UNIVERSITAS INDONESIA. Profil mikroba usus pada anak usia 2 12 tahun dengan diare dan non diare di Jakarta Utara, Indonesia

i

UNIVERSITAS INDONESIA

Profil mikroba usus pada anak usia 2 – 12 tahun dengan diare dan non diare di Jakarta Utara, Indonesia

TESIS TEGUH SARRY HARTONO NPM. 0806486060

PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS MIKROBIOLOGI KLINIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA JAKARTA

2014

Profil mikroba…, Teguh Sarry Hartono, FK UI, 2014

ii

UNIVERSITAS INDONESIA

Profil mikroba usus pada anak usia 2 – 12 tahun dengan diare dan non diare di Jakarta Utara, Indonesia

TESIS TEGUH SARRY HARTONO NPM. 0806486060

Diajukan di Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia Untuk Memenuhi Persyaratan Menjadi Dokter Spesialis Mikrobiologi Klinik

PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS MIKROBIOLOGI KLINIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA JAKARTA

2014


iii

Halaman Pernyataan Orisinalitas

Tesis ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar

Nama

: dr. Teguh Sarry Hartono

No. Mahasiswa

: 0806486060

Tanda tangan

:

Tanggal : 9 Desember 2013


iv

Lembar Pengesahan


v

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Indonesia, saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama

: dr. Teguh Sarry Hartono

NPM

: 0806486060

Program Studi : Pendidikan Dokter Spesialis Mikrobiologi Klinik Departemen

: Mikrobiologi Klinik

Fakultas

: Kedokteran.

Jenis karya

: Tesis

demi pengembangan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk memberikan kepada Universitas Indonesia Hak Bebas Royalti Noneksklusif (Non-exclusive RoyaltyFree Right) atas karya ilmiah saya yang berjudul :

Profil mikroba usus pada anak usia 2 – 12 tahun dengan diare dan non diare di Jakarta Utara, Indonesia beserta perangkat yang ada (jika diperlukan). Dengan Hak Bebas Royalti Noneksklusif ini Universitas Indonesia berhak menyimpan, mengalih media/formatkan, mengelola dalam bentuk pangkalan data (database), merawat, dan memublikasikan tugas akhir saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis/pencipta dan sebagai pemilik Hak Cipta. Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di

: Jakarta

Pada Tanggal : 9 Desember 2013 Yang menyatakan

( Teguh Sarry Hartono )


vi

KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah memberikan hidayah-Nya akhirnya tesis yang berjudul “Profil mikroba usus pada anak usia 2 – 12 tahun dengan diare dan non diare menggunakan Polymerase Chain Reaction / Electrospray Ionization- Mass Spectrometry (PCR/ESI-MS)” berhasil diselesaikan dengan baik. Ucapan terimakasih dan penghargaan setingi-tingginya penulis ucapkan kepada para pembimbing, guru-guru, rekan sejawat PPDS, rekan-rekan P3S kekhususan Mikrobiologi, staf administrasi dan laboratorium mikrobiologi. Khususnya kepada: 

dr. Lucky H Moehario, PhD, SpMK(K) sebagai pembimbing I atas bimbingan yang berharga bagi penyelesaian tesis ini. Terimakasih atas arahan yang sangat membuka wawasan berpikir dan memberikan motivasi penulis.



DR. Andi Yasmon, S.Pi sebagai pembimbing II atas bimbingan dan arahan dalam penulisan tesis ini. Perhatian atas detil penelitian ini yang sangat berharga bagi pengembangan penulisan tesis ini.



dr. Dewi Murniati, SpA sebagai pembimbing III atas arahan penulisan tesis ini. Terimakasih atas waktu yang diberikan di sela-sela kesibukan yang padat.



Prof. dr. Amin Soebandrio, Ph.D., SpMK(K) selaku Ketua Program Studi PPDS Mikrobiologi Klinik FKUI yang memberi kesempatan kepada penulis


vii

untuk

menimba ilmu mikrobiologi

dan dorongan semangat

dalam

menyelesaikan tesis ini. 

dr. R. Fera Ibrahim, MSc, PhD, SpMK(K) selaku Kepala Departemen Mikrobiologi FKUI yang telah mengijinkan penulis mempergunakan sarana dan prasarana Departemen dalam kelancaran studi dan penelitian.



dr. Yulia Rosa, SpMK dan DR. dr. Budiman Bela, SpMK(K) sebagai kepala LMK terdahulu serta dr. Anis Karuniawati, PhD, SpMK(K) selaku kepala LMK saat ini atas pemberian ijin penggunaan fasilitas laboratorium sebagai wahana belajar dan penelitian



Prof. dr. Usman Chatib Warsa, PhD, SpMK(K), Prof. dr. Agus Sjahrurachman, PhD, SpMK(K), Prof. dr. Amin Soebandrio, PhD, SpMK(K), Prof. dr. Pratiwi P Sudharmono, PhD, SpMK(K), dr. R. Fera Ibrahim, MSc, PhD, SpMK(K), dr. Lucky H Moehario, Ph.D., SpMK(K), dr. T. Mirawati Sudiro, Ph.D, dr. Anis Karuniawati, Ph.D., SpMK(K), dr. Mardiastuti HWK, M.Sc., SpMK(K), DR.dr. Budiman Bela, SpMK(K), dr. Yeva Rosana, SpMK(K), dr. Retno Kadarsih, SpMK (alm.), dr. Yulia Rosa, SpMK, Dra. Betty Ernawati, Ph.D, DR. Andi Yasmon, Andriansyah, Ssi., MBiomed., PhD, Dra. Conny Tjampakasari, Dra. Elizabeth Harahap, Dra. Ariani M. Biomed, Dra. Ikaningsih M.Biomed semua guru-guru atas ilmu, pengalaman, keteladanan dan inspirasi bagi penulis untuk menatap masa depan.


viii



Staf Dapur LMK, Ibu Lina, “the media expert” dan ibu semua orang, Mbak Sinta, Mas Ayub, Ibu Itje, Mbak Maria. Staf LMK, Bu Tatik, Mbak Aisyah, Mang Encep, Mang Aan, Mas Syarief, Mbak Linda, Mas Toyo, Mbak Yatmin. Teknisi, Mas Alfian yang setia menemani dari awal hingga selesai, Mbak Lolita, Mbak Nila. Staf administrasi, Mbak Tita Rosita, yang sangat membantu dan sangat pengertian, Mbak Wiwik, Mbak Hesti, Mbak Heni, Mbak Ayi dan Ayi, Pak Prawoto.



Dr. dr. Hj. Fatmawati, Direktur Utama Rumah Sakit Penyakit Infeksi Prof.Dr. Sulianti Saroso atas kepercayaan dan kepemimpinan yang diberikan mampu menyemangati penulis untuk menyelesaikan studi ini.



Dr. Tony Soetanto, SpPK, selaku Kepala Instalasi Laboratorium RSPI Prof Dr.Sulianti Saroso atas kesedian, bantuan dan kerjasamanya dalam melaksanakan penelitian di Instalasi Laboratorium RSPI Prof.Dr. Sulianti Saroso.



dr.Sanyoto Putro Pinardi, SpOT, yang telah memberikan pencerahan dan motivasi penulis untuk melanjutkan studi di bidang Mikrobiologi Klinik.



Dedy Supriyanto, S.Si dan Kak Linda Ria Uli S, S.Si, staf Laboratorium Penelitian RSPI Prof. Dr. Sulianti Saroso yang telah sangat membantu dan selalu bersama dalam suka dan duka di paboratorium penelitian.



Seluruh staf medis dan paramedik, khususnya di IGD, Poli Anak dan Bangsal Anak RSPI Prof. Dr. Sulianti Saroso yang telah membantu melakukan penelitian.


ix



Kepala Puskesmas beserta staf Puskesmas Kecamatan Pademangan, Kelurahan Sunter Agung, Kelurahan Sunter Jaya dan Kelurahan Papanggo I yang telah memberikan ijin dan bantuan dalam pelaksanaan pengumpulan sampel



“The courier” Ade yang selalu bersemangat mengambil dan mengumpulkan sampel.



Rekan-rekan seperjuangan dan senior, Mbak Leli, Mbak Iva, Enty, Hagni my best friend, Mbak Rina, Ka Dian, Arum, Delly, Mbak Hesty, Budi, Seto, Angky, Rini dan adik-adik kelas, hidup IRMK! Teman-teman dalam lab, Mas Mudin, Asri, Helen, Elly, Azmier gondrong dan lain-lain.



Yang tercinta almarhum Ibunda, akan doa, restu dan semangat yang diberikan

dan Bapak di

Joglo, penulis mohon dimaafkan jika selama

pendidikan melakukan kesalahan dan tindakan yang kurang berkenan. 

Yang tercinta almarhum Ibunda Siti Istiatun yang telah memberikan doa dan semangat kepada penulis dalam menyelesaikan studi ini.



Yang tercinta Mas Yogi, Mbak Prita, Mas Ade, Mba Ita, De Iyin, Koko, Uwi, Indah, Epi, Wulan, sebagai kakak dan adik yang selalu memberikan dukungan moril kepada penulis dalam menyelesaikan studi ini.



Adinta Anandani dan Bagas Afyad Anandya, istri dan putra penulis yang telah memberikan segalanya kepada penulis agar dapat menyelesaikan studi ini.


x



Semoga Allah SWT melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya kepada kita semua. Tesis ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu saran dan masukan sangat penulis harapkan.

Jakarta, 9 Desember 2013 Penulis


xi

ABSTRAK Nama : dr. Teguh Sarry Hartono Program studi : Pendidikan Dokter Spesialis Mikrobiologi Klinik Judul : Profil mikroba usus pada anak usia 2 – 12 tahun dengan diare dan non diare di Jakarta Utara, Indonesia Bakteri yang terdapat dalam usus manusia berada dalam keseimbangan dan memainkan peranan penting dalam fungsi metabolisme dan imunologi tubuh, Infeksi yang terjadi pada saluran cerna, seperti diare, dapat mengakibatkan terjadinya ketidakseimbangan pada komposisi bakteri usus tersebut. Pengetahuan mengenai profil mikroba usus pada kasus diare anak usia tertentu memiliki manfaat yang penting dalam memberikan informasi awal untuk pengembangan tata laksana kasus diare yang berkaitan dengan pengembalian keseimbangan mikroba usus.Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif analitik dengan disain potong lintang. Feses dikumpulkan dari dua kelompok subyek penelitian, dengan diare dan tanpa diare dari anak-anak usia 2-12 tahun di Jakarta Utara. Sampel kemudian di ekstraksi dengan kit QIAmp® DNA Stool Mini untuk kemudian dilakukan deteksi dan identifikasi bakteri dengan menggunakan polymerase chain reaction / Electrospray Ionization-Mass Spectrometry. Secara keseluruhan diperoleh 80 subjek, terdiri dari 33 anak-anak yang mengalami diare (subyek diare) dan 47 anak-anak yang tidak mengalami diare (subjek non-diare). Tiga puluh dari 33 sampel dalam kelompok diare terdeteksi keberadaan bakteri. Enam dari 33 sampel memberikan hasil multiple matches, sedangkan 3 sampel lainnya tidak terdeteksi adanya bakteri. Pada kelompok nondiare, di 28 dari 47 sampel terdeteksi adanya bakteri, hasil multiple matches pada 8 dari 47 sampel dan 13 sampel tidak terdeteksi adanya bakteri. Dalam kedua kelompok didominasi oleh Echerechia coli dan juga diikuti oleh Klebsiella pneumonia. Keragaman bakteri yang terdeteksi pada kelompok diare (12 dari 30 sampel) lebih dari pada kelompok non-diare (5 dari 28). Filum bakteri yang dideteksi pada kelompok sampel diare adalah Firmicutes (5 sampel), Proteobacteria (24), Bacteroidetes (1), dan di kelompok non diare adalah Actinobacteria (2), Proteobacteria (25), Verrucomicrobia (1). Hubungan antara enteropatogen dengan kejadian diare tidak signifikan secara statistik (p= 0,571, uji Chi-square), akan tetapi terdapat hubungan yang kuat antara risiko kejadian diare yang disebabkan oleh enteropatogen (OR = 0,724 dengan 95% CI: 0,237-2,215). Hasil penelitian menyimpulkan bahwa keragaman bakteri yang dideteksi pada kelompok diare lebih dari pada kelompok non-diare dengan adanya kesamaan dalam pola bakteri yang paling banyak terdeteksi pada kedua kelompok sampel, adanya temuan bakteri anggota filum Actinobacteria (Bifidobacterium longum) yang bersifat probiotik pada kelompok non diare dan tampaknya kemungkinan anak-anak yang positif enteropatogen pada fesesnya memiliki kecenderungan untuk mengalami diare dibandingkan dengan yang tidak. Kata kunci: mikrobiota usus, diare, PCR/ESI-MS


xii

ABSTRACT

Name : dr. Teguh Sarry Hartono Study Program : Specialist Program of Clinical Microbiology Title : Profiles of intestinal microbes in children aged 2-12 years with diarrhea and non-diarrhea in North Jakarta, Indonesia Microbiota present in the human intestinal are diverse and play important roles in metabolism and immunology. Infection that occurs in gastrointestinal tract, may lead to an imbalance in the composition of the intestinal bacteria. Knowledge on the intestinal microbes profile in children at spesific age with and without diarrhea might shed a light in the management of diarrhea associated with intestinal microflora imbalance. The objective this study is to obtain a profile of intestinal bacteria in children at spesific age with diarrhea and non-diarrhea which may be important for initial information in management of diarrhea associated intestinal microbes imbalance.This study was an analitical descriptive with cross sectional design. Stool samples were collected from two groups of subjects, with diarrhea and without diarrhea in children of 2-12 years old in North Jakarta. The samples were extracted using QIAamp® DNA Stool Mini Kit first followed by detection and identification using Polymerase Chain Reaction / Electrospray Ionization-Mass Spectrometry. A total 80 subjects were obtained, consisted of 33 children with diarrhea (diarrhea subjects) and 47 children without diarrhea (non-diarrheal subjects). Thirty of the 33 stool samples in diarrhea group showed the presence of one species microorganism (complete match), 6 samples resulted in multiple matches, while the other three samples did no show any bacteria. In the non-diarrhea group, of total 47 stool samples, 28 showed the presence of single match bacteria, 8 specimens gave result of multiple matches and 13 specimens showed no detectable bacteria. In both groups Echerechia coliand Klebsiella pneumonia appeared to be dominant. The bacteria present in the diarrhea group (12 of 30 samples) were more diverse than in nondiarrheal group (5 of 28).Phyla found in diarrhea group consisted of Firmicutes (5 samples), Proteobacteria (24), Bacteroidetes (1), while in non-diarrhea group were Actinobacteria (2), Proteobacteria (25), Verrucomicrobia (1). The conclusion is bacteria detected in diarrhea group apparently were more diverse than in nondiarrhea. There was similarity in the pattern of most detected bacteria in both sample groups, however, member of Actinobacteria (Bifidobacterium longum) where detected only in non-diarrhea group. Likely the chance of children with enteropathogen detected in the stool would have diarrhea more than children with no enteropathogen detected.

Keywords: gut microbiota, diarrhea, PCR/ESI-MS


xiii

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................... LEMBAR PENGESAHAN ......................................................................... LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ................... KATA PENGANTAR ................................................................................. ABSTRAK ................................................................................................... DAFTAR ISI ............................................................................................... DAFTAR GAMBAR ................................................................................... DAFTAR TABEL ............................................................................ DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... I. PENDAHULUAN .................................................................................... 1.1 Latar Belakang .................................................................................... 1.2 Rumusan Masalah ............................................................................... 1.3 Pertanyaan Penelitian ......................................................................... 1.4 Tujuan Penelitian ................................................................................ 1.4.1. Tujuan Umum ........................................................................... 1.4.2.Tujuan khusus ............................................................................ 1.5 Manfaat Penelitian ..............................................................................

ii iv v vi xi xiii xv xvi xvii 1 1 4 4 4 4 5 5

II. TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 2.1 Mikrobiota Usus ............................................................................... 2.2 Suksesi mikrobial ............................................................................. 2.3 Peranan mikrobiota usus pada kesehatan ......................................... 2.3.1 Dampak mikrobiota usus pada proses metabolik .... 2.3.2 Peran mikrobiota usus terhadap efek protektif pada epitel usus ......................................................................................... 2.4 Mikroba usus dan mekanisme pertahanan pejamu ......................... 2.4.1 Perubahan keseimbangan yang diinduksi oleh antibiotik ...... 2.4.2 Efek infeksi/inflamasi terhadap keseimbangan mikroba usus 2.4.3 Peran keseimbangan mikroba usus terhadap patogenesitas Infeksi ..................................................................................... 2.5 Diare ................................................................................................. 2.6 PCR dan PCR-ESI/MS .................................................................... 2.7 Panel Pemeriksaan PLEX-ID Broad Bacteria ........................... Kerangka Teori ............................................................................................ Konsep Penelitian ........................................................................................

6 6 7 8 9 9

III. METODOLOGI PENELITIAN ........................................................... 3.1 Desain penelitian ............................................................................ 3.2 Waktu dan tempat penelitian .......................................................... 3.3 Alur Penelitian ............................................................................... 3.4 Subyek Penelitian ...........................................................................


10 11 12 14 15 17 19 22 23 24 24 24 25 25

xiv

3.5 Kriteria inklusi dan eksklusi ......................................................... 3.5.1 Kriteria inklusi untuk subyek diare ................................... 3.5.2 Kriteria inklusi untuk subyek non diare ............................ 3.5.3 Kriteria eksklusi untuk kedua kelompok subyek penelitian 3.6 Penentuan besar sampel .............................................................. 3.7 Pengumpulan sampel .................................................................... 3.8 Pengelolaan sampel ...................................................................... 3.9 PCR-ESI/MS ............................................................................... 3.9.1 Ekstraksi DNA .................................................................... 3.9.2 Uji inhibitor ......................................................................... 3.9.3 Deteksi dan identifikasi mikroba usus dengan PLEX-ID Panel Broad Bacteria .......................................................... 3.10 Analisa Data ...............................................................................

26 26 26 26 26 27 29 29 29 30 31

4

HASIL PENELITIAN .............................................................. 4.1 Profil demografi subyek penelitian .............................................. 4.2 Presentasi klinis diare ................................................................... 4.3 Hasil Ekstraksi DNA sampel ........................................................ 4.4 Uji inhibitor pada sampel ............................................................. 4.5 Hasil PLEX-ID ........................................................................... 4.5.1 Hasil deteksi bakteri pada sampel ..................................... 4.5.1.1 Hasil multiple matches ........................................... 4.5.1.2 Hasil tidak terdeteksi ............. ................................. 4.6 Karakteristik klinis diare berdasarkan bakteri yang dideteksi .....

33 33 33 35 35 36 37 41 42 43

5

PEMBAHASAN ................................................................................... 5.1 Pengambilan dan penyimpanan spesimen .................................... 5.2 Karakteristik subyek penelitian .................................................... 5.3 Hasil ekstraksi DNA dan uji inhibitor ........................................... 5.4 Hasil PLEX-ID ............................................................................. 5.5 Keragaman bakteri yang terdeteksi .............................................. 5.6 Tinjauan klinis berdasarkan bakteri patogen yang terdeteksi .... 5.7 Keterbatasan penelitian ................................................................

47 47 47 48 49 49 52 54

6

KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................ 6.1 Kesimpulan ................................................................................... 6.2 Saran .............................................................................................

55 55 55

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. LAMPIRAN

56


32

xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Interaksi mikroba usus dengan sistem pencernaan pejamu Gambar 2.2. Kondisi yang terjadi akibat gangguan ekosistem usus Gambar 2.3. Filum bakteri utama pada beberapa lokasi anatomis tubuh manusia Gambar 2.4 Alur electrospray mass ionization dan pembacaan hasilnya

Gambar 2.5 Cakupan deteksi bakteri panel PLEX-ID Broad Bacteria Gambar 2.6 Hasil keluaran setiap sampel dari PLEX-ID Broad Bacteria pada lembar laporan hasil Gambar 3.1 Kit pengumpulan sampel Gambar 4.1. Hasil elektroforesis terhadap beberapa sampel produk ekstraksi Gambar 4.2. Hasil elektroforesis terhadap beberapa sampel produk ekstraksi untuk uji inhibitor pada sampel Gambar 4.3. Laporan pada lembar hasil PLEX-ID Gambar 4.4. Grafik perbandingan filum berdasarkan jumlah bakteri yang dideteksi pada kelompok sampel diare dan non diare Gambar 4.5 Contoh sampel hasil PLEX-ID yang negatif tetapi memberikan hasil positif pada PCR konvensional


xvi

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1. Profil subyek penelitian Tabel 4.2. Presentasi klinis subyek diare Tabel 4.3. Macam hasil deteksi PLEX-ID Tabel 4.4. Bakteri yang dideteksi PLEX-ID pada sampel diare dan sampel non diare Tabel 4.5. Hasil deteksi PLEX-ID dengan hasil multiple matches Tabel 4.6. Karakteristik klinis diare berdasarkan bakteri yang dideteksi Tabel 4.7. Tabulasi silang antara enteropatogen dan diare


xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Penjelasan dan form persetujuan penelitian (untuk subyek penelitian dengan diare) Lampiran 2. Penjelasan dan form persetujuan penelitian (untuk subyek penelitian tanpa diare) Lampiran 3. Form persetujuan Lampiran 4. Data pasien Lampiran 5. Hasil deteksi bakteri dengan data karakteristik klinis yang diperoleh pada sampel diare Lampiran 6. Hasil deteksi PLEX-ID pada sampel diare dan non diare Lampiran 7. Perhitungan statistik dengan SPSS


1

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Pada abad 400 SM, Hippocrates menyatakan bahwa “kematian terletak di dalam usus” dan “pencernaan yang tidak baik adalah sumber dari segala keburukan”. Hal ini menunjukkan peranan penting saluran pencernaan pada kesehatan manusia telah lama diketahui. Dalam beberapa dekade, sebagian penelitian mengenai dampak bakteri dalam saluran pencernaan terfokus pada patogen dan bagaimana mekanisme penyakitnya. Akan tetapi saat ini telah terjadi peningkatan penelitian tentang pengaruh adanya mikroba komensal dalam usus mamalia.1

Secara nyata semua

organisma multiseluler, termasuk manusia, hidup

berdampingan dengan mikroba di sekitarnya. Tubuh manusia dihuni oleh sejumlah

besar

bakteri,

archaea

dan

eukariota

uniseluler.

