i
TRANSFORMASI GENETIKA PADI DENGAN PERANTARA RHIZOBIUM DAN AGROBACTERIUM DAN ANALISIS PERANAN GEN OsHox6
SYAMSIDAH RAHMAWATI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Transformasi Genetika Padi dengan Perantara Rhizobium dan Agrobacterium dan Analisis Peranan Gen OsHox6 adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun.
Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Januari 2012 Syamsidah Rahmawati G361060111
ABSTRACT SYAMSIDAH RAHMAWATI. Genetic Transformation of Rice using Rhizobium and Agrobacterium and Functional Analysis of OsHox6 Gene. Under direction of SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, and INEZ HORTENSE SLAMET-LOEDIN Rice (Oryza sativa) is not only the most important crop in the world, but also a model plant for functional genomic studies. Genetic transformation is a routine technique for transferring important traits into plants including rice genome and for gene function analysis. Agrobacterium transformation technique is the most commonly used for genetic transformation of plants. However, the complexity of patents landscape surrounds this technology restricts its use for agricultural development in developing countries. In this study, the effectiveness of Rhizobium transformation techniques were evaluated in three rice cultivars Ciherang, Nipponbare, and Rojolele, and compared to Agrobacterium. Six-day old callus induced from immature embryos were co-cultivated with Rhizobium leguminosarum ANU845 and Agrobacterium tumefaciens LBA288 both carrying the plasmid pCAMBIA 5106. pCAMBIA 5106 is a cointegrative vector. The TDNA contained an hpt gene and a GUSPlus each controlled by the CaMV 35S promoter. This study showed that the Rhizobium could transfer genes into rice genome as efficient as that of Agrobacterium based on evaluation on transformation efficiency, transgene expression, copy number, segregation pattern, and plant growth and fertility. Drought is one of abiotic factors that inhibit rice growth and production. A number of genes responsible for drought tolerance have been identified, isolated and tested in different plant species. However, none of these genes was effective in the fields. In this study, a drought inducible gene, OsHox6, was selected to be studied further. Bioinformatics analysis of OsHox6 promoter sequences indicated that the OsHox6 promoter contains cis-regulatory elements important to drought and ABA responses. Temporal and spatial expression patterns of GUSPlus gene fused to OsHox6 promoter through histochemical visualization of GUSPlus in transgenic plant of Ciherang and Nipponbare showed that promoter activity was increased during dehydrated condition in vegetative and generative organs, although the expression was relatively low. Promoter activity was higher in meristematic tissues. Transgenic rice plants containing an extra copy of OsHox6 genes controlled by OsLEA3 promoter were obtained. Four transgenic of IR64 lines (I.19, I.23, I.33, and I.40) containing an extra copy of OsHox6 gene were more tolerant to drought condition, showing higher survival rate compare to wild type plants. It is anticipated that the increase in the survival rate was associated with the expression level of OsHox6 gene. Thus, the expression of OsHox6 gene will be further evaluated. The growths of transgenic rice plants were similar to its wild type counterpart. Further studies are needed to understand the modulation of drought tolerant by the OsHox6 gene. Key words: Drought stress, transcription factor, HD-Zip, OsHox6, OsLEA3, rice, Rhizobium leguminosarum ANU845, Agrobacterium tumefaciens, survival rate
RINGKASAN SYAMSIDAH RAHMAWATI. Transformasi Genetika Padi dengan Perantara Rhizobium dan Agrobacterium dan Analisis Peranan Gen OsHox6. Dibimbing oleh SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, dan INEZ HORTENSE SLAMET-LOEDIN Padi merupakan tanaman yang sangat penting, salah satu makanan pokok penduduk dunia dan tanaman model untuk penelitian functional genomic. Transformasi genetik merupakan teknik yang rutin digunakan saat ini untuk mentransfer berbagai sifat penting pada tanaman termasuk padi dan untuk analisis fungsi gen. Teknik transformasi Agrobacterium merupakan teknik transformasi yang paling umum digunakan karena besar kemungkinan untuk mendapatkan tanaman dengan salinan gen tunggal. Namun, teknik ini telah dipatenkan sehingga perlu agen transformasi alternatif yang memiliki kemampuan transfer gen seperti Agrobacterium. Penggunaan bakteri selain Agrobacterium sebagai agen transformasi genetik memungkinkan untuk dilakukan dengan melibatkan TDNA dan gen-gen virulen dari plasmid Ti yang telah dimodifikasi. Efektifitas teknik transformasi Rhizobium dievaluasi pada tiga kultivar padi, Ciherang (Indica), Nipponbare (Japonica), dan Rojolele (Javanica), dibandingkan dengan Agrobacterium. Kalus umur 6 hari yang diinduksi dari embrio padi masak susu (immature) dikokultivasi dengan Rhizobium leguminosarum bv trifolii ANU845 dan Agrobacterium tumefaciens LBA288 yang membawa plasmid pCAMBIA 5106. Plasmid pCAMBIA 5106 ini mengandung satu set minimal gen virulen dan T-DNA yang penting dalam proses transfer gen. Didalam T-DNA terdapat gen GUSPlus dan gen hpt masing-masing dikendalikan oleh promoter CaMV 35S. Efisiensi transformasi (jumlah tanaman PCR positif hpt dibagi jumlah kalus yang diinokulasi) bervariasi antara 1,14 hingga 12,05% tergantung pada genotipe dan bakteri yang digunakan. Efisiensi transformasi dan regenerasi tertinggi (12,05% dan 59,38%) diperoleh pada Ciherang yang ditransformasi dengan R. leguminosarum. Hampir semua tanaman transgenik yang diperoleh baik hasil transformasi dengan Agrobacterium maupun Rhizobium secara morfologi normal dan fertil. Integrasi, ekspresi dan pola pewarisan gen, dibuktikan dengan analisis molekuler dan genetik pada tanaman T 0 dan T 1 , menunjukkan bahwa efektifitas Rhizobium leguminosarum dalam melakukan transfer gen mirip dengan A. tumefaciens. Kekeringan adalah salah satu faktor abiotik yang menghambat pertumbuhan dan produksi tanaman padi. Sejumlah gen yang bertanggungjawab pada sifat toleran kekeringan telah diidentifikasi, namun belum ada dari gen-gen tersebut yang efektif di lapangan. Oleh karena itu, penelitian tentang analisis fungsi gen yang diduga terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan dan bagaimana mekanisme kerjanya pada level molekul aktif diteliti saat ini. Di dalam penelitian ini, fungsi gen OsHox6 yang diduga berperan penting dalam menentukan sifat toleran kekeringan pada tanaman padi dipelajari. OsHox6 merupakan anggota famili protein homeodomain leucine zipper (HD-Zip) sub-famili I yang menyandikan faktor transkripsi unik pada tumbuhan. Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekspresi gen OsHox6 diregulasi pada level transkripsi oleh ketersediaan air. Analisis bioinformatik sekuen promoter OsHox6
mengindikasikan bahwa promoter OsHox6 mengandung elemen responsif terhadap ABA dan elemen cis-regulatory responsif terhadap kekeringan. TATA box yang umum dijumpai di derah promoter tanaman, berdasarkan hasil analisis sekuen promoter OsHox6, tidak ditemukan. Hasil analisis pola ekspressi temporal dan spasial promoter gen OsHox6 melalui visualisasi gen GUSPlus secara histokimia pada jaringan tanaman transgenik Ciherang dan Nipponbare menunjukkan bahwa aktivitas promoter ini meningkat saat kekeringan pada organ vegetatif (batang, daun, dan akar) dan generatif (bunga). Aktivitas promoter lebih kuat pada daerah dimana terdapat jaringan meristem yang aktif membelah. Untuk mempelajari peranan gen OsHox6 dalam merespon kekeringan, digunakan tanaman padi transgenik mengandung gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 untuk meningkatkan ekspresi gen OsHox6. Empat galur padi transgenik mengandung ekstra salinan gen OsHox6 (IR64 I.19, I.23, I.33, dan I.40) lebih tahan pada kondisi kekeringan pada fase vegetatif, ditunjukkan oleh persentase recovery yang lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman kontrol tipe liarnya (IR64). Diduga peningkatan persentase recovery berhubungan dengan tingkat ekspresi gen OsHox6. Oleh karena itu konfirmasi ekspresi gen OsHox6 akan dilakukan. Penampilan morfologi (tinggi tanaman) padi hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 tidak berbeda dengan tanaman padi tipe liarnya. Karena aktivitas promoter OsHox6 lebih tinggi pada daerah akar lateral, maka diduga OsHox6 penting dalam pembentukan akar lateral. Oleh karena itu penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengamati morfologi akar tanaman transgenik yang mengoverekspresikan OsHox6. Kata Kunci:
Cekaman kekeringan, faktor transkripsi, HD-Zip, OsHox6, OsLEA3, padi, Rhizobium leguminosarum ANU845, Agrobacterium tumefaciens, pesentase recovery.
Hak cipta milik IPB, tahun 2012 Hak dilindungi undang-undang Dilarang mengutip sebahagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah, dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
TRANSFORMASI GENETIKA PADI DENGAN PERANTARA RHIZOBIUM DAN AGROBACTERIUM DAN ANALISIS PERANAN GEN OsHox6
SYAMSIDAH RAHMAWATI
Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Departemen Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Penguji pada ujian tertutup : 1. Dr. Ir. Miftahuddin, M.Si 2. Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Sc Penguji pada ujian terbuka : 1. Prof. Dr. Ir. Sudirman Yahya, M.Sc 2. Dr. Ir. Buang Abdullah, M.Sc
Judul
: Transformasi Genetika Padi dengan Perantara Rhizobium dan Agrobacterium dan Analisis Peranan Gen OsHox6
Nama Mahasiswa
: Syamsidah Rahmawati
NRP
: G361060111
Program Studi
: Biologi
Disetujui, Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA Ketua
Dr. Ir. Inez Hortense Slamet-Loedin Anggota
Prof. Dr. Ir. Didy Sopandie, M.Agr Anggota
Diketahui, Ketua Program Studi Biologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr
Tanggal Ujian: 17 Januari 2012
Tanggal Lulus:
PRAKATA Segala puji bagi Allah yang telah memberikan kenikmatan yang sangat banyak serta kemudahan-kemudahan, sehingga penulis dapat menyelesaikan disertasi ini. Penulis sangat beruntung mendapat kesempatan untuk melakukan penelitian Transformasi Genetika Padi dengan Perantara Rhizobium dan Agrobacterium dan Analisis Peranan Gen OsHox6. Penelitian ini merupakan penelitian yang sangat menarik bagi penulis karena memberikan wawasan baru tentang adanya teknik transformasi alternatif bagi tanaman dengan menggunakan bakteri selain Agrobacterium dan bagaimana mempelajari fungsi suatu gen. Penelitian ini akan sangat bermanfaat untuk mendukung karier penulis sebagai peneliti di masa mendatang. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih yang sebesarbesarnya kepada Prof. Suharsono, Prof. Didy Sopandie, dan Dr. Inez Hortense Slamet-Loedin atas kesediannya membimbing penulis dalam melakukan penelitian ini.
Ucapan terimakasih disampaikan kepada Kepala Puslit
Bioteknologi LIPI yang telah memberikan izin untuk melanjutkan studi pada program S3, kepada Kementrian Riset dan Teknologi dan Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia yang telah memberikan beasiswa kepada penulis selama pendidikan berlangsung, kepada Dekan Sekolah Pascasarjana dan Ketua Departemen Biologi IPB yang telah memberi kesempatan untuk mengikuti pendidikan S3 di Sekolah Pascasarjana Departemen Biologi IPB. Kepada Dr. Satya Nugroho dan Dr. Amy Estiati atas izin peggunaan fasilitas di Lab. Biologi Molekuler Puslit Bioteknologi LIPI. Kepada keluarga besar di Bogor dan di Medan saya ucapkan terimakasih atas semua dukungan dan doa sehingga penulis tetap bersemangat dalam menyelesaikan disertasi ini. Juga kepada semua teman dari lab “Padi” Puslit Bioteknologi LIPI, angkatan 2006 Pascasarjana IPB atas semua dukungan, bantuan, serta doanya saya ucapkan terimakasih. Semoga Disertasi ini bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan teknologi.
Bogor, Januari 2012 Syamsidah Rahmawati
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan Tapanuli Utara tanggal 8 April 1969, anak sulung dari Bapak Saman dan Ibu Amijah Porman Marpaung. Pendidikan Sarjana ditempuh di Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara Medan, lulus pada tahun 1992. Pada tahun 1997 penulis mendapatkan kesempatan mengikuti program S2 LINK Institut Teknologi Bandung dengan University of New South Wales Australia melalui program Beasiswa STAID yang dikoordinir oleh Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), lulus tahun 1999.
Pada tahun 2006, penulis
mendapat kesempatan untuk melanjutkan pendidikan S3 di Sekolah Pascasarjana IPB, Departemen Biologi dengan beasiswa dari Kementrian Riset dan Teknologi pada tahun pertama dan kedua, dan kemudian Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia pada tahun ke tiga dan ke empat. Penulis bekerja sebagai staf peneliti di Pusat Penelitian Bioteknologi sejak tahun 1993 pada bidang konservasi benih, kemudian sejak tahun 1996 pindah ke bidang biologi molekuler hingga sekarang.
Penulis terlibat dalam kegiatan
penelitian padi sejak tahun 1999 hingga sekarang terutama untuk transformasi genetika padi untuk memperbaiki sifat toleran padi terhadap cekaman biotik dan abiotik. Selama mengikuti program S3, penulis mendapat kesempatan untuk mengikuti training mengenai “Rice:Research to Production” di International Rice Research Institute (IRRI) Filipina selama 3 minggu pada tahun 2008. Topik penelitian untuk Disertasi adalah Transformasi Genetika Padi dengan Perantara Rhizobium dan Agrobacterium dan Analisis Peranan Gen OsHox6. Comparative analysis of rice transformation using Agrobacterium tumefaciens and Rhizobium leguminosarum yang merupakan bagian dari Disertasi ini telah dipublikasi di Indonesian Journal of Biotechnology Volume 15 No. 1 Juni 2010.
DAFTAR ISI Halaman Daftar Tabel ....................................................................................
iii
Daftar Gambar .................................................................................
v
Daftar Lampiran .............................................................................. .
vii
I. PENDAHULUAN Latar Belakang ......................................................................
1
Tujuan Penelitian
..................................................................
5
Manfaat Penelitian
................................................................
5
Ruang Lingkup Penelitian
.....................................................
6
Padi Sebagai Tanaman Penting ............................................
9
II. TINJAUAN PUSTAKA
Cekaman Kekeringan
...........................................................
10
Mekanisme Toleran Kekeringan pada Tanaman ..................
11
Identifikasi Gen yang Terlibat dalam Mekanisme Toleran Kekeringan
...........................................................................
Faktor Transkripsi HD-Zip
12
................................................................
13
.................................................................................
16
Analisis Fungsi Gen
.............................................................
Transformasi Genetika Tanaman
.........................................
18 21
III. ANALISIS KOMPARATIF TRANSFORMASI GENETIK PADI MENGGUNAKAN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS DAN RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM Abstrak
.................................................................................
27
Abstract
................................................................................
27
Pendahuluan
.........................................................................
Bahan dan Metode Hasil
28
...............................................................
29
.....................................................................................
33
Pembahasan Simpulan
.........................................................................
...............................................................................
38 40
ii
IV. ANALSIS REGULASI PROMOTER OsHox6 PADA TANAMAN PADI Abstrak
..................................................................................
41
Abstract
.................................................................................
41
Pendahuluan
..........................................................................
Bahan dan Metode Hasil
42
................................................................
43
......................................................................................
48
Pembahasan Simpulan
..........................................................................
56
...............................................................................
58
V. OVEREKSPRESI GEN OsHox6 PADA TANAMAN PADI Abstrak
....................................................................................
59
Abstract
....................................................................................
59
Pendahuluan
.............................................................................
Bahan dan Metode Hasil
60
...................................................................
62
.........................................................................................
65
Pembahasan Simpulan
.............................................................................
70
..................................................................................
72
VI. PEMBAHASAN UMUM Rhizobium Sebagai Agen Tranformasi Genetik Alternatif............
73
Pendekatan Reverse Genetic untuk Mempelajari Fungsi Gen OsHox6...................................................................................
75
Upaya Lebih Lanjut Analisis Fungsi Gen OsHox6 pada Tanaman Padi.................................................................................
77
VII. SIMPULAN UMUM DAN SARAN SIMPULAN UMUM.......................................................................
79
SARAN ........................................................................................
79
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................
81
LAMPIRAN .......................................................................................
99
iii
DAFTAR TABEL
Halaman 1 Gen yang terlibat dalam respon terhadap cekaman kekeringan dan fungsinya................................................................................. 14 2 Contoh faktor transkripsi tanaman dan peranannya dalam respon kekeringan...................................................................................... 15 3 Subfamili HD-Zip dan fungsinya.................................................... 18 4 Media yang digunakan untuk transformasi tiga varietas padi (Ciherang, Nipponbare, dan Rojolele)............................................ 32 5 Efisiensi transformasi tiga varietas padi hasil transformasi dengan Rhizobium leguminosarum dan Agrobacterium tumefaciens...................................................................................... 34 6 Ekspresi GUS dan HPT pada tiga varietas padi hasil transformasi dengan Rhizobium leguminosarum dan Agrobacterium tumefaciens berdasarkan uji GUS dan higromisin pada daun...................................................................... 35 7 Prakiraan jumlah gen hpt pada galur tanaman transgenik terpilih hasil transformasi dengan Agrobacterium (A) dan Rhizobium (R)................................................................................. 37 8 Segregasi gen hpt pada populasi tanaman T 1 galur terpilih............ 37 9 Pertumbuhan dan fertilitas beberapa galur transgenik terpilih hasil transformasi dengan Rhizobium dan Agrobacterium.............. 38 10 Kandidat cis-acting element responsif kekeringan dan ABA pada 1 kb daerah promoter OsHox6................................................ 50 11 Segregasi gen hpt pada populasi tanaman T 1 Ciherang dan IR64 yang ditransformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3........................................................................... 67 12 Tingkat recovery tanaman transgenik pada kondisi kekeringan....................................................................................... 69 13 Perbandingan antara transformasi menggunakan bantuan A. tumefaciens dengan R. leguminosarum........................................... 75
iv
v
DAFTAR GAMBAR
1 2 3 4
5 6 7
8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
19
Halaman Diagram alur penelitian......................................................................... 7 Skema struktur protein unik dari setiap subfamili HD-Zip................... 18 T-DNA di dalam pCAMBIA 5106........................................................ 31 Amplifikasi fragmen gen hpt tanaman transgenik terpilih hasil transformasi dengan A. tumefaciens atau R. leguminosarum pembawa plasmid pCAMBIA 5106...................................................... 34 Daun tanaman padi transgenik yang mengekspresikan β35 glucuronidase dan higromisin fosfotransferase .................................... Contoh hasil hibridisasi Southern.......................................................... 36 Penampilan morfologi Niponbare, Ciherang, dan Rojolele hasil transformasi dengan A. tumefaciens LBA288 (pCAMBIA5106) and R. leguminosarum (pCAMBIA5106).............................................. 38 Skema proses kloning untuk pembentukan fusi promoter OsHox6 dengan gen pelapor GUSPlus ................................................................ 46 Posisi elemen cis-acting responsif kekeringan pada daerah promoter OsHox6.................................................................................................. 50 Hasil pensejajaran sekuen kandidat promoter OsHox6 yang diisolasi dari padi Ciherang dengan sekuen acuan dari Nipponbare................... 51 Contoh hasil PCR menggunakan primer spesifik untuk gen hpt........... 52 Ekspresi GUSPlus pada berbagai organ tanaman padi cv Ciherang dan Nipponbare hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikontrol oleh promoter terinduksi kekeringan OsHOx6 dan promoter konstitutif CaMV 35S pada saat ada atau tidak ada induksi kekeringan.............................................................................................. 54 Pola ekspresi GUSPlus yang dikontrol oleh promoter OsHox6 pada berbagai organ tanaman......................................................................... 55 Penampang melintang dan membujur bagian buku batang padi yang telah di uji GUS..................................................................................... 56 T-DNA di dalam pCAMBIA 1301H OsHox6....................................... 65 Tahapan kultur jaringan untuk menghasilkan tanaman padi varietas Ciherang atau IR64 yang mengandung OsLEA3::OsHox6 .................. 68 Hasil hibridisasi Southern DNA tanaman IR64 yang ditransformasi dengan gen OsHox6............................................................................... 69 Recovery tanaman transgenik galur IR64 tahan higromisin mengandung 1 salinan gen hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3........................................... 71 Tinggi tanaman beberapa galur toleran kekeringan............................... 70
vi
vii
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3
Halaman Media Kultur Jaringan............................................................. 99 Media Bakteri.......................................................................... 106 Larutan Yoshida ..................................................................... 107
I. PENDAHULUAN Latar Belakang Padi (Oryza sativa L.) merupakan komoditas strategis, makanan pokok penduduk Indonesia dan penduduk di berbagai belahan dunia terutama Asia, Timur Tengah dan Amerika Latin. Selain sebagai makanan pokok, padi juga merupakan tanaman model untuk kelompok monokotil, karena dibandingkan dengan tanaman lain dari kelompok monokotil, padi memiliki ukuran genom yang relatif kecil (430 Mb), umur relatif singkat, menyerbuk sendiri, diploid sehingga memudahkan
dalam
melakukan
analisis
net/daisy/RiceGenome/3649/3593.html).
genom
(http://www.patentlens.
Meskipun variasi ukuran genom dan
ploidi pada tanaman monokotil sangat besar, genom padi dan tanaman monokotil lainnya sangat konservatif baik dalam hal sekuen dari gen yang ada, juga dalam urutan gen atau “synteni”. Sehingga informasi yang ada pada genom tanaman padi dapat digunakan sebagai acuan untuk mempelajari genom tanaman monokotil lainnya. Kekeringan adalah salah satu faktor utama penghambat produksi tanaman termasuk padi. Kekeringan menurunkan produksi tanaman dengan menghambat pertumbuhan dan fotosintesis (Shou et al. 2004). Menurunnya produksi akibat kekeringan
berdampak
memperburuk
pada
kemiskinan
peningkatan
harga
produk
pertanian
dan
(http://www.drought.unl.edu/archive/dnn-archive
/arch26.pdf). Studi dan analisis data iklim dan produksi padi di Jawa dan bali 25 tahun terakhir dan prediksi 50 tahun ke depan menggunakan model perubahan iklim global mengindikasikan bahwa kekeringan akan semakin sering terjadi (Naylor et al. 2007).
Kekeringan dapat terjadi kapan saja selama fase
pertumbuhan padi, namun yang paling merugikan adalah kekeringan yang terjadi pada fase generatif.
Perakitan padi toleran kekeringan sangat penting untuk
mengantisipasi perubahan iklim yang ekstrim. Upaya untuk mempelajari sifat toleran kekeringan pada level molekul sangat aktif dilakukan di seluruh dunia untuk membantu mengungkap mekanisme molekuler tanaman pada kondisi kekurangan air. Pemahaman ini sangat membantu upaya perakitan padi toleran kekeringan di masa mendatang.
2
Sifat toleran kekeringan sangat kompleks, dikendalikan oleh banyak gen (multigenik) yang tersebar di banyak lokus dan diwariskan secara kuantitatif (Valliyodan & Nguyen 2006; Fleury et al. 2010; Lang & Buu 2010). Selain itu tanaman memiliki mekanisme yang berbeda (escape, penghindaran atau avoidance, atau toleran) dalam merespon kekeringan (Levit 1972). Tanaman escape kekeringan dengan mempersingkat siklus hidupnya. Sebahagian tanaman menghindari kekeringan dengan meningkatkan penyerapan air dan meminimalkan kehilangan air.
Tanaman toleran kekeringan melibatkan mekanisme osmotic
adjustment, antioksidan, dan ketahanan desikasi. Namun bagaimana mekanisme molekuler tanaman dalam merespon dan beradaptasi terhadap kekeringan belum sepenuhnya dimengerti. Berbagai pendekatan telah diupayakan untuk mempercepat pengungkapan mekanisme toleran kekeringan pada level molekuler. Sejumlah gen terinduksi kekeringan telah berhasil diidentifikasi pada level transkripsi menggunakan analisis microarray pada tanaman model Arabidopsis dan padi (Seki et al. 2001; Seki et al. 2002; Rabbani et al. 2003; Zhou et al. 2007), namun belum semua fungsi gen berhasil diungkapkan. Analisis fungsional genomik sangat penting dilakukan untuk memahami lebih lanjut fungsi gen terkait dan bagaimana mekanisme pengaturannya pada level molekuler. Berdasarkan pengaturan ekspresi gen, Yamaguchi-Shinozaki dan Shinozaki (1993a) mengelompokkan gen-gen yang terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan ke dalam dua kelompok utama, yaitu kelompok yang ekspresinya bergantung pada ABA (ABA dependent) dan tidak bergantung pada ABA (ABAindependen). Berdasarkan peran atau fungsi proteinnya maka Shinozaki et al. (2003) mengelompokkan gen-gen yang terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan pada dua kelompok utama, protein fungsional (seperti osmoprotektan, LEA, transporter, chaperon) dan protein regulator (misalnya faktor transkripsi dan protein kinase).
