UNIVERSITAS INDONESIA

UNIVERSITAS INDONESIA

OPTIMASI PRODUKSI LIPASE DENGAN VARIASI KONSENTRASI SUBSTRAT DAN SUHU MELALUI FERMENTASI RENDAM RHODOTORULA MUCILAGINOSA (YUICC422) MENGGUNAKAN RESPON SURFACE METODOLOGY

SKRIPSI

ADITYA RINUS PRATAMA PUTRA 080 646 0414

TEKNOLOGI BIOPROSES DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA DEPOK JUNI 2012

Optimasi produksi..., Aditya Rinus Pratama Putra, FT UI, 2012


OPTIMASI PRODUKSI LIPASE DENGAN VARIASI KONSENTRASI SUBSTRAT DAN SUHU MELALUI FERMENTASI RENDAM RHODOTORULA MUCILAGINOSA (YUICC422) MENGGUNAKAN RESPON SURFACE METODOLOGY

SKRIPSI Diajaukan sebagai salah satu syarat untuk mendapkan gelar sarjana teknik

ADITYA RINUS PRATAMA PUTRA 080 646 0414

TEKNOLOGI BIOPROSES DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA







(Aditya Rinus Pratama Putra )

vii


ABSTRAK

Nama

: Aditya Rinus Pratama Putra

Program Studi : Teknologi Bioproses Judul

: Optimasi Produksi Lipase dengan Variasi Konsentrasi Substrat dan Suhu pada Fermentasi Rendam Rhodotorula mucilaginosa (YUICC422) menggunakan Response Surface Methodology

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kondisi optimum produksi lipase dengan variasi konsentrasi substrat sebagai induser dan suhu produksi enzim lipase oleh fementasi rendam Rhodotorula mucilaginosa (YUICC422) dengan Response Surface Methodology. Selain itu, penelitian ini juga ingin mengetahui potensi minyak jelantah yang banyak didapatkan di daerah laboratorium sebagai pengganti induser potensial. Sebagai pembanding minyak jelantah digunakan minyak dari palm oil dan minyak zaitun. Diagram penelitian ini terdiri dari 3 langkah besar, yaitu melakukan fermentasi untuk uji konsentrasi substrat dan suhu terbaik menggunakan metode One Factor at the Time (OFAT) sebagai acuan untuk pertimbangan desain RSM, kedua fermentasi model RSM, ketiga validasi model RSM. Hasil penelitian menunjukan bahwa nilai aktiftas enzim lipase dengan substrat minyak jelantah sebesar 0.051 U/ml. Sedangkan, nilai aktifitas enzim lipase dengan substrat minyak zaitun dan minyak goreng dari palm oil sebesar 0.054 U/ml dan 0.057 U/ml. Konsentrasi substrat terbaik adalah 1.67% dengan suhu produksi enzim 32.92 oC.

Kata kunci

:

Lipase, Rhodotorula mucilaginosa, Response Surface Methodology¸ konsentrasi substrat, Suhu.

viii


ABSTRACT

Name

: Aditya Putra Pratama Rinus

Study Program: Bioprocess Technology Title

: Optimization of Lipase Production by varying the Substrat Concentration and Temperature in submarged fermentation Rhodotorila mucilaginosa (YUICC422) using Response Surface Methodology

This research aims to obtain the optimum conditions for lipase productions by varying the temperature and

the concentrations of substrat by submerged

fermentations of Rhodotorula mucilaginosa (YUICC422) using Response Surface Methodology. In addition, this study also wanted to know the potential of “jelantah” oil ( reuse palm oil) that we can be found near laboratorium easyly. As a benchmark of jelantah oil is used palm oil and olive oil. Flow process of this study consists of three major steps. Firstly, testing the concentrations of substrat and the temperature to look for the optimum number for production lipase with One Factor at the Time methods (OFAT) as a consideration fo RSM design. Secondly, Fermentations of RSM models. Thirdly, validations RSM model. The result shows that the activity of lipase enzim with “jelantah” oil is 0.051 U/ml. Although, the activity of lipase enzim with zaitun and palm oil as substrat are 0.054 U/ml and 0.057 U/ml. The optimum condition of this study are substrat consentration 1.67%, Temperature 32.92oC.

Key words: Llipase, Rhodotorula mucilaginosa, Response Surface Methodology ¸ substrat concentration, temperature.

ix


DAFTAR ISI

COVER ............................................................................................................ i HALAMAN PENGESAHAN.......................................................................... ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS .............................................. iii KATA PENGANTAR ..................................................................................... iv HALAMAN PENYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ......................... vi ABSTRAK ....................................................................................................... vii ABSTRAC ....................................................................................................... Viii DAFTAR ISI .................................................................................................... ix BAB 1. PENDAHULUAN .............................................................................. 1 1.1 Latar Belakang .................................................................................. 1 1.2 Rumusan Masalah ............................................................................. 4 1.3 Tujuan ............................................................................................... 4 1.4 Batasan Masalah................................................................................ 4 1.5 Sistematika Penulisan ....................................................................... 5 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 6 2.1 Lipid .................................................................................................. 6 2.2 Enzim Lipase..................................................................................... 7 2.3 Yeast .................................................................................................. 9 2.4 Rhodotorula mucilaginosa ................................................................ 11 2.5 Fermentasi Lipase dari yeast ............................................................. 12 2.6 Pengaruh Konsenstrasi substrat dan suhu dalam pertumbuhan yeast 13 2.6.1 Pengaruh suhu .......................................................................... 13 2.6.2 Pengaruh Konsentrasi Substrat (Induser) dalam Fermentasi atau Produksi enzim .................................................................................. 15 2.7 Respons Surface Methodology .......................................................... 15 2.8 Central Composite Design ................................................................ 17 2.9 One Factor at The Time (OFAT) Design.......................................... 19 x


2.10 State of The Art ............................................................................... 20 BAB 3 METODE PENELITIAN..................................................................... 23 3.1 Diagram Alir Penelitian .................................................................... 23 3.2 Variable Penelitian ............................................................................ 27 3.3 Tempat dan Waktu Penelitian ........................................................... 27 3.4 Alat dan Bahan ................................................................................. 27 3.4.1 Alat ........................................................................................... 27 3.4.2 Bahan ....................................................................................... 29 3.5 Pelaksanaan Penelitian ...................................................................... 29 3.5.1 Pembuatan Media dan Produksi Enzim ................................... 29 3.5.1.1 Peremajaan Isolat ............................................................ 29 3.5.1.2 Pembuatan Isolat ............................................................. 30 3.5.1.3 Pembuatan Starter ........................................................... 30 3.5.1.4 Fermentasi untuk Produksi Lipase .................................. 30 3.5.1.5 Panen dan Penyiapan Ekstrak Kasar lipase..................... 31 3.5.2 Uji Pendahuluan dengan metode OFAT .................................. 31 3.5.2.1 Penentuan Konsentrasi Substrat (Induser) ...................... 31 3.5.2.2 Uji Pendahuluan Optimasi Suhu ..................................... 31 3.5.2.3 Uji Pendahuluan Konsentrasi Substrat (Induser) ............ 32 3.5.2.4 Optimasi dengan Response Surface Method (RSM) ....... 32 3.5.2.5 Melakukan Uji Optimasi Desain RSM ........................... 33 3.5.3 Pengujian Aktifitas Enzim Lipas dan Kadar Protein ............... 32 3.5.3.1 Metode Uji Lipase ........................................................... 32 3.5.3.2 Pengaruh Kadar Protein .................................................. 34 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................ 36 4.1 Penentuan Substat Terbaik ................................................................ 36 4.2 Penentuan Suhu Optimasi ................................................................. 38 4.3 Uji Penentuan Konsentrasi Substrat Optimum ................................. 42 4.4 Penentuan Desain Response Surface Methodology........................... 43 4.4.1 Uji Pemilihan Model Berdasarkan Sequential Model Sum of

xi


square ................................................................................................ 46 4.4.2 Uji Pemilihan Model Berdasarkan Lack of Fit ...................... 46 4.4.3 Uji Pemilihan Model Berdasarkan R Squared ......................... 47 4.4.4 Uji ANOVA ............................................................................. 48 4.5 Validasi Model .................................................................................. 51 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................... 53 5.1 Kesimpulan ....................................................................................... 53 5.2 Saran .................................................................................................. 53 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 54 LAMPIRAN ..................................................................................................... 61

xii


DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Reaksi hidrolisi trigliserida oleh lipase .......................................... 8 Gambar 2 Overview aplikasi yeast .................................................................. 9 Gambar 3 Rhodotorula mucilaginosa a) koloni tunggal b) perbesaran 100x . 12 Gambar 4 Pengaruh temperature pada laju pertumbuhan mikroba.................. 14 Gambar 5 Pengaruh produksi hydrogen kehadiran konsentrasi glukosa ......... 15 Gambar 6 Rancang CCD.................................................................................. 18 Gambar 7 Contoh permukaan RSM berbentuk 3 D ......................................... 19 Gambar 8 Contoh respok permukaan RSM berbentuk counter ....................... 19 Gambar 9 Diagram alir penelitian .................................................................... 23 Gambar 10 Pengaruh suhu pada aktifitas lipase substrat minyak goreng ........ 39 Gambar 11( a)Aktifitas lipase varisiasi suhu dengan variasi minyak ............. dan (b) aktifitas spesifik variasi suhu dan minyak ......................... 40 Gambar 12 Pengaruh suhu terhadap konsentrasi protein ................................. 41 Gambar 13 Pengaruh konsenstrasi substrat terhadap aktifitas lipase............... 42 Gambar 14 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kadar protein ................. 43 Gambar 15 Interaksi konsentrasi substrat dengan suhu untuk mendapatkan aktiftas maksimum pada produksi lipase bentuk counter ........... 50 Gambar 16. Interaksi konsentrasi substrat dengan suhu untuk mendapatkan aktiftas maksimum pada produksi lipase bentuk 3D .................................................... 51

xiii


DAFTAR TABEL Tabel 1 Aplikasi pasar lipase .......................................................................... 7 Tabel 2 yeast penghasil lipase ......................................................................... 10 Tabel 3 State of the Art .................................................................................... 22 Tabel 4 Penentuan desain Eksperimen CCD ................................................... 26 Tabel 5 Matriks eksperimen RSM ................................................................... 27 Tabel 6 Rancangan kurva kalibarasi aktifitas .................................................. 34 Tabel 7 Rancangan kurva standar BSA ........................................................... 35 Tabel 8 Perbandingan pada uji aktifitas dengan variasi substrat ..................... 37 Tabel 9 Rancangan batas bawah dan batas atas desain. .................................. 45 Tabel 10 Desain running fermentasi RSM dan hasilnya45 Tabel 11 Analisis Squential Model sum of Square .......................................... 46 Tabel 12 Lack of fit ......................................................................................... 47 Tabel 13 Model Summary Statistic .................................................................. 47 Tabel 14 ANNOVA Model produksi lipase..................................................... 48 Tabel 15 Nilai Kekarutan Desain ..................................................................... 49 Tabel 16 Optimasi yang dilakukan oleh RSM ................................................. 51 Tabel 17 Validasi Model RSM ........................................................................ 52

xiv


1

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Enzim merupakan poli makromolekul protein yang mampu mengkatalis suatu reaksi biologis dengan cara menurunkan energi aktifasi suatu reaksi. Enzim bekerja spesifik dalam mengkatalis suatu reaksi. Perkembangan teknologi enzim sangat pesat dalam kurun waktu dua abad terakhir. Pada tahun 1814, Kirchoff menemukan protein yang mampu membantu mengonversi starch menjadi gula. Pada tahun 1833, Payen dan Perzoz menemukan adanya senyawa dalam ekstrak gandum yang dapat menghidrolisis karbohidrat. Pada rentang tahun awal 1900-an hingga 1970-an mulai banyak teori-teori tentang kinetika enzim. Perkembangan yang sangat pesat ini membuktikan bahwa peran enzim sangat penting bagi kehidupan manusia. Hal ini juga dapat dilihat pada abad ke-20 ini, telah banyak industri yang memproduksi dan memanfaatkan enzim dari mikroorganisme yang disolasi. Salah satu enzim yang sering digunakan di dunia industri adalah enzim Lipase ( EC.3.1.1.3). Enzim ini berperan penting dalam

mengkatalis reaksi hidrolisis

minyak dan lemak untuk membentuk rantai panjang FFA dan gliserol. Enzim lipase pada umumnya memiliki sebuah titik tengan berupa ikatan ß Sheat dan gugus aktif yang terdiri dari serine, histidine dan grup karboksil (Gromada et all, 2005) . Oleh karena itu, lipase sering disebut juga serine hidrolase. Penggunaan enzim lipase telah berkembang pesat di Industri. Hal ini dikarenakan lipase tidak hanya mampu mengkatalis reaksi hidrolisis rantai ester melalui reaksi esterifikasi, melainkan juga dapat mengkatalis sintesis ikatan ester pada reaksi transesterifikasi di media non aqeous (Hamond,1987).

Penggunaan

lipase sebagai biokatalis sejak 1980 telah dilakukan (Srivinas et all, 2002). Lipase juga telah diteliti di industri pengolahan limbah (Jeager et all, 1999). Lipase juga digunakan pada industri detergent ( Vakhlu, 2006). Berdasarkan kekhasanya region dan stereospesifiknya, lipase dapat diaplikasikan pada reaksi sintesis obat-obatan pada industri farmasi, membantu memodifikasi lemak dan minyak serta perubahan 1 UNIVERSITAS INDONESIA


2

rasa makanan dari senyawa ester pada industri makanan. (Akoh,2006; Franken, 2009). Lipase dihasilkan hampir disuluruh tubuh makhluk hidup. Lipase dari hewan didapatkan dari pankreas. Lipase dari tanaman biasa didapatkan dari pepaya, biji gandum ataupun biji castor. Lipase yang berasal dari hewan memiliki kelemahan, tidak dapat mengkatalis senyawa yang berasal dari tanaman. Hal ini dikarenakan ekstrak lipase dari hewan, pada umumnya mengandung tripsin yang beraksi dengan protein. Di industri, lipase lebih banyak digunakan berasal dari mikrooganisme. Diantara banyak golongan mikroorganisme yang mampu menghasilkan lipase, yang paling baik menghasilkan lipase adalah mikroorganisme dari golongan yeast. Hal ini dikarenakan murah substratnya dan menghasilkan yield yang besar, serta mudah ditingkatkan hasil produksinya melalui berbagai macam rekayasa (Retra,2009). Produksi enzim lipase dari mikroorganisme terutama yeast telah banyak diteliti. Yeast yang paling terkenal untuk memproduksi lipase adalah dari keluarga Saccharomycetaceae ( Paskevicius, 2001). Selain itu, masih banyak lagi yeast yang dapat menghasilkan lipase antara lain,

Rhodotorula rubra atau nama lainnya

Rhodotorula Mucilaginosa, Rhodotorula minuta, candida lipolytica, candida prapsilosi,

candida

valida,

Debarymyces

vanriji,

geotrichum

fermentans

(Paskevicius, 2001), Candidia Rugosa ( Bales et all, 1998 ; Jyoti, 2006), Candida silvicola NRRL YB -2846 ( Hou, 1997), Penicillium chrysogenum ( Ferrer, 2000), Basidiomycete Bjerkandera adusta R59 ( Bancerz,2007). Seiring perkembangan penelitian enzim lipase, penelitian tentang optimasi enzim lipase juga telah banyak diteliti dengan berbagai metode. Metode yang paling sering dilakukan untuk penelitian optimasi enzim, pada umumnya menggunakan metode One Factor at the time (OFAT). Metode ini mengasumsikan semua parameter penting yang mempengaruhi produksi enzim dibuat tetap pada satu nilai, ketika salah satu parameter divariasikan. Selain itu, salah satu metode lain untuk optimasi produksi enzim lipase yang juga pernah dilakukan adalah metode Respons Surface Methodology (RSM). Salah satu ciri khas metode RSM, yaitu mampu melihat interaksi antar parameter, sehingga RSM dapat menvariasikan semua parameter



3

bersamaan.