Kumpulan

mikroorganisme yang hidup berdampingan di dalam tubuh pejamunya dikenal sebagai

mikrobiota,

mikroflora,

atau

flora

normal.

Namun

peranan

mikroorganisme dan eukariota uniseluler tersebut pada tubuh mamalia masih banyak yang belum dipahami.1 Diperkirakan bahwa mikrobiota manusia mengandung 1014 sel bakteri.1,2 Mikroba ini berkolonisasi di setiap permukaan tubuh manusia yang terpapar dengan lingkungan eksternal. Mikroba hidup di kulit, saluran pernapasan, saluran kemih dan saluran pencernaan. Kolonisasi mikroba terbanyak berada di saluran pencernaan, yang di kolon saja diperkirakan mengandung lebih dari 70% mikroba tubuh manusia.1

Proses yang terlibat dalam pembentukan populasi mikroba sangatlah kompleks, melibatkan perubahan mikroba sesuai dengan interaksi mikroba dan pejamunya yang pada akhirnya menjadi populasi stabil dan menetap pada daerah tertentu di usus.3 Kolonisasi mikroba di usus manusia dimulai segera setelah lahir. Pada saat


2

persalinan melalui jalan lahir, bayi telah terpapar dengan suatu populasi mikroba yang kompleks. Bukti bahwa adanya kontak segera dengan mikroba selama persalinan dapat mempengaruhi perkembangan mikroba usus adalah adanya fakta bahwa mikroba usus bayi dan mikroba vagina ibu menunjukkan kemiripan. Selain itu, kenyataan bahwa bayi yang dilahirkan melalui operasi sesar mempunyai komposisi mikroba yang berbeda dibandingkan dengan mikroba vagina ibu.1

Bakteri yang berkolonisasi di usus besar pada awalnya adalah bakteri anaerob fakultatif seperti E.coli dan Streptococcus spp. Kolonisasi ini kemudian memetabolisme setiap oksigen dalam usus sehingga menjadikan lingkungan di tempat tersebut berada dalam kondisi anaerob. Kolonisasi selanjutnya ditentukan oleh pola pemberian makanan bayi. Faktor-faktor seperti mikroba traktus genital ibu, sanitasi, teknik persalinan dan tipe pemberian makanan pada bayi, memberikan dampak segera terhadap kadar maupun frekuensi dari bermacammacam spesies yang berkolonisasi di usus bayi. Fase akhir dari akuisisi mikroba adalah pada saat penyapihan, saat berkembangnya mikroflora yang kompleks.1

Mikroba usus normal didominasi oleh bakteri anaerob. Secara total, mikroba usus terdiri dari sekitar 500-1,000 spesies, yang menariknya adalah sebagian besar hanya dimiliki oleh beberapa filum bakteri. Filum bakteri yang paling banyak terdapat dalam usus manusia adalah Firmicutes dan Bacteriodetes,4 yaitu berjumlah sekitar 64% dan 23% dari seluruh spesies bakteri yang ada pada usus normal. Sedangkan filum lain yaitu Proteobacteria berjumlah sekitar 8%, dan Actinobacteria3%.5 Spesies lain dengan jumlah yang lebih sedikit merupakan anggota dari filum Verrumicrobia, Fusobacteria dan Cyanobacteria.4,5Adanya mikroba pada saluran pencernaan juga berperan dalam mencegah terjadinya kolonisasi bakteri patogen. Telah banyak penelitian, yang menyumbangkan pengetahuan tentang identifikasi spesies-spesien bakteri yang berbeda-beda dengan aktivitas antagonistik terhadap bakteri patogen.

Diare merupakan penyebab utama morbiditas dan mortalitas dengan lebih dari 1,8 juta anak di bawah 5 tahun menderita karenanya yang 19% diantaranya


3

menyebabkan kematian.6 Salah satu penyebab diare adalah adanya infeksi bakteri patogen. Bakteri patogen penyebab diare yang penting adalah Escherichia coli diaregenik, Salmonella sp, Shigella sp, Yersinia sp, Campylobacter sp, dan Vibrio cholerae.7 Di Indonesia, bakteri patogen penyebab diare pada anak dan dewasa adalah Shigelle flexneri,

Salmonella spp, Vibrio spp,

Shigella sonei,

Campylobacter jejuni dan Shigella dysenteriae.8 Dalam suatu studi epidemiologi lainnya yang dilakukan di tiga Puskesmas di Jakarta, Indonesia didapatkan isolat Shigella spp, Vibrio cholera O1, Salmonella spp dan Campylobacter spp sebagai bakteri penyebab diare.9

Komposisi mikroba usus pada kasus diare anak usia 2-12 tahun belum pernah dilakukan di Indonesia. Pengetahuan mengenai profil mikroba usus pada kasus diare anak usia 2-12 tahun memiliki manfaat yang penting dalam memberikan gambaran informasi awal untuk pengembangan tata laksana kasus diare.

Ada berbagai teknik untuk mempelajari mikrobiota usus. Penggunaan metode kultur dalam penelitian mikroba usus sulit karena mayoritas bakteri dalam usus adalah anaerob dan diperkirakan bahwa lebih dari 80% mikrobiota usus tidak dapat ditumbuhkan dalam kondisi laboratorium standar.1 Metode lain dengan kemampuan yang lebih adekuat adalah dengan sekuensing gen 16S rRNA lengkap,10 denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) yang digunakan oleh Zoetendal dkk untuk mengidentifikasikan perbedaan komunitas bakteri di kolon dan di feses pada pasien kolitis ulseratif,11 dan fluorescent in situ hybridization terhadap kelompok bakteri tertentu.12

Teknologi lainnya yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi sejumlah besar mikroorganisme adalah dengan Polymerase Chain Reaction diikuti dengan Elektrospray Ionization/ Mass Spectrometry ( PCR / ESI - MS ). Prinsip teknologi ini didasarkan pada teknik PCR, dengan menggunakan multiprimer dan pembacaan dari produk PCR menggunakan teknologi dispersi dan elektro ionisasi spektrometri massa. Teknologi ini telah dilakukan untuk mendeteksi beberapa


4

mikroorganisme patogen dan non patogen.13,14 Dalam penelitian ini, digunakan teknologi Ibis PLEX-ID dari Abbott, yang merupakan suatu PCR / ESI - MS.

Pada penelitian ini profil mikroba usus pada kasus diare anak usia 2-12 tahun dideteksi dengan menggunakan tehnik PCR/ESI-MS, kemudian dibandingkan dengan profil mikroba pada anak yang tidak mengalami diare (non diare) sehingga diharapkan dapat diperoleh informasi awal dalam pengembangan tata laksana kasus diare.

1.2. Rumusan Masalah

Morbiditas dan mortalitas akibat diare cukup tinggi pada anak-anak. Diare tersebut dapat diakibatkan adanya infeksi bakteri patogen yang dapat menggangu keseimbangan mikrobiota dalam usus. Dengan mengetahui bagaimana profil bakteri pada anak yang mengalami diare dan anak non diare diharapkan dapat menggambarkan perbedaan profil mikroba usus pada anak diare dengan yang tidak mengalami diare (non diare).

1.3. Pertanyaan Penelitian

Apakah ada perbedaan profil mikroba usus pada anak diare dengan yang tidak mengalami diare (non diare)?

1.4 Tujuan Penelitian

1.4.1. Tujuan Umum :

Mendapatkan profil mikroba usus pada anak usia 2-12 tahun yang mengalami diare dan yang tidak mengalami diare (non-diare).


5

1.4.2.Tujuan khusus :

1. Mendapatkan profil mikroba usus pada anak usia 2-12 tahun yang mengalami diare dengan menggunakan teknologi PCR/ESI-MS 2. Mendapatkan profil mikroba usus pada anak usia 2-12 tahun yang tidak mengalami diare (non diare) dengan menggunakan teknologi PCR/ESIMS 3. Mendapatkan hubungan adanya enteropatogen pada kejadian diare.

1.5. Manfaat Penelitian

Manfaat yang bisa didapatkan dari penelitian ini adalah dapat memberikan informasi awal dalam pengembangan tata laksana diare dan mengetahui patofisiologi dan pathogenesis diare yang disebabkan oleh bakteri.


6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Mikrobiota Usus

Sejak lahir hingga mati, manusia selalu dalam keadaan kontak dengan mikroba, baik sementara maupun menetap. Secara nyata, setiap permukaan kulit dan mukosa di tubuh manusia terkolonisasi oleh mikroba residen yang menetap. Di sebagian besar relung dalam tubuh manusia, termasuk rongga mulut, esofagus, kolon ataupun kulit, mengandung banyak spesien bakteri. Distribusi mikroba ini bukanlah suatu kebetulan karena setiap relung terkolonisasi mikroba baik yang lestari (conserved) di sebagian besar manusia, ataupun secara khusus tergantung kondisi tertentu (host spesific).15

Mikroba yang mendiami saluran pencernaan mempunyai kepadatan populasi yang tinggi dengan viariasi yang sangat besar dan interaksi yang kompleks.3 Bakteri usus normal didominasi oleh bakteri anaerob yang jumlahnya 100-1000 kali bakteri aerob dan fakultatif aerob. Secara keseluruhan mikrob usus terdiri dari kira-kira 500-1000 spesies,4 walaupun analisis dari suatu penelitian yang melibatkan multipel subyek memberikan proyeksi bahwa mikrobiota usus manusia seluruhnya mengandung lebih dari 35000 spesies bakteri. Hampir semua spesies tersebut (98%) hanya dimiliki oleh empat filum bakteri: Firmicutes (64%),Bacteroidetes (23%), Proteobacteria (8%), dan Actinobacteria (3%).5 Spesies lain yang ada, merupakan anggota dari filum Verrumicrobia, Fusobacteria dan Cyanobacteria.4

Mikrobiota usus tidaklah homogen. Jumlah sel bakteri yang ada dalam usus mamalia menunjukkan peningkatan mulai dari 101 hingga 103 bakteri per gram kandungan dalam lambung dan duodenum, menjadi 104 hingga 107 sel per gram dalam jejunum dan ileum, dan mencapai puncaknya menjadi 1011 hingga 1012 sel dalam kolon. Selain itu komposisi mikrobiota juga berbeda pada lokasi-lokasi tersebut. Frank dkk melaporkan bahwa perbedaan jumlah kelompok bakteri pada


7

lokasi anatomis yang berbeda ketika membandingkan sampel biopsi dari usus kecil dan kolon dari individu sehat. Sampel dari usus kecil benyak mengandung bakteri dari kelas Bacilli dari filum Firmicutes, dan kelas Actinobacteria. Sebaliknya famili Bacteroidetes dan Lachnospiraceae dari filum Firmicutes lebih banyak jumlahnya di sampel dari kolon.5 Disamping adanya heterogenesitas longitudinal, ada juga variasi latitudinal dari komposisi mikrobiota. Epitel usus dipisahkan dari lumen oleh suatu lapisan mucus tebal dan secara psikokimia komplek. Mikrobiota yang berada dalam lumen intestinal berbeda secara signifikan dari mikrobiota yang melekat dan tertanam dalam lapisan mucus tersebut. Dalam suatu studi, Swidsinski dkk menemukan bahwa banyak spesies bakteri yang berada dalam lumen usus tidak mengakses lapisan mukus dan kripta epitel. Sebagai contoh Bacteroides, Bifidobacterium, Streptococcus, anggota Enterobacteriacea, Enterococcus, Clostridium, Lactobacillus, danRuminococcus semuanya ditemukan di feses, sementara hanya Clostridium, Lactobacillus, dan Enterococcus yang dideteksi di lapisan mukus dan kripta epitel usus kecil.16

2.2 Suksesi mikrobial

Perkembangan mikrobiota pada bayi dibagi menjadi empat fase terpisah menurut Cooperstock and Zedd. Fase 1 adalah akuisisi awal selama 1-2 minggu pertama, fase 2 adalah periode sisanya dengan ASI eksklusif, fase 3 adalah waktu antara awal pemberian makanan tambahan dan penyapihan ASI dan fase 4 adalah perubahan menjadi pola biota dewasa yang dimulai setelah penyapihan ASI selesai seluruhnya. Temuan yang konsisten adalah bahwa semua bayi pada awalnya terkolonisasi dengan sejumlah besar E. coli dan Streptococci, seringkali mencapai 108–1010/gr feses. Bakteri--bakteri tersebut diketahui bertanggung jawab dalam terciptanya lingkungan yang kurang menguntungkan untuk pertumbuhan genus anaerob Bacteroides, Bifidobacterium dan Clostridium pada hari 4-7. Pada bayi-bayi yang disusui pengurangan jumlah E. coli dan Streptococci, berkaitan dengan dominasi mikrobiota feses oleh Bifidobacteria. Sekali mendapatkan asupan makanan tambahan dimulai, profil bakteri pada bayi yang disusui menyerupai bayi yang mendapatkan susu formula sehingga


8

Bifidobacteria tidak lagi dominan. Selama fase 3 dan 4, setelah pengenalan makanan padat dan penyapihan, secara berurutan, perbedaan antara bayi yang menyusui dengan yang mendapatkan susu formula menjadi tidak ada lagi dan mikrobiota pada feses menyerupai orang dewasa pada kira-kira tahun kedua kehidupan.3 Mayoritas bakteri dalam usus orang dewasa adalah bakteri anaerob yang tidak membentuk spora, yang didominasi oleh Bacteroides spp. Bifidobacterium spp., Eubacterium spp., Clostridium spp., Lactobacillus spp., Fusobacterium spp dan beberapa bakteri Gram positif kokus. Bakteri yang berada dalam

jumlah

yang 2

Enterobacteriaceae.

lebih

sedikit

adalah

Enterococcus

spp.

Dan

Jumlah Bacteroides and bakteri Gram-positif kokus

(Peptococci dan Peptostreptococci) meningkat secara bertahap selama fase 3 dan 4. Selain itu pula, banyak kelompok bakteri lainnya termasuk Eubacteria, Veillonella, Staphylococci, Propionibacteria, Bacilli, Fusobacteria,dan ragi yang ada pada orang dewasa juga dapat dideteksi pada bayi. Pada umumnya, fluktuasi dalam populasi mikrobiota lebih banyak terjadi pada bayi daripada orang dewasa, yang makin besar dari hari ke hari dan dengan variasi yang diinduksi oleh diet. Secara relatif, sejumlah kecil susu formula tambahan yang diberikan kepada bayibayi yang menyusui akan menghasilkan pergesaran dari pola menyusui ke pola pemberian susu formula. Ada juga beberapa pandangan terhadap variasi Bifidobacteria yang terdeteksi. Pada beberapa bayi tidak terdeteksi adanya Bifidobacteria hingga makanan padat diberikan, dengan lebih banyak ketiadaan Bifidobacteria pada bayi yang mendapat susu formula dibandingkan yang menyusui. Sering, bayi-bayi yang tidak terdeteksi Bifidobacteria padanya, mempunyai sejumlah besar Bacteroides, Clostridia dan E. coli.3

2.3 Peranan mikrobiota usus pada kesehatan

Peranan flora usus normal pada kesehatan manusia muncul sebagai suatu dampak pada proses metabolik, pertumbuhan villus dan mikrovillus, suplai darah dan perkembangan jaringan limfoid berkaitan dengan usus atau gut-associated lymphoid tissue (GALT). Mikroflora pada usus normal juga mempengaruhi stimulasi produksi sel pensekresi IgA dan meningkatkan kadar IgA sekretori


9

(sIgA), demikian pula pada permukaan mukosa dan mempertahankan fungsi seleksi epitalial dan sawar perlindungan.17

2.3.1 Dampak mikrobiota usus pada proses metabolik

Banyak bakteri yang berkolonisasi di usus manusia mengandung enzim yang membuat mereka memfermentasi karbohidrat yang tidak dapat dicerna seperti pati, selulosa, hemiselulosa, pektin atau oligosakarida yang lolos dari pencernaan di saluran cerna bagian atas. Produk akhir metabolisme dari fermentasi karbohidrat adalah asam lemak rantai pendek atau short-chain fatty acids (SCFAs): acetate, butyrate dan propionate yang mempunyai efek tropik pada sel epitel usus dan memainkan peranan penting sebagai sumber energi untuk kolonosit. SCFA berperan penting dalam mempertahankan integritas mukosa kolon dan mencegah translokasi bakteri, juga untuk menstimulasi proliferasi sel epitel usus.17

2.3.2 Peran mikroba usus terhadap efek protektif pada epitel usus

Bakteri usus berperan penting dalam mencegah kolonisasi mikroba patogen di epitel usus. Beberapa mekanisme yang berimplikasi pada proses tersebut termasuk kompetisi untuk mendapatkan nutrien dan tempat perlekatan, dan produksi bakteriosin

polipeptida

yang

menghambat

pertumbuhan

kompetitornya

(patogen).17

Proteksi usus manusia oleh bakteri komensal terhadap patogen eksogen adalah suatu fenomena yang dikenal dengan resistensi kolonisasi dan dikatakan sebagai hasil dari inhibisi langsung dari bakteri. Akan tetapi, penelitian-penelitian saat ini telah menunjukkan bahwa bakteri komensal dapat juga secara langsung nmengendalikan patogen yang menyusup melalui peningkatan imunitas pejamu dalam usus (dikenal sebagai resistensi kolonisasi diperantarai imun). Kolonisasi mikroba pada usus mendorong pengembangan populasi sel imun yang berperan dalam proses kekebalan bawaan dan yang didapat. Bakteri komensal yang


10

mengatur imunitas dan yang dengan demikian memberikan kekebalan terhadap patogen usus yang kebal terhadap antibiotik mulai diidentifikasi pada filum yang merupakan mayoritas dari bakteri usus; Bacteroidetes, Firmicutes dan Actinobacteria.

Filum Bacteroidetes mengandung spesies-spesies

yang melindungi usus dari

infeksi patogen. Bacteroides thetaiotaomicron merupkan antagonis patogen usus melalui pengaturan mekanisme aktivasi sistem imun tubuh dan interaksi langsung dengan bakteri usus lainnya. Pada mencit bebas kuman yang dikolonisasikan dengan B. thetaiotaomicron dan Bifidobacterium longum memicu ekspresi IFNtipe I yang menginduksi GTPases yang berkaitan denganj infeksi virus. B.thetaiotaomicronmen sekresi faktor solubel yang menekan produksi toksin enterohaemorrhagic E. coli, yang mensiratkan bahwa bakteri komensal dapat saja mengatur sistem imun terhadap proses inflamasi patologik akibat patogen usus. Analisis bakteri pada tikus percobaan dengan infeksi C. difficile memperlihatkan penurunan berlimpahnya populasi Firmicutes dan peningkatan jumlah populasi Proteobacteria yang berhubungan dengan makin beratnya penyakit.18

2.4 Mikroba usus dan mekanisme pertahanan pejamu

Mikroba usus berperan pada berbagai aspek pertahanan tubuh pejamu terhadap invasi patogen, baik melalui efek antagonis mikrobial dan juga dengan pematangan sistem imun intestinal. (Gambar 2.1) Beberapa hasil metabolisme bakteri mempunyai efek sebagai antimikroba, seperti peroksida dan berbagai asam.19 Alakomi dkk mengemukakan bahwa beberapa zat tersebut tidak hanya dapat menghambat pertumbuhan patogen tetapi juga mampu untuk meningkaykan potensiasi keefektifan antimikroba lainnya.20 Hal lain yang dapat mencegah berdiamnya patogen di dalam pejamu adalah adanya pembentukan surfaktan21 dan adanya kompetisi pada lokasi perlekatan dan kebutuhan terhadap nutrisi.22

Penelitian lain mengenai peranan kelompok bakteri atau spesies bakteri terhadap berbagai aspek imun intestinal menunjukkan: adanya antigen polisakarida dari


11

Bacteroides fragilis yang memicu ekspansi sel T CD4 dan mengatur produksi sitokin

Th1/Th2,23

Bacteroides

thetaiotaomicron

menginduksi

ekspresi

angiogenin dengan aktivitas bakterisidal terhadap mikroba usus,19 Lactobacillus menstimulasi sel dendritik untuk mengaktivasi sel Natural Killer (NK) dan peranan segmented filamentous bacteria (SFB) terhadap induksi IgA intestinal,24 dan aktivasi limfosit intra epitelial serta induksi ekspresi MHC II pada sel epitel usus.25

SFB sendiri merupakan bakteri komensal yang ada di sejumlah mamalia dan mempunyai gen 16S rRNA yang berhubungan erat dengan Clostridia. SFB ini telah diketahui mempunyai sejumlah fungsi stimulasi sistem imun dan muncul di usus kecil setelah masa penyapihan.26

Gambar 2.1 Interaksi mikroba usus dengan sistem pencernaan pejamu untuk menstimulasi maturasi imun mukosa dan menyediakan resistensi kolonisasi terhadap invasi. Beberapa contoh bakteri yang berkontribusi dengan menginduksi beberapa aspek imun mukosa juga ditampilkan.19

2.4.1 Perubahan keseimbangan yang diinduksi oleh antibiotika

Pentingnya keseimbangan mikroba dalam tubuh mudah dipahami dengan mempertimbangkan efek merugikan pada pemberian antibiotik. Beberapa penelitian menunjukkan efek samping dari antibiotik yang berbeda terhadap mikroba usus, baik pada manusia maupun hewan coba. Satu contoh terbaik mengenai komplikasi yang timbul akibat terapi antibiotik adalah diare terkait


12

pemberian antibiotik (antibiotic-associated diarrhea), yang terjadi akibat pertumbuhan patologik dari Clostridium difficile pada saluran cerna.1 Pengobatan diare akibat C. difficile dengan kombinasi vancomycin dan probiotik ragi memperlihatkan hasil yang lebih efektif bila dibandingkan dengan vancomyin sendiri.27 Selain itu pula, pemberian probiotik bakteri pada sukarelawan sehat yang meminum amoksisilin menghasilkan pengurangan yang bermakna kejadian diare pada subyek yang diteliti28 menunjukkan bahwa usaha pengembalian keseimbangan mikroba usus dapat mengurangi kejadian diare terkait antibiotik.