Yang et al. (2010) membagi gen responsif kekeringan
berdasarkan fungsi biologisnya ke dalam 3 kelompok; yaitu yang berperan dalam (1) regulasi transkripsi, (2) post-transkripsi RNA atau fosforilasi protein, dan (3) metabolisme osmoprotektan atau molekul chaperon.
Selain itu masih ada
kelompok gen yang belum diketahui fungsinya (Bhatnagar-Mathur et al. 2008).
3
Oleh karena kompleksnya sifat toleran kekeringan, penyisipan satu gen yang memiliki fungsi tunggal tidak cukup untuk mengembalikan fungsi sel dan membuat tanaman lebih toleran kekeringan (Bohnert et al. 1995; Mitra 2001). Untuk mengatasi hal tersebut akhir-akhir ini penelitian lebih diarahkan pada penggunaan faktor transkripsi yang bertanggungjawab pada sifat toleran kekeringan. Faktor transkripsi berperan dalam mengatur ekspresi gen-gen lain melalui pengikatan spesifik antara protein faktor transkripsi dengan elemen cisacting promoter gen target. Sejumlah faktor transkripsi terinduksi kekeringan pada tanaman telah berhasil diungkap. Secara umum faktor transkripsi yang responsif terhadap kekeringan tersebut dikelompokkan ke dalam beberapa famili seperti AP2/ERF, bZIP, NAC, MYB, MYC, Cys2His2 zinc finger dan WRKY (Vinocur & Altman 2005; Bartels & Sunkar 2005; Shinozaki & YamaguchiShinozaki 2007). Setelah sekuen genom padi dan Arabidopsis berhasil diungkap, faktor transkripsi yang ada pada tanaman padi dan Arabidopsis dapat diidentifikasi (Seki et al. 2002; Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki 2007; Agalou et al. 2008). Berbagai teknik reverse genetik telah dikembangkan untuk mempelajari fungsi faktor transkripsi. Secara umum teknik reverse genetik ini dibagi ke dalam 2 pendekatan, yaitu overekspresi dan knockout (Zhang 2003). Selain itu analisis promoter yang difusikan dengan gen pelapor digunakan untuk mempelajari mekanisme regulasi proses transkripsi gen pada level molekuler dan aktivitas promoter secara spasial dan temporal (Hiwatashi & Fukuda 2000; Xiao & Xue 2001; Johannesson et al. 2003; Itoh et al. 2008). HD-Zip adalah salah satu faktor transkripsi yang unik ditemukan pada tanaman, dikenali dengan adanya homeodomain yang penting untuk pengikatan DNA dan motif leucin zipper yang membantu proses dimerisasi protein. Proses dimerisasi protein diperlukan untuk membantu proses pengikatan DNA. HD-Zip merupakan suatu famili faktor transkripsi yang besar yang dibagi ke dalam IV sub-famili berdasarkan kespesifikan pengikatan DNA oleh homeodomain, struktur dan fungsi gen, dan adanya motif lain (Ariel et al. 2007). HD-Zip memiliki fungsi yang sangat beragam.
Ekspresi Gen HD-Zip sub-famili I dan II di
pengaruhi faktor eksternal termasuk kekeringan dan berperan dalam adaptasi
4
perkembangan tanaman pada saat terjadi cekaman (Olsson et al. 2004; Dezar et al. 2005a; Agalou et al. 2008). Faktor transkripsi HD-Zip di tanaman padi baru diteliti beberapa tahun belakangan ini. Informasi tentang fungsi dan mekanisme regulasinya masih sangat terbatas. Dari 31 gen HD-Zip sub-famili I,II, dan III yang ada pada padi, baru 2 yang dipelajari fungsinya, yaitu OsHox1 dan OsHox4. OsHox1 berperan dalam differensiasi jaringan pembuluh (Scarpella et al. 2000), sedangkan OsHox4 berperan dalam pemanjangan dan pembesaran sel pembuluh (Agalou et al. 2008). Pada penelitian ini fungsi gen faktor transkripsi OsHox6 yang diisolasi dari tanaman padi dipelajari. Gen OsHox6, merupakan anggota HD-Zip sub-famili I, dilaporkan meningkat ekspresinya pada saat kekeringan (Purwantomo 2007; Agalou et al. 2008), sehingga diduga berperan penting dalam menentukan sifat toleran kekeringan. Untuk mempelajari lebih lanjut fungsi gen OsHox6 dalam adaptasi toleran kekeringan, aktivitas native promoter OsHox6 yang difusikan dengan gen GUSPlus diamati pada tanaman padi saat kekeringan. Kekeringan meningkatkan ekspresi gen OsHox6 pada berbagai organ (batang, akar, daun, dan bunga) tanaman padi, namun ekspresinya rendah. Oleh karena itu pada percobaan tahap berikutnya dilakukan penambahan jumlah salinan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter terinduksi kekeringan OsLEA3 untuk meningkatkan ekspresi gen OsHox6 padi pada kondisi kekeringan. Sebelumnya, Xiao et al. (2007) melaporkan bahwa OsLEA3 menunjukkan aktivitas yang tinggi pada kondisi kekurangan air. Selanjutnya toleransi tanaman padi yang mengandung tambahan gen OsHox6 terhadap kekeringan dievaluasi. Selanjutnya untuk mendukung kegiatan analisis fungsi gen, pengembangan teknik transformasi menggunakan Rhizobium sebagai upaya untuk menyediakan teknik transformasi alternatif untuk tanaman khususnya padi akan di pelajari. Teknik yang umum digunakan saat ini untuk mengintroduksi gen pada tanaman, khususnya padi, adalah menggunakan transformasi Agrobacterium. Teknik ini memiliki keunggulan dimana kemungkinan untuk menghasilkan satu salinan gen lebih besar dan dapat digunakan untuk mentransformasi berbagai tanaman termasuk dari kelompok dikotil dan monokotil.
Namun, teknik ini telah
5
dipatenkan yang mana dapat menjadi ganjalan bila produk akan dipasarkan. Oleh karena itu perlu diupayakan teknik transformasi alternatif. Broothaerts et al. (2005) melaporkan bahwa sejumlah bakteri yang berasosiasi dengan tumbuhan, jika dilengkapi dengan gen-gen virulen dan T-DNA dari plasmid Ti mampu mentransfer T-DNA ke dalam genom tanaman. Bakteri Sinorhizobium meliloti, Rhizobium sp dan Mesorhizobium loti mengandung plasmid Ti dari Agrobacterium dapat mentransfer T-DNA ke dalam genom padi, tembakau dan Arabidopsis dengan efisiensi transformasi yang bervariasi antara 140% tergantung pada spesies dan pengujian yang digunakan. Evaluasi efektititas bakteri selain Agrobacterium dalam mentransfer gen ke dalam genom tanaman dibandingkan dengan A. tumefaciens belum pernah dilakukan.
Informasi ini
penting sebagai langkah awal dalam upaya pengembangan transformasi genetik menggunakan bakteri selain Agrobacterium. Selanjutnya perubahan faktor yang mempengaruhi keberhasilan transformasi diharapkan dapat meningkatkan efisiensi transformasi di masa mendatang.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk; 1.
Mengevaluasi efektifitas sistem transformasi Rhizobium pada tanaman padi dibandingkan dengan sistem transformasi Agrobacterium,
2.
Menjelaskan regulasi gen OsHox6 melalui studi bioinformatik promoter gen OsHox6 serta analisis pola ekspresinya pada tanaman padi transgenik yang mengandung fusi promoter OsHox6 dengan gen penyandi β-glucuronidase, dan
3.
Menjelaskan peranan faktor transkripsi OsHox6 pada tanaman transgenik mengandung ekstra salinan gen OsHox6 pada kondisi kekeringan.
Manfaat Penelitian 1.
Teknik transformasi alternatif perlu ada selain untuk menghindari kendala paten juga untuk meningkatkan efisiensi transformasi tanaman yang sulit di transformasi dengan Agrobacterium.
6
2.
Informasi tentang peranan gen OsHox6 dalam mekanisme toleran kekeringan tanaman padi penting untuk diketahui dalam upaya mencari gengen potensial untuk toleran kekeringan.
3.
Promoter terinduksi kekeringan dapat digunakan untuk mengendalikan ekspresi gen-gen penting terkait toleran kekeringan.
4.
Padi toleran kekeringan sangat diperlukan untuk antisipasi fluktuasi iklim ekstrim (kemarau panjang) yang semakin sering terjadi akibat pemanasan global yang mengakibatkan gagal panen di daerah utama padi sawah yang rawan kekeringan.
Ruang Lingkup Penelitian Untuk mencapai tujuan penelitian di atas, maka penelitian ini dibagi dalam 3 tahap percobaan. Pada tahap awal dilakukan penelitian pendahuluan dengan topik
“Analisis
Agrobacterium
komparatif tumefaciens
transformasi dan
Rhizobium
genetik
padi
menggunakan
leguminosarum”.
Untuk
mengevaluasi keefektifan teknik transformasi Rhizobium dibandingkan dengan transformasi Agrobacterium pada tanaman padi, maka pengamatan difokuskan pada efisiensi regenerasi dan transformasi masing-masing sistem, ekspresi gen, kecenderungan jumlah salinan gen, pola pewarisan gen, dan pertumbuhan dan kesuburan (fertilitas) tanaman yang dihasilkan oleh kedua sistem transformasi ini. Pada tahap berikutnya dilakukan isolasi dan konstruksi vektor yang mengandung promoter OsHox6 yang difusikan dengan gen GUSPlus. Selanjutnya vector ini ditransformasikan ke dalam genom tanaman padi. Aktivitas promoter OsHox6 diamati pada tanaman padi yang mengandung promoter OsHox6 yang difusikan dengan gen GUSPlus pada kondisi air terbatas (kekeringan) atau tidak kekurangan air (normal).
Selanjutnya, pengamatan dilakukan pada organ
vegetatif (batang, akar, daun) dan generatif (bunga). Untuk mengamati jaringan yang mengakumulasikan GUSPlus dilakukan irisan secara melintang dan membujur. Percobaan tahap berikutnya dilakukan penambahan jumlah salinan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter terinduksi kekeringan OsLEA3 untuk meningkatkan ekspresi gen OsHox6 pada kondisi kekeringan.
Selanjutnya
7
ketahanan tanaman padi yang mengandung tambahan gen OsHox6 terhadap kekeringan dievaluasi. Seluruh kegiatan penelitian dalam disertasi ini dirangkum dalam alur penelitian yang disajikan pada Gambar 1.
Studi transformasi padi Ciherang, Rojolele dan Nipponbare dengan Rhizobium dan Agrobacterium
Evaluasi efektifitas transformasi
Isolasi Promoter OsHox6 dan konstruksi vektor pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus
Pembentukan populasi tanaman mengandung OsHox6P:: GUSPlus
Analisis ekspresi gen yang dikendalikan oleh promoter OsHox6
Pembentukan populasi tanaman mengandung OsLEA3P:: OsHox6
Evaluasi tingkat toleransi tanaman padi mengandung ekstra gen OsHox6 pada kondisi kekeringan
Gambar 1 Diagram alur penelitian
8
II. TINJAUAN PUSTAKA Padi Sebagai Tanaman Penting Padi tergolong ke dalam genus Oryza, sub-famili Oryzoideae, famili Poaceae kelas monocotyledoneae. Padi yang dibudidayakan tergolong ke dalam 2 spesies, yaitu Oryza sativa L. umum ditanam di Asia dan Oryza glaberrima Steud atau disebut juga padi Afrika. Dari kedua spesies tersebut O. sativa adalah yang paling banyak dibudidayakan. O. sativa diperkirakan terdiri dari sedikitnya 140,000 varietas dan secara umum dikelompokkan ke dalam 3 grup atau subspesies; yaitu Indica, Japonica dan Javanica (Tropical Japonica). Padi merupakan tanaman yang memiliki nilai ekonomi sangat penting, makanan pokok lebih dari separuh penduduk dunia. Berdasarkan nilai ekonomi tanaman pangan secara global tahun 2005-2009, padi menempati urutan teratas dibandingkan dengan tanaman pangan penting lainnya (jagung, gandum, kentang, singkong dan sorghum), sedangkan berdasarkan jumlah produksi, padi menempati urutan kedua setelah jagung (FAOSTAT 2009). Di Indonesia padi menempati urutan pertama dari 7 komoditas pangan utama baik dari segi produksi maupun nilai ekonomi (FAOSTAT 2009; BPS 2009). Selain sebagai makanan pokok, padi juga merupakan tanaman model untuk kelompok monokotil. Sebagai tanaman model padi memiliki ukuran genom yang relatif kecil (∼430 Mb), umur relatif singkat, dan jumlah set kromosom sederhana (diploid)
(http://www.patentlens.net/daisy/RiceGenome/3649/3593.html),
sehingga memudahkan dalam analisis sekuen genom. Selanjutnya tersedianya protokol transformasi genetika tanaman padi dengan efisiensi tinggi (Hiei et al. 1994; Hiei & Komari 2006), peta fisik dan genetika dengan kepadatan tinggi (Harushima et al. 1998; Temnykh et al. 2001; McCouch et al. 2002), dan kenyataan bahwa antara tanaman sereal memiliki derajat ‘synteni’ yang tinggi, menjadikan padi sebagai organisme yang unik untuk mempelajari fisiologi, biologi pertumbuhan dan perkembangan, serta genetika dan evolusi tumbuhan. Tahun 2002 sekuen lengkap genom padi berhasil diungkap dan dipublikasi (Goff et al. 2002; Yu et al. 2002), sebagai langkah awal dari upaya pemahaman tentang biologi padi pada level molekuler.
Rice Annotation Project (2007)
10
memprediksi padi mengandung ∼32.000 gen.
Jumlah ini lebih sedikit
dibandingkan dengan prediksi sebelumnya (30-50 ribu gen) oleh Goff et al. (2002). Sebanyak 28.469 cDNA utuh telah berhasil disekuen dan berdasarkan pencarian BLASTN dan BLASTX menunjukkan bahwa 75,86% diantaranya merupakan gen yang menyandikan protein yang mirip dengan data yang ada dipangkalan data (Rice Full-Length cDNA Consortium 2003). Sisanya, masih belum dipelajari. Oleh karena itu tugas berikutnya adalah mempelajari fungsi dari gen-gen tersebut.
Cekaman Kekeringan Kekeringan adalah salah satu faktor yang menghambat pertumbuhan dan produksi tanaman termasuk padi. Kekeringan menyebabkan kerugian ekonomi yang nyata (Kalsim 2007).
Kerugian akibat kekeringan ditaksir mencapai
milyaran rupiah setiap tahunnya. Kerugian akibat kekeringan sangat bergantung pada genotipe yang digunakan, fase pertumbuhan dimana kekeringan terjadi, dan lama serta tingkat keparahan kekeringan (Setter et al. 1995).
Fase generatif
merupakan fase yang sangat sensitif terhadap kekeringan (Yue et al. 2006). Kekeringan yang terjadi pada fase generatif dapat menyebabkan berkurangnya jumlah malai dan hasil, bahkan dapat mengakibatkan puso. Dalam beberapa tahun terakhir kasus kekeringan semakin sering terjadi akibat adanya perubahan iklim yang disebabkan oleh pemanasan global. Menurut prediksi menggunakan model perubahan iklim global berdasarkan data iklim dan produksi padi di Jawa dan bali 25 tahun terakhir mengindikasikan bahwa kekeringan akan semakin sering terjadi 50 tahun ke depan (Naylor et al. 2007). Oleh karena itu perakitan padi toleran kekeringan sangat penting untuk mengantisipasi fluktuasi iklim yang ekstrim. Untuk dapat merakit padi toleran kekeringan diperlukan pemahaman yang komprehensif tentang mekanisme pengaturan sifat toleran kekeringan pada tanaman. Oleh karena itu kajian tentang mekanisme pengaturan sifat toleran kekeringan pada level molekuler sangat penting dilakukan. Data hasil kajian yang telah berhasil diperoleh hingga saat ini dapat dijadikan sebagai dasar di dalam upaya memahami sifat toleran kekeringan pada tanaman padi, dan juga pada
11
tanaman sereal lainnya.
Tanaman toleran kekeringan adalah tanaman yang
mampu hidup, tumbuh, dan memberikan hasil yang memuaskan pada kondisi air terbatas (Turner 1979, diacu dalam Fleury et al. 2010). Padi toleran kekeringan yang ideal adalah padi yang dalam kondisi tercekam kekeringan memberikan hasil yang tinggi dibandingkan padi lainnya (Fukai & Cooper 1995) atau memberikan hasil stabil dan mampu bertahan pada kondisi kekeringan (Price et al. 2002).
Mekanisme Toleran Kekeringan pada Tanaman Tanaman tidak seperti makhluk hidup lain yang dapat bergerak atau berlari menghindar dari bahaya yang mengancam dirinya. mengatasi
cekaman
lingkungan
yang
tidak
Oleh karena itu untuk
menguntungkan,
tanaman
mengembangkan suatu mekanisme toleransi (Levit 1980; Mundree et al. 2002). Setiap tanaman memiliki kemampuan ini dengan derajat yang berbeda beda. Kemampuan tanaman dalam mengatasi cekaman lingkungan sangat dipengaruhi oleh mekanisme yang dimiliki tumbuhan untuk menghindari atau mengatasi cekaman yang dihadapinya dan tingkat keparahan cekaman. Untuk dapat mengatasi cekaman lingkungan, tanaman memberikan tanggapan dan adaptasi melalui perubahan morfologi, fisiologi, biokimia dan perkembangan, termasuk menginduksi ekspresi gen dan sintesis sejumlah protein (Takahashi et al. 2000). Tanaman yang berada di bawah cekaman menunjukkan perubahan pada aktivitas enzim daun, akumulasi mRNA, fotosintesis, kandungan karbohidrat dan asam amino (Foyer et al. 1998). Secara umum mekanisme yang dikembangkan oleh tumbuhan untuk mengatasi cekaman lingkungan (kekeringan) dikelompokkan ke dalam tiga kelompok (Levit 1980; Chaves et al. 2003), yaitu escape, penghindaran (avoidance), dan toleran. Mekanisme adaptasi tanaman ini tidak saling terpisah. Suatu tanaman dapat menggabungkan berbagai mekanisme yang berbeda untuk proses adaptasi terhadap cekaman (Ludlow 1989, diacu dalam Chavez et al. 2003).
12
Identifikasi Gen yang Terlibat dalam Mekanisme Toleran Kekeringan Salah satu kunci utama dalam pemuliaan tanaman toleran kekeringan adalah mengetahui gen-gen yang mengendalikan sifat toleran kekeringan. Diduga ada ratusan gen yang terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan.
Berbagai
pendekatan telah dilakukan untuk mengidentifikasi gen responsif kekeringan, diantaranya adalah substractive hybridization (Ouvrard et al. 1996; Deokar et al. 2011), differential display RT-PCR (Medini et al. 2009), cDNA AFLP (Gao et al. 2009), dan DNA microarray (Seki et al. 2001; Seki et al. 2002; Rabbani et al. 2003; Lorenz et al. 2011). Seki et al. (2001) mengamati 1300 gen Arabidopsis menggunakan cDNA microarray dan menemukan 40 gen terinduksi kekeringan, 14 diantaranya sudah pernah dilaporkan sebelumnya (rd29A/cor78, cor15a, kin1, kin2, rd17/cor47, erd10, dan rd20), sedangkan 30 sisanya belum diketahui fungsinya. Kemudian Seki et al. (2002) mengamati 7000 gen Arabidopsis lainnya dan menemukan 277 gen terinduksi kekeringan.
Sebanyak 128 diantaranya ekspresinya hanya
terinduksi oleh kekeringan, sedangkan sisanya diinduksi oleh kekeringan, salinitas, dan ABA. Rabbani et al. (2003) mengamati 1700 cDNA tanaman padi menggunakan cDNA microarray dan menemukan 67 gen terinduksi kekeringan, sebahagian diantaranya belum diketahui fungsinya. Akhir-akhir ini Gao et al. (2009) membandingkan ekspresi gen terinduksi kekeringan pada padi sawah dan padi gogo. Dari hasil kajian tersebut ditemukan bahwa ada 57 gen yang secara spesifik diekspresikan pada padi gogo dan 38 gen yang secara spesifik diekspresikan pada padi sawah mengindikasikan adanya ekspresi gen yang berbeda antara padi gogo dan padi sawah. Berdasarkan pengaturan ekspresinya Shinozaki dan Yamaguchi-Shinozaki (1997) membagi gen terinduksi kekeringan ke dalam dua kelompok, yaitu yang ekspresinya diinduksi oleh ABA (ABA-dependent) dan tidak diinduksi ABA (ABA-independent). Berdasarkan fungsinya, Shinozaki dan Yamaguchi-Shinozaki (2007) membagi produk dari gen-gen ini ke dalam 2 grup, yaitu: protein fungsional dan protein regulator.
Protein fungsional meliputi protein yang
berperan dalam merespon kekeringan misalnya protein yang berperan sebagai protease, water channel atau transporter, enzim detoksifikasi, protein faktor
13
makromolekul, (LEA protein dan Chaperon), dan enzim kunci untuk biosintesa osmolit (prolin, gula). Protein regulator meliputi protein yang mengatur ekspresi gen lain, misalnya faktor transkripsi, protein kinase, dan protein yang mengatur biosintesa ABA.
Menurut Cushman dan Bohnert (2000) setidaknya ada 8
kelompok gen responsif kekeringan berdasarkan fungsi gennya, yaitu yang berperan dalam sintesa osmoprotektan, reactive oxygen spesies (ROS), protein stres, ion atau proton transporter, protein yang mengendalikan status air sel, komponen sinyal, kontrol transkripsi, dan pengaturan pertumbuhan. Beberapa gen yang berperan dalam mekanisme toleran kekeringan disajikan pada Tabel 1. Pada masa awal pengembangan tanaman toleran kekeringan, pendekatan yang digunakan adalah memanfaatkan atau meningkatkan ekspresi satu gen dengan fungsi tunggal seperti osmoprotektan, protein LEA, atau heat shock protein. Tanaman yang dihasilkan, berdasarkan pengamatan di Laboratorium atau di rumah kaca, memiliki ketahanan yang lebih baik dari tetuanya. Namun, hingga saat ini belum ada tanaman toleran kekeringan hasil rekayasa genetika yang telah berhasil dilepas secara komersial. Karena kompleksnya sifat toleran kekeringan yang melibatkan banyak gen penting, rekayasa satu enzim atau protein kelihatannya tidak cukup untuk membantu tanaman menghadapi kondisi cekaman kekeringan (Nakashima & Yamaguchi-Shinozaki 2005; Bhatnagar-Mathur et al. 2008).
Oleh karena itu
akhir-akhir ini pengembangan padi toleran kekeringan dengan pendekatan rekayasa
genetika
diarahkan
pada penggunaan
faktor transkripsi
yang
mengendalikan sekaligus beberapa gen terkait toleran kekeringan (BhatnagarMathur et al. 2008).
