ÚLOHA 18 Imunochemická detekce a kvantifikace heat shock proteinu Hsp70 ve vzorcích rostlin metodou Western blot Teoretický úvod Živé organismy jsou schopny potlačit nebo zastavit syntézu řady proteinů a naopak syntetizovat nové proteiny jako odpověď k abiotickému environmentálnímu stresu. Organismy vystavené vysokým neletálním teplotám, tj. teplotám, které jsou pro daný organismus nad prahem jeho optima, spouští de novo syntézu charakteristických proteinů, tzv. heat shock proteinů (Hsps). Dochází k fyziologické odpovědi na teplotní stres, označované jako heat shock odpověď (HSR), která je jednou z nejvíce evolučně konzervovaných biochemických drah v přírodě. HSR vede k ochraně buněk před poškozením, k obnově normálních buněčných a fyziologických aktivit a k dosažení vyšší úrovně termotolerance. V živých systémech se většina Hsps nachází konstitutivně, avšak působením stresových faktorů a během různých vývojových stádií organismu dochází k jejich intenzivní expresi. Zvýšenou produkci Hsps vyvolávají environmentální (stresové) podmínky (např. působení vysoké teploty, inkorporace těžkými kovy a analogy aminokyselin, hodnota extracelulárního pH, dále pak působení detergentů, peroxidu vodíku a močoviny), patofyziologické podmínky (virální nebo bakteriální infekce, intracelulární hladina vápníku a hodnota intracelulárního pH) a nestresové podmínky (diferenciace a vývoj, stádia buněčného cyklu). Hsps mají hlavní funkci jako molekulární chaperony, dokáží rozpoznat proteiny, které jsou v nestabilním, inaktivním stavu a interagovat s nimi. Molekulární chaperony jsou definovány jako rodina strukturně nepříbuzných celulárních proteinů, které se účastní translokace, skládání, uspořádání a degradace proteinů, a to zejména stabilizací částečně nesložených forem, avšak netvoří složky jejich finálních struktur. Chaperony se účastní skládání nově syntetizovaných proteinů a udržují proteiny v jejich funkční konformaci. Chaperony neobsahují informaci pro správné složení, ale spíše ochraňují proteiny před jejich agregací. Hsps jsou klasifikovány podle molekulové hmotnosti do pěti hlavních rodin : nízkomolekulární malé Hsp (sHsp), Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100. U eukaryot jsou jednotlivé rodiny dále rozlišovány na podrodiny a skupiny lišící se inducibilitou, intracelulární lokalizací a funkcí. Nízkomolekulární Hsps (sHsp) jsou ve srovnání s ostatními rodinami nejméně konzervované. Proteiny této rodiny se odlišují zejména ve své velikosti (15-30 kDa) a v aminokyselinovém složení. Hlavní funkcí sHsp je stabilizace a ochrana denaturovaných proteinů proti nepřirozeným agregacím. Pravděpodobným mechanismem jsou hydrofobní interakce, které způsobují velkou kapacitu sHsps pro vazbu na denaturované proteiny. sHsps nejsou schopny znovusložení denaturovaného proteinu, pouze usnadňují následné znovusložení pomocí ATP-dependentních chaperonů jako je např. DnaK systém. Syntéza sHsp u eukaryot i prokaryot probíhá v odpovědi na teplotní a jiný environmentální stres, u některých organismů dochází k produkci v určitých vývojových stádiích. Při odpovědi na stres dochází ke sjednocování 15-20 sHsp a tvoří se větší struktury, tzv. heat shock granule (HSG). Tyto struktury byly detekovány u rostlin i savců. Hsp60 proteiny/chaperoniny (57-60 kDa) se vyskytují v cytosolu bakterií (GroEL proteiny), u eukaryot v matrix mitochondrií a ve stromatu chloroplastů. Pod pojmem chaperonin rozumíme označení třídy molekulárních chaperonů, které jsou evolučně homologní s GroEL Escherichia coli. Chaperoniny jsou rozděleny do dvou podrodin : 1. podrodina – GroE