Hal lainya yang dapat terjadi akibat gangguan keseimbangan mikroba usus pada anak-anak adalah meningkatnya resiko intususepsi usus yang berkaitan erat dengan penggunaan antibiotik pada neonatus29 dan juga berkaitan dengan terjadinya kegagalan fungsi organ berganda akibat tereduksinya keragaman mikroba usus dan pertumbuhan berlebihan dari Enterococcus spp pada pasienpasien yang mendapatkan terapi di unit perawatan intensif.30

2.4.2 Efek infeksi/inflamasi terhadap keseimbangan mikroba usus

Di lain sisi, walaupun dengan segala mekanisme protektif yang ada, manusia kadang kala juga menjadi korban dari invasi patogen enterik, termasuk bakteri dan virus.1 Infeksi enterik dapat terjadi baik hasil karena tubuh menghadapi patogen sebenarnya atau patogen oportunis, atau karena adanya pertumbuhan patologis dari mikroba dalam komunitas mikroba usus. Agar suatu infeksi dapat berhasil, agen infeksi harus menghadapi sejumlah sistem pertahanan tubuh pejamu, seperti imunitas mukosa atau ressistensi kolonisasi yang dibuat oleh mikroba usus normal.23 Kondisi yang terjadi akibat infeksi/inflamasi serta gangguan terhadap keseimbangan mikroba terangkum dalam gambar 2.2.

Kolonisasi mukosa usus oleh bakteri patogen enterik menyebabkan terjadinya induksi respon inflamantori yang kuat yang sebenarnya bertujuan untuk mengendalikan paparan patogen tersebut. Akan tetapi respon inflamasi tersebut ternyata juga memperlihatkan efek menurunkan viabilitas mikroba usus yang


13

mengakibatkan bakteri patogen mengokupasi lokasi tersebut. Sejumlah patogen, semuanya dari filum Proteobacteria menunjukkan kemampuan menggunakan mekanisme

tersebut

untuk

memaksimalkan

efek

infeksinya.

Famili

Enterobacteriaceae menyebabkan pengurangan jumlah total mikrobiota usus karena efek yang diperantarai reaksi inflamasi tersebut dan mempermudahnya untuk berkolonisasi di lokasi tersebut.1

Gambar 2.2 Kondisi yang terjadi akibat gangguan pada ekosistem usus19

Komposisi mikroba pejamu dapat diubah oleh proses infeksi, khususnya bakteri komensal anaerob obligat yang sangat dipengaruhi. Pada saat yang sama, proses inflamasi mukosa usus juga menunjukkan dapat memicu pertumbuhan yang berlebihan Enterobacteriaceae dari komensal menjadi patogen.31 Lupp dkk melakukan penelitian dengan menginfeksikan tikus percobaan menggunakan Citrobacter rodentium, patogen enterik dari tikus, sebagai model infeksi enterohaemorrhagik E.coli (EHEC), yang hasilnya memperlihatkan terjadi pengurangan jumlah total koloni mikroba usus dan secara nyata merubah komposisi dari mikroba usus alami.31

Beberapa penelitian lainnya (Kuehl dkk, 2005; Aebischer dkk,. 2006) menyebutkan bahwa pada infeksi spesies-spesies Helicobacter juga menunjukkan perubahan komposisi dari komunitas mikroba alami pada pejamu, dengan terjadinya pengurangan keragaman dan jumlah mikrobiota pada saluran cerna bagian bawah dan meningkatnya keragaman mikroba lambung.32,33


14

2.4.3 Peran keseimbangan mikroba usus terhadap patogenesitas infeksi

Tubuh manusia mempunyai komposisi mikrobiota atau flora normal yang berbeda-beda di setiap lokasi anatomi. (Gambar 2.3) Tampak pada gambar 2.3 tersebut, komposisi mikrobiota di kulit didominasi oleh filum Actinobacteria. Hal ini berbeda dengan komposisi mikrobiota pada saluran cerna, dimulai dari mulut hingga kolon, sebagian besar didominasi oleh filum Firmicutes. Khusus pada lambung terdapat komposisi yang cukup berbeda berdasarkan terdeteksi atau tidaknya Helicobacter pylori di dalamnya. Pada lambung yang terdeteksi adanya H.pylori mempunyai komposisi mikrobiota yang didominasi oleh filum Proteobacteria yang diikuti oleh Firmicutes, Fusobacteria dan Actinobacteria. Sedangkan di lambung yang tidak terdeteksi H.pylori di dalamnya, komposisi mikrobiotanya

didominasi

oleh

Firmicutes,

diikuti

oleh

Proteobacteria,

Fusobacteria, Actinobacteria dan Bacteriodetes.15

Gambar 2.3 Filum bakteri utama pada beberapa lokasi anatomis tubuh manusia. Lambung 1 menunjukkan komposisi mikroba dengan terdeteksinya Helicobacter pylori di dalamnya. Lambung 2 menunjukkan komposisi mikroba dengan tidak terdeteksinya H.pylori di dalamnya.15 Sejauh ini belum ditemukan data tentang peranan keseimbangan mikroba usus terhadap infeksi, namun dalam beberapa penelitian dilaporkan adanya peran keseimbangan mikrobiota dalam patogenesis infeksi. Hal ini tampak dari interaksi Helicobacter pylori dengan manusia. Walaupun H.pylori ada di hampir setiap


15

manusia dewasa, saat ini bakteri tersebut secara cepat menghilang dari populasi manusia karena adanya perubahan pola sanitasi, demografi dan penggunaan antibiotik.34 Bik dkk melaporkan bahwa H.pylori, bila ada, adalah bakteri yang dominan dalam lambung,35 sehingga menghilangnya bakteri tersebut adalah suatu hal yang secara potensial signifikan. Fungsi fisiologi, endokrin dan immunologi dalam lambung diperkuat oleh H.pylori melalui efek pro-imfalamatorinya.36 Akan tetapi keberadaan H.pylori juga mempunyai implikasi terhadap kondisi biologis yang mungkin timbul, termasuk ulkus peptikum dan adenokarsinoma lambung bagian distal. Kondisi ini diperantarai oleh adanya gen cag+. Sebaliknya, strainstrain yang memiliki gen tersebut juga memiliki sifat protektif terhadap gastroesophageal reflux disease (GERD) dan kondisi yang diakibatkan selanjutnya, termasuk adenokarsinoma.34 Kondisi lain yang dapat terjadi dengan ketidakberadaan H.pylori adalah ketidakseimbangan energi, asma dan diare (sitasi Peek & Blaser, 2002).34 H.pylori dapat dianggap sebagai “organisme petunjuk” terhadap perubahan mikroekologi pada manusia dengan resiko penyakit yang timbul. Sebaliknya, fenomena ketidakberadaan suatu bakteri di kulit, mulut, kolon atau organ genital manusia masih sulit diketahui dengan teknologi dan pengetahuan saat ini.34

2.5 Diare

Diare didefinisikan dengan buang air besar (BAB) cair atau lunak tiga kali atau lebih dalam sehari (atau dengan frekuensi yang lebih sering daripada biasanya). BAB sering tapi padat tidak disebut diare, demikian juga dengan BAB lunak, seperti pasta, pada bayi yang diberi ASI.37 Ada tiga tipe klinis diare yaitu diare akut cair (acute watery diarrhoea) yang berlangsung beberapa jam hingga beberapa hari, termasuk disini kolera; diare bedarah akut (acute bloody diarrhoea) yang disebut juga disentri, dengan diare yang berdarah, lendir dan darah yang terlihat pada feces; dan diare persisten yang berlangsung 14 hari atau lebih.37


16

Hasil suatu telah pustaka sistemik di tahun 2011 menyebutkan

bahwa diare

diperkirakan bertanggung jawab sebagai penyebab 31,3% kematian anak usia 159 bulan dibandingkan dengan 26,1% penyebab lainnya di Asia Tenggara.38 Di negara-negara berkembang, anak-anak di bawah usia 3 tahun, rata-rata mengalami episode diare sebanyak 3 kali setiap tahun.37

Diare merupakan salah satu gejala adanya infeksi yang disebabkan oleh bakteri, virus ataupun parasit. Rotavirus dan Escherichia coli adalah dua penyebab yang paling sering di negara berkembang.37 Penyebab lain adalah Campylobacter spp, Salmonella spp, Shigella spp, danYersinia spp. Sedangkan Shigella spp merupakan penyebab diare akut berdarah paling penting yang menyumbang angka kematian hingga 15% dari semua kejadian diare pada anak balita. Vibrio cholerae merupakan penyebab timbulnya diare epidemik, khususnya di lokasi dengan sanitasi yang buruk. Vibrio cholerae strain non aglutinasi atau non-O1 yang sebelumnya digolongkan non patogenik, telah diidentifikasikan sebagai patogen yang bertanggungjawab menyebabkan wabah diare.39

Ditinjau dari strain bakteri, diare yang disebabkan E.coli memiliki sifat yang berbeda. Semua strain dapat menyebabkan diare pada anak di negara-negara berkembang, walau enterohemorrhagic E. coli (EHEC, termasuk E. coli O157:H7) lebih sering menyebabkan diare di negara maju. Enterotoxigenic E. coli (ETEC) selain menyebabkan travel’s diarrhea juga menyebabkan diare pada bayi dan anak di negara berkembang. Enteropathogenic E. coli (EPEC) menjadi penyebab diare pada anak usia kurang dari 2 tahun dan juga diare kronik, tetapi jarang menyebabkan diare pada orang dewasa. Enteroinvasive E. coli (EIEC) menyebabkan diare berlendir dan berdarah yang sering disertai demam. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) menimbulkan diare berdarah, kolitis hemoragik berat dan sindroma uremik hemolitik. Sedangkan pada infeksi Enteroaggregative E. coli (EAggEC) diare yang timbul pada anak-anak berupa diare cair, selain dapat pula menyebabkan diare perssiten pada anak dan dewasa dengan infeksi HIV.40


17

Manifestasi klinis utama dari infeksi Campylobacter adalah timbulnya diare akut yang pada awalnya berupa diare cair dengan frekuensi lebih dari delapan kali sehari yang seringkali disertai nyeri perut dan demam. Diare kemudian dapat disertai darah. Nyeri perut yang timbul dapat terlihat sangat parah dann menyerupai apendisitis.41

Infeksi Shigella spp lebih sering menyerang anak-anak usia taman kanak-kanak daripada bayi. S. sonnei menimbulkan gejala yang paling ringan dan paling sering terjadi di negara maju. S. flexneri menyebabkan timbulnya gejala disentri dan diare persisten, paling sering terjadi di negara berkembang. Tipe infeksi Shigella spp yang paling ganas disebabkan oleh S.dysenteriae type 1 (Sd1) yang menghasilkan toksin Shiga sebagaimana EHEC, yang kemudian menimbulkan diare berdarah dengan case fatality rate mencapai 10% di Asia, Afrika dan Amerika Tengah.40

Pada infeksi V.cholera, walau banyak spesies Vibrio dapat menyebabkan diare di negara berkembang, serogrup O1 dan O139 lah yang menyebabkan hilangnya volume cairan tubuh secara cepat dengan tingkat keparahan yang tinggi. Tanpa pengobatan dan rehidrasi yang adekuat, syok hipovolemik dan kematian dapat terjadi dalam 12 hingga 18 jam setelah gejala pertma kali timbul. Seringkali disertai muntah, tetapi jarang dengan demam.40

Diare akut yang disebabkan oleh infeksi Salmonella spp dapat berupa diare cair atau disentri dengan atau tanpa disertai darah. Demam dapat menyertai infeksi ini pada sekitar 70% anak yang terkena.40

2.6 PCR dan PCR-ESI/MS

PCR atau reaksi berantai polimerase merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. PCR dapat mengamplifikasi suatu target DNA tunggal menjadi produk asam nukleat yang berlipat ganda secara eksponensial melalui rangkaian 25 – 40 siklus


18

reaksi.42 Dengan teknik ini, dapat dihasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat sehingga memudahkan untuk menganalisis DNA dengan metodemetode lainnya. Salah satu metode yang digunakan untuk menganalis DNA produk PCR adalah electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS).

Metode kombinasi PCR dan ESI/MS yang disebut sebagai PCR–electrospray ionization mass spectrometry (PCR-ESI/MS) merupakan suatu teknik yang sudah banyak digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi mikroorganisme. Prinsip PCR-ESI/MS tersebut adalah mengamplifikasi DNA target menggunakan teknik PCR yang kemudian kandungan Guanin (G) dan Cytosin (C) dari produk PCR tersebut dianalisis menggunakan ESI/MS sehingga diperoleh kandungan GC tertentu. Untuk mengetahui genus dan atau spesies suatu mikroorganisme, kandungan G-C tersebut dibandingkan dengan kandungan G-C pada basis data. Secara garis besar proses PCR-ESI/MS meliputi ekstraksi DNA, PCR menggunakan bermacam primer yang spesifik terhadap genus dan spesies mikroorganisme tertentu, desalting, ESI-Time OF Flight (TOF) dan hasil secara otomatis.43 Dalam proses desalting, garam-garam yang terdapat di reaksi PCR dibuang sebelum fragmen DNA murni diinjeksikan ke spektrometer massa.

Tahap berikutnya, fragmen DNA murni tersebut diinjeksikan ke dalam spektrometer massa menggunakan teknik electrospray ionization.43 Berdasarkan hasil analisis spektrometer massa akan memberikan informasi berat molekul dengan kandungan G-C fragmen DNA tersebut. Berat molekul yang diperoleh akan dikonversi menjadi jumlah kopi (copy number) DNA, sedangkan kandungan G-C akan dibandingkan dengan basis data untuk memberikan informasi genus dan atau spesies mikroorganisme yang memiliki fragmen DNA sesuai dengan DNA yang dianalisis (Gambar 2.4).43,44


19

Gambar 2.4 Alur electrospray mass ionization dan pembacaan hasilnya44 2.7 Panel Pemeriksaan PLEX-ID Broad Bacteria

Panel PLEX-ID Broad Bacteria merupakan panel pemeriksaan non-diagnostik yang didisain untuk mendeteksi dan mengidentifikasikan semua kelompok bakteria sebagai mikroorganisme tunggal atau campuran melalui amplifikasi asam nukleat dan analisis komposisi basa selanjutnya. Secara teori, panel ini mancakup semua bakteri yang diketahui yang meliputi

5885 spesies dan 10561

strain,termasuk organisme intraseluler seperti Mycoplasma, Chlamydia, dan Rickettsia.44 Cakupan tersebut tergambar dalam Gambar 2.5


20

Gambar 2.5. Cakupan deteksi bakteri dengan menggunakan panel PLEX-ID Broad Bacteria.44 Hasil keluaran dari proses deteksi dengan PLEX-ID termuat dalam lembar hasil (Gambar 2.6). Q-score merupakan nilai kepercayaan yang tergantung dari jumlah primer yang membuat identifikasi suatu sampel dan kesesuaian dengan basis data yang tersedia

Gambar 2.6. Hasil keluaran setiap sampel dari PLEX-ID Broad Bacteria pada lembar laporan hasil. Ambang batas nilai kepercayaan ini berbeda-beda pada setiap panel pemeriksaan. Kaleta (Use of, 347; Comparative, 1059) pada penelitian yang menggunakan panel pemeriksaan untuk Candida dan Bakteria dari cairan steril memakai nilai 87,5 % atau 0,875 sebagai ambang batas deteksi. Dengan nilai tersebut, skor kepercayaan lebih kecil dari 87.5% dinyatakan sebagai hasil yang tidak dapat diinterpretasikan.13,45


21

Deteksi mikroorganisme menggunakan teknologi ESI/MS adalah deteksi spektrotometer massa berdasarkan rasio massa/charging (m/z) yang oleh computer akan langsung dikonversikan dalam satuan copy genome (jumlah sel) dan merupakan metode semikuantitatif, dalam arti kuantifikasi titrasi (elektrospray) yang dibandingkan dengan internal kontrol/standar. Copy genome yang dinyatakan sebagai level pada hasil PLEX-ID menggambarkan jumlah genome yang teridentifikasi oleh pendeteksi electrospray per μl.14,46


22

KERANGKA TEORI

Keterangan : : Faktor-faktor yang mempengaruhi keseimbangan mikrobiota usus, tetapi tidak diamati dalam penelitian ini. : Faktor-faktor yang mempengaruhi keseimbangan mikrobiota usus, yang diamati dalam penelitian ini : Proses yang berlangsung secara teori yang diamati dalam penelitian. : Proses yang berlangsung secara teori yang tidak diamati dalam penelitian.


23

KONSEP PENELITIAN

Keterangan : : Konsep atau rencana analisa hasil penelitian secara langsung : Konsep atau rencana analisa hubungan antara hasil penelitian


24

BAB III METODOLOGI

3.1 Desain penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif analitik dengan desain penelitian potong lintang.

Metode yang digunakan dalam pengambilan sampel adalah dengan metode consecutive sampling yaitu semua subyek penelitian yang datang dan memenuhi kriteria inklusi dimasukan dalam penelitian hingga jumlah sampel yang diperlukan terpenuhi

3.2 Waktu dan tempat penelitian

Penelitian dilakukan dari bulan Juni 2012 hingga Agustus 2013, yang meliputi beberapa kegiatan yaitu pengumpulan sampel, pengolahan pada sampel (pengelolaan sampel dan PCR-ESI/MS) dan pengolahan data.

Tempat penelitian meliputi lokasi pengambilan sampel dan tempat pengolahan sampel. Pengambilan sampel dilakukan di empat Puskesmas di wilayah Jakarta Utara dan di Rumah Sakit Penyakit Infeksi Prof Dr Sulianti Saroso (RSPI). Keempat Puskesmas tersebut adalah Puskesmas Kecamatan Pademangan, Puskesmas Kelurahan Sunter Agung, Puskesmas Kelurahan Sunter Jaya dan Puskesmas Kelurahan Papanggo I. Tempat pengolahan sampel adalah di Laboratorium Mikrobiologi Klini Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia (LMK-FKUI) dan di Instalasi Laboratorium Penelitian Rumah Sakit Penyakit Infeksi Prof Dr Sulianti Saroso


25

3.3 Alur Penelitian

3.4 Subyek Penelitian

Subyek penelitian terdiri dari kelompok diare dan non-diare.Subyek penelitian kelompok diare adalah anak-anak usia 2-12 tahun yang datang ke tempat pengambilan sampel dan sesuai dengan kriteria inklusi. Subyek penelitian nondiare merupakan anak-anak usia 2-12 tahun yang datang ke tempat pengambilan sampel dan sesuai dengan kriteria inklusi, dan anak-anak yang melakukan kegiatan di Pendidikan Anak Usia Dini (PAUD) binaan Puskesmas tempat pengambilan sampel.

Untuk kedua kelompok subyek penelitian data yang dikumpulkan meliputi identitas, alamat, usia. Sedangkan pada kelompok subyek dengan diare ditambah data klinis yang meliputi frekuensi diare, durasi diare hingga saat data diperoleh, konsistensi feses dan gejala penyerta.


26

3.5 Kriteria inklusi dan kriteria eksklusi

Subyek yang menjadi sampel pada penelitian ini diambil melalui mekanisme penapisan gejala klinis yang meliputin kriteria inklusi dan eksklusi sebagai berikut

3.5.1 Kriteria inklusi untuk subyek diare : 1. Anak usia 2 – 12 tahun 2. Mengalami episode diare akut sesuai kriteria WHO37 3. Orang tua/wali setuju dengan menandatangani informed consent

3.5.2 Kriteria inklusi untuk subyek non diare: 1. Anak usia 2 – 12 tahun 2. Tidak mengalami episode diare sesuai kriteria WHO37 3. Orang tua/wali setuju ikut penelitian dengan menandatangani informed consent

3.5.3 Kriteria eksklusi untuk kedua kelompok subyek penelitian

Kriteria

eksklusi

untuk

kedua

kelompok

subyek

penelitian

adalah

mendapatkan antibiotik untuk penyakit apapun sebelum pengambilan sampel.