Faktor Transkripsi Faktor transkripsi, disebut juga faktor pengikat sekuen DNA tertentu (sequence-specific DNA-binding factor), adalah suatu protein yang menempel pada urutan DNA tertentu dan mengatur proses transkripsi satu atau lebih gen. Sejak sekuen lengkap genom beberapa tanaman berhasil diungkap, faktor transkripsi dapat diidentifikasi dengan lebih mudah menggunakan kajian
14
Tabel 1
Kelompok/ Fungsi
Gen yang terlibat dalam respon terhadap cekaman kekeringan dan fungsinya Kemungkinan mekanisme
Osmo protektan
Penyesuaian osmotic (osmotic adjustment); perlindungan atau stabilisasi membrane/ protein, pemusnah reactive (OH-)
Reactive oxygen scavengers
Detoksifikasi spesies oksigen reaktif (ROS)
Protein stres
Stabilisasi protein, stabilisasi membrane, chaperon Tingkah laku stomata, pengaturan jumlah AQP pada tonoplas dan membrane plasma Transduksi sinyal yang dimediasi oleh sensor Ca 2+ / fosforilasi
Status air
Komponen sinyal
Kontrol transkripsi
Pengaktifan transkripsi
Pengatur pertumbuh an
Perubahan homeostasis hormon
Produk
Gen
• Asam amino (prolin, ektoin) • Dadc (Capel et al. 2004), ectABC (Nakayama et al. • Senyawa dimetil sulfonium 2000), AtP5CS (Yamada (glisin betain, DMSP) et al. 2005) • Polyol (mannitol, D-ononitol, • CMO (Shirasawa et al. sorbitol) 2006) • Gula (sucrose, trehalose, fruktan) • mtlD (Karakas et al. 1997), IMT1 (Sheveleva et al. 1997) • OtsA, OtsB (Garg et al. 2002) chlCU/ZN SOD • Enzim (catalase, Fe/Mn (Chatzidimitriadou et al. superoxide dismutase, askorbat 2009), PpAPX (Li et al. peroksidase, enzim siklus 2009), SOD, APX (Lu et glutation, glutathione Sal. 2010), Eltayeb et al. transferase, glutation 2007) peroksidase, gammaglutamilsistein sintetase, alternative oksidase) • Non enzim (askorbat, flavon, karotenoid, antosianin) Protein LEA (late embryogenesis HaDhn1,2 (Cellier et al. abundant ); mis. dehidrin 1998), OsLEA3-1 (Xiao et al. 2007) Aquaporin atau lubang (channel) OsPIP2-2 (Guo et al. air 2006)
Homolog histidin kinase OsMPK5 (Xiong & Yang (AtRR1/2), MAP kinase 2003), OsSIK1 (Ouyang (PsMAPK, HOG), Ca 2+ dependent et al. 2010). protein kinase, SNF1/kinase, protein fosfatase (ABI1/2), system sinyal CAN/B,Ca 2+ sensor (SOS3), inositol kinase Faktor transkripsi famili: • OsDREB1 (Ito et al. APETELA2 (AP2), bZIP, zinc2006) finger, MYB, MYC, NAC,HD-Zip • OsbZIP23 (Xiang et al. 2008) • WRKY11 (Wu et al. 2009), • OsMyb4 (Mattana et al. 2005) • SNAC1 (Hu et al. 2006) • Hahb4 (Dezar et al. 2005a) Mengubah jalur biosintesis atau ARR4 and ARR5 (Miyata level konjugat ABA, sitokinin et al. 1998) OsRR6 ( Jain et al. 2006) dan/atau brassinosteroid
15
bioinformatik. Konsorsium faktor transkripsi tanaman, menggunakan data dari 50 spesies tanaman, memperkirakan tanaman mengandung ribuan faktor transkripsi yang dibagi ke dalam 58 famili berdasarkan struktur dari domain penempelannya (binding domain) (Zhang et al. 2011). Jumlah ini diperkirakan akan meningkat dimasa mendatang seiring dengan bertambahnya spesies tanaman yang dipelajari. Setiap tanaman memiliki komposisi faktor transkripsi yang berbeda. Arabidopsis, misalnya, diprediksi mengandung 2023 faktor transkripsi yang dikelompokkan ke dalam 58 famili. Sementara padi Japonica dan Indica diprediksi masing-masing mengandung 2438 dan 1943 faktor transkripsi yang dikelompokkan kedalam 56 famili. Setiap famili memiliki anggota yang bervariasi jumlahnya mulai dari puluhan hingga ribuan anggota dan baru sedikit yang sudah dipelajari. Dari 58 famili faktor transkripsi yang ada pada tanaman beberapa dilaporkan terkait dengan toleran kekeringan, yaitu famili AP2/ERF, C2H2 Zinc finger, NF-YA, bZip, NAC, MYB, WRKY, dan HD-Zip. Beberapa contoh anggota dari masingmasing famili dan fungsi yang diperankan terkait dengan toleran kekeringan disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2
Contoh faktor transkripsi tanaman dan peranannya dalam respon kekeringan
Family AP2/ERF
Gen DREB
CBF4 HARDY
C2H2 Zinc Finger WRKY
GmERF3 SHN1/WIN1 dst BhWRKY1
NF-YA
NFYA5
MYB
MYB96
NAC bZip HD-Zip
AtMYB60 SNAC ONAC045 PtrABF Hahb4
Mekanisme Biosintesa osmoprotectan, protein LEA, & pengaturan pertumbuhan Pengaturan pertumbuhan Meningkatkan efisiensi penggunaan air (WUE) Biosintesa osmoprotektan Biosintesa lapisan lilin Pengaturan stomata
Pustaka Ito et al. 2006; Lopato & Langridge 2011
Signaling oligosakarida famili rafinosa Pengaturan stomata
Wang et al. 2009
Pengaturan lapisan kutikula Pengaturan stomata Pengaturan stomata
lilin
Scavenging ROS Pengaturan perpanjangan sel atau pertumbuhan
Haake et al. 2002 Karaba et al. 2007 Zhang et al. 2009 Aharoni et al. 2004 Huang et al. 2009
Li et al. 2008, Cominelli et al. 2010 Seo et al. 2011 Cominelli et al. 2005 Hu et al. 2006 Zheng et al. 2009 Huang et al. 2010 Dezar et al. 2005a
16
HD-Zip HD-Zip atau homeodomain leucin zipper protein adalah faktor transkripsi yang unik pada tumbuhan. Protein HD-Zip memiliki ciri yang unik yaitu adanya homeodomain (HD) dan leucin zipper motif yang penting untuk proses pembentukan protein dimer. Homo ataupun heterodimerisasi protein diperlukan dalam proses pengikatan DNA.
Faktor transkripsi HD-Zip ditemukan pada
berbagai tumbuhan, mulai dari tumbuhan tingkat rendah lumut (Sakakibara et al. 2001), paku (Aso et al. 1999), hingga tumbuhan tingkat tinggi poplar (Populus tricocarpa) (Robischon et al. 2011), dari kelas monokotil seperti padi (Agalou et al. 2008) dan jagung (Whipple et al. 2011), maupun dikotil misalnya Arabidopsis (Henriksson et al. 2005), bunga matahari (Manavella et al. 2008), dan tumbuhan gurun Craterostigma plantagineum (Deng et al. 2002), tanaman C3 padi dan tanaman C4 jagung. Pusat bioinformatik China memprediksi secara total ada 1419 gen dari famili HD-Zip pada tanaman yang sudah diidentifikasi (http://planttfdb.cbi. pku.edu.cn/).
Pada Arabidopsis thaliana, misalnya, terdapat 56 gen HD-Zip,
kemudian pada bunga matahari ada 15, sedangkan pada padi Indica dan pada padi Japonica secara berturut-turut adalah 46 dan 61 (Zhang et al. 2011). Gen HD-Zip ini dibagi kedalam empat sub-famili (I-IV) berdasarkan empat kriteria, yaitu; (1) konservasi domain HD-Zip yang menggambarkan spesifisitas pengikatan DNA, (2) struktur gen, (3) motif conserved tambahan, dan (4) berdasarkan fungsinya (Ariel et al. 2007). Perbedaan struktur protein dari masing-masing sub-famili diilustrasikan pada Gambar 2. Berdasarkan
hasil
penelitian
sebelumnya
pada
berbagai
tanaman
menunjukkan gen HD-Zip memiliki fungsi yang sangat beragam (Tabel 3). Beberapa protein HD-Zip yang terkenal adalah GLABRA dari sub-famili IV dan PHABULOSA, CORONA dan REVOLUTA dari sub-famili III. Gen GLABRA penting dalam pembentukan trikoma (Rerie et al. 1994), sedangkan gen REVOLUTA, PHABULOSA dan CORONA berperan dalam perkembangan daun, jaringan pembuluh dan inisiasi jaringan meristem (Prigge et al. 2005). Akhir-akhir ini gen dari faktor transkripsi HD-Zip khususnya sub-famili I dan II banyak dipelajari terkait respon kekeringan. Pada tanaman gurun yang sangat
17
toleran kekeringan Craterostigma plantagineum telah diisolasi 5 gen HD-Zip (CpHB3, 4, 5, 6, 7) responsif kekeringan (Deng et al. 2002). Sebelumnya, Frank et al. (1998) telah mengisolasi 2 gen HD-Zip (CpHB1 & 2) responsif kekeringan dari spesies yang sama. Namun, belum ada laporan lebih lanjut mengenai fungsi atau mekanisme toleran yang diperankan oleh masing gen HD-Zip ini dalam merespon kekeringan. Pada Arabidopsis 26 gen HD-Zip dari sub-famili I dan II telah berhasil diisolasi.
Empat (AtHB5, 6, 7, dan 12) diantaranya responsif
terhadap kekeringan. Kekeringan menurunkan ekspresi gen AtHB5 dan 6, dan sebaliknya meningkatkan ekspresi gen AtHB7 dan 12 (Ariel et al. 2007). Overekspresi gen AtHB7 dan 12 mengakibatkan tanaman menjadi lebih pendek karena panjang sel berkurang (Hjellstrom et al. 2003; Olsson et al. 2004), namun belum membuktikan bahwa gen AtHB7 dan 12 meningkatkan ketahanan terhadap kekeringan.
Penelitian yang menunjukkan bahwa gen HD-Zip meningkatkan
ketahanan tanaman terhadap kekurangan air dilaporkan oleh Dezar et al. (2005a) menggunakan gen Hahb-4 (HD-Zip sub-famili I) bunga matahari. Overekspresi Hahb-4 dengan promoter CaMV35S menyebabkan tanaman lebih toleran kekeringan dengan tingkat survival yang lebih tinggi dari tetuanya.
Hal ini
menunjukkan potensi pemanfaatan gen HD-Zip dalam perakitan tanaman toleran kekeringan di masa mendatang. Pada tanaman padi gen HD-Zip baru dipelajari beberapa tahun terakhir ini. Hasil analisis in silico terhadap sekuen utuh genom padi yang dilakukan oleh Agalou et al. (2008) berhasil mengidentifikasi 26 gen HD-Zip sub-famili I dan II. Delapan (yaitu OsHox4, 6, 11, 19, 20, 22, 24, dan 27) dari 26 gen HD-Zip tersebut responsif kekeringan pada dua varitas padi Zhensan97 (padi sawah sensitif kekeringan) dan IRAT109 (padi gogo toleran kekeringan) berdasarkan hasil analisis ekspresi menggunakan real-time PCR.
Overekspresi OsHox4
menggunakan promoter CaMV35S pada tanaman Arabidopsis dan padi meningkatkan ketahanan tanaman terhadap kekeringan. Namun, tanaman menjadi kerdil akibat ukuran sel yang pendek dan steril (Agalou et al. 2008). Hal ini mengindikasikan bahwa OsHox4 berperan dalam pemanjangan sel. Fungsi gen responsif kekeringan OsHox lainnya belum diketahui, sehingga analisis fungsi gen OsHox masih perlu dilakukan.
18
Gambar 2 Skema struktur protein unik dari setiap sub-famili HD-Zip. HD homeodomain, LZ leucin zipper, CPSCE asam amino konservatif Cys, Pro, Ser, Cys, Glu dengan sandi satu huruf, domain MEKHLA asam amino konservatif Met, Glu, Lys, His, Leu, Ala , N-term consensus ujung-N, SAD START-adjacent domain, START (steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer ( Ariel et al. 2007).
Tabel 3 Sub-famili HD-Zip dan fungsinya Sub-famili
Fungsi
HD-Zip I
Respon terhadap cekaman abiotik , respon terdap ABA, de-etiolasi, sinyal cahaya biru HD-Zip II Respon terhadap keadaan pencahayaan,toleran naungan (Shade avoidance), respon terhadap auxin HD-Zip III Embriogenesis, pengaturan meristem, inisiasi organ lateral, polaritas daun, perkembangan jaringan pembuluh, transport auxin HD-Zip IV Differensiasi sel epidermis, akumulasi antosianin, perkembangan akar, pembentukan trikom Sumber: Ariel et al. 2007
Analisis Fungsi Gen Tujuan jangka panjang dari proyek sekuensing genom adalah diketahuinya fungsi setiap gen yang ada di dalam genom dan bagaimana interaksinya dengan gen lain. Data ini sangat penting dalam memahami biologi tanaman pada level molekuler dan untuk memuliakan tanaman pada masa mendatang. Secara umum ada 2 pendekatan untuk melakukan analisis fungsi gen, yaitu dengan pendekatan forward dan reverse
genetic (Peters et al. 2003).
Forward genetic adalah
pendekatan yang digunakan untuk mengidentifikasi gen yang bertanggung jawab menentukan fenotipe tertentu dalam suatu organisme. Sebaliknya reverse genetic meliputi pendekatan yang digunakan untuk mengetahui fenotipe dari suatu gen tertentu.
19
Forward genetic secara umum dilakukan untuk mengindentifikasi gen atau mutasi gen yang menentukan fenotipe mutan yang spesifik. Fenotipe mutan yang spesifik menjadi bahan dasar kajian dari forward genetic.
Tanaman mutan
diperoleh dari hasil mutasi alam atau mutasi buatan. Mutasi alam terjadi sangat jarang dan kemungkinannya sangat kecil sehingga untuk mendapatkan populasi mutan yang besar diperlukan induksi mutasi. Ada beberapa pendekatan yang digunakan untuk menginduksi mutasi pada tanaman, yaitu dengan menggunakan senyawa kimia (mis. EMS, NaN 3 ), radiasi ion (mis. sinar gamma), transformasi T-DNA atau dengan penyisipan transposon (Ramachandran & Sundaresan 2001; Walden 2002; Kim et al. 2006; Al-Qurainy & Khan 2009; Suprasanna et al. 2009). Identifikasi gen dari mutan hasil induksi dengan senyawa kimia atau iradiasi sinar gamma membutuhkan proses yang panjang dan memerlukan waktu dan tenaga yang banyak karena harus menggunakan teknik map-based cloning (Peters et al. 2003). Sebaliknya, identifikasi gen pada mutan yang diperoleh dengan transformasi T-DNA dan penyisipan transposon lebih mudah dan cepat dengan menggunakan sequen yang ada pada daerah T-DNA atau transposon sebagai pelacak. Namun, keberhasilan insersi T-DNA dan transposon biasanya tergantung pada genotipe tanaman yang digunakan dan hanya dapat dilakukan pada tanaman dimana sistem transformasinya sudah dikuasai dengan baik (Gepts et al. 2008). Secara ringkas tahapan yang dilakukan untuk mengidentifikasi gen menggunakan teknik map-based cloning atau disebut juga positional cloning adalah; (1) membuat populasi mapping yang besar dengan menyilangkan tanaman mutan dengan tipe liarnya, (2) mengidentifikasi marka yang bertautan (linkage) erat dengan gen target, (3) mengidentifikasi pustaka YAC (yeast artificial chromosom) atau BAC (bacterial artificial chromosom) yang berhibridisasi dengan pelacak marka, (4) membuat atau mencari marker baru dari YAC atau BAC (biasanya sekuen dari ujung klon) yang berkosegregasi dengan gen target, (5) skrining ulang (jika diperlukan) dari klon YAC atau BAC yang berbeda untuk memperoleh marker yang berkosegregasi dengan gen target, (6) mengidentifikasi kandidat gen dari klon BAC atau YAC yang berkosegregasi dengan gen target, (7) melakukan komplementasi genetika, dengan transformasi kandidat gen ke
20
tanaman mutan, untuk memulihkan fenotipe tipe liar, dan terakhir (8) menyekuen gen dan mengidentifikasi sekuen untuk menentukan fungsinya (McClean 1998). Saat ini banyak teknik yang dikembangkan untuk memudahkan identifikasi gen pada tanaman menggunakan pendekatan insertional mutagenesis. Beberapa dari teknik tersebut adalah T-DNA tagging, transposon tagging, retrotransposon tagging, activation tagging, dan entrapmen tagging. Masing-masing memiliki keunggulan dan kelemahan (Jeon & An 2001; Ramachandran & Sundaresan 2001). DNA tagging atau gene tagging secara sederhana dapat diartikan sebagai penandaan atau pelabelan gen sehingga mudah dilacak. Pada dasarnya tahapan yang dilakukan untuk mengidentifikasi gen pada mutan hasil insertional mutagenesis adalah sama meskipun teknik insertional mutagenesis yang dipilih berbeda. Tahapan yang dilakukan meliputi (1) pembentukan populasi mutan yang besar menggunakan teknik transformasi tanaman, (2) karakterisasi molekuler mutan untuk mencari galur-galur dengan satu salinan, (3) penapisan galur mutan stabil dengan teknik PCR, (4) penapisan galur stabil dengan fenotipe yang diharapkan, (5) isolasi sekuen DNA yang mengapit daerah yang diberi label (mis. dengan thermal asymmetric interlaced (TAIL) PCR, adapter-ligated PCR, inverse PCR, atau plasmid rescue), (6) Sekuensing DNA yang mengapit daerah yang diberi label dan identifikasi sekuen untuk menentukan fungsinya dengan studi bioinformatik (Vandenbusschea et al. 2003). Pendekatan reverse genetic memanfaatkan data yang ada di pangkalan data hasil proyek sekuen genom, EST, atau transcript profiling.
Reverse genetic
dimulai dengan pemilihan gen target kemudian melihat pengaruh yang ditimbulkan terhadap fenotipenya akibat perubahan yang dibuat pada gennya. Secara umum pendekatan yang digunakan untuk mempelajari fungsi gen secara reverse genetika terdiri dari beberapa percobaan; (1) menghilangkan fungsi (loss of function) gen target, (2) meningkatkan fungsi (gain of function) gen target, (3) tracking
dan
(4)
kajian
ekspresi
(http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_
engineering) Percobaan untuk menghilangkan fungsi suatu gen melibatkan pembuatan atau manipulasi DNA secara in vitro dengan teknik tertentu sehingga gen tersebut menjadi tidak fungsional. Dalam menghilangkan fungsi suatu gen dikenal istilah
21
knockout dan silencing gen. Knockout gen menghilangkan fungsi gen dengan mengubah suatu sekuen gen menjadi tidak aktif sedangkan silencing gen menghilangkan
fungsi
gen
dengan
menghambat
proses
transkripsinya
(Thorneycroft et al. 2001). Knockout dapat dilakukan diantaranya dengan insersi T-DNA atau transposon (Thorneycroft et al. 2001), sedangkan silencing dapat dilakukan dengan teknik RNAi (Kusaba 2004).
Konstruk gen dari hasil
modifikasi ditransformasikan kembali ke dalam genom tanaman untuk melihat pengaruhnya pada fenotipe yang dikendalikan. Kegiatan meningkatkan fungsi (gain of function) suatu gen adalah kebalikan dari loss of function. Kegiatan ini biasanya diparalelkan dengan loss of function untuk mendapatkan data atau hasil yang lebih komprehensif. Prosesnya sama seperti loss of function hanya konstruknya dirancang untuk meningkatkan fungsi gen.
Umumnya dengan menambah ekstra salinan gen disertai dengan
penggunakan promoter yang lebih kuat (Lloyd 2003; Cho & Hong 2006) Tracking dilakukan untuk menggali informasi tentang lokalisasi dan interaksi protein terkait.
Salah satu cara untuk melakukan ini adalah
menggabungkan sekuen gen aslinya dengan gen pelapor misalnya green fluorescent protein (GFP) yang memudahkan visualisasi produk modifikasi genetika dalam sel atau jaringan tanaman (Boulin et al. 2006; Ko et al. 2007). Kajian ekspresi bertujuan mengetahui dimana dan kapan protein tertentu dihasilkan.
Dalam melakukan penelitian ekspressi gen, promoter gen target
difusikan dengan suatu gen pelapor (mis. gus, atau GFP) dan ditransformasikan kembali ke dalam sistem tanaman. Expresi gen kemudian diamati pada berbagai sel atau jaringan, pada tahap pertumbuhan tertentu, atau pada kondisi lingkungan tertentu (Boulin et al. 2006; Ko et al. 2007).
Transformasi Genetika Tanaman Transformasi genetika tanaman adalah salah satu teknik yang sangat penting dalam penelitian biologi molekuler dan pemuliaan tanaman.
Transformasi
genetika memungkinkan pemindahan dan penyisipan satu atau beberapa DNA/gen dari berbagai sumber (bakteri, fungi, hewan dan tumbuhan) ke dalam suatu genom tanaman. Teknik transformasi genetika pada tanaman secara umum dibagi ke
22
dalam 2 kelompok, yaitu teknik transformasi langsung (penembakan DNA, elektroporasi, mikroinjeksi, dan PEG), dan dengan bantuan bakteri Agrobacterium (Jahne et al. 1995; Komari et al. 1998; Tzfira & Citovsky 2006).
Teknik
transformasi secara langsung dapat diaplikasikan pada berbagai jenis tanaman, namun cenderung menyisipkan gen dengan jumlah salinan banyak pada satu lokus (Dai et al. 2001).
Hal ini menyebabkan tingginya DNA rearrangement
(penyusunan kembali) atau pembungkaman gen, sehingga dapat menimbulkan kesalahan dalam interpretasi data (Kohli et al. 1998; Reddy et al. 2003). Transformasi Agrobacterium merupakan teknik yang paling umum digunakan saat ini, karena memiliki kelebihan antara lain tidak memerlukan peralatan yang mahal, dapat diaplikasikan secara luas baik pada kelompok tanaman dikotil maupun monokotil, pola integrasi DNA lebih mudah diprediksi dan yang paling penting adalah kemungkinan untuk mendapatkan tanaman dengan satu salinan gen sangat tinggi (Roy et al. 2000; Dai et al. 2001). Tanaman homozigot dengan satu salinan gen sangat penting didalam pemuliaan tanaman dan kajian fungsi gen karena tanaman dianggap sudah stabil dan lebih mudah dalam interpretasi datanya. Secara alami Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen tanah yang
dapat
menyebabkan
dikotiledoneae.
penyakit
Dalam
tumor
sistematika
pada
tumbuhan
mikroorganisme
dari
kelas
Agrobacterium
diklasifikasikan sebagai berikut: Kingdom
: Bacteria
Phylum
: Proteobacteria
Class
: Alpha Proteobacteria
Ordo
: Rhizobiales
Famili
: Rhizobiaceae
Genus
: Agrobacterium (http://en.wikipedia.org/wiki/ Agrobacte
rium) Tumor disebabkan oleh suatu plasmid Agrobacterium yang sangat besar yang kemudian disebut dengan plasmid Ti (Tumor inducing).
Plasmid Ti
mengandung T-DNA yang diapit oleh 23 pasang sekuen basa berulang dan satu set gen virulen (virA, virB, virC, virD, virE, virG, dan virH) yang diperlukan
23
untuk mengangkut T-DNA dari sel bakteri dan menyisipkannya ke dalam genom tanaman. T-DNA mengandung gen penyandi senyawa opine (octopin, nopalin, atau leucinopin) yang diperlukan oleh Agrobacterium dan gen penyandi hormon pertumbuhan tanaman yang mengakibatkan pertumbuhan sel tidak terkendali dan membentuk tumor. Proses transfer gen oleh Agrobacterium sudah banyak diulas sebelumnya diantaranya oleh Sheng dan Citovsky (1996) dan Tinland (1996). Hasil penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa T-DNA dapat dipisahkan secara fisik dari gen virulen menjadi dua plasmid yang terpisah yang kemudian dikenal dengan sistim biner (Hoekema et al. 1984). Sifat onkogenik tetap terpelihara selama kedua plasmid berada di dalam Agrobacterium yang sama. Selanjutnya setiap DNA asing yang disisipkan ke dalam T-DNA dapat ditransfer ke dalam sel tanaman. Hal ini sangat menguntungkan karena plasmid lebih kecil dan mudah dimanipulasi. Selanjutnya onkogen dapat dihilangkan dari T-DNA agar tanaman tumbuh normal, dan situs restriksi unik ditambahkan untuk memudahkan penyisipan gen asing (Riva et al. 1998; Lee & Gelvin 2008). Transformasi Agrobacterium kemudian digunakan secara luas pada tanaman dikotil, namun tidak pada monokotil karena tanaman dari kelompok ini bukan inang dari Agrobacterium. Keberhasilan transformasi dari kelompok monokotil pertama kali dilaporkan oleh Hiei et al. (1994) pada tanaman padi Japonica kultivar Tsukinohikasi, Asanohikari, dan Koshihikari. Dari berbagai eksplan yang diuji, kalus embriogenik dari skutellum umur tiga hari adalah bahan yang paling sesuai untuk infeksi Agrobacterium. Kalus diko-kultivasi dengan A. tumefaciens strain LBA4404 dan EHA101, masing-masing mengandung plasmid pTOK233 atau pIG121Hm, selama tiga hari pada media mengandung 100 µM asetosyringon. Plasmid pTOK233 dan pIG121Hm masing-masing mengandung gen penanda gus dan penyeleksi hpt. Hasil analisis berdasarkan gen β-glucuronidase (gus) dan gen penyeleksi hygromycin phosphotransferase (hpt) pada tanaman transgenik R1 dan R2 menunjukkan integrasi, ekspresi, dan pewarisan gen yang stabil (Hiei & Komari 1996). Meskipun efisiensi transformasi Agrobacterium masih dianggap rendah pada saat itu dan sulit untuk padi Indica, penelitian ini telah menginspirasi peneliti untuk meningkatkan efisiensi transformasi pada tanaman padi. Faktorfaktor yang mempengaruhi keberhasilan transformasi pada tanaman banyak
24
dipelajari, diantaranya pengaruh genotipe tanaman, strain Agrobacterium, plasmid, senyawa penginduksi gen virulen (vir), komposisi media, dan jaringan yang digunakan (Opabode 2006). Faktor lain yang juga penting menentukan keberhasilan transformasi tanaman adalah perlakuan osmotik pada eksplan, lama ko-kultivasi,
kerapatan
A.
tumefaciens,
pengeringan
eksplan,
perlakuan
antinekrotik, suhu selama ko-kultivasi, penambahan surfaktan, media inokulasi dan ko-kultur, antibiotik dan agen penyeleksi yang digunakan.
