Úlohy pro předmět: Pokročilá analytická chemie

Jednotlivé úlohy jsou rozepsány dle jednotlivých cvičení, do kterých byly (či v průběhu LS 2006/07budou) zařazeny.

Úlohy pro předmět: Pokročilá analytická chemie I. Stanovení optické čistoty tamsulosinu Úvod Ionizovatelné deriváty cyklodextrinů jsou dnes rutinně využívány v CE technikách jak pro separace chirálních látek, tak pro separace achirálních molekul. Zejména aniontové deriváty, jako jsou sulfobutylether-, sulfopropylether-, sulfato-, karboxymethylcyklodextriny, jsou velmi populární. Doposud byla publikována celá řada přehledných článků zabývající se problematikou syntézy, teorií a aplikací ionizovatelných cyklodextrinů. Jednoznačně největší aplikační užití v CE z ionizovatelných cyklodextrinů skýtá sulfatovaný-β-cyklodextrin (s-βCD). Oproti ostatním (zejména nativním CD) není v případě sulfatovaných forem CD zcela zřejmé, proč je separační a enantioselektivní schopnost sulfatovaných forem CD vyšší. Struktura hypotetické monomerní jednotky sulfatovaného cyklodextrinu je na obrázku 1.1 (zde je znázorněna maximální možná substituce hydroxylových skupin sulfatoskupinami na b-D-glukosové jednotce, která ovšem nemůže nastat).

Obr. 1: Obecná struktura monomerní jednotky S-β-CD CD je cyklický oligosacharid, který může teoreticky být sulfatovaný na všech třechhydroxylových skupinách, přičemž stále zůstává zachována transparentnost molekuly pro UV záření. Vezmeme-li v úvahu substituci tří běžných nativních CD (α-, β-, γ-CD), je možné získat po totální sulfataci sulfatační stupně 18, 21 a 24. Totální sulfatace nativního CD je ovšem nemožná díky stérickému a elektrostatickému bránění postupné substituce hydroxylu sulfoskupinou. Z tohoto důvodu jsou komerčně dostupné sulfatované CD s různým stupněm sulfatace. Vzhledem k obecně vyšší reaktivitě primární hydroxylové skupiny jsou nejsnáze sulfatovatelné hydroxylové skupiny na uhlíku C6. V porovnání s β-CD je rozpustnost s-β-CD několikanásobně vyšší (rozpustnost pro β-CD je asi 1,8 g/100 ml a pro s-b-CD je rozpustnost >100 g/100 ml). Tato vysoká rozpustnost zvyšuje rozsah použitelných koncentrací selektoru v pracovním elektrolytu. Vzhledem k silně iontové charakteru s-b-CD lze tento selektor využít v celém rozsahu pH (pro vodné prostředí) ve formě polyaniontu. Celkový záporný náboj s-β-CD je tedy nezávislý na pH pracovního elektrolytu, což umožňuje využít tento selektor jak v kyselém, tak bazickém separačním módu.

R,S-tamsulosin je bazické léčivo, které je využívané při léčbě onemocnění prostaty. Netoxickým, a v léčbě úspěšným izomerem je R-tamsulosin. Pro bezproblémovou kvantifikaci obou izomerů je nutné dosáhnout vysokého rozlišení během krátké doby analýzy. Struktura tamsulosinu je na obrázku 2.

Obr. 2: Struktura R,S-tamsulosinu (chirální centrum je vyznačeno hvězdičkou) R,S-tamsulosin má 2 ionizovatelné (protonizovatelné) aminoskupiny. V kyselém prostředí migruje R,S-tamsulosin jako kation. Může docházet k elektrostatické interakci mezi protonovanými aminoskupinami a negativně nabitými sulfoskupinami s-β-CD. Současně lze předpokládat inkluzní komplexaci mezi R,S-tamsulosinem a hydrofobní kavitou s-β-CD (interakci mezi kavitou a selektandem zde pravděpodobně zprostředkovává aromatický kruh). Podmínky měření Stanovení optické čistoty tamsulosinu jsou prováděny pomocí kapilární elektroforézy Agilent HP3D CE (Agilent Technologies, Waldbronn, Německo) s DAD detektorem. Pro separaci se použije nepokrytá křemenná kapilára vnitřního průměru 50 µm, celkové délky 33 cm a efektivní délky 24,5 cm. Vlnová délka pro detekci pomocí DAD detektoru je 200 nm. Kapilára je termostatována na teplotu 25 °C. Separace se uskutečňuje při vloženém napětí +20 kV, vzorek je dávkován hydrodynamicky tlakem 50 mbar (5.103 Pa) po dobu 5s. Pro chirální separaci je využit s-β-CD s průměrnou substitucí 7–11 mol/mol (Sigma, St. Louis, USA). Pracovní elektrolyt: Pracovním elektrolytem vhodným pro chirální separaci R,S-tamsulosinu je 100 mmol.l-1acetát tris pH 4,0 s přídavkem s-β-CD. Pracovní elektrolyt se připravuje rozpuštěním koncentrované kyseliny octové v deionizované vodě v odměrné baňce na 100 ml. Poté se připravený 100 mmol.l-1 roztok kyseliny octové vytitruje za současného míchání a kontroly pH pevným TRISem na pH 4,0. s-β-CD se přídá až po vytitrování pracovního elektrolytu nakonec. Připraví se několik pracovních elektrolytů o koncentracích 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 % (w/v) s-β-CD (od každé koncentrace stačí 2 ml pracovního elektrolytu s odpovídajícím množstvím s-β-CD. Standardní roztoky R,S-tamsulosinu R,S-tamsulosin je k dispozici jako hydrochlorid. Navažte potřebné množství tamsulosin hydrochloridu, tak aby jeho koncentrace v 1 ml eppendorfce byla 1.10-3 mol.l-1 a rozpusťte jej v 500 µl methanolu a 500 µl vody. Z tohoto zásobního roztoku připravte kalibrační řadu

v rozmezí koncentrací 5.10-6 mol.l-1 až po 5.10-5 mol.l-1 v deionizované vodě (každého standardu stačí 500 µl). Příprava reálného vzorku tablety Tabletu Omnic (jejíž účinnou složkou je R tamsulosin) rozlomte a nechte rozpustit v 10 ml 50% methanolu v ultrazvuku. Sonifikujte 15 minut. Pomocí injekční stříkačky a mikrofitru (průměr pórů v mikrofiltru < 45 µm) přefiltrujte vzniklý roztok a 300 µl přepipetujte do dávkovací nádobky. Vlastní měření a vyhodnocení Kapilára je promytá 0,1 mol.l-1 NaOH (15 minut) a vodou (15 minut). Kapiláru promyjeme pracovním elektrolytem s nejnižší koncentrací s-β-CD a proveďte separaci standardu o koncentraci 1.10-5 mol.l-1. Se stejnou koncentrací standardu R,S-tamsulosinu proměřte separace s dalšími koncentracemi s-β-CD v pracovním elektrolytu a zvolte ve studovaném intervalu nejlepší koncentraci s-β-CD v elektrolytu. S elektrolytem s nalezenou nejlepší koncentrací s-β-CD proveďte proměření kalibrační křivky a sestrojte kalibrační křivku zvlášť pro R- a zvlášť pro S-tamsulosin. Z kalibrační křivky odhadněte mez stanovitelnosti a mez detekce. Za stejných podmínek proměřte roztok vzniklý rozpuštěním tablety Omnicu a vyhodnoťte obsahy enantiomerů R,S-tamsulusinu v tabletě. Všechny měření proveďte 2x. Literatura: [1] V. Maier, J. Horáková, J. Petr, E. Tesařová, P. Coufal, J. Ševčík, J. Pharm. Biomed. Anal. 39 (2005) 691. II. Identifikace a stanovení chelerythrinu v ústní vodě Úvod Chelerythrin (obr. 1) patří mezi významné benzo[c]fenanthridinové alkaloidy, vykazuje protizánětlivou a antimikrobiální aktivitu. Chelerythrin inhibuje protein kinasu C a interaguje s DNA. Toto široké spektrum jeho účinků je dáno přítomností tohoto alkaloidu při fyziologickém pH 7,4 ve dvou formách: jako kvarterní iminiový kation (chelerythrin) a neutrální pseudobáze. Rovnovážná konstanta tohoto děje se pohybuje v rozmezí 7,5 až 8,1. O O +

N

H3CO

CH3

OCH3

chelerythrin

Cl

O OH

-

H

+

-

O N

H3CO OCH3 H

OH

CH3

pseudobáze

Obr. 1: Struktura chelerythrinu a jeho pseudobáze Chelerythrin je díky svým dezinfekčním vlastnostem přidáván do přípravků osobní hygieny (např. zubní pasta, ústní voda). Je zřejmé, že nutné provádět kontrolu kvality výroby. Běžně používaná metoda kapalinové chromatografie stanovení chelerythtrinu vyžaduje použití

značného množství chemikálií (směs methanolu, vody a triethylaminu je využívána jako mobilní fáze) a navíc je i časově náročná. Jako zajímavá alternativa se jeví použití kapilární elektroforézy. Separace kapilární elektroforézou je založena na rozdílech v rychlostech pohybu částic (iontů) v elektrickém poli. Rychlost v je přímo úměrná intenzitě elektrického pole E: v = µE , kde µ je elektroforetická pohyblivost (mobilita). Pro sférickou částici lze odvodit vztah pro elektroforetickou pohyblivost:

µ=

q 6πηr

,

kde q je náboj částice, η je dynamická viskozita prostředí a r je efektivní poloměr částice. Z tohoto vztahu plyne, že čím větší náboj bude částice mít, tím se bude rychleji pohybovat a naopak, čím větší bude její efektivní poloměr, tím se bude pohybovat pomaleji. Nejčastěji se v kapilární elektroforéze používá spektrofotometrická detekce separovaných látek. Moderní přístroje pracují s detektorem diodového pole (diode array detector, DAD), který umožňuje snímat absorbanci při všech vlnových délkách, které lampa poskytuje. Použitím tohoto detektoru, tak získáme i strukturní informaci o analyzované sloučenině – získáme její absorpční spektrum. Přesto pro identifikaci UV/Vis detektor nestačí, ideálním řešením je použití hmotnostního spektrometru, který většinou poskytne dostatečnou informaci pro jednoznačnou identifikaci sloučeniny. Jistou alternativou je využití srovnání migračních dat, resp. standardizace jako v plynové chromatografii pomocí retenčních indexů. Přesto ani tato metoda není v kapilární elektroforéze spolehlivá, protože získat pokaždé stejný vnitřní povrch kapiláry je takřka nemožné. Stejně jako v ostatních metodách se proto doporučuje použití standardu pro jednoznačnou identifikaci. Nejčastěji provádíme tzv. fortifikací, tedy nejprve provedeme analýzu neznámého vzorku a pak další analýzu, kdy k tomuto vzorku přidáme standard o známé koncentraci a pozorujeme nárůst plochy píku odpovídající koncentraci přidaného standardu (pro představu lze říct, že se jedná o modifikaci kalibrace metodou standardního přídavku). Úkol Identifikovat pomocí UV/Vis detekce a fortifikace chelerythrin v ústní vodě a stanovit jeho množství pomocí metody standardního přídavku. Pro stanovení chelerythrinu metodou kapilární elektroforézy je možné využít elektrolyt o pH přibližně o 1 až 2 jednotky nižší než je prezentovaná rovnovážná konstanta (tedy elektrolytu, kde bude chelerythrin přítomen pouze ve formě iminiové soli, tj. bude nabitý a bude migrovat). Jako elektrolytu se využívá 50 mM fosfát/tris o pH 2,5 s přídavkem 50% acetonitrilu. Používáme nemodifikovanou křemennou kapiláru a napětí 30 kV. Postup Příprava elektrolytů a vzorku • Základní elektrolyt připravíme rozpuštěním vypočteného množství kyseliny fosforečné v redestilované vodě (koncentrace 50 mmol/l, objem 250 ml). Připravený