Kemampuan RSM dalam

mengoptimasi berbagai macam

variable

secara bersamaan dan meninjau interaksi antar variable yang divariasikan, membuat optimasi menggunakan RSM menjadi lebih baik, lebih cepat dan lebih komperhensif dibandingkan

menggunakan

menggunakan

RSM

ini

OFAT.

pernah

Penelitian

dialakukan

optimasi

produksi

menggunakan

berbagai

lipase jenis

mikroorganisme antara lain, Bacillus sp (Hameed, 2001), Rhizopus homothallicus (Rogriguez et all,2006), Geoacillus sp (Ebrahimpour, 2008), Colletotrichum gleosporiodes (balaji,2008), Arthrobacter sp (Sharma, 2009), Staphylococcus (Pogaku, 2010), Aspergilus Carneus (Kushik, 2010), Gunederma Lucidium ( Amin, 2011). Salah satu spesies yeast yang potensial menghasilkan enzim lipase adalah yeast

dari kultur koleksi Universitas Indonesia (YUICC) nomer 422. Yeast ini

merupakan spesies Rhodotorula mucilaginosa (Retra, 2009). Untuk menghasilkan lipase dari spesies ini menggunakan fermentasi rendam (Potumarthi et al. ,2008) . Ciri khas dari fermentasi ini adalah mikroba berada di bawah air dan dapat bergerak bebas di medium pertumbuhan. Retra pada tahun 2009 telah telah mengoptimasi faktor-faktor produksi lipase dan membuktikan waktu inkubasi produksi, suhu dan pH optimumnya adalah 72 jam, 300C dan 6 serta indusernya terbaiknya adalah 2% tributirin dan sumber nitrogenya 1% ammonium sulfat. Retra juga telah mengkarakterisasi pH, suhu, termostabil ,dan waktu inkubasi optimum,serta pengaruh ion logam, untuk mendapatkan enzim lipase dengan aktiftias terbaik yang dihasilkan Rhodotorula mucilaginosa. Retra juga telah memurnikan lipase dari yeast ini serta menerapkanya pada sintesis metal ester. Penelitian ini pada dasarnya melanjutkan penelitan Retra. Pada 2009, Retra telah melakukan optimasi menggunakan cara One factor at the time (OFAT), dimana semua faktor dibuat tetap ketika satu faktor divariasikan. Sementara penulis lakukan adalah optimasi tentang kondisi interaksi terbaik dari parameter suhu dan konsenstrasi induser untuk menghasilkan aktifitas lipase yang paling tinggi dengan metode Respon Surface Methodology. Kelebihan metode ini dibandingkan metode lain, karena metode ini mempertimbangkan interaksi dari berbagai variabel penting



4

yang mempengaruhi proses. Respon surface methodology sendiri memiliki dua rancangan desain yaitu Central composite design dan box bhenken design yang dapat digunakan bergantung kondisi data. Retra telah mengoptimasi suhu produksi dengan metode OFAT dan belum mengoptimasi konsentrasi optimum dari induser. Pada penelitian ini, penulis melakukan dua hal,

yaitu mengoptimasi produksi lipase

dengan variasi konsentrasi substrat atau induser dan suhu dengan desain central composite dan mengindentifikasi potensi minyak jelantah yang merupakan limbah sebagai induser pengganti berdasarkan aktifitas enzim dan kadar proteinnya.

1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang diatas, rumusan masalah dari penelitian ini adalah 1. Bagaimana potensi minyak jelantah dibandingkan minyak kelapa sawit, minyak zaitun sebagai induser produksi lipase? 2. Bagaimana interaksi antara konsentrasi induser atau substrat dengan suhu untuk mendapatkan aktifitas lipase tertinggi, pada produksi lipase, dengan fermentasi rendam Rhodotorula mucilaginosa?

1.3 Tujuan Berdasarkan rumusan masalah diatas, tujuan dari penelitian ini adalah 1. Menentukan nilai aktifitas dan kadar protein dari

interaksi konsentrasi

induser dan suhu terbaik agar produksi lipase dari fermentasi rendam Rhodotorula

mucilaginosa

optimum,

menggunakan

Respon

Surface

Methodology (RSM). 2. Menentukan potensi minyak jelantah sebagai induser dibandingkan minyak kelapa sawit dan zaitun, berdasarkan aktifitas enzim lipase yang diproduksi oleh Rhodotorula mucilaginosa dengan substrat atau induser dari minyak jelantah, minyak zaitun dan minyak kelapa sawit.



5

1.4 Batasan Masalah Pada pemilihan induser terbaik, penelitian ini hanya menggunakan kandidiat induser, minyak jelantah, minyak kelapa sawit, dan minyak zaitun. Rhodotorula mucilaginosa didapatkan dari koleksi culture BPPT serpong yang merupakan yeast UI culture collections yang diisolasi dari limbah yang mengandung minyak. Produksi enzim lipase ini dilakukan pada skala laboratorium dengan volum produksi 50 mL. Penelitian dilakukan di Puspiptek Serpong, Provinsi Banten.

1.5.

Sistematika Penulisan

Sistematika penulisan yang digunakan adalah sebagai berikut: Bab I Pendahuluan Pada bab pendahuluan ini terdiri atas latar belakang, rumusan masalah, tujuan penelitian, batasan masalah, dan sistematika penulisan. Bab II Tinjauan Pustaka Tinjauan pustaka berisikan

ulasan

mengenai

Lipid,

Lipase, Yeast,

Rhodotorula mucilaginosa ( YUICC422) , Response Surface Methodology. Bab III Metode Penelitian Pada bab ini berisi tentang diagram alir penelitian, alat dan bahan yang digunakan, prosedur penelitian, lokasi penelitian. Bab IV Hasil dan Pembahasan Pada bab ini berisi penjelasan hasil eksperimen dan analisis hasil eksperimen Bab V Kesimpulan dan Saran Berisi Kesimpulan akhir penelitian dan saran untuk penelitian lanjutan yang dilakukan terkait hasil penelitian sekarang



BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Lipid Lipid merupakan senyawa non polar atau hidrofobik, sehingga tidak larut dalam pelarut polar. Lipid merupakan salah satu sumber energi di dalam tubuh makhluk hidup, dan juga berperan penting dalam pembentukan sel. Lipid pada umumnya di dominasi oleh dua jenis gugus yaitu, gugus ketoasil dan gugus isoprena (Brown, et all, 2005). Lipid yang diturunkan dari kondensasi subsatuan ketoasil dibagi menjadi enam kelompok antara lain, fatty acid, gliserollipid, gliserofosfolipid, sfingolipid, sakarolipid, dan poliketida. Sedangkan

lipid yang diturunkan dari

kondensasi subsatuan isoprena dibagi menjadi dua kelompok kelompok sterol, dan kelompok lipid prenol . Perkembangan industri lipid di eropa dimulai sekitar dua abad lalu. Penggunaan lipid di industri sabun dimulai sejak penemuan proses pembuatan soda oleh French N blank pada thuan 1791. Kemudian pada tahun 1902, Normann menemukan lipid jenis asam stearat ( fat hardening) oleh prosess augmentasi katalik hydrogen dengan katalis nikel (Birgit,2006). Sejak saat itu industri lipid di Eropa mulai memasuki babak baru. Pada tahun 1991, produksi asam lemak mencapai 2,5 juta ton di Eropa, dimana 40% berasal dari bahan alam. Seiring semakin besarnya penggunaan lipid dari alam, maka penggunaan enzim lipase sebagai enzim yang mampu mengkatalis reaksi-reaksi lipid pun berkembang pesat. Pada tahun 1996, penggunan lipase dari candida rugosa mulai ramai diperbincangkan. Hal ini dikarenakan lipase yang dihasilkan candida rugosa pada umumnya menghasilkan aktifitas enzim lipase yang cukup tinggi dibandingkan dengan mikroba lainya. (Redondo et al.1 995). Pada perkembanganya asam lemak dari tanaman, biasa digunakan untuk pembuatan sabun, pelumas, senywa ester, ethoxylat, surfaktan, kosmetik, resin alkel, polyamine, plastic, kertas, ataupun dunia farmasi. (Ahmed and Morris 1994). Berikut beberapa potensi perkembangan produk turunan lipid.

6 UNIVERISTAS INDONESIA


7

Tabel 1. Aplikasi Pasar lipase (sumber : Handbook of Enzyme)

Jenis

Konsumsi Total

Konsumsi

Potensi Pasar

Potensi Pasar

pasar

(1998) (k ton)

pasar dari

dari Bahan

2010 (%)

bahan alam

Alam

Polymer

33000

25

500

1.5

lubricant

42400

100

200

5

Solvent

4000

60

235

12.5

surfactan

2260

1180

1450

52

2.2 Enzim Lipase Enzim merupkan suatu poliprotein kompleks berukuran sekitar 1000-2000000 gram/mole, yang mampu mengkatalis suatu reaksi biologis secara spesifik dengan cara menurunkan energi aktifasinya. Enzim memiliki sisi aktif yang hanya dapat menerima substrat tertentu secara spesifik. Setiap enzim mengkatalisis satu reaksi kimia pada substrat kimia tertentu dengan enantioselektivitas sangat tinggi dan enantiospecicity dengan harga yang mendekati kesempurnaan katalitik (Bugg, 2004). Dengan demikian, enzim berfungsi efektif menurunkan energi aktifitas dari suatu biosintesis. Berdasarkan jenis reaksinya, enzim dibagi menjadi enam golongan yaitu, enzim oxidoreduktase (EC1), enzim transfarase (EC2), enzim hidrolase (EC3), enzim liase (EC4),isomerase ( EC5), enzim ligase( EC6). Lipase sendiri merupakan salah satu enzim dari golongan enzim hidrolisis (E.C.3.1.1.3). Sesuai dengan penamaanya, lipase merupakan enzim yang mampu menghidrolisis lipid menjadi asam lemak dan gliserol dengan adanya air. Lipase juga dapat didefinisikan sebagai enzim karboksil esterase yang mengkatalis reaksi hdirolisis dari rantai panjang asil gliserol menjadi gliserol, asam lemak, mono dan digleserida. Selain mampu mengkatalis reaksi hidrolisis, lipase juga dapat mengkatalis reaksi esterifikasi dan transesterifikasi (Palmeros B.,1994). Dilaporkan juga lipase dapat mengkatalis reaksi inter-esterfikasi, alkoholisis, acidolisis, aminolisis. Lipase merupakan enzim yang larut dalam air dan dapat berkerja dalam emulsi minyak dan air. Berikut reaksi hidirolisis trigliserida

UNIVERISTAS INDONESIA


8

trigleserida

monogliserida

Digliserida Gambar 1. Reaksi hidrolisis trigliserida oleh lipase ( Berg et al, 2006)

Seperti halnya enzim pada umumnya, lipase memiliki sisi aktif spesifik pada

stuktur tersiernya, dimana sisi polar berinteraksi dengan larutan dan sisi non polar yang masuk ke dalam. Secara reaksi biokimia, lipase ini diklasifikasikan menjadi enzim serine hydrolase karena gugus serine menjadi bagian penting dari sisi aktif enzim (Antonian, 1988). Berbeda dengan enzim pada umumnya, reaksi lipase lebih kompleks karena substratnya (lipid) tidak larut di dalam air. Oleh karena itu perlu dilakukan beberapa teknik untuk menciptakan permukaan interaksi antara lipase dengan reaksi yang dikatalisnya. Salah satu hal yang biasa dilakukan dengan adsorpsi enzim ke suatu permukaan tertentu. Lipase dapat ditemukan secara luas di dalam seluruh organisme hidup baik secara intraseluler maupun ekstraseluler (Ibrahim, et all 1987). Lipase dapat ditemukan

di

beberapa

mikroba

antara

lain,

Aspergiluss

niger,

bacillus

thermoleovorans, candida cylindracea, candida rugosa, chromobacterium viscosum, geotrichum candidum, fusarium heterosporum, fusarium oxysporum, humicola lanuginose, mucor miehei, oospora lactis, penicillium cyclopium, penicillium roqeuforti,

pseudomonas

aeroginosa,

pseudomonas

cepacia,

pseudomonas

fluorescens, pseodomona putida, rhizopus putida, rhizopus arrhizus, rhizopus boreas, rhizopus thermosus, rhizopus usamii, rhisopus stolonifer, rhizopus fusiformis,

rhizopus circinans, rhizopus delemar, rhizopus chinensis, rhizopus japanicus NR 400. Selain itu, Lipase juga dapat dihasilkan oleh hewan, biasanya berasal dari lipase

pankreas. Lipase dari tanaman biasa didapatkan dari papaya biji gandum ataupun biji



9

castor. Kelemahan lipase dari hewan adalah lipasenya tidak dapat digunakan untuk memproses senyawa dari tanaman, karena ekstrak lipase dari hewan mengandung tripsin yang beraksi dengan protein. Lipase dari yeast dan mikroba serta dari hewan ini sangat luas digunakan untuk industri, berbeda dengan penggunaan lipase yang dari tanaman yang sangat sedikit dieksplorasi.

2.3 Yeast Yeast telah digunakan sejak ribuan tahun yang lalu. Pada tahun 400-1000 SM ditemukan proses fementasi bear (Demanin and Solomon 1981). Pada tahun 3000 SM di mesoptamia juga ditemukan beer dari yeast ( Corran 1975). Saat ini, sekitar 100 golongan yeast dan lebih dari 700 spesies yeast telah diteliti (Kurtzman and Fell 1998). Yeast merupakan mikroorganisme uniseluler yang secara khas bereproduksi secara vegetatif dengan cara fisi dan budding, ataupun kombinasis dari keduanya. Yeast digolongkan ke dalam grup fungsi. Dalam dua puluh tahun terakhir eksploitasi yeast untuk industri berkembang sangat pesat (Van djiken, 2001). Ilmu terbaru tentang yeast membahas tentang psikologi yeast (Walker, 2008). Ilmu ini membahas kemampuan yeast di dalam dunia aplikasi untuk dapat beradaptasi dengan lingkungan seperti tingkah laku yeast selama masa pertumbuhan dalam skala industri di dalam fermentor. Yeast lebih mudah diamati dibandingkan dengan mikroorganisme lainya. Yeast memiliki ukuran yang lebih besar dan morfologi yang berbeda dibandingkan bakteri. Yeast juga memiliki dinding yang lebih kuat dibandingkan dengan protozoa. Yeast tidak melakukan photosintesis seperti halnya mikroalga. Yeast memiliki kemampuan memecah bahan kimia jauh lebih baik dibandingkan dengan kapang. Yeast berbentuk sperikal hingga mendekati ovoid. Yeast lebih tahan dibandingkan bakteri dalam larutan gula ataupun larutan garam yang lebih pekat. Yeast juga lebih menyukai adanya asam dan oksigen dibandingkan dengan bakteri. Yeast resisten dengan penambahan antibiotik dan antibakteri. Yeast dapat menghambat pertumbuhan bakteri dan kapang.



