorida jenuh. Apabila tidak melaksanakan semua reaksi COX dalam satu hari, timbang seksama lebih kurang 125 mg timah (II) klorida dalam vial lain dan tambahkan 2,5 mL HCl 0,1 M.

6.

Pembuatan Larutan Dapar EIA Dibuat dengan mengencerkan isi konsentrat dapar EIA dengan 90 ml air UltraPure. Bilas vial untuk membersihkan garam yang mengendap.

7.

Pembuatan Larutan Dapar Cuci Dibuat dengan mengencerkan isi konsentrat dapar cuci hingga 2 liter dengan air UltraPure dan tambahkan 1 mL tween 20. Dapar cuci volume yang lebih kecil dapat dibuat dengan mengencerkan konsentrat dapar cuci 1:400 dan menambahkan tween 20 (0,5 mL/L dapar cuci).

8.

Pembuatan Tracer AChE Skrining Prostaglandin Dibuat dengan merekonstitusi PG tracer skrining dengan 6 mL dapar EIA.

9.

Pembuatan Antiserum Skrining Prostaglandin Dibuat dengan merekonstitusi PG skrining antiserum dengan 6 mL dapar EIA.

3.2.2.2 Pembuatan larutan Asetosal sebagai pembanding Larutan induk Asetosal dibuat dengan menimbang seksama ± 5,0 mg Asetosal, kemudian masukkan ke dalam labu ukur 5,0 mL , dilarutkan dengan pelarut DMSO, cukupkann volumenya dengan DMSO hingga 5,0 mL, kocok hingga homogen (konsentrasi 100µM). Buat pengenceran dengan konsentrasi 50, 25, 10 dan 1 µM menggunakan pelarut campuran DMSO dan dapar reaksi (1:1). Universitas Indonesia


27

3.2.2.3 Pembuatan larutan Selekoksib sebagai pembanding Larutan induk Selekoksib dibuat dengan menimbang seksama ± 10,0 mg Selekoksib, kemudian masukkan ke dalam labu ukur 5,0 mL, larutkan dengan pelarut DMSO, cukupkann volumenya dengan DMSO hingga 5,0 mL, kocok hingga homogen (konsentrasi 100µM). Buat pengenceran dengan konsentrasi 10, 1, 0,1 dan 0,01 µM menggunakan pelarut campuran DMSO dan dapar reaksi (1:1).

3.2.2.4 Pembuatan larutan sampel senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida. Larutan induk sampel senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida dibuat dengan menimbang seksama ± 11,0 mg sampel, kemudian masukkan ke dalam labu ukur 5,0 mL, larutkan dengan pelarut DMSO, cukupkann volumenya dengan DMSO hingga 5,0 mL, kocok hingga homogen (konsentrasi 100µM). Buat pengenceran dengan konsentrasi 20, 10, 5 dan 1 µM menggunakan pelarut campuran DMSO dan dapar reaksi (1:1).

3.2.2.5 Pembuatan Larutan Standar Prostaglandin (PG) Larutkan standar PG terliofilasi

dalam 1 mL dapar EIA. Konsentrasi

larutan ini adalah 10 µg/mL (standar bulk). Larutan standar prostaglandin dibuat pada konsentrasi 2000; 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,3 dan 15,6 pg/ml. Untuk membuat standar untuk digunakan dalam EIA : Siapkan 8 tabung uji bersih dan beri nama #1 hingga #8. Isikan 800 μL dapar EIA pada tabung uji #1 dan 500 μL dapar EIA pada tabung uji #2-8. Pindahkan 200 μL standar bulk pada tabung uji #1 dan aduk sebaik mungkin. Secara serial encerkan standar ini dengan mengambil 500 μL dari tabung uji #1 dan memasukkannya ke tabung uji #2, campur sebaik mungkin. Kemudian ambil 500 μL dari tabung uji #2 dan memasukkannya ke tabung uji #3, campur sebaik mungkin. Ulangi proses ini untuk tabung uji #4-8. Skema penyiapan standar PG dapat dilihat pada Lampiran.3.



28

3.3

Cara Kerja

3.3.1

Uji Penghambatan Aktivitas Siklooksigenase-2

3.3.1.1 Pelaksanaan Reaksi 1. Inaktivasi enzim Pipet 20 µL enzim COX-2 ke 500 µL tabung mikro dan inaktifkan selama 3 menit dalam air mendidih. 2. Pereaksian diatas penangas air pada suhu 370C Pipet 970µL dapar reaksi, masukkan ke dalam tabung uji BC. Pipet 950µL dapar reaksi, masukkan ke dalam tabung IA dan ke semua tabung uji. Tambahkan 10µL heme ke semua tabung. Tambahkan 10 µL COX-2 inaktif ke tabung BC. Tambahkan 10 µL COX-2 aktif ke IA dan semua tabung uji. Tambahkan 20 µL pelarut (campuran dapar reaksi dan DMSO (1:1)). Tambahkan 20 µL larutan inhibitor pada tabung inhibitor lalu vortex. Inkubasi selama 10 menit. Tambahkan 10 µL asam arakidonat pada semua tabung uji, vortex dan inkubasi kembali selama 2 menit. Lalu tambahkan 50 µL HCl 1 M pada setiap tabung uji. 3. Angkat tabung-tabung uji dari penangas air. 4. Tambahkan 100 µL larutan timah (II) klorida pada tiap tabung uji dan vortex. Inkubasi selama 5 menit pada suhu kamar. 5. Sentrifugasi 4000 rpm (10-20 menit) semua larutan uji hingga diperoleh supernatan yang jernih.

3.3.1.2 Pengenceran Hasil Reaksi 1. Sampel Background (BC) Masukkan 990 µL dapar EIA pada tabung mikro, tambahkan 10 µL supernatan sampel BC kocok hingga homogen. 2. Sampel Aktivitas Inisial COX-2 100% ( IA) Masukkan 990 µL dapar EIA pada tabung mikro pengenceran pertama (IA.1), lalu tambahkan 10 µL supernatan sampel IA, kocok hingga homogen. Masukkan 950 µL dapar EIA pada tabung mikro pengenceran kedua (IA.2), Lalu tambahkan 50µL supernatan sampel IA.1 ke IA.2, kocok hingga homogen. Universitas Indonesia


29

3. Sampel Inhibitor COX-2 Masukkan 990 µL dapar EIA pada tabung mikro pengenceran pertama (COX-2.1), lalu tambahkan 10 µL supernatan sampel inhibitor COX-2, kocok hingga homogen. Masukkan 950 µL dapar EIA pada tabung mikro pengenceran kedua (COX-2.2), Lalu tambahkan 50µL supernatan sampel inhibitor COX-2.1 ke COX-2.2, kocok hingga homogen.

