Prosiding Seminar Hasil Penelitian LPPM UMP 2014 ISBN 978-602-14930-2-1 Purwokerto, 6 September 2014
Uji Proliverasi dan Uji Apotoksis Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst sebagai Antikanker Serviks Ikhsan Mujahid1, Bunyamin Muchtasjar2 Program Studi Keperawatan S1, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Purwokerto. Kampus II Jl. Letjen Soepardjo Roestam Km 7, PO Box 229 Purwokerto 53181 Telp. (0281) 6844253, 6844252 ext 117 Email:
[email protected] ABSTRAK Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst dikenal sebagai penyakit pada pohon juga sebagai obat bagi kesehatan atau medicinal mushroom.G. lucidum menarik perhatian banyak peneliti karena senyawa yang dikandungnya memiliki aktivitas antikanker. Tujuan penelitian untuk mengkaji antiproliferasi dan induksi apoptosis dari tiga jenis ekstrak miselium G. lucidum serta membandingkan pengaruh antiproliferasi dan induksi apoptosis dari ketiga jenis ekstrak tersebut terhadap kanker serviks secara in vitro. Penelitian dilakukan secara eksperimental, dengan perlakuan ekstrak etanol, etil asetat dan n-heksan miselium GL2 dengan konsentrasi masing-masing ekstrak uji 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, dan 62,5 µg/ml, serta kontrol. Pengesktraksian miselium GL2 dengan metode maserasi. Aktivitas antikanker dilakukan dengan uji antiproliferasi dan induksi apoptosis sel HeLa. Hasil penelitian menunjukan bahwa ekstrak etanol, etil asetat dan nheksan miselium GL2 memiliki potensi sebagai antikanker serviks diperlihatkan dengan sifat sitotoksiknya terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 di bawah 1000 µg/ml. Nilai IC50 ekstrak etanol 158,202 µg/ml, ekstrak etil asetat 114,270 µg/ml dan n-heksan 77,987 µg/ml. Berdasarkan uji doubling time ketiga ekstrak mampu menghambat proliferasi sel HeLa dan mampu menyebabkan apoptosis sel HeLa. Terdapat perbedaan kesitotoksikan dari ketiga ekstrak miselium GL2, paling kuat kesitotoksikannya adalah ekstrak n-heksan. Tidak terdapat perbedaan waktu doubling time atau waktu pembelahan sel HeLa dari ketiga ekstrak pada konsentrasi di bawah 200 µg/ml dan mampu menghambat pembelahan sel kanker serviks melalui mekanisme apoptosis. Kata Kunci : G. lucidum, antikanker, serviks PENDAHULUAN Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst adalah jamur dari genus Ganoderma yang termasuk ordo Aphyllophorales. G. luidum kelas Basidiomycets. G. lucidum memiliki pori di bawah tubuh buah, bereproduksi dengan spora, tumbuh dari jaringan miselium, mendegradasi kayu dalam waktu yang lama, kemudian membentuk tubuh buah. G. lucidum tumbuh pada kondisi lingkungan yang cukup panas dan lembap terutama pada daerah sub tropik dan tropik, dikenal sebagai penyakit pada pohon juga sebagai obat (medicinal mushroom). Jamur G. lucidum, memiliki berbagai senyawa bioaktif. Senyawa bioaktif tersebut memiliki potensi sebagai penurun tekanan darah, penurun kadar kolesterol dalam darah, inhibitor penggumpalan platetat, protein imunomodulator, pencegah pelepasan histamin, anti HIV, antitumor dan antikanker (Dunham, 2000; Parjimo dan Soenanto, 2008). Senyawa bioaktif antikanker menghambat radikal bebas yang menyebabkan kanker. Kanker dinamai sesuai organ dan jenis tempat pertama berkembang seperti kanker serviks yang menyerang serviks ( Kelvin dan Tyson, 2011). Kanker serviks merupakan penyakit kanker yang terjadi pada daerah leher rahim atau yang berasal dan tumbuh pada serviks. Kanker ini 99,7% disebabkan oleh human papilloma virus (HPV). Kanker serviks menjadi masalah kesehatan di Indonesia. Penanganan kanker serviks umumnya didasarkan atas upaya pengangkatan jaringan atau dengan mematikan sel kanker tersebut serta meminimalkan efek samping terhadap sel normal. Umumnya kerja obat kurang spesifik, sehingga dapat menyebabkan efek samping pada sel yang sehat. Antikanker bekerja terhadap sel yang aktif sehingga efek sampingnya terutama mengenai jaringan dengan proliferasi tinggi.