10

Hampir 50% lebih mikroba penghasil lipase berasal dari yeast (Afnet Kouur, 2006). Sebagian besar lipase dari yeast merupakan ekstrasellular, monomerik glikoproteins dengan Mr sekitar 33-64 kD. Yeast yang paling sering digunakan untuk memproduksi lipase secara komersial adalah yeast candida rugosa(Jyoti, 2006). Hal ini dikarenakan candida rugosa memiliki tingkat aktifitas yang tinggi baik untuk reaksi hidrolisis atuapun sintesis. Berikut beberapa yeast penghasil lipase. Tabel 2 Yeast penghasil lipase, (sumber : Jyoti 2006)

Sumber

Lokasi Cellular

Reference

Arxulaadeninivorans

Ekstraseluler

Boer et all 2005

Candida Antarctica

Ekstraseluler

heeg et al 1995 oignede et all 2001

Candida

parapasilosis

cell bound

neugnot et al 2002

CBS 604 Candida rugosa

Ekstraseluler

broca et al 1995 pandev 2001 gibbbs 1989

Candida deformanns

Ekstraseluler

bigey et al 2003

Geotrichum asteroid

Ekstraseluler

kazanina et al 1981

Kurttzmanonyces sp

Ekstraseluler

kakugawa et al 2002

Saccharomyses cerevicaie

Ekstraseluler

oishi et al 199

Yerrowia lipolytoca

cell bond

ota et al 1982 destain et al 1997

Trichosporona steroide

Ekstraseluler

dhashiti, amaranond



11

Saat ini yeast telah sangat berkembang dengan pesat. Berikut aplikasi penggunaan yeast,

Gambar 2. Overview aplikasei yeast Sumber : (walker, 1998)

2.4 Rhodoturula mucilaginosa Rhodoturula merupakan yeast berpigmen. Yeast ini biasanya berwarna orange hingga kemerah-merahan di dalam koloni. Media pertumbuhan biasanya agar dextrosa. Pigmen ini membantu sel lebih tahan rusak oleh panjang gelombang tertentu, karena dibelokkan oleh panjang gelombang warna tersebut. Rhodoturula sangat mudah ditemukan di lingkungan sekitar, seperti tanah, air dan udara. Karena

yeast ini mampu hidup di lingkungan sekitar, maka termasuk dalam golongan misofil, yaitu mikroorganisme yang dapat tumbuh di suhu sekitar 27 0C -37 0C. Salah satu spesies dari genus Rhodoturula ini adalah Rhodotorula

mucilaginosa. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Retra pada tahun 2009,



12

fermentasi Rhodotorula mucilaginosa didalam media agar dextrosa, mampu menghasilkan enzim lipase, dengan waktu produksi lipase optimum optimum 72 jam, dengan aktifitas 3.44 U/ml, dengan pH produksi optimum produksi 6, dan suhu produksi

optimum sekitar 30 0C. Pada tepung jagung setelah 72 jam inkubasi pa`da 25 ° C, ukuran yeast ini sektitar 2,5-10 m (Kurtzman,2000) Retra pada tahun 2009 juga mengkarakteristikan enzim lipase tersebut,dan membuktikan bahwa Rhodotorula mucilaginosa tidak tahan terhadap kondisi yang terlalu asam dan basa. Hal ini terlihat dari aktifitasnya meningkat pada penambahan buffer phospat dengan pH 8. Retra juga membuktikan aktifitas enzim lipase dari R.

mucilaginosa meningkat dengan penambahan logam MgCl2, CaCl2, Cu, KCl, dan MnCl2, dan terhambat aktifitasnya dengan penambahan logam BaCl2 dan ZnCl2. Kingdom

:Fungi

Phylum

:Basidiomycota

Class

:Urediniomycetes

Order

:Sporidiales

Family

:Sporidiobolaceae

Genus

:Rhodotorula

Spesies

:R. Mucilagalosa

Gambar 3 Rhodotorula mucilaginosa perbesaran 100x

(sumber : Penulis)



13

2.5 Fermentasi Lipase dari Yeast Produksi lipase dengan yeast dilakukan dengan cara fermentasi. Fermentasi sendiri berasal dari kata yunani yaitu fervere yang berarti mendidih. Fermentasi merupakan proses menghasilkan energi dari berabagai senyawa organik oleh mikroorganisme dengan bantuan enzim. Dalam ferementasi lipase dari yeast sangat bergantung pada siklus pertumbuhan dan keadaan optimum aktifitas yeast itu sendiri. Agar fermentasi dalam keadaan optimum perlu dilakuakn pengontrolan kondisi suhu, pH dan lama dari fermentasi. Pada umumnya fermentasi yeast membutuhkan waktu sekitar 2-5 hari, pH sekitar 4-8 dan dengan rentang suhu bergantung jenis spesies yeast-nya. Ferementasi Rhodototula mucilaginosa membutuhkan waktu optimum fermentasi 72 jam atau 3 hari, pada suhu 30 0C dan ph 6 (Retra, 2009). Pada Bacillus sp kondisi optimum fermentasi untuk menghasilkan lipase dengan fermentasi selama 64 jam, pH 6 dan suhu 300C (Ertugrul, et all 2007). Pennicillium cgrysogenum 9 dari tanah di kawasan artik tundra membutuhkan waktu fermetasi optimum 5 hari pada suhu 20 0C dan pH 6 (Bacerz et all, 2005). Yeast jenis Arxulaa deninivorans, memiliki pH optimum7.5 dan suhu optimum 300C (Booer et all, 2005 ). Genus Rhodotorula dengan spesies R.Glutinis memiliki suhu optimum 350C, pH 7.5 dan waktu fermentasi 5 hari (Papapareskevas, 1992). Dalam ferementasi yeast, selain kondisi optimum seperti dijelaskan diatas juga perlu mempertimbangkan komposisi medium pertumbuhan yeast itu sendiri. Medium pertumbuhan biasanya mengandung unsur, karbon, nitrogen, dan berbagai nutrisi untuk yeast tumbuh dengan baik. Nitrogen dapat didapatkan dari urea, ekstrak yeast, tryptone, peptone, corn steep liquor, kasein, ammonium sulfat, ammonium phospat, ammonium nitrat ataupun ammonium khlorida (Papapareskevas, 1992). Karbohidrat merupakan salah satu sumber karbon terbaik dalam produksi lipase (Hahas, 1988). Namun, sumber karbon ini bisa juga digunakan dari kelompok minyak, seperti minyak zaitun, sawit, kedelai, kelapa (Sharma et all, 2001).



14

2.6 Pengaruh Konsentrasi Substrat dan Suhu dalam Pertumbuhan Yeast. 2.6.1 Pengaruh Suhu Pertumbuhan mikroba sangat bergantung dengan suhu. Hal ini berkaitan dengan kamampuan mikroorganisme untuk bertahan dan beraktifitas maksimum pada

kondisi tertentu. Untuk mikroorganisme yang dapat hidup dalam rentang 150C -250C dikelompokkan pada kelompok psycohiles. Mikroorganisme dari kelompok

mesophiles dapat tumbuh optimum pada suhu 20oC-450C. Kelompok mesophiles inilah yang paling memiliki banyak anggot anggota, a, karena pada umumnya mikrooganisme hidup pada suhu ini. Namun, ada juga mikroorganisme kelompok thermophiles yang dapat tumbuh hingga suhu 450C-800C dan optimum pada suhu 500C -650C. Selain kedua kelompok tersebut, ternyata mikroba ada juga yang dapat hidup dalam kondisikondisi ekstrim contohnya kelompok ekstrim thermophiles memilili tolerasnsi suhu

gingga 1000C dan kelompok obligate psycophiles yang mampu hidup pada rentang suhu 00C-150C.

Berikut gambar profil pertumbuhan mikroba dengan perubahan

suhu.

Gambar 4. Pengaruh temperatur pada laju pertumbuhan mikroba. (Sumber : http://www.microbiologylabs.info/wp-content/uploads/2011/10/Enzyme-activity-and-

Temarature-grapg.jpg)

Pertumbuhan mikroba pada suhu rendah, dikarenakan enzim tidak bekerja

secara optimum. Lipid pada kondisi ini, cenderung mengeras dengan demikian



15

kehilangan fluiditas membrane. Laju pertumbuhan mikroba akan terus meningkat hingga suhu optimum dicapai. Bioreaksi akan semakin cepat dengan meningkatnya suhu. Namun, setelah melewati suhu optimum pertumbuhan bakteri semakin menurun, dikarenakan enzim dan protein di dalam tubuh mikroba mulai mengalami denaturasi dan mengakibatkan laju bioreaksi semakin lambat.

2.6.2 Pengaruh Konsenstrasi Substrat (Induser) dalam fermentasi atau Produksi Enzim Konsentrasi substrat atau inducer mempengaruhi proses fermentasi. Karena konsentrasi substrat dapat mempengaruhi terlepasnya membran plasma dari dinding sel ke lingkungannya serta sifat substrat yang inhibitor terhadap sel yang menyebabkan nilai fermentasi turun (Goksungur & Zorlu, 2001)

Gambar 5 Pengaruh produksi hydrogen dengan kehadiran konsentrasi glukosa Sumber : Fabiano, 2001

Nilai fermentasi awalnya meningkat dengan penambahan susbtrat. Ketika konsentrasi sudah mencapai konsentrasi optimum, dimana medium jenuh dengan substrat, produk yang dihasilkan cenderung menurun.

2.7 Respon Surface Methodology Desain eksperimen merupakan suatu proses memprediksi atau merancang yang dilakukan sebelum peneilitian, dengan cara memanipulasi variabel bebas untuk



16

mendapatkan data yang akurat dan objektif tentang hubungan sebab akibat antar variabel bebas tersebut. Optimasi sendiri didefinisikan sebagai suatu pendekatan terukur, untuk mengidentifikasi keputusan terbaik dengan mempertimbangkan berbagai variabel pembangun sistem, baik variabel variabel terikat ataupun variabel variabel terikatnya. Optimasi dapat dilakukan dengan mengendalikan variabel bebas yang paling mentukan hasil yang diharapkan dari suatu proses. Dalam penelitian terdapat beberapa bentuk desain bergantung dari tujuannya yaitu, (1) Desain komparatif yang dipakai bertujuan mencari faktor utama apa yang paling penting dan berpengaruh signifikan pada suatu sistem ketika kondisi sistem terdiri dari berbagai macam faktor. (2) Desain screening, bertujuan untuk memilih dan menggambarkan beberapa efek penting dari banyak efek yang tidak penting, oleh karena itu, desain screening sering disebut juga main effect design. (3) Response surface bertujuan untuk melihat, mengukur keterkaitan antar interaksi variabel dalam suatu sistem dengan efek kuadrat yang mampu memberikan kita gambaran permukaan yang akurat. Response surface ini biasa digunakan untuk mengoptimasi suatu proses, mencari kelemahan proses, dan membuat proses menjadi lebih tidak sensitif terhadap ganguan eksternal. Untuk percobaan yang mencoba mencari nilai optimum dari interaksi beberapa variabel dalam suatu sistem proses dari penjelasan diatas, paling tepat menggunakan metode Respon surface methodology (RSM). RSM akan membantu menyarankan komposisi terbaik dari interaksi variabel variabel tersebut agar mendapatkan suatu proses yang optimal. RSM merupakan salah satu metode paling penting dalam statistik desain percobaan. RSM terdiri dari kumpulan dari teknik matematika dan statistik yang bertujuan untuk menjelaskan interaksi antara berbagai jenis variabel respon dengan cara mengurutkan percobaan yang dirancang untuk mendaptkan respon yang otpimum. Metode ini pertama kali diperkenalkan pada tahun 1951 oleh PMP box dan KB Wilson. Model ini menggunakan pendekatan polinomial tingkat 2. Kelebihan pendekatan ini, dapat memberikan penjelasan suatu interaksi berbagai variabel, meskipun kita tidak mengetahui karakteristik dari suatu proses. Alur berfikir dari RSM sebagai berikut



17

y=f(x1,x2,xn,….xn+1)+ e misalanya untuk proses berorde dua, dimana x1 dan x2 merupakan variabel bebas yang berpengaruh dan y adalah respon dari fungsi yang bergantung pada x1 dan x2. Sedangkan nilai e merupakan eroor dari respon. RSM membantu mencari kondisi nilai y optimum dimana interaksi antar variabel dapat menghasilkan suatu model yang maksimum. Langkah langkah umum penentuan rancangan optimum dari suatu metode respon permukaan antara lain, (1) Screening: dalam tahap ini, berbagai faktor yang diduga berpengaruh, diseleksi faktor-faktor yang memberikan dampak besar terhadap sistem, sedangkan faktor yang tidak signifikan diabaikan, (2) Improvisasi: dalam tahap ini dilakukan pengubahan nilai faktor-faktor secara berulang-ulang sehingga mendapatkan sekumpulan variasi data yang dapat diolah secara statistik untuk kemudian dicari nilai optimumnya. Proses ini dapat dilakukan dengan metode Box atau Central Composite Design, bergantung pada jenis dan sifat rancangan sistem,(3) Penentuan titik optimum: Merupakan proses pencarian titik optimum menggunakan metode regresi orde dua.

2.8 Central Compotsite Design (CCD) Dalam metode RSM terdiri dari dua macam jenis rancangan percobaan yaitu Central Composite Design (CCD) dan Box Bhenken Model(BBM). Jika jenis percobaanya adalah sequential maka digunakan model rancangan CCD. Akan tetapi, jika jenis percobaanya non sequential rancangan percobaanya digunakan BBM. CCD merupakan rancangan percobaan menggunakan desain faktorial pangkat 2, dengan menambahkan titik pusat dan titik aksial. Desain pusat komposit umum memiliki 5 tingkat, meskipun biasanya dapat dimodifikasi dengan memilih nilai alpa=1 ( menghadap CCD). CCD juga membentuk estimasi kuadratik dan kurang sensitive terhadap kehilangan data. Desain pusat komposit memiliki tiga kelompok esperimen yaitu a. Sebuah desain faktorial ( biasanya sangat mungkin pecahan nilainya) yang memiliki dua tingkat. Desain faktorial ini terdiri dari semua kemungkinan dari +1



18

dan -1. Untuk variabel varian dua faktor, ada 4 desain yaitu, (-1,-1), (+1,-1) (1,+1),(+1,+1). b. Sebuah nilai tengah, yang merupakan nilai tengah dari desain percobaan. Nilai ini diulang lebih sering dan dalam jumlah lebih banyak dibandingkan kelompok lain, untuk meningkatkan ketepatan percobaan.