roztok vytitrujeme tris(hydroxymethyl)aminomethanem na pH 2,5. K takto připravenému roztoku přidáme acetonitril tak, aby jeho výsledná koncentrace byla 50% (v/v). • Standardní roztok chelerythrinu o koncentraci 5.10-5 mol/l připravíme rozpuštěním navážené látky v desetkrát zředěném elektrolytu. Připravujeme roztok do 1 ml vialky, ředění nesmí být najednou větší než 100x. • Vzorek ústní vody ultrazvukujeme 10 minut, zředíme redestilovanou vodou (1:1) a přefiltrujeme jej přes membránový filtr. Vlastní měření • Na přístroji si za pomoci vedoucího cvičení otevřeme metodu „che_cv“, dále postupujeme podle pokynů vedoucího cvičení (ovládání a vyhodnocení). • Provedeme analýzu standardu a změříme UV/Vis spektrum standardu. Dále provedeme analýzu vzorku ústní vody, změřené UV/Vis spektrum porovnáme se standardem, fortifikací idenfikujeme chelerythrin. • Provedeme kalibraci chelerythrinu metodou standardního přídavku. Kvantifikaci provádíme při 270 nm. Kalibraci vyhodnotíme. Literatura [1] J. Ševčík, J. Vičar, J. Ulrichová, I. Válka, K. Lemr, V. Šimánek, J. Chromatogr. A 2000, 866, 293-298. [2] M. Vlčková, P. Barták, V. Kubáň, J. Chromatogr. A 2004, 1040, 141-145. [3] M.G. Khaledi (Ed.), High-Performance Capillary Electrophoresis. Theory, Techniques, and Applications. John Wiley & Sons, New York 1998. III. Stanovení rozdělovacích koeficientů metodou micelární elektrokinetické chromatografie Úvod Rozdělovací koeficienty patří mezi důležité fyzikálně-chemické parametry ve výzkumu a vývoji (např. vývoj nových léčiv). Rozdělovací koeficient je definován jako poměr aktivity látky v jednom prostředí a aktivity látky v druhém prostředí. Nejčastěji používanými charakteristikami léčiv jsou rozdělovací koeficienty oktanol – voda. Pokud budeme uvažovat koncentrace, místo aktivit lze rozdělovací koeficient definovat jako: c A,o K ow = , (1) c A, w kde cA,o je koncentrace látky A v oktanolu a cA,w je koncentrace látky A ve vodě. Rozdělovací koeficient tedy reprezentuje číselné vyjádření schopnosti látky přecházet do méně polárního prostředí (oktanolu). Určení koeficientu je důležité v případě léčiv pro představu o distribuci těchto látek v organismu – představu o jejich rozdělování do méně polárních oblastí buněk, do membrán apod. Klasická metoda stanovení rozdělovacích koeficientů je L-L extrakce. Je časově náročná (koeficient je definován pro stav rovnováhy) a vyžaduje značnou spotřebu chemikálií apod. Naproti tom použití micelární elektrokinetické chromatografie (MEKC) výrazně urychlíme celý proces a rovněž snížíme i spotřebu chemikálií. Separace micelární elektrokinetickou chromatografií je založena na různém rozdělování látek mezi pseudostacionární fázi – micelární fázi a volný elektrolyt podobně jak je tomu

u kapalinové chromatografie. Kapacitní faktor k´ je definován jako poměr látkového množství látky A v micelární fázi a látky A ve vodné fázi: n (2) k´= mic . naq Z tohoto vztahu lze následně odvodit: V n c V k´= mic = mic mic = K mw mic , Vaq naq c aqVaq

(3)

kde Kmw je rozdělovací koeficient micely-voda. Kapacitní faktor v MEKC je definován vztahem:

k´=

tr − t0  t t 0 1 − r  t mic

  

= K mw

Vmic , Vaq

(4)

kde tr je migrační čas látky A, t0 je migrační čas markeru elektroosmotického toku a tmic je migrační čas micel. Ze vztahu (4) vyplývá, že pro určení rozdělovacího koeficientu potřebujeme změřit migrační časy studovaných léčiv, markeru EOF a micel a dále pak poměr objemů micelární a vodné fáze. Tento poměr je možné určit experimentálně dle vztahu: V (c srf − CMC ) Vmic = , (5) Vaq 1 − V (c srf − CMC )

kde V je částečný specifický objem, csrf je koncentrace příslušného tenzidu. Částečný specifický objem se určí z částečného molárního objemu vydělením molekulovou hmotností příslušného tenzidu. Částečný molární objem V ρ představuje objemový přírůstek přidáním 1 molu tenzidu k přebytku roztoku dané koncentrace. Tuto hodnotu je možné určit z pyknometrických měření hustoty ρ v závislosti na koncentraci roztoku c dle vztahu: 1000 Vρ =

ρ  M .c  1−    1000 

.

(6)

Z tangenty závislosti V ρ = f (c ) při dané koncentraci získáme po vydělení molekulovou hmotností tenzidu hodnotu částečného specifického objemu V . Kritickou micelární koncentraci CMC určíme jednoduše pomocí konduktometrické titrace (závislost vodivosti na koncentraci tenzidu), protože přeskupením molekul tenzidu do micel dojde k změně směrnice této závislosti.

Úkol: Určit pomocí micelární elektrokinetické chromatografie rozdělovací koeficienty dvou derivátů 2-chinolonu (obr. 1). O R1

H

O

OH

N

R2

O

R3

Obr. 1: Základní strukturní jednotka derivátů 2-chinolonu

Jako základní elektrolyt použijeme 25 mM borát/Na pH 9,5 s přídavkem SDS (tak, aby výsledná koncentrace SDS byla 50 mM), používáme napětí +20 kV. V tomto pH bude silný elektroosmotický tok a bude hlavní hybnou silou. Micely SDS (kritická micelární koncentrace se pohybuje okolo 8 mM) jsou negativně nabité, ale přesto jsou unášeny k záporně nabité elektrodě. Zároveň unáší i deriváty 2-chinolonu, které jsou díky různé schopnosti interakce s micelami (různé distribuční koeficienty mezi micelami a elektrolytem) odseparovány. Postup: Stanovení kritické micelární koncentrace SDS pomocí konduktometrické titrace. • Titrujeme 25 mM borát/Na pH 9,5 roztokem SDS o koncentraci 100 mM, tak abychom přídavkem změnili maximálně výslednou koncentraci SDS o 0,5 mM. Zaznamenáváme hodnoty vodivosti, titrujeme přibližně do koncentrace SDS 20 mM. Titraci provádíme 3x. Křivku vyhodnotíme – zlom ve směrnici na křivce odpovídá kritické micelární koncentraci SDS v prostředí 25 mM borátu/Na pH 9,5. Stanovení částečného specifického objemu SDS • Stanovení provedeme pomocí pyknometrického měření hustoty roztoků SDS o koncentraci 10 mM, 25 mM, 50 mM a 75 mM. Měření musíme provádět při konstantní teplotě (teplotu zaznamenáme), každé měření opakujeme 3x. Ze změřených hodnot vyneseme závislost V ρ = f (c ) a pro použitou koncentraci SDS (50 mM)

určíme ze závislosti částečný molární objem, který potom převedeme na částečný specifický objem. Stanovení migračního času markeru EOF a micel. • Jako marker EOF použijeme methanol. Pro měření migračního času micel se používají markery, u kterých se předpokládá jejich silná interkace s micelami, přesto pro přesná fyzikálně-chemická měření je toto zjednodušení nedostatečné. Proto se používá metoda aproximace a kalibrace systému na alkylbenzeny. Pro náš případ si nejprve připravíme základní elektrolyt rozpuštěním patřičného množství kyseliny borité (tak aby koncentrace byla 25 mM), tuto potom titrujeme hydroxidem sodným na pH 9,5. K takto připravenému elektrolytu přidáme pevné SDS tak, aby výsledná koncentrace SDS byla 50 mM. Dále si připravíme vzorek alkylbenzenů v methanolu: benzen, toluen, ethylbenzen, propylbenzen, butylbenzen, dodecylbenzen (výsledná koncentrace 10-4 mol/l, připravujeme objem max 1 ml!). Základním elektrolytem

naplníme 3 elektrolytové nádobky, vzorkem alkylbenzenů jednu vialku na vzorky. Tyto s pomocí vedoucího cvičení umístíme do přístroje, kde je již připravená křemenná kapilára, otevřeme metodu „part_cv“ a zanalyzujeme vzorek alkylbenzenů 3x. Vyhodnocení provedeme následujícím způsobem: vypočteme příslušné kapacitní faktory, dodecylbenzen budeme považovat za marker migračního času micel a vypočteme příslušné rozdělovací koeficienty. Ty porovnáme s publikovanými hodnotami (viz např. Gavenda et. al., J. Sep. Sci. 2001, 24, 723-728), dále tyto hodnoty vyneseme do grafu proti migračnímu času. Body proložíme vhodnou (t − t ).a závislostí ( K ow = r 0 − c ) a z této závislosti vypočteme aproximovaný migrační t 0 − b.t r čas micel jako hodnotu t0/b (asymptotu dané funkce). Stanovení rozdělovacích koeficientů derivátů 2-chinolonu. • Za stejných podmínek provedeme elektroforetickou separaci daných derivátů 2chinolonu. Pomocí již popsaných vztahů a s použitím aproximovaného migračního času micel vypočteme rozdělovací koeficienty obou derivátů. Literatura: [1] A. Gavenda, P. Bednář, P. Barták, P. Adamovský, J. Ševčík, P. Tzoumas, J. Ulrichová, J. Sep. Sci. 2001, 24, 723-728. [2] L. Müller, P. Bednář, P. Barták, K. Lemr, J. Ševčík, J. Sep. Sci. 2005, 28, 1285-1290.

Úlohy pro předmět: Cvičení z instrumentálních metod IV. Separace cytokininů metodou kapilární zónové elektroforézy Úvod: Cytokininy jsou rostlinné hormony regulující dělení buněk, popř. stimulující diferenciaci rostlinných tkání. Struktura všech cytokininů je odvozena od adeninu nebo adenosinu substitucí jednoho atomu vodíku v amino skupině v pozici 6. Přehled základních cytokininů uvádí následující tabulka. Tabulka 1: Struktury vybraných cytokininů odvozených od adenosinu HN N HO

N O

OH

OH

R

N N

Název benzylaminopurinribosid

–R CH2 HO

ortho-topolinribosid

CH2 OH

meta-topolinribosid CH2

kinetinribosid

CH2

zeatinribosid

H

O CH3 C

C

dihydrozeatinribosid

CH3 CH2 CH2 CH2

isopentenyladenosin

CH2 H C CH2

OH OH C H

Jelikož je funkce různých cytokininů různá (některé dokonce vykazují protinádorovou aktivitu), je nutné sledovat jejich výskyt v různých částech rostlin. Hormony živočichů i rostlinné hormony se vyskytují v různých koncentracích po celý rok, proto je rovněž důležité sledovat jejich zastoupení v různých ročních obdobích. Jak vyplývá z tabulky 1, kde je uveden pouze výčet nejznámějších cytokininů, je pro jejich kvantifikaci nutná nejprve separace jednotlivých cytokininů od sebe, ale i od zbylé matrice. Kapilární zónová elektroforéza představuje efektivní separační metodu. Separace je založena na rozdílných rychlostech pohybu iontů ve stejnosměrném elektrickém poli. Rychlost pohybu iontu v je přímoúměrná intenzitě elektrického pole E: U v = µE = µ , L kde µ je elektroforetická pohyblivost (mobilita), U je vložené napětí a L je délka kapiláry. Ion se v prvním přiblížení pohybuje rovnoměrně přímočaře, přičemž za migrační čas tm dorazí do detektoru, tj. urazil tzv. efektivní vzdálenost l (vzdálenost začátek kapiláry – detektor), na základě změření tohoto času, lze vypočítat elektroforetickou pohyblivost iontu dle vztahu: l U lL v= =µ ⇒ µ= tm L Utm

Rychlost pohybu iontů (resp. mobilitu) můžeme ovlivnit použitím činidel, které budou s těmito ionty interagovat, popř. vytvoří komplex. Takovou interakci je možné popsat příslušnou rovnováhou a interakční konstantou: a A + B ↔ AB; K = AB a A aB kde ai jsou aktivity jednotlivých interagujících složek. Jaký má vliv tvorba komplexu na rychlost migrace iontu? Máme-li dva ionty, které nelze rozseparovat pouze v základním elektrolytu, lze přídavkem činidla změnit jejich efektivní mobility, tak že jsou odlišné a dojde k separaci. Podmínkou je rozdílnost interakčních konstant. Tyto činidla tedy obecně nazýváme selektory. Mezi velice zajímavé selektory patří cyklodextriny. Jde o sloučeniny, které ve své struktuře obsahují β-D-glukopyranosové jednotky vzájemně spojené do kruhu. Podle počtu jednotek rozlišujeme α-cyklodextriny (6 jednotek), β-cyklodextriny (7 jednotek) a γ-cyklodextriny (8 jednotek). Cyklodextriny mají tvar dutého komolého kužele, kde na vnější straně jsou umístěny hydroxylové skupiny a uvnitř je uhlíková kostra. Z toho vyplývá, že dutina (kavita) je méně polární a bude snadněji interagovat s nepolárními částmi molekul. Je logické, že čím více jednotek cyklodextrin obsahuje, tím je dutina větší (má větší průměr) – např. do β-cyklodextrinové dutiny se snadno umístí jednoduchá aromatická skupina (fenyl), do γcyklodextrinové dutiny dvojčlenný aromatický skelet (naftyl) a proto jsou tyto deriváty hlavně využívány pro ovlivňování selektivity separace sloučenin s aromatickými jádry. Cíl úlohy:

Cílem této úlohy je rozseparovat a kvantifikovat 5 derivátů cytokininů ve vzorku rostlinného extraktu. Cytokininy podléhají disociační rovnováze: =NH + H3O+ ↔ =NH2+ + H2O Hodnoty pK cytokininů se pohybují okolo 3, tedy je nutné zvolit takové pH, aby cytokininy migrovali v elektrickém poli (aby byly kladně nabité). Jako ideální pH se jeví pH 2,5 kdy je zároveň částečně potlačen elektroosmotický tok. Jako základní elektrolyt mající v této oblasti dobrou pufrační kapacitu je zvolen 100 mM fosfát titrovaný tris(hydroxymethyl)aminomethanem na pH 2,5. Pro zajištění selektivity separace se do základního elektrolytu přidává γ-cyklodextrin (výsledná koncentrace 25 mmol/l). Analyty se detekují spektrofotometricky při 200 nm. Praktické provedení:

•

Příprava základního elektrolytu

Připravíme 100 ml kyseliny fosforečné o koncentraci 100 mmol/l. Tento roztok následně vytitrujeme pevným tris(hydroxymethyl)aminomethanem na pH 2,5. Na závěr přidáme γ-cyklodextrin, tak aby jeho výsledná koncentrace byla 25 mmol/l.