Saat ini
transformasi tanaman padi Japonica sangat mudah dilakukan dengan efisiensi transformasi yang tinggi. Selanjutnya protokol transformasi untuk tanaman padi Indica juga sudah tersedia (Toki 1997; Saharan et al. 2004; Lin & Zhang 2005; Hiei & Komari 2006). Sejumlah sifat agronomi penting telah ditransformasi ke dalam genom tanaman padi dengan bantuan Agrobacterium untuk meningkatkan ketahanan cekaman biotik dan abiotik, dan meningkatkan kualitas nutrisinya (Roy et al. 2000). Higga saat ini Agrobacterium masih dianggap sebagai satu-satunya genus bakteri yang mampu melakukan transfer gen ke dalam genom tanaman dan digunakan secara luas pada tanaman termasuk padi.
Namun, kebanyakan
teknologi yang terlibat di dalamnya dilindungi oleh paten di berbagai belahan dunia, yang kebanyakan dipegang oleh perusahaan multi nasional. Hal ini dapat menjadi kendala dalam pemanfaatan teknik ini untuk pemuliaan tanaman (Jambresic 2005), sehingga ada upaya untuk mencari bakteri alternatif selain Agrobacterium. Adanya kenyataan bahwa gen virulen dan T-DNA yang terlibat dalam transfer gen tidak dipatenkan kemudian dimanfaatkan untuk merekayasa bakteri selain Agrobacterium untuk digunakan sebagai agen transfer gen. Ide ini pertama kali direalisasikan oleh Broothaerts et al. (2005) yang merekayasa bakteri dari golongan Rhizobia agar dapat dimanfaatkan sebagai agen transfer gen. Bakteri yang tergolong ke dalam kelompok Rhizobia adalah bakteri tanah yang sudah lama dikenal berasosiasi dengan tanaman membentuk bintil akar yang penting untuk proses fiksasi nitrogen dari udara (Weir 2011).
Contoh bakteri yang
tergolong ke dalam kelompok Rhizobia adalah Rhizobium, Mesorhizobium,
25
Ensifer/Shinorhizobium, dan Bradyrhizobium.
Semua masuk dalam famili
Rhizobiaceae. Proses transfer gen yang terjadi pada Rhizobia hasil rekayasa adalah dengan melibatkan gen virulen dan T-DNA dari Agrobacterium (Broothaerts et al. 2005). berbagai
Ti plasmid dimodifikasi sehingga lebih mudah dimobilisasikan ke genus
Rhizobia
termasuk
Rhizobium,
Sinorhizobium
dan
Mesorhizobium. Bakteri ini kemudian diuji dengan mentransformasikannya ke tiga tanaman model dari latar belakang genetika yang berbeda, yaitu padi, tembakau dan Arabidopsis. Ketiga spesies ini mampu melakukan transfer gen pada ketiga tanaman model meskipun dengan efisiensi yang rendah. Efisiensi transformasi padi dengan S. meliloti hanya 0.6% berdasarkan uji GUS dibandingkan
dengan
50-80%
menggunakan
transformasi
dengan
memperhatikan
Agrobacterium.
faktor-faktor
yang
Optimasi
mempengaruhi
keberhasilan transformasi pada tanaman perlu dilakukan untuk meningkatkan efisiensi transformasi tanaman dengan bantuan Rhizobia. Frekuensi yang rendah transformasi Agrobacterium pada beberapa spesies atau kultivar yang sulit, secara perlahan dapat ditingkatkan dengan manipulasi pada 20 tahun yang lalu (Gelvin 2005).
Hingga
saat
ini
informasi
tentang
penggunaan
Agrobacterium sebagai agen transfer masih sangat terbatas.
bakteri
selain
III. ANALISIS KOMPARATIF TRANSFORMASI GENETIKA PADI MENGGUNAKAN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS DAN RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM Abstrak Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan teknik transformasi Rhizobium dengan teknik transformasi yang paling banyak digunakan saat ini, yaitu transformasi Agrobacterium, pada tiga kultivar padi Ciherang (Indica), Nipponbare (Japonica), and Rojolele (Javanica). Kalus umur 6 hari yang diinduksi dari embrio padi masak susu (immature) diko-kultivasi dengan Rhizobium leguminosarum bv trifolii ANU845 dan Agrobacterium tumefaciens LBA288 yang membawa plasmid pCAMBIA 5106. Plasmid pCAMBIA 5106 ini mengandung satu set minimal gen virulen dan T-DNA yang penting dalam proses transfer gen. Didalam T-DNA terdapat gen GUSPlus dan gen hpt masing-masing dikendalikan oleh promoter CaMV 35S. Hasil penelitian menunjukkan bahwa efisiensi transformasi (jumlah tanaman PCR positif hpt dibagi jumlah kalus yang diinokulasi) bervariasi antara 1,14 hingga 12,05% tergantung pada genotipe dan bakteri yang digunakan. Efisiensi transformasi dan regenerasi tertinggi (12,05% dan 59,38%) diperoleh pada Ciherang yang ditransformasi dengan R. leguminosarum. Hampir semua tanaman transgenik yang diperoleh baik hasil transformasi dengan Agrobacterium maupun Rhizobium secara morfologi normal dan fertil. Integrasi, ekspresi dan pola pewarisan gen dibuktikan dengan analisis molekuler dan genetika pada tanaman T0 dan T1. Kata Kunci:
Rhizobium leguminosarum, padi, embrio padi masak susu, Agrobacterium tumefaciens
Abstract This study was aimed to study the effectiveness of Rhizobium transformation system compared to the most widely used Agrobacterium mediated transformation system on three rice cultivars, Ciherang (Indica), Nipponbare (Japonica), and Rojolele (Javanica). Six day old calli induced from immature embryos were inoculated with Rhizobium leguminosarum bv trifolii ANU845 and Agrobacterium tumefaciens LBA288 that harbored with pCAMBIA 5106. pCAMBIA 5106 is a cointegrate plasmid that contains a minimum set of transfer machinery genes and had a GUSPlus and an hpt gene driven by 35S CaMV promoter in the T-DNA. The results showed that the transformation frequencies (number of PCR positive plants per number of calli inoculated) ranging from 1,14 to 12.05 % depend on the genotype and transfer agent used. The highest transformation and regeneration frequency (12.05% and 59.38% respectively) was obtained in Ciherang transformed with R. leguminosarum. Most of the transgenic rice obtained by Rhizobium transformation were normal in morphology and fertile similar to those obtained by Agrobacterium transformation. Integration, expression and inheritance of transgenes were demonstrated by molecular and genetic analysis in T0 and T1 generations. Keywords: Rhizobium leguminosarum, rice, immature embryos, Agrobacterium tumefaciens
28
Pendahuluan
Transformasi Agrobacterium adalah teknik yang paling banyak digunakan saat ini karena memberikan peluang yang tinggi untuk memperoleh tanaman dengan salinan gen tunggal. Tanaman transgenik yang memiliki satu salinan gen sangat penting untuk memudahkan analisis fungsi gen.
Namun, metode
transformasi dengan Agrobacterium pada tanaman dilindungi oleh ratusan paten di berbagai belahan dunia (Rodriguez & Nottenburg 2003; Chilton 2005; Nottenburg & Rodriguez 2007).
Paten-paten ini umumnya dipegang oleh
perusahaan multinasional, sehingga menghambat pemanfaatan teknologi ini untuk pengembangan pertanian terutama bagi negara-negara berkembang. Oleh karena itu, untuk menghindari paten pada metode transformasi Agrobacterium, penggunaan bakteri selain Agrobacterium akan sangat membantu upaya perbaikan genetika tanaman di masa mendatang. Keberhasilan penggunaan bakteri selain Agrobacterium (Rhizobium spp NGR234, Shinorhizobium meliloti, dan Mesorhizobium loti) sebagai agen transformasi untuk pertama kalinya dilaporkan oleh Broothaerts et al. (2005) pada tanaman model Arabidopsis thaliana, tembakau, dan padi dengan efisiensi transformasi yang rendah. Wendt et al. (2010) melaporkan keberhasilan ketiga Rhizobia ini melakukan transfer gen pada tanaman kentang dengan efisiensi transformasi bervariasi antara 1,86-5,85%.
Rhizobia sudah lama dikenal
berinteraksi dengan tanaman. Rhizobia adalah sekelompok bakteri tanah yang membentuk suatu simbiosis mutualisme berupa nodul atau bintil akar untuk mengikat nitrogen (N2) bebas dari udara dan mengubahnya menjadi ammonia (NH4) dan ion nitrat (NO3-)yang berguna untuk tanaman. Bakteri simbiotik ini telah direkayasa untuk membuat mereka mampu melakukan transfer gen. Proses transfer gen pada Rhizobia terjadi dengan memanfaatkan sekelompok gen virulen dari plasmid extrakromosom Ti (Tumor-inducing) yang telah dimodifikasi. Gen-gen virulen ini berperan penting dalam proses penyisipan T-DNA ke dalam inti sel tanaman. Spesies Rhizobia hasil modifikasi genetika ini mampu melakukan transfer gen pada ketiga tanaman model yang digunakan, meskipun efisiensi transformasinya rendah.
Efisiensi transformasi padi
29
menggunakan S. meliloti, misalnya, hanya 0,6% (dibandingkan dengan 50-80% dengan
Agrobacterium).
Perbaikan
faktor–faktor
yang
mempengaruhi
keberhasilan transfer dan integrasi T-DNA ke dalam genom tanaman, seperti: eksplan, vektor-plasmid, strain bakteri, senyawa fenolik sintetik penginduksi gen virulen, komposisi media kultur, eliminasi bakteri pasca infeksi, dan pengeringan eksplan (Roy et al. 2000; Opabode 2006), mungkin dapat meningkatkan efisiensi transformasi. Efisiensi transformasi Agrobacterium yang rendah pada banyak jenis tanaman yang sulit ditransformasi meningkat secara substansial selama 20 tahun terakhir dengan memanipulasi faktor-faktor tersebut (Gelvin 2005). Pada penelitian ini dua sistim transformasi, yaitu Agrobacterium dan Rhizobium, dibandingkan.
Penelitian ini dimaksudkan untuk mengevaluasi
efisiensi Rhizobium dalam mentransfer gen ke dalam genom tanaman padi dan membandingkannya dengan Agrobacterium tumefaciens. Untuk tujuan tersebut penelitian ini difokuskan pada efisiensi regenerasi dan transformasi masingmasing sistem, ekspresi gen target, kecenderungan jumlah salinan gen, pola pewarisan gen, dan penampilan morfologi dan fertilitas tanaman.
Bahan dan Metode
Bahan Tanaman dan Induksi Kalus Benih padi varietas Ciherang, Rojolele, dan Nipponbare ditanam di rumah kaca. Kalus berumur enam hari yang diinduksi dari embrio padi masak susu (1012 hari setelah antesis) digunakan untuk bahan transformasi. Benih dikupas dan disterilisasi dengan 70% etanol selama satu menit dilanjutkan dengan 2,5% larutan natrium klorida (NaClO) yang mengandung setetes Tween 20 selama 15 menit.
Benih kemudian dicuci beberapa kali dengan air steril untuk
menghilangkan larutan NaClO.
Embrio dikeluarkan dengan menekan benih
menggunakan pinset steril dalam laminar, selanjutnya ditanam pada media induksi kalus (Tabel 4) dan disimpan pada kondisi gelap selama 6 hari.
30
Strain Bakteri dan Plasmid Agrobacterium
tumefaciens
LBA288
(pCAMBIA5106),
Rhizobium
leguminosarum bv trifolii ANU845 (pCAMBIA5106), dan Agrobacterium tumefaciens LBA288 (pCAMBIA0105), diperoleh dari CAMBIA Australia. Agrobacterium tumefaciens strain LBA288 adalah strain avirulen yang tidak memiliki plasmid Ti.
Plasmid pCAMBIA0105 adalah plasmid biner yang
memiliki gen GUSPlus dan hpt di dalam T-DNA. Agrobacterium tumefaciens LBA288 membawa vektor pCAMBIA0105 digunakan sebagai kontrol negatif untuk transfer DNA. Plasmid pCAMBIA 5106 adalah plasmid cointegratif yang memiliki satu set minimum gen vir dan T-DNA. Pada daerah T-DNA terdapat gen pelapor GUSPlus yang memiliki intron, dan gen penyeleksi hpt (Gambar 3).
Transformasi dan Regenerasi Transformasi dan regenerasi kalus Ciherang dilakukan mengikuti Hiei dan Komari (2006) dengan beberapa modifikasi.
Sedangkan transformasi dan
regenerasi Rojolele dan Nipponbare dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Slamet-Loedin et al. (1996) dan Hiei et al. (1994) dengan beberapa modifikasi. Agrobacterium atau Rhizobium dibiakkan selama 3 hari pada media LB atau YM yang mengandung antibiotik rifampisin 20 mgL-1 dan kanamisin 50 mgL-1, pada suhu 28 oC. Bakteri disuspensi dalam media infeksi R2 yang mengandung 0,5 mM acetosyringone hingga mencapai OD600 0,275.
Setiap kalus ditetesi 5μl
suspensi bakteri selanjutnya disimpan pada kondisi gelap. Enam hari kemudian kalus dipindahkan ke media seleksi yang sesuai mengandung higromisin 50 mgL-1 dan antibiotik cefotaksim 100 mgL-1 dan timentin 150 mgL-1 (Tabel 4). Kalus tahan higromisin diregenerasikan pada media regenerasi yang sesuai (Tabel 4). Planlet dipindahkan ke media ½MS yang diperkaya dengan 1 mgL-1 NAA untuk memperbaiki perakaran.
Uji GUS Uji histokimia GUS pada kalus 6-hari setelah ko-kultivasi dan daun tanaman transgenik dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Hiei et al. (1994).
31
Gambar 3 T-DNA di dalam pCAMBIA 5106. Sepasang primer, forward (FP) and reverse (RP), digunakan untuk memperbanyak daerah penyandi gen hpt. Produk PCR (P) digunakan sebagai pelacak pada analisis Southern. Uji Higromisin Dari setiap tanaman yang diuji dipilih satu daun hijau dan sehat. Untuk keseragaman dipilih daun yang paling muda yang telah membuka sempurna. Daun ditandai dengan membuat 3 garis menggunakan spidol tahan air. Sebanyak 5 µl larutan higromisin (0,2 mgml-1 higromisin B, 0,5% gelatin, 0,001% triton-X) diteteskan pada setiap garis, dua garis (ulangan) setiap daun.
Reaksi tanpa
higromisin digunakan sebagai kontrol. Pengamatan dilakukan pada hari keempat setelah penetesan. Daun dengan gejala nekrotik mengindikasikan tanaman tidak mengekspresikan
higromisin
phosphotransferase,
sehingga
mendetoksifikasi
higromisin
B.
tetap
Daun
yang
tidak
hijau,
mampu
sebaliknya,
mengindikasikan tanaman mengekspresikan higromisin phosphotransferase.
PCR DNA diekstraksi dari daun seperti yang dijelaskan oleh Heusden et al. (2000).
Sepasang primer, forward 5'-GCATCTCCCGCCGTGCAC-3 'dan
reverse 5'-GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3 digunakan untuk mengamplifikasi daerah penyandi gen hpt. Reaksi perbanyakan gen hpt adalah 1 µl sampel DNA, 2,5 pM masing-masing primer, dan 6,5 µl GoTaq ® Green Master Mix (Promega) dan air hingga mencapai total reaksi 12,5 µl. Perbanyakan DNA dilakukan dengan kondisi PCR sebagai berikut: satu siklus denaturasi awal pada suhu 95 ºC selama 3 menit, 35 siklus dimana denaturasi pada suhu 95 ºC selama 1 menit, annealing pada suhu 60 ºC selama 1 menit dan perpanjangan pada 72 ºC selama 1 menit, dan satu siklus polimerisasi DNA pada suhu 72 oC selama 10 menit. agarosa.
Produk PCR dipisahkan dengan elektrophoresis mengunakan 1% gel
32
Tabel 4 Media yang digunakan untuk transformasi tiga varietas padi (Ciherang, Nipponbare, dan Rojolele). Tujuan Induksi kalus
Infeksi
Varietas Rojolele
Media LS
Nipponbare
NB1
Ciherang
NB2
Rojolele Nipponbare Ciherang Rojolele
R2
Komposisi MS garam mayor, MS garam minor, LS vitamin, 30 gl-1 sukrosa, 2,5 mgl-1 2,4-D, 2,5 gl-1 phytagel, pH 5,8 N6 garam mayor, B5 garam minor, B5 vitamin, 0,3 gl-1 casamino acids, 0,5 gl-1 L-prolin, 0,5 gl-1 L-glutamin, 30 gl-1 sukrosa, 2,5 mgl-1 2,4-D, 2,5 gl-1 phytagel, pH 5,8 N6 garam mayor, B5 garam minor, B5 vitamin, 0,5 gl-1 casamino acids, 0,5 gl-1 L-prolin, 20 gl-1 sukrosa, 10 gl-1 Dglukosa, 2 mgl-1 2,4-D, 1 mgl-1 NAA, 1mgl-1 BAP, 5,5 gl-1 agarose type I, pH 5,8 R2 garam mayor, R2 garam minor, LS vitamin, 10 gl-1 Dglukosa, 2,5 mgl-1 2,4-D, 0,5 mM acetosyringone, pH 5.2
MS garam mayor, MS garam minor, LS vitamin, 30 gl-1 sukrosa, 2,5 mgl-1 2,4-D, 0,1 mM acetosyringone, 2,5 gl-1 phytagel, pH 5,2 Nipponbare R2-As R2 garam mayor, R2 garam minor, LS vitamin, 10 gl-1 Dglukosa, 2,5 mgl-1 2,4-D, 0,1 mM acetosyringone, 2,5 gl-1 phytagel, pH 5,2 Ciherang NB-As N6 garam mayor, B5 garam minor, B5 vitamin, 0,5 gl-1 casamino acids, 0,5 gl-1 prolin, 20 gl-1 sukrosa, 10 gl-1 Dglukosa, 2 mgl-1 2,4-D, 1 mgl-1 NAA, 1 mgl-1 BAP, 0,1 mM acetosyringone, 5,5 gl-1 agarose type I, pH 5,2 Seleksi Rojolele LS MS garam mayor, MS garam minor, LS vitamin, 30 gl-1 sukrosa, 2,5 mgl-1 2,4-D, 100 mgl-1 higromisin, 100 mgl-1 cefotaxime, 150 mgl-1 timentin, 2,5 gl-1 phytagel, pH 5,8 Nipponbare R2 R2 garam mayor, R2 garam minor, LS vitamin, 30 gl-1 sukrosa, 2,5 mgl-1 2,4-D, 50 mgl-1 higromisin, 100 mgl-1 cefotaxime, 150 mgl-1 timentin, 2.5 gl-1 phytagel, pH 6,0 Ciherang NBM N6 garam mayor, B5 garam minor, B5 vitamin, 0,5 gl-1 casamino acids, 0,5 gl-1 prolin, 0,3 gl-1 L-glutamin, 20 gl1 D- maltosa, 36 gl-1 D-mannitol, 2 mgl-1 2,4-D, 1 mgl-1 NAA, 0.2 mgl-1 BAP, 50 mgl-1 higromisin, 100 mgl-1 cefotaxime, 150 mgl-1 timentin, 5 gl-1 Gelrite, pH 5,8 PraCiherang NBPR N6 garam mayor, B5 garam minor, B5 vitamin, 0,5 gl-1 regenerasi casamino acids, 0,5 gl-1 L-prolin, 0,3 gl-1 L-glutamin, 30 gl-1 D- maltosa, 2 mgl-1 2,4-D, 1 mgl-1 NAA, 1 mgl-1 BAP, 7 gl-1 Gelrite, pH 5,8 Regenerasi Rojolele, LS MS garam mayor, MS garam minor, LS vitamin, 40 gl-1 Nipponbare sukrosa, 0,5 mgl-1 IAA, 0,3 mgl-1 BAP, 3,75 gl-1 phytagel, pH 5,8 Ciherang RNM N6 garam mayor, B5 garam minor, B5 vitamin, 0,3 gl-1 casamino acids, 0,3 gl-1 L-prolin, 0,3 gl-1 L-glutamin, 30 gl-1 D- maltosa, 1 mgl-1 NAA, 3 mgl-1 BAP, 4 gl-1 agarose type I, pH 5,8 Perkem Ciherang ½MS ½ MS garam mayor, MS garam minor, B5 vitamin, 10 gl-1 bangan sukrosa, 2 mgl-1 NAA, 2,5 gl-1 phytagel, pH 5,8 planlet Rojolele, ½MS ½ MS garam mayor, MS garam minor, B5 vitamin, 10 gl-1 Nipponbare sukrosa, 0,05 mgl-1 NAA, 2,5 gl-1 phytagel, pH 5,8 Sumber: modifikasi dari Hiei et al. (1994); Hiei & Komari (2006); dan Slamet Loedin et al. (1996). Kokultivasi
LS
33
Analisis Southern Blot DNA genom total diekstrak dari daun segar tanaman transgenik positif PCR hpt seperti yang dijelaskan oleh Lodhi et al. (1994). Sampel DNA dipotong dengan enzim restriksi EcoRI. Southern blot dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Sambrook et al. 1989).
Fragmen DNA hasil PCR (492 bp)
menggunakan primer spesifik untuk gen hpt (Gambar 3) digunakan sebagai pelacak. Pelacak dilabel dan dideteksi dengan Alkphos labelling and detection system dari GE Healthcare (Amersham Bioscience) mengikuti petunjuk produsen.
Morfologi dan Fertilitas Tanaman Transgenik Tinggi tanaman, jumlah anakan total, jumlah anakan produktif, jumlah benih total dan jumlah benih bernas diamati pada galur terpilih hasil transformasi dengan menggunakan Agrobacterium dan Rhizobium.
Pengamatan dilakukan
pada fase akhir pertumbuhan padi.
Hasil Efisiensi Regenerasi dan Transformasi Pada penelitian ini, efisiensi regenerasi dan transformasi padi sangat bervariasi tergantung pada agen transformasi dan genotipe tanaman yang digunakan. Seperti yang diharapkan, kalus yang ditransformasi dengan strain avirulent (tidak memiliki plasmid Ti) Agrobacterium tumefaciens LBA288 membawa plasmid biner pCAMBIA0105 tidak menghasilkan kalus dan planlet tahan higromisin. Efisiensi regenerasi tanaman padi yang ditransformasi dengan R. leguminosarum lebih tinggi dibandingkan dengan A.tumefaciens pada ketiga genotipe tanaman yang diteliti. Efesiensi regenerasi tertinggi (59,38%) diperoleh pada padi varietas Ciherang yang ditransformasi dengan R. leguminosarum (Tabel 5). Keberadaan gen hpt dianalisis dengan PCR (Gambar 4) pada semua kandidat tanaman transgenik. Hasil PCR menunjukkan bahwa sebahagian besar tanaman hasil transformasi positif mengandung gen hpt, hanya 7% tanaman escape (tidak mengandung transgen).