3.3.1.3 Pelaksanaan EIA a.

Penambahan Larutan Bahan

1. Dapar EIA : Tambahkan 100 μL dapar EIA pada sumur pengikatan non spesifik (NSB). Tambahkan 50 μL dapar EIA untuk sumur Pengikatan maksimum (Bo) 2. Standar Skrining PG : Tambahkan 50 μL dari tabung #8 pada sumur standar paling bawah (S8). Tambahkan 50 μL dari #7 pada masing-masing dua sumur standar berikutnya (S7). Teruskan prosedur ini hingga semua standar terisi. Ujung pipet yang sama digunakan untuk mengisi semua standar. Sebelum memipet masing-masing standar, setimbangkan ujung pipet ini dalam standar tersebut. 3. Sampel-sampel background (tabung uji BC1 dan BC2) : Tambahkan 50 μL sampel per sumur. Masing-masing sampel diuji dua kali. 4. Sampel-sampel aktivitas inisial COX 100% (tabung uji IA2 dan IA3) : Tambahkan 50 μL sampel per sumur. Diuji masing-masing sampel pada dua pengenceran dengan masing-masing pengenceran diuji dua kali. 5. Sampel-sampel COX Inhibitor (tabung uji C2 dan C3) : Tambahkan 50 μL sampel per sumur. Diuji masing-masing sampel pada dua pengenceran dengan masing-masing pengenceran diuji dua kali. 6. Tracer AChE Skrining PG : Tambahkan 50 μL tracer skrining PG pada masing-masing sumur kecuali sumur-sumur Total aktivitas (TA) dan blanko (Blk). 7. Antiserum Skrining PG : Tambahkan 50 μL Antiserum skrining PG pada masing-masing sumur kecuali Total aktivitas (TA) dan blanko (Blk).



30

b.

Inkubasi Lempeng

Tutup setiap lempeng dengan film plastik dan inkubasi selama 18 jam pada temperatur kamar di atas orbital shaker. c.

Pengembangan Lempeng 1. Rekonstitusi satu vial Reagen Elman dengan 20 ml air “Ultrapure” 2. Kosongkan sumur-sumur dan cuci limakali dengan Dapar Cuci. 3. Tambahkan 200 μL Reagen Elman pada tiap sumur uji 4. Tambahkan 5 μL tracer pada sumur Aktivitas Total (TA).

d.

Pembacaan Lempeng Baca lempeng pada panjang gelombang 405-415 nm. Serapan dicek secara

berkala sampai sumur Bo mencapai minimum 0,3 A.U. (blanko pengurang). Lempeng dibaca bila serapan sumur Bo pada rentang 0,3 – 1,0 A.U. (blanko pengurang). Bila serapan dari sumur-sumur melebihi 1,5, cuci lempeng, dan tambahkan reagen Elman yang segar dan biarkan mengembang lagi.

3.3.2 Analisis/Perhitungan Data Data diplot sebagai %B/Bo versus log konsentrasi menggunakan kurva log- logit (data reduction software). Bo terkoreksi =Bo - NSB %B/Bo Sn =

Sn - NSB Bo terkoreksi

(3.1) x 100

(3.2)

Keterangan : Bo

= serapan rata-rata sumur pengikatan maksium (Bo)

NSB = serapan rata-rata sumur pengikatan non spesifik (NSB) Sn

= serapan standar prostaglandin ke-n

n

= 1 sampai 8

3.3.2.1 Plot Kurva Standar Universitas Indonesia


31

Plot %B/Bo untuk standar S1-S8 versus konsentrasi PG, menggunakan linier (y) dan log (x). Plot data sebagai logit (B/Bo) versus log konsentrasi dan lakukan pencocokan regresi linier.

3.3.2.2 Penentuan Konsentrasi Sampel a. Hitung nilai %B/Bo untuk sampel b. Tentukan konsentrasi untuk setiap sampel dengan mengidentifikasi %B/Bo pada kurva standar dan baca nilai yang bersesuaian pada aksis-x. Kalikan sampel-sampel COX dengan faktor pengenceran yang sesuai (BC= 100; IA dan Inhibitor = 2000) IA terkoreksi = A = AI – BC

(3.3)

Sampel terkoreksi = B = Sampel – BC

(3.4)

% inhibisi =

A-B A

x 100

(3.5)

c. Buat grafik persen inhibisi dengan konsentrasi inhibitor untuk menentukan nilai IC50. Nilai IC50 dihitung menggunakan rumus persamaan regresi untuk menentukan y = a + bx. Aktivitas inhibisi dinyatakan dengan Inhibition Concentration 50% (IC50) yaitu konsentrasi sampel yang dapat menghambat kerja enzim sebesar 50% (Murray, 2009).



BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

Uji Penghambatan Aktivitas Siklooksigenase-2

4.1.1 Pelaksanaan Reaksi Prinsip dari reaksi siklooksigenase ini dimana, siklooksigenase (COX) merupakan katalisis pertama biosintesis asam arakidonat menjadi PGG2, selanjutnya perubahan PGG2 menjadi PGH2 oleh aktivitas peroksidase COX (heme). Katalisis dihentikan dengan penambahan HCl. PGH2 kemudian direduksi menjadi PGF2α dengan penambahan timah (II) klorida (SnCl2). Setelah pereaksian COX selesai, lalu diinkubasi selama 5 menit. Produk prostanoid yang dihasilkan, diukur secara kuantitatif dengan Enzyme Immunoassay (EIA) menggunakan antiserum yang berikatan dengan prostaglandin. Pada tahap pelaksanaan reaksi dilakukan diatas penangas air dengan suhu 0

37 C. Dalam pelaksanaan reaksi digunakan beberapa tabung antara lain: tabung BC (Background), IA 100% (Initial Activity 100%) dan tabung inhibitor. Tabung BC merupakan blanko/kontrol dimana kondisi enzim di inaktifkan. Pada reaksi EIA, BC tidak akan memberikan aktivitas penghambatan. Karena enzim inakif meskipun ditambahkan substrat BC tidak akan menghasilkan prostaglandin. Tabung IA berisi enzim aktif sehingga memberikan aktivitas 100%. Pada IA juga tidak ada aktivitas penghambatan, karena tidak adanya penambahan inhibitor dalam pereaksian. Tabung inhibitor merupakan tabung untuk senyawa pembanding