3.6 Penentuan besar sampel

Penelitian ini merupakan penelitian potong lintang. Sampel diambil dengan cara consecutive sampling yaitu setiap sampel yang memenuhi kriteria penelitian di masukkan dalam penelitian sampai besar sampel terpenuhi. Besar sampel ditentukan dengan rumus (Mudiyono, 2008)47:


27

Prevalensi diare di DKI Jakarta sebesar 8% (Kemenkes 2011)48dengan tingkat kemaknaan 95%, ketepatan absolut 10% maka jumlah sampel adalah Zα = 1,96 P = 0,08; Q = 1-0,08 = 0.92 d = 10% N = 28,27≈ 28 Jadi jumlah sampel setidaknya 28 orang.

3.7 Pengumpulan Sampel

Sampel klinik yang diambil sebagai sampel penelitian adalah spesimen feses dari anak diare dan yang non diare yang sesuai dengan kriteria inklusi penelitian dan dikumpulkan dengan prosedur sebagai berikut :

Ketentuan umum 1

Anak yang akan menjadi responden harus memenuhi kriteria inklusi penelitian

2

Sebelum dilakukan pengambilan sampel, oang tua responden harus diberikan penjelasan mengenai penelitian dan perlakuan yang akan dilakukan, serta menandatangani form persetujuan

Prosedur pengumpulan feses 1

Siapkan kit pengumpulan sampel, yaitu: 1. Plastik klip besar sebagai kantong utama 2. Plastik klip sedang sebagai palstik limbah 3. Plastik klip kecil yang berisi pot sampel 4.

Sarung tangan non steril


28

Gambar 3.1. Kit pengumpulam sampel

2

Tulis identitas pasien pada pot sampel sebelum pengambilan sampel, yaitu 1. Nama lengkap pasien 2. Usia pasien dalam tahun dan dan bulan 3. Waktu pengambilan spesimen (jam, tanggal dan tahun)

3

Gunakan sarung tangan yang telah disediakan.

4

Ambil pot sampel dari plastik klip dan dibuka bila akan digunakan.

5

Tadahkan sekop pada tutup pot sampel dibawah dubur subyek untuk mendapatkan langsung sampel feses. Feses yang diambil sejumlah kira-kira satu sendok makan atau seukuran sekop pot. Kemudian masukan feses ke dalam pot dan tutup rapat pot sampel. Tidak mengambil sampel feses yang sudah bercampur air toilet atau wc, dan/atau dari pampers.

6

Masukkan pot sampel yang telah berisi sampel kedalam plastik klip semula

7

Lepas sarung tangan, dan masukkan sarung tangan bekas pakai tersebut ke dalam plastik klip khusus limbah untuk kemudian di buang ke tempat sampah medis.

8

Masukan plastik klip pot sampel ke dalam plastik klip besar, lalu tulis kembali identitas seperti diatas.

9

Masukan plastik klip yang telah berisi sampel ke dalam kotak pendingin (280C) selama tidak lebih dari 24 jam yang kemudian disimpan di suhu 700C.


29

3.8 Pengelolaan sampel

Setelah sampel dikumpulkan, sampel disimpan di tempat penyimpanan sementara pada suhu 2-80C tidak lebih dari 24 jam. Sampel di kirim ke Laboratorium Penelitian RSPI menggunakan kotak pendingin khusus (suhu 2-80C). Setelah sampai di laboratorium, sampel segera disimpan di suhu -700C. Setelah sampel terkumpul, sampel secara kolektif dibawa ke LMK-FKUI menggunakan kotak pendingin khusus (suhu 2-80C). Setelah sampai di LMK-FKUI, sampel disimpan di -700C sampai diproses selanjutnya.

3.9 PCR-ESI/MS

3.9.1 Ekstraksi DNA

Sebelum dilakukan ekstraksi DNA, sampel ditimbang sesuai dengan berat yang direkomendasikan dalam kit ekstraksi QIAamp® DNA Stool Mini Kit yaitu 180220 mg untuk sampel padat atau lunak, dan 200 µl untuk sampel cair dan kemudian dimasukan ke dalam tabung ependorf 1,5 ml steril.

Ekstraksi DNA dari sampel feses dilakukan dengan menggunakan kit ekstraksi dari Qiagen® yaitu QIAamp® DNA Stool Mini Kit dengan prosedur sebagai berikut : pada tabung ependorf 1,5 ml yang telah berisi sampel ditambahkan 1.4 ml buffer ASL dan vortex selama 1 menit atau hingga homogen. Selanjutnya suspensi diinkubasi selama 5 menit pada suhu 70°C.Vortex kembali selama 15 detik dan sentrifus dengan kecepatan penuh (1200 rpm) selama 3 menit. Ambil dan masukkan 1.2 ml supernatan ke tabung mikrosentrifus 2 ml yang baru dan buang pelletnya. Kemudian masukan 1 tablet Inhibit EX (tanpa menyentuh tablet), vortex segera selama 1 menit atau hingga tablet larut dan inkubasi suspensi selama 1 menit pada suhu ruang. Selanjutanya suspensi disentrifus dengan kecepatan penuh selama 3 menit. Ambil dan masukkan semuasupernatan ke tabung mikrosentrifus 1,5 ml yang baru dan buang pelletnya dan sentrifus dengan kecepatan penuh selama 3 menit. Ambil 200 μl supernatan dari suspensi tersebut


30

kemudian masukan ke dalam tabung mikrosentrifus 1,5 ml yang baru yang telah terlebih dahulu diisi 15 μl proteinase K. Tambahkan 200 μl Buffer AL dan vortex selama 15 detik lalu inkubasi pada suhu 70°C selama 10 menit. Kemudian spin 15 detik. Setelah itu tambahkan 200 μl

ethanol (96–100%) ke dalam lisat dan

campur dengan memvortexnya atau spin selama 15 detik. Siapkan dan beri label pada tutup QIAamp spin column yang baru, tempatkan ke dalam collection tube 2 ml. Kemudian masukkan lisat dari suspensi yang selesai di vortex ke dalam QIAamp spin column tanpa membasahi tepinya. Tutup tabung dan sentrifus dengan kecepatan penuh selama 1 menit.Tempatkan QIAamp spin column ke collection tube 2 ml yang baru, dan buang tabung berfiltrat. Buka dengan hati-hati QIAamp spin column, tambahkan 500 μl Buffer AW1. Tutup tabung dan sentrifus selama 1 menit.Tempatkan QIAamp spin column ke dalam collection tube 2 ml yang baru, dan buang collection tube berfiltrat. Buka dengan hati-hati QIAamp spin column, tambahkan 500 μl Buffer AW2. Tutup tabung dan sentrifus selama 3 menit. Buang collection tube berfiltrat.Tempatkan QIAmp spin collum ke dalam collection tube 2 ml yang baru dan buang collection tube yang berfiltrat. Sentrifus dengan kecepatan penuh selama 1 menit. Pindahkan QIAamp spin column ke dalam tabung mikrosentrifus 1,5 ml yang baru yang telah diberi label. Buka dengan hati-hati QIAamp spin column dan pipet 200 μl Buffer AE langsung ke membran QIAamp. Tutup tabung dan inkubasi 5 menit pada suhu ruang kemudian sentrifus selama 2 menit. Simpan elusi pada suhu –40°C.

3.9.2 Uji Inhibitor

Sebelum sampel DNA hasil ekstraksi diaplikasikan pada PCR-ESI/MS, dilakukan uji inhibitor PCR. Uji inhibitor dilakukan untuk mengetahui apakah isolasi DNA yang dilakukan berada pada kondisi yang ideal untuk dilakukan proses deteksi dengan PCR-ESI/MS Uji inhibitor ini dilakukan dengan PCR konvensional menggunakan sepasang primer (forward primer yang digunakan adalah:

5'-

AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3 dan 5'-AACTGGAGGAAGGTGGGGAC3', dan reverse primer yang digunakan 5'-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3') yang mengamplifikasi 370 pb fragmen dari gen target 16S rRNA bakteri.49


31

Uji ini dilakukan dengan melakukan PCR pada dua sampel dipilih secara acak. Master mix PCR pada penelitian ini menggunakan HotStarTaq® Master Mix kit yaitu HotStarTaq® Master Mix 2x yang terdiri atas 2,5 unit HotStarTaq® DNA Polymerase, 1,5 mM MgCl2, 200 mM dNTP Mix, dan 10 μM setiap primer, DNAase-free water serta 5 μl cetakan DNA. Mesin PCR yang dipergunakan adalah AB Applied Biosystem® GeneAmp PCR System 2400 dengan siklus termal (30 siklus) sebagai berikut: tahap aktivasi awal (aktivasi enzim) pada suhu 950C, selama 15 menit, tahap denaturasi (suhu 950C selama 30 detik), penempelan primer (550C, 60 detik), ekstensi (720C, 30 detik) dan ekstensi akhir (720C, 5 menit)

Hasil dari PCR kemudian dideteksi menggunakan jel agarosa 2% dengan menggunakan elektroforesa chamber, dengan langkah-langkah sebagai berikut: masing-masing sampel diambil sebanyak 10 µl, kemudian ditambahkan ke dalam sampel tersebut 1 µl (6x loading dye). Salah satu well diisi dengan marker GelPilot (100bp) sebanyak 5 µl. Nyalakan power supplay pada 100 volt selama 45 menit. Setelah selesai kemudian dimasukan ke dalam larutan ethium bromide selama lebih kurang 10 menit. Hasil elektroforesis dapat dilihat dengan transluminator ultravioletdan difoto menggunakan program Gel Doc XR (Biorad).

3.9.3 Deteksi dan identifikasi mikroba usus dengan PLEX-ID Panel Broad Bacteria

Total DNA hasil ekstraksi dimasukan ke dalam sumur lempeng pemeriksaan kit Panel Broad Bacteria PLEX-ID. Identitas DNA yang terdapat dalam sampel akan dianalisis secara otomatis menggunakan perangkat PLEX-ID. Prinsip pemeriksaan ini adalah mengamplifikasi DNA target menggunakan teknik PCR yang kemudian kandungan Guanin (G) dan Cytosin (C) dari produk PCR tersebut dianalisis menggunakan ESI/MS sehingga diperoleh kandungan G-C tertentu, Untuk mengetahui genus dan atau spesies suatu mikroorganisme, kandungan G-C tersebut dibandingkan dengan kandungan G-C pada basis data.43


32

3.10 Analisa Data

Karakteristik mikrobiota yang dideteksi pada kelompok sampel diare dan non diare dibandingkan dan dijabarkan secara deskriptif. Analisis statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak SPSS versi 17. Hubungan antara enteropatogen dengan kasus diare dianalisa dengan uji Chi-square dengan nilai p < 0,05 dianggap signifikan. Hubungan resiko (Odss ratio) antara keduanya juga dihitung.


33

BAB IV HASIL PENELITIAN

4.1 Profil demografi subyek penelitian

Pemilihan subyek penelitian dan pengumpulan sampel dilakukan dari bulan September hingga Desember 2012. Secara keseluruhan diperoleh 80 subyek penelitian sesuai kriteria inklusi yang terdiri dari 33 anak yang mengalami diare (subyek diare) dan 47 anak yang tidak mengalami diare (subyek non diare).

Tabel 4.1. Profil subyek penelitian Diare Laki-laki Perempuan Total

Non diare

Total

24

27

51

9

20

29

33

47

80

Subyek diare terdiri dari 24 anak laki-laki (72,7%) dan 9 anak perempuan (27,3%) dengan rentang usia 2 tahun hingga 9 tahun dan median usia 3 tahun. Sedangkan subyek non diare terdiri dari 27 anak laki-laki (57,4%) dan 20 anak perempuan (42,6%) dengan rentang usia 2 tahun 3 bulan hingga 11 tahun dengan median usia 4 tahun 4 bulan.

4.2 Presentasi klinis diare

Dari tiga puluh tiga subyek penelitian pada kelompok diare, data karakteristik klinis yang dapat dikumpulkan secara lengkap sebanyak 28 subyek (Lampiran 5), termasuk didalamnya 3 sampel yang tidak terdeteksi. Dengan demikian uraian dan analisis terhadap karakteristik klinis dalam hubungannya dengan hasil deteksi PLEX-ID dilakukan terhadap 28 subyek tersebut. Tabel 4.2 dibawah memaparkan presentasi klinis secara umum dari dua puluh delapan subyek kelompok diare tersebut.

Universitas Indonesia Profil mikroba…, Teguh Sarry Hartono, FK UI, 2014

34

Dari tabel tersebut terlihat bahwa sebagian besar konsistensi diare adalah seperti bubur (12 dari 28). Lima puluh persen dari jumlah sampel feses (14 dari 28) tersebut,

dengan berbagai konsistensi, tidak disertai dengan penyerta berupa

lendir dan atau darah.

Tabel 4.2. Presentasi klinis subyek diare Presentasi klinis

Jumlah sampel perempuan

laki-laki Konsistensi feses (n=28) cair seperti bubur lunak Penyerta (n=28) Tidak ada lendir/darah Lendir Darah Lendir + darah Frekuensi diare (n=28) 3-5x 6-10x >10x Durasi (n=28) 1-2 hari 3-5 hari >5 hari Gejala lain (n=28) Tidak ada Demam Muntah Demam + Muntah

total

7 9 6

2 3 1

9 12 7

11 9 0 2

3 3 0 0

14 12 0 2

17 4 1

5 1 0

22 5 1

18 2 1

7 0 0

25 2 1

13 4 0 5

3 2 0 1

16 6 0 6

Dua belas sampel hanya disertai lendir dan dua sampel disertai dengan lendir dan darah. Diare dengan frekuensi terbanyak adalah yang berlangsung 3 hingga 5 kali sehari. Sebagian besar subyek diare (16 dari 28 subyek diare) tidak mengalami demam, sedangkan sisanya (12 dari 28) mengalami demam dengan 6 diantarnya disertai muntah


35

4.3 Hasil Ekstraksi DNA sampel

Semua sampel feses yang diperoleh dari 80 subyek penelitian tersebut diesktraksi. Setiap ekstraksi pada masing-masing sampel menghasilkan kurang lebih 200 uL elusi. Sebelum dilakukan tahap selanjutnya, beberapa sampel hasil ekstraksi tersebut dipilih secara acak untuk langsung dilakukan deteksi DNA bakterinya dengan elektroforesis menggunakan agar agarosa (Gambar 4.1).

Gambar 4.1. Hasil elektroforesis terhadap beberapa sampel produk ekstraksi. M=marker 100 bp. S22, S19, S01 dan S25 adalah sampel non diare. Pada Gambar 4.1. tersebut terlihat hasil elektroforesis menunjukkan adanya “smear” DNA pada gel agarosa. Hal ini menunjukkan bahwa hasil ekstraksi genom bakteri diduga berhasil dilakukan.

4.4 Uji inhibitor pada sampel

Uji ini dilakukan dengan melakukan PCR pada dua sampel yang dipilih secara acak, masing-masing satu dari sampel diare dan non diare. Hasil uji ini (Gambar 4.2) memperlihatkan bahwa reaksi PCR memberikan hasil positif pada kedua sampel yang diujikan. Berdasarkan hasil tersebut, diasumsikan bahwa hasil ekstraksi DNA tidak mengandung inhibitor reaksi PCR. Oleh karena itu DNA yang sudah diekstraksi dapat diproses ke tahap selanjutnya.


36

Gambar 4.2. Hasil elektroforesis terhadap beberapa sampel produk ekstraksi untuk uji inhibitor PCR pada sampel. M=marker 100 bp. S37 dan D05 adalah sampel dari anak diare dan non diare. KN adalah kontrol negatif (DNA free water)

4.5 Hasil PLEX-ID

Hasil deteksi dari PLEX-ID memiliki pengertian bahwa prosesor PLEX-ID membaca satu atau lebih mikroorganisme dengan Q score diatas 0.85 yang sesuai dengan basis data spektrometer PLEX-ID. Sehingga jika ditemukan lebih dari satu bakteri maka interpretasinya adalah terdapat dua atau lebih bakteri yang ditemukan dengan Q score >0.85 dan memiliki peluang yang sama sebagai bakteri yang terdeteksi. Berdasarkan hasil deteksi PLEX-ID yang tercantum dalam lembar hasil, hasil tersebut terbagi dalam 3 macam hasil, seperti yang ditunjukakan pada Gambar 4.3.

Pada hasil yang memperlihatkan hasil multiple matches, seperti pada gambar 12b., tertera tiga nama bakteri dengan hanya satu nilai Q-score dan satu nilai level. Hal tersebut berarti bahwa hasil deteksi PLEX-ID yang dianalisis sesuai dengan bakteri-bakteri yang terdapat di basis data. Oleh karena itu, hasil pada multiple


37

matches menampilkan lebih dari satu bakteri dengan hanya satu Q-score dan satu level.

Gambar 4.3. Lembar hasil PLEX-ID yang menunjukkan deteksi terhadap bakteri, dengan masing-masing mempunyai Q-score dan level yang berbeda (ditunjukan oleh tanda panah). a. menunjukkan deteksi terhadap satu bakteri, b. menunjukkan deteksi terhadap satu bakteri dan deteksi bakteri dengan hasil multiple matches dan c. menunjukkan hasil tidak terdeteksi

Hal ini berbeda dengan hasil pada Gambar 12a yang menunjukkan hasil deteksi terhadap bakteri dan 12b dengan speies bakteri yang mempunyai satu nilai Qscore dan satu level. Hasil yang ditunjukkan pada Gambar 12c memperlihatkan hasil negatif, yaitu tidak terdeteksi adanya bakteri.

1.5.1 Hasil deteksi bakteri pada sampel

Keluaran hasil deteksi PLEX-ID pada sampel diare dan non diare tertera pada Lampiran 2 dan 3. Dari hasil deteksi tersebut, pada 30 dari 33 sampel pada kelompok diare dideteksi adanya bakteri (Tabel 4.3). Enam dari 33 sampel memberikan hasil multiple matches, sedangkan pada 3 sampel lainnya tidak terdeteksi adanya bakteri. Pada kelompok non diare, pada 28 dari 47 sampel


38

dideteksi adanya bakteri, hasil multiple matches pada 8 dari 47 sampel dan 13 sampel tidak terdeteksi adanya bakteri. Satu dari 58 sampel diare dan non diare memberikan deteksi bakteri hanya sampai genus Streptococcus, sedangkan lainnya memberikan hasil pada tingkat spesies (Tabel 4.4).

Tabel 4.3. Macam hasil deteksi PLEX-ID Kelompok sampel

Deteksi bakteri

Deteksi multile matches

Tidak terdeteksi bakteri

Diare (n =33)

30

6

3

Non diare (n =47)

28

8

13

Total (n=80)

58

14

16

Pada kelompok diare, didominasi oleh kelas Gamma Proteobacteria dari filum Proteobacteria dengan spesies Escherechia coli merupakan bakteri dominan yang dideteksi yang diikuti oleh Klebsiella pneumonia. Kelas bakteri lain yang dideteksi adalah Epsilon Proteobacteria (Campylobacter jejuni) dan Beta Proteobacteria

(Acidovorax avenae dan Aquaspirillum gracile) dari filum

Proteobacteria, Kelas Cocci (Staphylococcus epidermidis), Clostridia (Clostridium perfringens) dan Bacilli (Streptococcus vestibularis) dari filum Firmicutes, serta

Bacteroides (Prevotella albensis) dari filum Bacteroidetes.

Di kelompok non diare juga didominasi oleh kelas Gamma Proteobacteria dengan Escherechia colisebagai bakteri dominan diikuti pula oleh Klebsiella pneumonia. Gamma Protobacteria lain yang dideteksi adalah Escherichia fergusonii.Selain itu dideteksi pula adanya Bifidobacterium longum dari filum Actinobacteria, dan kelas Verrcomicrobiae (Akkermansia muciniphila) dari filum Verrucomicrobia. Pada kelompok non diare Escherechia coli juga merupakan bakteri dominan yang dideteksi, diikuti oleh Klebsiella pneumoniae dan Bifidobacterium longum.

Pada kelompok sampel diare dideteksi bakteri yang tergolong sebagai flora normal pada saluran pencernaan, seperti Escherechia coli, Klebsiella pneumonia dan Eubacterium rectale. Selain itu dideteksi bakteri yang merupakan Universitas Indonesia Profil mikroba…, Teguh Sarry Hartono, FK UI, 2014

39

enteropatogen sebenarnya, yaitu Campylobacter jejuni dan Shigella boydii. Dari hasil tersebut di atas, juga dideteksi adanya bakteri Aquaspirillum gracile yang diketahui sebagai bakteri lingkungan dan Acidovorax avenae yang diketahui sebgai bakteri penyebab penyakit pada tanaman (fitopatogen). Pada kelompok sampel non diare, semua bakteri yang dideteksi merupakan bakteri yang memang terdapat dalam saluran pencernaan manusia.