chaperoniny lokalizovány v bakteriích, mitochondriích a chloroplastech eukaryot, 2. podrodina – CCT chaperoniny lokalizovány u Archaea a v cytosolu eukaryot. Významná role chaperoninů byla popsána při tvorbě nově syntetizované nebo translokované nativní fromy proteinů. Dále byla prokázána účast při tvorbě konečné struktury enzymu RUBISCO (EC 4.1.1.39). CCT chaperoniny se podílí na skládání tubulinu a aktinu, u E. coli byl popsán vliv na zvýšení salinitní a osmotické tolerance. Hsp90 rodina (80-94 kDa) se podílí na správném skládání proteinů, má důležitou roli v signální transdukční síti, při kontrole buněčného cyklu a degradaci proteinů. Byla popsána interakce s 26S proteasomy, Hsp90 mají zásadní význam v jejich kompletování a údržbě. Hsp90 společně s Hsp70 působí jako multichaperonové systémy a kooperují s řadou kochaperonů jako je Hsp interagující protein (Hip) a Hsp70/Hsp90 organizující protein (Hop). Exprese rodiny Hsp90 je konstitutivní u většiny organismů a je zvyšována odpovědí na stres. Hsp90 mají důležitou roli v regulaci určitých transkripčních faktorů a proteinkinas, byla popsána interakce s kaseinkinasou II (EC 2.7.11.1), eIF-2α kinasou, se steroidními receptory, onkogenními tyrosinkinasami, kalmodulinem, aktinem a tubulinem. Analýza kaseinkinasy II provedená in vitro prokázala chaperonovou funkci Hsp90. Hsp100/Clp (100-114 kDa) je velká rodina chaperonů s vysoce konzervovanými proteiny s ATPasovou aktivitou. Výskyt byl popsán u prokaryot (Clp) i eukaryot. Proteiny Hsp100 rodiny byly poprvé popsány jako složky bakteriálního Clp proteasového systému, který je tvořen ATPasovou/chaperonovou jednotkou (ClpA a ClpX) a proteolytickou jednotkou ClpP. Hlavní funkcí Hsp100/Clp je disagregace a/nebo degradace proteinů. Proteinové agregáty jsou rozpuštěny a mohou být dále znovu správně poskládány za účasti Hsp70. Asociace Hsp100 s Clp vede k úplné degradaci vybraných proteinů nebo proteiny nejsou složeny a jsou uvolněny. Hsp70/DnaK (69-71 kDa) jsou považovány za jedny z nejvýznamnějších proteinů indukovaných teplotním stresem. Hsp70 proteiny mají dvě hlavní funkční domény. N-terminální doména (~40kDa) váže ATP a hydrolyzuje ho na ADP. C-terminální doména (~25 kDa) zodpovídá za vazbu substrátových proteinů a polypeptidů. Domény odděluje krátká spojující sekvence, která je náchylná na štěpení proteasou. Hsp70 mají významnou funkci v ochraně proteinů před agregací, podílí se na skládání proteinů a při tvorbě jejich nativní konformace. Dále se účastní proteinového importu, translokačních procesů a usnadňují proteolytickou degradaci tak, že nestabilní proteiny nasměrují do lysosomů nebo proteasomu. U řady proteinů z rodiny Hsp70 bylo popsáno zapojení v importu a translokaci proteinů do chloroplastů a mitochondrií. Metoda otisků (z angl. blotting) je analytická metoda, která umožňuje přenos molekul z mobilní fáze (např. agarózový nebo polyakrylamidový gel, ale také běžný roztok) do pevné fáze, na kterou jsou fixovány. Tuto pevnou fázi může představovat např. nitrocelulozová membrána. Přenos lze uskutečnit běžnou difúzí přiložením membrány na gel, což připomíná odsávání skvrn pomocí savého papíru a odtud také název blotting, pomocí jednosměrného proudu (electroblotting) nebo filtrací roztoku přes membránu (dot blotting) pomocí speciálních zařízení. Molekuly přenesené a fixované na pevné fázi se zviditelňují přímo po fixaci různými barevnými reakcemi, autoradiografií nebo reakcí se specifickými protilátkami (immunoblotting). Otiskové metody se používají především pro přenos molekul DNA, RNA, proteinů a glykoproteinů po jejich předcházející separaci elektroforézou nebo izoelektrickou fokusací na gelových nosičích. Na druhé straně nacházejí stále více uplatnění imunodotovací techniky (DIBA - dot immunobindig assay), kdy jsou na membránách imobilizovány čisté antigeny,