Astosal,

Selekoksib

dan

senyawa

metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida,

4-[(E)-2-{4-okso-3-(4dimana

memberikan

aktivitas penghambatan. Tiap tabung diberikan penambahan heme dan asam arakhidonat. Heme merupakan kofaktor dalam reaksi COX yang berfungsi melengkapi struktur enzim sehingga interaksi antara enzim dengan substrat dapat lebih optimum. Bila kekurangan heme maka akan menghambat aktivitas enzim atau dengan kata lain kofaktor dapat mengatur aktivitas enzim. Sedangkan asam arakhidonat merupakan

32



33

substrat yang akan menginisiasi reaksi pembentukan prostaglandin. Dalam penambahan asam arakhidonat harus ditambahkan secara kuantitatif, karena dapat mempengaruhi aktivitas penghambatan enzim. Lalu di inkubasi selama 2 menit, tahap terakhir dalam reaksi dengan penambahan HCl 1 M yang berfungsi untuk menghentikan reaksi COX. Pada reaksi COX-2, masing-masing sampel inhibitor dibuat larutan induk dengan konsentrasi 100 µM. Dari larutan induk 100 µM tiap sampel dilakukan pengenceran dengan konsentrasi yang berbeda-beda. Untuk senyawa pembanding Asetosal dibuat dengan konsentrasi 50, 25, 10, dan 1 µM. Senyawa pembanding Selekoksib dibuat dengan konsentrasi 10, 1, 0,1, 0,001 µM. Sedangkan senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida dibuat dengan konsentrasi 20, 10, 5, dan 1 µM. Pertimbangan konsentrasi pengenceran masing-masing larutan inhibitor ini berdasarkan data % inhibisi yang dihasilkan setelah pengukuran uji penghambatan aktivitas COX-2. Mula-mula dilakukan pengujian dengan menggunakan konsentrasi 10 µM dari masing-masing larutan inhibitor, dilanjutkan dengan konsentrasi lebih besar atau lebih kecil dari 10 µM, sampai didapat % inhibisi diatas 50 % untuk menghitung nilai IC50 dari masing-masing inhibitor tersebut.

4.1.2 Pelaksanaan EIA Pelaksanaan reaksi EIA dilakukan dengan penambahan larutan bahan yang telah disiapkan kedalam sumuran uji. Sumuran uji ini terdiri dari Blk (blanko), NSB (Non Specific Binding), Bo (Maximum Binding), TA (Total Activity), BC (Background), aktivitas inisial 100% (IA), sandar prostaglandin, dan sampel inhibitor. Format lempeng sumur uji sampel dapat dilihat pada Lampiran 4. Sumur Blk tidak ada penambahan reaksi apapun, Blk berfungsi sebagai kontrol dalam reaksi EIA. Sumur NSB dilakukan penambahan dapar reaksi dan tracer. Dalam sumur NSB tidak terdapat antigen (tidak ada reaksi) tetapi kemungkinan ada reaksi antara sumuran dengan pereaksi lain (reagen ellman) sehingga reaksi tersebut merupakan reaksi ikatan non spesifik. Ikatan ini mungkin



34

terjadi dalam jumlah yang sangat kecil sehingga serapan yang dihasilkan juga seharusnya lebih rendah. Sumur Bo dilakukan penambahan dapar EIA, PG tracer dan antiserum sehingga sumur Bo akan menghasilkan serapan yang maksimum karena tidak ada kompetisi antara prostaglandin bebas dengan PG tracer untuk berikatan dengan antiserum. Sumur TA menghasilkan serapan dari aktivitas enzimatik total dari ikatan asetilkolinesterase. Serapan yang diperoleh dari TA tidak diikutsertakan dalam perhitungan karena hanya merupakan analog untuk aktivitas spesifik tracer yang bersifat radioaktif. Sumur BC merupakan kontrol untuk mengkoreksi, dimana kondisi enzim inaktif juga tanpa penambahan tracer sehingga seharusnya tidak menghasilkan serapan (serapan nol). Tetapi dari hasil yang didapat masih ada serapan yang diperoleh dari sumur. Hal ini kemungkinan karena ada sedikit enzim yang masih aktif sehingga masih ada sedikit PG yang terbentuk. Sedangkan pada sumur IA terjadi reaksi enzimatik yang maksimum (aktivitas enzim 100%) dan tanpa penambahan inhibitor. PG bebas yang dihasilkan lebih banyak daripada PG tracer yang jumlahnya terbatas, sehingga PG bebas yang paling banyak berikatan dengan antiserum. Sedangkan

pada

sumur

standar

prostaglandin

ditambahkan

dari

konsentrasi prostaglandin yang terkecil sampai terbesar. Sumuran sampel inhibitor dilakukan penambahan larutan sampel inhibitor, tracer, dan antiserum. Setelah dilakukan penambahan-penambahan bahan pada reaksi EIA, dilakukan inkubasi selama 18 jam pada temperatur kamar diatas orbital shaker. Selama inkubasi, terjadi kompetisi antara prostaglandin (PG) dan suatu konjugat prostaglandinasetilkolinesterase (PG-AChE) yang merupakan PG tracer untuk berikatan dengan Prostaglandin antiserum. Kompleks antiserum kelinci-PG ini kemudian berikatan dengan antibodi anti-kelinci monoklonal mencit (mouse monoclonal anti-rabbit antibody) yang telah dimasukkan terlebih dahulu pada sumur uji (IgG). Setelah dilakukannya inkubasi 18 jam. kosongkan lempeng sumur uji dan kemudian dicuci dengan dapar cuci untuk menghilangkan semua reagen yang tidak berikatan dengan IgG, kemudian tambahkan reagen Ellman’s, yang berisi



35

asetiltiokolin (substrat untuk AChE) dan asam 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzoat), ditambahkan ke sumur uji. Asetilkolin akan dihidrolisis oleh asetilkolinesterase pada PG tracer yang berikatan pada sumur uji, menghasilkan tiokolin dan asam asetat. Tiokolin selanjutnya bereaksi dengan 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzoat) menjadi asam 5-tio-2-nitrobenzoat yang berwarna kuning terang. Intensitas warna (besarnya serapan) diukur dengan EIA plater reader. Besarnya serapan ini sebanding dengan jumlah PG tracer yang berikatan pada sumur uji, dan berbading terbalik dengan jumlah PG yang ada dalam sumur reaksi selama inkubasi. Sehingga semakin besar aktivitas inhibitor COX, semakin kecil PG yang diproduksi, maka semakin banyak PG tracer yang diikat pada sumur uji, dan semakin besar intensitas warnanya. Selanjutnya, baca lempeng pada panjang gelombang 405-415 nm. Lempeng dibaca bila serapan sumur Bo pada rentang 0,3-1,0 A.U (blanko pengurang). Bila serapan dari sumur-sumur melebihi 1,5 maka cuci lempeng, dan tambahkan reagen Elman yang segar dan biarkan mengembang lagi, dari hasil pengukuran berupa serapan baik untuk standar maupun untuk semua sampel inhibitor.