Efisiensi transformasi, yaitu jumlah
tanaman PCR positif dibagi jumlah kalus yang diinokulasi, antara ketiga kultivar
34
bervariasi dari 1,14% hingga 12,05% tergantung pada genotipe tanaman dan strain bakteri yang digunakan (Tabel 5).
Efisiensi transformasi kalus yang diko-
kultivasi dengan Rhizobium lebih tinggi dibandingkan dengan Agrobacterium pada ketiga genotipe padi yang diteliti. Efisiensi transformasi tertinggi (12,05%) diperoleh dari Ciherang yang ditransformasi dengan Rhizobium diikuti oleh Nipponbare (7,95%) yang diko-kultivasi dengan Rhizobium. Sebaliknya, efisiensi transformasi Ciherang dan Nipponbare yang diinfeksi dengan Agrobacterium secara berturut-turut adalah 3,41% dan 1,14%.
Efisiensi transformasi pada
Rojolele sangat rendah dibandingkan dengan Ciherang dan Nipponbare baik ketika ditransformasi dengan Agrobacterium (1,14%) maupun dengan Rhizobium (2,05%). Tabel 5
Efisiensi transformasi tiga varietas padi hasil transformasi dengan Rhizobium leguminosarum dan Agrobacterium tumefaciens.
Varietas
Bakteri
Total kalus di infeksi *
Ciherang
Rl At Rl At Rl At
440 440 440 440 440 440
Nipponbare Rojolele
Jumlah kalus tahan higro misin 96 43 127 50 154 103
Jumlah planlet**
Efisiensi regenerasi
Tanaman positif PCR hpt
Efisiensi transfor masi (%)***
57 16 37 6 9 5
59.38 37.21 29.13 12.00 5.84 4.85
53 15 35 5 9 5
12.05 3.41 7.95 1.14 2.05 1.14
Keterangan: Rl R. leguminosarum (pCAMBIA5106), At A. tumefaciens LBA288 (pCAMBIA5106) * jumlah eksperimen masing-masing 11 **Tanaman /planlet independen, tanaman berasal dari kalus berbeda, hanya diambil 1 tanaman per kalus *** Jumlah tanaman + PCR dibagi jumlah kalus yang diinfeksi
Gambar 4
Amplifikasi fragmen gen hpt tanaman transgenik terpilih hasil transformasi dengan A. tumefaciens atau R. leguminosarum pembawa plasmid pCAMBIA 5106. λ. Marka DNA λHindIII, P: Plasmid pCAMBIA5106, C: DNA tanaman positif mengandung hpt, N: DNA tanaman tidak ditransformasi, W: Kontrol reaksi.
35
Ekspresi Gen GUSPlus dan hpt Hasil uji GUS dan higromisin pada daun tanaman transgenik hasil transformasi dengan perantara Agrobacterium maupun Rhizobium menunjukkan ekspresi GUS dan HPT dengan intensitas yang bervariasi (Gambar 5). Tabel 6 menunjukkan bahwa sebahagian besar tanaman positif PCR hpt, baik hasil transformasi
dengan
Agrobacterium maupun
Rhizobium mengekpresikan
higromisin. Sejumlah tanaman yang berdasarkan uji GUS atau higromisin negatif atau nekrotik terbukti mengandung gen hpt berdasarkan PCR.
Hal ini
mengindikasikan terjadinya fenomena pembungkaman (silencing). Fenomena ini telah dilaporkan sebelumnya pada padi (Lin & Zhang 2005) dan tanaman lainnya (Li et al. 2002).
T1
T2
NC
R. leguminosarum bv trifolii ANU45
- hygromisin
A. tumefaciens LBA288
+ higromisin
Tidak ditransformasi
a
1 mm
b
Gambar 5 Daun tanaman padi transgenik yang mengekspresikan β-glucuronida se (a), dan higromisin fosfotransferase (b). T1 daun tetap hijau mengindikasikan ekspresi higromisin fosfotransferase, T2 daun nekrotik mengindikasikan tidak ada ekspresi higromisin fosfotrans ferase, dan NC daun tanaman yang tidak ditransformasi Tabel 6 Ekspresi GUS dan HPT pada tiga varietas padi hasil transformasi dengan Rhizobium leguminosarum dan Agrobacterium tumefaciens berdasarkan uji GUS dan higromisin pada daun Varietas
Agen transformasi
Jumlah planlet
Jumlah tanaman positif PCR hpt
Ciherang
R. leguminosarum A. tumefaciens R. leguminosarum A. tumefaciens R. leguminosarum A. tumefaciens
57 16 37 6 9 5
53 15 35 5 9 5
Nipponbare Rojolele
Jumlah tanaman independen tahan higromisin 43 13 30 5 6 4
Jumlah tanaman independen mengekspresi kan GUS 38 13 23 3 6 3
36
Jumlah Salinan Gen Jumlah salinan gen hpt dianalisis dengan analisis Southern (Gambar 6). Masing-masing 20 tanaman hasil transformasi Agrobacterium atau Rhizobium yang sudah diketahui PCR positif hpt dipilih untuk dievaluasi lebih lanjut. Jumlah rata-rata salinan gen hpt pada tanaman hasil transformasi dengan Rhizobium dan Agrobacterium tidak berbeda nyata, secara berturut-turut adalah 1,20 dan 1,35 (Tabel 7). Namun, frekuensi tanaman transgenik mengandung satu salinan gen (hpt) untuk padi yang diinfeksi dengan Rhizobium lebih tinggi (85%) dibandingkan dengan padi yang diinfeksi dengan Agrobacterium (70%). Pola Segregasi Pola segregasi gen hpt pada tanaman hasil transformasi dengan Rhizobium diamati berdasarkan hasil PCR populasi tanaman T1 dari 4 galur terpilih. Setiap populasi terdiri dari 30 progeni. Hasil analisis chi-square menunjukkan bahwa gen hpt diwariskan mengikuti pola segregasi Mendel dengan rasio segregasi 3:1 untuk galur Rc162, Rc208, dan Rc214, dan 15:1 untuk galur Rc203 (Tabel 8). Hal ini mengindikasikan bahwa transgen terintegrasi dalam genom padi secara berturut-turut pada satu dan dua lokus independen (Clemente et al. 2000).
Gambar 6 Contoh hasil hibridisasi Southern. DNA diisolasi dari daun padi Ciherang (a) dan Nipponbare (b) hasil transformasi dengan R. leguminosarum bv trifolii ANU845 (pCAMBIA5106) dan A. tumefaciens LBA288(pCAMBIA5106). Sampel DNA PCR positif hpt, dipotong dengan EcoRI . Produk PCR hasil perbanyakan daerah penyandi gen hpt digunakan sebagai pelacak. P: Plasmid utuh pCAMBIA5106, C: Ciherang dan N: Nipponbare kontrol tidak ditransformasi.
37
Tabel 7 Prakiraan jumlah gen hpt pada galur tanaman transgenik terpilih hasil transformasi dengan Agrobacterium (A) dan Rhizobium (R). Galur A An37 An172 An28 An31 An82 An35 An23 An29 An30 An31 Ac126 Ac148 Ac120 Ac130 Ac136 Ac179 Ac150 Ac119 Ac127 Ar2 Rataan
Jumlah salinan gen hpt 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 2 1 1 2 2 1 2 1 2 1.35
Galur R Rn41 Rn6 Rn24 Rn7 Rn43 Rn52 Rn17 Rn231 Rn28 Rc94 Rc214 Rc171 Rc156 Rc208 Rc205 Rc159 Rc181 Rc203 Rc106 Rr32 Rataan
Jumlah salinan gen hpt 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 3 2 1 1.20
Tabel 8 Segregasi gen hpt pada populasi tanaman T1 galur terpilih. Jumlah Total Rasio X2 P tanaman tanaman segregasi T1 PCR yang diuji + hpt Rc162 24 30 3:1 0.4 Rc208 20 30 3:1 1.10 0.05* Rc203 30 30 15:1 2 Rc214 23 30 3:1 0.04 * sangat berbeda nyata pada selang kepercayaan 95%. X2 tabel (df=1, α0.05) = 3.841 Galur
Morfologi dan Fertilitas Tanaman Transgenik Hasil pengamatan terhadap morfologi dan fertilitas tanaman menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata antara tanaman hasil transformasi Rhizobium dengan Agrobacterium (Tabel 9). Semua galur transgenik yang diamati adalah normal dan fertil (Gambar 7).
38
Gambar 7 Penampilan morfologi a. Niponbare, b. Ciherang, dan c. Rojolele hasil transformasi dengan A. tumefaciens LBA288 (pCAMBIA5106) (At) and R. leguminosarum (pCAMBIA5106) (Rl). d. Ciherang berbunga dengan normal setelah ditransformasi dengan R. leguminosarum ANU845 (pCAMBIA5106). Table 9
Galur/ Bakteri
Pertumbuhan dan fertilitas beberapa galur transgenik terpilih hasil transformasi dengan Rhizobium dan Agrobacterium Tinggi tanaman (cm)
Jumlah anakan produktif
Jumlah anakan
Total benih
Benih bernas
Ciherang Rl 66,00 ± 3,53 12,80 ± 2,25 10,40 ± 2,84 791,40 ± 215,61 412,50 ± 163,03 At 68,10 ± 6,57 12,00 ± 2,91 9,10 ± 2,28 749,80 ± 174,09 353,20 ± 99,23 Nippon bare Rl 54,50 ± 3,32 17,00 ± 2,74 14,00 ± 2,55 623,40 ± 174,18 393,00 ± 240,12 At 50,20 ± 3,70 17,60 ± 2,61 15,60 ± 1,52 619,80 ± 113,60 402,40 ± 78,71 Catatan: Data merupakan rataan dari 10 tanaman untuk Ciherang dan 5 tanaman untuk Nipponbare. Rl R. leguminosarum (pCAMBIA5106), At A. tumefaciens LBA288 (pCAMBIA5106)
Pembahasan Pada penelitian ini dua sistim transformasi, yaitu Agrobacterium dan Rhizobium, dibandingkan.
Penelitian ini dimaksudkan untuk mengevaluasi
apakah Rhizobium mampu mentransfer gen ke dalam genom padi seefisien Agrobacterium tumefaciens. Untuk tujuan tersebut penelitian difokuskan untuk melihat
efisiensi
regenerasi
dan
transformasi
masing-masing
sistem,
kecenderungan jumlah salinan gen, pola pewarisan gen, dan penampilan
39
morfologi dan fertilitas tanaman. Untuk meminimalkan pengaruh faktor yang tidak
terkendali
selama
pengembangan
tanaman
transgenik,
plasmid
(pCAMBIA5106) dan batch kalus yang sama digunakan untuk transformasi Agrobacterium dan Rhizobium. Selanjutnya strain A. tumefaciens LBA288 yang digunakan adalah tipe avirulen sehingga diharapkan sebanding dengan R. leguminosarum bv trifolii ANU845. Namun, setiap genotipe padi dikultur pada media yang spesifik karena belum ada media universal yang cocok untuk semua genotipe padi (Ge et al. 2006). Hasil penelitian pendahuluan menunjukkan bahwa ketiga genotipe hanya dapat membentuk kalus embriogenik jika dikultur pada media khusus yang telah dikembangkan sebelumnya (data tidak ditampilkan). Ciherang, misalnya, tidak dapat membentuk kalus yang baik untuk transformasi jika dikultur pada media yang dikembangkan untuk Nipponbare atau Rojolele. Demikian juga sebaliknya. Dibandingkan dengan sistem transformasi sebelumnya menggunakan S. meliloti (Broothaerts et al. 2005), efisiensi transformasi menggunakan R. leguminosarum bv trifolii ANU845 telah meningkat tajam dengan efisiensi transformasi berkisar antara 2,05-12,05%, tergantung pada genotipe tanaman yang digunakan. Efisiensi transformasi tertinggi (12,05%) diperoleh pada Ciherang yang
ditransformasi
dengan
R.
leguminosarum
bv
trifolii
ANU845
(pCAMBIA5106). Hal ini sangat menarik, karena Ciherang sudah diterima luas oleh petani Indonesia saat ini. Pada saat ini, Ciherang berada di posisi kedua setelah IR64 berdasarkan luas areal tanam, dan trennya meningkat setiap tahun sejak dirilis tahun 2000.
Perbaikan teknik kultur jaringan dan metode
transformasi akan membantu mempercepat perbaikan sifat agronomi tanaman padi di masa depan. Perkembangan teknik kultur jaringan Ciherang telah dirintis sebelumnya (Purnamaningsih 2006), namun, belum ada laporan mengenai upaya transformasinya. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa R. leguminosarum yang mengandung pCAMBIA5106 mampu mentransfer gen ke berbagai macam genotipe padi. Efisiensi transformasi dan regenerasi tanaman hasil transformasi dengan Rhizobium lebih tinggi dibandingkan dengan Agrobacterium apalagi dengan Shinorizobium.
Tanaman transgenik dianalisa dengan uji GUS, uji
40
higromisin, PCR, dan Southern blot. Sama seperti tanaman hasil transformasi Agrobacterium, analisis molekuler pada tanaman T0 dan T1 yang ditransformasi dengan Rhizobium, membuktikan bahwa transgen telah terintegrasi ke dalam genom tanaman (Gambar 6), diekspresikan di dalam sel tanaman (Gambar 5), dan diwariskan ke generasi berikutnya mengikuti pola pewarisan Mendel (Tabel 8). Hasil pengamatan morfologi menunjukkan tanaman transgenik tumbuh normal dan fertil (Tabel 9 dan Gambar 7). Namun, plasmid pCAMBIA5106 memiliki kelemahan dimana situs restriksi yang unik untuk sub-kloning sangat terbatas dan merupakan situs restriksi yang jarang digunakan. Agar teknik transformasi Rhizobium ini dapat digunakan lebih luas untuk kegiatan transformasi genetika tanaman maka penyediaan dan penggunaan plasmid biner yang lebih mudah dimanipulasi secara in vitro akan sangat membantu.
Simpulan Efektivitas Rhizobium leguminosarum bv trifolii ANU845 yang telah direkayasa dalam mentransfer gen ke dalam genom tanaman padi sebanding dengan pembandingnya Agrobacterium tumefaciens LBA288.
Efisiensi
transformasi dengan bantuan bakteri Rhizobium, seperti halnya Agrobacterium, dipengaruhi oleh genotipe tanaman yang digunakan.
IV. ANALISIS REGULASI PROMOTER OsHox6 PADA TANAMAN PADI Abstrak Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui regulasi gen OsHox6 melalui studi bioinformatik promoter gen OsHox6 serta analisis pola ekspresinya di tanaman padi transgenik yang mengandung fusi promoter OsHox6 dengan gen pelapor β-glucuronidase. Satu kb fragment DNA upstream daerah penyandi OsHox6 diiolasi dari daun tanaman padi cv Ciherang, disekuen, difusikan dengan gen pelapor GUSPlus dari vektor pCAMBIA1305.1 dan ditrasformasi ke dalam genom tanaman padi varietas Ciherang dan Nipponbare. Ekspresi βglucuronidase (GUS) diamati dengan uji histokimia. Pensejajaran sekuen promoter hasil isolasi dari padi varietas Ciherang dengan sekuen DNA genom padi acuan (varietas Nipponbare) menunjukkan kemiripan yang tinggi (identity 100%). Hasil analisis bioinformatik sekuen DNA promoter OsHox6 mengindikasikan bahwa promoter OsHox6 mengandung elemen responsif terhadap kekeringan dan ABA. TATA box yang umum dijumpai di daerah promoter tanaman, berdasarkan hasil analisis sekuen promoter OsHox6, tidak ditemukan. Hasil analisis pola ekspressi temporal dan spasial promoter gen OsHox6 melalui visualisasi gen GUSPlus secara histokimia pada jaringan tanaman transgenik Ciherang dan Nipponbare menunjukkan bahwa aktivitas promoter ini meningkat saat kekeringan pada organ vegetatif maupun generatif. Aktivitas promoter OsHox6 lebih kuat pada jaringan muda yang aktif membelah. Kata Kunci: Promoter terinduksi kekeringan, OsHox6, Ciherang, Nipponbare Abstract This study was aimed to understand the regulation of OsHox6 gene through bioinformatics study of OsHox6 gene promoter and the analysis of its expression patterns in transgenic rice plants containing the fusion of promoter OsHox6 with the β-glucuronidase reporter gene. One kb DNA fragment upstream coding region of OsHox6 was isolated from the leaves of rice Ciherang, sequenced, fused with a GUSPlus reporter gene of vector pCAMBIA1305.1 and transformmed into the genome of rice Nipponbare and Ciherang. Expression of β-glucuronidase (GUS) was observed with histochemical assay. Alignment of isolated promoter sequence of rice cv Ciherang with that of reference fragments of genomic DNA of rice Nipponbare showed a high similarity with 100% identity. The results of the promoter sequence analysis indicate that OsHox6 promoter contains cis-regulatory elements responsive to drought and ABA. TATA box that commonly found in plants promoter region, based on the promoter sequences analysis, was not found. The results of temporal and spatial expression patterns analysis of OsHox6 gene through the histochemical visualization of GUSPlus in transgenic plant tissue of Ciherang and Nipponbare showed that the promoter activity was increased during drought stress both in vegetative and generative organ. Promoter OsHox6 is highly active in meristematic tissue. Key words: Drought inducible promoter, OsHox6, Ciherang, Nipponbare
42
Pendahuluan Respon tanaman terhadap kekeringan sangat kompleks dan melibatkan banyak gen (Rabbani et al. 2003, Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki 2006). Sejumlah gen yang responsif kekeringan telah dilaporkan sebelumnya meskipun belum semuanya berhasil dikarakterisasi dan diketahui fungsinya. Salah satu upaya untuk mempelajari fungsi suatu gen adalah dengan mempelajari aktivitas promoternya.
Selain itu, identifikasi promoter terinduksi kekeringan sangat
penting dilakukan dalam upaya pengembangan tanaman toleran kekeringan karena penggunaan promoter konstitutif seringkali menimbulkan efek negatif pada pertumbuhan dan produksi tanaman (Jaglo-Ottosen et al. 1998; Kasuga et al. 1999; Pino et al. 2007; Purwantomo 2007). Promoter adalah bagian dari DNA tempat menempelnya RNA polimerase dan faktor transkripsi untuk memulai proses
transkripsi
suatu
gen
(http://www.biology-online.org/dictionary/
Promoter). Berbagai pendekatan telah dikembangkan untuk tujuan identifikasi dan isolasi promoter. Untuk memprediksi promoter beberapa metode komputasi telah dikembangkan (Qiu 2003).
Metode ini secara umum dibagi ke dalam dua
kelompok. Pertama, pendekatan berbasis motif-motif tertentu (seperti TATA box, CAAT box, dsb) sebagai dasar pencarian. Kedua, pendekatan berbasis urutan basa tertentu yang menggunakan perbedaan urutan basa tertentu (seperti preferensi pasangan basa triplet di daerah awal transkripsi, frekuensi heksamer di daerah 5’ sepanjang 100 pasang basa, dsb) sebagai dasar untuk membedakan daerah promoter dengan daerah non-promoter.
Tingkat keberhasilan prediksi
promoter dengan metode komputasi bervariasi antara 15-54%. Saat ini, jumlah gen yang telah berhasil diannotasi dengan baik terus meningkat.
Hal ini memudahkan penentuan daerah promoter dengan
mensejajarkan mRNA atau cDNA utuh dengan DNA genomik yang sepadan. Dengan pendekatan ini, tingkat ketepatan identifikasi promoter dapat mencapai lebih dari 80% (Qiu 2003). Setelah promoter berhasil diidentifikasi, selanjutnya promoter dapat diisolasi. Pendekatan yang umum digunakan untuk isolasi promoter adalah dengan menggunakan pendekatan berbasis PCR. Pendekatan ini secara umum dibagi ke
43
dalam dua kelompok.
Pertama, teknik berbasis PCR yang digunakan untuk
mendapatkan sekuen yang belum diketahui baik di daerah 5’ atau 3’ dari suatu sekuen yang sudah diketahui urutan basanya. Ada dua metode PCR yang paling banyak digunakan untuk mendapatkan daerah 5’ atau 3’ dari suatu sekuen yang sudah diketahui urutan basanya, inverse PCR dan PCR vectorette (Kilstrup & Kristiansen 2000). Inverse PCR menggunakan dua primer yang masing-masing terletak di ujung fragmen dan mengarah ke bagian luar dari fragmen tersebut (Souza et al. 2009). Cetakan untuk reaksi amplifikasi adalah pustaka fragmen DNA kromosom yang telah disirkulasi. Metode genom walking lainnya disebut metode PCR vectorette. Vectorette adalah kaset DNA beruntai ganda parsial yang ujung 5'-nya terfosforilasi, dan setelah ligasi unit vectorette dengan campuran fragmen DNA kromosom, masing-masing untai memiliki unit vectorette yang menempel pada kedua ujungnya. Pustaka ini digunakan sebagai cetakan untuk perbanyakan DNA menggunakan primer spesifik genom bersama dengan primer spesifik vectorette yang identik tetapi tidak komplemen satu sama lain. Pendekatan ini sangat populer saat ini karena sudah banyak kit yang tersedia secara komersial (Yang et al. 2002; Chen et al. 2005; Tittarelli et al. 2007). Kedua, teknik PCR genomik yang memanfaatkan informasi sekuen utuh cDNA yang tersedia dan data sekuen lengkap genom di pangkalan data (GenBank). Daerah promoter diidentifikasi dengan mensejajarkan sekuen utuh cDNA dan sekuen genom kemudian diisolasi menggunakan sepasang primer yang spesifik. Rai et al. (2009) berhasil mengidentifikasi dan mengisolasi 3 promoter terinduksi kekeringan (rab16A, OsABA2, dan HP1) dengan menggunakan metode PCR genomik. Saat ini, banyak promoter gen terinduksi kekeringan dari berbagai tanaman yang telah berhasil diisolasi dan dipelajari, diantaranya adalah RD29A (Yamaguchi-Shinozaki & Shinozaki 1993b), BcDh2 (Shen et al. 2004), AtHB7 dan AtHB12 (Olsson et al. 2004), MYB (Chen et al. 2005), Hahb4 (Dezar et al. 2005b), dan rab16, OsABA2, dan HP1 (Rai et al. 2009). Dari hasil penelitian tersebut diketahui bahwa promoter terinduksi kekeringan memiliki motif elemen cis-acting yang spesifik yang tidak dimiliki oleh promoter lainnya. Selain itu hasil analisis promoter gen-gen terinduksi kekeringan diketahui bahwa ABA
44
responsive element (ABRE), drought responsive element (DRE), myb, myc adalah beberapa elemen cis-acting penting yang banyak dijumpai pada daerah promoter gen terinduksi kekeringan dan bertanggung jawab dalam menginduksi ekspresi gen pada saat tanaman mengalami kondisi keterbatasan air (Shen et al. 2004; Chen et al. 2005; Rai et al. 2009). Gen OsHox6 dari padi merupakan anggota dari famili HD-Zip. Purwantomo (2007) dan Agalou et al. (2008) melaporkan bahwa transkrip OsHox6 meningkat pada saat ada induksi kekeringan. Namun, hingga saat ini, belum ada laporan mengenai analisis promoter gen OsHox6. Analisis promoter penting dilakukan untuk mengetahui mekanisme regulasi proses transkripsi gen pada level molekuler. Di dalam kegiatan penelitian ini promoter OsHox6 dari padi varietas Ciherang diisolasi dan dipelajari aktivitasnya pada dua tanaman padi varietas Ciherang dan Nipponbare. Promoter diisolasi menggunakan pendekatan PCR genomik dengan memanfaatkan informasi yang ada di GenBank.
Kandidat
promoter kemudian difusikan dengan gen pelapor GUSPlus dan ditransformasikan ke dalam genom tanaman padi cv Ciherang dan Nipponbare. Aktifitas promoter diamati pada organ vegetatif dan generatif tanaman T 0 menggunakan uji GUS. Selanjutnya, elemen cis-acting terkait kekeringan diprediksi dengan bantuan perangkat
lunak PLACE (Plant cis-acting
regulatory DNA
elements)
(http://www.dna.affrc. go.jp/PLACE/ signalscan.html).
Bahan dan Metode Bahan Tanaman Promoter OsHox6 diisolasi dari tanaman padi (Oryza sativa L.) varietas Ciherang. Fusi promoter OsHox6 dengan gen pelapor GUSPlus ditransformasi ke dalam genom tanaman padi varietas Ciherang dan Nipponbare.