které pak mohou sloužit ke screeningovému průkazu protilátek v analyzovaných vzorcích. Tyto techniky našly uplatnění např. v diagnostice specifických IgE, autoprotilátek, infekční sérologii apod. Na membrány mohou však být navázány také specifické protilátky, které pak slouží naopak k průkazu antigenů v analyzovaných vzorcích. Výhodou těchto technik je jejich jednoduchost, dobrá reprodukovatelnost, malá spotřeba vzorku a poměrně vysoká citlivost. Např. dolní hranice stanovitelnosti imunoglobulinů pomocí těchto technik je 1-5 ng. Význam DIBA vzrůstá v poslední době také s rozvojem techniky biočipů, která umožňuje současnou detekci a semikvantifikaci desítek analytů v mikrolitrových objemech jednoho vzorku. Přenos fragmentů DNA z agarózového gelu na nitrocelulózovou membránu popsal poprvé roku 1975 E. M. Southern. Odtud dostala tato technika název Southern blot. V roce 1977 tuto metodu vylepšili použitím diazobenzylmethylovaného papíru J. C. Alvine a kol. Tato varianta, umožňující přenos RNA, dostala název Northern blot. Roku 1979 J. Renart a kol. a H. Towbin a kol. obě metody adaptovali na analýzu proteinů (immunoblotting). A v roce 1981 W. N. Burnette použil na detekci imobilizovaných antigenů specifické protilátky a radioaktivně značený protein A ve funkci druhého ligandu. Tato metoda dostala název Western blot, přestože jako předchozí varianty nemá se zeměpisnými stranami co do činění. Otiskové metody obecně zahrnují tyto kroky: 1. Zkoumaná směs antigenů se rozdělí pomocí jednorozměrné případně dvourozměrné elektroforézy na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu nebo se purifikované antigeny případně protilátky naředí na vhodnou koncentraci ve vhodném pufru. 2. Pomocí vhodné blotovací aparatury se přenesou antigeny z gelu na membránu (matrici). 3. Po imobilizaci antigenů se membrána inkubuje s blokujícím agens, čímž se vysytí (zablokují) nespecifická vazebná místa, aby v následných krocích nedocházelo k nespecifickým interakcím mezi detekční sondou a matricí. Detekčními sondami mohou být protilátky, specifické vazebné proteiny nebo jiné ligandy. 4. Posledním krokem je vizualizace použitím detekční sondy (např. autoradiograficky, barevnou reakcí, fluorescenčně apod.), která může mít také několik kroků. Membrány používané pro blotting jsou celulosová, nitrocelulosová, PVDF, celulosaacetátová, polyethansulfonová a nylonová. Unikátní vlastnosti mikroporézního povrchu membrány jsou : (a) vysoká vazebná kapacita (b) krátkodobé nebo dlouhodobé skladování imobilizovaných molekul (c) nedochází k interferencím při detekci (d) reprodukovatelnost detekce Pro přenos proteinů na membránu byla vypracována řada technik. V praxi se setkáme s metodou Western blotting, kdy jsou proteiny imobilizovány na membránu pomocí jednosměrného elektrického proudu následně po elektroforetické separaci v gelu.
Difuzní blottingu: Jedná se o prostou difuzi v tanku s přenosovým pufrem, která trvá cca 36-
48 hodin, což představuje velkou nevýhodu. Další nevýhodou je difuze do stran, která může způsobit zhoršení rozlišení vlastní elektroforetické separace.
Kapilární blottingu: V tomto uspořádání je blotovací membrána umístěna na povrchu gelu,
který leží na porézní podložce v nádobě s přenosovým pufrem. Na ní je pak vrstva vlhkého
filtračního papíru a řada vrstev suchých filtračních papírů. Celá jednotka je zatížena. Suchý papír nasává kapilárními silami pufr, vzorek je tak tažen z gelu na membránu. Trvá zhruba 12 hodin.
Vakuový blottingu: Obdobné uspořádání jako u kapilárního blottingu, místo kapilárních sil je vzorek tažen vakuem. Výhodou jsou ostřejší pásy (potlačení difuze) a doba trvání cca 30 min.
Elektroblotting: Jedná se o nejrychlejší a nejúčinnější metodu. Hnací silou je síla elektrického pole. Existují dva možné způsoby uspořádání : tankový (tank, wet) a polosuchý (semi-dry) blotting. Při tankové variantě se do speciální kazety skládá následující vrstva (sendvič) : porézní houbička, filtrační papír, gel, membrána, filtrační papír, porézní houbička. Poté se kazeta vloží do blotovací komůrky naplněné přenosovým pufrem. Přenos proteinů na membránu probíhá při konstantním proudu, jehož hodnota závisí na ploše membrány (0,8 mA·cm-2). Doba blotování je 2 hodiny. Při uspořádání semi-dry se používají plošné grafitové elektrody. Na tyto elektrody se naskládá několik vrstev filtračního papíru nasyceného blotovacím pufrem, gel, blotovací membrána, opět filtrační papíry a nahoru se položí druhá elektroda. Hlavními výhodami polosuchého blottingu v porovnání s tankovým jsou: 1. 2. 3. 4.