•

Příprava kapiláry

Křemenná kapilára o průměru 50 µm, efektivní délce 40 cm a délce 48,5 cm je připravena v přístroji (připraví vedoucí cvičení). Kapiláru je potřeba před zahájením experimentů promýt 5 minut 0,1 M NaOH, pak 5 minut deionizovanou vodou, pak 5 minut 0,1 M HCl a 10 minut deionizovanou vodou.

• Příprava vzorku Ze standardních roztoků cytokininů připravíme standardní směs o koncentraci 1.10-4 mol/l. Vzorek cytokininů z rostlinného extraktu neupravujeme (je již přefiltrován) a dávkujeme přímo. • Měření Do 3 elektroforetických viálek dáme základní elektrolyt obsahující γ-cyklodextrin, do vialek pro vzorky nachystáme standardní směs a vzorek. Viálky pro základní elektrolyt dáme do pozice 11, 12, 13. Vzorek, ze kterého budeme dávkovat na pozici 15. Pro práci s přístrojem nejprve načteme metodu (soubor cytok_cv), pak nastavíme jméno vzorku – viz manuál k přístroji, počkáme na ustavení teploty a analýzu spustíme tlačítkem „start“. V okně sledujeme průběh analýzy.Analýzu standardní směsi a vzorku opakujeme 3x, fortifikací identifikujeme jednotlivé analyty. Poznámka: Nastavení metody cytok_cv: napětí 20 kV, vlnová délka: 200 nm, před analýzou promytí kapiláry 2 min deionizovanou vodou, 5 minut základním elektrolytem. • Vyhodnocení Vyhodnocení provádíme v tomtéž programu, integrujeme jednotlivé píky a identifikujeme analysy. Vyhodnocení proveďte s vedoucím cvičení. Literatura: [1] P. Barták, J. Ševčík, T. Adam, D. Friedecký, K. Lemr, Z. Stránský, J. Chromatogr. A 1998, 818, 231-238. [2] P. Barták, P. Bednář, Z. Stránský, P. Boček, R. Vespalec, J. Chromatogr. A 2000, 878, 249-259. [3] H. Kovářová, M. Hajdúch, G. Kořínková, P. Halada, S. Krupičková, A. Gouldsworthy, N. Zhelev, M. Strnad, Electrophoresis 2000, 21, 3757-3764. [4] D. R. Baker, Capillary Electrophoresis. John Wiley & Sons, New York 1995. [5] D. Heiger, High performance capillary electrophoresis. An introduction. Agilent Technologies, Germany 2000.

V. Stanovení kationtů kovů metodou kapilární izotachoforézy Úvod Kapilární izotachoforéza (capillary isotachophoresis, cITP) je separační metoda, jejíž hnací silou je aplikace elektrického pole. V izotachoforéze dávkujeme vzorek mezi dva elektrolyty – vedoucí (leading electrolyte, LE) a koncový (terminating electrolyte, TE). Tyto elektrolyty jsou voleny tak, aby ionty vedoucího elektrolytu měly nejvyšší pohyblivost (mobilitu) v daném systému a ionty koncového elektrolytu tak, aby měly nejnižší pohyblivost. Narozdíl od ostatních elektromigračních metod používáme upravené kapiláry, abychom eliminovali elektroosmotický tok a aplikujeme konstantní elektrický proud.

Na základě uvedených skutečností si lze představit průběh izotachoforézy následujícím průběhem (obr. 1): ve vzorku jsou ionty A + B, přičemž ion A má větší mobilitu než ion B. V zóně vzorku má intenzita elektrického pole svoji určitou konstantní velikost. Po aplikaci el. proudu dochází k migraci iontů A, B různou rychlostí (v = µ.E) a tím dojde k jejich separaci. Na konci je ustanoven stacionární stav, ve kterém se všechny zóny pohybují stejnou rychlostí.

Obr. 1: Schéma mechanismu kapilární izotachoforézy

Kapilární izotachoforézu charakterizují dvě základní přednosti: samozaostřující efekt a schopnost prekoncentrace. Samozaostřující efekt je poznat z předchozího obrázku (Obr. 1d), opustí-li ion A svoji zónu v důsledku difuze do zóny vedoucího elektrolytu, dojde k jeho zpomalení díky nižší intenzitě elektrického pole v této zóně. Stejně tak, je tomu i v případě přechodu iontu A do zóny iontů B, zde dojde k urychlení iontu A, protože v zóně B je vyšší intenzita elektrického pole – tím vznikají ostrá rozhraní mezi zónami. Druhý jev, prekoncentrace, je spojený s použitím konstantního proudu, resp. proudové hustoty. Za těchto podmínek dochází k zakoncentrování vzorku na přibližně stejnou hodnotu koncentrace vedoucího elektrolytu v důsledku zákona zachování náboje (náboj přenesený při elektromigraci musí zůstat stejný v daném místě kapiláry, a proto se musí vzorek zakoncentrovat) – obr. 2.

Obr. 2: Schématická princip zkoncentrování zóny vzorku v ITP

Z principu izotachoforézy je zřemé, že pro kvantifikaci nebudeme vyhodnocovat výšku či plochu píku jako tomu je u zónové elektroforézy, ale budeme určovat délku zóny. Jistý problém s sebou přináší detekce – jaký detektor použít, chceme-li detekovat rozdělené zóny za sebou? Nejčastěji se používá vodivostní detekce, která plně vyhovuje všem podmínkám v ITP. Úkol: Stanovit kationty těžkých kovů Pb2+, Cd2+, Zn2+, Cu2+ ve vzorcích životního prostředí metodou kapilární izotachoforézy.

Prezentované kationty těžkých kovů nelze rozseparovat s použitím klasického elektrolytu. Pro jejich separaci je nutné použít komplexačního činidla, které způsobí změnu jejich efektivních pohyblivostí a tím je možné dosáhnout separace. Jako efektivní komplexační činidlo se využívá kyselina hydroxyisomáselná, která vytváří s kovy poměrně slabé komplexy. V našem případě použijeme pro separaci kovů vedoucí elektrolyt: LE: 10 mM KOH vytitrovaný kyselinou hydroxyisomáslenou na pH 5,0, TE: 5 mM kyselinu octovou. V tomto systému slouží K+ ionty jako vedoucí ionty a ionty H3O+ jako koncové ionty. Zde dochází na první pohled k problému ve faktech – ionty H3O+ mají nejvyšší pohyblivost ze všech kationtů, ale zde mají sloužit jako terminátor, tedy ion s nejmenší pohyblivostí. Tento rozpor je snadno vysvětlitelný – pokud použijeme dobrý pufrační systém, dojde k tomu, že hydroxoniové ionty nebudou volně migrovat a stanou se tak dobře použitelným koncovým elektrolytem. Postup: • Příprava elektrolytů. LE: 10 mM KOH vytitrovaný kyselinou hydroxyisomáslenou na pH 5,0; TE: 5 mM kyselina octová (roztoky připravujeme do objemu 100 ml, používáme redestilovanou vodu, dbáme na čistotu, po přípravě roztoky zfiltrujeme pomocí injekční stříkačky). • Příprava vzorků a standardů. Standardy Pb2+, Cd2+, Zn2+, Cu2+ rozpustíme v redestilované vodě a připravíme směs o koncentraci 10-5 mol/l. Dále připravíme kalibrační řadu pro Pb2+. Koncentrace ostatních iontů potom počítáme pomocí

•

odezvových faktorů (jsou k dispozici v laboratoři). Vzorek říční vody přefiltrujeme pomocí injekční stříkačky a upravíme pH kyselinou dusičnou přibližně na hodnotu 6. Provedení analýz. Do 2 viálek dáme LE, do 1 viálky TE, dále do viálek pro vzorky kalibrační řadu, směs standardů a vzorky říční vody. S vedoucím cvičení otevřeme na přístroji metodu „ITPme_cv“ (před měřením s vedoucím zkontrolujeme zdali je v přístroji teflonová kapilára), provedeme analýzy a vyhodnotíme je podle pokynů vedoucího.

Literatura: [1] Z. Stránský, V. Dostál, Izotachoforéza v zemědělské praxi. [2] P. Boček, M. Deml, P. Gebauer, V. Dolník, Analytical Isotachophoresis. VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1988. [3] L. Křivánková, P. Boček, v knize: High Performance Capillary Electrophoresis. (M. G. Khaledi, Ed.), John Wiley & Sons, New York 1998. [4] J. Petr, V. Maier, J. Horáková, J. Ševčík, Z. Stránský, J. Sep. Sci. 2006, 29, 2705-2715. VI. Stanovení antracyklinových antibiotik kapilární elektroforézou On-line prekoncentrace Úvod Antracyklinová antibiotika byla objevena a izolována v 60. letech minulého století z kultur plísní Streptomyces peucetius varieta Caesius. Některé z nich, našly již uplatnění při léčbě onkologických onemocnění. Mezi nejvýznamnější z nich patří doxorubicin, daunorubicin a idarubicin. Tato léčiva mají řadu negativních účinků, zejména však mají za následek poškození srdečního svalu. Chemická struktura vybraných antracyklinových antibiotik (doxorubicinu a daunorubicinu) je na obrázku 1. O

OH

O CH3

OH

OH O

OH

OCH3

OCH3

O

O

OH

O

OH

NH2

O

O

OH O

CH3 OH

NH2

Doxorubicin

CH3 O

Daunorubicin

Obr. 1: Struktury atracyklinových antibiotik

Sledování hladiny antracyklinových antibiotik v tělních tekutinách má význam pro kontrolu a sledování léčby. Pro stanovení hladiny anthracyklinů v plazmě se používají výhradně