Isolasi DNA dan Konstruksi Plasmid DNA genom total diisolasi dari daun padi mengikuti protokol yang dijelaskan oleh Heusden et al. (2000). Sekuen promoter gen terinduksi kekeringan OsHox6 diidentifikasi dengan mensejajarkan cDNA utuh gen OsHox6 (no. aksesi
45
AF145730) dengan klon BAC APOO5681 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Daerah upstream cDNA OsHox6 sepanjang 1 kb diperbanyak menggunakan sepasang primer PCR, selanjutnya diisolasi dan disub-klon ke dalam vektor pGEM®-T
Easy
(Promega).
Primer
forward
5′-
GCGAATTCTGGTGTATGTGTGGTGTGTGTTC- 3′ mengandung situs restriksi EcoRI (miring) sedangkan primer reverse 5′-ATCCATGGCGCCCGATCGAG CTCTGATGATCGATG-3′ mengandung situs restriksi NcoI (tebal) pada daerah ujung 5’nya.
Plasmid pGEM®-T Easy mengandung kandidat DNA sisipan
(insert) selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel kompeten E. coli strain DH5α menggunakan metode kejut panas (heat shock).
Plasmid pGEM-T Easy
mengandung kandidat (putative) promoter OsHox6 diisolasi dari koloni putih positif PCR dan kemudian disekuen untuk menjamin kebenaran hasil isolasi. Urutan DNA diedit secara manual sebelum disejajarkan dengan sekuen DNA acuan (BAC clone APOO5681) menggunakan software DNAMAN for Windows versi 4.0.0.1 (Lynnon BioSoft). Promoter OsHox6 yang berukuran 1 kb kemudian dipotong dari pGEM-T Easy menggunakan enzim restriksi EcoRI and NcoI dan kemudian disisipkan ke dalam vektor biner pCAMBIA1305.1 yang telah dipotong dengan enzim yang sama untuk menghilangkan promoter CaMV 35S yang mengontrol gen GUSPlus (Gambar 8). Plasmid hasil modifikasi, disebut dengan plasmid pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus, kemudian diuji untuk konfirmasi DNA sisipan dengan memotong plasmid menggunakan enzim restriksi tertentu. Vector pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus, selanjutnya, dimobilisasikan dari E. coli DH5α ke A. tumefaciens EHA 105 menggunakan metode tri-parental mating dengan bantuan E. coli yang membawa plasmid pRK 2013. DNA plasmid pCAMBIA 1305.1 OsHox6P::GUSPlus, kemudian diisolasi dari A. tumefaciens dan dipotong menggunakan enzim restriksi tertentu untuk konfirmasi.
Transformasi Padi Transformasi padi varietas Ciherang dan Nipponbare dilakukan pada kalus yang diinduksi dari embrio padi belum masak dengan bantuan A. tumefaciens mengikuti protokol yang telah dijelaskan pada Bab III.
46
a
b
Gambar 8
Skema proses kloning untuk pembentukan fusi promoter OsHox6 dengan gen pelapor GUSPlus (a). Vektor biner pCAMBIA1305.1 digunakan sebagai vektor dasar. Promoter OsHox6 (1kb) disisipkan ke dalam pCAMBIA1305.1 menggantikan promoter 35S untuk menghasilkan plasmid pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus. (b). Gambaran proses kloning pada agarose gel elektroforesis. Kolom: 1. Hasil perbanyakan PCR promoter OsHox6 dengan ukuran 1 kb, 23. Vektor pGEM-T Easy mengandung promoter OsHox6 (1 kb) dipotong dengan EcoRI and NcoI untuk melepas promoter sisipan, 45 dan 11. Vektor pCAMBIA1305.1 dipotong dengan enzim EcoRI and NcoI untuk menghasilkan gen GUSPlus tanpa promoter, 6-10 pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus diisolasi dari A. tumefaciens dan dipotong dengan EcoRI and NcoI, M 1 . Marka DNA λ HindIII , M 2 . 100bp DNA ladder.
PCR DNA diekstraksi dari daun seperti yang dijelaskan oleh Heusden et al. (2000).
Sepasang primer, forward 5'-GCATCTCCCGCCGTGCAC-3' dan
reverse 5'-GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3’ digunakan untuk mengamplifikasi daerah penyandi gen hpt.
Reaksi perbanyakan gen hpt adalah 1 µl
sampel DNA, 6,25 µM masing-masing primer, dan 6,5 µl KAPA Taq ReadyMix
47
PCR Kit (KAPA Biosystems) dan air hingga mencapai total reaksi 12,5 µl. Perbanyakan DNA dilakukan dengan kondisi PCR sebagai berikut: satu siklus denaturasi awal pada suhu 95 ºC selama 3 menit, 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 95 ºC selama 1 menit, annealing pada suhu 60 ºC selama 1 menit dan perpanjangan pada 72 ºC selama 1 menit, dan satu siklus polimerisasi DNA pada suhu 72 oC selama 10 menit.
Produk PCR dipisahkan dengan
elektrophoresis mengunakan 0.8% gel agarosa.
Analisis Southern Blot DNA genom total diekstrak dari daun segar tanaman transgenik positif PCR hpt seperti yang dijelaskan oleh Lodhi et al. (1994). Sampel DNA dipotong dengan enzim restriksi EcoRI. Southern blot dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Sambrook et al. 1989). Sebagai pelacak gen hpt digunakan fragmen DNA hasil PCR (492 bp) yang diperbanyak menggunakan primer spesifik untuk gen hpt. Pelacak dilabel dan dideteksi dengan Alkphos labelling and detection system dari GE Healthcare (Amersham Bioscience) mengikuti petunjuk produsen.
Induksi Kekeringan Induksi kekeringan diberikan pada fase vegetatif dan generatif tanaman T 0 positif PCR hpt dengan 2 pendekatan. Pendekatan pertama, induksi kekeringan dilakukan dengan cepat yaitu dengan mengering anginkan sampel di atas kertas seperti yang dilakukan Gao et al. (2011) selama 1 jam. Tanaman yang tidak dikeringkan digunakan sebagai kontrol.
Kedua, kekeringan dilakukan secara
lambat dimana tanaman ditanam pada pipa paralon (PVC) mengikuti metode yang dijelaskan oleh Yue et al. (2006). Tanaman ditanam masing-masing satu tanaman per paralon. Tanaman disiram setiap hari. Pada saat perlakuan kekeringan air pada pipa dibuang melalui lubang yang ada di bagian bawah pipa, dan tidak disiram selama percobaan kekeringan dilakukan hingga 50% dari tanaman menunjukkan gejala daun menggulung.
Sampel (daun, akar, batang, bunga)
diambil sebelum perlakuan (hari ke 0), kemudian pada hari ke 2, 4, 6, 7 hari setelah pengeringan, dan 1 hari setelah disiram kembali. Tanaman yang tidak ditransformasi dan yang ditransformasi dengan pCAMBIA1305.1 digunakan
48
sebagai pembanding.
Kadar air relatif daun di ukur pada awal dan akhir
percobaan kekeringan mengikuti persamaan berikut: Kadar air relatif (%) = [(berat segar – berat kering)/(berat turgid-berat kering)] x 100
Uji Aktivitas GUS Tanaman T 0 Transgenik Analisis histokimia GUS dilakukan untuk mempelajari pola ekspresi gen GUSPlus pada tanaman padi yang dikendalikan oleh promoter OsHox6. Organ tanaman (daun, batang, akar, bunga) direndam dalam larutan X-Gluc (2 mM XGluc, 1 mM potassium ferrisianida, 1 mM potassium ferrosianida, 100 µg/ml chloramphenicol, 10 mM Na 2 EDTA.2H 2 O, 0,1% triton-X, 20% metanol dan 50mM dapar sodium fosfat pH 7) disimpan pada suhu 37oC selama 36 jam pada kondisi gelap. Selanjutnya organ tanaman dicuci dengan tiga seri larutan etanol (50,70, dan 95% v/v) hingga pigmen klorofil hilang. Jaringan kemudian diamati di bawah mikroskop.
Pembuatan Preparat Jaringan Jaringan yang telah diwarnai secara histokimia disayat secara melintang dan membujur menggunakan mikrotom beku (freeze mikrotom) tipe Yamato RV 240 dengan tebal 15 mikron. Hasil sayatan disusun pada suatu gelas objek dan ditetesi dengan gliserin sebelum ditutup dengan gelas penutup.
Sampel diamati
menggunakan mikroskop Nikon Eclipse 80i.
Hasil Identifikasi, Karakterisasi dan Isolasi Promoter OsHox6 Kandidat promoter OsHox6 diidentifikasi dengan mensejajarkan cDNA utuh gen OsHox6 (no. aksesi AF145730) dengan klon BAC APOO5681 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Motif atau cis-acting elemen yang terdapat pada daerah 5’ dari gen terinduksi kekeringan OsHox6 diprediksi dengan bantuan PLACE (Plant cis-acting regulatory DNA elements) (http://www.dna.affrc.go.jp/ PLACE/signalscan.html).
Berdasarkan keberadaan cis-regulatory element dan
untuk kemudahan isolasi (PCR) dan konfirmasi (sekuensing) selanjutnya dipilih 1 kb daerah upstream dari kodon ATG gen OsHox6 untuk analisis fungsi. Daerah
49
promoter OsHox6 yang berukuran 1 kb ini diprediksi mengandung 8 kandidat cisregulatory element terkait respon kekeringan, yaitu motif yang mirip dengan MYB1 dan MYC dari Arabidopsis thaliana, ABRE like/ERD1, ERD1, dan LTRE (Gambar 9; Tabel 10). Selain itu elemen lain (ABRE related sequences, CGCG Box, SORLIP1 dan SORLIP2) yang terkait dengan respon terhadap ABA juga ditemukan.
Berdasarkan data ini maka promoter OsHox6 diduga responsive
terhadap kekeringan dan ABA. Namun, berdasarkan hasil analisis prediksi ini promoter OsHox6 tidak memiliki TATA box yang umum dijumpai pada promoter sel eukaryot. Selanjutnya promoter OsHox6 diisolasi dari tanaman padi Ciherang menggunakan sepasang primer yang spesifik. Urutan DNA kandidat promoter hasil isolasi dari daun padi kultivar Ciherang menunjukkan kemiripan yang sangat tinggi (identity 100%) dengan sekuen DNA acuan (BAC clone APOO5681) dari Nipponbare (Gambar 10).
Kloning, Konstruksi Plasmid dan Transformasi Tanaman Padi Kandidat promoter OsHox6 (1 kb) yang diisolasi dari padi cv Ciherang difusikan dengan gen GUSPlus plasmid pCAMBIA 1305.1 yang telah dihilangkan promoter
CaMV35S-nya
(Gambar
8).
Vektor
pCAMBIA1305.1
OsHox6P::GUSPlus ditransformasikan ke dalam genom tanaman padi Nipponbare dan Ciherang dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens EHA105.
Vektor
pCAMBIA yang membawa gen GUSPlus yang dikendalikan oleh promoter CaMV35S digunakan sebagai positif kontrol, sedangkan tanaman yang tidak ditransformasi digunakan sebagai negatif kontrol. Tiga (3) tanaman Ciherang dan tiga puluh dua (32) tanaman Nipponbare kandidat transgenik berhasil diperoleh. Tanaman transgenik di PCR dan Southern untuk konfirmasi keberadaan transgen menggunakan pelacak gen hpt.
Hasil PCR menunjukkan, secara
berturut-turut, 30 dan 1 tanaman Nipponbare dan Ciherang, positif PCR hpt (Gambar 11). Sebanyak 12 tanaman Nipponbare positif PCR hpt di Southern menggunakan pelacak hpt. Enam tanaman Nipponbare hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikontrol oleh promoter OsHox6, mengandung satu salinan gen hpt (data tidak ditampilkan), meyakinkan bahwa gen telah terintegrasi ke dalam genom tanaman. Tanaman yang mengandung satu salinan gen GUSPlus ini
50
kemudian digunakan untuk analisis selanjutnya untuk mempelajari pola ekspresi gen GusPlus yang dikendalikan oleh promoter OsHox6.
Gambar 9 Posisi elemen cis-acting responsif kekeringan pada daerah promoter OsHox6. Informasi lebih lanjut dari masing-masing cis-acting elemen dirangkum pada Tabel 10.
Tabel 10 Kandidat cis-acting element responsif kekeringan dan ABA pada 1 kb daerah promoter OsHox6. Nama ciselemen
Sekuen cis-elemen
Jumlah ciselemen 1
Posisi
Keterangan
Pustaka
-348
etiolation-induced expression of erd1 (early responsive to dehydration) etiolation-induced expression of erd1 (early responsive to dehydration) dehydration-responsive element (DRE) binding proteins (DREBs) Cold, drought, ABA responsive element ABA, dehydration responsive Water stress
Simpson et al. 2003
ABRE like/ERD1
ACGTG
AtACGT/ ERD1
ACGT
3
HvCBF
RYCGAC
1
-349, 361 -568 -384
LTRE
CCGAC
1
-572
AtMYB1
WAACCA
1
-583
AtMYC/ ERD1 CGCG BOX
CATGTG
1
-978
VCGCGB
19
ABRE related sequence SORLIP1
MACGYG B GCCAC
2
SORLIP2
GGGCC
2
-248 -795 dst -630 -795 -127 -643 dst -177 -839
8
Ca++/Calmodulin binding
Ca++ responsive Phytochrome A-induced motifs Phytochrome A-induced motifs
Simpson et al. 2003 Xue 2002
Baker et al. 1994 Abe et al. 2003 Tran et al. 2004 Yang & Poovaiah 2002 Kaplan et al. 2006 Jiao et al. 2005
Hudson & Quail 2003 TATA Box TATAA 0 Grace et al. 2004 R adalah nukleotida A atau G, Y nukleotida C atau T, dan W nucleotida A atau T, V nukleotida A, C, atau G, B nukleotida C, G, atau T, dan M nukleotida A atau C.
51
OsHox6P CH
OsHox6P NB:OsHox6P CH identity= 100% 106 AAACACATCCCCTAGCTAGTAGCTGCTGGTAAACTACCGTCCTGAGCAACAGAGAAGCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 1 AAACACATCCCCTAGCTAGTAGCTGCTGGTAAACTACCGTCCTGAGCAACAGAGAAGCAA
OsHox6P NB
166
OsHox6P CH
61
OsHox6P NB
226
OsHox6P CH
121
OsHox6P NB
286
OsHox6P CH
181
OsHox6P NB
346
OsHox6P CH
241
OsHox6P NB
406
OsHox6P CH
301
OsHox6P NB
466
OsHox6P CH
361
OsHox6P NB
526
OsHox6P CH
421
OsHox6P NB
586
OsHox6P CH
481
OsHox6P NB
646
OsHox6P CH
541
OsHox6P NB
706
OsHox6P CH
601
OsHox6P NB
766
OsHox6P CH
661
OsHox6P NB
826
OsHox6P CH
721
OsHox6P NB
886
OsHox6P CH
781
OsHox6P NB
946
OsHox6P CH
841
OsHox6P NB
1006
OsHox6P CH
901
OsHox6P NB
AGCAATGAGTTGACGCGACCGAATCCGCGACGCCGCCCTCGCACCGCAAGGGCCACGCCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCAATGAGTTGACGCGACCGAATCCGCGACGCCGCCCTCGCACCGCAAGGGCCACGCCA ATTTGGTGCTCGATCGATCGGAACGCGCGCGGCGCTCCACGGCCATGTCCCACCGCACGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTTGGTGCTCGATCGATCGGAACGCGCGCGGCGCTCCACGGCCATGTCCCACCGCACGA ACCGCGCGGCCGCCCGCCAACCGAGCTAGCGCGCGGCCCCGGCCGCCGCCATGCTAACAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACCGCGCGGCCGCCCGCCAACCGAGCTAGCGCGCGGCCCCGGCCGCCGCCATGCTAACAC ACACCCGATGCGTTGCATTGCATGGCCGCTCCACGACGCCTCCCGCCCGCCTCGCGCCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACACCCGATGCGTTGCATTGCATGGCCGCTCCACGACGCCTCCCGCCCGCCTCGCGCCAC CACGGCCACGCGGTGCACCAGCTATAGCTAGCTAGCTAGGCGCATGGGGAGACGCTCCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACGGCCACGCGGTGCACCAGCTATAGCTAGCTAGCTAGGCGCATGGGGAGACGCTCCAC GACGCCCACTGCACTCCCGACACGTTTCCCCCAACCAACCACCACGCACCAACCCAAAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGCCCACTGCACTCCCGACACGTTTCCCCCAACCAACCACCACGCACCAACCCAAAAC CATCCATCCATCCAGCCAGCCAAGCCAATCTCCCGGCTCCCTCCGCTACGCGCCCCACGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CATCCATCCATCCAGCCAGCCAAGCCAATCTCCCGGCTCCCTCCGCTACGCGCCCCACGA CCTTTTTCCCATCACCCGCCCGCGCGCGCGGTCGAGCGCAACGCAACGCAACTCCACCGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTTTTTCCCATCACCCGCCCGCGCGCGCGGTCGAGCGCAACGCAACGCAACTCCACCGT ACCAACCGCGGCGCGGCCGATCGATCGACGCGAATCCCGCATGCGTATACGTACTATTCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACCAACCGCGGCGCGGCCGATCGATCGACGCGAATCCCGCATGCGTATACGTACTATTCT ACGTGAAGTATATGTGTAGCCGATCGAGCCGTCTCCCACCGCGCGCTCCCTCCCTGCCCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGTGAAGTATATGTGTAGCCGATCGAGCCGTCTCCCACCGCGCGCTCCCTCCCTGCCCC CGCGACAGCGACGCCGAGCGAGCGAGAGCGCGCAGCTAGCCACAGCCTCCAGAGCTATAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGCGACAGCGACGCCGAGCGAGCGAGAGCGCGCAGCTAGCCACAGCCTCCAGAGCTATAG CTACAGCGCGATCGAGAGAGAAGGGGGGAGACAGTGAGGCCGAGAGCGAGAGGGCCAGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTACAGCGCGATCGAGAGAGAAGGGGGGAGACAGTGAGGCCGAGAGCGAGAGGGCCAGCC ACGCACGCACGCACGCCACCGCGCTCCATTGGCCACCCCCTCGCCATCGCCACGATTAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGCACGCACGCACGCCACCGCGCTCCATTGGCCACCCCCTCGCCATCGCCACGATTAAA CTACTCTCTTGCTACTCCCCCTCCATCCATCCACACACTCCACCATTTCCTCTTCTTCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTACTCTCTTGCTACTCCCCCTCCATCCATCCACACACTCCACCATTTCCTCTTCTTCTT CCTCCATATCACACGGTTTTCGTCCATCGATCATCAGAGCTCGATCGGGCGCCATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCCATATCACACGGTTTTCGTCCATCGATCATCAGAGCTCGATCGGGCGCCATG
Gambar 10 Hasil pensejajaran sekuen kandidat promoter OsHox6 yang diisolasi dari padi Ciherang dengan sekuen acuan (BAC APOO5681) dari Nipponbare.
52
Gambar 11 Contoh hasil PCR menggunakan primer spesifik untuk gen hpt. DNA genomik tanaman diisolasi dari daun tanaman hasil transformasi dengan vektor mengandung gen pelapor GUSPlus yang dikontrol oleh promoter OsHox6. M. DNA λ yang dipotong dengan enzim HindIII, P. DNA plasmid pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus, Pt. Kontrol tanaman positif hpt, Nt. Kontrol tanaman tidak ditransformasi, R. Kontrol reaksi. 1-32. Sampel DNA tanaman hasil transformasi dengan vektor mengandung gen pelapor GUSPlus yang dikontrol oleh promoter OsHox6.
Aktifitas GUSPLUS Pada Tanaman T 0 Transgenik Pada Saat Ada Induksi Kekeringan Aktifitas GUSPlus pada tanaman transgenik Nipponbare dan Ciherang hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikontrol oleh 1 kb promoter OsHox6 diamati dengan uji histokimia pada saat ada atau tidak ada induksi kekeringan. Warna biru pada sel atau jaringan mengindikasikan adanya ekspresi GUSPlus. Pada kondisi normal ekspressi GUSPlus pada berbagai organ vegetatif (seperti akar, batang, dan daun) dan generatif (bunga) tidak ada atau sangat rendah. Ekspresi gen GUSPlus meningkat ketika tanaman diinduksi kekeringan, baik dengan menggunakan metode dehidrasi secara cepat di Lab maupun dengan induksi kekeringan secara lambat di rumah kaca. Ekspresi GUSPlus meningkat secara nyata ditandai dengan munculnya warna biru pada jaringan setelah dikering anginkan selama 1 jam di atas meja di Laboratorium (Gambar 12). Dari hasil pengamatan ekspresi GUSPlus pada berbagai organ (akar, batang, daun dan bunga), sebanyak 92% (dari total 12 tanaman yang diuji) ekspresi GUSPlus di jumpai pada batang terutama pada daerah buku batang, sedangkan pada organ lain (akar, daun, dan bunga) kejadiannya hanya 8,3%. Tidak ada ekspresi GUSPlus
53
pada tanaman yang tidak ditransformasi, dan seperti yang diharapkan, ekspresi GUSPlus pada tanaman hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikendalikan promoter konstitutif CaMV 35S terjadi pada berbagai jaringan baik sebelum dan setelah dikeringkan. Hasil uji histokimia pada tanaman Nipponbare positif PCR hpt, hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikendalikan promoter OsHox6, yang diinduksi kekeringan dengan cara kedua (lambat) menunjukkan kecenderungan yang sama.
Ekspresi GUSPlus sesaat sebelum dikeringkan (hari ke-0)
menunjukkan ekspresi yang rendah atau tidak ada ekspresi (RWC daun berkisar antara 91 - 95%). Ekspresi GUSPlus yang tinggi ditandai dengan peningkatan intensitas warna biru yang kuat dijumpai pada batang, akar, dan bunga pada hari ke 6 dan ke 7 setelah dikeringkan (RWC daun berkisar antara 79 hingga 80%, menunjukkan tingkat stres moderat menurut Agalou et al. (2008) dan 50% tanaman yang diuji sudah mulai menunjukkan gejala daun menggulung. Ekspresi GUSPlus kembali rendah atau tidak ada 1 hari setelah tanaman di siram kembali (Gambar 13) membuktikan bahwa gen OsHox6 terinduksi kekeringan. Pada batang, ekspresi GUSPlus terutama ditemukan pada bagian buku batang dan sudah mulai terlihat pada awal percobaan kekeringan, kemudian meningkat hingga akhir pengamatan (hari ke -7).
Pada daun peningkatan
intensitas warna biru tidak meningkat secara nyata dan baru terlihat pada hari ke-6 atau ke-7. Hal yang sama juga ditemukan pada akar dan bunga. Pada bunga warna biru dengan intensitas yang kuat ditemukan pada dasar bunga (Gambar 13C). Sedangkan pada akar intensitas yang kuat ditemukan pada daerah pertemuan akar primer dan lateral. Untuk
mengetahui lebih
lanjut
bagian
sel,
jaringan,
atau
yang
mengekspresikan GUSPlus, dilakukan irisan terhadap sampel yang sudah diuji GUS. Irisan dilakukan baik secara melintang maupun membujur. Hasil irisan menunjukkan GUSPlus diakumulasikan terutama pada jaringan meristem yang aktif membelah. Pada kondisi yang melimpah GUSPlus ditemukan menyebar pada berbagai jaringan (Gambar 14).
Dengan melihat hasil irisan secara
melintang dapat terlihat jelas bahwa warna biru ditemukan lebih pekat pada lingkaran luar yang mengelilingi batang (lingkaran paling dalam).
Daerah
54
lingkaran luar tersebut merupakan bagian dari pangkal pelepah daun. Sehingga hasil ini memperjelas bahwa GUSPlus diekspresikan lebih kuat pada daerah pangkal pelepah daun dibandingkan dengan helaian daun yang dijelaskan sebelumnya (Gambar 13B).
Selanjutnya lingkaran daun yang paling dalam
menunjukkan intensitas warna yang lebih kuat dibandingkan dengan lingkaran terluar, hal ini mengindikasikan bahwa ekspresi GUSPlus lebih kuat pada bagian yang lebih muda.
Akar
Tidak didehidrasi Batang Daun Bunga
Akar
Didehidrasi Batang Daun
Bunga
OsHox6
N32
N37
Kontrol CaMV 35S
Promoter
CH1
Gambar 12 Ekspresi β-glucuronidase (warna biru) pada berbagai organ (akar, batang, daun, dan bunga) tanaman padi cv Ciherang (CH) dan Nipponbare (N) hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikontrol oleh promoter terinduksi kekeringan OsHOx6 dan promoter konstitutif CaMV 35S pada saat ada atau tidak ada induksi kekeringan. Garis merepresentasikan 1 mm.