58
Prosiding Seminar Hasil Penelitian LPPM UMP 2014 ISBN 978-602-14930-2-1 Purwokerto, 6 September 2014 Medicinal mushroom memiliki potensi sebagai regulator negatif onkogen dan regulator positif gen tumor suppressor, sehingga berpotensi sebagai antikanker seperti jamur G. lucidum. Jamur G. lucidum paling efektif menyebabkan sitotoksik dan antiproliferatif terhadap sel kanker serviks (Choong et al., 2008) Penelitian bertujuan untuk mengkaji potensi ekstrak miselium GL2 sebagai antikanker servik dari berbagai pelarut sifat sitotoksik, antiprolifertif dan induksi apoptosis pada sel sel kanker serviks secara in vitro dan membedakan pengaruh ekstrak etil asetat, etanol dan n-heksan miselium GL2 terhadap sel kanker serviks melaui uji sitotoksik, antiproliferatif dan induksi apoptosis in vitro. METODE PENELITIAN Bahan yang digunakan meliputi : miselium G. lucidum, kultur sel kanker serviks (HeLa), medium PDA, medium GMC, akuades steril, medium RPMI, Natrium bikarbonat, hepes, FBS 10% (v/v), penisilin-streptomisin 1% (v/v), fungison 0,5% (v/v), etanol 96% (v/v), etanol 76%, SDS, DMSO, akridin oranye, etidium bromida, 10% dalam HCl, MTT 5 mg/ml dalam FBS, metanol, kloroform, n-heksana, nitrogen, HCl. Penelitian menggunakan metode eksperimental. Perlakuan yang dicobakan yaitu ekstrak etanol, etil asetat dan n-heksana miselium GL2 dengan konsentrasi masing-masing ekstrak uji yaitu 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, dan 62,5 µg/ml. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Uji Antiproliferasi Uji antiproliferasi merupakan uji lanjutan dari uji sitotoksik terhadap sampel yang berpotensi sebagai antikanker atau memiliki harga IC50 kurang dari 1000 µg/ml. 1. Uji Antiproliferasi Ekstrak Etanol Hasil uji antiproliferasi ekstrak etanol miselium GL2 pada konsentrasi 200 µg/ml menunjukkan grafik linier negatif waktu inkubasi dari jam ke-0 sampai jam ke-72. Hal ini menunjukkan pada konsentrasi tersebut mampu menekan pertumbuhan sel HeLa. Adapun grafik linier positif waktu inkubasi dari jam ke-0 sampai jam ke-72 ditunjukkan oleh konsentrasi di bawah 100 µg/ml termasuk kontrol. Pada konsentrasi tersebut sel HeLa mampu melakukan proliferasi sel HeLa. Konsentrasi ekstrak etanol di bawah 200 µg/ml kurang mampu menghambat pertumbuhan sel HeLa. y = 0.0062x + 0.2066 R² = 0.9806
0.8 0.7
y = 0.0062x + 0.2416 R² = 0.992
Absorbansi
0.6 0.5
y = 0.0065x + 0.226 R² = 0.9834
0.4
0.3
y = 0.0057x + 0.2272 R² = 0.9584
0.2 0.1
y = -0.0018x + 0.2047 R² = 0.9132
0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
Waktu (jam) 0
30
50
100
200