4.2

Analisis/perhitungan Data Serapan yang dihasilkan dari sumur B0 dan NSB ini digunakan untuk

menghitung B0 terkoreksi yang selanjutnya dihitung B/B0 yaitu perbandingan serapan yang diperoleh dari sumur standar atau sampel dengan serapan dari sumur B0. Dari B/B0 dapat dibuat kurva kalibrasi standar prostaglandin dengan konsentrasi 2000; 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,3; dan 15,6 pg/mL diperoleh persamaan regresi linier kurva standar yaitu y= -0,635 In(x)+2,9058 dimana y adalah Logit (B/B0) dan x adalah konsentrasi dari prostaglandin (pg/mL) dan r = 0,9961. Data kurva kalibrasi standar prostaglandin dapat dilihat pada Tabel 4.2. Kurva standar prostaglandin dapat dilihat pada Gambar 4.1. Hasil persen inhibisi uji aktivitas penghambatan enzim siklooksigenase-2 masing-masing dapat dilihat pada Tabel 4.4. Sebagai senyawa pembanding Asetosal dengan konsentrasi 50, 25, 10, dan 1µM didapat % inhibisi berturut-turut



36

55,51%, 50,56%, 43,47%, dan 3,19%. Data selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.5. Kurva hubungan ln konsentrasi standar Asetosal dengan %inhibisi dapat dilihat pada Gambar 4.2. Pada Selekoksib dengan konsentrasi 10, 1, 0,1, dan 0,01µM didapat % inhibisi berturut-turut 81,51%, 52,50%, 38,91% dan 15,99%. Data selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.6. Kurva hubungan In konsentrasi standar Selekoksib dengan % inhibisi dapat dilihat pada Gambar 4.3. Sedangkan pada

senyawa


benzensulfonamida dengan konsentrasi 20, 10, 5, dan 1µM didapat % inhibisi berturut-turut 54,58%, 45,35%, 26,41%, dan 14,55%. Data selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.7. Kurva hubungan ln konsentrasi standar senyawa 4-[(E)-2{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida dapat dilihat pada Gambar 4.4. Aktivitas penghambatan enzim siklooksigenase-2 dinyatakan dengan Inhibition Concentration 50% (IC50) yaitu konsentrasi sampel yang dapat menghambat kerja enzim siklooksigenase-2 sebesar 50%. Nilai IC50 dihitung berdasarkan persentase inhibisi terhadap prostaglandin dari masing-masing konsentrasi larutan sampel. Hasil pengujian yang dilakukan diperoleh IC50 untuk Asetosal yaitu 24,97 µM, Selekoksib 0,43 µM dan senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida sebesar 16,67 µM, dapat dilihat pada Gambar 4.6. Dari hasil ini dapat diketahui bahwa senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida berpotensi menghambat aktivitas COX-2 lebih besar dibandingkan Asetosal dan lebih kecil dibandingkan dengan Selekoksib. Nilai IC50 terhadap COX-2 yang diperoleh dapat dibandingkan dengan penelitian sebelumnya dari beberapa jurnal, sebagai berikut :



37

Tabel 4.1 Perbandingan nilai IC50 hasil pengujian dengan penelitian sebelumnya. Nilai IC50 Senyawa Uji Asetosal

Hasil Uji

Referensi

24,97 µM

Selekoksib

4-[(E)-2-{4-okso-3-(4metoksifenil)kuinazolin-2-il}vinil] benzensulfonamida

2,4 µM (Chintakunta. et.al, 2002) 15,5 µM (Wanda dan Brian, 2006) 0,4248 µM 0,04 µM (Chintakunta. et.al, 2002) 0,12 µM (Chowdhury,M.A.et.al. 2010) 1,7 µM (Ramana, R. et.al, 2005) 16,67 µM -

Dari tabel 4.1 menunjukkan hasil yang berbeda-beda. Dapat dibandingkan bahwa % inhibisi yang didapat masih jauh lebih kecil dibandingkan referensi. Hal ini menunjukkan kondisi pengujian yang berbeda akan diperoleh hasil yang berbeda pula. Selain itu kemungkinan karena kondisi enzim pada saat penyimpanan sudah tidak baik sehingga aktivitasnya juga berkurang. Dari hasil pengukuran EIA didapat koefisien variasi yang kurang baik yaitu lebih dari 15%. Hal ini kemungkinan dapat disebabkan karena adanya senyawa pengganggu pada saat melakukan reaksi sehingga mempengaruhi hasil pengukuran. Senyawa pengganggu disini adalah senyawa organik (timah (II) klorida) yang digunakan pada saat pelaksanaan reaksi EIA. Oleh karena itu, sebelum dilakukan pengenceran, perlu dilakukan pemisahan terhadap senyawa organik tersebut dengan cara sentrifugasi sampai dihasilkan supernatan yang jernih. Kesalahan terjadi mungkin pada saat pengambilan supernatan tanpa disengaja masih ada senyawa organik yang belum terpisah. Pada sampel BC (background) memberikan hasil koefisien variasi sebesar 50%, Sumur BC merupakan kontrol untuk mengkoreksi, dimana kondisi enzim inaktif juga tanpa penambahan tracer sehingga seharusnya tidak menghasilkan serapan (serapan nol). Tetapi dari hasil yang didapat masih ada serapan yang diperoleh dari sumur. Hal ini mungkin disebabkan karena pengerjaan yang kurang hati-hati sehingga masih terdapat senyawa pengganggu yang mempengaruhi reaksi EIA pada sumur tersebut. Universitas Indonesia


BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1

Kesimpulan Sampel

senyawa

4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-

il}vinil]benzensulfonamida memiliki potensi penghambatan terhadap aktivitas siklooksigenase-2 dengan nilai IC50 yang diperoleh sebesar 16,91 µM. Sedangkan pada senyawa pembanding Asetosal dan Selekoksib secara berturut-turut sebesar 24,97 µM dan 0,43 µM. Dapat disimpulkan bahwa senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil]benzensulfonamida

memiliki

potensi

penghambatan lebih rendah dibandingkan Selekoksib dan lebih tinggi dibandingkan dengan Asetosal.