Homogenní elektrické pole Možnost vyššího napěťového gradientu Menší spotřeba přenosového pufru Možnost simultánního přenosu z několika gelů
Pro kontrolu přenosu proteinů na membránu se používají činidla Ponceau S, Amidočerň 10B a Fast Green, která lze buď jednoduše vymýt destilovanou vodou nebo se používá odbarvovací roztok. Pro blotovací metody je nutné dodržet několik zásad: 1. Pufry by neměly obsahovat více než 0,05% detergentu (detergenty inhibují vazbu proteinů na membránu). 2. Při volbě množství nanášeného vzorku je nutné nepřekročit vazebnou kapacitu membrány (pro PVDF membránu je max. vazebná kapacita pro antigen 170 μg·cm-2). 3. Velké částice nebo vysoká viskozita mohou způsobit zanesení membrány. Před aplikací takového vzorku je nutná centrifugace (nanášení pouze supernatantu), případně snížení viskozity zředěním vzorku vhodným pufrem. 4. PVDF membrána musí být před použitím správně ošetřena (na povrch membrány je nanesen methanol na 15 s, poté je membrána opatrně ponořena na 2 min do vody a 5 min do vhodného pufru). Proteiny fixované na membráně metodou Western blotting, případně „dot/slot blotting“ mohou být detekovány imunochemicky (immunoblotting). Podstatou všech imunochemických metod je interakce mezi antigenem a protilátkou in vitro. V imunochemii se setkáváme s pojmem polyklonální protilátky a monoklonální protilátky. Polyklonální protilátky můžeme stručně charakterizovat jako směs protilátek různé afinity a specifity, které jsou vytvořeny v organismu po vpravení cizorodého imunogenu. Nehomogennost takto připravených protilátek je způsobena jednak existencí řady determinantních míst na molekule antigenu
(proti každé determinantě se tvoří specifické Ig, které pak neinteragují s jinými determinantami) a jednak složitostí imunitního systému (na každou determinantu reaguje více mateřských buněk lymfocytů). Kromě toho má protilátková odpověď každého jedince do značné míry individuální charakter. Naproti tomu monoklonální protilátky představují chemické individuum. Všechny molekuly produkovaných Ig jsou naprosto identické, vykazují shodnou afinitu i specifitu při interakci s antigenem. Zatímco polyklonální protilátky se připravují poměrně jednoduchou procedurou imunizace zvířete (injekční vpravení antigenu, izolování krevního séra - antiséra, popřípadě imunoglobulinové frakce), zahrnuje příprava monoklonálních protilátek vedle imunizace i vysoce náročnou technologii přípravy a selekce tzv. hybridomů. Slezinné buňky imunizovaného zvířete (produkují protilátky) se in vitro fúzují s nádorovými buňkami (mají výjimečnou schopnost se dělit). Vyselektovaná hybridomová buňka (má vlastnosti obou mateřských buněk) je pak základem pro homogenní klon buněk použitelných k produkci homogenních protilátek. V případě polyklonálních protilátek se většinou nepracuje s izolovanými imunoglobuliny proti antigenu použitému k imunizaci, ale s celým krevním sérem (směs spousty imunoglobulinů a dalších bílkovin), popř. s IgG-frakcí (i v ní představují IgG reagující se zmíněným antigenem jen malou část ze všech přítomných IgG). Imunochemické metody využívají interakce antigenu se specifickými protilátkami in vitro za tvorby imunokomplexu antigen-protilátka. Imunochemická detekce proteinu na membráně se provádí pomocí série dvou protilátek. První protilátka reaguje imunochemicky s detekovaným proteinem za tvorby komplexu. Takto vytvořený komplex je rozpoznán druhou protilátkou značenou detekovatelnou sondou (např. vázaná alkalická fosfatasa, atom izotopu atd.). Klasický Western blot versus rychlá imunodetekce na přístroji SNAP id. Příprava vzorku
Elektroforéza
Přenos na membránu
Blokování membrány
Imunochemické reakce
Detekce
45 min – 2 h
0,5 – 1 h
1 – 2,5 h
1 h
3 h
15 min
SNAP i.d. System 30 min Výhody oproti klasické metodě Western blot • Rychlost • Kompatibilita se standardními pufry a blokovacími roztoky • Zpracování až šesti membrán zároveň • Možnost recyklace protilátek • Nízká interference signálu pozadí Nevýhody • Nutná optimalizace podmínek před zahájením vlastního experimentu • Nižší citlivost – nutno použít koncentrovanější roztoky protilátek • Cena příslušenství
Materiál a chemikálie 1. Rostlinný materiál : 3 genotypy Solanum spp. 2. Standard Hsp70 z hovězího mozku
příprava: k 10 μl zamraženého Hsp70 přidat 190 μl R roztoku (výsledná koncentrace 0,2 μg/μl), nechat inkubovat 5 min při 100°C a do jamky aplikovat 5 μl (1 μg).