Nilai tengah atau titik pusat ini,

merupakan nilai poin dimana semua tingkat diarahkan ke tingkat kode 0, yang merupakan titik tengan dari setiap rentang dari varian. Nilai titik tengah ini biasanya diulang 4-6 kali untuk mendapatkan perkiraan yang terbaik dan meminimalisir kesalahan percobaan. c. Sebuah nilai aksial, nilai yang sangat jauh dari nilai titik pusat, baik menjadi batas bawah ataupun atas dari sebuah desain pangkat dua. Nilai aksial ini biasa juga disebut nilai star dimana mempunyai faktor yang mengarah pada sumbu 0, titih tengan, kecuali satu faktor yang memiliki nilai +/- alpha. Untuk varian dua variabel nilai aksialnya adalah, (-α,0),(+α,0)(0,-α)(0,+α). Nilai alpha ini dihitung pada setiap desain agar memiliki kemampuan

blok

berotasi dan ortogonal.

Gambar 6 Rancang CCD Sumber : Design Expert Software

Berikut salah satu contoh regresi orde dua dengan Respin surface dengan 2 faktor, pada penelitian vargas et all yang membahas otpimasi temperature dan moisture pada produksi lipase oleh pennicilium simplissiuum pada soya bean GL = 1.085 · T − 3.107 · T.2 + 1.618 ·W − 1.736 ·W2 + 1.600 · T · W Dengan grafik respon permukaannya adalah sebagai berikut,



19

Gambar 7. Contoh respon permukaan RSM Sumber : Gean D. L.P vargas et all, 2008

Gambar 8. Contoh respon permukaan RSM berbentuk kountur Sumber Gean D. L. P vargas, 2008

2.9 One Factor at The Time (OFAT) Design Desain optimasi ini merupakan desain optimasi konvensional dimana variabel-variable yang berpengaruh diasumsikan tetap ketika mencari nilai terbaik dari variabel lain yang di variasikan. Sebagai contoh ada dua variabel input (X1 dan X2) dan satu variabel output (Y). Agar output didapatkan dengan optimum, Hal pertama yang harus dilakukan adalah mengasumsikan kompososi X2 adalah tetap pada nilai tertentu, lalu kita variasikan X1 sehingga kita mendapatkan nilai optimum



20

dari output yaitu Y. Setelah didapatkan X1 optimum, maka nilai tersebut dibuat tetap untuk mencari varian X2 terbaik yang dimodifikasi. Kelamahan dari metode ini adalah tidak adanya pertimbangan terhadap suatu proses dimana sangat dimungkinkan X1 dan X2 merupakan variabel terikat.

2.10 State of The Art Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui interaksi optimum antara konsentrasi induser yang dipilih dan suhu fermentasi agar mendapatkan nilai aktifas enzim lipase dari fermentasi yeast Rhodotorula mucilaginosa (YUICC422) yang didapatkan dari koleksi BPPT Serpong dari UI cultur collection 422. Penelitian tentang optimasi lipase dari mikroorganisme baik menggunakan jenis bakteria ataupun fungi telah banyak dilakukan. Pada umumnya optimasi enzim lipase dibagi menjadi dua kelompok, pertama kelompok yang mengoptimasi pada proses produksi lipase dan kelompok yang mengoptimasi karakterisasi lipase. Pada tahun 2011 lalu, Amin dkk telah mengoptimasi parameter pertumbuhan produksi lipase dari Genoderma Lucidum menggunakan Respon surface Methdology. Amin dkk menemupakan fermentasi rendam dari Genoderma lucidum akan optimum pada level moistuere 80%, , pH 4.5, olive oil sebagai induser esebanyak 2% dan waktu inkubasi 96 jam pada suhu 30 C. Penelitian produksi lain menggunakan mikro organimse lain dengan Respon surface Methdology

antara lain, Arthrobacter (Sharma 2009),

Fusarium Oxyfarum (Rifaat, 2010), Baccilus sp (Hasan, 2001),colletorichum gloesporildes ( Balaji, 2008) dan Staphylococcus sp lp 12 (pogaku, 2009). Optimasi dengan cara lain misalanya OFAT juga telah dilakukan antara lain, Penicillium verrucosum ( Pinheiro dkk, 2008), Rhizopus oryzae ( Cos dkk, 2005), Pseuodomonas ( carvalho dkk ,2008) dan masih banyak lagi. Penelitian ini sendiri merupakan kelanjutan dan inovasi pada point interasksi konsentrasi induser dan suhu optimum fermentasi menggunakan RSM, dari penelitian yang telah dilakukan oleh Retra Roza yang telah terlebih dahulu pada tahun 2009, memproduksi, mengkarakterisasi dan memurnikan secara parsial enzim lipase yang didapatkan dari Yeast UI CC 422. Yeast ini oleh retra dibuktikan merupakan spesies



21

Rhodotorula mucilaginosa. Retra

juga menemukan bahwa kondisi optimum pH

media 6, suhu produksi optimum 30 0C dan masa inkubasi 72 jam, dan hasil karakterisasinya aktivitas optimum pada pH 8, menggunkan tris Cl dengan waktu inkubasi 60 menit. Retra juga menemukan bahwa ada empat macam jenis lipase yaitu, lipase 1 (38,46 kDa), Lipase 2 (32,89 kDa), lipase 3 (28,18) dan lipase 4 (16.29 kDa) serta membuktikan lipase ini dapat digunakan untuk membuat biodiesel. Penelitian yang dilakukan ingin mengetahui mengoptimumkan interaksi konsentrasi substrat atau induser dan suhu inkubasi produksi lipase yang retra lakukan pada kondisi konsentrasi induser 2 % dan suhu inkubasi 300 C. Untuk itu dilakukan uji pendahuluan dengan metode OFAT yaitu One Factor at the Time.



22

Tabel 3 State of the Art

Produksi yeast Lipase

State of the art

no consideration Karakterisa Growth parameter si

liu et al 2005, kiran et al 2008, carvalho et al ( 2008), ertugrul et al 2008), Sharma, 2009, shirsha abada ( 2008), rifaat 2010, korbekandi, 2008, (2010,) hasan 2001, pogaku, (2009), Lee, sun and xu ( 2008), diaz (1999), chen 2003 et al ( 2006), palma et al ( 200), azeredoo et all ( 2007), vargas et al (2005), dutra et al (2008), ballaji (2008)

papaparaskevas, (1992), Mladenoska, (2001), Shukla, (2007), Silva, (2008), bancerz (2005), sahnchez, (1999)

Kaushik et al., (2006), amin et all, (2011), Fafilolgli, (2001), Vargas ( 2008)

Rodriguez, 2006 Banzerz, (2007), haas, (1992), Muderhwa (1986), Hoe (1997), abbas, (2002)

ibrhaimpour, 2011

Karakterisasi Growth Substrate parame Vs Suhu ter C: N

Rhodotorula mucilaginosa

YeasLain

Organisme

non yeast

Metode Optimasi Non RSM RSM Submarged Fermentasi Solid State fermentasi Submarged Fermentasi Solid state fermentasi

Retra, (2009)

Penelitian yang dilakukan



BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Diagram Alir Penelitian Secara garis besar , urutan penelitan yang akan dilakukan sebagai berikut, Stock Kultur

Peremajaan isolat

Pembuatan starter

UJI PENDAHULUAN KONDISI FERMENTASI DENGAN DESAIN OFAT (One Factor at The Time) Uji Inducer Konsentrasi 2%, suhu 30 0C Minyak goreng bekas, olive oil, min. goreng palm

Substrate

Uji Suhu,

Uji Konsentrasi inducer

[inducer optimum 2%] 27 oC,30 oC,33 oC,35 oC,37 o C,40oC

Suhu dan % inducer optimum

Fermentasi

Persiapan Medium Fermentasi YNBB

10% starter

Uji aktifitas Silva et all 2005

Uji Protein Metode Bradford

Crude Lipase 6000 rpm, 15 menit

RESPONS SURFACE METHODS Desain Central Composite →Running

Desain 13 Titik Kombinasi desain RSM dengan fermentasi→ Suhu dan % Substrate Optimum

VALIDASI DESAIN OPTIMUM RSM



24

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kondisi interaksi terbaik dari konsentrasi substrat dan suhu dalam produksi lipase dengan fermentasi Rhodotorula mucilaginosa

menggunakan

response

surface

methodology

dan

melihat

kemungkinan minyak goreng bekas sebagai substrat untuk produksi lipase. Penelitian

ini

diawali

dengan

peremajaaan

mikroba

Rhodotorula

mucilaginosa yang merupakan koleksi dari Universitas Indonesia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, yang diisolasi oleh Dian Oetari. Mikroba ini didapatkan dari koleksi mikroba BPPT Serpong. Mikroba yang telah disimpan pada suhu 80 oC ini perlu diremajakan dengan cara ditumbuhkan pada medium cair Potato Dextra Broth

selama 5 hari. Selanjutnya mikroba golongan yeast ini

ditumbuhkan di medium agar selama 5 hari. Selanjutnya, mikroba yang didapatkan pada medium agar ini, dipindahkan ke medium agar miring dengan tujuan untuk memudahkan pembuatan starter dan memastikan hanya ada koloni tunggal yang berada di medium agar miring tersebut. Pembuatan starter yang digunakan untuk fermentasi sebanyak 10%, selalu dibuat menggunakan biakan koloni tunggal yang sudah ada di agar miring, dengan menumbuhkan 2-5 ose yeast di agar miring ditambahkan PDB selama 14 jam ( retra, 2009).Prose selanjutnya adalah proses fermentasi. Proses fermentasi ini dilakukan menjadi 3 kelompok yaitu

1.

Tahap Uji Pendahuluan

Pada tahap ini, metode yang diguanakan adalah metode OFAT merupakan metode optimasi konvensional, dimana metode ini tidak memperhatikan interaksi antara variabel. Bisa jadi dengan input konsentrasi substrat (X1) tertentu atau bahkan konsentrasi sangat rendah dapat menghasilkan output besar, pada X2 yang diasumsikan disuatu nilai. Nilai X1 yang didapatkan akan diasumsikan tetap, untuk mencari nilai X2 optimum. Cara ini tidak cukup akurat bila X1 dan X2 saling berhubungan. Namun, cara ini sangat membantu untuk uji pendahuluan sebagai bahan pertimbangan faktor faktor penting untuk input desain RSM. Dengn uji ini, setidaknya memberikan sedikit gambaran dimana nilai X1 dan X2 optimum terletak pada rentang tertentu. Pada tahap ini, penggunanan metode OFAT bertujuan untuk



25

mendapatkan desain awal dan memprediksi nilai maksimum dari konsentrasi substrat dan suhu. Nilai prediksi yang didapatkan akan dijadikan acuan dan pertimbangan untuk menjadi data input data pada Respon Surface Methods. Pada uji pendahuluan ini terdiri dari 1 tahap uji substrat dan 2 tahap uji pendahuluan konsentrasi susbtrat dan suhu optimasi untuk menentukan range desain RSM. Pada fermentasi pada tahap ini perlu diperhatikana volum substrat yang ditambahkan dan air yang ditambahkan untuk menghomogenkan medium pertumbuhan, bergantung pada komposisi kondis fermentasi yang diinginkan,

Uji Pendahulan Pemilihan Substate Terbaik Pada uji ini, kita menggunakan metode One factor at the time. Pada uji ini suhu dibuat tetap karena substrat yang akan divariasikan, substrat yang digunakan adalah minyak jelantah, minyak kelapa sawit , minyak zaitun. Dengan konsentrasi minyak 2 % ( 1 ml), jumlah air 44 ml, jumlah starter 10% (5 ml), setiap produksi 50 ml lipase. Kemudian diukur aktifitas dan kadar protein enzim lipasenya. Nilai tertinggi merupakan kondisi susbtrat terbaik

Uji Pendahuluan Variasi Suhu Pada uji variasi suhu ini, konsenstrasi substrat dipilih tetap, yaitu 2% ( 1 ml dalam 50 ml), selanjutnya suhu divarisaikan dari 27 oC, 30 oC, 33 oC, 35 oC, 37 oC, 40oC. Dengan kondisi demikian maka, air yang digunakan untuk melarutkan sebanyak 44 ml. Pada tahap ini, sebenarnya cukup dengam menggunakan salah satu minyak diantara minyak kelapa sawit, minyak zaitun, dan minyak jelantah. Karena minyak terbaik telah ditentukan pada tahap uji sebelumnya. Namun, penulis melakukan tahap ini untuk semua minyak, dengan tujuan untuk memastikan hasil uji tahap pertama. Nilai aktifitas enzim dan kadar protein enzim tertinggi menandakan titik terbaik.



26

Uji pendahuluan konsenstrasi substat Pada kondisi ini substrat divarisiakan dari 1 %, 2%, 4%, 6,% 10%, 20%, 40%, 60%. Konsekuensi dari perbedaan komposisi substra dalam volum ini tentunya akan mempengaruhi jumlah air yang digunakan untuk menghomogenkan medium fermentasi. Berikut rumus cara menghitung jumlah air yang digunakan Jumlah air yang digunakan = Volume Produksi – 10 % volume produksi (A)- X% volum produksi( B)

2. Tahap running Respons surface Methodology Dari uji pendahuluan diatas, kita dapat menentukan range dimana suhu optimum dan konsentrasi substrat optimum untuk desain RSM. Karena penelitian ini, menggunakan variabel 2 faktor, maka sesuai rule of thumb RSM dengan desain central composit , akan dilakukan fermentasi dengan 13 titik fermentasi. Berikut tabel desain 13 titik tersebut. Rancangan desain yang digunakan pada penelitian ini adalah matriks rancangan Central Composite Design Tabel 4 Penentuan desain Ekperimen CCD

-

Kode

Variabel

-1

0

+1

A

Suhu

25 30

35

22.92893

37.07107

B

Konsentrasi substrat

3

0.585786

3.414214

1

2

Alpha

+ alpha

Level nol (0) merupakan nilai yang diharapkan hasil dari uji pendahuluan, dan untuk menentukan batas bawah -1 level dan batas atas +1 level. Kemudian nilai-nilai parameter dari design expert ini digenerasikan ke dalam software Design expert, seperti yang tertera di dalam tabel dibawah ini,



27

Tabel 5 Matriks eksperiment RSM

Standar

Run

Suhu

Konsentrasi

10

1

30

2

2

2

35

1

6

3

37.07107

2

13

4

30

2

12

5

30

2

5

6

22.92893

2

9

7

30

2

3

8

25

3

8

9

30

3.414213562

4

10

35

3

7

11

30

0.585786438

1

12

25

1

11

13

30

2

Aktfitas

Ada 13 titik yang merupakan ciri khas dari central composite design dua faktor. Seluruh titik pada tabel itu diuji di laboratorium untuk mencari nilai aktifitas lipase dari setiap variasi perlakuan yang diberikan oleh RSM . Dari percobaan kita dapat menentukan nilai aktifitas terbaik, kemudian software design expert akan memberikan berbagai macam bentuk analisis, sehingga kita dapat menyimpulkan titik mana yang terbaik dan optimum dari suatu proses.