5.2

Saran 1. Perlu dilakukan juga uji penghambatan aktivitas terhadap siklooksigenase1 sehingga dapat diketahui selektivitasnya antara siklooksigenase-1 dan siklooksigenase-2. 2. Perlu diperhatikan suhu pada saat penyimpanan dan pelaksaanan reaksi siklooksigenase-2. 3. Untuk peneliti selanjutnya sebaiknya dalam melakukan pelaksanaan reaksi menggunakan pipet mikro multichannel.

38



DAFTAR REFERENSI

Aziz, A. (1999). Pengembangan Metode ELISA Langsung Untuk Penentuan Residu Kloramfenikol . Depok: FMIPA UI. 8 – 14. Baratawijadjaja, K. G. (2000). Imunologi Dasar Edisi VIII. Jakarta: Balai Penerbit FKUI. Hal: 22-25. Campbell, W.B. (1991). Lipid-Derived Autacoids : Eicosanoids and PlateletActivating Factor. Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. Ed 8(1). New York : Pergamen Press. 600–602, 605–606. . Cayman Chemicals Inc, Ann Arbor, MI. (2010). Retrieved from Cayman's COX (ovine) Inhibitor Screening Assay Kit, Catalog No. 560101: www.caymanchem.com. Champe, Pamela C., Richard A. H., & Denise R. F. (2005). Lippincott’s Illustrated Reviews : Biochemistry. Baltimore : Lippincott Williams & Wilkins. 143–149. Chintakunta, et. al. (2002). 3-O-Substituted benzyl pyridazinone derivatives as COX inhibitors. E. J. of Med. Chem.. 37(4): 339-347. Chowdhury, M.A. (2009). Synthesis and biological evaluation of salicylic acid and N-acetyl-2-carboxybenzenesulfonamide regioisomers possessing a Ndifluoromethyl-1,2-dihydropyrid-2-one pharmacophore: Dual inhibitors of cyclooxygenases and 5-lipoxygenase with anti-inflammatory activity. Bioorg. & Med. Chem. Lett. 19, 6855-6861. Coruzzi,G., Verturi, N., Spaggiari S. (2007). Gastrointestinal Safety of Novel Nonsteroidal Antiinflamatory Drugs: Selective COX-2 inhibitor and beyond. Acta Biomedica. 78,96-110. Crofford, L.J. (2000). Clinical Experience with Specific COX-2 Inhibitor in Arththritis. Curr. Pham., 6(17): 1725-1736. Dannhardt, G. and S. Laufer. (2000). Structural Approach to Explain the Selectivity of COX-2 Inhibitors: Is There a Common Pharmacophore?. Curr. Med. Chemistry. 7, 1101-1112.

39



40

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1995). Farmakope Indonesia IV. Jakarta : Depkes, 31. Fernandez de Arriba et al., (1999). Efect of 4-trifluoromethyl derivatives of salicylate on nuclear factor kB-dependent transcription in human astrocytoma cells. Mol. Pharmacol., 55, 753 ± 761. Fitzgerald, G.A., Patrono, C. (2001). The Coxibs, Selective Inhibitors of Cyclooxygenase-2. N Eng J Med ; 345 (6): 433-442 Foye, W.O. (Ed). (1996). Prinsip-prinsip Kimia Medisinal. Terj. dari Principles of Medicinal Chemistry, oleh Raslim Rasyid dkk. Gajah Mada University Press, Yogyakarta: 1095-1147 Harder, A.T. & An, Y.H. (2003). The mechanisms of the inhibitory effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs on bone healing: a concise review. The Journal of Clinical Pharmacology, 43, 807-815. Hassanein,H., Khalifa, El-Samaloty, El-Rahim, Tha,& Ismail, (2008). Synthesis and Biological Evaluation of Novel Imidazolone Derivatives as Potential COX-2 Inhibitors. Arch Pharm Res ; 31(5), 562-568, Hayun, Yanuar, A., Hanafi, M., & Hudiyono, S. (2011). Virtual Screening of 2,3disubstitued-4(3H)-quinazolinones Prossessing Benzenesulfonamide Moiety for COX-2 Inhibitor. Bioinformasi, 7(5), 246-250. Hudiyono, S. dan Hayun. (2011). Sintesis 4-[(E)-2-{4-okso-3-fenil-kuinazolin-2il}vinil]benzensulfonamida dan Analognya. Depok : Laporan Akhir Hibah Riset Pasca Sarjana UI. 21-31. In S. C. Sweetman. (2009). Martindale, The Complete Drug Reference 36st (pp. 20, 34). London: The Pharmaceutical Press. Kartasasmita, R.E. (2002). Perkembangan Obat Antiradang Bukan Steroid. Fakultas Kedokteran UGM. 75 (27/4). Lim, L. (Performer). (2012). Seminar of BioTek's Solution to ELISA Detection. Depok. Lombardino,G. (1985). Nonsteroidal Anti-inflammatory Interscience ; John Wiley and sons: New York. 814-817

Drugs.