3. Roztoky pro přípravu gelů
akrylamid-N,N´-methylenbisakrylamid: 30 % (w/v) akrylamidu, 0,8 % bisakrylamidu (w/v) ve vodě -
pufr do zaostřovacího gelu (stacking gel buffer): 0,5 M Tris/HCl, pH 6,8
-
pufr do dělícího gelu (running gel buffer): 1,5 M Tris/HCl, pH 8,8
-
N,N´-tetrametylendiamin (TEMED)
-
10 % (w/v) persíran amonný (APS) ((NH4)2S2O8 )
-
10% (w/v) SDS
-
vodou nasycený n-butanol
4. Elektrodový pufr: 0,025 mol.L-1 Tris, 0,192 mol.L-1 glycin, 0,1% (w/v) SDS, pH 8,3 5. Pufr na přípravu vzorků: 0,125 M Tris/HCl, 4% (w/v) SDS, 20% v/v glycerol, 5% merkaptoethanol, 0,02% (w/v) bromfenolová modř, pH 6,8) 6. Barvící roztok s Ponceau S: 0,2% (w/v) Ponceau S v 10% (v/v) kys. octové 7. Blotovací pufr: 0,025 mol.L-1 Tris, 0,192 mol.L-1 glycin, 20% (v/v) methanol, pH 8,3
příprava: 3,025g Tris a 14,41 g glycinu, rozpustíme v 200 ml vody, přidáme 200 ml methanolu, zkontrolujeme pH a doplníme vodou do 1 l, uchovávat při 4°C.
8. Pracovní pufr pro imunodetekci TBS: 20 mM Tris , 500 mM NaCl, pH 7,5
příprava: 4,84 g Tris, 58,44 g NaCl rozpustit v 1 l, upravit pH na 7,5 a doplnit do 2 l vodou
9. Tween-20 TBS (TTBS)
příprava: 0,15 ml Tween-20 do 300 ml TBS
10. 0,5% nízkotučné mléko v Tween-20 TBS (TTBS)
příprava: 0,5 g sušeného nízkotučného mléka do 100 ml TTBS
11. Barvící roztok s NBT-BCIP
příprava: 75 μl komerčního roztoku NBT-BCIP smíchat s 5 ml barvícího pufru 12. Primární protilátka: monoklonální myší protilátka anti-Hsp70 (ředění 1:500) 13. Sekundární anti-myší protilátka značená alkalickou fosfatasou (ředění 1:500) příprava: 3 l sek. Ab do 1,5 ml 0,5% nízkotučného mléka v TTBS 14. Sekundární anti-myší protilátka značená peroxidasou (ředění 1:1000) příprava: 1,5 l sek. Ab do 1,5 ml 0,5% nízkotučného mléka v TTBS
14. Luminol
příprava : roztok A smíchat s roztokem B v poměru 1:1, 0,5 ml roztoku A + 0,5 ml roztoku B
15. Barvící pufr (staining buffer) : 0,1M Tris, 0,1 M NaCl, 0,005 M MgCl2, pH 9,5
16. Kádinky, teflonová míchadla, automatické pipety, ependorfky, ledová lázeň, mikrocentrifuga, vyhřívací box do 100°C, Hamiltonova pipeta (50 μL), nalévací stojánek,
elektroforetická komůrka, skla pro elektroforézu, mezerníky (spacery), hřebínek, střička s destilovanou vodou, střička s lihem, třepačka, zdroj pro elektroforézu, blotovací aparatura, misky na barvení, nůžky, misky pro imunodetekci. UPOZORNĚNÍ Akrylamid a N,N´- methylenbisakrylamid jsou neurotoxické látky. S jejich roztokem vždy pracujeme s největší opatrností a v gumových rukavicích. Postup 1. Příprava listových disků Připravíme si šest Petriho misek, na jejichž dno dáme 3 vrstvy buničiny a 1 kolečko filtračního papíru. Do každé Petriho misky napipetujeme 7,5 ml destilované vody. Ze 4. pravých listů rostlin vyřízneme korkovrtem disky o průměru 12 mm a do Petriho misky vložíme 16 listových disků. Tři Petriho misky budou sloužit jako kontrola, další tři Petriho misky dáme do inkubátoru vyhřátého na 40 °C a inkubujeme po dobu 2 h. Poté umístíme misky do fytotronu (20/18 °C s 12-ti hodinovou fotoperiodou) a další den provedeme odběr vzorků pro extrakci. 2. Příprava rostlinných extraktů Extrakce bude provedena v poměru 1:2 (w:v) v „R“ roztoku. Všechny listové disky v Petriho miskách postupně zvážíme. Zapíšeme si jejich hmotnost a vypočítáme si potřebný objem R roztoku pro extrakci. Poté provedeme homogenizaci v třecí misce na ledové lázni s přídavkem mořského písku a příslušného objemu R roztoku. Extrakt centrifugujeme po dobu 10 minut při 16000 g a teplotě 4 °C. Odebereme supernatant do předem připravených a popsaných eppendorfek. Vzorky inkubujeme 5 minut v termobloku při 100 °C. Do jamek aplikujeme vždy 18 μl vzorku. 3. SDS-PAGE elektroforéza Malá (bez zářezu) i velká sklíčka (se zářezem) důkladně odmastíme lihem. Připravíme skla k nalévání gelu : na rovné podložce přiložíme malé sklíčko na zářezovou stranu velkého sklíčka,tak, aby mezi nimi vznikl prostor pro gel a umístíme do stojánku pro nalévání gelu. Je třeba zkontrolovat, zda gumové podložky ve stojánku dobře těsní (hrozí vytečení gelu). Mezi skla vložíme hřebínek a na sklo si fixou označíme vzdálenost 1 cm od konce zubů hřebínku. Poté hřebínek odstraníme. Přichystáme si dvě označené kádinky na přípravu zaostřovacího a dělícího gelu. Podle následující tabulky napipetujeme jednotlivé roztoky (složky gelu) do příslušných kádinek. Rozpis je uveden pro 2 gely a 0,75 mm skla.