3. Tahap Validasi Hasil RSM Setelah melakukan running pada tahap dua, RSM akan memberikan beberapa kondisi ideal dari suatu proses. Kondisi ideal itu yang kita validasi untuk membutktikan seberapa bagus desain yang kita miliki.

3.2 Variabel Penelitian Penelitian ini terdiri dari beberapa kelompok variabel penelitian, yaitu



28

1. Variabel bebas Variabel bebas merupakan variabel yang diatur pada suatu nilai tertentu. Variabel bebas

pada penelitian ini adalah jenis substrat, konsentrasi substrat dan suhu

produksi lipase. Pada uji pendahuluan,

Jenis substrat yang divariasikan adalah

minyak goreng dari palm oil, minyak zaitun, dan minyak jelantah. Konsentrasi substrat divariasikan menjadi 1%,2%,4%,6%,10%,20%,40%,60%. Suhu divariasi pada suhu 27 oC, 30 oC, 33 oC,35 oC,37 oC dan 40 oC. Pada uji RSM variabel bebasnya konsentrasi substrat dan suhu produksi lipase dengan komposisi seperti pada tabel 6. 2. Variabel terikat Variabel ini merupakan variabel yang diukur nilainya setelah diberikan harga tertentu pada variabel bebas. Variabel terikat pada penelitian ini adalah aktivitas enzim. 3. Variabel kontrol Variabel tetap dalam penelitian ini adalah enzim lipase dan menggunakan bakteri Rhodotorula mucilaginosa (YUICC 422)

3.3 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Bioindustri, LAPTIAB - BPPT, Serpong, Tangerang, Banten dan waktu penelitian dari bulan Januari 2012 hingga Juni 2012.

3.4 Alat dan Bahan 3.4.1 Alat Alat-Alat

digunakan dalam penelitian ini adalah miliki Laboratorium

Bioindustri BPPT Tanggerang.

Alat-alat yang digunakan antara lain, alat gelas

seperti cawan petri, tabung reaksi, tabung fermentasi (Pyrex), Incubator static (Memert), timbangan analitik (Radwag), Hotplate stirrer (Heidolph), Autoklaf (Hitachi), pH meter ( Ino Lab), mikrotube (Eppendorf), Shaking incubator ( Kuhner), tabung sentrifugasi (Nunc), High Speed Refrigated Centrifuge dan Rotor R1OA2



29

(Himac), Sentrifuge ( Hitachi), Vortex (Eppendorf), spektrofotometer UV-vis (Hitachi), pipet mikro (Thermo).

3.4.2 Bahan Bahan-bahan kimia yang digunakan berasal dari koleksi dari BPPT Serpong, dan beberapa bahan yang didapatkan dengan membeli di luar BPPT Serpong. Pada penelitian ini menggunakan Yeast UICC422 (Rhodotorula mucilaginosa) yang merupakan khamir koleksi UI yang didapatkan dari isolasi limbah terkontaminasi limbah telah digunakan dan disimpan oleh BPPT Serpong. Penumbuhkan dan Peremajaan yeast ini menggunakan medium pertumbuhan Potato Dextra Agar dan Potato Dextra Broth (Difco). Medium yang digunakan untuk menumbuhkan yeast menggunakan ekstrak yeast (Scharlau), Polivinil alcohol ( Merk), K2HPO4 (Merck), MgSO4. 7H2O (Merck), NaCl (Merck), (NH4)2.SO4 (Merck). Untuk melihat aktifitas enzim digunakan P-nitrofenil palmitat (Merck), isopropanol, gum Arabic, triton x100 (Sigma), dan untuk membuat kurva standar aktiftas menggunakan nitrophenol (Sigma). Kurva standar protein menggunakan Bouvine Serum Albumine (Sigma ). Substrat selama produksi enzim menggunakan minyak goreng kelapa sawit (Bimoli), minyak zaitun, dan minyak jelantah dari pedang ayam goreng di sekitar BPPT.

3.5 Pelaksanaan Penelitian 3.5.1 Pembuatan Media dan Produksi enzim 3.5.1.1 Peremajaan Isolat Stok kultur dari kulkas bersuhu -88 0C perlu diaktikan kembali dan dibuat ke koloni tunggal agar dapat digunakan ferementasi. Hal pertama yang dilakukan adalah menumbuhkanya pada medium Potato Dextra Broth (PDB). Medium PDB yang telah distrilisasi sebanyak 5 ml dibuat dengan komposisi 26,5 gram dalam 1000 ml. ditambahkan Yeast

di stok kulture dengan perbandingan, yeast dan PDB 1:5.

Kemudian dibiakkan dengan menaruhnya pada shaker kuhner 150 rpm, 30 C selama 5 hari. Selanjutnya membuat medium PDA pada cawan petri untuk membentuk koloni tunggal yeast, dengan komposisi 39 gram dalam 1000 ml, dengan modifikasi



30

NaCl 1,5%. Yeast yang telah tumbuh dan berwarna pink tersebut digores pada medium PDA yang telah dibuat pada cawan petri.

3.5.1 2 Pembuatan Isolat Pembuatan Isolat pada tabung miring dilakukan dengan menumbuhkan Yeast pada medium agar. Medium yang digunakan adalah Potato Dextra Agar (PDA). Komposisi PDA yang digunakan yaitu 39 medium PDA dalam 1000 ml akuades. Medium ini dimodifikasi dengan penambahan NaCl 1,5%. Kemudian dilarutkan hingga sempurna dan homogen dengan bantuan stirrer dan pemanasan. Kemudian di masukkan dengan sangat aseptis sebanyak 4 ml tabung reaksi yang telah disterilisasi. Penambahan kloramfenikol juga dapat dilakukan sebagai antibakteri. Kemudian larutan disterilisasi pada autoklaf selama 15 menit, 1 atm, 121 C. Setelah diseterilisasi, tabung

diletakkan miring pada papan kayu. Kemudian didiamkan

sekitar 12 jam agar mengerasg dan membentuk agar. Kemudian secara aseptis yeast koloni tunggal yang telah dibuat pada cawan petri, ditumbuhkan pada agar miring dengan cara menggoresnya dengan pola tertentu.

3.5.1.3 Pembuatan Starter Pembuatan medium starter enzim lipase menggunakan medium PDB (Potato Dextrose Broth) dengan cara 2.65% media PDB dimasukkan ke elenmeyer 50 ml, dilarutkan dengan akuades. Kemudian dihomogenkan dengan stirrer dan dipanaskan hingga larut serta disterilisasi di dalam autoklaf pada suhu 121 C tekanan 1 atm selama 15 menit. Biakan isolat yeast yang telah diremajakan diinokilasi pada agar miring, sebanyak 5 ose ke dalam medium starter secara aseptis. Kemudian diinkubasi dalam shaker inkubator pada suhu 150 rpm , suhu 30 0C selama 14 jam.

3.5.1.4 Fermentasi untuk Produksi Lipase Pembutan medium fermentasi, dengan 45 ml YNBB ditambahkan 15 gram NaCl dan 2% ml minyak goring. Selanjutnya ditambahkan 10% starter yeast. Diinkubasi dengan shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm suhu 30C selama 72



31

jam (Retra,2009).

Dibuat juga medium control tanpa penambahan yeast. Suhu

dipertahankan pada suhu 30 oC

3.5.1.5 Panen dan Penyiapan Ekstrak Kasar Lipase Setelah selama 72 jam dibiakkan, Suspensi hasil fermentasi dimasukkan ke tube untuk di sentrifugasi menggunakan High Speed Refrigenated Centrifuge Himac CR21G dan rotor R1OA2 selama 15 menit pada suhu 4 oC. Supernatan diambil dan dipisahkan dari padatanya. Supernatant yang didapatkan telah mengandung ekstrak kasar enzim. Ekstrak kasar enzim di uji aktifitasnya menggunakan spektrofotometer panjang gelombang 410 nm, dan kemudian dicari kadar proteinya menggunakan spektofotometer pada panjang gelombang 595 nm dengan metode Bradford .

3. 5.2 Uji Pendahuluan dengan Metode One Factor at the Time (OFAT) 3.5.2.1 Penentuan Konsentrasi Substrat (Inducer ) Tujuan tahap ini adalah untuk melihat potensi minyak goreng bekas atau minyak jelantah sebagai substrat inducer dalam fermentasi atau produksi enzim lipase. Semua metode sama dengan pada sub bab sebelumnya, hanya berbeda pada jenis induser, induser yang digunakan adalah minyak jelantah, dan pembanding minyak goreng dan minyak olive oil. Kemudian nilai aktifitas tertinggi dari fermentasi ini, akan digunakan selama fermentasi.

3.5.2.2 Uji Pendahuluan Optimasi Suhu Pada tahap ini, digunakan metode OFAT (One Factor at the Time) dimana konsentrasi substrat dibuat tetap yaitu 2%, dan menggunakan minyak terpilih. Sementara semua proses metode fermentasi sama seperti pada sub bab 3.5.1.13.5.1.5. Hal yang berbeda pada tahap ini adalah suhu yang digunakan untuk produksi lipase divariasikan pada suhu 270C,300C,330C,350C,370C,40 0C. Kemudian dilihat aktifitas dan protein terbaiknya.



32

3.5.2.3 Uji Pendahuluan Konsentrasi Substrat (Induser) Pada tahap ini, masih menggunakan metode OFAT dimana suhu yang terpilih pada tahap sebelumnya dibuat tetap, dan menvariasikan konsentrasi Induser yaitu 1%,2%, 5%,10%,15%,20%, 40%, 60%.

3.5.3. Optimasi dengan Respon Surface Method (RSM) Pada tahap ini, hasil dari uji pendahuluan didapatkan nilai prediksi suhu dan konsenstrasi substrat induser optimum, kemudian data itu digunakan untuk menentukan batas atas dan batas bawah desain Central Composite yang digunakan pada metode RSM ini. Karena penelitian ini melibatkan 2 faktor yang berbeda, menurut rule of thumb desain RSM akan diberikan 13 titik variasi interaksi antara dua variabel yang di input. Kemudian melakukan fermentasi untuk ke 13 titik yang disarankan oleh RSM. Kemudian dengan berbagai alur analisis statistika RSM, akan didapatkan keadaan dua variabel penting yang optimum.

3.5.4 Melakukan Uji Optimasi Desain RSM Hasil analisis RSM kita uji ke dalam proses produksi lipase yang sama dengan sebelumnya dengan berbagai macam modifikasi bergantung keadaan yang RSM berikan sebagai hasil analisinya.

3.5.5 Pengujian Aktifitas Enzim Lipase dan Kadar Protein 3.5.5.1 Metode Uji Lipase Aktivitas lipase pada penelitian pemurnian dan karakterisasi lipase diukur dengan metode spektrofotometer menggunakan p-nitrofenil palmitat sebagai substratnya (Silva, et, al., 2005). . Larutan A dibuat dengan mencampurkan 30 mg pnitrofenill palmitat ke dalam 10 mL isopropanol.

Larutan B dibuat dengan

melarutkan 100 mg Gum Arabic dan 400 mg Triton X-100 dengan 90 mL bufer TrisCl 50 mM pH 8,0 (retra, 2009). Larutan A dan B dicampurkan sampai homogen dengan perbandingan A dan B 9 :1. Selanjutnya, sebanyak 100 µL enzim dan 900 µL



33

substrat dimasukan ke dalam eppendorf. Blanko dibuat dengan menggantikan enzim lipase dengan bufer Tris-Cl 50 mM pH 8,6. Tabung eppendorf diinkubasi dalam termomixer selama 30 menit pada suhu 37 ⁰C. Kemudian absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 410 nm. Satu unit enzim dinyatakan sejumlah 1 µmol p-nitrofenol secara enzimatis dilepaskan dari substrat setiap menit. Hasil pengukuran absorbansi kemudian dikonversi ke dalam aktivitas berdasarkan persamaan kurva standar p-nitrofenil. Persamaan kurva standar p-nitrofenil adalah Y= ax + b Keterangan: Y= Nilai aktivitas (µmol) X= Absorbansi Aktivitas (Y) dikonversi untuk memperoleh nilai aktivitas lipase (satuan unit/mL) dengan persamaan: U= Yx 100/(t xV x Mr nitphenol) Keterangan: U= Aktivitas lipase (U/min/mL) Y= Nilai aktivitas (µmol) t = Waktu reaksi (menit) V= Volume ekstrak kasar lipase (mL)

Persamaan kurva ini didapatkan dari kurva standar yang dibuat,dengan melihat absorbansi dari berbagai variasi konsenstrasi nitrophenol pada tris HCl pH 8. Hal ini dilakukan karena enzim lipase akan mengubah p-nitrofenil palmitat yang merupakan substatenya menjadi nitrophenol. Oleh karena itu, kita mencoba milihat nitrophenol murni dengan berbagai macam konsentrasi dan absorbansinya.



34

Tabel 6 Rancangan kurva kalibarasi aktifitas

Nitro

tris

Absorbansi (Y)

1

0

1000

2

100

900

3

200

800

4

300

700

5

400

600

6

500

500

7

600

400

8

700

300

9

800

200

10

900

100

11

1000

0

Pengukuran Aktivitas Spesifik Lipase dihitung dengan membagi aktivitas enzim dengan kadar protein lipase.