Wiley



41

Murray, R.K., D.K. Granner , V.W. Rodwell. (2006). Harper’s Illustrated Biochemistry27th Edition. New York: Mc Graw Hill. 53-55. Pfizer. [cited: July 20, 2007]. Celebrex® celecoxib capsuls. Available from http://pfizer.com/download/uspi_celebrex.pdf Radji, M. (2010). Imunologi & Virologi. Jakarta: PT.ISFI Penerbitan. 25-29 dan 83-85 Ramana, R.M.V, et.al.(2005). Design, synthesis, and biological evaluation of (E)and (Z)-styryl-2-acetoxyphenyl sulfides and sulfones as cyclooxygenase-2 inhibitors. Bio & Med Chem, 13: 1715–1723. Rittenburg, J.H. dan Smith C.J. (1990). Fundamentals of immunoassay. In Development and Application of Immunoassay for Food Analysis. Elsevier Applied Science. 1, 29-57. Sherwood, L. (1996). Human Physiology : From Cells to Systems (2nd ed.). (B. I. Santoso, Penyunt.) West: A Division of International Thomson Publishing Inc. 368-370 Syarif, Amir, et al. (2007). Farmakologi dan Terapi Edisi 5. Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia : Jakarta. 230 – 242. Wanda, A. C & Brian P. K. (1996). Selective Inhibition of Cyclooxygenase-1 and -2 Using Intact Insect Cell Assays. Biochemical Pharmacology., (52): 17771785. Zarghi A, Rao, P.N.P and E.E.Knauss. (2007). Design and Synthesis of New Rofecoxib analogs as Selective Cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitors : Replacement of the Methanesulfonyl Pharmacophore by an NAsetylsulfonamido Bioisostere. J. Pharm and Pharmaceut. Sci., 10(2) : 159



GAMBAR


42

Gambar 3.1 Alat Plate Reader Biotek ELx808 dan komputer yang dilengkap dengan program Gen 5

Gambar 3.2 Alat mikro pipet


43

Gambar 3.3 96 well plate

Gambar 3.4 Bahan-bahan reaksi inhibisi COX (ovine)


44

Gambar 3.5 Tabung-tabung pelaksanaan reaksi inhibisi COX


45

2,5 2,0 1,5 Logit(B/Bo)

1,0 0,5 0,0 -0,5

1

10

100

1000

10000

-1,0

-1,5 -2,0 -2,5

Konsentrasi (pg/mL) Gambar 4.1 Kurva kalibrasi standar prostaglandin

70 y = 13,74x + 5,7876 r = 0,9822

% Inhibisi

60 50 40 30 20 10 0 0

1

2 3 ln Konsentrasi

4

5

Gambar 4.2 Kurva hubungan ln konsentrasi standar asetosal dengan % inhibisi


46

% Inhibisi

90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00

-6,00

-4,00

y = 9,1267x + 57,735 r = 0,9911

-2,00 0,00 ln Konsentrasi

2,00

4,00

Gambar 4.3 Kurva hubungan ln konsentrasi standar selekoksib dengan % inhibisi

60 y = 13,595x + 11,748 r = 0,9638

%Inhibisi

50 40 30 20 10 0 0

1

2 In Konsentrasi

3

4

Gambar 4.4 Kurva hubungan ln konsentrasi senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4metoksifenil)-kuinazolin-2il}vinil] benzensulfonamida dengan % inhibisi


47

24,97 Konsentrasi (µM)

25 16,67

20 15 10 5

0,4287

0 Selekoksib

Asetosal

Sampel

Gambar 4.5 Perbandingan IC50 antara selekoksib, asetosal dan sampel senyawa 4[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2il}vinil] benzensulfonamida


TABEL


48

Tabel 4.2. Data Kurva kalibrasi standar prostaglandin

Konsentrasi (pg/ml) 2000,00

1000,00

500,00

250,00

125,00

62,50

31,25

15,63

Serapan

B/Bo

0,173

0,132

0,165

0,126

0,227

0,174

0,229

0,175

0,313

0,240

0,370

0,284

0,435

0,334

0,473

0,363

0,609

0,468

0,593

0,456

0,801

0,616

0,797

0,613

0,877

0,675

0,888

0,683

0,953

0,734

0,953

0,734

Persamaan regresi

y = -0,63ln(x) +2,9058


r = 0,9961

49

Tabel 4.3. Data serapan Blanko, NSB, Bo, IA 100% dan BC

Nama sampel Blanko

NSB

Serapan 0,116 0,110 0,116 0,114 1,430

Bo

1,375 1,429 0,409

IA

0,399 0,404 0,437 1,368

BC

1,356 1,373 1,351


50

Tabel 4.4 Data ringkasan hasil pengukuran Nama Sampel

Serapan

B/Bo

PG (pg/mL)

BC

1,368 1,356 1,373 1,351 0,409 0,399 0.404 0.437 0,556 0,517 0,540 0,533 0,535 0,500 0,537 0,515 0,501 0,486 0,498 0,489 0,399 0,419 0,412 0,404 0,711 0,701 0,708 0,704 0,523 0,524 0,520 0,527 0,496 0,466 0,483 0,479 0,419 0,453 0,410 0,453

0,967 0,957 0,970 0,953 0,227 0,219 0,223 0,248 0,340 0,310 0,328 0,322 0,324 0,297 0,326 0,309 0,298 0,286 0,295 0,289 0,219 0,235 0,229 0,223 0,460 0,452 0,457 0,454 0,315 0,316 0,312 0,318 0,294 0,271 0,284 0,281 0,228 0,261 0,228 0,261

50,6 72,8 39,8 83,6 1338151,6 1435340,4 1385594,6 1108997,1 550587,3 683319,6 600851,6 624588,4 617691,3 753430,8 610887,1 691132,9 749064,1 818077,8 762260,7 803650,9 1435340,4 1249623,6 1310732,4 1385594,6 250135,5 262687,4 253833,2 258853,4 660528,1 656821,5 671804,2 645854,5 771221,4 923223,1 832835,7 853045,1 1328926,8 1001038,1 1328926,8 1001038,1

IA

Asetosal 50 µM

25 µM

10 µM

1 µM

Selekoksib 10 µM

1 µM

0,1 µM

0,01 µM

SD

% KV

30,95

50,18

68722,80

4,96

93855,91

15,21

95982,34

14,00

48800,06

6,23

131321,59

9,78

8875,57

3,46

2620,99

0,40

107481,46

12,69

231852,35

19,90


51

lanjutan

Sampel 20 µM

10 µM

5 µM

1 µM

0,531 0,532 0,532 0,533 0,498 0,500 0,497 0,501 0,436 0,462 0,456 0,482 0,423 0,431 0,432 0,424

0,321 0,322 0,322 0,323 0,295 0,297 0,295 0,298 0,250 0,268 0,252 0,263 0,238 0,244 0,245 0,248

631580,2 628072,4 628072,4 624588,4 762260,7 753430,8 766724,5 749064,1 1094691,2 946303,8 1073684,8 982346,6 1216408,3 1153424,3 1145858,2 1208289,0