Tabulka : Složení dělícího a zaostřovacího gelu. Objemy jsou uvedeny v ml. Typ gelu
Dělící 7% Zaostřovací 4%
AA/BIS 30%/0,8%
Tris HCl 1,5 mol·l-
Tris HCl 0,5 mol·l-
H2O
SDS
TEMED
Start 10% APS
2,3 0,65
2,5 -
1,25
5,1 3,05
0,1 0,05
0,01 0,01
0,1 0,1
1
1
Polymerace gelu je vždy zahájena přídavkem roztoku persíranu amonného. Připravený dělící gel po promíchání (cca 5-10 s) rychle přeneseme pomocí Pasteurovy pipety do prostoru mezi skla. V roztoku mezi skly se nesmí objevit vzduchové bubliny. Gel naléváme až po značku na skle (1 cm pod hřebínek). Gel opatrně převrstvíme n-butanolem. Po 15-30 minutách polymerace při laboratorní teplotě odstraníme n-butanol pomocí filtračního papíru (nedotýkat se povrchu připraveného gelu) a povrch gelu propláchneme destilovanou vodou a opět vysušíme pomocí filtračního papíru. Po nastartování polymerizace přídavkem roztoku APS do kádinky, obsahující komponenty pro zaostřovací gel, přeneseme připravenou směs pomocí Pasteurovy pipety do prostoru mezi skla na již zpolymerovaný dělící gel až po okraj skla. Mezi skla vložíme hřebínek pro vytvoření požadovaného množství jamek. Pod zuby hřebínku se nesmí dostat vzduchové bubliny. Pokud se tak stane, rychle hřebínek vyjmeme a znovu vsuneme. Pozor, roztok se stává silně viskózní během několika minut. Poté necháme gel polymerovat 30 minut. Skla s připraveným gelem vložíme do elektroforetické komůrky. Fixou si označíme zuby hřebínku. Nalijeme připravený elektrodový pufr – nejprve do prostoru mezi skly a poté do zbývajícího prostoru okolo. Pod elektrodovým pufrem opatrně vyjmeme hřebínek a pomocí Pasteurovy pipety jamky důkladně proplácheneme. Do jamek aplikujeme připravené vzorky (18 μl) a standard (5 μl) dle uvedeného schématu. Pozor, vzorky neaplikujeme do krajních jamek, dochází zde k deformacím drah seprovaných proteinů. Elektroforetickou komůrku uzavřeme víkem, vložíme do chladničky a připojíme ke zdroji. Je nutné dbát na správnou orientaci víka a elektrod. Dělení probíhá při konstantním napětí. Na zdroji nastavíme 120 V. Jakmile zóna bromfenolové modři doputuje na rozhraní zaostřovacího a dělícího gelu (cca 10 min), nastavíme zdroj na 180 V. Po doputování zóny bromfenolové modři (čelo dělících se látek) téměř na úroveň dolního okraje skla vypneme zdroj napětí. Odstraníme víko a vylijeme pufr. Pomocí plastové špachtle oddělíme od gelu skla, oddělíme a vyhodíme zaostřovací gel. Odkrojíme levý dolní roh gelu (pro orientaci ve vzorcích při vyhodnocování gelu).