3.5.5.2 Pengukuran Kadar Protein Pengukuran protein menggunakan metode Bradford (1976),

30µL crude

enzim direaksikan dengan 1.5 ml reagen Bradford dan dinkubasi selama 20 menit pada suhu ruang. Dan diukur pada spectofotometer pada panjang gelombang 595nm. Blanko yang digunakan adalah 30µL akuades ditambabahkan 1.5 ML reagen Bradford. Reagen Bradford dibuat dengan cara mencampurkan 0.01 g coomassie brilian blue (CBB) G‐250, kemudian dilarutkan dalam 50 ml etanol 95% (v/v), lalu ditambahkan 100 ml asam fosfor 85% (v/v). Campuran dihomogenkan, lalu disaring



35

dengan kertas saring dan disimpan dalam botol gelap dan suhu rendah. Stok pereaksi Bradford harus diencerkan 5 kali sebelum digunakan. Untuk mengukur kadar proteinya dengan bantuan kurva standar Bovine Serum Albumin, yang merupakan hubungan konsentrasi protein standar BSA dengan nilai panjang gelombang 750 nm. Berikut rancangan kurva BSA

Tabel 7 Rancangan kurva standar BSA

BSA

Tris HCl

ABS

1

0

1000

2

100

900

3

200

800

4

300

700

5

400

600

6

500

500

7

600

400

8

700

300

9

800

200

10

900

100

11

1000

0



BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Tujuan utama penelitian ini adalah menentukan nilai konsentrasi induser optimum dan suhu optimum pada produksi lipase dari fermentasi rendam Rhodotorula mucilaginosa unguk menghasilkan aktiftas lipase tertiinggi. Tujuan lain dari penelitian ini adalah menentukan potensi minyak jelantah sebagai induser minyak kelapa sawit dibandingkan minyak zaitun dengan melihat aktifasi enzim lipase. Parameter yang digunakan untuk mengukur setiap variabel dalam penelitian ini adalah aktifitas enzim lipase dan kadar protein yang di dapatkan dari serangkain percobaan yang dilakukan. Pada tahap pertama dilakukan uji pendahuluan yang menggunakan metode OFAT (Oone Factor at the Time). Pada tahap ini setidaknya ada tiga hasil yang didapatkan berdasarkan aktifitas dan protein yang dimiliki enzim lipase. Pertama, nilai aktifitas dan kandungan protein minyak jelantah yang dibandingkan dengan nilai aktifitas dan protein ketika menggunakan minyak kepala sawit dan palm oil yang dapat menggambarkan substrat terbaik. Kedua, nilai suhu optimum dari produksi lipase. Ketiga, nilai konsesntrasi substrat optimum produksi lipase. Dari hasil, ketiga dan kedua kita jadikan dasar acuan dan pertimbangan dalam menentukan batas atas dan batas bawah intput metode RSM. Kelebihan metode RSM dibandingkan dengan OFAT, RSM juga ikut memikirkan interaksi dari variabel-variabel yang divarisaikan. Pada akhirnya, hasil model dari RSM akan divalidasi dengan dilakukan fermentasi sesuai kondisi yang RSM berikan.

4.1 Penentuan Substrat Terbaik. Subtrat merupakan sumber karbon yang digunakan oleh mikroba sebagai sumber energi. Produksi lipase sendiri sangat bergantung pada substrat yang digunakan, komposisi media yang berbeda akan memiliki efek simultan pada produksi lipase dengan jenis mikroorganisme yang berberda. Hal ini dikarenakan

36


37

psikologikal dan biokimia pathway dari suatu mikroorganisme. (Ebrahimpour, 2008). Substrat atau induser dalam produksi lipase merupakan salah satu faktor penting yang memiliki perngaruh signifikan dalam produksi lipase ( kumar & gupta, 2008). Oleh karena penelitian ini, salah satu faktor yang menjadi perhatian adalah konsentrasi substrat, Penelitian ini bertujuan mencari optimasi produksi lipase maka kita rancang sedemikian rupa agar satu satunya sumber karbon yang digunakan merupakan lemak. Dengan hanya ada sumber karbon yang berasal dari lemak, maka Rhodotorula mucilaginosa akan memaksa dirinya menghasilkan lipid dalam jumlah besar dibandingkan dengan enzim lainya, karena hanya lipase yang dapat mengkatalis metabolisme lemak. Pemilihan substrat berupa minyak ini juga sejalan dengan literature

yang menyatakan bahwa Rhodotorula mucilaginosa tidak dapat

mengfermentasi karbohidrat.( Figueras, 2000) Lipid yang digunakan pada penelitian ini adalah minyak jelantah yang didapatkan dari pedagang penjual ayam goreng diserpong. Minyak goreng bekas sangat banyak ditemukan dikawasan BPPT Serpong, oleh karena itu dipilih substrat dari minyak goreng bekas atau jelantah ini, untuk mengetahui potensinya sebagai penghasil lipase. sebagai pembanding lipid yang digunakan untuk menghasilkan lipase berasal dari minyak kelapa sawit yang diadapat dan minyak zaitun. Berdasarkan perobaaan produksi lipase menggunakan lipid dari minyak jelantah, minyak kelapa sawait dan minyak zaitun sebanyak 2%, waktu inkubasi 72 jam dan suhu 30 0 C adalah sebagai berikut, Tabel 8 Perbandingan pada uji aktifitas dengan variasi substrat

Substrat

Absorbansi

Absorbansi

Uji Aktifitas

protein

Aktifitas

Aktiftas Sspesifik

U/ml

U/mg

Goreng palm oil

0.324

0.142

0.058

0.265

jelantah

0.286

0.118

0.051

0.257

olive

0.305

0.122

0.055

0.255


38

Berdasarkan tabel 8 diatas, dapat disimpulkan substrat terbaik untuk memproduksi lipase adalah minyak goreng dari kelapa sawit dengan absorbansi 0.3235 atau setara dengan 0.057 U/ml. Olive oil dengan absrobansi yang tidak jauh dari palm oul sebesar 0.305 atau setara 0.054 U/ml., juga dapat dijadikan substrat pertumbuhan Rhodotoruka mucilaginosa,. Hal ini sesuai dengan penelitian Bancez pada 2010 yang mengatakan olive oil sebagai salah satu substrat yang baik bagi yeast. Selian itu Penelitian ini sesuai dengan hasil dari papaparaskevas, (1992), aktifitas lipase dari palm oil lebih tinggi dibandingkan denggan olive oil. Dengan demikian, substrat yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah minyak dari kelapa sawit atau palm oil. Minyak disini tidak hanya berlaku sebagai substrat melainkan sumber karbon bagi pertumbuhan mikroorganisme itu sendiri (Xu, 2008) Dari hasil percobaan ini juga membuktikan bahwa minyak jelantah masih potensial untuk dimanfaatkan kembali sebagai penghasil lipase melalui fermentasi rendam Rhodotorula mucilaginosa. Meskipun nilai absorbansi dan aktifitasnya tidak jauh lebih baik dibandingkan dengan nilai absorbasi dan aktifitas dari palm oil dan olive oil. Sehingga pemanfaatan minyak jelantah sebagai salah satu alternative pengganti substrat perumbuhan yeast ini sangat mungkin dilakukan.

4.2 Penentuan Suhu Optimum Suhu merupakan salah satu faktor pertumbuhan yang penting bagi mikroorganisme,

karena

suhu

sangat

mempengaruhi

proses

metabolismee

mikroorganisme. Pada umumnya mikroorganisme termasuk golongan thermofilik yang memiliki reantang suhu 30 oC -40oC dimana suhu optimum fermentasi biasanya pada suhu 37 oC. Berdasarkan literature dari penelitian retra suhu optimum dari fermentasi Rhodotorula mucilaginosa adalah 30 C. Untuk memastikan apakah benar suhu tersebut suhu optimum pertumbuhan mikroba, penulis mencoba menfermetasi mulai dari suhu 27 ooC, 30 oC, 33 oC, 35 oC, 37 oC dan 40 oC. Berbeda dengan Retra, yang melakukan uji ini dengan rentang besar 30oC, 35oC, 40 oC, 45oC. Rentang suhu yang digunakan penelitian ini rentangnya relatif kecil, dengan tujuan untuk melihat


39

secara seksama perbedaan suhunya. Ketika variabel suhu ini divariasikan. Semua faktor yang mempengaruhi fermentasi dijaga stabil.

0,08

Aktifitas Enzim (U/ml)

0,06 0,04 0,02 0 25

27

29

31

33 Suhu (

35

37

39

41

0C)

Gambar 10 pengaruh suhu pada aktifitas lipase dengan substrat minyak goreng

Berdasarkan grafik diatas (gambar10) dapat dilihat bahwa suhu untuk produksi lipase yang menghasilkan lipase dengan aktifitas tertinggi adalah 30 oC. Hal ini sejalan dengan beberapa penelitian tentang produksi lipase dari yeast yang memiliki suhu optimum . Suhu yang menghasilkan aktifitas lipase terendah adalah suhu 37

o

C. Kondisi ini, berkaitan dengan kondisi metabolisme Rhodotorula

mucilaginosa itu sendiri. Pada suhu 37 oC enzim yang ada di tubuh Rhodotorula mucilaginosa sudah mulai bekrja tidak optimum, disebabkan oleh protein ditubuh mikroba ini mulai terdenaturasi. Jika diamati, pada suhu 40 oC terjadi kenaikan aktifitas lipase. Penulis menduga bahwa ini diakibatkan oleh jenis lipase lainya yang dihasilkan oleh enzim ini, pendapat ini didukung oleh penelitian Retra 2009 yang menyatakan ada 4 jenis lipase yang dihasilkan zimogram. Sehingga, kemungkinan salah satu dari lipase tersebut memiliki titik optimum lainya. Sebagai tambahan pada penelitian ini, penulis juga membandingkan produksi lipase yang dihasilkan oleh minyak goreng / palm oil, olive oil dan jelantah pada variasi suhu. Seperti yang terlihat pada grafik dibawah (gambar 11). Pada gambar tersebut dapat dilihat jelas bahwa minyak goreng atau palm oil masih yang terbaik


40

sebagai substrat penghasil lipase, meskipun untuk suhu semakin tinggi olive oil lebih tinggi aktifitas lipasenya.

Aktifitas Enzim U/ml

0,08

0,06

0,04

minyak goreng/ palm oil Olive oil/minyak zaitun

0,02

jelantah

0 25

30

35

40

Suhu ( oC)

(a)

Aktifitas Enzim U/ml

0,4 0,3 0,2

palm oil

olive oil

0,1

jelantah ( re use palm oil )

0 25

30

35

40

Suhu (0C)

(b) Gambar 11. ( a)Aktifitas lipase varisiasi suhu dengan variasi minyak dan (b) aktifitas spesifik variasi suhu dan minyak

Dari penelitian ini juga dapat disimpulkan bahwa jumlah protein yang dihasilkan cenderung berbanding lurus dengan aktfitas yang dihasilkan. Pada suhu 30 oC, aktifitas lipase optimum, begitu juga jumlah proteinya juga pada kadar tertinggi pada kondisi ini. Hal ini disebabkan, semakin banyak enzim yang dihasilkan


41

semakin banyak protein yang dihasilkan juga, karena enzim merupakan protein. Selanjutnya titik optimum ini akan digunakan sebagai pertimbangan dalam menentukan titik dalam desain RSM

Konsentrasi Protein mg/ml

0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 25

27

29

31

33

35

37

39

Suhu (0C)

Gambar 12 Pengaruh suhu terhadap konsentrasi protein

4.3 Uji Penentuan Konsentrasi Subtstrat Optimum Setelah didapatkan suhu optimum produksi lipase dan substrat terbaik dari substrat yang digunakan dalam penelitian ini,

dilanjutkan dengan mencari nilai

konsentrasi substrat optimum dari penelitian ini. Pada peneilitan ini, konsentrasi substrat yang digunakan divariasikan mulai dari 1%, 2% 5%, 20%, 20%, 40% dan 60 %. Dapat dilihat di dalam gambar dibawah, bahwa kurva aktfitas optimum pada konsentrasi substrat 2%. Hal ini sejalan dengan kondisi konsentrasi substrat pada penelitian yang dilakukan Retra 2009. Dari gambar dibawah ini dapat diamati, selama penambahan konsenstrasi substrat aktifitas lipase yang diproduksi terus berkurang. Penulis menduga pada kondisi konsentrasi substrat semakin tinggi, jumlah air semakin berkurang, jumlah air ini sangat diperlukan dalam memproduksi lipase yang merupakan jenis enzim hidrolisis sehingga air menjadi faktor penting dalam produksi lipase. Selain itu, air berguna sebagai salah satu bahan pereksi katalis


42

trrigliserida menjadi gliserol dikatalis lipase pada metabolisme lemak.

Air juga

menyediakan ruang interface pertemuan antara gugus hidrodilik lipid dengan enzim. Grafik penurunan ini juga disebabkan media pertumbuhan sudah jenuh dengan semakin banyaknya substrat yang ada(amin, et all, 2007). Ketika titik jenuh telah tercapai, penambahan konsenstrasi subsrtat tidak akan membuat perbedaan. Namun, karena dalam penelitian ini, dengan penambahan substrat jumlah air pun berkurang sementara air diperlukan dalam reaksi ini, maka berkibat pada penurunan aktifitas atau enzim yang dihasilkan selama produksi enzim.

Aktifitas enzim U/ml

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

Konsentrasi Substrtat (ml/ml)

Gambar 13 Pengaruh konsenstrasi substrat terhadap aktifitas lipase

Seperti yang diduga pada pembahasan sebelumnya, kadar protein akan cenderung berbanding lurus dengan produksi lipasenya. Semakin tinggi yeild lipase yang dihasilkan protein yang dihasilkan juga akan semakin tinggi. Seperti yang dapat dilihat dari gambar berikut. Selanjutnya didapatkan kadar konsentrasi substrat optimum dari percobaan ini adalah 2%. Hasil ini akan dijadikan sebagai pertimbangan

penting dalam

menyususn desain model dari metode Response

Surface Methodology.


43

Konsentrasi protein mg/ml

1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

Konsentrasi Substrat (ml/ml)

Gambar 14 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kadar protein

4.4 Penentuan Desain Response Surface Metodology Setelah melakukan uji pendahuluan, kami merancang desain optimasi menggunakan

RSM. Kelebihan metode ini dibandingkan Uji pendahuluan yang

menggunakan metode OFAT, yaitu RSM mempertimbangkan interaksi dari variabel variabel yang di variasikan dalam hal ini, interaksi antara suhu dan konsentrasi substrat. Langkah pertama dalam mendesain RSM adalah memilih desain percobaan. Ada dua jenis desain yang dimiliki oleh RSM yaitu, Central Composite Design (CCD) dan Box Bhenken Design (BBD). Kedua desain ini dapat digunakan untuk mengoptimasi model kuadratik. Namun, ada beberapa perbedaan antara dua desain in. perbedaan pertama, CCD biasanya digunakan untuk mengolah data dan mengoprimasi data yang bersifat sequential sedangkan Box bhenken digunakan untuk mengolah data non sequential . perbedaan kedua, BBD mememiliki jumlah titik desain yang lebih sedikit dibandingkan dengan CCD, karena BBD tidak memiliki sentral point, sementara central point ini dapat membantu mengetahui dengan lebih jelas kesesuain model yang didapatkan. Berdasarkan penjelasan diatas, karena data


44

yang digunakan dalam uji pendahuluan cenderung sequential

dan untuk lebih

kesesuain model yang lebih mudah dintreprestaskan, maka dipilih model CCD. Langkah selanjutnya dalam mengoptimasi suatu proses dengan RSM adalah menentukan batas bawah dan batas atas dari variabel-varibale yang divariasikan. Pada penelitian ini ada dua variabel yang digunakan yaitu suhu, dan konsentrasi substrat. Berbeda dengan optimasi OFAT yang ketika salah satu variabel divariasikan , variabel lain dibuat tetap, metode ini menvariasikan

semua variabel secara

bersamaam. Berikut model desain batas bawah dan batas atas dari variabel suhu dan variabel konsentrasi substrat.

Tabel 9 Rancangan batas bawah dan batas atas desain.