separační metody a to vysokoúčinná kapalinová chromatografie s fluorescenční nebo elektrochemickou detekcí a vysokoúčinná kapilární elektroforéza s laserem indukovanou fluorescencí (LIF). Fluorescenční detekce případně elektrochemická detekce je zde volena díky velmi nízké terapeutické koncentraci, která se nachází při užívání v plazmě. Kapilární elektroforéza CE je vysoce účinná separační technika, ale ve spojení se spektrofotometrickým detektorem není příliš citlivá (koncentrační limit detekce se pohybuje kolem jednotek µmol.l-1). CE se spektrofotometrickým detektorem tak neposkytuje dostatečnou citlivost pro stanovení desítek nanomolů antibiotik. CE má ovšem tu výhodu, že při vhodně zvolených experimentálních podmínkách lze docílit zakoncentrování analytu z dávkovaného většího objemu vzorku do velmi úzké zóny přímo v separační kapiláře (tzv. on-line prekoncentrace). Antracyklinové antibiotika jsou aromatické deriváty, které mají omezenou rozpustnost ve vodě. Pro analýzu neutrálních aromatických látek a jejich derivátů je vhodná micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC). Jde o elektromigrační techniku využívající přídavku tenzidu do pracovního elektrolytu v koncentraci větší než je kritická micelární koncentrace (CMC) tenzidu. Micely tenzidu přítomné v pracovním elektrolytu mohou solubilizovat nepolární analyty, a protože se používají nejčastěji anionaktivní tenzidy, má výsledny komlex negativní náboj a může migrovat v elektrickém poli. Interakce mezi analytem a micelou tenzidu je dynamické povahy a popisuje ji rozdělovací konstanta. Interakce odlišných nepolárních analytů je různá a díky tomu je rozdílná i jejich rychlost migrace v el. poli a je tedy možné docílit separace látek, které nemají náboj. Micely tenzidu přítomné v pracovním elektrolytu je možné využít i pro on-line prekoncentraci s využítím tzv. sweepingu („zametání“). Tento způsob se používá pro neutrální analyty s velkou afinitou k micelám tenzidu. Princip prekoncentrace, jak už je z názvu patrné, spočívá v prostupování micel dlouhou zónou vzorku, při kterém micely před sebou sbírají (zametají) neutrální analyty do úzké zóny, čímž dochází k žádanému zakoncentrování vzorku. Analyty v této úzké zóně se v dalším průběhu analýzy od sebe separují do zón, které jsou detekovány. Tento princip je velmi jednoduchý a účinný, avšak je použitelný pouze v micelární elektrokinetické chromatografii. Stupeň zakoncentrování se v případě využití sweepingu pohybuje v rozmezí 10 až 1000. Úkol: Vyzkoušet si sweeping prekoncentraci dvou antracyklinových antibiotik doxorubicinu a daunorubicinu a porovnat je s citlivostí detekce bez využití prekoncetrace. Chemikálie: kyselina fosforečná, 50% (w/w) roztok NaOH, acetonitril, methanol, dodecylsulfát sodný (SDS), doxorubicin, daunorubicin. Pomůcky: Kapilární elektroforéza HP3D Agilent, nepokrytá křemenná kapilára o vnitřním průměru 50 µm, celková délka kapiláry 48,5 cm, efektivní délka 40 cm, reagenční láhev, ultrazvuk, mikropipety, vialky a víčka, odměrná baňka, teflonové míchadlo, magnetická míchačka, pH metr, kádinka. Postup: A. Příprava pracovního elektrolytu 1) Do odměrné baňky na 100 ml odpipetujte vypočítané množství kyseliny fosforečné (údaje o hmotnostní koncentraci, molekulové hmotnosti a hustotě jsou uvedeny na láhvi) a doplňte deionizovanou vodou po rysku a protřepte. 2) S pomocí vedoucího cvičení nakalibrujte pH-metr. Použijte kalibrační pufry na pH 2,0 a 4,0. 3) Přelijte připravený roztoky kyseliny fosforečné do kádinky na 150 ml a vložte do roztoku teflonové míchadlo. Kádinku umístěte na magnetické míchadlo a do míchaného roztoku

kyseliny pomořte elektrodu pH-metru. 50% roztokem NaOH vytitrujte roztok kyseliny fosforečné na pH 2,5 (tímto připravíte roztok pracovního elektrolytu 100 mmol.l-1 fosfát sodný o pH 2,5). 4) Do jedné reagenční láhve připravte roztok pracovního elektrolytu s 20 % obsahem methanolu (v/v). Výsledný objem je 75 ml. 5) Do další reagenční láhve navažte pevný SDS (tak, aby v 50 ml roztoku byla výsledná koncentrace 100 mmol.l-1 SDS). Jako rozpouštědlo použijte 50 ml roztoku pufru 100 mmol.l-1 fosfátu sodného pH 2,5 s přídavkem 20 % methanolu. B. Příprava standardního roztoku tetracyklinových antibiotik 1) Do dvou malých mikrozkumavek na objem 1,5 ml (eppendorfka) navažte po 1 mg doxorubicinu a 1 mg daunorubicinu. Obě navážky rozpusťte v 1 ml pufru 100 mmol.l-1 fosfát sodný pH 2,5 s 20 % methanolu a 100 mmol.l-1 SDS. 2) Do dalších mikrozkumavek připravte 10-krát (0,1 mg/ml), 100-krát (0,01 mg/ml) a 1000krát (0,001 mg/ml) zředěné roztoky antibiotik a zároveň i jejich směsi o stejných koncentracích. C. Vlastní analýza 1) Pro analýzu bude využita negativní polarita (na vstupní elektrodě je záporný pól). Do 3 vialek napipetujte 600 µl pufru (100 mmol.l-1 fosfát sodný pH 2,5 s 20 % methanolu a 100 mmol.l-1 SDS) a zavíčkujte. Do dalších vialek odpipetujte vždy 600 µl směsi antibiotik o připravených koncentracích a opět zavíčkujte. Všechny vialky popiště lihovým fixem a vložte na 10 minut do ultrazvukové lázně a sonifikujte. 2) Podle pokynů vedoucího cvičení proměřte postupně všechny připravené roztoky o klesajících koncentrací s využitím hydrodynamického nástřiku a s využitím sweepingu. Vyhodnocení Na základě získaných dat (ploch analytů pro jednotlivé koncentrace) a vyhodnoťte limit detekce pro hydrodynamický nástřik a pro sweeping. Vypočítejte prekoncentrační faktor.

Literatura: [1] J. P. Landers, Handbook of capillary electrophoresis 2nd edition, USA Washington (1997). [2] A. Gavenda, J. Ševčík, J. Psotová, Chem. Listy 94 (2000) 1010.

Úlohy pro předmět: Aplikovaná analytická chemie VII. Stanovení konzervačních látek v potravinách Úvod

Konzervační látky patří k hojně využívaným aditivům v potravinářském průmyslu, protože prodlužují životnost potravin. Mezi dříve hojně využívané konzervanty patřily benzoová kyselina a sorbová kyselina, přesto je v dnešní době jejich použití omezováno (zejména u benzoátu, který je považován za sloučeninu, která může způsobovat kancerogenezi (obzláště při vyšších koncentracích). Z tohoto důvodu je důležité sledovat koncentrace obou kyselin v potravinách. Rychlý a účinný způsob stanovení umožňují elektromigrační techniky. V našem případě použijeme micelární elektrokinetickou chromatografii (MEKC) a kapilární izotachoforézu (ITP). MEKC separace, je založena na rozdílném rozdělování analytů mezi pohybující se

micely tenzidu a vlastní elektrolyt. Separace kapilární izotachoforézou (CITP) je založena na rozdílech v pohybu v elektrickém poli; vzorek je dávkován mezi elektrolyt vedoucí a koncový. Vedoucí elektrolyt je volen tak, aby měl nejvyšší pohyblivost v daném systému a koncový elektrolyt je volený, aby měl nejmenší pohyblivost. Aplikací konstantního proudu pak dojde k separaci. CITP má oproti klasické MEKC výhodu v možnosti rychlé prekoncentrace analyzovaných látek, takže v kombinaci s MEKC dosahujeme detekčních limitů řádově 10-7 – 10-8 mol/l. Úkol

Proveďte stanovení konzervačních látek ve vzorcích džusů metodami micelární elektrokinetické chromatografie a kapilární izotachoforézy. Pro stanovení micelární elektrokinetickou chromatografií používáme fosfátový pufr (100 mM fosfát/Na) o pH 2,5 s přídavkem SDS (výsledná koncentrace SDS je 150 mM). Při pH 2,5 jsou obě kyseliny neutrální (pKa obou kyselin je přibližně 4,5) a tak se snadno inkorporují do SDS neutrálních jader micel. Pro separaci izotachoforézou používáme jako LE: 10 mM HCl vytitrovanou β-alaninem na pH 3,5 (cca 20 mM β-alanin) s přídavkem 0,1 % (w/v) hydroxyethylcelulózy, TE: 5 mM kyselinu kapronovou s 10 mM histidinem. Postup Příprava elektrolytů a vzorku • Základní elektrolyt pro MEKC připravíme rozpuštěním vypočteného množství kysliny fosforečné v redestilované vodě (koncentrace 100 mmol/l, objem 100 ml). Připravený roztok vytitrujeme hydroxidem sodným na pH 2,5. K takto připravenému roztoku přidáme SDS tak, aby jeho výsledná koncentrace byla 150 mmol/l. • Vedoucí elektrolyt připravíme rozpuštěním vypočteného objemu kyseliny chlorovodíkové v redestilované vodě (výsledná koncentrace HCl 10 mmol/l; celkový objem 50 ml), roztok vytitrujeme β-alaninem na pH 3,5 a pak přidáme hydroxyethylcelulózu (výsledná koncentrace 0,1 % w/v). • Koncový elektrolyt připravíme rozpuštěním kyseliny kapronové v redestilované vodě (koncentrace 5 mmol/l, objem 50 ml), k roztoku přidáme histidin (koncentrace 10 mmol/l). • Kalibrační roztoky kyseliny benzoové a sorbové připravíme o koncentracích 1.10-4 mol/l - 5.10-6 mol/l pro MEKC a 1.10-6 mol/l - 5.10-8 mol/l pro CITP. Vzorky připravujeme rozpuštěním naváženého množství analytu v 10x zředěném fosfátovém pufru. • Vzorky džusu odplyníme v ultrazvuku, zfiltrujeme přes mikrofiltr a 10x – 100x zředíme fosfátovým elektrolytem. Vlastní měření • Na přístroji si za pomoci vedoucího cvičení otevřeme metodu „bMEKCcv“, dále postupujeme podle pokynů vedoucího cvičení (ovládání a vyhodnocení). Provedeme analýzy standardů, kalibračních roztoků a vzorků džusů. • Vyměníme kazetu s kapilárou za kazetu s teflonovou kapilárou pro ITP. Na přístroji si za pomoci vedoucího cvičení otevřeme metodu „bCITPcv“, dále postupujeme podle pokynů vedoucího cvičení (ovládání a vyhodnocení). Provedeme analýzy standardů, kalibračních roztoků a vzorků džusů.

Literatura

[5]

J. Horáková, J. Petr, V. Maier, J. Znaleziona, A. Staňová, J. Marák, J. Ševčík, D. Kaniansky, J. Chromatogr. A, zasláno. J. Horáková, J. Petr, V. Maier, E. Tesařová, L. Veis, D. W. Armstrong, B. Gaš, J. Ševčík, Electrophoresis, přijato. M.G. Khaledi (Ed.), High-Performance Capillary Electrophoresis. Theory, Techniques, and Applications. John Wiley & Sons, New York 1998.

[6] [7]

VIII. Chirální separace D,L-mléčné kyseliny kapilární zónovou elektroforézou. Stanovení kyseliny L-mléčné v jogurtu Úvod

Mléčná kyselina je produktem tzv. mléčného kvašení, které probíhá v potravinách, ať už jako přirozená součást výroby (jogurt) nebo jako nechtěný chemický proces při stárnutí a kažení potravin. Při výrobě jogurtů přirozenou cestou je mléčné kvašení přirozený proces. Za tímto účelem se před kvašením přidávají do základu jogurtu živé baktérie L-lactobacilus acidophilus. Z cukru obsaženého v mléce se anaerobním kvašením pomocí baktérií vyrábí L-mléčná kyselina. Ta je pro ogranismus stravitelná (lidské tělo ji může bez problémů zabudovat do svého metabolismu). Čisté baktérie L-lactobacilus se získávají obtížně a vždy je v baktériích obsaženo i malé množství D-lactobacilu, která mléčným kvašením produkuje D-mléčnou kyselinu. Ta už je pro lidský organismus obtížně zpracovatelná. Kvalitní jogurt by tedy měl obsahovat pouze zanedbatelné množství D-mléčné kyseliny. Kapilární zónová elektroforéza (CZE) je separační technika, která je pro separaci enantiomerů velice vhodná. CZE může využívat velmi širokou škálu chirálních selektorů pro separaci enantiomerů při jejich velmi nízké spotřebě. Mléčná kyselina je molekula, která neobsahuje ve své struktuře žádný vhodný chromofor pro citlivou přímou spektroforometrickou detekci. V případě spektrofotometrické detekce je nutné volit nepřímou spektrofotometrickou detekci, kdy je součástí pracovního elektrolytu tzv. vizualizujcí ko-ion. Vizualizující ko-ion má stejné znaménko náboje jako detekovaný ion a obsahuje ve své struktuře vhodný chromofor. Pracovní elektrolyt tak sám absorbuje UV záření. Zóna neabsorbujícího analytu při průchodu detektorem tvoří negativní pík. Nepřímá spektrofotometrická detekce je náročná z hlediska volby vhodného vizualizujícího ko-iontu. Další alternativní detekční technikou je bezkontaktní vodivostní detekce (CCD, contactless conductivity detection). Vodivostní detekce je univerzální detekční technika pro jakékoli separované ionty. Principem detekce je nalezení co největšího rozdílu mezi vodivostí pracovního elektrolytu a vodivostí zóny analytu. Čím je tento rozdíl větší, tím bude vodivostní detekce citlivější. Výhodou obou detekčních technik (nepřímé spektrofotometrické a vodivostní) je možnost detekce kyseliny mléčné bez předchozí derivatizace. Jako chirální selektor pro enantioseparaci D,L-mléčné kyseliny pomocí CZE byl doposud využíván 2-hydroxypropyl-β-cyklodextrin. Vhodnějším selektorem je však makrocyklické antibiotikum vankomycin chlorid.