40

Tabel 4.4. Bakteri yang dideteksi PLEX-ID pada sampel diare dan sampel non diare Bakteri di sampel diare

Famili

Filum

Bakteri di sampel non diare

Famili

Filum

18

Enterobacteriaceae

Proteobacteria

Escherechia coli

21

Enterobacteriaceae

Proteobacteria

Klebsiella pneumonia

2

Enterobacteriaceae

Proteobacteria

Klebsiella pneumoniae

3

Enterobacteriaceae

Proteobacteria

Prevotella albensis

1

Bacteroidaceae

Bacteroidetes

Bifidobacterium longum

2

Bifidobacteriaceae

Actinobacteria

Staphylococcus epidermidis

1

Staphylococcaceae

Firmicutes

Escherichia fergusonii

1

Enterobacteriaceae

Proteobacteria

Eubacterium rectale

1

Eubacteriaceae

Firmicutes

Akkermansia muciniphila

1

Verrucomicrobiaceae

Verrucomicrobia

Clostridium perfringens

1

Clostridiaceae

Firmicutes

Streptococcus vestibularis

1

Streptococcaceae

Firmicutes

Streptococcus sp

1

Streptococcaceae

Firmicutes

Acidovorax avenae

1

Comamonadaceae

Proteobacteria

Aquaspirillum gracile

1

Comamonadaceae

Proteobacteria

Campylobacter jejuni

1

Campylobacteraceae

Proteobacteria

Shigella boydii

1

Enterobacteriaceae

Proteobacteria

Escherechia coli

Total

Jumlah

30

Total

Jumlah

28


41

Keragaman bakteri yang dideteksi pada kelompok diare (12 bakteri dari 30 sampel) lebih banyak dibandingkan pada kelompok non diare (5 dari 28) Grafik dibawah memperlihatkan perbandingan antar filum yang dideteksi pada masing-masing kelompok sampel.

60

50

40

25 30

20

24

10

0

1

5 Firmicutes

Proteobacteria

Bacteroidetes Diare

2

1

Actinobacteria Verrucomicrobia

Non diare

Gambar 4.4. Grafik perbandingan filum berdasarkan jumlah bakteri yang dideteksi pada kelompok sampel diare dan non diare. Dari grafik tersebut diatas terlihat bahwa filum Firmicutes dan Bacteroidetes hanya dideteksi pada kelompok sampel diare, sedangkan filum Actinobacteria dan Verrumicrobia hanya dideteksi pada kelompok sampel non diare. Proteobacteria dideteksi pada kedua kelompok sampel dengan jumlah pada kelompok sampel non diare lebih banyak daripada kelompok sampel diare (25 vs 24).

4.5.1.1 Hasil multiple matches

Pada Tabel 4.5 tertera hasil multiple matches pada masing-masing kelompok.


42

Tabel 4.5. Hasil deteksi PLEX-ID dengan hasil multiple matches Kode sampel diare

Bakteri

D02 D11 D13

E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei E.coli/Shigella dysenteriae E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei

D14 D15

E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei E.coli/Escherichia coli O157:not H7/Shigella boydii/Shigella sonnei E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei

D33

Kode sampel non diare S10 S11 S14 S17 S23 S26 S38 S46

Bakteri

E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei Vibrio proteolyticus/Vibrio sp. E.coli/Escherichia coli O157:not H7/Shigella sonnei E.coli/Shigella dysenteriae E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei E.coli/Escherichia coli O157:not H7/Shigella sonnei

Hasil multiple matches ini didominasi oleh klaster Escherichia coli/Shigella flexneri/S.sonnei pada masing-masing kelompok sampel, yaitu 4 sampel (D02, D13, D14 dan D33) pada kelompok sampel diare, dan 4 sampel (S10, S17, S23 dan S38) pada kelompok sampel sehat. Sampel D11, D33 dan S11 selain dideteksi sebagai multiple matches, juga mendeteksi bakteri, genus Streptococcus sp pada D11, spesies Aquaspirillum gracile pada D33 dan genus Vibrio sp. pada sampel S11 (Lampiran 5 dan 6)

4.5.1.2 Hasil tidak terdeteksi

Dari total 80 sampel, terdapat 16 sampel yang tidak terdeteksi adanya bakteri. Terdiri dari 13 sampel dari kelompok non-diare dan 3 dari kelompok diare. Diduga penyebab tidak terdeteksinya bakteri pada sampel-sampel tersebut disebabkan adanya inhibitor yang menghambat reaksi kit PLEX ID. Untuk membuktikan kemungkinan itu, semua sampel negatif (tidak terdeteksi adanya bakteri) dijadikan cetakan untuk PCR konvensional.


43

Gambar 4.5 Empat contoh sampel hasil PLEX-ID yang negatif tetapi memberikan hasil positif pada PCR konvensional. M=marker, KN=kontrol negatif, S37,S41,S45 dan S01 adalah no sampel. Berdasarkan uji PCR konvensional ini, semua sampel negatif menunjukkan hasil PCR positif. (Gambar 4.5) Hal ini mengindikasikan bahwa pada sampel tersebut tidak terdapat inhibitor yang menghambat reaksi enzimatik PCR. Penyebab kegagalan deteksi bakteri kit PLEX-ID diduga terjadi akibat faktor-faktor lainnya.

4.6 Karakteristik klinis diare berdasarkan bakteri yang dideteksi

Karakteristik klinis diare berdasarkan bakteri yang dideteksi dipaparkan pada table 4.6. Pada sampel yang terdeteksi adanya E.coli mempunyai karakteristik klinis yang bervariasi, baik frekuensi diare, konsistensi maupun gejala penyerta. Pada sampel-sampel tersebut frekuensi diare terbanyak adalah yang berlangsung 3-5 hari, disertai dengan lendir (5 sampel) dan darah (1 sampel). Demam timbul pada 6 dari 13 subyek, yang dua diantaranya disertai muntah.

Konsistensi feses cair terlihat pada sampel yang tidak terdeteksi adanya bakteri dan pada sampel yang terdeteksi adanya bakteri E.coli (5 sampel), E.coli dan Acidovorax

avenae

(1)

dan

satu

sampel

multiple

matches

(E.coli/S.flexneri/S.sonnei). Sedangkan konsistensi feses seperti bubur, selain pada E.coli juga terlihat pada C,jejuni, Ecoli + Klebsiella pneumonia, E.coli +


44

S.vestibularis dan tiga sampel multiple matches, yaitu E.coli/S.dysentriae + Streptococcus sp. (1 sampel) dan E.coli/S.flexneri/S.sonnei (2 sampel).

Dari 28 sampel tersebut, sebagian besar disertai lendir dan hanya pada sampel E.rectale, Provetella albensis, E.coli+Acidovorax avanae yang tidak disertai lendir. Sedangkan darah hanya tampak pada sampel yang terdeteksi adanya E.coli dan hasil multiple matches (E.coli/S.flexneri/S.sonnei).

Gejala yang menyertai diare adalah demam yang timbul pada 12 subyek dengan 6 diantaranya disertai muntah. Dua belas subyek tersebut adalah pada 6 sampel yang terdeteksi adanya E.coli dan masing-masing satu sampel yang terdeteksi adanya C.jejuni, E.coli+S.vestibularis, S.boydii+C.perfringens serta dua hasil multiple matches E.coli/S.flexneri/S.sonnei dan E.coli/Escherichia coli O157:not H7/Shigella boydii/Shigella sonnei.

Lima sampel dengan data yang tidak lengkap terkumpul terdiri dari sampelsampel yang terdeteksi adanya E.coli (2 sampel), K.pneumonia (1), S.epidermidis (1) dan deteksi multiple mathces E.coli/S.flexneri/S.sonnei

Dalam penelitian ini, enteropatogen ditentukan dengan menggunakan asumsi bahwa bakteri yang dideteksi menggunakan PLEX-ID adalah bakteri yang dikenal sebagai enteropatogen. Pada deteksi tunggal, adalah Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens dan E.coli; pada deteksi multiple matches adalah Shigella spp. dan Vibrio spp. Tabel 4.7 menunjukkan bahwa semua sampel dengan enteropatogen, 48,2% (27/56) mengalami diare. Sementara pada sampel dengan non-enteropatogen, yang mengalami diare adalah sebanyak 56,5% (9/16). Dengan menggunakan uji Chi-square diperoleh nilai p=0.571. Hal ini berarti tidak ada hubungan yang secara statistik bermakna antara enteropatogen dengan kejadian diare. Odds ratio digunakan untuk melihat kekuatan hubungan kejadian diare yang disebabkan oleh enteropatogen (OR 0,724 [95% CI: 0,237-2,215]). Ini berarti bahwa kemungkinan timbulnya diare yang disebabkan oleh enteropatogen adalah 0,724 kali lebih sering daripada oleh non-enteropatogen.


45

Tabel 4.6. Karakteristik diare berdasarkan bakteri yang dideteksi pada 28 sampel* Bakteri

Jumlah sampel

Karakteristik diare Konsistensi feses Berlendir Berdarah

Frekuensi diare (x/hari) 3-5 6- >10 Cair Seperti Lunak 10 bubur

Gejala penyerta Demam Muntah

Escherechia coli 13 11 1 1 5 4 4 5 1 6 Campylobacter jejuni 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 Eubacterium rectale 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 Provetella albensis 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 E.coli+Acidovorax avenaea 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 a E.coli+Klebsiella pneumonia 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 E.coli+Streptococcus vestibularisa 1 1 0 0 0 1 0 1 0 1 a Shigella boydii+Clostridium perfringens 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 E.coli/S.dysentriae +Streptococcus spa,b 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 E.coli/S.flexneri/S.sonneib 3 3 0 0 1 2 0 1 1 1 E.coli/Escherichia coli O157:not 1 1 0 0 0 1 0 1 0 1 H7/Shigella boydii/Shigella sonneib Tidak terdeteksi 3 1 2 0 2 1 0 0 0 1 Total 28 22 5 1 9 12 7 12 2 12 *28 sampel yang mempunyai data keterangan klinis,amerupakan sampel dengan deteksi dua bakteri, b: merupakan hasil multiple matches


2 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 6

46

Tabel 4.7 Tabulasi silang antara enteropatogen dan diare Enteropatogen diare Total

+ -

+

-

27 29 56

9 7 16

Total 36 36 72


47

BAB V PEMBAHASAN

5.1 Pengambilan dan penyimpanan spesimen

Pada penelitian ini lokasi pengambilan sampel terletak di daerah Jakarta Utara, yang meliputi dua kecamatan dengan keseluruhan empat puskesmas dan satu rumah sakit. Sampel-sampel semuanya dikumpulkan di Rumah Sakit Penyakit Infeksi Prof Dr Sulianti Saroso (RSPI) terlebih dahulu sebelum diolah lebih lanjut. Atas dasar jarak antar lokasi, yaitu berkisar 4 km dengan RSPI, puskesmaspuskesmas tersebut dipilih untuk mempermudah pengumpulan sampel. Selain itu diasumsikan homogenisasi kondisi sosial, ekonomi, lingkungan dan iklim dari subyek penelitian, sehingga diharapkan variabilitas kondisi sosiodemografik dapat ditekan serendah mungkin.Spesimen yang didapat ditempatkan di dalam kotak pendingin dengan suhu berkisar 80C sebelum di antar ke tempat pengumpulan di RSPI pada hari tersebut atau keesokan harinya. Dari berbagai kepustakaan, spesimen feses dapat disimpan dalam suhu 2-80C sebelum dilakukan pemprosesan.8

5.2 Karakteristik subyek penelitian

Jumlah subyek penelitian/sampel penelitian minimal sesuai dengan perhitungan junmlah sampel adalah 28 untuk masing-masing kelompok dan sampel yang diharapkan terkumpul adalah 60 sampel untuk setiap kelompok sesuai dengan ketersedian reagen panel pemeriksaan. Tetapi pada akhirnya hanya terkumpul 33 sampel diare dan 47 sampel sehat.

Untuk kelompok sampel diare, hal tersebut dikarenakan keterbatasan tenaga yang memantau serta menyaring kasus diare di puskesmas dan juga banyak orang tua dari subyek penelitian tidak datang kembali untuk mengembalikan pot sampel yang telah diberikan. Kondisi ini dimungkinkan karena gejala diare sudah mereda atau bahkan sudah tidak ada.


48

Dari 33 subyek diare, terdapat 24 anak laki-laki (72,7%) dan 9 anak perempuan (27,3%) dengan rentang usia 2 tahun hingga 9 tahun dan median usia 3 tahun. Ini sesuai dengan hasil Survei Dasar Kesehatan Indonesia tahun 2007 yang menyatakan prevalensi diare pada anak laki-laki lebih tingi dari anak perempuan, demikian pula dengan prevalensi berdasarkan kelompok umur yaitu usia 24-48 bulan mempunyai prevalensi yang lebih tinngi dibandingkan usia 48 bulan ke atas.34

5.3 Hasil ekstraksi DNA dan uji inhibitor

Sampel feses mengandung bakteria yang sangat besar jumlahnya. Isolasi DNA dari sampel klinis tersebut merupakan salah satu tahap dalam meneliti keanekaragaman bakteri yang terkandung dalam saluran pencernaan. Sehingga sangatlah penting untuk mendapatkan DNA yang mewakili komunitas bakteri yang terdapat pada sampel.36 Hal ini dikarenakan pada feses mengandung banyak inhibitor polimerase DNA, seperti polisakarida (dari mucus, bakteri dan makanan) dan garam empedu.37 Berdasarkan uji ekstraksi dan inhibitor, hasil PCR menunjukkan pita-pita fragmen DNA yang sesuai dengan primer yang digunakan (370pb). (Gambar 4.2); oleh karena itu, diduga bahwa tahapan ekstraksi tidak mengandung inhibitor npolymerase DNA.

Pendeteksian hasil ekstraksi DNA yang dilanjutkan dengan deteksi produk PCR pada sampel yang dipilih secara acak bertujuan untuk memastikan bahwa ekstraksi yang dilakukan telah dapat meminimalkan kemungkinan kandungan inhibitor pada produk ekstraksi yang kemudian akan dilakukan proses selanjutnya dengan PLEX-ID.

Primer yang digunakan sesuai dengan regio gen 16S rRNA yang merupakan gen yang sangat conserved diantara berbagai grup Eubacteria dan diharapkan dapat mengamplifikasi DNA dari sebagian besar bakteri.49


49

5.4 Hasil PLEX-ID

Teknologi PLEX-ID pada penelitian ini menggunakan panel Broad Bacteria. Panel ini menggunakan enam belas pasang primer untuk mengamplifikasi DNA bakteri dari sampel klinis. Setelah analisis amplikon oleh spektrometer massa, jumlah basa nukleotida kemudian ditentukan dengan membandingkan terhadap 10562 strain bakteri di basis data yang ada, yang selanjutnya keluar hasil sebagai bakteri yang terdeteksi.

Penggunaan PLEX-ID terhadap sampel feses secara langsung, sepanjang pengetahuan peneliti baru dilakukan pada penelitian ini. Pada penelitianpenelitian terdahulu pada kultur darah didapatkan kesesuaian hasil pada tingkat spesies dengan metode standar sebesar 86,75% (n = 234)13 dan pada isolat klinis diperoleh hasil 74% (n=156) teridentifikasi dengan tepat, dengan hanya 9% yang salah diidentifikasikan.50 Pada penelitian ini, dikarenakan tidak menggunakan metode pembanding, hasil yang dapat dinyatakan adalah diperoleh 80% (64 dari 80) terdeteksi adanya bakteri dengan 14 sampel dari 64 hasil deteksi tersebut merupakan hasil multiple matches (Tabel 4.5). Hasil deteksi ini tidak dapat dibedakan lebih lanjut sehingga dilaporkan sebagai klaster (M. Rost, komunikasi pribadi, 12 April, 2013).51 Dari 14 sampel multiple matches tersebut, didominasi oleh klaster Escherichia coli dengan genus Shigella. Hal ini terjadi karena E.coli dan spesies Shigella merupakan bakteri dengan hubungan filogenik yang erat.50

5.5 Keragaman bakteri yang terdeteksi Escherechia coli merupakan bakteri dominan pada saluran pencernaan.52 Hal tersebut tampak pada kedua kelompok penelitian bahwa sebagian besar bakteri yang dideteksi adalah E.coli. Terdeteksinya Campylobacter jejuni dan Shigella boydii,

yang merupakan

enteropatogen,

pada

kelompok

sampel

diare,

membedakan keragaman hasil deteksi dengan kelompok non diare. Walau pada penelitian sejenis dengan metode deteksi yang berbeda, Bodhidatta (2010) di Thailand menemukan bahwa Campylobacter dan Shigella juga ditemukan di


50

sampel non diare.53 Selain itu, juga dideteksi adanya Aquaspirillum gracile yang mempunyai nama baru sebagai Hylemonella gracilis. Bakteri ini merupakan bakteri yang biasa ditemukan di ekosistem air.54 Bakteri lain yang dideteksi pada kelompok sampel diare adalah Acidovorax avenae. Bakteri ini adalah bakteri Gram negatif batang, tidak berpigmen dan tidak memfermentasi laktosa. Biasanya ditemukan di tanah dan air, selain juga diketahui sebagai patogen tanaman. Ada laporan kasus yang menyatakan bahwa bakteri ini berkaitan dengan timbulnya catheter related sepsis.55 Walaupun amat jarang, peran bakteri lingkungan tersebut yang tidak biasa ditemukan yang berhubungan dengan diare perlu dievaluasi dan dipelajari di masa akan datang.

Pada kelompok sampel non-diare dideteksi bakteri yang semuanya merupakan flora normal saluran pencernaan.

Akkermansia muciniphila berkolonisasi di

lapisan mukosa usus dan berjumlah 3-5% dari seluruh komunitas bakteri usus.56 Spesies Bifidobacterium adalah bakteri komensal yang berkaitan dengan jaringan intestinal yang mensintesis senyawa yang mempengaruhi imunitas seseorang. B.longum mengekspresikan inhibitor protease serin yang berperan pada fungsi immunomodulator.18 Pada kelompok non diare, tidak terdeteksi bakteri-bakteri yang tergolong patogen seperti Campylobacter sp dan Shigella sp. Pada kelompok diare, tidak terdeteksi bakteri-bakteri yang bersifat probiotik yang berperan dalam mempertahankan kondisi imunologi anak. Kemungkinan terjadi ketidakseimbangan mikrobiota dalam saluran pencernaan anak yang mengalami diare dibandingkan yang tidak mengalami diare.

Dideteksinya E.coli dan K.pneumonia pada kedua kelompok sampel sebagai bakteri yang terbanyak dideteksi dan juga adanya kemiripan hasil pada hasil multiple matches, menyiratkan adanya kesamaan pola keragaman mikrobiota usus pada subyek yang diteliti. Kemungkinan hal ini karena adanya kesamaan demografi subyek, sehingga lingkungan, kebiasaan dan pola makan mempunyai kemiripan. Dalam penelitiannya, Yatsunenko dkk (2012) menyatakan bahwa


51

perbedaan dalam tradisi budaya yang mempengaruhi pola makan, paparan terhadap hewan peliharaan dan ternak serta faktor lainnya dapat berdampak pada bagaimana dan darimana mikrobiota usus didapat.57

Dari data yang diperoleh, filum yang dominan pada kelompok diare dan non diare adalah Proteobacteria.Filum bakteri yang hanya dideteksi pada kelompok sampel diare adalahFirmicutes dan Bacteroidetes sedangkan filum bakteri yang hanya ditemukan pada kelompok sampel non diare adalah Actinobacteria dan Verrumicrobia. Komposisi filum bakteri tersebut merupakan komposisi mikroba usus.4, 5 Pada penelitian ini, analisis terhadap komposisi mikroba usus dari sampel feses hanya menggambarkan komposisi mikroba usus secara umum dan tidak menggambarkan komposisi mikroba usus pada lokasi anatomis saluran cerna. Hal tersebut dikarenakan sebagian besar hasil yang diperoleh pada setiap sampel hanya satu bakteri dan untuk dapat mengetahui komposisi mikroba yang berbeda pada masing-masing lokasi anatomi maka sampel harus diperoleh dari lokasi anatomi tersebut, seperti pada penelitian yang dilakukan oleh Frank5, Monstein58 dan Morteau.59

Dari data mengenai komposisi mikroba usus tersebut pula tidak dapat menggambarkan

hubungan

antara

keseimbangan

mikroba

usus

dengan

patogenesis penyakit.

Fenomena tersebut telah dilaporkan pada mikroba lambung. Helicobacter pylori merupakan bakteri yang sangat beradaptasi untuk berkolonisasi di lambung manusia. Lambung manusia merupakan habitat utama H.pylori.15 Penelitian mengenai mikroba lambung berdasarkan sekuensing gen 16 sRNA menunjukkan bahwa H.pylori mempunyai proporsi yang tinggi (70-90%).35,

60

Ada atau

tidaknya H.pylory ternyata juga berkaitan dengan komposisi bakteri dalam lambung sebagaimana tampak pada Gambar 2.3. Pada gambar tersebut terlihat bahwa pada lambung yang terdeteksi adanya H.pylori mempunyai komposisi mikrobiota yang didominasi oleh filum Proteobacteria yang diikuti oleh Firmicutes, Fusobacteria dan Actinobacteria. Sedangkan di lambung yang tidak


52

terdeteksi H.pylori di dalamnya, komposisi mikrobiotanya didominasi oleh Firmicutes, diikuti oleh Proteobacteria, Fusobacteria, Actinobacteria dan Bacteriodetes.15 Adanya H.pylori berkaitan dengan meningkatnya resiko ulkus pepticum dan non-cardia adenocarcinoma.61 Akan tetapi ada hipotesis yang menyatakan bahawa H.pylori berperan dalam memberikan perlindungan terhadap beberapa penyakit infeksi.15

Peran keseimbangan mikroba usus terhadap patogenesis infeksi seperti yang telah dilaporkan pada mikroba lambung belum diketahui. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui peran keseimbangan mikroba usus terhadap patogenesis suatu infeksi.