Kode

Name

Units

A

Suhu

C

B

Konsentrasi

v/v

level -1

level + 1

alpha -

alpha +

25

35

22.93

37.07

1

3

0.59

3.414

Pada gambar diatas dapat dilihat batas bawah dari suhu adalah 25 oC sedangkan batas atas 35 oC. Angka ini dipiliih berdasarkan pertimbangan bahwa suhu optimum

pada uji pendahuluan

adalah 30 oC. Oleh karena itu, penulis

merancang agar central point berada pada suhu 30 oC, dengan cara merancang desain suhu optimum dengan rentang batas bawah dan batas atas 25 oC-35 oC. Dengan alasan yang sama, penulis juga menentukan batas bawah dan batas atas dari konsentrasi suhu pada rentang 1%-3%, agar mendapatkan titik tengah atau central point pada nilai 2%. Kemudian RSM akan memberikan data kondisi yang harus difermentasi secara laboratorium untuk melihat kesesuain model. Ada tiga belas titik yang harus dilakukan fermentasi. Berikut hasil fermentasi titik titik tersebut,


45

Tabel 10 Desain running fermentasi RSM dan hasilnya

suhu Vs

aktifitas

protein

U/ml

Konsentrasi

absorbansi

absorbansi

y

substrat

rata2

rata2

aktifitas

U aktfias

mg/ml

unit/mg

y

U

spesifik

protein

protein

22/2

0.0765

0.089

0.005

0.012

0.159

0.159

0.073

25/1

0.116

0.072

0.007

0.018

0.128

0.128

0.138

25/3

0.107

0.088

0.007

0.016

0.157

0.166

0.105

30/0.5

0.205

0.115

0.013

0.031

0.205

0.205

0.153

30/3.4

0.148

0.108

0.009

0.025

0.193

0.192

0.117

30/2

0.3992

0.129

0.025

0.061

0.239

0.230

0.266

30/2

0.309

0.121

0.020

0.047

0.216

0.216

0.219

30/2

0.292

0.124

0.019

0.045

0.221

0.220

0.202

30/2

0.3465

0.126

0.022

0.053

0.224

0.224

0.236

30/2

0.376

0.135

0.024

0.056

0.240

0.240

0.239

35/1

0.195

0.11

0.013

0.030

0.196

0.196

0.152

35/1

0.02775

0.054

0.002

0.004

0.096

0.096

0.044

37/2

0.0352

0.076

0.002

0.005

0.135

0.135

0.040

Berdasakan hasil percobaan melakukan fermentasi ketiga belas titik diatas kita akan mendapatkan nilai aktifitas yang akan kita masukkan ke kolom diatas sebagai input RSM. Selanjutnya pemilihan model dilakukan berdasarkan beberapa parameter antara lain, jumlah

kuadrat dari urutan model (Sequential Model Sum of Squares),

pengujian ketidaktepatan model (Lack of Fit Tests) dan ringkasan model secara statistik (Model Summary Statistics). Model yang mungkin terpilih dari metode permukaan respon adalah model linier, 2FI (antara dua faktor), dan kuadratik.

4.4.1 Uji Pemilihan Model Berdasarkan Sequential Model Sum of Square CCD memiliki banyak model matematika yang dapat digunakan untuk menentukan desain terbaik. Uji yang dilakukan saat ini, bedasarkan pada jumlah kuadarat dari urutan model, dimana model yang terbaik adalah model yang memiliki


46

nilai probabilitas kurang dari 5%.

Nilai ini berarti ketidaktepatan model yang

diberikan kurang dari 5%. Tabel 11 Analisis Sequential Model Sum of Square

Sequential Model Sum of Squares [Type I] Sum of Squares

Source

df

Mean

F

p-value

Square

Value

Prob > F

Mean vs Total

0.0125

1

0.0125

Linear vs Mean

0.0002

2

0.0001

0.2234 0.8037

2FI vs Linear

0.0002

1

0.0002

0.2998 0.5974

Quadratic vs 2FI

0.0048

2

0.0021

64.922 <

Suggested

0.0001 3.66E-05

2 1.83E-05

Residual

0.0002

5 3.77E-05

Total

0.0172 13

Cubic vs Quadratic

0.4864 0.6412

Aliased

0.0013

Berdasarkan tabel diatas hanya model Cubic vs Quadratik yang dapat dijadikan kandidiat model, karena satu satunya yang memiliki nilai probabilitas kurang dari 5%.

4.4.2 Uji Pemilihan Model Berdasarkan Lack of fit Uji ini berdasarkan pada seberapa berpengaruh nilai lack of fti atau ketidak sesuai model. Parameter keberpengaruhan ketidaktepatan model adalah nilai p-value. Secara spesifik tujuan dari uji ini adalah menguji kesesuain model yang didesain dengan desain model orde 2. Berdasarkan uji lack of fit pada gambar dibawah model yang disarankan oleh software design expert adalah model quadratic.


47

Tabel 12 Lack of fit

Lack of Fit Tests Sum of Squares

Source

Df

Mean

F

p-value

Square

Value

Prob > F

Linear

0.0044

6

0.0007

15.510 0.0096

2FI

0.0042

5

0.0008

17.987 0.0076

Quadratic 3.77E-05

3 1.26E-05

0.2683 0.8458

Suggested

1.05E-06

1 1.05E-06

0.0224 0.8882

Aliased

0.0002

4 4.68E-05

Cubic Pure Error

4.4.3 Uji Pemilihan Model Berdasarkan R squared Uji ini berdasarkan nilai R Squared adjusted and Predicted dimana nilai yang baik adalah nilai yang mendekati nilai 1. Tabel 13 Model Summary Statistic

Model Summary Statistics Std. Dev.

Source

R-Squared

Adjusted

Predicted

R-

R-Squared

PRESS

Squared

Linear

0.02131

0.042762

-0.14869

-0.55864

0.00740

2FI

0.02210

0.073615

-0.23518

-1.05659

0.00976

Quadratic

0.00567

0.952612

0.91876

0.881905

0.00056 Suggested

0.960331 0.904793

0.924205

0.00036 Aliased

Cubic

0.006138

Pada tabel diatas dapat dilihat model yang disarankan adalah model qudratik karena nilai Rsquared adjusted dan R-Squared predicted yang paling mendekati nilai 1 adalah model cubic. Sehingga software ini menyarankan model quadratic.

4.4.4 Uji ANOVA


48

Untuk mengetahui interaksi respon antar variabel dalam proses, analisis ini digunakan. Model persaman ini, memiliki 2 term linier, 1 efek interaksi dan 2 efek kuadratik. Tabel 14 ANNOVA Model Produksi lipase

Response ANOVA for Response Surface Quadratic Model Analysis of variance tabel [Partial sum of squares - Type III] Sum of

Mean

F

pvalue

Squares

Source

Df

Square

Value

Prob > F

0.004523 5

0.000905 28.14361 0.0002

A-suhu

1.01E-05 1

1.01E-05 0.313083 0.5932

B-Kosentrasi

0.000193 1

0.000193 6.003616 0.0441

AB

0.000146 1

0.000146 4.557606 0.0702

A^2

0.003447 1

0.003447 107.2514 <

Model

significant

substrat

0.0001 0.001182 1

0.001182 36.76422 0.0005

Residual

0.000225 7

3.21E-05

Lack of Fit

3.77E-05 3

1.26E-05 0.268345 0.8458

Pure Error

0.000187 4

4.68E-05

Cor Total

0.004748 12

B^2

not significant

Pada tabel diatas A menggambarkan variabel suhu, B merupakan variabel konsentrasi. Parameter pengaruh signifikan dari suatu faktor adalah besarnya nilai probailitas p Value >F harus kurang dari 5%. Dari tabel diatas yang memiliki kriteria parameter ini adalah nilai suhu kuadarat dan nilai konsentrasi kuadrat. Dengan demikian kuadarat dari suhu dan konsentrasi sangat berperngaruh pada proses model ini. Nilai interaksi suhu dan konsentrasi sedikit signifikan karena ia


49

berada nilai 7%. Meskpiun demikian nilai interaksi suhu dan konsentrasi masih sangat berkaitan karena nilai probailitas p Value >F harus lebih besar mendekati 5%.

Pada tabel diatas juga dapat dilihat nilai lack of fit tidak signifikan

dibandinggkan dengan kemungkinan eror murni. Sehingga, nilai 84.75% lack of fit lack of fit yang terjadi disebabkan oleh noise. Nilai lack of fit yang tidak signifikan ini yang diingikan dari suatu model. Tabel 15 Nilai Kekarutan Desain

Std. Dev.

0.236479 R-Squared

Mean

1.292291 Adj R-

0.952604 0.91875

Squared C.V. %

18.29918 Pred R-

0.881858

Squared PRESS

0.975767 Adeq

12.30041

Precision

Berdasarkan uji ANOVA pada tabel diatas diperoleh nilai koefisien determinasi R2=0,9526 yang menunjukkan bahwa 95,26% variabel sampel pada produksi lipase dipengaruhi oleh variabel independen, dan hanya 4,74 % dari semua variabel yang tidak dapat dijelaskan oleh model. Dari tabel diatas dapat dilihat nilai devisiasi yang rendah hanya 0.23. Nilai devisiasi yang rendah menggambarkan keakuratan model tersebut. Dari tabel diatas juga hubungan nilai pred R squared 0.8819 dan nilai Adj R Squared 0.9187 cukup rasional untuk disimpulkan mereka berintreaksi dengan baik. Nilai adj R squared juga mengoreksi nilai R2 , dimana nilai adj R squared bisa jadi lebih kecil dari nilai R2 karena ukuran sample yang kecil (amin, et all, 2007). Nilai CV ( 18.2 %) menggambarkan tingkat residu antara nilai aktual dan nilai prediksi dari aktifitas enzim.

Persamaan dari model yang disarankan dari anova adalah demikian


50

aktvitas

= -0.85691 + (0 .055623x suhu )+ ( 0.083533x Kosentrasi substrat) -

(1.21036E-003x suhu x Kosentrasi substrat) – (8.90452E-004 x suhu x suhu) – (0.013034 x Kosentrasi substrat x konsentrasi substrat)

Berdasrakan persamaan diatas dapat disimpulkan bahwa, pengaruh suhu dan konsentrasi subsrtat sangat berpengaruh terhadap produksi lipase. Hal in dapat dilihat bahwa nilai variabel suhu dan variabel konsenstrasi substrat memiliki tanda positif.

Gambar 15. Interaksi konsentrasi substrat dengan suhu untuk mendapatkan aktiftas maksimum pada produksi lipase bentuk counter


51

Gambar 16. Interaksi konsentrasi substrat dengan suhu untuk mendapatkan aktiftas maksimum pada produksi lipase bentuk 3D

4.5 Validasi Model Setelah dilakukan berbagai proses analisis, software design expert akan memberikan saran optimasi dari desain yang diberikan, sebagai berikut

Tabel 16 Optimasi yang dilakukan oleh RSM

Solutions Number

Suhu

Kosentrasi

Aktvitas

Desirability

substrat

1

32.99

1.672

0.053

Setelah dilakukan validasi didapatkan nilai aktifitas ebagai berikut,


0.761 Selected

52

Tabel 17 Validasi model RSM

Suhu

Kosentrasi absorbansi substrat

32.99033

1.672

Aktifitas

aktiftas rata-rata 0.311

0.0565

Setelah RSM memberikan saran titk mana yang harus divalidasi dilakukan uji validasi model RSM. Setelah dilakukan validasi dengan cara melakukan fermentasi sesuai yang disarankan RSM, penulis mendapatkan nilai yang tidak jauh berbeda, tingkat kesamaan dengan model yang RSM berikan sebesar

95.2 %. Sehingga,

Model ini dapat diterima.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan Berdasarkan pembahasan penelitian diatas dapat disimpulkan bahwa, 1. Nilai aktiftas enzim lipase dengan substrat minyak jelantah sebesar 0.051 U/ml sedangkan nilai aktifitas enzim lipase dengan substrat minyak goreng dari palm oil dan minyak zaitun sebesar 0.057 U/ml dan 0.054 U/ml. Dari data tersebut dapat disimpulkan nilai aktifitas enzim dari minyak jelantah tidak jauh lebih baik dari minyak goreng dari kepala sawit dan minyak zaitun. Namun, perbedaan aktifitas minyak jelantah dengan minyak palm oil dan minyak zaitun realtif kecil dan tidak terlalu signifikan, sehingga, minyak jelantah yang banyak di daerah Serpong masih dapat digunakan sebagai bahan pengganti substrat dalam produksi lipase menggunakan Rhodotorula mucilaginosa.. 2. Kondisi optimum interaksi suhu dan konsentrasi substrat dari produksi lipase menggunakan jenis Rhodotorula mucilaginosa adalah 32.99

o

C dan

konsentrasi substrat 1.67%, menghasilkan aktiftas lipase sebesar 0.053 U/ml Dengan persamaan model, sebagai berikut aktvitas

= -0.85691 + (0 .055623x suhu )+ ( 0.083533x Kosentrasi

substrat) - (1.21036E-003x suhu x Kosentrasi substrat) – (8.90452E-004 x suhu x suhu) –(0.013034 x Kosentrasi substrat x konsentrasi substrat)

5.2 Saran Berdasarkan kesimpulan dari penelitian ini, penulis menyarankan 1. Penelitian ini hanya memvariasikan 2 variabel. Oleh karena itu perlu dilakukan optimasi RSM kembali dengan variabel penting lebih dari dua macam agar keterkaitan antar faktor bisa lebih teroptimasi, sehingga didapatkan aktfitas enzim yang maksimum untuk skala yang lebih besar. Faktor penting lainya yang dapat dioptimasi antara lain, agitasi, aerasi, pH,

53


54

lama inkubasi, konsentrasi substrat , medium, sumber nitrogen dan suhu produksi enzim 2. Pengukuran enzim sebaiknya dalam keadaan murni bukan dalam keadaan crude enzim untuk hasil yang lebih persisi.


DAFTAR PUSTAKA

Amin M, Bhatti HN, Perveen F (2008). Production, partial purification and thermal characterization of β-Amylase from Fusarium solani in solid-state fermentation. J. Chem. Soc. Pak. 30: 480-485. Avneet kour. Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene.Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458 Vol.9 No.1, Issue of January 15, 2006 Balia, R., L. 2004. Potensi dan Prospek Yeast (Khamir) dalam Meningkatkan Diversifikasi Pangan di Indonesia. Universitas Padjajaran, Bandung. Bancerz, R.,

Ginalska G., and Gromada, F. 2005. Cultivation conditions and

properties of xtracellular crude lipase from the psychrotrophic fungus Penicillium chrysogenum 9¢. Microbiol Biotechnol. 32: 253–260 Benjamin S, Pandey A (1997). Coconut cake-a potent substrat for the production of lipase

by

Candida

rugosa

in

solid-state

fermentation.

Acta

Biotechnologia, 17: 241-251. Benjamin S, Pandey A (1998). Mixed-solid substrat fermentation: A novel process for enhanced lipase production by Candida rugosa. Acta Biotechnologia, 18: 315-324. Bennett, J. E. 1990. Searching for the yeast connection [editorial; comment] [see comments]. N Engl J Med. 323:1766-7. Bhatti HN, Nawaz S (2009). Production of endoglucanase by Fusarium solani grown in solid-state fermentation. Asian J. Chem. 21: 1943- 1948. Bhatti HN, Rashid MH, Nawaz R, Asgher M, Perveen R, Jabbar A(2007). Optimization of media for enhanced glucoamylase production in solidstate fermentation by Fusarium solani. Food Technol. Biotechnol. 45, 5156. Bradford M (1976). A rapid and sensitive method for the quantification of microorganism quantities of protein, using the principle of proteindye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.