Vankomycin chlorid je makrocyklické antibiotikum, které ve své struktuře obsahuje 18 stereogenních center a funkční skupiny různé povahy (karboxylová, amino-, amidoskupina, hydroxylové skupiny, aromatické kruhy apod.), které mohou zprostředkovat různé typy interakcí mezi vankomycinem a enantiomery. Chemická struktura vankomycinu je na obrázku 1.

Obrázek 1: Chemická struktura vankomycinu

Přehled vybraných fyzikálně chemických vlastností vankomycin chloridu jsou uvedeny v tabulce 1. Tabulka 1: Fyzikálně chemické vlastnosti vankomycin chloridu Charakteristika

Vankomycin

Molekulová hmotnost

1449

Počet stereogenních center

18

Počet mikrocyklů

3

Počet hydroxylových skupin

9 (z toho 3 fenolické)

Počet aminoskupin

2

Počet karboxylových skupin

1

Počet amido skupin

7

Počet aromatických jader

5

pI

7,2

Relativní stabilita

až 2 týdny

Díky přítomnosti 3 makrocyklických kruhů a dvou postranních řetězců vytváří vankomycin v roztoku tvar připomínající koš. Tento koš tak umožňuje částečnou inkluzní komplexaci se separovanými enantiomery. Vankomycin je velmi dobře rozpustný ve vodě a v polárních organických rozpouštědlech, takže je často využíván jako chirální selektor v CZE v kyselých pracovních elektrolytech (v rozmezí pH 3 až 6).

I když vankomycin chlorid poskytuje velmi dobré rozlišení při separacích enantiomerů, má jeho využití v CZE několik nevýhod. Vankomycin chlorid, díky své struktuře velmi silně absorbuje UV záření zejména v intervalu od 190 do 260 nm. Navíc se vankomycin velmi ochotně v kyselém prosředí sorbuje na stěnu nepokryté křemenné kapiláry a dochází tak ke vzniku rozmytých zón. Pro eliminacei uvedených problémů se používají nejčastěji kombinaci dvou technik. Jde o využití kovalentně pokryté křemenné kapiláry (dochází k eleminaci záporného náboje na vnitřní stěně kapiláry) a techniky částečného plnění kapiláry (angl. partial filling technique) elektrolytem obsahující vankomycin (eliminace vankomycinu z detekčního okénka). Pro kovalentní pokrytí křemenných kapilár se využívá několik postupů, ale většinou jde principielně o chemické navázání a zpolymerování akrylamidu na silanolové skupiny křemenné kapiláry. Technika částečného plnění kapiláry je velmi výhodný způsob separace analytů, v případě že k jejich separaci je potřeba využít aditivum, které poskytuje v detektoru odezvu podobně jako analyt. V případě vankomycinu by přítomnost vankomycinu v pracovním elektrolytu vedla k velkému snížení citlivosti UV detekce. Pro separaci kyseliny mléčné je možno využít kyselý pracovní elektrolyt, kdy je vankomycin kladně nabitý a kyselina mléčná nese záporný náboj (pKa pro kyselinu mléčou je asi 3,9). V nepokryté křemenné kapiláře po vložení stejnosměrného napětí se vankomycin+ a mléčnanbudou pohybovat navzájem v opačném směru. Pokud před vlastní separací nadávkujeme pracovní elektrolyt obsahující vankomycin chlorid pouze po detekční okénko a za tuto dlouhou zónu elektrolytu se selektorem nadávkujeme separované enantiomery mléčné kyseliny, bude se po vložení stejnosměrného napětí pohybovat vankomycin+ směrem od detekčního okénka (k záporně nabité elektrodě) a mléčnan- směrem k detekčnímu okénku, kde v okamžiku detekce budou přítomen pracovní eletkrolyt bez vankomycinu. Schéma techniky částečného plnění je na obrázku 2.

Obrázek 2: Schéma částečného plnění při enatioseparaci mléčné kyseliny Chemikálie: kyselina salicylová, standardní roztok D,L-mléčné kyseliny o koncentraci 1.10-3 mol.l-1, L-histidin, kyselina šťavelová, vankomycin chlorid, kalibrační pufry pro kalibraci pH metru na pH 2 a 7.

Pomůcky: Kovalentně pokrytá kapilára o vnitřním průměru 50 µm, celkové délky 48,5 cm a efektivní délky 40 cm (je už připravená a vložená v přístroji vedoucím cvičení), ultrazvuk, pH-metr, kapilární elektroforéza s DAD detektorem HP3D Agilent, bezkontaktní vodivostní detektor, magnetická míchačka, teflonové magnetické mchadlo, kádinka, odměrná baňka, kádinka. Postup: A. Příprava pracovního elektrolytu 10 mmol.l-1 salycilátu L-histidinia pH 4,5 a proměření kalibrační řady roztoků D,L-mléčné kyseliny. 1) Do odměrné baňky na 100 ml navažte přesně vypočítané množství kyseliny salicylové (výsledná koncentrace by měla být 10 mmol.l-1) a rozpusťte ji asi v 50 ml deionizované vody. Odměrnou baňky uzavřete a protřepte, opět otevřete a vložte ji na 10 minut do ultrazvukové lázně. Sonifikujte nejméně 10 minut, nebo do rozpuštění kyseliny salicylové. Po rozpuštění doplňte roztok deionizovanou vodou po rysku. 2) S pomocí vedoucího cvičení nakalibrujte pH-metr. Do kádinky na 150 ml přelijte připravený roztok kyseliny salycilové a vložte teflonové magnetické míchadlo. Kádinku umístěte na magnetické míchadlo, ponořte elektrodu pH metru do kádinky s roztokem (pozor aby míchadlo při otáčení nenaráželo do elektrody pH-metru!). Pevným L-histidinem vytitrujte roztok za současného míchání a kontroly hodnoty pH na pH-metru na hodnotu 4,5. Pracovní elektrolyt 10 mmol.l-1 salicylát L-histidinia přelijte do reagenční láhve na 100 ml a uzavřete.

3) Do 2 ml plastové nádobky navažte 8 mg vankomycin chloridu a rozpustťe ve 2 ml pufru 10 mmol.l-1 salicylátu l-histidinia pH 4,5. Tento pufr použijete pro nepřímou UV-Vis detekci 4) Podobným postupem 1) až 2) připravte 5 mmol.l-1 oxalát/L-his pH 4,5 a do jeho 2 ml odvažte 20 mg vankomycin chloridu. Tento pufr použijete pro vodivostní detekci. 4) Ze standardního roztoku D,L-mléčné kyseliny o koncentraci 1.10-3 mol.l-1 si připravte kalibrační roztoky o koncentraci 2, 4, 6 a 8.10-4 mol.l-1. V každém kalibračním roztoku tak bude D- a L-mléčná kyselina o stejné koncentraci. 5) S pomocí vedoucího cvičení projděte celou předprogramovanou analýzu včetně promývaní kapiláry. 6) Do vialek odpipetujte vždy 600 µl kalibračního roztoku a zavřete víčky. Do 3 dalších vialek odpipetujte vždy 600 µl pracovního elektrolytu bez vankomycin chloridu a do 1 vialky odpipetujte 600 µl pracovního elektrolytu s vankomycin chloridem a opět zavíčkujte (pro oba pracovní elektrolyty zvlašť). Všechny vialky vložte na 5 minut do ultrazvukové lázně a sonifikujte. 7) Pod dohledem vedoucího cvičení vložte vialky do přístroje a proměřte kalibrační řadu (každou koncentraci 2x). B. Příprava vzorku jogurtu a chirální separace D,L-mléčné kyseliny v jogurtu Bílý jogurt (je předem vytažený z lednice a vytemperovaný na laboratorní teplotu) zhomogenizujte lžičkou a navažte 100 mg jogurtu do 100 ml odměrné baňky a navážku rozpustťe v asi 50 ml deionizované vody a sonifikujte v ultrazvuku asi 10 minut. Po rozpuštění navážky doplňte roztok v odměrné baňce po rysku. Z tohoto vzorku odeberte k analýze 600 µl do vialky a zavíčkujte. Vzorek proměřte 3 x opakovaně (je potřeba zopakovat 3 x celý postup).

Vyhodnocení 1) Odečtěte plochy a migrační časy pro D- a L- izomery mléčné kyseliny při jednotlivých koncentracích. Z opakovaných měření vypočítejte průměrné hodnoty a zaznamenejte je do tabulky (vše zaokrouhlujte na jedno platné desetinné číslo). Koncentrace

Migrační čas

Migrační čas

Plocha

Plocha

-1

(průmer)

(průměr)

(průměr)

(průměr)

L-mléčná [s]

D- mléčná [s]

L-mléčná [-]

D-mléčná [-]

[mol.l ]

2.10-4 …

2) Z hodnot ploch a příslušných koncentrací sestrojte kalibrační závislosi (zvlášť pro L- a Dmléčnou kyselinu) pomocí programu Excel nebo QC Expert vyhodnoťte rovnici kalibrační závislosti, koeficient determinace, mez detekce a stanovitelnosti a zhodnoťte zda kalibrační křivka prochází počátkem. 3) Vypočítejte množství D- a L-mléčné kyseliny ve vzorku jogurtu. 4) Porovnejte výsledky z obou detekcí (UV/Vis a vodivostní). Literatura: [1] V. Maier, J. Petr, R. Knob, J. Horáková, J. Ševčík, Electrophoresis (v tisku). [2] P. Camilleri, Capilary electrophoresis. Theory nad practice 2nd edition, CRC Press, London, 1998. IX. Separace polyfosforečnanů v pracích prostředcích metodou ITP Úvod

Polyfosforečnany tvořily a v některých případech dosud tvoří významnou součást pracích prostředků. Z důvodu jejich masového využívání dochází k značnému zatěžování životního prostředí a tím i k postupnému přecházení od starších technologií k novější „bioaktivním“. Přesto v mnoha pracích prostředcích definovaných jako bezfosfátové lze nalézt polyfosforečnany. Kapilární izotachoforéza (ITP) se jeví jako ideální metoda pro stanovení obsahu polyfosforečnanů. V izotachoforéze dávkujeme vzorek mezi dva elektrolyty – vedoucí (leading electrolyte, LE) a koncový (terminating electrolyte, TE). Tyto elektrolyty jsou voleny tak, aby ionty vedoucího elektrolytu měly nejvyšší pohyblivost (mobilitu) v daném systému a ionty koncového elektrolytu tak, aby měly nejnižší pohyblivost. Narozdíl od ostatních

elektromigračních metod používáme upravené kapiláry, elektroosmotický tok, a aplikujeme konstantní elektrický proud.

abychom

eliminovali

Na základě uvedených skutečností si lze představit průběh izotachoforézy podle následujícího schématu (obr. 1): ve vzorku jsou ionty A + B, přičemž ion A má vyšší mobilitu než ion B. V zóně vzorku má intenzita elektrického pole svoji určitou konstantní velikost. Po aplikaci stejnosměrného el. proudu dochází k migraci iontů A, B různou rychlostí (v = µ.E) a tím dojde k jejich separaci. Na konci je ustanoven stacionární stav, ve kterém se všechny zóny pohybují stejnou rychlostí.

Kapilární izotachoforézu charakterizují dvě základní přednosti: samozaostřující efekt a schopnost prekoncentrace. Samozaostřující efekt je poznat z předchozího obrázku (obr 1.d), opustí-li ion A svoji zónu v důsledku difuze do zóny vedoucího elektrolytu, dojde k jeho zpomalení díky nižší intenzitě elektrického pole v této zóně. Stejně tak tomu je i v případě přechodu iontu A do zóny iontů B. Zde dojde k urychlení iontu A, protože v zóně B je vyšší intenzita elektrického pole – tím vznikají ostrá rozhraní mezi zónami. Úkol

Provést separaci a kvantifikaci polyfosforečnanů ve vzorku pracího prostředku. Pro separaci polyfosforečnanů použijeme následující elektrolyty: LE: 10 mM HCl + β-alanin pH 4,0; TE: 5 mM glutamová kyselina. Chloridové ionty budou hrát roli vedoucího elektrolytu a glutamát bude hrát roli koncového elektrolytu. Postup

•

Jako vedoucí elektrolyt připravíme 10 mM roztok kyseliny chlorovodíkové v deionizované vodě (celkový objem 100 ml), tento roztok vytitrujeme β-alaninem na

pH 4,0 a přidáme 0,05 % (w/w) polyvinylalkohol. Koncový elektrolyt připravíme rozpuštěním vypočteného množství glutamové kyseliny v deionizované vodě (celkový objem 100 ml). Všechny chemikálie musí být čistoty vhodné pro ITP! Kalibrační roztoky směsi polyfosforečnanů připravíme zředením zásobního roztoku na koncentrace 5.10-7 mol/l až 5.10-5 mol/l; roztok připravujeme do 1 ml vialky, ředění nesmí být v jednom kroku větší než 100x. Přesně navážený vzorek (přibližně 1 g) přineseného pracího prostředku rozpustíme v deionizované vodě (10 ml). Vzorek přefiltrujeme, zředíme deionizovanou vodou (1:1) a přefiltrujeme jej přes membránový filtr. Takto upravený vzorek dáme do vialky pro vzorky. S vedoucím cvičení otevřeme na přístroji metodu „ITPph_cv“ (před měřením s vedoucím zkontrolujeme, zdali je v přístroji teflonová kapilára), provedeme analýzy a vyhodnotíme je podle pokynů vedoucího.