5.6 Tinjauan klinis berdasarkan bakteri patogen yang terdeteksi

Pada penelitian ini dideteksi E.coli pada 18 sampel diare dan 21 sampel non diare. Akan tetapi E.coli yang dideteksi tesebut tidak dapat dibedakan berdasarkan strain patogennya. Kemungkinan dideteksinya strain patogen E.coli pada anak-anak yang tidak mengalami diare dilaporkan oleh Hien dkk (2007) dan Bodhidatta dkk (2010). Hien melaporkan dideteksinya 23% strain patogen E.coli pada anak-anak yang tidak mengalami diare62, sedangkan Bodhidatta melaporkan dideteksinya 17% ETEC dan 19% EPEC pada anak-anak yang tidak mengalami diare.53 Panel pemeriksaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah panel Broad Bacteria yang dirancang untuk mendeteksi semua kelompok bakteri, tetapi tidak untuk strain patogen E.coli. Deteksi strain patogen E.coli dan bakteri patogen saluran cerna dideteksi dengan panel Food Borne assay. Sedangkan untuk virus dideteksi dengan panel Broad Viral.43 Oleh karena itu, hasil deteksi pada penelitian ini tidak dapat menyatakan dengan pasti penyebab dari diare pada kelompok sampel diare. Diare pada anak akibat infeksi dapat disebabkan oleh berbagai mikroorganisme, baik bakteri, virus ataupun parasit.53,63, 64Bahkan kemungkinan timbulnya infeksi campuran dapat terjadi. Roman dkk (2003) dalam penelitiannya melaporkan adanya infeksi campuran pada 5% kasus gastroenteritis anak, yang sepertiga dari jumlah tersebut adalah infeksi virus – bakteri.65Sedangkan de Wit dkk (2001)


53

melaporkan

2,3%

dideteksinya

lebih

dari

satu

patogen

pada

kasus

gastroenteritis.66 Di negara berkembang sulit untuk menentukan etiologi sebenarnya berdasarkan patogen enterik yang terdeteksi pada anak-anak yang mengalami diare.53

Dari data yang ada, sebagian besar sampel mempunyai konsistensi feses seperti bubur (12 sampel) diikuti oleh lunak (7) dan cair (9).Penelitian ini tidak dapat mendeskripsikan distribusi dari kecenderungan konsistensi feses berdasarkan bakteri yang terdeteksi oleh karena hanya ada masing-masing satu sampel diare yang terdeteksi bakterinya (Tabel 4.6), kecuali pada sampel yang terdeteksi E.coli (13). Beberapa penelitian lain mengelompokan data tentang karakteristik klinis diare hanya berdasarkan cair atau tidak, serta adanya lendir atau darah. Bonkoungou dkk (2013) memaparkan bahwa diare yang disebabkan oleh bakteri patogen ataupun virus memiliki konsistensi feses cair hampir 100%.67 Hasil serupa juga dilaporkan oleh Youseff dkk (2000).68

Berdasarkan data yang terkumpul dari 28 subyek penelitian, 12 diantarnya mengalami demam dan 16 tidak mengalami demam. Manifestasi klinis demam pada diare dapat timbul baik pada infeksi bakteri ataupun virus. Youseff dkk, melaporkan bahwa demam pada diare timbul di 38% kasus infeksi Rotavirus, sedangkan pada infeksi bakteri demam timbul pada 47,5%, 60%,80% dan 60% kasus infeksi akibat EPEC, Shigella spp, ETEC dan EaggEC.68 Sedangkan Denno DM dkk melaporkan adanya demam pada 12 dari 33 kasus diare akibat infeksi virus dan 8 dari 88 kasus diare akibat infeksi bakteri.64

Demam dapat timbul karena enterotoksin atau indikasi adanya kerusakan jaringan akibat invasi mikroorganisme.69 Kadar interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) yang meningkat juga berkaitan dengan timbulnya demam dan jumlah episode diare yang timbul.70

Dalam beberapa penelitian diketahui bahwa E. coli, Campylobacter jejuni, Shigella spp dan Vibrio spp.9, 53, 71 sebagai penyebab diare pada anak, sementara


54

Clostridium perfringens dketahui sebagai penyebab gastroenteritis akibat keracunan makanan.72,

73

Karena penelitian ini tidak dapat mendeteksi dan

membedakan strain pathogen E.coli, sehingga diasumsikan bahwa E.coli yang dideteksi

merupakan

patogen.

Dalam

penelitian

ini

hubungan

antara

enteropatogen dan kejadian diare tidak bermakna secara statistik (p = 0,571). Terdapat dua kemungkinan yang mendukung analisis statistik ini: (1) semua E.coli yang dideteksi (pada kelompok diare 18, dan non-diare 21) dianggap sebagai enteropatogen tanpa investigasi strain patogenik, (2) perhitungan juga memasukkan hasil deteksi multiple matches yang berkontribusi terhadap hasil analisis statistik. Kekuatan hubungan antara enteropatogen dan diare dalam klinis perlu dianalisa dengan desain kasus-kontrol, dengan menggunakan odds ratio. Nilai OR yang diperoleh adalah 0,724 (CI 95%: 0,237 – 2,215) mempunyai arti adanya hubungan kuat yang bermakna antara enteropatogen dengan kejadian diare (CI melewati angka 1). Hal ini menunjukkan bahwa enteropatogen memberikan kontribusi peranan dalam menyebabkan diare. Lebih lanjut lagi probabilitas kasus diare untuk disebabkan enteropatogen dengan nilai OR=0,724 adalah sebesar 42% (p=OR/(1+OR).

5.7 Keterbatasan penelitian

Hasil deteksi PCR-ESI/MS dari penelitian ini meski tidak memberikan gambaran interaksi antara populasi mikrobiota dan enteropatogen pada anak sehat dan diare namun memberikan hasil bahwa enteropatogen hanya ditemukan pada kasus diare. Selain itu, tidak dilakukannya investigasi lebih lanjut terhadap strain pathogen E.coli mempunyai pengaruh terhadap analisa statistik yang dilakukan. Keterbatasan ini masih dapat diatasi dengan penelitian lanjutan, salah satunya adalah komparasi dengan metode deteksi yang lain.


55

BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil yang telah diperoleh, dapat disimpulkan bahwa :

1. Pada kelompok sampel diare dideteksi enteropatogen yaitu Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni dan Shigella boydii yang tidak dideteksi pada sampel non diare. 2. Pada kelompok sampel non diare dideteksi bakteri anggota filum Actinobacteria

(Bifidobacterium

longum)

yang

bersifat

probiotik

sementara pada kelompok diare tidak ditemukan. 3. Tampaknya kemungkinan anak-anak yang positif enteropatogen pada fesesnya memiliki kecenderungan untuk mengalami diare dibandingkan dengan yang tidak.

6.2 Saran

1. Perlu dilakukan uji lebih lanjut untuk mengkonfirmasi hasil multiple matches pada kedua kelompok sampel untuk mendapatkan hasil yang pasti. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap mikroba lingkungan dalam kaitannya dengan diare. 3. Perlu diteliti lebih lanjut mengenai komposisi dan keseimbangan mikroba usus terhadap patogenesitas infeksi sebagaimana yang telah dilaporkan pada mikroba lambung 4. Perlunya diperhatikan asupan makanan sehari-hari yang mengandung probiotik demi memelihara kesehatan saluran cerna.


56

DAFTAR PUSTAKA

1.

Sekirov I, Russell SL, Antunes LC, Finlay BB. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev 2010;90:859-904.

2.

Wallace TC, Guarner F, Madsen K, Cabana MD, Gibson G, Hentges E, et al. Human gut microbiota and its relationship to health and disease. Nutrition reviews 2011;69:392-403.

3.

Mackie RI, Sghir A, Gaskins HR. Developmental microbial ecology of the neonatal gastrointestinal tract. Am J Clin Nutr 1999;69:1035S-45S.

4.

Sommer F, Backhed F. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nat Rev Microbiol 2013;11:227-38.

5.

Frank DN, St Amand AL, Feldman RA, Boedeker EC, Harpaz N, Pace NR. Molecular-phylogenetic characterization of microbial community imbalances in human inflammatory bowel diseases. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104:13780-5.

6.

Pinto C, Velebit L, Shibuya K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. In: Bulletin of the World Health Organization; 2008:710-7.

7.

Allen SJ, Martinez EG, Gregorio GV, Dans LF. Probiotics for treating acute infectious diarrhoea. Cochrane Database Syst Rev 2010:CD003048.

8.

Oyofo B, Murad L, Subekti D, Tjaniadi P, Larasati W, Putri M. Surveillance of bacterial pathogen of diarrhea disease in Indonesia. Diagnost Microbiol and Infect Dis 2002:227-34.

9.

Oyofo B, Subekti D, Tjaniadi P, Machpud N, Komalarini S, Setiawan B. Enteropathogen associated with acute diarrhea in community and hospital patients in Jakarta, Indonesia. FEMS Immun and Med Microbiol 2002:139-46.

10

Eckburg P, Bik E, Bernstein C, Purdom E, Dethlefsen L, Sargent M, et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 2005:1635-8.

11. Zoetendal EG, von Wright A, Vilpponen-Salmela T, Ben-Amor K, Akkermans AD, de Vos WM. Mucosa-associated bacteria in the human gastrointestinal tract are uniformly distributed along the colon and differ from the community recovered from feces. Appl Environ Microbiol 2002;68:3401-7.


57

12. Franks AH, Harmsen HJ, Raangs GC, Jansen GJ, Schut F, Welling GW. Variations of bacterial populations in human feces measured by fluorescent in situ hybridization with group-specific 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes. Appl Environ Microbiol 1998;64:3336-45. 13. Kaleta EJ, Clark AE, Johnson DR, Gamage DC, Wysocki VH, Cherkaoui A, et al. Use of PCR coupled with electrospray ionization mass spectrometry for rapid identification of bacterial and yeast bloodstream pathogens from blood culture bottles. J Clin Microbiol 2011;49:345-53. 14. Ecker DJ, Sampath R, Blyn LB, Eshoo MW, Ivy C, Ecker JA, et al. Rapid identification and strain-typing of respiratory pathogens for epidemic surveillance. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:8012-7. 15. Cover TL, Blaser MJ. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology 2009;136:1863-73. 16. Swidsinski A, Loening-Baucke V, Lochs H, Hale LP. Spatial organization of bacterial flora in normal and inflamed intestine: a fluorescence in situ hybridization study in mice. World J Gastroenterol 2005;11:1131-40. 17. Sobieszczańska BM. The influence of intestinal dysbiosis on human’s health. Gastroenterologia Polska 2008;15:287-90. 18. Buffie CG, Pamer EG. Microbiota-mediated colonization resistance against intestinal pathogens. Nature reviews Immunology 2013;13:790-801. 19. Sekirov I, Finlay BB. The role of the intestinal microbiota in enteric infection. J Physiol 2009;587:4159-67. 20. Alakomi HL, Skytta E, Saarela M, Mattila-Sandholm T, Latva-Kala K, Helander IM. Lactic acid permeabilizes gram-negative bacteria by disrupting the outer membrane. Appl Environ Microbiol 2000;66:20015. 21. Velraeds MM, van der Mei HC, Reid G, Busscher HJ. Inhibition of initial adhesion of uropathogenic Enterococcus faecalis by biosurfactants from Lactobacillus isolates. Appl Environ Microbiol 1996;62:1958-63. 22. Reid G, Howard J, Gan BS. Can bacterial interference prevent infection? Trends Microbiol 2001;9:424-8. 23. Mazmanian SK, Liu CH, Tzianabos AO, Kasper DL. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell 2005;122:107-18.


58

24. Suzuki K, Meek B, Doi Y, Muramatsu M, Chiba T, Honjo T, et al. Aberrant expansion of segmented filamentous bacteria in IgA-deficient gut. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:1981-6. 25. Umesaki Y, Okada Y, Matsumoto S, Imaoka A, Setoyama H. Segmented filamentous bacteria are indigenous intestinal bacteria that activate intraepithelial lymphocytes and induce MHC class II molecules and fucosyl asialo GM1 glycolipids on the small intestinal epithelial cells in the ex-germ-free mouse. Microbiol Immunol 1995;39:555-62. 26. Ivanov, II, Littman DR. Segmented filamentous bacteria take the stage. Mucosal immunology 2010;3:209-12. 27. Pham M, Lemberg DA, Day AS. Probiotics: sorting the evidence from the myths. Med J Aust 2008;188:304-8. 28. Koning CJ, Jonkers DM, Stobberingh EE, Mulder L, Rombouts FM, Stockbrugger RW. The effect of a multispecies probiotic on the intestinal microbiota and bowel movements in healthy volunteers taking the antibiotic amoxycillin. Am J Gastroenterol 2008;103:178-89. 29. Hviid A, Svanstrom H. Antibiotic use and intussusception in early childhood. J Antimicrob Chemother 2009;64:642-8. 30. Iapichino G, Callegari ML, Marzorati S, Cigada M, Corbella D, Ferrari S, et al. Impact of antibiotics on the gut microbiota of critically ill patients. J Med Microbiol 2008;57:1007-14. 31. Lupp C, Robertson ML, Wickham ME, Sekirov I, Champion OL, Gaynor EC, et al. Host-mediated inflammation disrupts the intestinal microbiota and promotes the overgrowth of Enterobacteriaceae. Cell Host Microbe 2007;2:204. 32. Kuehl CJ, Wood HD, Marsh TL, Schmidt TM, Young VB. Colonization of the cecal mucosa by Helicobacter hepaticus impacts the diversity of the indigenous microbiota. Infect Immun 2005;73:6952-61. 33. Aebischer T, Fischer A, Walduck A, Schlotelburg C, Lindig M, Schreiber S, et al. Vaccination prevents Helicobacter pylori-induced alterations of the gastric flora in mice. FEMS Immunol Med Microbiol 2006;46:2219. 34. Blaser MJ. Who are we? Indigenous microbes and the ecology of human diseases. EMBO Rep 2006;7:956-60. 35. Bik EM, Eckburg PB, Gill SR, Nelson KE, Purdom EA, Francois F, et al. Molecular analysis of the bacterial microbiota in the human stomach. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103:732-7.


59

36. Blaser MJ, Atherton JC. Helicobacter pylori persistence: biology and disease. J Clin Invest 2004;113:321-33. 37. WHO. Diarrhoeal disease. In: World Health Organization Fact Sheet 2009. 38. Fischer Walker C, Aryee M, Pinto C, Black R. Estimating Diarrhea Mortality among Young Children in Low and Middle Income Countries. In: PLoS ONE 7(1); 2012:e29151. doi:10.1371/journal.pone.0029151. 39. Thapar N, Sanderson IR. Diarrhoea in children: an interface between developing and developed countries. Lancet 2004;363:641-53. 40

Farthing Mc. World Gastroenterology Organisation Practice Guideline : Acute Diarrhea. In: World Gastroenterology Organisation 2008.

41. Blasser M. Epidemiologic and Clinical Features of Campylobacter jejuni Infections. J Infect Dis 1997;176 Suppl 2:S103-5. 42. Taylor G. Polymerase Chain Reaction: Basic Priciples and Automation. In: McPherson M, Quirke P, Taylor G, eds. PCR Vol 1 Practical Approach. Oxford: Oxford University Press; 1991:1-49. 43. Wolk DM, Kaleta EJ, Wysocki VH. PCR-electrospray ionization mass spectrometry: the potential to change infectious disease diagnostics in clinical and public health laboratories. J Mol Diagn 2012;14:295-304. 44. Inc AM. PLEX-ID System Customer Training Guide. In; 2011. 45. Kaleta EJ, Clark AE, Cherkaoui A, Wysocki VH, Ingram EL, Schrenzel J, et al. Comparative analysis of PCR-electrospray ionization/mass spectrometry (MS) and MALDI-TOF/MS for the identification of bacteria and yeast from positive blood culture bottles. Clin Chem 2011;57:1057-67. 46. Jacob D, Sauer U, Housley R, Washington C, Sannes-Lowery K, Ecker DJ, et al. Rapid and high-throughput detection of highly pathogenic bacteria by Ibis PLEX-ID technology. PLoS One 2012;7:e39928. 47. Mudiyono B, Moeslichan S, Sastroasmoro S, Budian I, Purwanto H. Perkiraan Besar Sampel. In: Sastroasmoro S, Ismael S, eds. Dasar-Dasar Metodologi Penelitian Klinis Edisi 2. Jakarta: Sagung Seto; 2002:25786. 48. Kementerian Kesehatan RI. Situasi diare di Indonesia. Buletin Jendela Data & Informasi Kesehatan 2011.


60

49. Greisen K, Loeffelholz M, Purohit A, Leong D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol 1994;32:335-51. 50. Sampath R, Mulholland N, Blyn LB, Massire C, Whitehouse CA, Waybright N, et al. Comprehensive biothreat cluster identification by PCR/electrospray-ionization mass spectrometry. PLoS One 2012;7:e36528. 51. Rost M. PLEX-ID enquiries from Indonesia. In: Meulila F, ed.; 2013. 52. Bannister B, Gillespie S, Jones J. Infection Microbiology and Management 3rd ed. Massachusetts: Blackwell Publishing; 2006. 53. Bodhidatta L, McDaniel P, Sornsakrin S, Srijan A, Serichantalergs O, Mason CJ. Case-control study of diarrheal disease etiology in a remote rural area in Western Thailand. Am J Trop Med Hyg 2010;83:1106-9. 54. Pawlowski D, Raslawsky A, Siebert G, Metzger D, Koudelka G, Karalus R. Identification of Hylemonella gracilis as an Antagonist of Yersinia pestis Persistence J Bioterr Biodef S3:004 2011:doi:10.4172/2157-526. 55. Malkan AD, Strollo W, Scholand SJ, Dudrick SJ. Implanted-port-catheterrelated sepsis caused by Acidovorax avenae and methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2009;47:3358-61. 56. Everard A, Belzer C, Geurts L, Ouwerkerk JP, Druart C, Bindels LB, et al. Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity. Proc Natl Acad Sci U S A 2013;110:9066-71 57. Yatsunenko T, Rey FE, Manary MJ, Trehan I, Dominguez-Bello MG, Contreras M, et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature 2012;486:222-7. 58. Monstein HJ, Tiveljung A, Kraft CH, Borch K, Jonasson J. Profiling of bacterial flora in gastric biopsies from patients with Helicobacter pyloriassociated gastritis and histologically normal control individuals by temperature gradient gel electrophoresis and 16S rDNA sequence analysis. J Med Microbiol 2000;49:817-22. 59

Marteau P, Pochart P, Dore J, Bera-Maillet C, Bernalier A, Corthier G. Comparative study of bacterial groups within the human cecal and fecal microbiota. Appl Environ Microbiol 2001;67:4939-42.


61

60. Andersson AF, Lindberg M, Jakobsson H, Backhed F, Nyren P, Engstrand L. Comparative analysis of human gut microbiota by barcoded pyrosequencing. PLoS One 2008;3:e2836. 61. Suerbaum S, Michetti P. Helicobacter pylori infection. N Engl J Med 347 2002:1175–86. 62. Hien BT, Trang do T, Scheutz F, Cam PD, Molbak K, Dalsgaard A. Diarrhoeagenic Escherichia coli and other causes of childhood diarrhoea: a case-control study in children living in a wastewater-use area in Hanoi, Vietnam. J Med Microbiol 2007;56:1086-96. 63. Dennehy PH. Acute diarrheal disease in children: epidemiology, prevention, and treatment. Infect Dis Clin North Am 2005;19:585-602. 64. Denno DM, Stapp JR, Boster DR, Qin X, Clausen CR, Del Beccaro KH, et al. Etiology of diarrhea in pediatric outpatient settings. Pediatr Infect Dis J 2005;24:142-8. 65. Roman E, Wilhelmi I, Colomina J, Villar J, Cilleruelo ML, Nebreda V, et al. Acute viral gastroenteritis: proportion and clinical relevance of multiple infections in Spanish children. J Med Microbiol 2003;52:43540. 66. de Wit MA, Koopmans MP, Kortbeek LM, van Leeuwen NJ, Vinje J, van Duynhoven YT. Etiology of gastroenteritis in sentinel general practices in the netherlands. Clin Infect Dis 2001;33:280-8. 67. Bonkoungou IJ, Haukka K, Osterblad M, Hakanen AJ, Traore AS, Barro N, et al. Bacterial and viral etiology of childhood diarrhea in Ouagadougou, Burkina Faso. BMC pediatrics 2013;13:36. 68. Youssef M, Shurman A, Bougnoux M, Rawashdeh M, Bretagne S, Strockbine N. Bacterial, viral and parasitic enteric pathogens associated with acute diarrhea in hospitalized children from northern Jordan. FEMS Immunol Med Microbiol 2000;28:257-63. 69. McQuaid K. Gastrointestinal Disorders. In: McPhee S, Papadakis M, Tierney L, eds. Current Medical Diagnosis & Treatment 2009. New York: McGraw Hill:487-581. 70. Reisinger EC, Fritzsche C, Krause R, Krejs GJ. Diarrhea caused by primarily non-gastrointestinal infections. Nature clinical practice Gastroenterology & hepatology 2005;2:216-22. 71. Buktiwetan P, Surjawidjaja J, Salim O, Aidilifit M, Lesmana M. Diare bakterial : etiologi dan kepekaan Antibiotika di dua Pusat Kesehatan Masyarakat di Jakarta. Jkedokter Trisakti 2001;20:57-65.