55 A. Pengamatan hari ke2
4
6
7
S*
7
S*
7
S*
N18
N47
CaMV 35S
Promoter
OsHox6P
0
B.
Pengamatan hari ke-
OsHox6P
2
4
6
N18
N47
CaMV 35S
Promoter
0
C.
Pengamatan hari ke-
OsHox6P
2
4
N18
N47
D.
Pengamatan hari ke-
OsHox6
0
N 18
N47
CaMV 35S
Promoter
6
CaMV 35S
Promoter
0
6
7
Gambar 13 Pola ekspresi GUSPlus yang dikontrol oleh promoter OsHox6 pada berbagai organ tanaman padi. A. batang, B. Daun, C. Bunga , dan D. Akar. Warna biru menunjukkan ekspressi gen GUSPlus. Garis putus-putus menunjukkan saat tanaman disiram kembali. S* sampel diambil 1 hari setelah tanaman disiram kembali. Garis merepresentasikan 1 mm.
56
Irisan Melintang Kontrol
Irisan Membujur
OsHox6P::GUSPlus
VB
Xy
Ph
35S CaMV
Promoter
VB
Gambar 14 Penampang melintang dan membujur bagian buku batang padi yang telah di uji GUS. Jaringan tanaman yang tidak ditransformasi digunakan sebagai kontrol pembanding. VB. Vessel bundle (jaringan pembuluh), Xy. Xylem, Ph. Phloem. Garis menunjukkan 100 µm.
Pembahasan Analisis promoter sangat penting dilakukan untuk mempelajari fungsi dan mekanisme regulasi proses transkripsi gen pada level molekuler.
Pengaturan
ekspresi gen reponsif terhadap cekaman (kekeringan) terjadi dengan adanya interaksi antara faktor transkripsi dan elemen cis-acting yang ada di daerah promoter gen target. Gen HD-Zip pada tanaman padi baru diteliti beberapa tahun belakangan ini (Agalou et al. 2008), sehingga informasi tentang pola ekspresi gen
57
dan elemen penting yang mengendalikan regulasi transkripsi gen HD-Zip ini masih sangat terbatas. Di dalam penelitian ini, promoter gen OsHox6 yang merupakan anggota dari HD-Zip sub-famili I dan dilaporkan responsif kekeringan (Agalou et al. 2008) dipelajari fungsinya dengan melihat keberadaan elemen cis-acting yang ada di daerah promoter tersebut dan dengan melakukan analisis fungsional promoter yang difusikan dengan gen pelapor GUSPlus.
Keberadaan elemen cis-acting
terkait cekaman tertentu merupakan salah satu petunjuk awal bahwa promoter dapat mengatur proses transkripsi pada saat ada cekaman tertentu, meskipun tidak ada jaminan efektifitas ekspresi gen. Oleh karena itu analisis fungsi dari kandidat promoter perlu dilakukan dengan menggabungkan kandidat promoter dengan suatu gen pelapor dan mengujinya pada kondisi cekaman tertentu. Hasil analisis sekuen 1 Kb kandidat promoter OsHox6 yang diisolasi dari Ciherang menunjukkan kemiripan yang sangat tinggi (identity 100%) dengan sekuen DNA acuan (Nipponbare). Hal ini mengindikasikan adanya konservasi pengaturan ekspresi gen OsHox6 yang tinggi pada Nipponbare dan Ciherang. Hasil analisis PLACE menunjukkan bahwa promoter OsHox6 mengandung elemen cis-acting yang penting untuk respon kekeringan (yaitu MYB1 dan MYC, ABRE like/ERD1, ERD1, dan LTRE) dan respon ABA (seperti ABRE related sequences, CGCG Box, SORLIP1 dan SORLIP2).
Sehingga ekspresi gen
OsHox6 kemungkinan diregulasi oleh kekeringan dan ABA. Untuk membuktikan dugaan ini maka dapat dilakukan dengan melakukan analisis ekspresi pada tanaman transgenik mengandung promoter OsHox6 yang difusikan dengan suatu gen pelapor.
Ekspresi gen pelapor diamati ketika tanaman transgenik di
tumbuhkan pada kondisi kekurangan air atau pada media mengandung ABA. Salah satu hal menarik dari promoter OsHox6 adalah tidak adanya TATA box yang merupakan elemen penting untuk inisiasi proses transkripsi. Hal yang sama juga dilaporkan sebelumnya oleh Chen et al. (2005) dan Rai et al. (2009), masing-masing pada promoter MYB dan HP1.
Meskipun demikian, analisis
fungsi promoter berdasarkan uji GUS pada tanaman transgenik positif PCR hpt menunjukkan promoter OsHox6 fungsional pada padi Nipponbare dan Ciherang.
58
Diduga ada motif lain yang belum diketahui yang memiliki fungsi yang mirip dengan TATA box. Aktivitas promoter OsHOx6 meningkat pada saat ada cekaman kekeringan ditandai dengan peningkatan intensitas warna biru pada jaringan.
Namun
berdasarkan uji GUS diamati bahwa pola ekspresi GUSPlus cenderung diekspresikan lebih tinggi pada daerah dimana terdapat jaringan meristem, seperti daerah intercalary meristem pada batang dan daun, daerah meristematis pada bunga dan daerah lateral meristem pada batang. Hasil pengamatan ekspresi GUSPlus pada berbagai organ tanaman padi menunjukkan ada perbedaan pola ekspresi pada batang dan organ selain batang. Pada batang ekspresi GUSPlus dapat diamati pada tahap awal dehidrasi, sedangkan pada akar, daun, dan bunga ekspresi GUSPlus baru dapat diamati setelah kekeringan berlangsung 6-7 hari.
Hal ini mengindikasikan adanya
kemungkinan mekanisme regulasi gen Oshox6 yang berbeda pada batang dan organ lainnya. Pengamatan lebih lanjut pada setiap tahap perkembangan juga perlu dilakukan untuk melihat apakah promoter OsHox6 diregulasi oleh tahap perkembangan tanaman. Ekspresi gen OsHox6 seperti yang disimpulkan dari pola aktivitas promoter OsHox6, mirip dengan promoter AtHB7 Arabidopsis. Keduanya berhubungan erat dengan sel-sel yang mengalami fase differensiasi (Hjellstrom et al. 2003). Seperti AtHB7, aktivitas GUS paling kuat pada jaringan muda daerah batang yang aktif memanjang atau membelah.
Simpulan Promoter OsHox6 berdasarkan hasil analisis bioinformatik mengandung elemen cis-acting responsif kekeringan dan ABA. Promoter OsHox6 teraktivasi oleh proses kekeringan berdasarkan hasil analisis histokimia GUS pada tanaman transgenik hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikendalikan oleh promoter OsHox6. Aktivitas promoter OsHox6 lebih tinggi pada buku batang dan jaringan yang aktif membelah.
V. OVEREKSPRESI GEN OsHox6 PADA TANAMAN PADI
Abstrak Protein homeodomain leucin zipper (HD-Zip) merupakan suatu famili faktor transkripsi yang hanya ditemukan pada tanaman. OsHox6 adalah anggota dari HD-Zip sub-famili I pada tanaman padi. Ekspresi OsHox6 diregulasi pada level transkripsi oleh ketersediaan air. Untuk mengetahui fungsi gen OsHox6 dalam merespon kekeringan, digunakan tanaman padi sawah Ciherang dan IR64 transgenik mengandung gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3. Empat galur (I.19, I.23, I.33, dan I.40) tanaman padi transgenik IR64 yang mengandung satu salinan transgen berdasarkan Southern blot lebih toleran pada kondisi kekeringan, ditunjukkan oleh persentase recovery yang lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman kontrol tipe liarnya. Konfirmasi ekspresi gen akan dilakukan. Penampilan morfologi tanaman transgenik berdasarkan pengamatan tinggi tanaman tidak berbeda dengan kontrolnya. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengetahui cara kerja OsHox6 dalam mekanisme toleran kekeringan. Kata Kunci:
Gen OsHox6, promoter OsLEA3, padi transgenik, tingkat kelangsungan hidup, toleran kekeringan
Abstract Homeodomain leucine zipper (HD-Zip) proteins constitute a family of transcription factors unique to plants. OsHox6 is a member of rice HD-Zip subfamily I. It is regulated at the transcriptional level by water availability. In order to establish if this gene plays a functional role in drought responses, transgenic rice plants (Ciherang and IR64) containing OsHox6 gene driven by OsLEA3 promoter were obtained. Four transgenic lines of IR64 (I.19, I.23, I.33, and I.40) containing single copy of transgene were more tolerant to water stress conditions, showed by higher survival rates than wild-type plants. The expression level of OsHox6 gene in these transgenic plants will be confirmed. The morphological performance of transgenic plants having an extra copy of transgene were similar to that of wild type plants. Further investigations are required to evaluate the modulation of drought tolerance by OsHox6. Key words:
OsHox6 gene, OsLEA3 promoter, transgenic rice, survival rate, drought tolerance
60
Pendahuluan Gen homeodomain leucin zipper (HD-Zip) menyandikan protein faktor transkripsi yang unik pada tanaman.
Protein ini dikenali dengan adanya
homeodomain yang penting untuk pengikatan DNA dan motif leucin zipper yang diperlukan untuk proses dimerisasi.
Gen HD-Zip ditemukan pada berbagai
tumbuhan, mulai dari tumbuhan tingkat rendah seperti lumut Physcomitrella patens (Sakakibara et al. 2001), kemudian pakis Ceratopteris richardii (Aso et al. 1999), dan tumbuhan tingkat tinggi seperti Arabidopsis thaliana (Hanson et al. 2002; Hjellstrom et al. 2003; Olsson et al. 2004; Kim et al. 2007), kedelai (Wang et al. 2005), dan tanaman gurun yang sangat toleran kekeringan Craterostigma plantagienum (Deng et al. 2002).
Beberapa protein HD-Zip
khususnya sub-famili I dilaporkan berperan dalam mengatur perkembangan tanaman dalam merespon kondisi lingkungan seperti kekeringan, suhu ekstrem, stres osmotik, dan kondisi pencahayaan (Ariel et al. 2007). Keterlibatan gen dari famili HD-Zip dalam adaptasi kekeringan pada tanaman telah dilaporkan sebelumnya pada tanaman model toleran kekeringan Craterostigma plantagineum dan tanaman model Arabidopsis thaliana (Deng et al. 2002, Hjellstrom et al. 2003, Olsson et al. 2004, Dezaar et al. 2005a, Deng et al. 2006).
Gen HD-Zip pada tanaman padi baru diteliti beberapa tahun
belakangan ini (Agalou et al. 2008). Sebanyak 8 dari 31 gen HD-Zip sub-famili I, II dan III yang berhasil diungkap pada tanaman padi dilaporkan responsif terhadap kekeringan. Lima (5) gen (OsHox4, 6, 20, 22, dan 24) diantaranya merupakan anggota dari kelompok sub-famili I dan 3 gen (OsHox11, 19, dan 27) merupakan anggota dari sub-famili II. Gen-gen ini berpotensi sebagai kandidat gen yang menentukan sifat toleran kekeringan yang diperlukan dalam upaya perakitan tanaman toleran kekeringan. Dari 8 gen HD-Zip responsif kekeringan tersebut, baru gen OsHox1 dan Oshox4 padi yang telah dipelajari secara mendetil. OsHox1 berperan dalam differensiasi jaringan pembuluh (Scarpella et al. 2000). Agalou et al. (2008) melaporkan bahwa overekspresi gen OsHox4 yang dikendalikan promoter 35S meningkatkan toleransi tanaman padi varietas Nipponbare terhadap kekeringan. Namun, tanaman yang dihasilkan kerdil akibat ukuran sel yang lebih pendek dan steril.
Dai et al. (2008) menduga bahwa
61
overekspresi gen OsHox4 mengganggu respon tanaman terhadap hormon giberelin, sehingga menyebabkan tanaman kerdil. Overekspresi gen OsHox4 juga menghambat produksi α-amilase yang tergantung pada giberelin pada saat proses perkecambahan. Hingga saat ini fungsi gen OsHox lainnya pada tanaman padi belum diketahui. Gen OsHox6 adalah salah satu anggota dari faktor transkripsi HD-Zip subfamili I. Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa pada tanaman padi ditemukan 1 salinan gen OsHox6 yang terletak pada kromosom 9 (Meijer et al. 2000; Agalou et al. 2008). Ekspresi gen OsHox6 meningkat saat ada kekeringan sehingga diduga OsHox6 memiliki peran dalam mekanisme adaptasi terhadap kekeringan (Purwantomo 2007; Agalou et al. 2008)
Fungsi OsHox6 dalam
merespon cekaman kekeringan belum diketahui sebelumnya. Hasil penelusuran protein
OsHox6
pada
pangkalan
data
(http://www.uniprot.org/uniprot/)
menunjukkan bahwa protein OsHox6 baik pada padi Indica (Q9XH35) maupun Japonica (Q651Z5) terdiri dari 249 asam amino dengan perkiraan berat molekul 27,3 kDa. OsHox6 diekspresikan pada kecambah, akar, daun, buku, ruas batang, bunga dan embrio (Meijer et al. 2000; Agalou et al. 2008). Rekonstruksi filogeni gen HD-Zip dari tanaman monokotil dan dikotil berdasarkan kemiripan sekuen dan organisasi intron-exon menunjukkan bahwa gen OsHox6 pada tanaman padi ortholog dengan gen AtHB7 dan AtHB12 dari Arabidopsis (Agalou et al. 2008), gen MtHB1 dari Medicago truncatula dan gen NaHD20 dari tanaman tembakau Nicotiana attenuata (Harris et al. 2011). Ortholog adalah gen-gen dari spesies berbeda yang berevolusi dari suatu gen leluhur
umum,
dan
oleh
karena
itu
memiliki
(http://homepage.usask.ca/~ctl271/857/def_homolog.shtml).
fungsi
yang
sama
Penelitian pada
Arabidopsis menunjukkan bahwa gen AtHB7 dan AtHB12 dalam proses respon terhadap kekeringan berperan dalam mengatur pemanjangan sel dan pertumbuhan tanaman melalui jalur ABA (ABA dependent pathway) (Hjellstrom et al. 2003; Olsson et al. 2004). Sedangkan NaHD20 menginduksi akumulasi ABA pada tanaman tembakau (Re et al. 2010). Pada Medicago truncatula, MtHB1 diinduksi oleh ABA dan berperan dalam menghambat pembentukan akar lateral (Ariel et al. 2010). Diduga ada kemiripan fungsi gen OsHox6 dengan AtHB7 dan AtHB12 dari
62
Arabidopsis thaliana, NaHD20 dari tembakau, dan MtHB1 dari Medicago truncatula. Pada Bab ini fungsi gen OsHox6 dipelajari menggunakan tanaman padi transgenik hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3. Promoter OsLEA3 dilaporkan menunjukkan aktivitas yang tinggi pada kondisi kekeringan.
Peranan gen OsHox6 tanaman padi dalam
merespon cekaman kekeringan dievaluasi dengan melihat persentase recovery tanaman transgenik setelah diberi perlakukan kekeringan selama 14 hari pada fase vegetatif.
Bahan dan Metode
Bahan Tanaman dan Induksi Kalus Benih padi varietas Ciherang dan IR64 ditanam dan dipelihara di rumah kaca sebagai sumber eksplan embrio benih padi. Embrio benih padi masak susu (10-12 hari setelah anthesis) digunakan sebagai bahan untuk induksi kalus. Benih dikupas dan disterilisasi dengan 70% etanol selama satu menit dilanjutkan dengan 2,5% larutan natrium klorida (NaClO) yang mengandung setetes Tween 20 selama 15 menit. Benih kemudian dicuci beberapa kali dengan air steril untuk menghilangkan larutan NaClO.
Embrio dikeluarkan dengan menekan benih
menggunakan pinset steril dalam laminar, selanjutnya ditanam pada media induksi kalus (lihat Tabel 4) dan disimpan pada kondisi gelap selama 6 hari. Kalus yang berumur 6 hari kemudian digunakan sebagai bahan transformasi.
Strain Bakteri dan Plasmid Plasmid pCAMBIA1301H OsLEA3P::OsHox6 (Gambar 15) diperoleh dari Dr. Pieter B.F. Ouwerkerk (Univ. Leiden, Belanda). Di dalam T-DNA plasmid pCAMBIA1301H
OsLEA3P::OsHox6
mengandung
gen
OsHox6
yang
dikendalikan oleh promoter terinduksi kekeringan OsLEA3 dan gen penanda gusA serta gen penyeleksi hpt masing-masing dikontrol oleh promoter 35S CaMV. Gen
63
Gambar 15 T-DNA di dalam pCAMBIA 1301H OsLEA3P::OsHox6. Sepasang primer, forward (P1) and reverse (P2), digunakan untuk memperbanyak daerah penyandi gen hpt. Fragmen gen hpt (492pb) hasil PCR digunakan sebagai pelacak pada analisis Southern.
OsHox6 (640 pb) diisolasi dari padi varietas IR58. Plasmid pCAMBIA1301H OsLEA3P::OsHox6 ditransformasi ke dalam sel E.coli DH5α dengan metode kejut panas untuk perbanyakan.
Vector pCAMBIA1301H OsLEA3P::OsHox6
dimobilisasikan dari E. coli DH5α ke A. tumefaciens LBA4404 menggunakan metode tri-parental mating dengan bantuan E. coli yang membawa plasmid pRK 2013. DNA plasmid pCAMBIA1301H OsLEA3P::OsHox6, kemudian diisolasi dari A. tumefaciens dan dipotong menggunakan enzim restriksi untuk konfirmasi.
Transformasi dan Regenerasi Transformasi dan regenerasi kalus Ciherang dan IR64 dilakukan mengikuti cara kerja seperti yang telah dijelaskan di ‘Bahan dan Metode’ pada Bab III disertasi ini.
PCR DNA diekstraksi dari daun seperti yang dijelaskan oleh Heusden et al. (2000).
Sepasang primer, forward 5'-GCATCTCCCGCCGTGCAC-3' dan
reverse 5'-GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3' digunakan untuk mengampli fikasi daerah penyandi gen hpt. Reaksi perbanyakan gen hpt adalah 1 µl sampel DNA, 2,5 pM masing-masing primer, dan 6,5 µl GoTaq ® Green Master Mix (Promega) dan air hingga mencapai total reaksi 12,5 µl. Perbanyakan DNA dilakukan dengan kondisi PCR sebagai berikut: satu siklus denaturasi awal pada suhu 95 ºC selama 3 menit, 35 siklus dimana denaturasi pada suhu 95 ºC selama 1
64
menit, annealing pada suhu 60 ºC selama 1 menit dan perpanjangan pada 72 ºC selama 1 menit, dan satu siklus polimerisasi DNA pada suhu 72 oC selama 10 menit. Produk PCR dipisahkan dengan elektrophoresis menggunakan 1% gel agarosa.
Analisis Southern Blot DNA genom total diekstrak dari daun segar tanaman transgenik PCR-positif hpt seperti yang dijelaskan oleh Lodhi et al. (1994). Sampel DNA dipotong dengan enzim restriksi EcoRI. Southern blot dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Sambrook et al. 1989). Sebagai pelacak gen hpt digunakan fragmen DNA hasil PCR (492 bp) menggunakan primer spesifik untuk gen hpt (Gambar 15). Pelacak dilabel dan dideteksi dengan Alkphos labelling and detection system dari GE Healthcare (Amersham Bioscience) mengikuti petunjuk produsen.
Uji Kekeringan Kecambah umur 1 minggu dari galur T1 terpilih ditumbuhkan dimedia Yoshida mengandung higromisin 50 mg/l selama 2 minggu atau hingga semua tanaman kontrol yang tidak ditransformasi mati. Sebagai positif kotrol digunakan tanaman Ciherang homozigot untuk gen hpt yang diperoleh dari percobaan sebelumnya, sedangkan negatif kontrol digunakan tanaman padi IR64 dan Ciherang yang tidak ditransformasi. Tanaman transgenik yang tumbuh normal dipindahkan ke pot yang berisi campuran topsoil, pasir dan cocopeat (2:1:1). Masing-masing pot berisi 12 tanaman, setiap galur terdiri dari 4 pot. Tanaman ditumbuhkan selama dua minggu pada kondisi normal di rumah kaca. Tanaman kemudian dibagi dua perlakuan, dikeringkan dan tidak dikeringkan (kontrol). Sehingga untuk setiap galur, satu perlakuan terdiri dari 2 pot. Sebelum perlakuan kekeringan dimulai, tanaman disiram hingga jenuh.
Selanjutnya, tanaman
dikeringkan (tidak disiram) selama 14 hari atau hingga tanaman kontrol tipe liar menunjukkan layu kritis atau mati.
Kemudian tanaman disiram kembali dan
diamati setelah 4 hari disiram kembali. Kadar air tanah pada awal dan akhir percobaan dicatat. Pengamatan terhadap survival rate dilakukan pada hari keempat setelah tanaman disiram kembali dan dihitung berdasarkan jumlah tanaman
65
yang segar kembali dibagi jumlah tanaman yang diuji. Selain itu tinggi tanaman diukur 1 minggu setelah disiram kembali, sebelum kemudian dipindahkan ke pot yang lebih besar untuk memperoleh benih generasi berikutnya.
Hasil Transformasi dan Analisis Molekuler Tanaman Hasil Transformasi dengan OsLEA3P::OsHox6 Gen OsHox6 padi varietas IR58 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 di transfer ke dalam genom tanaman padi varietas Ciherang dan IR64 menggunakan transformasi Agrobacterium tumefaciens.
Untuk memudahkan
proses seleksi dan konfirmasi hasil transformasi, gen penanda gus dan penyeleksi hpt yang dikendalikan promoter 35S CaMV juga disertakan dalam T-DNA (Gambar 15).
Seleksi dilakukan secara ketat sejak fase kalus hingga planlet
(Gambar 16c, d, f) dengan menambahkan masing-masing higromisin 50 mg/l pada media seleksi dan pra regenerasi, dan 30 mg/l pada media induksi akar ½ MS. Kandidat tanaman transgenik di karakterisasi lebih lanjut dengan PCR dan Southern blot untuk seleksi tanaman positif mengandung transgen dan memilih tanaman dengan salinan gen tunggal. Hasil transformasi terhadap 7101 kalus Ciherang dan 2320 kalus IR64 diperoleh masing-masing 29 dan 11 tanaman konsisten positif PCR hpt. Tanaman positif PCR hpt ini kemudian di Southern. Tanaman positif PCR atau berdasarkan hasil Southern mengandung satu salinan transgen dibiarkan menyerbuk sendiri untuk menghasilkan benih T 1 .
Populasi tanaman T 1 selanjutnya digunakan
sebagai bahan untuk mengevaluasi segregasi gen hpt berdasarkan analisis PCR. Hasil analisis PCR 29 galur Ciherang hasil transformasi dengan gen OsHox6 diperoleh 4 kandidat galur Ciherang (CH.5, CH.152, CH.153, dan CH.197) bersegregasi 3:1 (Tabel 11), mengindikasikan penyisipan tunggal. Konfirmasi jumlah salinan gen dengan Southern blot pada tanaman Ciherang masih perlu dilakukan. Selanjutnya, hasil analisis Southern pada 11 tanaman T 0 IR64 positif PCR hpt menunjukkan 6 galur (I33, I19, I23, I29, I.31, dan I40) diantaranya memiliki salinan gen tunggal (Gambar 17). Berdasarkan hasil analisis PCR dan
66
Southern blot kemudian dipilih sepuluh galur, yaitu 4 galur Ciherang (CH.5, CH.152, CH.153, dan CH.197) dan 6 galur IR64 (I33, I19, I23, I29, I.31, dan I40), untuk dievaluasi tingkat toleransinya pada kondisi kekeringan.
a
b
c
f
g
d
e h
i
Gambar 16. Tahapan kultur jaringan untuk menghasilkan tanaman padi varietas Ciherang atau IR64 yang mengandung OsLEA3::OsHox6. (a). Kalus yang diinduksi dari immature embrio diinkubasi dengan A. tumefaciens pCAMBIA 1301H OsLEA3P::OsHox6, (b). Kalus mengeks presikan β-glucuronidase 6 hari setelah ko-kultivasi dengan A. tumefaciens pCAMBIA 1301H OsLEA3P::OsHox6, (c). Kalus tahan higromisin tumbuh aktif pada media seleksi mengandung higromisin 50 mg/l, (d). Planlet beregenerasi dari kalus tahan higromisin, (e). Planlet hasil regenerasi yang mengekspresikan β-glucuronidase, (f). Planlet aktif tumbuh pada media induksi perakaran ½ MS yang mengandung higromisin 30 mg/l. (g). Tanaman T 0 Ciherang hasil transformasi dengan OsHox6 yang dikendalikan promoter OsLEA3, (h). Daun tanaman yang mengekspresikan β-glucuronidase, dan (i). Uji higromisin pada daun tanaman Ciherang hasil transformasi dengan OsHox6.