• •

•

Literatura

[8] [9] [10]

P. Boček, F. Foret, J. Chromatogr. 1984, 313, 189-222. P. Boček, B. Kaplanová, M. Deml, J. Janák, J. Chromatogr. 1978, 153, 287-292. F. M. Everaerts, J. L. Beckers, T. P. E. M. Verheggen, Isotachophoresis: Theory, Instrumentation and Applications. Elsevier, Amsterdam 1976. P. Boček, M. Deml, P. Gebauer, V. Dolník, Analytical Isotachophoresis. VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1988. J. Petr, V. Maier, J. Horáková, J. Ševčík, Z. Stránský, J. Sep. Sci. 2006, 29, 27052715.

[11] [12]

Úlohy do předmětu: Experimentální metody biochemie X. Stanovení kyseliny orotové v moči kapilární zónovou elektroforézou Úvod Kyselina orotová (orotic acid, OA) je intermediárním produktem biosyntézy pyrimidinu. Stanovení OA je velmi důležitým diagnostickým postupem umožňující diagnostikovat vrozené dědičné metabolické poruchy. Struktura OA je na následujícím obrázku (obr. 1). OH

N

O

N H

COOH

Obr. 1: Struktura orotové kyseliny Biosyntéza pyrimidinových nukleotidů probíhá z kyseliny asparagové a z karbamoylfosfátu. Meziproduktem sledu biochemických reakcí je kyselina orotová, která s 5-fosfribosa-1difosfátem poskytuje orotidin-5´-fosfát a dekarboxylací uridin -5´-fosfát (UMP). Ostatní pyrimidinové deriváty vycházejí z UMP.

Dědičné metabolické poruchy jsou spojeny s defektem uridin monofosfát syntázy (UMPS), orotátfosforybosyltransferázy (OPRT) a orotidin momfosfát dekarboxylázy (ODC). Defekt všech tří enzymů je označován jako orotová acidurie typ I a defekt pouze ODC jako orotová acidurie typ II. U zdravých pacientů je exkrece kyseliny orotové močí na velmi nízké koncentrační hladině (méně než 10 µmol.l-1). U nemocných postižených orotovou acidurií dochází ke zvýšené exkreci orotové kyseliny v moči, kde ji lze poměrně jednoduše stanovit. Pro stanovení orotové kyseliny se dnes běžně využívají metody HPLC a spektrofotometrické, ale je možné provést i stanovení enzymovou analýzou a metodou GC/MS s využitím izotopického zřeďování. Velmi jednoduché, rychlé a selektivní stanovení orotové kyseliny umožňuje i kapilární zónová elektroforéza (CZE). Pro elektroforetické stanovení musí analyt splňovat podmínku, kdy lze nalézt vhodné prostředí (pH), kdy je analyt v nabité formě, tak aby mohl migrovat ve stejnosměrném elektrickém poli. Vzhledem k tomu, že v moči (nebo v jakémkoli biologickém materiálu) se nachází i značné množství látek, které mohou při stanovení interferovat, je nutné zajistit kvalitní separaci orotové kyseliny od ostatních složek moči. Orotovou kyselina je poměrně silná organická kyselina, pKa disociace karboxylové skupiny je 1,8. Tato příznivá hodnota disociační konstanty umožňuje využít velmi kyselý pracovní elektrolyt pro její separaci od ostatních aniontů slabších kyselin, které jsou v moči rovněž přítomné. Orotová kyselina má navíc chromofory, které umožňují její spektrofotometrickou detekci při 280 nm. Při této vlnové délce a v kyselém prostředí je selektivně detekovatelná pouze kyselina orotová z možných složek moči. Separace probíhá v nepokryté křemenné kapiláře při tzv. obrácené polaritě (na vstupní elektrodě je záporný pól). Chemikálie a roztoky: kyselina orotová p.a., kyselina fosforečná p.a., 50% NaOH, destilovaná voda. Pracovní elektrolyt: 100 mmol.l-1 fosfát sodný pH 2,25 Pracovní elektrolyt se připravuje do odměrné nádobky na 100 ml. Odpipetuje se odpovídající množství kyseliny fosforečné (w = 85%, d = 1,85, Mr = 98) a doplní destilovanou vodou po rysku odměrné baňky. Nakalibruje se pH-metr a následně se provede vytitrování roztoku 100 mmol.l-1 kyseliny fosforečné 50%-ním NaOH za stálého míchání na pH 2,25 přesně. Příprava standardu kyseliny orotové: Kyselina orotová se naváží a rozpustí v 1 ml deionizované vody v eppendorfce, tak aby její výsledná koncentrace byla 1.10-3 mol.l-1. Z připraveného zásobního roztoku se pak ředěním připraví sada kalibračních roztoků o koncentraci 2.10-5 mol.l-1, 4.10-5 mol.l-1, 6.10-5 mol.l-1, 8.10-5 mol.l-1, 1.10-4 mol.l-1. Přístrojové vybavení a kapilára: Kapilární elektroforéza HP 3D CE Agilent s DAD detektorem pracujícím v rozmezí 190 až 600 nm. Dávkování standardů i vzorků se provádí hydrodynamicky 50 mbar/5s. Detekční vlnová délka se nastaví na 280 nm. (Metoda OA.M je uložená v počítači k přístroji). Nepokrytá křemenná kapilára celkové délky 48,5 cm a efektivní délky 40 cm se před měřením promyje 0,1 M NaOH 15 minut a vodou 15 minut (provede vedoucí cvičení). Separační napětí je -20 kV. Příprava vzorku moče:

Moč pacienta s orotovou acidurií se pouze naředí 1:10 vodou (moč:voda), promýchá se na vortexu a dávkuje se. Kontrolní moč zdravého pacienta se musí před měřením zakoncentrovat. Moč se alkalizuje na pH 12,0 pomocí 1 mol.l-1 NaOH a aplikuje se na Dowex 1 kolonku (v HCOO- cyklu). Kyselina orotová se eluuje amoniakem. Vlastní měření: Před měřením se kapilára promyje 15 minut pracovním elektrolytem 100 fosfát sodný pH 2,25. Standardy kyseliny orotové se napipetují do dávkovacích vialek (odpipetuje se vždy 300 µl). Vzorky moče se rovněž odpipetují (300 µl) do dávkovacích vialek. Standardy se postupně proměří od nejnižší koncentrace až po nejvyšší (každý ve 2 opakovaných měřeních) a poté se proměří vzorek moči (každý ve dvou opakovaných měřeních). Vyhodnocení: Z elektroforegramů se odečtou plochy pro jednotlivé koncentrace kyseliny orotové a migrační časy píků. Kalibrační křivku vyhodnocujeme jako podíl plochy a migračního času (tzv. redukovaná plocha). Stejně tak pro reálné vzorky vypočítáme poměry plochy a migračního času a dosadíme do rovnice kalibrační přímky. Koncentraci kyseliny orotové v reálných vzorcích vyhodnocujeme v µmol.l-1. Literatura: [1] J. Ševčík, T. Adam, J. Sázel, Anal. Chim. Acta 18 (1997) 259. XI. Stanovení aktivity adenosin deaminasy v erythrocytech metodou kapilární izotachoforézy / kapilární zónové elektroforézy

Úvod

Adenosin deamináza (EC 3.5.4.4) patří mezi důležité enzymy v katabolismu purinových sloučenin v organismu (obr. 1), kde katalyzuje přeměnu adenosinu na inosin. V případě, že není tento enzym aktivní, či vykazuje sníženou aktivitu, dochází k imunitním dysfunkcím, Z tohoto důvodu je významné měření enzymové aktivity adenosin deaminázy.

Obr. 1: Zjednodušené schéma katabolizmu purinových sloučenin. Standardní metodou pro stanovení aktivity adenosin deaminasy v erythrocytech je HPLC. Kapilární elektroforéza nabízí poměrně jednodušší a rychlejší možnost stanovení aktivity enzymu, přesto s použitím klasické UV detekce (spektrofotomerické detekce) jsou problémy s citlivostí (z důvodu krátké optické délky). Zajímavou alternativou je použití stavu přechodné izotachoforézy pro on-line prekoncentraci analytů. Takto lze dosáhnout řádově několika set násobné prekoncentrace vzorku, čímž se dostaneme na úroveň koncentrací analytů řádově 10-8 mol/l, což je koncentrace běžná v tělních tekutinách. Stanovení aktivity enzymu je založeno na sledování enzymatické reakce mezi substrátem a enzymem: S + E → SE → P + E Z této rovnice lze odvodit známou rovnici Michaelise a Mentenové: V =

Vmax [S ] , K m + [S ]

kde Km je Michaelisova konstanta, V je rychlost přeměny, Vm je maximální rychlost přeměny a [S] je koncentrace substrátu.

Pro určení kinetických parametrů rovnice je nutné, aby rychlost přeměny byla ve vztahu s měřitelnou veličinou (absorbance, proud apod.). V případě stanovení aktivity adenosin deaminasy bude měřenou veličinou plocha píku produktu reakce (inosinu), kterou adenosin deaminasa katalyzuje. Stanovení aktivity adenosin deaminasy v erythrocytech tedy provedeme přidáním různých koncentrací adenosinu k hemolyzátu erythrocytů, inkubací reakční směsi a následně rozseparujeme jednotlivé složky směsi a kvantifikujeme inosin (~V). Získáme typickou křivku popisující aktivitu enzymu (obr. 2).

Obr. 2: Křivka závislosti okamžité rychlost enzymové reakce na rovnovážné koncentraci

substrátu. Z této křivky pak lze odečíst hodnotu Michaelisovy konstanty a hodnotu Vmax. Pokud nemáme k dispozici statistický software, který je následující křivku schopen vyhodnotit většinou pracujeme s upraveným vztahem (tzv. Lineweaver-Burkova linearizace): Km 1 1 = + , V Vmax [S ] Vmax kde vynášíme 1/[S] proti 1/V čímž získáme lineární závislost (obr. 3) a lze tedy již jednoduše určit hodnoty Km a Vmax.

Obr. 3: Linearizovaná závislost okamžité rychlosti na rovnovážné koncentraci substrátu.

Úkol

Stanovit aktivitu adenosin deaminasy v hemolyzátu erythrocytů pomocí kapilární elektroforézy s prekoncentrací pomocí přechodné izotachoforézy. Vzorek erythrocytů rozpustíme v pufru 50 mM fosfát/Na pH 7,4. Jako základní elektrolyt použijeme 300 mM borát/Na pH 10,0; separaci provedeme v nepokryté kapiláře (musíme počítat se silným elektroosmotickým tokem) při 15 kV. Borátový elektrolyt používáme z důvodu jeho schopnosti interakce s vicinálními OH skupinami (umožní separaci nukleosidů od volných bazí). Pokud se zamyslíme nad prezentovaným systémem, dojdeme k závěru, že borátový anion je nejpomalejším iontem, fosfátový anion nejrychlejší a analyzované složky mají mobility mezi těmito ionty. Zajistíme-li dostatečné zředění chloridových iontů ze vzorku, pak bude fosfát hrát úlohu vedoucího elektrolytu a borát úlohu terminátoru. Tento přechodný izotachoforetický stav bude v kapiláře po určitou dobu probíhat a zakoncentruje analyty. Po skončení tohoto stavu dojde k separaci již na základě principů zónové elektroforézy. Postup

Příprava vzorků • 25 µl centrifugovaného a inkubačním pufrem (50 mM fosfát/Na pH 7,4) zředěného lyzátu erythrocytů (již je připraven) dáme do 200 µl roztoku adenosinu v inkubačním pufru (roztoky adenosinu o koncentracích: 0,25 mM, 0,1 mM, 0,05 mM, 0,025 mM; pro každou koncentraci připravujeme 2 vzorky). • Směs inkubujeme přesně 15 minut při 37°C, reakci zastavíme přidáním 25 µl 40% trichloroctové kyseliny a důkladným promícháním směsi. Precipitát proteinů odstraníme centrifugací. Supernatant extrahujeme směsí voda-diethylether tak, aby měl výsledný roztok pH > 5,0 (přibližně 5krát). Elektroforetická měření • Do dvou viálek dáme předem připravený borátový pufr o pH 10,0 (připravíme 300 mM roztok kyseliny borité do 250 ml baňky; roztok titrujeme hydroxidem sodným na pH 10,0). Do jedné viálky dáme inkubační pufr; dále dáme do viálek pro vzorky roztok adenosinu (5.10-5 M), inosinu (5.10-5 M) a připravené vzorky. S vedoucím cvičení otevřeme na přístroji metodu „ADA_cv“ a podle jeho pokynů provedeme analýzy a vyhodnotíme je. Analýzy provádíme při 15 kV, dávkujeme 50% délky kapiláry. • Na základě zjištěných výsledků spočítáme aktivitu adenosin deaminasy. Literatura [1] T. Adam, J. Ševčík, Z. Švagera, L. D. Fairbanks, P. Barták, Electrophoresis 1999, 20, 564-568. [2] R.H. Garrett, C.M. Grisham, Biochemistry. Thomson Brooks Cole 2005. [3] Z. Glatz, J. Chromatogr. B 2006, 841, 23-37. [4] D. Voet, J. G. Voet, Biochemie. Victoria Publishing 2003.