Schéma : Aplikace vzorků do jamek. Standard Hsp 70
Kontrola
S. lycopersicum cv. Amateur
Teplotní stres
S. lycopersicum
Kontrola
S. chmielewskii
cv. Amateur
5 μl
18 μl
18 μl
18 μl
Teplotní stres
Kontrola
18 μl
18 μl
S. chmielewskii
S. habrochaites
Teplotní stres
S. habrochaites
18 μl
4. Tank blotting Připravíme si blotovací membránu (nitrocelulosová), 2 ks silných filtračních papírů stejné velikosti jako jsou rozměry gelu (8,4 x 4,2 cm). Pozor, nedotýkat se membrány bez rukavic. Membránu, gel, filtrační papíry a porézní houbičky ponoříme na 5 minut do blotovacího pufru. Do blotovací kazety skládáme směrem od černé desky kazety k průsvitné straně kazety následovně jednotlivé vrstvy : Porézní houbička - filtrační papír - gel - membrána - filtrační papír* - porézní houbička * je nutné odstranit vzduchové bubliny mezi gelem a membránou pomocí skleněné tyčinky
Kazetu uzavřeme a vložíme do blotovací komůrky. Černá strana kazety směřuje vždy k černé straně blotovací komůrky (katoda (-)). Blotovací komůrku naplníme blotovacím pufrem, uzavřeme víkem (nutno dbát na správnou orientaci elektrod) a vložíme do chladničky (nutné chlazení). Před připojením ke zdroji je nutné vypočítat na základě velikosti membrány proud, který se na zdroji nastaví dle následujícího vzorce : Plocha gelu x počet gelů x 0,8 mA·cm-2 Po 2 hodinách ukončíme blotování. Blotovací pufr slijeme zpět do zásobní lahve a vyjmeme blotovací kazetu. Pro ověření přenosu proteinů na membránu použijeme činidlo Ponceau S. Do misky vložíme membránu a přidáme 5 ml činidla Ponceau S. Po 5 min inkubaci se na membráně vizualizují přenesené proteiny. Činidlo poté vymyjeme destilovanou vodou. 5. Rychlá imunodetekce na přístroji SNAP id. SNAP id. položíme na rovnou plochu pracovního stolu. Připojíme hadici přívodu vakua k zadní části přístroje s použitím plastové spojovací trubičky, která se zaklapne do otvoru v zadní části. Připojíme druhý konec hadice ke zdroji vakua, použijeme 1 l odsávací láhev a filtr pro ochranu zdroje vakua před kapalinami a kontaminací. Při zapojování dbáme na dostatek prostoru pro hadice, aby nedošlo k jejich ohýbání případně zaškrcení. Před zahájením skládání držáku blotu pro dvě membrány si předem připravíme protilátky, blokovací roztok a promývací roztok. Otevřeme víko držáku blotu, nedotýkáme se bílého vniřního povrchu. Navlhčíme bílý vnitřní povrch držáku deionizovanou vodou, až změní barvu na šedou. Přebytečnou vodu odstraníme blotovacím válečkem pro zamezení posunů blotovací membrány v držáku. Vložíme navlhčenou membránu na střed komůrky držáku stranou s proteiny směrem dolů. Jemným přejetím válečkem odstraníme veškeré vzduchové bubliny mezi blotovací membránou a povrchem komůrky držáku. Na membránu položíme spacer (není třeba vlhčit) tak, aby kompletně pokrýval celou blokovací membránu a znovu jemným pohybem přejedeme válečkem pro zajištění dokonalého kontaktu spaceru a membrány. Pokud spacer nepokrývá celou plochu blokovací membrány, po vyvolání membrány mohou být pozorovány tmavé čáry v místech polohy okraje spaceru na membráně. Uzavřeme víko držáku blotu a pevně držák zespodu zmáčkneme pro dokonalé uzavření držáku. Otevřeme víko přístroje a vložíme držák do komory přístroje komůrkou směrem vzhůru tak, aby držák zapadl v těle přístroje. Zavřeme víko přístroje. Do každé komůrky držáku blotu pro dvě membrány nalijeme vždy 15 ml 0,5% roztoku nízkotučného mléka v roztoku Tween-20 v TBS (TTBS) a ihned zapneme přívod vakua otočením přepínače vakua příslušného držáku. (každý přepínač reguluje nezávisle vakuum pro příslušný držák). Při použití systému SNAP id. není nutná inkubace s blokovacím roztokem. Po úplném vyprázdnění komůrky držáku (10-20 sekund) vypneme zdroj vakua otočením přepínače. Do každé komůrky aplikujeme 1,5 ml primární monoklonální myší anti-Hsp70 protilátky ředěné 1:500 v 0,5% mléku s TTBS. Roztok protilátky musí