62

72. Baumgardner DJ. Soil-related bacterial and fungal infections. Journal of the American Board of Family Medicine : JABFM 2012;25:734-44. 73

Haagsma J. Pathogenic anaerobic bacteria and the environment. Rev Sci Tech 1991;10:749-64.





Lampiran 1

PENJELASAN DAN FORM PERSETUJUAN PENELITIAN (Subyek Penelitian dengan diare)

Profilmikrobaususpadaanakusia 2 – 12 tahundengandiaredan non diaremenggunakanPolymerase Chain Reaction / Electrospray Ionization- Mass Spectrometry (PCR/ESI-MS)

Kami peneliti dari Departemen Mikrobiologi Klinik FKUI Jakarta sedang melakukan penelitian untuk menganalisa mikroba usus pada anak usia 2-5 tahun dengan diare dan non diare menggunakan Polymerase Chain Reaction / Electrospray Ionization Mass Spectrometry (PCR/ESI-MS) dengan focus pada bakteri pathogen penyebab diare dan bakteri penghasil asam laktat. Diare merupakan salah satu penyebab utama morbiditas dan mortalitas pada anak balita, dengan rata-rata episode per anak per tahun pada kelompok umur ini di negara berkembang adalah 3,2. Di Indonesia, dari survei rumah tangga didapatkan bahwa diare merupakan penyebab ketiga terbanyak angka kesakitan dengan 7,8 per 1000 penduduk dan menjadi penyebab terbanyak kematian pada bayi yaitu 24,1% dari semua kematian dan 40% dari seluruh kematian bayi di bawah 2 tahun. Putra atau putri anda merupakan subyek yang terpilih karena memiliki gejala diare dan diminta ikut serta dalam penelitian ini. Adanya mikrobiota pada saluran pencernaan dapa tberperan dalam mencegah terjadinya kolonisasi bakteri patogen.Telah banyak penelitian, khususnya penelitian mengenai probiotik yang menyumbangkan pengetahuan tentang identifikasi

spesies-spesien

bakteri

yang berbeda-beda

dengan

aktivitas

antagonistic terhadap bakteri patogen. Komposisi mikroba usus pada kasus diare anak usia 2-5 tahun belum pernah dilakukan di Indonesia. Pengetahuan mengenai komposisi mikroba usus memiliki manfaat dalam studi epidemiologi mikrobiota usus pada kelompok umur khusus, mengetahuikomposisibakteri pathogen dan


bakteri penghasil asam laktat (BAL), dan member pertimbangan terapetik terkait probiotik. Bila anda berkenan, kami akan melakukan pengambilan sample feses (tinja) dari putra/putri anda. Tindakan ini tidak berbahaya karena mengambil feses yang telah dikeluarkan dari tubuh. Sample fesesl didapatkan, akan dipergunakan dalam penelitian yang bertujuan untuk pengembangan pemeriksaan laboratorium dan pengembangan pengobatan. Kami menjamin bahwa bahan tersebut tidak akan digunakan untuk kepentingan lain dan data-data

tentang

keluarga

Bapak/Ibu/saudara akan

dijaga

kerahasiaannya. Bersama ini kami sertakan form persetujuan untuk mengikuti penelitian.


Lampiran2

PENJELASAN DAN FORM PERSETUJUAN PENELITIAN (Subyek Penelitian tanpa diare)

Profilmikrobaususpadaanakusia 2 – 12 tahundengandiaredan non diaremenggunakanPolymerase Chain Reaction / Electrospray Ionization- Mass Spectrometry (PCR/ESI-MS)

Kami peneliti dari Departemen Mikrobiologi Klinik FKUI Jakarta sedang melakukan penelitian untuk menganalisa mikroba usus pada anak usia 2-5 tahun dengan diare dan non diare menggunakan Polymerase Chain Reaction / Electrospray Ionization Mass Spectrometry (PCR/ESI-MS) dengan focus pada bakteri pathogen penyebab diare dan bakteri penghasil asam laktat. Diare merupakan salah satu penyebab utama morbiditas dan mortalitas pada anak balita, dengan rata-rata episode per anak per tahun pada kelompok umur ini di negara berkembang adalah 3,2. Di Indonesia, dari survei rumah tangga didapatkan bahwa diare merupakan penyebab ketiga terbanyak angka kesakitan dengan 7,8 per 1000 penduduk dan menjadi penyebab terbanyak kematian pada bayi yaitu 24,1% dari semua kematian dan 40% dari seluruh kematian bayi di bawah 2 tahun. Adanya mikrobiota pada saluran pencernaan dapat berperan dalam mencegah terjadinya kolonisasi bakteri patogen. Pengetahuan mengenai komposisi mikroba usus memiliki manfaat dalam studi epidemiologi mikrobiota usus pada kelompok umur khusus, mengetahui komposisi bakteri pathogen dan bakteri penghasil asam laktat (BAL), dan member pertimbangan terapetik terkait probiotik. Penelitian mengenai komposisi mikroba usus pada anak usia 2-5 tahun belum pernah dilakukan di Indonesia. Bila anda berkenan, maka putra atau putri andaakan kami ikut sertakan sebagai subyek penelitian kami yang akankami ambil sample feses (tinja)nya. Tindakan ini tidak berbahaya karena mengambil feses yang telah dikeluarkan dari tubuh.


Sample feses yang didapatkan, akan dipergunakan dalam penelitian yang bertujuan untuk pengembangan pemeriksaan laboratorium dan pengembangan ilmu pengetahuan. Kami menjamin bahwa bahan tersebut tidak akan digunakan untuk kepentingan lain dan data-data

tentang

keluarga

Bapak/Ibu/saudara akan

dijaga

kerahasiaannya. Bersama ini kami sertakan form persetujuan untuk mengikuti penelitian.


Lampiran 3. FORM PERSETUJUAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa setelah membaca lembar informasi penelitian : ‫־‬

Saya mengerti sepenuhnya tentang konsekuensi pengambilan feses (tinja) putra/putri saya.

‫־‬

Saya telah cukup mendapatkanin formasim engenai penelitian yang akan dilakukan mencakup tujuan dan manfaat penelitian, prosedur yang akan dilakukan dan kemungkinan efek samping

‫־‬

Saya setuju untuk dilibatkan dalam penelitian ini

‫־‬

Saya tahu bahwa data penelitian ini akan dirahasiakan oleh peneliti

‫־‬

Saya bersedia

semua data yang didapatkan akan dikumpulkan dan

diproses sesuai prosedur penelitian dan saya berhak mengetahui hasil pemeriksaan terhadap sample feses putra/putri saya. ‫־‬

Saya tidak berkeberatan bila isolate dari sample feses tersebu tmenjadi milik dan koleksi Dept. Mikrobiologi FKUI untuk dapat dilakukan penelitian selanjutnya.

Saya BERSEDIA / TIDAK BERSEDIA*)ikutsertadalampenelitianini. Jakarta, …………………… 2012 Pasien Nama jelas dan tanda tangan

( ......................................... ) *) Coret yang tidak perlu

Peneliti : dr. Teguh Sarry Hartono (081584379119) PPDS MikrobiologiKlinik FKUI Jl. PegangsaanTimur 16 JakartaPusat Tandatangan Lampiran 4 ……………………………………. Universitas Indonesia Profil mikroba…, Teguh Sarry Hartono, FK UI, 2014

DATA PASIEN

Kode pasien

:

Nama subyek/pasien

:

Usia

:

Jenis kelamin

:L/P

Nama orang tua

:

Alamat

:

Pengambilansample feses

: tgl………………………jam pengambilan:

…….


Lampiran 5. Hasil deteksi bakteri dengan data karakteristik klinis yang diperoleh pada sampel diare Kode sample D04 D15 D16 D16 D17 D17 D20 D30 D13 D18 D25 D27 D19 D24 D14 D22 D22 D29 D31 D08 D11 D11 D03 D14 D05 D07 D09 D28 D28 D32 D01 D21 D02 D23 D06 D10 D12 D26 D33 D33

Usia (tahun. bulan) 2.2 4.6 4.4 4.4 2.0 2.0 2.6 2.6 3.0 3.0 3.0 2.0 4.0 4.6 1.10 2.7 2.7 2.0 2.8 5.2 4.5 4.5 2.1 1.10 6.3 4.5 2.2 4.3 4.3 2.0 5.0 2.1 9.10 4.2 7.1 4.6 2.0 3.4 2.0 2.0

Jenis Kelamin Laki-laki Perempuan Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Perempuan Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Perempuan Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Perempuan Perempuan Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Perempuan Perempuan Perempuan Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Perempuan Perempuan Laki-laki Perempuan Perempuan

Copy genome (/uL)

Bakteri E.coli E.coli/E. coli O157:not H7/S. boydii/S. sonnei C.perfringens Shigella boydii E.coli Strep estibularis TTd C.jejuni E.coli/S.flexneri/S.sonnei E.coli E.coli E.coli E.coli E.coli E.coli/S.flexneri/S.sonnei E.coli Klebsiella pneumonia E.coli E.coli E.coli E.coli/S.dysentriae Strep sp E.coli E.coli/S.flexneri/S.sonnei TTd TTd E.coli Acidovorax avenae E.coli E.coli Eubacterium rectale Provetella albensis E.coli/S. flexneri/S.sonnei E.coli Klebsiella pneumonia S.epidermidis E.coli E.coli Aquaspirillum gracile E.coli/S.flexneri/S.sonnei

8438 19691 170 6276 328 2993 0 9847 274 178 300 266 1288 314 245 876 466 290 415 7459 213 1786 14178 245 0 0 2918 965 2508 428 1436 20090 373 43128 268 5768 12362 305 86826 276

Qscore

1,00 0,97 0,86 0,99 0,92 0,86 0,00 0,90 0,93 0,95 0,93 0,94 0,97 0,93 0,93 0,96 0,92 0,89 0,95 1,00 0,9 0,87 0,99 0,93 0,00 0,00 0,93 0,88 0,99 0,95 0,99 0,89 0,94 1,00 0,93 0,90 1,00 0,93 0,85 0,93

Konsistensi feses seperti bubur seperti bubur seperti bubur seperti bubur seperti bubur seperti bubur seperti bubur seperti bubur seperti bubur cair cair cair lunak lunak cair lunak lunak lunak lunak seperti bubur seperti bubur seperti bubur seperti bubur cair cair cair cair cair cair cair lunak lunak seperti bubur seperti bubur

Penyerta lendir lendir lendir lendir lendir lendir lendir lendir lendir, darah

lendir lendir lendir lendir lendir lendir lendir lendir lendir, darah lendir

Riwayat Penyakit Sekarang Diare Gejala lain Frekuensi/ha Warna Lama (hari) Demam Muntah ri kunin 3-5x 5 ya 3-5x 1 ya kuning kehijauan 6-10x 2 ya ya kuning kehijauan 6-10x 2 ya ya kuning kehijauan 3-5x 7 ya ya kuning kehijauan 3-5x 7 ya ya 6-10x 2 ya 6-10x 2 ya ya kuning 3-5x 1 ya ya 3-5x 1 ya 3-5x 1 ya 6-10x 2 ya ya 3-5x 2 ya ya 3-5x 2 ya 3-5x 1 3-5x 1 3-5x 1 3-5x 1 kehijauan 3-5x 1 3-5x 2 3-5x 2 3-5x 2 kehijauan >10x 1 3-5x 1 6-10x 1 3-5x 1 3-5x 3 3-5x 2 3-5x 2 3-5x 1 3-5x 1 3-5x 1 3-5x 2 3-5x 1

Keterangan : Data disusun berdasarkan kelengkapan data yang dikumpulkan kemudian dikelompokan berdasarkan ada atau tidaknya demam. Kode sampel yang sama menandakan bahwa sampel berasal dari sampel yang sama dan pada sampel tersebut dideteksi bakteri seperti yang tercantum


Lampiran 6. Hasil deteksi PLEX-ID pada sampel diare dan non-diare Sample diare

Usia Kode (tahun. sample bulan) D01 D02 D03 D04 D05 D06 D07 D08 D09 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 D19 D20 D21 D22 D23 D24 D25 D26 D27 D28 D29 D30 D31 D32 D33

5.0 9.10 2.1 2.2 6.3 7.1 4.5 5.2 2.2 4.6 4.5 2.0 3.0 1.10 4.6 4.4 2.0 3.0 4.0 2.6 2.1 2.7 4.2 4.6 3.0 3.4 2.0 4.3 2.0 2.6 2.8 2.0 2.0

Sampel non-diare

Jenis Kelamin

Mikroorganisme

Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Perempuan Perempuan Perempuan Laki-laki Laki-laki Perempuan Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Perempuan Laki-laki Laki-laki Laki-laki Perempuan Laki-laki Perempuan Laki-laki Perempuan Perempuan

Eubacterium rectale E.coli/S.flexneri/S.sonnei E.coli E.coli TTd Klebsiella pneumonia TTd E.coli E.coli S.epidermidis E.coli/S.dysentriae + Strep sp E.coli E.coli/S.flexneri/S.sonnei E.coli/S.flexneri/S.sonnei E.coli/Escherichia coli O157:not H7/Shigella boydii/Shigella sonnei Shigella boydii + C.perfringens E.coli + Strep estibularis E.coli E.coli TTd Provetella albensis E.coli + K.pneumonia E.coli E.coli E.coli E.coli E.coli E.coli + Acidovorax avenae E.coli C.jejuni E.coli E.coli E.coli/S.flexneri/S.sonnei + Aquaspirillum gracile

Usia Kode (tahun. Jenis Kelamin sample bulan) S01 S02 S03 S04 S05 S06 S07 S08 S09 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S30 S31 S32 S33 S34 S35 S36 S37 S38 S39 S40 S41 S42 S43 S44 S45 S46 S47

4.6 3.11 5.6 4.6 2.3 5.0 2.3 6.0 4.2 4.10 5.1 4.5 4.4 4.8 5.0 5.5 4.11 3.10 6.10 4.3 4.6 7.5 4.7 5.1 4.4 5.4 4.8 3.9 3.9 4.11 4.11 4.7 6.5 5.3 11.0 6.0 4.10 4.11 3.9 4.2 4.1 6.4 10.7 5.6 5.1 4.10 5.0 5.1

Perempuan Laki-laki Perempuan Laki-laki Laki-laki Laki-laki Perempuan Perempuan Perempuan Perempuan Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Perempuan Perempuan Perempuan Perempuan Laki-laki Perempuan Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Perempuan Laki-laki Laki-laki Perempuan Perempuan Perempuan Perempuan Laki-laki Laki-laki Perempuan Laki-laki Perempuan Laki-laki Perempuan Perempuan Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki Laki-laki

Mikroorganisme Ttd E.coli E.coli E.coli E.coli E.coli E.coli Klebsiella pneumoniae E.coli E.coli/S.flexneri/S.sonnei E.coli + Vibrio proteolyticus/Vibrio sp. E.coli Ttd E.coli/Escherichia coli O157:not H7/S.sonnei E.coli Escherichia fergusonii E.coli/S.dysentriae Klebsiella pneumoniae Ttd E.coli E.coli Ttd E.coli/S.flexneri/S.sonnei Ttd Ttd E.coli/S.flexneri/S.sonnei Klebsiella pneumoniae Ttd Bifidobacterium longum Akkermansia muciniphila E.coli E.coli E.coli E.coli Ttd Ttd Ttd Ttd E.coli/S.flexneri/S.sonnei Bifidobacterium longum E.coli Ttd E.coli E.coli E.coli Ttd E.coli/Escherichia coli O157:not H7/S.sonnei E.coli


Lampiran 7. Perhitungan statistik dengan SPSS ver 17 diare * enteropatogen Crosstabulation enteropatogen Tidak diare

Tidak

Count

29

36

8.0

28.0

36.0

43.8%

51.8%

50.0%

9

27

36

8.0

28.0

36.0

56.3%

48.2%

50.0%

16

56

72

16.0

56.0

72.0

100.0%

100.0%

100.0%

% within enteropatogen Count Expected Count % within enteropatogen Total

Count Expected Count % within enteropatogen

Total

7

Expected Count

Ya

Ya

Chi-Square Tests Asymp. Sig. Value Pearson Chi-Square Continuity Correction

df

(2-sided)

a

1

.571

.080

1

.777

.322

1

.570

.321

Exact Sig. (2- Exact Sig. (1sided)

sided)

b

Likelihood Ratio Fisher's Exact Test N of Valid Cases

.778

.389

72

a. 0 cells (.0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 8.00. b. Computed only for a 2x2 table


Risk Estimate 95% Confidence Interval Value Odds Ratio for diare (Tidak /

Lower

Upper

.724

.237

2.215

.778

.325

1.862

1.074

.838

1.376

Ya) For cohort enteropatogen = Tidak For cohort enteropatogen = Ya N of Valid Cases

72


Identification of intestinal microbes profile in children with diarrhea and non-diarrhea using Polymerase Chain Reaction / Electrospray Ionization-Mass Spectrometry (PCR / ESI-MS) Teguh Sarry Hartono1, Dewi Murniati2, Andi Yasmon3, Lucky H Moehario3 1

Infectious Disease HospitalProf Dr Sulianti Saroso, Jalan Baru Sunter Permai Raya, Jakarta 14350 and Clinical Microbiology Resident–Departement of Microbiology, Faculty of Medicine, University of Indonesia,Jalan Pegangsaan Timur No.16, Jakarta 10320, Indonesia 2 Infectious Disease Hospital Prof Dr Sulianti Saroso, Jalan Baru Sunter Permai Raya, Jakarta 14350, Indonesia 3 Department of Microbiology, Faculty of Medicine, University of Indonesia, Jalan Pegangsaan Timur No.16, Jakarta 10320, Indonesia

Abstract Background: Microbiotapresent in the human intestinal are diverse and play important roles in metabolism and immunology. Infection that occurs in gastrointestinal tract, may lead to an imbalance in the composition of the intestinal bacteria.Knowledge of the intestinal microbes profile in children at spesific age with and without diarrhea might shed a light in the management of diarrhea associated with intestinal microflora imbalance. Objective: To obtain a profile of intestinal bacteria in children at spesific age with diarrhea and non-diarrhea which may be important for initial information in management of diarrhea associated intestinal microbes imbalance. Methods: This study was an analitical descriptive with cross sectional design. Stool samples were collected from two groups of subjects, with diarrhea and without diarrhea in children of 2-12 years old in North Jakarta. The samples were extracted using QIAamp® DNA Stool Mini Kit first followed by detection and identification using Polymerase Chain Ceaction / Electrospray Ionization-Mass Spectrometry. Result: A total 80 subjects were obtained, consisted of 33 children who had diarrhea (diarrhea subjects) and 47 children who did not have diarrhea (non-diarrheal subjects). Thirty of the 33 stool samples in diarrhea group showed the presence of one species microorganism (complete match), 6 samples resulted of multiple matches, while the other three samples did no show any bacteria. In the non-diarrhea group, of total 47 stool samples, 28 showed the presence of single match bacteria, 8 specimens gave result of multiple matches and 13 specimens showed no detectable bacteria. In both groups Escherechia coliand Klebsiella pneumonia appeared to be dominant. The bacteria present in the diarrhea group (12 of 30 samples) were more diverse than in nondiarrheal group (5 of 28). Phyla found in diarrhea group consisted of Firmicutes (5 samples), Proteobacteria (24), Bacteroidetes (1), while in non-diarrhea group were Actinobacteria (2), Proteobacteria (25), Verrucomicrobia (1). The relationship between enteropathogens with the incidence of diarrhea was not statistically significant (p=0.571; Chi-square test). The risk relationship between the incidence of diarrhea caused by enteropathogens was strong (OR = 0.724 with 95% CI: 0.237-2.215). 1 Profil mikroba…, Teguh Sarry Hartono, FK UI, 2014

Conclusion: Bacteria detected in diarrhea group apparently were more diverse than in nondiarrhea. There was similarity in the pattern of most detected bacteria in both sample groups, however, member of Actinobacteria (Bifidobacterium longum) where detected only in nondiarrhea group. Likely the chance of children with enteropathogen detected in the stool would have diarrhea more than children with no enteropathogen detected. Keywords: gut microbiota, diarrhea, PCR/ESI-MS

Introduction It is reported that the human microbiota contains as many as 1014 bacterial cells.1,2 The gastrointestinal tract (GIT) is the most heavily colonized organ; the colon alone contains over70% of all the microbes in the human body1, 2 The intestinal microbiota composed of more than 1000 species.3Almost all of these species (98%) owned only by four bacterial phyla: Firmicutes (64%), Bacteroidetes (23%), Proteobacteria (8%), and Actinobacteria (3%).4 Other species that exist, are members of the phylum Verrumicrobia, Fusobacteria and Cyanobacteria.3Samples from the small intestine were enriched for the Bacilli class of the Firmicutes and Actinobacteria. On the otherhand, Bacteroidetes and the Lachnospiraceae family of the Firmicutes were more prevalent in colonic samples.4 Humans occasionally fall victim to invading enteric pathogens.1 The infection will affect on interaction among microbiota and trigger inflamation respone. Both of these process will influence the composition of intestinal microbiota. The composition ofthe host’s microbiota was altered by the infectious process, in particular, the resident obligately anaerobic bacteria were adversely affected.5 The intestinal mucosal inflammatory process also shows can trigger excessive growth of commensal Enterobacteriaceae become pathogenic.5 Intestinal microbial composition in children aged 2-12 years with diarrhea has not been done in Indonesia. Knowledge of the intestinal microbial profiles in the case of diarrhea of children aged 2-12 years had a significant benefit in providing a picture of the initial information for the development of case management of diarrhea associated with the restoring of intestinal microbial balance. A variety of techniques are available to study intestinal microbial communities. Some of these techniques include the full-length 16S rRNA sequencing6, denaturing gradient gel electrophoresis which was used by Zoetendal et al.7, and fluorescent in situ hybridization as was done by Franks et al.8Another technique for a complete identification of a large number of microorganisms is a Polymerase Chain Reaction 2 Profil mikroba…, Teguh Sarry Hartono, FK UI, 2014

coupled with Electrospray Ionization/Mass Spectrometry (PCR/ESI-MS), a technologybased on the PCR technique, using a wide range of primary and readout techniques of PCR products using dispersion technology and electro ionization mass spectrometry. This technology has been carried out to detect multiple pathogens and non-pathogenic microorganisms.9,10Therefor, we detected intestinal microbes to obtain a profile of the bacteria in children with diarrhea compared with non-diarrhea that is expected to describe the differences due to the imbalance of the gut microbiota.