2480,41

0,39

6243,67

0,82

104925,76

10,28

44536,45

3,76


52

Tabel 4.5 Data uji aktivitas penghambatan oleh Asetosal

Konsentrasi

Serapan

Konsentrasi

% Inhibisi

Prostaglandin (pg/ml)

Sampel (µM) 50

0,537

616953,5

55,51

25

0,522

685561,0

50,56

10

0,494

783571,0

43,49

1

0,409

1342482,0

3,19

Persamaan garis

:

y = 13,7402ln(x) + 5,7876

Koefisien korelasi :

r = 0,9822

Nilai IC50

24,97

:

Tabel 4.6 Data uji aktivitas penghambatan oleh Selekoksib

Konsentrasi

Serapan

Konsentrasi

% Inhibisi

Prostaglandin (pg/ml)

Sampel (µM) 10

0,706

256411,4

81,51

1

0,524

658674,8

52,50

0,1

0,481

847222,2

38,91

0,01

0,434

1164982,5

15,99

Persamaan garis

:

y = 9,1267 ln(x) + 57,7350


r = 0,9911

Nilai IC50

0,43

:


53

Tabel 4.7 Data uji aktivitas penghambatan oleh 4-[(E)-2-{4-okso-3 (4metoksifenil)-kuinazolin-2il}vinil]benzensulfonamida

Konsentrasi Sampel (µM)

Serapan

Konsentrasi Prostaglandin (pg/ml)

% Inhibisi

20

0,532

629826,3

54,58

10

0,499

757829,6

45,35

5

0,459

1020497,5

26,41

1

0,428

1184916,3

14,55

Persamaan garis

:

y = 13,5956 ln(x) + 11,7476


r = 0,9638

Nilai IC50

16,67

:


LAMPIRAN


54

Lampiran 1. Skema isolasi Selekoksib Keluarkan isi 2 kapsul Celebrex @200 mg, lalu gerus dan masukkan ke dalam erlenmeyer Tambahkan metanol, lalu ultrasonik selama 5 menit, saring Filtrat Uapkan diatas penangas air, suhu 500C

Residu direkristalisasi

Larutkan dengan 5 - 10 ml asetonitril panas

Saring panas, lalu diuapkan / divakum

Filtrat dikeringkan dalam oven vakum suhu 85o C, 1 jam. Saring vakum

Dinginkan dalam lemari es Uji Kemurnian

Jarak Lebur

Spektrofotometri UV-Vis

KLT

Spektrofotometri IR


55

Lampiran 2. Hasil Uji Kemurnian Selekoksib

Dibandingkan dengan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Fabian Teixeira Primo dan Pedro E. Froehlich (2005). a. Jarak Lebur Pembanding 161,3 – 162,2o C

Hasil isolasi 154 – 155,5oC. 154 - 155 oC 154 – 155,5 oC 154 - 155 oC Faktor Koreksi alat +7o C

b. Spektrofotometri UV-Vis

Keterangan: Spektrum serapan pembanding selekoksib dalam pelarut metanol pada panjang gelombang 252 nm


56

Keterangan: Spektrum serapan sampel selekoksib dari kapsul celebrex dalam pelarut metanol pada panjang gelombang 252 nm

c. Kromatografi Lapis Tipis

Rf=0,69 Rf=0,45 Rf=0,32

(1)

(2)

Keterangan: Hasil kromatografi lapis tipis selekoksib pembanding (1) dan sampel selekoksib (2) (a) Sampel, (b) Standar Selekoksib, dan (c) Rofecoxib. Fase diam : silika gel Fase gerak : kloroform-etil asetat-eter (10:5:1)


57

d. Spektrofotometri Inframerah

Keterangan : Hasil uji kemurnian secara spektrofotometri infra merah terhadap standar selekoksib (a) 1150-11350 : S = O stretching (sulfonamide grup) (b) 1550-1600 : N-H streching (c) 3300-3500 : NH2 streching

90 %T 82.5

75

67.5

1560.46

1348.29

37.5

3340.82 3234.73

45

1498.74

3099.71

52.5

2922.25

60

1165.04

30

3900 3300 2700 Celicoxib dari kapsul Celebrex

1950

1800

1650

1500

1350

1200

1050

900

750

600

450 1/cm

Keterangan : Hasil uji kemurnian secara spektrofotometri infra merah terhadap selekoksib dari kapsul celebrex (a) 1166,04 : S = O stretching (sulfonamide grup) (b) 1560,46 : N-H streching (c) 3234,73-3340,82 : NH2 streching


58

Lampiran 3. Pembuatan larutan standar prostaglandin

1 mL Dapar EIA

800µL Dapar EIA

2000 pg/ml

500µL Dapar EIA

1000 pg/ml

500µL Dapar EIA

500 pg/ml

500µL Dapar EIA

250 pg/ml

500µL Dapar EIA

125 pg/ml

500µL Dapar EIA

62,5 pg/ml

10 ng/ml Standar induk

[Sumber : Cayman, 2010, telah dioleh kembali]


500µL Dapar EIA

31,3 pg/ml

500µL Dapar EIA

15,6 pg/ml

59

Lampiran 4. Format lempeng sumur uji sampel

Keterangan : Blk

= Blank

TA

= Total Activity

NSB

= Non-Specific Binding

Bo

= Maximum Binding

S1 – S8

= Standar 1 – 8

BC

= Background

‡

= Initial Activity 100%

H

= Inhibitor COX-2


60

Lampiran 5. Perhitungan penimbangan sampel a.

Asetosal BM : 180,2 Konsentrasi : 100 µM Perhitungan : V1 . N1 = V2 . N2 20 µL. x = 1000µL . 100µM x = 5000 µM . BM x = 5000 µM . 180,2 x = 5 mmol/L . 180,2 x = 901 mg/L = 0,901 mg/ml = 4,51 mg/5 ml

b.

Selekoksib BM : 381,4 Konsentrasi : 100 µM Perhitungan : V1 . N1 = V2 . N2 20 µL. x = 1000µL . 100µM x = 5000 µM . BM x = 5000 µM . 381,4 x = 5 mmol/L . 381,4 x = 1907 mg/L = 1,907 mg/ml = 9,53 mg/5ml

c.

Senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil] benzensulfonamida. BM = 433,480 Konsentrasi : 100 µM Perhitungan : V1 . N1 = V2 . N2 20 μL . x = 1000 μL . 100 μM x = 5000 μM x BM x = 5 mmol/L x 433,480 x = 2167,4 mg/L = 2,1674 mg/mL= 10,84 mg/5 mL


61

Lampiran 6. Cara pembuatan larutan inhibitor a.