Gambar 1. Hubungan waktu inkubasi dengan pembelahan sel HeLa (ekstrak etanol)
Pembelahan sel pada konsentrasi 30 µg/ml lebih cepat daripada pembelahan sel pada konsentrasi 100 µg/ml. Namun pada konsentrasi 50 µg/ml menunjukan profil yang tidak sama dengan kontrol. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak etanol semakin besar kemampuan penghambatan terhadap
59
Prosiding Seminar Hasil Penelitian LPPM UMP 2014 ISBN 978-602-14930-2-1 Purwokerto, 6 September 2014 pembelahan sel. Waktu pembelahan sel atau doubling time bertambah lama dengan adanya peningkatan perlakuan konsentrasi ekstrak etanol miselium GL2. Pembelahan sel HeLa tertekan pada konsentrasi 200 µg/ml, pada konsentrasi tersebut ekstrak etanol memiliki kemampuan penghambatan terhadap pembelahan sel. 2 Uji Antiproliferasi Ekstrak Etil Asetat Hasil uji antiproliferasi ekstrak etil asetat miselium GL2 dengan konsentrasi 0 µg/ml (kontrol), 30 µg/ml (seperempat IC50), 50 µg/ml(setengah IC50), 100 µg/ml (satu IC50), dan 200 µg/ml (dua IC50) disajikan pada Gambar 2. y = 0.0075x + 0.1909 R² = 0.9512
0.9 0.8
y = 0.0055x + 0.2367 R² = 0.9619
0.7 Absorbansi
0.6
y = 0.0057x + 0.231 R² = 0.9694
0.5 0.4
y = 0.0059x + 0.2072 R² = 0.9826
0.3 0.2
y = -0.0014x + 0.2297 R² = 0.4596
0.1 0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
Waktu (jam) 0
30
50
100
200
Gambar 2. Hubungan waktu inkubasi dengan pembelahan sel HeLa (etil asetat)
Grafik linier positif waktu inkubasi dari jam 0 -72, sel HeLa mampu melakukan proliferasi sel. Konsentrasi ekstrak etil asetat di bawah 200 µg/ml kurang mampu menghambat pertumbuhan sel HeLa. Pemberian ekstrak etil asetat pada konsentrasi 200 µg/ml mampu menekan pertumbuhan sel HeLa. Waktu Doubling time sel pada konsentrasi 30 µg/ml lebih lambat daripada pembelahan sel pada konsentrasi 50 µg/ml, 100 µg/ml dan kontrol. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak etil asetat maka semakin besar kemampuan penghambatan terhadap pembelahan sel. 3. Uji Antiproliferasi Ekstrak n-heksan Hasil uji antiproliferasi ekstrak n-heksan miselium GL2 disajikan pada Gambar 3 berikut ini. Pembelahan sel pada konsentrasi 30 µg/ml lebih cepat dari pada pembelahan sel pada konsentrasi 100 µg/ml. Hal ini berarti semakin tinggi konsentrasi ekstrak n-heksan semakin besar kemampuan penghambatan terhadap pembelahan sel. Waktu pembelahan sel atau doubling time bertambah lama dengan adanya peningkatan perlakuan konsentrasi ekstrak n-heksan miselium GL2. Pembelahan sel HeLa terhambat pada konsentrasi 200 µg/ml, pada konsentrasi tersebut ekstrak nheksan memiliki kemampuan penghambatan terhadap pembelahan sel.