Materials and methods

Clinical specimens The research was an analitical descriptive study with cross sectional design.Stool samples were collected from September to December 2012 at five site (Infectious Diseases Hospital Prof Dr Sulianti Saroso (IDH) and four public health centers (Puskesmas)) in the surrounding area, in North Jakarta, Indonesia. After sample collection, the samples were stoed at 40C for not more than 24 hours and immediately transported to laboratory using special coolbox. After arrival, the samples were stored at -700C until processed. The inclusion criteria for diarrhea sample were children aged 2-12 year which had an episode of acute diarrhea according to WHO criteria11, has not received antibiotic. For non-diarrheal sample, inclusion criteria were children aged 2-12 years, not being experienced episodes of diarrhea. For both sample groups , the parent or guardian agrees ascertained , by signing an informed consent. This study was approved by Ethical Committee Of Faculty Of Medicine, University of Indonesia with number 4751A/PT02.FK/ETIK/2012.

DNA extraction

Total DNA was extracted from 180-220 mg solid stool or 200 µl liquid stool. The extraction was performed by using QIAamp® DNA Stool Mini Kit according to the manufacturer's instructions with 200 µl of the elution. The elution was stored at -700C until processed.

3 Profil mikroba…, Teguh Sarry Hartono, FK UI, 2014

PCR-ESI/MS assay

Prior to PCR-ESI/MS, inhibitor in the samples were analized by conventional PCR. PCR-ESI/MS was performed by using PLEX-ID Broad Bacteria panel in accordance with manufacture’s instruction. The data treshold is 0.85 confidence, in that less than 0.85 were reported uninterpratable.12

Statistical analysis Statistical analysis was performed by using SPSS ver 17 software. The relationship between enteropathogens and diarrhea cases was done using Chi-square test with a p value of < 0.05 was considered significant. The risk relationship (Odds ratio) between those two was also measured

Result

Subjects profiles

Overall 80 subjects was obtained in accordance with the inclusion criteria, consisted of 33 children who had diarrhea (diarrhea subjects) and 47 children who did not have diarrhea (non-diarrheal subjects). Diarrhea subjects consisted of 24 boys and 9 girls with an age range of 2 years to 9 years and the median age of 3 years. While the non-diarrheal subjects consisted of 27 boys and 20 girls with an age range of 2 years 3 months to 11 years with a median age of 4 years and 4 months.

PLEX-ID result

The results of the PLEX-ID detection has the sense that the processor PLEX-ID reads one or more microorganisms with a Q score above 0.85 in accordance with the spectrometer database PLEX-ID. Thus if more than one bacteria detected in one sample with a different Q score, then the interpretation is that there is more than one bacteria that had the same opportunities as the detected bacteria. PLEX-ID detection results are listed in the result sheet, the results are divided into three kinds of results, as showed in Figure 1. From the results of the detection, at 30 of the 33 samples in diarrhea group detected the presence of bacterial (Table 1). Six of the 33 samples gave results of multiple matches, 4 Profil mikroba…, Teguh Sarry Hartono, FK UI, 2014

while the 3 other samples no detectable bacteria. In the non-diarrhea group, in 28 of 47 samples detected the presence of bacteria, the results of multiple matches in 8 of 47 samples and 13 samples no detectable bacteria

Detection of bacteria in samples

In Table 2, shows the bacterias which were detected in each sample gorup. In the diarrhea group, dominated by Escherechia coli followed by Klebsiella pneumonia, both from the phylum Proteobacteria. Another bacteriaswere Campylobacter jejuni, Acidovorax avenae and Aquaspirillum gracile, all from Proteobacteria, Staphylococcus epidermidis, Clostridium perfringens,

Streptococcus

vestibularfrom

Firmicutes

and

Prevotella

albensisfrom

Bacteroidetes. In the non-diarrhea group also dominated by Echerechia coliand also followed by Klebsiella

pneumonia.

Another

Protobacteria

detected

wasEscherichia

fergusonii.

Additionally it also detected the presence of Actinobacteria (Bifidobacterium longum) and Verrucomicrobia (Akkermansia muciniphila). Additionally it also obtained that the diversity of bacteria were detected in the diarrhea group (12 of 30 samples) more than in non-diarrheal group (5 of 28). In Figure 2 shows Firmicutes and Bacteroidetes were only detected in diarrhea group, while Actinobacteria and Verrumicrobia were only detected in non-diarrhea group. Proteobacteria was detected in both groups by the number of samples in non diarrhea more than in diarrhea group (25 vs. 24) The results of multiple matches was dominated by clusters of Escherichia coli / Shigella flexneri / Shigella sonnei in each sample group, 4 samples (D02, D13, D14 and D33) in the diarrhea group, and 4 samples (S10, S17, S23 and S38) in the non diarrhea group. Samples D11, D33 and S11 in addition detected as multiple matches, also detected bacteria, Streptococcus sp on D11, Aquaspirillum gracile species on sample D33, and Vibrio sp. on sample S1 (Table 3).

In this study, enteropathogens were determined using the assumption that the organisms identified using PLEX-ID were organisms known as enteropathogens. In single detection, they were Campylobacter jejuni., Clostridium perfringens and E. coli; in multiple matches, they were Shigella spp and Vibrio spp. Table 4 shows that of all cases with enteropathogens, 48.2% (27/56) had diarrhea. While in the cases with non-enteropathogens, which had 5 Profil mikroba…, Teguh Sarry Hartono, FK UI, 2014

diarrhea was 56.5% (9/16). Using Chi-square test gave p = 0.571. It means there is no significant relationship between enteropathogens with the incidence of diarrhea. Odds ratio is used to see the strength of the relationship between the incident of diarrhea by enteropathogens (OR 0,724 [95% CI: 0,237-2,215]). This means that the chance of having diarrhea caused by enteropathogens was 0.724 times than by non-enteropathogen.

Discussion

In this study, sampling sites located in North Jakarta, which includes two districts with a total of four health centers and one hospital. On the basis of the distance between the sites, which ranges from 4 km to IDH, the health centers were selected to facilitate sample collection. In addition, it is assumed homogenization of social, economic, environmental and climate of the subjects. Specimens obtained were placed in a cooler box with temperatures around 80C before transfer to a collection point in IDH on the day or the next day. From the published literature, stool specimens can be stored at 2-80C prior to processing.13 Of the 33 subjects diarrhea, there were 24 boys and 9 girls with an age range of 2 years to 9 years. This is in accordance with the Basic Health Survey Indonesia in 2007 that claimed the prevalence of diarrhea in boys was higher than girls, as well as the prevalence by age group ie 24-48 months of age had a higher prevalence than the age of 48 months upwards.14 The use of PLEX - ID of the faecal samples directly, as far as we know just recently conducted in this study. In previous studies on blood culture, the suitability of the results obtained at the species level by standard methods of 86.75 % ( n = 234 ) 9 and the results obtained in clinical isolates74% ( n = 156 ) identified appropriately, with only 9 % were incorrectly identified.15 In this study, due to not using the comparison method, the results of which can be expressed was, obtained 80 % ( 64 of 80 ) detected the presence of bacteria, with 14 of 64 samples detection results were the result of multiple matches ( Table 3 ). The detection results can not be distinguished further so reported as a cluster ( M. Rost, personal communication, April 12, 2013 ).16 Of the 14 samples are multiple matches , dominated by a cluster of Escherichia coli andShigella sp. This happens due to E. coli and Shigella is a bacterial species with close ties phylogenic.15 Escherechia coli is the dominant bacteria in the gastrointestinal tract.17 It is evident in both groups of the study that most of the E. coli bacteria was detected. Detection of Campylobacter jejuni and Shigella boydii , which are enteropathogens, in the diarrhea group, 6 Profil mikroba…, Teguh Sarry Hartono, FK UI, 2014

distinguish diversity detection results with non-diarrhea group. Despite the similar study with different detection methods , Bodhidatt ( 2010) in Thailand found that Campylobacter and Shigellawere also found in non-diarrheal samples.18 Moreover, it also detected the presence of the Aquaspirillum gracile which have a new name as Hylemonella gracilis. This bacterium is a bacterium commonly found in aquatic ecosystems.19 Other bacteria were detected in the diarrhea group were Acidovorax avenae. This bacterium is a Gram-negative rod bacteria, not pigmented and do not ferment lactose . Usually found in soil and water, as well known as plant pathogens. There are case reports stating that the bacteria associated with the onset of catheterrelated sepsis.20 Although very rare, the role of environmental bacteria which are not usually found associated with diarrhea should be evaluated and studied in the future. In the group of non-diarhea samples detected bacteria that all of them are is normal flora in the gastrointestinal tract.

Akkermansia

muciniphila colonizes in the intestinal mucosal lining and amounted to 3-5 % of the entire community of gut bacteria.21 Bifidobacterium species are commensal bacteria associated with the intestinal tissues synthesize compounds that affect a person's immunity. B.longum express serine protease inhibitor which plays a role in the function of immunomodulator.22 In non diarrhea samples, was not detected bacteria belonging to pathogens, such as Campylobacter sp and Shigella sp. While in the diarrhea group, no detection of probiotic bacteria that play a role in maintaining immunological conditions of children. There is possibility of imbalance in the digestive tract of children with diarrhea than non diarrhea, although it is more confirmed when the number of samples involved in this study is greater. Detection of E.coli and K.pneumonia in both groups of samples as most bacteria are detected, and also the similarity in the results of multiple matches, implies similarities of the intestinal microbiota in the subjects studied. The possibility of this is due to the similarity of subject demographics, which causes environmental, habits and eating patterns have similarities. In a study conducted by Yatsunenko et al (2012) stated that differences in cultural tradition also affect food, exposure to pets and livestock, and many other factors that could influence how and from where a gut microbiota/microbiome isacquired.23 We obtained, the dominant phyla in diarrhea and non-diarrhea group was Proteobacteria. Bacterial phyla were only detected in diarrhea group were Firmicutes and Bacteroidetes whereas that is only found in non-diarrheal group were Actinobacteria and Verrumicrobia. The composition of those bacterial phyla are intestinal microbial composition.3, 4 In this study, analysis of the intestinal microbial composition obtained from faecal samples only describe the intestinal microbial composition in general and do not 7 Profil mikroba…, Teguh Sarry Hartono, FK UI, 2014

describe the composition of gut microbes on the anatomical location of gastrointestinal tract. That is because most of the results obtained in each sample only one bacterium and to be able to know the different microbial composition at each anatomical location, samples should be obtained from the anatomical locations, such as the research conducted by Frank et al4, Monstein et al24 and Morteau et al.25 In few studies noted that E. coli, Campylobacter jejuni, Shigella spp and Vibrio spp as a cause of diarrhea in children,13, 18, 26 while Clostridium perfringens is known to cause food poisoning causes gastroenteritis.27, 28 Investigation of pathogenic strains of E. coli, was not included in the study, so the analysis it is to be assumed that allE. coli detected as a pathogen. In the study the relationship between enteropathogens and diarrhea incidence is not significant (p = 0.571). There are two possibilities that support this statistical analysis: (1) all E. coli detected (diarrhea = 18 and non-diarrhea = 21) were considered as enteropathogens without any investigation of pathogenic strains, (2) the calculation also includes multiple matches that likely contributed to the statistical analysis. The strength of the relationship between enteropathogens and diarrhea in a clinical need to be analyzed with the case-control design, using odds ratio. OR values obtained were 0.724 (95% CI: 0.237-2.215). It means there is a strong correlation between enteropathogens with the incident of diarrhea. Limitation of study was the results of PCR-ESI/MS detection while not giving an overview of interaction between microbiota and enteropathogens populations in non-diarrhea and diarrhea children, but provide results that enteropathogens found only in cases of diarrhea. These limitations can still be overcome by further research, one of which is a comparison with other detection methods.

Conclusion

Bacteria detected in the diarrhea group were more diverse than in the non-diarrhea group and similarity in the pattern of most detected bacteria in both sample groups. Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae were two most detected bacteria in both groups, suggest the gut microbiota was influenced by environmenta, habits and eating patterns. One of the well known probiotic bacteria i.e. Bifidobacterium longum were found only in non diarrhea group. Likely the chance of children with enteropathogen detected in the stool would have diarrhea 0.724 times more than children with no enteropathogen detected.


References

1.

Sekirov I, Russell SL, Antunes LC, Finlay BB. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev 2010;90:859-904.

2.

Ley RE, Peterson DA, Gordon JI. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell 2006;124:837-48

3.

Sommer F, Backhed F. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nat Rev Microbiol 2013;11:227-38.

4.

Frank DN, St Amand AL, Feldman RA, Boedeker EC, Harpaz N, Pace NR. Molecularphylogenetic characterization of microbial community imbalances in human inflammatory bowel diseases. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104:13780-5.

5.

Lupp C, Robertson ML, Wickham ME, Sekirov I, Champion OL, Gaynor EC, et al. Host-mediated inflammation disrupts the intestinal microbiota and promotes the overgrowth of Enterobacteriaceae. Cell Host Microbe 2007;2:204.

6.

Eckburg P, Bik E, Bernstein C, Purdom E, Dethlefsen L, Sargent M, et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 2005:1635-8.

7.

Zoetendal EG, von Wright A, Vilpponen-Salmela T, Ben-Amor K, Akkermans AD, de Vos WM. Mucosa-associated bacteria in the human gastrointestinal tract are uniformly distributed along the colon and differ from the community recovered from feces. Appl Environ Microbiol 2002;68:3401-7.

8.

Franks AH, Harmsen HJ, Raangs GC, Jansen GJ, Schut F, Welling GW. Variations of bacterial populations in human feces measured by fluorescent in situ hybridization with group-specific 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes. Appl Environ Microbiol 1998;64:3336-45.

9.

Kaleta EJ, Clark AE, Johnson DR, Gamage DC, Wysocki VH, Cherkaoui A, et al. Use of PCR coupled with electrospray ionization mass spectrometry for rapid identification of bacterial and yeast bloodstream pathogens from blood culture bottles. J Clin Microbiol 2011;49:345-53.

10. Ecker DJ, Sampath R, Blyn LB, Eshoo MW, Ivy C, Ecker JA, et al. Rapid identification and strain-typing of respiratory pathogens for epidemic surveillance. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:8012-7. 11. WHO. Diarrhoeal disease. In: World Health Organization Fact Sheet 2009. 12. Inc AM. PLEX-ID System Customer Training Guide. In; 2011.


13. Oyofo B, Subekti D, Tjaniadi P, Machpud N, Komalarini S, Setiawan B. Enteropathogen associated with acute diarrhea in community and hospital patients in Jakarta, Indonesia. FEMS Immun and Med Microbiol 2002:139-46. 14. Kementerian Kesehatan RI. Situasi diare di Indonesia. Buletin Jendela Data & Informasi Kesehatan 2011. 15. Sampath R, Mulholland N, Blyn LB, Massire C, Whitehouse CA, Waybright N, et al. Comprehensive biothreat cluster identification by PCR/electrospray-ionization mass spectrometry. PLoS One 2012;7:e36528. 16. Rost M. PLEX-ID enquiries from Indonesia. In: Meulila F, ed.; 2013. 17. Bannister B, Gillespie S, Jones J. Infection Microbiology and Management 3rd ed. Massachusetts: Blackwell Publishing; 2006. 18. Bodhidatta L, McDaniel P, Sornsakrin S, Srijan A, Serichantalergs O, Mason CJ. Casecontrol study of diarrheal disease etiology in a remote rural area in Western Thailand. Am J Trop Med Hyg 2010;83:1106-9. 19. Pawlowski D, Raslawsky A, Siebert G, Metzger D, Koudelka G, Karalus R. Identification of Hylemonella gracilis as an Antagonist of Yersinia pestis Persistence J Bioterr Biodef S3:004 2011:doi:10.4172/2157-526. 20. Malkan AD, Strollo W, Scholand SJ, Dudrick SJ. Implanted-port-catheter-related sepsis caused by Acidovorax avenae and methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2009;47:3358-61. 21. Everard A, Belzer C, Geurts L, Ouwerkerk JP, Druart C, Bindels LB, et al. Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity. Proc Natl Acad Sci U S A 2013;110:9066-71. 22. Buffie CG, Pamer EG. Microbiota-mediated colonization resistance against intestinal pathogens. Nature reviews Immunology 2013;13:790-801. 23. Yatsunenko T, Rey FE, Manary MJ, Trehan I, Dominguez-Bello MG, Contreras M, et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature 2012;486:2227. 24. Monstein HJ, Tiveljung A, Kraft CH, Borch K, Jonasson J. Profiling of bacterial flora in gastric biopsies from patients with Helicobacter pylori-associated gastritis and histologically normal control individuals by temperature gradient gel electrophoresis and 16S rDNA sequence analysis. J Med Microbiol 2000;49:817-22. 25. Marteau P, Pochart P, Dore J, Bera-Maillet C, Bernalier A, Corthier G. Comparative study of bacterial groups within the human cecal and fecal microbiota. Appl Environ Microbiol 2001;67:4939-42.


26. Buktiwetan P, Surjawidjaja J, Salim O, Aidilifit M, Lesmana M. Diare bakterial : etiologi dan kepekaan Antibiotika di dua Pusat Kesehatan Masyarakat di Jakarta. Jkedokter Trisakti 2001;20:57-65. 27. Baumgardner DJ. Soil-related bacterial and fungal infections. Journal of the American Board of Family Medicine : JABFM 2012;25:734-44. 28. Haagsma J. Pathogenic anaerobic bacteria and the environment. Rev Sci Tech 1991;10:749-64.

.


Figure

Figure 1. PLEX-ID result sheet which shows the detection of bacteria, with each having Qscore and the different levels. a. shows the detection of a single bacterium, b. shows the detection of the bacteria, and bacterial detection with the results of multiple matches and c. shows no detectable.

Figure 2. Phyla comparison chart based on the number of bacteria that were detected in a sample group of diarrhea and non-diarrhea


Tables Table 1. Types of PLEX-ID detection results

Diarrhea (n =33) Non diarrhea (n =47) Total (n=80)

Detection of bacteria 30 28 58

Detection of multiple matches 6 8

No detectable bacteria 3 13

14

16


Table 2. Detected bacteria in samples gorup diarrhea and non-diarrhea. Bacteria in diarrhea samples

Family

Phylum

Bacteria in non diarrhea samples

Family

Phylum

18

Enterobacteriaceae

Proteobacteria

Escherechia coli

21

Enterobacteriaceae

Proteobacteria

Klebsiella pneumonia

2

Enterobacteriaceae

Proteobacteria

Klebsiella pneumoniae

3

Enterobacteriaceae

Proteobacteria

Prevotella albensis

1

Bacteroidaceae

Bacteroidetes

Bifidobacterium longum

2

Bifidobacteriaceae

Actinobacteria

Staphylococcus epidermidis

1

Staphylococcaceae

Firmicutes

Escherichia fergusonii

1

Enterobacteriaceae

Proteobacteria

Eubacterium rectale

1

Eubacteriaceae

Firmicutes

Akkermansia muciniphila

1

Verrucomicrobiaceae

Verrucomicrobia

Clostridium perfringens

1

Clostridiaceae

Firmicutes

Streptococcus vestibularis

1

Streptococcaceae

Firmicutes

Streptococcus sp

1

Streptococcaceae

Firmicutes

Acidovorax avenae

1

Comamonadaceae

Proteobacteria

Aquaspirillum gracile

1

Comamonadaceae

Proteobacteria

Campylobacter jejuni

1

Campylobacteraceae

Proteobacteria

Shigella boydii

1

Enterobacteriaceae

Proteobacteria

Escherechia coli

Total

Number

30

Total

Number

28


Table 3. The results of multiple matches Diarrhea Sample code

Bacteria

D02 D11 D13

E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei E.coli/Shigella dysenteriae E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei

D14 D15

E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei E.coli/Escherichia coli O157:not H7/Shigella boydii/Shigella sonnei E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei

D33

Non diarrhea Sample code S10 S11 S14 S17 S23 S26 S38 S46

Bacteria

E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei Vibrio proteolyticus/Vibrio sp. E.coli/Escherichia coli O157:not H7/Shigella sonnei E.coli/Shigella dysenteriae E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei E.coli/Shigella flexneri/S.sonnei E.coli/Escherichia coli O157:not H7/Shigella sonnei

Table 4. Cross tabulation between entropathogen and diarrhea incidence Enteropathogen diarrhea Total

+ -

+

-

27 29 56

9 7 16

Total 36 36 72


UNIVERSITAS INDONESIA. Profil mikroba usus pada anak usia 2 12 tahun dengan diare dan non diare di Jakarta Utara, Indonesia

Recommend Documents