Asetosal Larutan induk 100µM Timbang 4,51 mg Asetosal + DMSO ad 5 mL Pipet 50,0 µL +50,0 µL DMSO

Larutan 50 µM

Pipet 25,0 µL + 25,0 µL DMSO + 50,0 µL dapar reaksi

Larutan 25 µM

Pipet 10,0 µL + 40,0 µL DMSO + 50,0 µL dapar reaksi.

Larutan 10 µM Pipet 10,0 µL + 40,0 µL DMSO + 50,0 µL dapar reaksi.

Larutan 1 µM

b. Selekoksib Larutan induk 100µM Timbang 9,83 mg Selekoksib + DMSO ad 5 mL Pipet 10,0 µL +40,0 µL DMSO +50,0 dapar reaksi

Larutan 10 µM Pipet 10,0 µL +40,0 µL DMSO +50,0 dapar reaksi

Larutan 1 µM Pipet 10,0 µL +40,0 µL DMSO +50,0 dapar reaksi

Larutan 0,1 µM Pipet 10,0 µL +40,0 µL DMSO +50,0 dapar reaksi

Larutan 0,01 µM


62

c. Senyawa 4-[(E)-2-{4-okso-3-(4-metoksifenil)-kuinazolin-2-il}vinil] benzensulfonamida

Larutan induk 100 µM Timbang 10,84 mg Selekoksib+DMSO ad 5 ml


Larutan 20 µM


Larutan 10 µM


Larutan 5 µM


Larutan 1 µM


63

Lampiran 7. Cara pelaksanaan reaksi COX-2

Siapkan tabung reaksi diatas Penangas air suhu 37o C

Tabung BC + 970 µL dapar reaksi, 10 µL heme, 10 µL COX-2 inaktif

Tabung IA

Tabung Inhibitor

+ 950 µL dapar reaksi, 10 µL heme, 10 µl COX-2 aktif, 20 µL pelarut

+ 950 µL dapar reaksi, 10 µL heme, 10 µL COX-2 aktif, 20µL larutan inhibitor

Vortex, inkubasi 10 menit + 10 µL asam arakhidonat, vortex, inkubasi 2 menit. + 50 µL HCl 1 M Angkat tabung dari penangas air + 100 µL SnCl2, inkubasi 5 menit suhu kamar Sentrifugasi 4000 rpm (10 – 20 menit) Supernatan Pengenceran Reaksi COX-2


64

Lampiran 8. Cara pengenceran reaksi COX-2 Tabung BC

Tabung IA

Tabung Inhibitor

10 µL Supernatan + 990 µL dapar EIA (pengenceran 100 kali)

10 µL Supernatan + 990 µL dapar EIA (pengenceran 100 kali)

10 µL Supernatan + 990µL dapar EIA (pengenceran 100 kali)

Pipet 50 µL + 950 µL dapar EIA (pengenceran 2000 kali)

Pipet 50 µL + 950 µL dapar EIA (pengenceran 2000 kali)


65

Lampiran 9. Cara perhitungan jumlah prostaglandin

Perhitungan jumlah prostaglandin dilakukan mencari Logit B/Bo lalu dikonvesikan dengan menggunakan persamaan kurva kalibrasi prostaglandin.

Contoh: Senyawa uji (sampel) dengan konsentrasi 20µM mempunyai nilai B/Bo adalah 0,321 Logit B/Bo = ln = ln

= - 0,749

maka: y = -0,63 ln(x) + 2,9058 -0,749 = -0,63 ln(x) + 2,9058 -3,6548 = -0,63 ln(x) ln(x) = 5,8013 x = 330,7193 dikalikan dengan faktor pengenceran x = 330,7193 x 2000 x = 661438,51 pg/mL


66

Lampiran 10. Cara perhitungan simpangan deviasi dan koefisien variasi

Perhitungan uji keterulangan dilakukan dengan mencari simpangan deviasi (SD) dan koefisien variasi.

Rata-rata : X =

Simpangan deviasi: SD =

Koefisien variasi: KV =

X 100%

Keterangan: x

: prostaglandin (pg/mL)

x

: prostaglandin rata-rata (pg/mL)

n

: jumlah data


67

Lampiran 11. Suhu penyimpanan dan waktu stabilitas larutan

Penyimpanan Sebelum

Sesudah

PG Skrining EIA Antiserum

-200C

40C

Waktu Stabilitas Larutan 4 minggu

PG Skrining EIA tracer

-200C

40C

1 minggu

PG Skrining EIA Standar

-200C

40C

6 minggu

Dapar EIA

Suhu kamar

Suhu kamar

2 bulan

Dapar Cuci

Suhu kamar

Suhu kamar

2 bulan

-20 C

Suhu kamar

1 bulan

Suhu kamar

Suhu kamar

-

40C

40C

-

96 sumuran plate

Suhu kamar

Suhu kamar

-

Ellman’s reagen

-200C

Suhu kamar

-

COX-2

-800C

800C

6 minggu

Nama Bahan

Dapar Reaksi Tween 20 Ig G yang dilapisi pada plate

0

0

Heme

-20 C

Suhu kamar

12 jam

Asam Arakidonat (substrat)

-200C

Suhu kamar

1 jam

Asam Hidroksida (KOH)

-200C

Suhu kamar

-

Asam Klorida (HCl)

-200C

Suhu kamar

1 bulan

Timah(II)Klorida

-200C

Suhu kamar

8 jam


68

Lampiran 12. Daftar Singkatan

DAFTAR SINGKATAN

AINS

: Antiinflamasi Non Steroid

B

: Binding

B0

: Binding nol

BC

: Background

Blk

: Blanko

COX

: Cyclooxygenase

DMSO

: Dimethylsulfoxide

EIA

: Enzyme Immunoassay

HCl

: Hydro Chloride

IA 100%

: Initial Activity 100%

IC50

: Inhibition Concentration 50%

KOH

: Kalium Hidroksida

NSB

: Non Spesific Binding

PG

: Prostaglandin

PGS

: Prostaglandins

PGI2

: Prostacylin

SnCl2

: Stano Chloride

TA

: Total Activity

TXA2

: Tromboxan A2


69

Lampiran 13. Sertifikat Analisis Asetosal


70

Lampiran 14. Sertifikat Kit EIA


UNIVERSITAS INDONESIA

Recommend Documents