Úlohy do předmětu: Cvičení z fyzikální chemie Stanovení aktivačních parametrů chemické reakce Základní úlohou reakční kinetiky je stanovení rychlostní konstanty reakce. Tuto konstantu je možno stanovit z průběhu koncentračních změn jednotlivých látek v čase. Obecné závislosti koncentrací reagujících látek na čase pro jednotlivé typy reakcí lze získat integrací základních diferenciálních rovnic. Pro reakci typu A + B = produkty (1 ) probíhající za konstantní teploty závisí její rychlost v na součinu molárních koncentrací takto: (2) v = k . c αA . c Bβ kde koeficient úměrnosti k se nazývá rychlostní konstanta, cA , cB jsou okamžité molární koncentrace výchozích látek A, B a exponenty α , β jsou dílčí reakční řády. V případě, že pokus je uspořádán tak, že koncentrace jedné z látek je v mnohonásobném nadbytku (např. cB ›› cA ), je možno časovou změnu její koncentrace neuvažovat a považovat ji za konstantní. Rovnice (2) tím nabude tvar : (3) v = k1 . c αA a za předpokladu, že α =1 platí v = - dcA/dt = dx/dt k1 . cA = k1(a-x)

(4)

kde a je počáteční koncentrace látky A a x je úbytek látky A během reakce. Integrací rovnice (4) v mezích t=0 až t, x=0 až x dostaneme výraz pro výpočet okamžité koncentrace výchozí látky A v libovolném čase (5) cA = a. exp [− k1 .t ] Při reakci 1. řádu je možno brát teoreticky kterýkoliv čas za počáteční, nicméně pro přesnost výpočtu bychom se měli snažit získat alespoň 10 hodnot z prvních 25% konverze. Pokud data získáváme z konce reakce, pokles okamžité koncentrace je skoro lineární funkcí času a získaná experimentální data jsou obtížně vyhodnotitelná. Úkol: Stanovení aktivačních parametrů reakce krystalové violeti s hydroxylovými ionty Intenzívně zbarvená kationtová forma krystalové violeti přechází reakcí s hydroxylovými ionty na bezbarvou neutrální formu.

Reakční rychlost této reakce je určena vztahem v = - dcA/dt = k2 . cOH- . cA

(6)

Protože koncentrace hydroxidu, který je zde ve značném nadbytku, se prakticky nemění, je možno tuto reakci interpretovat jako reakci 1. řádu – pseudomonomolekulární. K měření změny koncentrace barevné formy krystalové violeti během reakce se používá spektrofotometrického měření. Výchozí barevná forma krystalové violeti a vznikající neutrální forma se vzájemně liší absorpčními koeficienty (pro neutrální formu je při vhodně zvolené vlnové délce roven 0). 0,8 0,7

absorbance

0,6 0,5 barevná forma

0,4

bezbarvá forma

0,3 0,2 0,1 0 350

450

550

650

750

vlnová délka [λ]

Obr. 1 Závislost absorbance na vlnové délce pro barevnou a bezbarvou formu krystalové violeti Za předpokladu, že absorbance neutrální formy tedy bude na konci reakce rovna nule, můžeme okamžitou absorbanci vyjádřit jako funkci času (obr. 2) A = (A0 - A∞).exp [− k1 .t ] + A∞

(7)

kterou můžeme linearizovat a získáme vztah ve tvaru

ln(A - A∞) = ln (A0 - A∞) – k1t k1 =

A − A∞ 1 . ln 0 t A − A∞

(8)

(9)

0,8 0,7

absorbance

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

čas [s]

Obr. 2: Kinetická křivka V souhlase s experimentálními výsledky vystihl Arrhenius závislost reakční rychlosti na teplotě rovnicí k= A . exp [− E A / RT ]

(10)

kde EA je Arrheniova aktivační energie, A je frekvenční faktor a R je univerzální plynová konstanta. Arrheniova rovnice se tradičně pro další použití linearizuje, čímž nabývá tvaru ln k = ln A – EA/RT

(11)

V teorii absolutních reakčních rychlostí (Eyringova teorie) nověji nazývané teorií tranzitního stavu se předpokládá, že určujícím dějem je rovnováha mezi výchozími látkami a tzv. aktivovaným komplexem. Tato rovnováha je popsána rovnovážnou konstantou K≠, pro kterou platí k=

k BT ≠ K h

(12)

kde kB je Boltzmannova konstanta a h je konstanta Planckova. Protože rovnovážnou konstantu je možno vyjádřit pomocí změny Gibbsovy energie aktivovaného komplexu, pro kterou platí ∆G ≠ = ∆H ≠ - T ∆S ≠

(13)

je možno výsledný výraz pro závislost rychlostní konstanty na teplotě (Eyringova rovnice) psát ve tvaru k=

k BT ∆H ≠ ∆S ≠ . exp . exp h RT R

(14)

resp. v linearizované podobě ln k = ln(kBT/h) - ∆H ≠ /RT + ∆S ≠ /R

(15)

kde ∆H ≠ a ∆S ≠ jsou aktivační entalpie a aktivační entropie. Derivujeme-li Arrheniovu i Eyringovu rovnici podle teploty a obě porovnáme, dostaneme vztah Ea = ∆H ≠ + RT

(16)

Společným řešením rovnic (11), (15) a (16) získáme vztah pro výpočet aktivační entropie ∆S ≠ = R [ln A − ln (k B T / h ) − 1]

(17)

Experimentální vybavení: Spektrofotometr Specord 600 s s Peltierovým termostatem, vodný roztok krystalové violeť o koncentraci 10-4 mol.dm-3, , 0,5 mol.dm-3 roztok NaOH, 0,8 mol.dm-3 roztok KNO3, pipety, odměrné baňky o objemu 25 a 50 cm3. Pracovní postup: Ověříme, zda pro krystalovou violeť platí Lambertův-Beerův zákon (úlohaxxx). Ověření provedeme při vlnové délce 590 nm. Tuto vlnovou délku použijeme i při následné časové závislosti poklesu absorbance při vlastní reakci. Pro další měření rychlosti reakce krystalové violeti s hydroxylovými ionty požijeme tu koncentraci krystalové violeti, jejíž absorbance se pohybovala okolo hodnoty 0,8 (5 cm3 5.10-5 mol.dm-3). Do odměrné baňky o objemu 25 cm3 pipetujeme postupně příslušné množství zásobního roztoku krystalové violeti a KNO3 (koncentrace KNO3 v reakční směsi má být 0,2 mol.dm-3 pro udržení konstantní iontové síly) a baňku doplníme destilovanou vodou. 2,5 cm3 vzorku dáme do kyvety a tu vložíme do termostatovaného kyvetového prostoru spektrofotometru. Po vytemperování na požadovanou teplotu teprve poté připipetujeme 0,025 cm3 zásobního roztoku NaOH, aby jeho výsledná koncentrace byla 0,005 mol.dm-3 , dobře promícháme a vložíme kyvetu zpět do kyvetového prostoru. Spustíme stopky. Vzhledem k tomu, že od smíchání krystalové violeti s hydroxidem již běží reakce, co nejrychleji provedeme první měření absorbance. Měření ukončíme po poklesu absorbance na ¼ výchozí hodnoty (přibližně 0,150 -0,200). Stejné měření provedeme pro teploty 20, 30, 40, 50, 60oC Pozn. Pro zjednodušení jako srovnávací vzorek použijeme 0,2 mol.dm-3 KNO3 , do kyvety se srovnávacím vzorkem vložíme teplotní sondu. Tuto kyvetu dáme do kyvetového prostoru ve stejnou dobu jako měřený vzorek.

0,8 0,7

absorbance

0,6 20°C

0,5

30°C 0,4

40°C 50°C

0,3

60°C

0,2 0,1 0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

čas [s]

Graf 1. Kinetické křivky reakce krystalové violeti s OH- při různých teplotách Vyhodnocení: Pomocí PC a softwaru vyhodnotíme časové závislosti a získáme vypočítané hodnoty rychlostních konstant a grafické závislosti okamžitá koncentrace vs. čas. Pro kontrolu, že jsme vhodně zvolili software vypočítáme v jednom případě (např. pro teplotu 20oC) rychlostní konstantu podle vztahu (9). Získané rychlostní konstanty pro jednotlivé teploty uvedeme do tabulky I. a doplníme o údaje potřebné pro výpočet aktivačních parametrů. Tabulka I: Hodnoty rychlostní konstanty reakce krystalové violeti s OH- ionty pro různé teploty. T (K) ….. …..

1/T ….. …..

k1 (s-1) ….. …..

ln k1 …… …..

Máme-li k dispozici PC a vhodný software, vyhodnotíme nelineární závislost dle vztahu (10) nelineární regresí k vs. T. Neznámými parametry jsou zde EA a A. Orientační výsledek je možno rovněž získat i lineární regresí ln k proti 1/T podle linearizovaného vztahu (11). Ze směrnice –EA/R vyčíslíme EA. Graficky znázorníme závislost ln k = f(1/T) a pro teplotu 298 K vypočítáme aktivační parametry studované reakce Ea, ∆S ≠ a ∆G ≠ .

Úlohy pro předmět: Pokročilé cvičení z fyzikální chemie Studium kinetiky autokatalytické reakce Úvod Autokatalytická reakce patří mezi základní mechanismy průběhu chemických reakcí, charakteristický tím, že produkt reakce je současně katalyzátorem pro její uskutečnění. Obecné schéma nejjednoduššího případu autokatalytické reakce lze zapsat rovnicí (1):

A + B → 2B + C

(1)

a rychlost průběhu této reakce rovnicí (2): dx/dt = k1·(a-x)·x

(2)

kde a značí počáteční koncentraci výchozí látky A a x její zreagované množství, současně označující množství vzniklého produktu. Aby tato reakce mohla probíhat, je nutné předpokládat, že na počátku reakce je k dispozici nenulové množství produktu-katalyzátoru B, toto množství si označíme písmenem b a kinetická rovnice přejde na tvar (3): dx/dt = k·(a-x)·(b+x)

(3)

Integrace rovnice (3) vede k integrálnímu tvaru kinetické rovnice autokatalytické reakce (4):  a ⋅ (b + x)  1 ⋅ ln  = k ⋅t a + b  b ⋅ (a − x) 

(4)

Kinetická křivka autokatalytické reakce má tak podle této rovnice (4) charakteristický sigmoidní tvar (viz Obr.1) s maximální rychlostí odpovídající inflexu v bodě cA=0,5(a+b).