60
Prosiding Seminar Hasil Penelitian LPPM UMP 2014 ISBN 978-602-14930-2-1 Purwokerto, 6 September 2014
0.9
y = 0.0075x + 0.1909 R² = 0.9512
0.8
y = 0.0049x + 0.2712 R² = 0.5975
0.7 Absorbansi
0.6
y = 0.0052x + 0.263 R² = 0.6758
0.5 0.4
y = 0.0029x + 0.2552 R² = 0.5846
0.3
y = -0.0007x + 0.2158 R² = 0.3216
0.2 0.1 0 0
10
20
0
30
30
50
40 50 Waktu (jam) 100
60
70
80
200
Gambar 3. Hubungan waktu inkubasi terhadap pembelahan sel kanker HeLa (n-heksan) B. Uji Apoptosis Hasil penelitian menunjukan bahwa ekstrak uji baik ekstrak etanol, etil asetat maupun n-heksan miselium GL2 mampu menyebabkan apoptosis terhadap sel HeLa. Hasil pengecatan DNA sel HeLa sesuai dengan hasil uji doubling time perlakuan ektrak etanol, etil asetat dan n-heksan yang masingmasing menujukan slope pertumbuhan negatif mulai dari konsentrasi 200 µg/ml. Pada proses pembelahan sel atau proliferasi sel, checkpoints terlibat dalam replikasi sel, yaitu suatu cara sel normal dapat memastikan sintesis DNA terinisiasi apabila berada pada kondisi yang tidak diinginkan. Kehilangan kontrol checkpoints akan berdampak adanya variasi abnormal pada gen terutama yang terjadi pada sel kanker. Apoptosis dapat diamati pada penampakan morfolgis berupa pengerutan sel, kerusakan membran plasma, kondensasi kromatin dan fragmentasi DNA. Sel yang mati dengan proses ini tidak kehilangan kandungan internal sel dan tidak menimbulkan respon inflamasi, sel yang rusak dapat terus menerus membelah tanpa terbatas, pada akhirnya menjadi kanker. KESIMPULAN Hasil penelitian menunjukan bahwa ekstrak etanol, etil asetat dan n-heksan miselium GL2 memiliki potensi sebagai antikanker serviks diperlihatkan dengan sifat sitotoksiknya terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 di bawah 1000 µg/ml. Nilai IC50 ekstrak etanol 158,202 µg/ml, ekstrak etil asetat 114,270 µg/ml dan n-heksan 77,987 µg/ml. Berdasarkan uji doubling time ketiga ekstrak mampu menghambat proliferasi sel HeLa dan mampu menyebabkan apoptosis sel HeLa. Terdapat perbedaan kesitotoksikan dari ketiga ekstrak miselium GL2, paling kuat kesitotoksikannya adalah ekstrak n-heksan. Tidak terdapat perbedaan waktu doubling time atau waktu pembelahan sel HeLa dari ketiga ekstrak pada konsentrasi di bawah 200 µg/ml dan mampu menghambat pembelahan sel kanker serviks melalui mekanisme apoptosis. DAFTAR PUSTAKA Choong, Y.K., Noordin, M.M., Mohamed, S., Ali, A.,M.,Umar, NAB dan Tong, C.C. 2008. The Nature of Apoptosis of Human Breast Cancer Cells Induced by Three Species of Genus Ganoderma P. Karst. (Aphyllophoromycetideae) Crude Extracts.International Journal for Medicinal Mushrooms. 10. P : 115 DeFillippis, R.A., Goodwin, E.C., Wu, L., DiMaio, D., 2003, Endogenous Human Papillomavirus E6 and E7 Proteins Differentially Regulate Proliferation, Senescence, and Apoptosis in Hela Cervical Carcinoma Cells. Journal of Virology.(2) : 1551-1563.
61
Prosiding Seminar Hasil Penelitian LPPM UMP 2014 ISBN 978-602-14930-2-1 Purwokerto, 6 September 2014 Gao, Y dan Zaou, S. 2002. The Imunomodulating Effects of Ganoderma lucidum(Curtis) P. Karst(G. lucidum, Reishi Mushrooms (Aphyllophoromycetidae). International Journal for Medicinal Mushrooms. 4: 11 Kelvin, J.F dan Tyson, L.B. 2011. Tanya Jawab Mengenai Gejala Kanker dan Efek Samping Pengobatan Kanker. Ed. Kedua. PT Indeks, Jakarta Nurlaelah, I. 2012. Potensi Antibakteri dan Antikanker Ganoderma lucidum (Fr.) Karst Isolat Asal Cianjur Jawa Barat. Tesis. Universitas Jenderal Soedirman. Purwokerto. Ratnaningtyas, N.I., Endang, S. P dan Sucianto, E. T. 2010. Pengembangan Potensi Ganoderma lucidum Isolat Indegenous sebagai antikanker Rahim. Laporan Penelitian. Unversitaas Jenderal Soedirman. Purwokerto
62