rovnoměrně pokrýt celý povrch komůrky! Se zdrojem vakua stále odpojeným provedeme inkubaci s primární protilátkou 10 minut při laboratorní teplotě. Roztok bude absorbován do povrchu držáku blotu a povrch se může jevit zdánlivě jako suchý. Dobu inkubace je možno prodloužit, ale může to vést ke zvýšení signálu pozadí. Po uplynutí 10 min zapojíme zdroj vakua a vyčkáme 10-20 sekund pro dokonalé odstranění roztoku protilátky z komůrky držáku. Se zdrojem vakua stále připojeným, promyjeme každou komůrku 15 ml promývacího roztoku Tween-20 v TBS. Pro optimální promytí opakujeme nejméně třikrát. Každý promývací
krok by měl trvat nejméně 20 s. Po posledním promývání a úplném odsátí promývací roztoku odpojíme zdroj vakua. Do jedné komůrky aplikujeme 1,5 ml roztoku sekundární anti-myší protilátky značené alkalickou fosfatasou ředěné 1:500 v 0,5% mléku s TTBS, do druhé komůrky aplikujeme 1,5 ml sekundární anti-myší protilátky značené peroxidasou ředěné 1:1000 v 0,5% mléku s TTBS. Roztok protilátky musí rovnoměrně pokrýt celý povrch komůrky! Se zdrojem vakua stále odpojeným, inkubujeme s primární protilátkou 10 min při laboratorní teplotě. Roztok bude absorbován do povrchu držáku blotu a povrch se může jevit zdánlivě jako suchý. Dobu inkubace je možno prodloužit, ale může to vést ke zvýšení signálu pozadí. Po uplynutí 10 min zapojíme zdroj vakua a počkáme 10-20 s pro dokonalé odstranění roztoku protilátky z komůrky držáku. Je nutné si poznačit, která membrána byla inkubována s kterou sekundární protilátkou kvůli následné detekci! Se zdrojem vakua stále připojeným, promyjeme každou komůrku 15 ml promývacího roztoku TTBS. Pro optimální promytí opakujeme nejméně třikrát. Každý promývací krok by měl trvat nejméně 20 s. Po posledním promývání a úplném odsátí promývací roztoku odpojíme zdroj vakua. Vyjmeme držák blotu z přístroje, položíme na pracovní plochu komůrkou dolů a otevřeme víko držáku. Pinzetou opatrně odstraníme spacer. Vyjmeme membránu a pokračujeme v postupu vizualizace proteinů zvolenou metodou. Držák blotu recyklujeme do odpadu pro plasty a vyčistíme přístroj propláchnutím deionizovanou vodou. Pro detekci barevného produktu použijeme chromogenní substrát NBT-BCIP (nitrotetrazoliová modř ve spojení s 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-fosfátem) pro sekundární protilátku značenou alkalickou fosfatasou. Připravíme si 5 ml barvícího roztoku : 75 μl komerčního roztoku NBT-BCIP smícháme s 5 ml barvícího pufru. Inkubujeme maximálně 10 minut do vyvinutí tmavě fialového zbarvení. Membránu vyfotíme a vyhodnotíme v dokumentačním systému Biospectrum 410 vybaveným citlivou chlazenou CCD kamerou a napojeným na počítač s programem VisionWorks pro sběr a analýzu získaných obrazových dat. Pro chemiluminiscenční detekci přeneseme membránu na skleněnou desku a připravíme si roztok komerčního luminolu smícháním 0,5 ml roztoku A s 0,5 ml roztoku B. Pozor, pro každý roztok použijeme čistou špičku, aby nedošlo ke kontaminaci a možnému znehodnocení roztoku. Připraveným roztokem lehce převrstvíme membránu a inkubujeme 5 minut ve tmě v komoře dokumentačního zařízení. Mezitím vedoucí cvičení vysvětlí nastavení jednotlivých parametrů programu VisionWorks pro mód Western blot. Po ukončení inkubace odsajeme nadbytečný roztok luminolu. Spustíme expozici po dobu 1 min, poté membránu vyfotíme a vyhodnotíme. Vyhodnocení 1. Membránu s detekovanými proteiny vyfotíme v dokumentačním systému Biospectrum 410. 2. Sestrojíme graf závislosti intenzity signálu na typu vzorku. 3. Porovnáme použité metody detekce z hlediska citlivosti, reprodukovatelnosti experimentu apod. 4. Na základě doporučené literatury se pokusíme zdůvodnit, proč se jednotlivé genotypy Solanum spp. lišily v zastoupení Hsp70 po vystavení teplotnímu stresu. Literatura B. T. Kurien & R. H. Scofield (2009) Protein blotting and detection, Methods in Molecular Biology 536.