Obr. 1: Kinetické křivky autokatalytické reakce probíhající podle rovnice (1). Průběh autokatalytické reakce podle rovnice (1) ovšem předpokládá nenulovou výchozí koncentraci katalyzujícího produktu B, protože při jeho výchozí nulové koncentraci se reakce nerozeběhne. Pro takové případy je třeba předpokládat další reakční krok, v nejjednodušším případě reakci 1. řádu, při níž přímo z výchozí látky vzniká katalyzující produkt, rychlost této reakce je obvykle velmi nízká ve srovnání s autokatalytickým průběhem, přesto stačí, aby bylo vytvořeno nenulové počáteční množství katalyzátoru pro nastartování autokatalytického mechanismu. Nový mechanismus pak sestává ze dvou reakčních schemat: A→B+C

(5)

A + B → 2B + C

(6)

s diferenciálním tvarem kinetické rovnice (7): dx/dt = k1·(a-x) + k2·x·(a-x)

(7)

a integrálním tvarem podle rovnice (8):  a ⋅ (k1 + k 2 ⋅ x)  ln   = (k1 + k 2 a ) ⋅ t  k1 ⋅ (a − x) 

(8)

Typickým případem autokatalytické reakce řídící se uvedenými principy jsou oxidace organických látek (např. kyseliny šťavelové) roztokem manganistanu draselného v kyselém prostředí, kde katalyticky působí vznikající Mn2+ ion. Proto zpočátku běží tato reakce velmi pomalu do okamžiku vzniku dostatečného množství katalyzátoru, kdy se rychlost odbarvování manganistanového aniontu výrazně zrychlí. Úkol: Studium kinetiky autokatalytické reakce mezi kyselinou šťavelovou a manganistanem draselným v kyselém prostředí

Proveďte fotometrické studium kinetiky autokatalytické reakce mezi kyselinou šťavelovou a manganistanem draselným v kyselém prostředí a vyšetřete závislost kinetiky této reakce na koncentraci katalyzátoru - manganatém kationtu. Pomůcky: Spektrofotometr Specord 600 (Analytik Jena), kyvety 1 cm, krytka na kyvetu, 4 ks pipety dělené 1 ml, 1 ks pipeta dělená 5 ml, pipeta automatická 10-100 µl, 5 ks odměrná baňka 25 ml, 4 ks kádinka 25 ml, kádinka 100 ml, kádinka 250 ml, stopky, střička.

Chemikálie: roztoky 0,02 mol.dm-3 KMnO4, 0,05 mol.dm-3 (COOH)2, 2 mol.dm-3 H2SO4, 10-4 mol.dm-3 MnSO4. Pracovní postup:

Nejprve ověřte platnost Lambert-Beerova zákona pro zředěné roztoky KMnO4. Připravte si sadu šesti roztoků KMnO4 v koncentračním rozmezí 0,02 až 0,0001 M a proměřte jejich absorbanci při vlnové délce 565 nm. V celém rozsahu by měla být závislost absorbance na koncentraci roztoku KMnO4 lineární. V prvním pokusu bez přídavku katalyzátoru do fotometrické kyvety o objemu cca 3,5 ml odměřte 1 ml 0,05 M roztoku kyseliny šťavelové, 0,5 ml 2M roztoku H2SO4, 0,8 ml dest. vody a 0,2 ml 0,02 M roztoku KMnO4. Kyvetu uzavřete čepičkou, promíchejte a okamžitě vložte do spektrofotometru. Při vlnové délce 565 nm odečítejte v pravidelných časových intervalech 30 s hodnotu absorbance roztoku až do chvíle, kdy klesne prakticky k nule. Počátek reakce odpovídá okamžiku, kdy jste do kyvety přidali roztok KMnO4 (v té chvíli spouštíte stopky). Další pokusy proveďte stejným způsobem, pouze přidáte před roztokem KMnO4 0,1 mM roztok MnSO4 - provedete celkem 5 pokusů s přídavkem 0,01; 0,02; 0,04; 0,08 a 0,1 ml roztoku MnSO4. Vyhodnocení:

1. Naměřené hodnoty absorbance pro různě koncentrované roztoky KMnO4 vyneste do grafu a proložte přímkou. Určete molární absorpční koeficient pro roztok KMnO4. 2. Naměřené hodnoty z kinetických měření po přepočtu absorbance na koncentraci KMnO4 vyneste do grafické podoby kinetických křivek. 3. Nelineární regresí podle rovnice (4) určete rychlostní konstantu k pro nenulová počáteční množství katalyzátoru b. Získanou funkcí proložte experimentální data. Jednotlivé hodnoty zapište do tabulky proti koncentraci katalyzátoru přidaném v podobě MnSO4. 4. Odvoďte integrální tvar kinetické rovnice (4) z diferenciálního tvaru (3) kinetické rovnice autokatalytické reakce.

Studium povrchového plasmonu kovových nanočástic Úvod Nanočástice kovů vykazují zajímavé fyzikální i chemické vlastnosti, kterými se mnohdy výrazně liší od makrofáze příslušného kovu. Díky těmto vlastnostem jsou nanočástice kovů významným objektem studia aplikačních možností v oblasti nanotechnologií. Typickou fyzikálně chemickou odlišnost nanočástic stříbra od jeho kovové makrofáze představuje existence tzv. povrchového plasmonu, způsobující, že vodné disperze těchto nanočástic jsou zabarveny slabě žlutě až oranžovo červeně, v závislosti na velikosti těchto nanočástic. Povrchový plasmon souvisí s kolektivní oscilací vodivostních elektronů v kovové částici při vybuzení elmg. polem o vhodné energii fotonu. Díky této oscilaci dochází k silné adsorpci dopadajících fotonů a disperze těchto nanočástic vykazuje vysokou absorbanci při určité vlnové délce záření, charakteristické jak pro daný kov, tak i pro velikost jeho nanočástic (viz obr. 1). Obvykle se tento efekt objevuje u částic menších než 100 nm (nanočástic), větší částice kovů (koloidní) již obvykle vykazují souvislou vysokou absorpci světla v celém viditelném spektru – disperze jsou černé. Poloha maxima plasmonové absorbance je závislá i na dalších charakteristikách systému, zejména na dielektrických vlastnostech nejbližšího okolí

kovové nanočástice. Poloha maxima tak velmi citlivě reaguje jak na změnu rozpouštědla, tak i na stav povrchu částice, snadno ovlivnitelný adsorpcí komponent roztoku. Z tohoto důvodu se kovové nanočástice stávají vhodným adeptem pro konstrukci specifických a vysoce citlivých nanosenzorů. V této úloze s pomocí sledování absorbance v maximu povrchového plasmonu nanočástic stříbra bude provedeno studium agregačního chování vodných disperzí těchto nanočástic.

A

1

0,5

0 300

400

500

600

λ (nm )

700

Obr. 1: Absorpční křivka vykazující silnou absorpci světla v maximu plasmonové resonance při 425 nm pro vodnou disperzi stříbrných nanočástic o průměrné velikosti 50 nm. Úkol: Studium povrchového plasmonu kovových nanočástic Proveďte spektrofotometrické studium kinetiky agregace vodné disperze nanočástic stříbra vyvolané zvýšením jejich kinetické energie pomocí sledování změny polohy maxima absorpce povrchového plasmonu vyvolané agregací. Pomůcky: Spektrofotometr Specord S600 s integrovaným Peltierovým termostatem, kyveta 1 cm, krytka na kyvetu, pipeta 1 ml. Chemikálie: vodné disperze nanočástic stříbra o průměrné velikosti 30 a 60 nm a koncentraci 10 mg Ag/l, vodná disperze nanočástic stříbra o průměrné velikosti 60 nm stabilizovaná 1% roztokem polyvinylpyrrolidonu 360. Pracovní postup:

Nejprve proměřte absorpční křivku disperze nanočástic stříbra o velikosti 25 nm při 20ºC a určete z této křivky polohu maxima absorbance této disperze vyvolanou povrchovým plasmonem. Následně nastavte pro Peltierův termostat postupný nárůst teploty z 20ºC na hodnotu 80ºC rychlostí 1ºC/min. Měření absorbance převeďte do módu kinetických měření při konstantní vlnové délce a dobu měření nastavte na 1 hod. Po nastavení všech parametrů spusťte kinetické měření. Po ukončení prvého pokusu s disperzí částic o velikosti 25 nm proveďte druhý pokus s disperzí částic o velikosti 60 nm a na závěr stejný pokus s touto disperzí stabilizovanou 1% roztokem polyvinylpyrrolidonu. Vyhodnocení:

1. Naměřené kinetické křivky v souřadnicích absorbance vs. teplota převeďte do diferenciálního tvaru a vyhodnoťte pro jednotlivé případy agregační teplotu, odpovídající maximu na diferenciální křivce. 2. Na základě vyhodnocených agregačních teplot a za využití Einsteinova vztahu pro rychlostní konstantu agregace ve tvaru k = 4 kBT / 3 η (kde kB je Boltzmannova konstanta a η viskozita prostředí) určete hodnotu rychlostní konstanty agregace pro jednotlivé případy.

3.

Na základě porovnání získaných kinetických údajů kvalitativně posuďte stabilitu jednotlivých disperzí stříbra vůči agregaci.

Úloha do předmětu: Cvičení z pokročilých fyzikálně chemických metod studia látek Studium termického rozkladu a kinetiky dehydratace heptahydrátu síranu manganatého Úvod: Termická analýza obecně studuje změny vlastností látek v závislosti na (zpravidla lineárně rostoucí) teplotě. Nejčastěji používanými metodami jsou - TG (termogravimetrie), zkoumající závislost hmotnosti vzorku na teplotě - DTA (diferenční termická analýza), studující závislost rozdílu teplot mezi studovaným vzorkem a standardem (předem vyžíhaný Al2O3) na teplotě - DSC (diferenční skenovací kalorimetrie), která měří množství tepla, potřebného k dosažení stejné teploty vzorku i standartu v závislosti na teplotě Podrobnější teorii metodiky je možno nalézt ve skriptech F. Březina a kol.: Stereochemie a některé fyzikálně chemické metody studia anorganických látek. Úkol: 1. Proveďte termickou analýzu monohydrátu šťavelanu vápenatého. 2. Vypočtěte aktivační energii odštěpení vody z TG metodou Freeman-Carrol a z DTA metodou Pilojan-Novikova. Pomůcky: Přístroj pro termickou analýzu SEIKO TG/DTA 6200 s nově zabudovanou pecí a přísl. (TG/DTA 200 H turnace, PAN Sample open PT5PC/set, balance beam set) (viz obr. 1). Obr. 1 Přístroj SEIKO TG/DTA 6200 s nově zabudovanou pecí

Chemikálie: Ca(COO)2.H2O, Al2O3 Pracovní postup: Provedeme navážku vzorku (0,1 g) do kelímku a umístíme jej do pece. Zapneme přístroj (postupujeme dle návodu) a sejmeme TG/DTA křivku Provedeme zpracování naměřených dat na počítači a odečteme počátek a konec termického rozkladu, plata a odpovídající meziprodukty, endo a exoefekty. Z naměřených dat vypočteme aktivační energii odštěpení vody. Detailní postup ovládání přístroje k dispozici přímo u úlohy; přesný postup výpočtu viz výše uvedená skripta. Konkrétní naměřené křivky – viz obr. 2.

Obr. 2.

Přístrojové vybavení je významnou měrou využíváno studenty při realizaci bakalářských a diplomových prací. A v neposlední řadě nově pořízené přístrojové vybavení přímo slouží i studentů doktorských studijních programů chemie (6)a biochemie(2) při realizaci jejich doktorských prací. Např. Doktorské práce

Mgr. Čeněk Gregor: Vliv reakčních podmínek na katalytické vlastnosti oxidů železa připravených v pevné fázi (zahájeno 1.10.2006, školitel Doc. RNDr. Radek Zbořil, Ph. D.) Mgr. Kateřina Kutláková: Vícejaderné komplexy vybraných přechodných kovů (zahájeno 1.10.2005, školitel: Prof.RNDr. J.Kameníček, CSc.) Mgr. Pavel Štarha: Studium biologicky aktivních komplexů platiny a paládia (zahájeno 1.10.2006, školitel prof.RNDr. Zdeněk Trávníček, Ph. D.) Diplomová práce:

Bc. Alena Vaníčková: Studium heterogenní katalýzy modelových reakcí – jako katalyzátory budou použity různé formy oxidu železitého a koloidní stříbro Bc. Kamila Štěpánková: Syntéza komplexů ruthenia s cytokininovými deriváty Tomáš Peterek: Heterocyklické a jiné vybrané dithiokarbamáty niklu ve vyšším oxidačním stupniMichal Valášek: Analýza fyziologických látek Jakub Němec: Analýza fyziologických látek kapilární elektroforézou Radka Vávrová: Analýza opticky aktivních látek Czemeková Lýdie :Analýza pesticidů v životním prostředí metodami CZE Poláček Petr: Analýza obsahu těžkých kovů v životním prostředí metodami CZE Bakalářské práce

Adéla Andrésová: Studium heterogenní katalýzy na oxidech železa Pavlína Ginterová: Vliv teploty na reakční kinetiku ( zpracování návodu pro cvičení) Jana Juráňová: Studium heterogenní katalýzy na oxidech železa

Přístrojové vybavení pořízené z prostředků FRVŠ a PřF UPOL byla rovněž prezentována v rámci Dne otevřených dveří a využívána frekventanty Letní školy chemiků a Dalšího vzdělávání učitelů, čímž bude přispívat k popularizaci chemie vně vysoké školy.