55


56

Dutra JC, da Terzi S, Bevilaqua JV et al (2008) Lipase production in solid-state fermentation monitoring biomass growth of Aspergillus niger using digital image processing. Appl Biochem Biotechnol 147:63–75 Fahy E, Subramaniam S, Brown HA, et al. (2005). "A comprehensive classification sistem for lipids". Journal of Lipid Research 46 (5): 839–61. doi:10.1194/jlr.E400004-JLR200. PMID 15722563 Fukuda H, Kondo A, Noda H (2001). Biodiesel fuel production by transesterification of oils. J. Biosci. Bioeng. 92: 405-416. Ghanem A, Aboul-Enein HY (2004).Lipase-mediated chiral resolution of

racemates in organic

solvents. Tetrahedron, 15: 3331-3351. Ghanem EH, Al-Sayeed HA, Saleh KM: An alkalophilic thermostabel lipase produced by a new isolate of Bacillus alcalophilus. World J Microb Biot 2000, 16:459-464. Gunawan ER, Basri M, Rahman MBA, Salleh AB, Rahman RNZA: Study on response surface methodology (RSM) of lipase-catalyzed synthesis of palm-based wax ester. Enzyme Microb Technol 2005, 37:739-744. Gupta N, Sahai V, Gupta R: Alkaline lipase from a novel strain Burkholderia multivorans : Statistical medium optimization and production in a bioreactor. Process Biochem 2007,42:518-526. Gupta R, Gupta N, Rathi P. 2004. Bacterial lipases: an overview of production, purification and biochemical properties. Appl Microbiol Biotechnol 64(6): 763-781. Gupta N, Rathi P, Gupta R (2002). Simplified p-nitrophenyl palmitate assay for lipase and esterases. Anal. Biochem. 311: 98-99. Kaushik R, Saran S, Israr J, Guo Z, Xu X. 2005. New opportunity for enzymatic modification of fats and oils with industrial potentials. Org Biomol Chem 3 (14): 2615-2619. Gutarra MLE, Godoy MG, Maugeri F et al (2009) Production of an acidic and thermostabel lipase of the mesophilic fungus Penicillium simplicissimum by solid-state fermentation. Bioresour Technol 100:5249–5254


57

Hasan F, Shah AA, Hameed A: Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and Microb Technol 2006, 39:235-251. Hernández-Rodríguez B, Cordova J, Bárzana E et al (2009) Effects of organic solvents on activity and stability of lipases produced by thermotolerant fungi in solid-state fermentation. J Mol Catal B Enzym 61:136–142 Jyoti vakhlu. 2006.Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning.

Department of Biotechnology University of Jammu

Jammu-180006 ( J&K)cIndia Tel: 094191-17624 Kumar SS, Gupta R (2008). An extracellular lipase from Trichosporon asahii MSR 54: Medium optimization and enantioselective deacetylation of phenyl ethyl acetate. Process Biochem. 43: 1054- 1060. Kumar S, Katiyar N, Ingle P et al (2011) Use of evolutionary operation (EVOP) factorial design technique to develop a bioprocess using grease waste as a substrat for lipase production. Bioresour Technol 102:4909–4912 Kumar R, Mahajan S, Kumar A, Singh D (2010). Identification of variabels and value optimization for optimum lipase production by Bacillus pumilus RK31 using

statistical

methodology.

New

Biotechnol.

doi:10.1016/j.nbt.2010.06.007. Kurtzman, C. P., and J. W. Fell (ed.). 2000. The Yeasts. A Taxonomic Study. Elsevier Scientific B.V., Amsterdam, The Netherlands. Larios A, Garcia HS, Oliart RM, Valerio-Alfaro G (2004). Synthesis of flavor and fragrance esters using Candida antarctica lipase. Appl. Microbiol. Biotechnol. 65: 373-376. Lotti M, Monticelli S, Montesinos JL, Brocca S, Valero F, Lafuente J: Physiological control on the expression and secretion of Candida rugosa lipase. Chem Phys Lipids 1998, 93:143-148.

Lowry, O. Nira, J. R., Lewis, F., dan Rose J.R. 1951. Protein Measurement With The Follin Phenol Reagent. Washington University School of Medicine. St. Louis


58

Maeder, M., P. R. Vogt, G. Schaer, A. von Graevenitz, and H. F. Gunthard. 2003. Aortic homograft endocarditis caused by Rhodotorula mucilaginosa. Infection. 31:181-3 Martinez-Rodriguez A, Garcia HS, Saucedo- Castañeda G et al (2008) Organic phase synthesis of ethyl oleate using lipases produced by solid-state fermentation. Appl Biochem Biotechnol 151:393–401 Mala JG, Edwinoliver NG, Kamini NR et al (2007) Mixed substrat solid-state fermentation for production and extraction of lipase .Gen Appl Microbiol 53:247–53 Monteiro JB, Nascimento MG, Ninow JL (2003). Lipase-catalyzed synthesis of monoacylglycerol in a homogeneous sistem. Biotechnol. Lett. 25: 641-644. Raimbault M, Alazard D (1980) Culture method to study fungal growth in solid state fermentation. Eur J Appl Microbiol Biotechnol 9:199–209 Rajendran A, Palanisamy A, Thangavelu V (2008). Evaluation of medium components by Plackett-Burman statistical design for lipase production by Candida rugosa and kinetic modeling. Chin. J. Biotechnol. 24, 436444. Rajendran A, Thangavelu V (2009). Statistical experimental design for evaluation of medium components for lipase production by Rhizopus arrhizus MTCC 2233. Food Sci. Technol. 42, 985-992. Retra Roza. Program Pascasarjana Universitas Brawijaya. Produksi, Karakterisasi dan Pemurnian Parsial Lipase dari Isolat UICC Y-422 serta Aplikasinya dalam Reaksi Transesterifikasi.2010. Serpong-Unair Rodriguez JA, Mateos JC, Nungaray J et al(2006) Improving lipase production by nutrient source modification using Rhizopus homothallicus cultured in solidstate fermentation. Proc Biochem 44:2264–2269 Rigo E, Ninowa JL, Di Luccio M et al (2010) Lipase production by solid fermentation of soybean meal with different supplements. Food Sci Technol 43:1132–1137


59

Osório NM, Ferreira-Dias S, Gusmão JH, da Fonseca MMR: Response surface modelling of the production of ω-3 polyunsaturated fatty acids-enriched fats by a commercial immobilizedlipase. J Mol Catal B: Enzym 2001, 11:677-686. Saxena RK, Sheoran A, Giri B, Davidson WS (2003). Purification strategies for microbial lipases. J. Microbiol. Methods, 52: 1-18. Sifour M, Zaghloul TI, Saeed HM, Berekaa MM, Abdel-fattah YR (2010). Enhanced production of lipase by thermophilic Geobacillus stearothermophilus strain-5 using statistical experimental design. New Biotechnol. (27): 330336. Amin et al. 5523 Shaheen I, Bhatti HN, Ashraf T (2008).Production, purification and thermal characterization of invertase from a newly isolated Fusarium sp. under solid-state fermentation. Int.J. Food Sci. Technol. 43, 1152- 1158. Sharma R, Soni SK, Vohra RM, Jolly RS, Gupta LK, Gupta JK: Production of extracellular alkaline lipase from a Bacillus sp. RSJ1 and its application in ester hydrolysis. Ind J Microbiol 2002, 42:49-54. Shukla P, Garai D, Zafar M, Gupta K, Shrivastava S (2007). Process parameters optimization for lipase production by Rhizopus oryzae kg- 10 under submerged fermentation using response surface methodology. J. Appl. Sci. Environ. Sanit. 2: 93-103. Saucedo-Castañeda G, Trejo-Hernández MR(1994) On-line automated monitoring and control sistems for CO 2 and O 2 in aerobic and anaerobic solid-state fermentations. Proc Biochem 29:13–24 Sexana RK (2006). Statistical optimization of medium components and growth conditions by response surface methodology to enhance lipase production by Aspergillus carneus. J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 40: 121-126. Soberón-Chávez G, Palmeros B. 1994. Pseudomonas lipases: molecular genetics and potential industrial applications. Crit Rev Microbiol 20(2): 95-105. (Inggris)


60

Sugihara A, Tani T, Tominaga Y: Purification and characterization of a novel thermostabel lipase from Bacillus sp. J Biochem 1991, 109:211-215. 28. Bora L, Kalita MC: Production and Optimization of Thermostabel lipase from a Thermophilic Bacillus sp LBN 4. The Internet J Microbiol 2007, 4(1):. Sun SY, Xu Y (2008). Solid-state fermentation for whole-cell synthetic lipase production from Rhizopus chinensis and identification of the functional enzyme. Process Biochem. 43: 219-224. Svendsen A. 2000. Lipase protein engineering. Biochem Biophys Acta 1543(2): 223228 :(Inggris) Svendsen A: Enzyme Functionality, Design, Engineering, and Screening New York: Marcel Dekker, Inc; 2004. Sztajer H, Maliszewska I, Wieczorek J: Production of exogenouslipases by bacteria, fungi, and actinomycetes. Enzyme Microb Technol 1988, 10:492-497. Teng Y, Xu Y (2008). Culture condition improvement for whole-cell lipase production in submerged fermentation by Rhizopus chinensis using statistical method. Bioresour. Technol. 99: 3900-3907. Vakhlu, J., dan Kour, A. 2006. Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning. Electronic Journal of Biotechnology, 9 (1). Variketta M., Namboodiri, H., and Chattopadhyaya, R. 2000.

Purification and

Biochemical Characterization of a Novel Thermostabel Lipase from Aspergillus niger, Paper no. L8402 in Lipids. 35, 495–502 Wang D, Xu Y, Shan T (2008). Effects of oils and oil-related substrats on the synthetic activity of membrane-bound lipase from Rhizopus chinensis and optimization of the lipase fermentation media. Biochem. Eng. J. 41: 30-37. Yagiz F, Kazan D, Akin AN (2007). Biodiesel production from waste oils by using lipase immobilized on hydrotalcite and zeolites. Chem. Eng. J. 134: 262267.

LAMPIRAN


Gambar Rhodotorula dalam media agar, dalam bentuk berkelompok, koloni tunggal, dan dalam agar miring

Gambar Tabung setelah fermentasi

61 UNIVERSITAS INDONESIA


Pemilihan Substrat substrat goreng jelantah olive

Absorbansi 0.3595 0.2855 0.305

Absorbasi pengukuran Aktifitas Sample Pada Pemilihan Suhu Optimum

Suhu Palm Oil 27 30 33 35 37 40

absorbansi

Suhu Olive Oil

Absorbansi

0.184 0.3935 0.35 0.118 0.052 0.108

27 30 33 37 40

Suhu Jelantah

0.182 0.305 0.211 0.102 0.181

Absorbansi 27 30 33 37 40

0.119 0.289 0.19 0.07 0.106

Absorbasi pengukuran Protein Sample Pada Pemilihan Suhu Optimum

ii Optimasi produksi..., Aditya Rinus Pratama Putra, FT UI, 2012

T Palm oil Absorbansi 27 0.092 30 0.142 33 0.1385 35 0.102 37 0.098 40 0.088 T Olive 27 30 33 37 40

Absorbansi 0.092 0.122 0.115 0.09902 0.112

T jelantah absorbansi 27 0.092 30 0.118 33 0.116 37 0.088 40 0.093

iii Optimasi produksi..., Aditya Rinus Pratama Putra, FT UI, 2012

Absorbansi pengikiran konsentrasi substrat

konsentrasi 1% 2% 4% 6% 10% 40%

konsentrasi 1% 2% 4% 6% 10% 40% 60%

absorbansi aktiftas U/ml aktifitas 0.282 0.503543241 0.4335 0.774063812 0.1645 0.293733557 0.152 0.271413378 0.112 0.199988805 0.148 0.264270921

Absorbansi Protein 0.389 0.58 0.311 0.296 0.29 0.261 0.2562

mg/ml 0.69631 1.0382 0.55669 0.52984 0.5191 0.46719 0.458598

iv Optimasi produksi..., Aditya Rinus Pratama Putra, FT UI, 2012

Model Respon Surface Dan Hasilnya

Model RSM 22/2 25/1 25/3 30/0.5 30/3.4 30/2 30/2 30/2 30/2 30/2 35/1 35/1 37/2

aktifitas protein absorbansi absorbansi rata2 rata2 0.0765 0.189199 0.116 0.172 0.107 0.188 0.205 0.2153 0.148 0.20833 0.3992 0.229 0.309 0.2212 0.292 0.224 0.3465 0.226 0.376 0.235 0.195 0.21 0.02775 0.154 0.0352 0.176

spesifik absorbansi

y aktifitas 0.048836 0.074052 0.068307 0.130868 0.09448 0.254841 0.197259 0.186407 0.221199 0.240031 0.124484 0.017715 0.022471

0.404336 0.674419 0.569149 0.95216 0.710411 1.743231 1.396926 1.303571 1.533186 1.6 0.928571 0.180195 0.2

U aktfias

y protein

0.11702 0.177443 0.163675 0.313584 0.226392 0.610647 0.47267 0.446666 0.530033 0.575158 0.298287 0.042449 0.053845

0.336774 0.30616 0.33464 0.383234 0.370827 0.40762 0.393736 0.39872 0.40228 0.4183 0.3738 0.27412 0.31328

Kurva standar Protein Konsentrasi Absorbansi 0.1

0.09175

0.2

0.16225

0.3

0.219

0.4

0.26175

0.5

0.3162

0.6

0.372

0.7

0.45

v Optimasi produksi..., Aditya Rinus Pratama Putra, FT UI, 2012

U protein 0.336774 0.30616 0.33464 0.383234 0.370827 0.40762 0.393736 0.39872 0.40228 0.4183 0.3738 0.27412 0.31328

unit/mili spesifik 0.347474 0.579574 0.489109 0.818257 0.610505 1.498079 1.200475 1.120249 1.317572 1.37499 0.797985 0.154854 0.171874

Kurva Standar Protein konsentrasi Proteim

0,8 y = 1,749x - 0,068 R² = 0,994

0,6 0,4 0,2 0 0

0,1

0,2

0,3

0,4

absrobansi

Kurva standar Aktifitas

absorbansi Konsentrasi 0.025

0

0.1882

0.01

0.301

0.02

0.448

0.03

0.63

0.04

0.78

0.05

0.882

0.06

0.9273

0.07

vi Optimasi produksi..., Aditya Rinus Pratama Putra, FT UI, 2012

0,5

Kurva Standar Aktifitas 0,07 y = 0,068x - 0,001 R² = 0,996

0,06

aktfitas

0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 -0,01 0

0,2

0,4

0,6

0,8

absorbansi

vii Optimasi produksi..., Aditya Rinus Pratama Putra, FT UI, 2012

1

UNIVERSITAS INDONESIA

Recommend Documents