67
Tabel 11 Segregasi gen hpt pada populasi tanaman T 1 Ciherang dan IR64 yang ditransformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3. Jumlah tanaman Total tanaman Rasio X2 P T 1 PCR + hpt yang diuji segregasi Ciherang CH.5 15 21 3:1 0,14 CH.152 18 24 3:1 0 CH.153 17 26 3:1 1,28 CH.197 13 22 3:1 3,16 0,05* IR64 I.19 18 30 3:1 3,60 I.23 20 30 3:1 1,11 I.29 18 30 3:1 3,60 I.31 26 30 3:1 3,18 I.33 20 30 3:1 1,11 I.40 22 30 3:1 0,04 * sangat berbeda nyata pada selang kepercayaan 95%. X2 tabel (df=1, α0.05) = 3.841 Varietas
Galur
M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Kb 23 9 6 4
2,2 2,0
Gambar 17 Hasil hibridisasi Southern DNA tanaman IR64 yang ditransformasi dengan gen OsHox6. DNA diisolasi dari daun padi positif PCR hpt. Sampel DNA genom total di potong dengan EcoRI. Produk PCR hasil perbanyakan daerah penyandi gen hpt digunakan sebagai pelacak. M. Marka λ DNA HindIII, 1-12. Sampel DNA IR64 yang ditransformasi dengan gen OsHox6.
68
Persentase recovery (Survival Rate) Tanaman Transgenik Mengandung Ekstra Salinan Gen OsHox6 Sebanyak sepuluh galur, masing-masing 4 galur Ciherang (CH.5, CH.152, CH.153, dan CH.197) dan 6 galur IR64 (I.33, I.19, I.23, I.29, I.31, dan I.40) diseleksi di media mengandung higromisin 50 mgL-1 sebelum dievaluasi tingkat toleransinya terhadap kekeringan.
Semua tanaman kontrol yang tidak
ditransformasi tidak ada yang bertahan hidup setelah di kultur selama 2 minggu pada media yang mengandung higromisin 50 mgL-1, sebaliknya tanaman kontrol positif mengandung dan mengekpresikan hpt tumbuh normal (data tidak ditampilkan). Setelah dua minggu ditumbuhkan dimedia seleksi semua tanaman Ciherang yang berdasarkan PCR bersegregasi 3:1 tumbuh terhambat dan kemudian mati. Sebaliknya sebahagian besar tanaman T 1 IR64 tumbuh subur pada media mengandung higromisin 50 mgL-1. Tanaman toleran higromisin ini kemudian dipindahkan ke dalam pot dan ditumbuhkan selama 2 minggu untuk pemulihan sebelum selanjutnya diuji kekeringan. Evaluasi tingkat toleransi tanaman transgenik terhadap kekeringan dilakukan dengan tidak menyiram tanaman selama 14 hari.
Pada hari ke-14
semua daun tanaman sudah menggulung dan layu akibat kekeringan. Kadar air tanah pada hari ke-14 adalah 9,07 ± 1,96 (∼23% dari kapasitas lapang). Kadar air tanah kapasitas lapang adalah 39,28 ± 6,57 %.
Setelah disiram kembali
sebahagian tanaman segar kembali (Gambar 18). Tingkat toleran kekeringan dari masing-masing galur dihitung berdasarkan tingkat recovery (survival rate) tanaman padi umur 5 minggu yang dikeringkan selama 14 hari di rumah kaca, kemudian disiram kembali selama 4 hari sebelum pengamatan. Empat galur, yaitu IR64 I.23, I.40, I. 19, dan I.33 menunjukkan tingkat kelangsungan hidup (survival rate) yang lebih tinggi dibandingkan dengan tipe liarnya (Tabel 12), mengindikasikan bahwa OsHox6 meningkatkan toleransi tanaman padi terhadap cekaman kekeringan. Galur I.19 dan I.23 menunjukkan tingkat recovery paling tinggi (87,5%) dilanjutkan oleh galur, I.40, dan I.33 masing-masing dengan recovery 83,3 dan 62,5%. Dua galur, yaitu I.31 dan I.29, menunjukkan tingkat recovery yang lebih rendah (masing-masing 12,5 dan 0%) dari kontrol IR64 yang tidak ditransformasi (41,7%).
69
Gambar 18 Recovery tanaman transgenik galur IR64 tahan higromisin mengandung 1 salinan gen hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3. Tanaman ditumbuhkan selama 2 minggu pada kondisi normal, kemudian tidak disiram selama 14 hari dan dikembalikan pada kondisi normal selama 4 hari sebelum pengambilan foto.
Tabel 12 Tingkat recovery tanaman transgenik pada kondisi kekeringan Galur
Jumlah tanaman Total tanaman Tingkat recovery hidup hidup* yang diuji (%)** IR64 tipe liar 10 24 41,7 I.19 21 24 87,5 I.23 21 24 87,5 I.29 0 24 0 I.31 3 24 12,5 I.33 15 24 62, 5 I.40 20 24 83,3 * Tanaman padi transgenik umur 4 minggu yang dikeringkan selama 14 hari di rumah kaca, kemudian disiram kembali dan ditumbuhkan pada kondisi normal selama 4 hari. ** Jumlah tanaman hidup dibagi total tanaman yang diuji x 100%
70
Pertumbuhan Tanaman Transgenik Secara umum pertumbuhan tanaman transgenik hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 tidak berbeda nyata dengan tanaman padi yang tidak ditransformasi dan fertil. Pengamatan terhadap tinggi tanaman, pada kondisi normal, menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata antara galur tanaman transgenik dengan tanaman pembanding yang tidak ditransformasi (Gambar 19). Seperti halnya tanaman pada umumnya, kondisi kekurangan air menyebabkan tanaman transgenik menjadi lebih pendek.
Gambar 19 Tinggi tanaman beberapa galur toleran kekeringan. Data merupakan rataan dari 10 tanaman. Pengamatan dilakukan 1 minggu setelah disiram kembali. Pengamantan meliputi pada tanaman kontrol yang disiram (N) dan tanaman yang diberi perlakuan kekeringan (K).
Pembahasan Untuk mempelajari fungsi gen OsHox6 pada tanaman padi, dilakukan overekspresi gen OsHox6 pada dua varietas tanaman padi, yaitu IR64 dan Ciherang. IR64 dan Ciherang adalah dua varietas padi sawah irigasi yang tidak
71
toleran kekeringan. Padi IR64 dan Ciherang ditransformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3. Pengamatan pada generasi awal (T 0 ) menunjukkan fenotipe tanaman transgenik hasil transformasi dengan OsHox6 yang dikendalikan promoter OsLEA3 tidak berbeda nyata dengan fenotipe tanaman kontrol yang tidak ditransformasi dan fertil.
Analisis molekuler
berdasarkan PCR pada populasi tanaman T 0 dan T 1 padi Ciherang dan IR64 hasil transformasi dengan gen OsHox6 menunjukkan bahwa transgen diwariskan ke generasi T 1 IR64 dan Ciherang mengikuti segregasi 3:1 (Tabel 11). Karena tanaman yang akan digunakan dalam percobaan kekeringan ini adalah tanaman dari generasi bersegregasi atau belum homozigot (stabil) maka tanaman terlebih dahulu diseleksi pada media mengandung higromisin 50mgL-1. Namun, hanya tanaman transgenik IR64 yang hidup di media seleksi mengandung higromisin.
Diduga pada tanaman Ciherang transgenik terjadi mekanisme
pembungkaman gen seperti yang pernah dilaporkan sebelumnya (Li et al. 2002; Lin & Zhang 2005). Oleh karena itu, untuk evaluasi tingkat toleransi tanaman padi transgenik terhadap kekeringan maka pengamatan difokuskan pada ke-6 galur padi IR64 (yaitu I.33, I.19, I.23, I.29, I.31, dan I.40) yang mengandung ekstra salinan gen OsHox6 berdasarkan hasil analisis Southern. Hasil evaluasi tingkat toleransi keenam galur IR64 transgenik terhadap kekeringan menunjukkan tingkat toleransi yang bervariasi. Empat galur, yaitu I.23, I.40, I.19, dan I.33, menunjukkan tingkat toleransi yang lebih tinggi dari kontrol tipe liarnya berdasarkan pengamatan terhadap tingkat kelangsungan hidup (survival rate) pada fase vegetatif (Tabel 12). Sementara pada dua galur lainnya, yaitu I.31 dan I.29, lebih rendah dibandingkan dengan kontrol IR64 yang tidak ditransformasi.
Hal ini diduga berhubungan dengan ekspresi gen OsHox6,
sehingga analisis ekspresi gen dari masing-masing galur akan dilakukan untuk melihat korelasi antara peningkatan ekspresi gen OsHox6 dengan tingkat kelangsungan hidup tanaman transgenik.
Ekspresi transgen pada tanaman
transgenik dipengaruhi oleh jumlah salinan gen (Rai et al. 2007), posisi integrasi transgen (position-effect) di dalam genom (Bhattachryya et al. 1994) dan integritas transgen (Kohli et al. 2003). Meningkatnya toleransi beberapa galur IR64 (I.23, I.40, I. 19, dan I.33) hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang
72
dikendalikan
promoter
OsLEA3
mengindikasikan
bahwa
gen
OsHox6
bertanggungjawab dalam menentukan sifat toleran kekeringan. Penelitian ini menunjukkan bahwa transformasi gen OsHox6 yang dikendalikan promoter OsLEA3 pada tanaman padi IR64 tidak mempengaruhi pertumbuhan vegetatif tanaman (tinggi tanaman). penggunaan promoter terinduksi kekeringan.
Hal ini mungkin karena
Promoter OsLEA3 dilaporkan
menunjukkan aktivitas yang tinggi pada kondisi kekeringan, sedangkan pada kondisi normal ekspresinya rendah (Xiao & Xue 2001; Xiao et al. 2007). Penggunaan promoter konstitutif seperti promoter 35S dilaporkan menyebabkan tanaman menjadi tumbuh kerdil dan steril (Jaglo-Ottosen et al. 1998; Kasuga et al. 1999; Pino et al. 2007; Purwantomo 2007).
Simpulan Empat galur tanaman padi hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 lebih toleran terhadap kekeringan pada fase vegetatif.
Meningkatnya persentase recovery tanaman padi transgenik hasil
transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 mengindikasikan bahwa OsHox6 berperan dalam menentukan sifat toleran kekeringan. Tinggi tanaman padi hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 tidak berbeda dengan tanaman padi tipe liarnya.
VI. PEMBAHASAN UMUM Rhizobium Sebagai Agen Tranformasi Genetika Alternatif Transformasi genetika merupakan teknik yang rutin digunakan saat ini untuk mentransfer berbagai sifat penting pada tanaman dan untuk analisis fungsi gen. Diantara berbagai teknik transformasi genetika yang telah dikembangkan saat ini, teknik transformasi Agrobacterium merupakan teknik transformasi yang paling umum digunakan. Keunggulan teknik transformasi genetika menggunakan bantuan Agrobacterium adalah tidak diperlukan peralatan yang canggih dan kemungkinan untuk mendapatkan tanaman transgenik dengan salinan gen tunggal lebih tinggi dibandingkan dengan teknik transformasi genetika lain.
Namun,
teknik transformasi Agrobacterium telah dipatenkan sehingga menghambat pemanfaatannya
untuk pengembangan
pertanian
terutama
untuk negara
berkembang. Penggunaan bakteri selain Agrobacterium sebagai agen transformasi genetika memungkinkan untuk dilakukan dengan melibatkan T-DNA dan gen-gen virulen
dari
plasmid
transformasinya rendah.
Ti
yang
telah
dimodifikasi,
meskipun
efisiensi
Broothaerts et al. (2005) dan Wendt et al. (2010)
menggunakan bakteri pembentuk bintil akar (Rhizobia) dalam transformasi genetika beberapa tanaman termasuk padi, tembakau, Arabidopsis, dan kentang. Evaluasi efisiensi bakteri selain Agrobacterium dalam mentransfer gen ke dalam genom tanaman dibandingkan dengan A. tumefaciens perlu dilakukan sebagai langkah awal dalam pengembangan transformasi genetika tanaman menggunakan bakteri selain Agrobacterium. Untuk tujuan tersebut Rhizobium leguminosarum ANU845 dibandingkan dengan Agrobacterium tumefaciens LBA288 Hasil evaluasi terhadap efektifitas R. leguminosarum dalam mentransfer gen ke dalam tiga genotipe padi menunjukkan R. leguminosarum ANU845 yang telah direkayasa mampu mentransfer gen dengan efektifitas sama dengan A. tumefaciens LBA288. Berdasarkan efisiensi regenerasi dan transformasi, ekspresi gen (gus dan hpt), jumlah salinan gen target, pola pewarisan gen, serta pertumbuhan dan fertilitas tanaman tanaman hasil transformasi dengan kedua sistim transformasi (Tabel 13), R. leguminosarum efektif dalam melakukan
74
transfer gen. Oleh karena itu bakteri Rhizobium leguminosarum sangat potensial digunakan sebagai agen transformasi alternatif pada tanaman padi. Aspek penting lain yang juga perlu dilihat adalah kemungkinan penyisipan daerah di luar T-DNA. Penyisipan daerah tulangpunggung plasmid di luar TDNA ini tidak diinginkan, terutama jika disertai dengan penyisipan gen penyandi antibiotik (misalnya, ampisilin, tetrasiklin) yang tidak diperbolehkan ada di dalam tanaman transgenik, sehingga dapat menimbulkan masalah dalam pelepasan (EFSA 2004). Kemungkinan penyisipan daerah di luar T-DNA pada transformasi menggunakan Agrobacterium adalah 20-30% (Martineau et al. 1994 ), sedangkan Rhizobium belum diketahui. Keberhasilan transformasi menggunakan bakteri Rhizobia sangat tergantung pada genotipe tanaman serta species atau strain bakteri yang digunakan (Broothearts et al. 2005, Wendt et al. 2010). Selain itu, bahan tanaman (eksplan) yang digunakan sangat berpengaruh terhadap keberhasilan transformasi. Beberapa protokol transformasi Agrobacterium yang sesuai untuk genotipe tanaman padi tertentu telah dikembangkan (Hiei & komari 2008). Protokol ini mungkin dapat diaplikasikan pada transformasi genetika padi menggunakan Rhizobium atau bakteri selain Agrobacterium agar diperoleh efisiensi transformasi yang lebih tinggi. Rhizobium leguminosarum sangat potensial digunakan sebagai agen transformasi alternatif pada tanaman.
Agar teknik transformasi genetika
menggunakan perantara Rhizobium dapat digunakan lebih luas di masa mendatang maka tersedianya plasmid yang lebih kecil dan mudah dimanipulasi secara in vitro diperlukan. pCAMBIA 5106 adalah plasmid cointegratif yang memiliki ukuran yang besar (∼42 Kb) dan situs restriksi unik yang diperlukan untuk proses kloning gen sangat terbatas. Oleh karena itu, meskipun pCAMBIA 5106 masih dapat digunakan, penggunaan plasmid yang lebih mudah dimanipulasi secara invitro (plasmid biner) akan lebih bermanfaat.
75
Tabel 13 Perbandingan antara transformasi menggunakan bantuan A. tumefaciens dengan R. leguminosarum Parameter Efisiensi regenerasi Efisiensi transformasi Jumlah tanaman mengekspresikan gen hpt Rata-rata jumlah salinan gen Pola segregasi gen Fenotipe
Agen transformasi A. tumefaciens R.leguminosarum 4,85 – 37,21 5,84 – 59,38 1,14 – 3,41 2,05 – 12,05 >80% 1,35 Mendel Normal, fertil
>60% 1.20 Mendel Normal, fertil
Pendekatan Reverse Genetic untuk Mempelajari Peranan Gen OsHox6 Untuk mempelajari fungsi gen OsHox6 diperlukan tanaman transgenik yang ekspresi gen OsHox6-nya diubah dari kondisi normalnya, yaitu dengan meningkatkan ekspresi (overekspresi) dan menghilangkan ekspresi (knockout) OsHox6. Untuk meningkatkan expresi gen OsHox6, tanaman padi ditransformasi menggunakan plasmid mengandung gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3. Hasil transformasi tanaman padi diperoleh 6 galur tanaman padi varietas IR64 transgenik yang mengandung satu salinan gen tunggal dan bersegregasi 3:1 berdasarkan PCR hpt. Namun, konfirmasi lebih lanjut mengenai level ekspresi gen OsHox6 pada tanaman transgenik masih perlu dilakukan. Tanaman transgenik OsHox6 yang diharapkan mengoverekspresikan OsHox6 ini selanjutnya digunakan untuk analisis selanjutnya.
Sebaliknya, tanaman yang
tidak mengekspresikan OsHox6 belum diperoleh sehingga data atau informasi mengenai pengaruh peniadaan ekspresi gen OsHox6 tidak dapat dilaporkan. Regulasi gen OsHox6 diprediksi menggunakan analisis bioinfomatik promoter gen OsHox6, sedangkan analisis pola ekspresi gen OsHox6 dilakukan dengan menggunakan padi transgenik yang mengandung fusi promoter OsHox6 dengan gen pelapor β-glucuronidase. Analisis bioinfomatik promoter gen OsHox6 menunjukkan bahwa aktivitas promoter OsHox6 diregulasi oleh kekeringan dan ABA ditandai oleh adanya cisacting elemen yang penting untuk respon kekeringan (MYB1 dan MYC, ABRE like/ERD1, ERD1, dan LTRE) dan respon ABA (ABRE related sequences,
76
CGCG Box, SORLIP1 dan SORLIP2). Keberadaan elemen cis-acting terkait respon kekeringan merupakan salah satu petunjuk awal bahwa aktivitas promoter diregulasi oleh kekeringan, meskipun tidak ada jaminan efektifitas ekspresi gen. Oleh karena itu analisis fungsi dari kandidat promoter perlu dilakukan dengan menggabungkan kandidat promoter dengan suatu gen pelapor dan mengujinya pada kondisi cekaman kekeringan. Hasil analisis ekspresi gen GUSPlus yang dikendalikan oleh promoter OsHox6 padi menunjukkan bahwa aktivitas promoter OsHox6 diregulasi oleh kekeringan.
Ekspresi gen OsHox6, yang disimpulkan dari pola ekspresi fusi
promoter OsHox6 dengan gen GUSPlus, menunjukkan aktivitas promoter OsHox6 meningkat pada saat ada cekaman kekeringan. Ekspresi GUSPlus diakumulasikan pada jaringan muda yang aktif membelah (buku batang, daerah pertemuan antara helaian daun dengan pelepah daun, dan dasar bunga), mengindikasikan bahwa ekspresi gen OsHox6 tinggi pada jaringan meristematis. Pola ekspresi OsHox6 pada batang berbeda dengan organ lainnya. Pada batang ekspresi GUSPlus dapat diamati pada tahap awal dehidrasi, sedangkan pada akar, daun dan bunga ekspresi GUSPlus baru dapat diamati setelah tanaman mengalami kekeringan lebih lanjut (6-7 hari), mengindikasikan adanya kemungkinan mekanisme regulasi gen OsHox6 yang berbeda pada batang dan organ lainnya. Pola ekspresi GUSPlus yang dikendalikan promoter OsHox6 ini mirip dengan ekspresi gen TLD1/OsGH3.13 yang terkait dengan keseimbangan hormon pertumbuhan auksin (IAA) (Zhang et al.
2009).
Hormon pertumbuhan
dilaporkan berinteraksi dengan gen HD-Zip sub-famili I. Deng et al. (2006) melaporkan tanaman yang mengoverekspresikan CpHB-7 (HD-Zip I) menjadi kurang sensitif terhadap ABA selama perkecambahan.
Selanjutnya OsHox4
berfungsi sebagai represor dalam respon giberelin (Dai et al. 2008), menyebabkan tanaman menjadi kerdil akibat panjang sel berkurang.
Berdasarkan hasil
penelitian ini diduga OsHox6 berperan dalam pengaturan pertumbuhan tanaman padi dalam respon terhadap cekaman kekeringan. pertumbuhan dengan OsHox6 belum diketahui.
Interaksi antara hormon
Penelitian lebih lanjut untuk
mempelajari pengaruh hormon terhadap ekspresi gen yang dikendalikan oleh promoter OsHox6 akan dilakukan.
77
Evaluasi awal tingkat toleransi galur padi transgenik OsHox6 terhadap kekeringan mengindikasikan bahwa gen OsHox6 berperan penting dalam mekanisme toleran kekeringan pada tanaman padi. Empat (IR64 I.23, I.40, I. 19, dan I.33) dari enam galur padi transgenik OsHox6 yang diuji menunjukkan tingkat toleransi yang lebih tinggi dari kontrol tipe liarnya berdasarkan pengamatan terhadap tingkat recovery dari masing-masing galur. Persentase recovery tanaman setelah diberi perlakuan cekaman kekeringan selama 14 hari digunakan sebagai indikator awal tanaman toleran kekeringan. Evaluasi lebih lanjut akan dilakukan pada fase pertumbuhan generatif menggunakan galur stabil (homozigot) yang mengoverekspresikan OsHox6. Hasil pengamatan terhadap tinggi tanaman padi transgenik hasil transformasi gen OsHox6 yang dikendalikan promoter terinduksi kekeringan menunjukkan tidak ada perbedaan antara tanaman transgenik dengan tanaman kontrol padi tipe liarnya.
Upaya Lebih Lanjut Analisis Fungsi Gen OsHox6 pada Tanaman Padi Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui cara kerja OsHox6 dalam merespon kekeringan. Identifikasi gen-gen yang ekspresinya berubah pada tanaman yang mengoverekspresikan OsHox6 akan membantu menjelaskan peranan gen OsHox6 dalam membantu tanaman padi beradaptasi terhadap cekaman kekeringan. Sejauh ini, berdasarkan fungsi ada 8 kelompok gen yang berperan dalam merespon kekeringan, yaitu protein yang berperan dalam sintesa osmoprotektan, reactive oxygen spesies (ROS), protein stres, ion atau proton transporter, protein yang mengendalikan status air sel, komponen sinyal, kontrol transkripsi, dan pengaturan pertumbuhan (Cushman & Bohnert 2000). Analisis microarray dapat membantu mengidentifikasi gen yang ekspresinya dipengaruhi oleh ekspresi gen OsHox6. Selanjutnya pengamatan yang lebih mendetil terhadap karakter morfologi (ukuran sel, tinggi tanaman, daya hasil, dsb), fisiologi (status air daun, konduktan stomata, potensial air daun, fotosintesa, dsb), dan biokimia (prolin,
gula,
asam
amino,
protein
LEA,
dsb)
pada
tanaman
yang
mengoverekspresikan OsHox6 akan membantu memperjelas peranan OsHox6 dalam merespon kekeringan.
78
Selanjutnya, informasi dari hasil pengamatan pada tanaman mutan yang ekspresi gen OsHox6 dihambat diperlukan agar kesimpulan mengenai fungsi gen OsHox6 lebih akurat. Akhir-akhir ini pendekatan RNAi (RNA interference juga dikenal dengan post-transcriptional gene silencing atau disingkat PTGS) umum dilakukan karena sangat efektif dalam menghambat kerja suatu gen (Matthew 2004; Small 2007). Pada beberapa gen terutama jika ada dua gen yang memiliki fungsi yang mirip pada tanaman seperti yg terjadi pada gen OsHox4 dengan OsHox20, pendekatan dengan menghilangkan satu fungsi gen sering kurang efektif dan tidak memberikan fenotipe yang jelas berbeda (Agalou et al. 2008). Hal ini dapat diatasi dengan menghilangkan fungsi beberapa gen sekaligus yang memiliki fungsi yang mirip atau sama (Zhang 2003).
79
VII. SIMPULAN UMUM DAN SARAN
SIMPULAN UMUM R. leguminosarum ANU845 yang telah direkayasa mampu mentransfer gen dengan efektifitas yang sama dengan A. tumefaciens LBA288, sehingga memungkinkan untuk digunakan sebagai agen transformasi alternatif untuk rekayasa genetika tanaman. Seperti halnya terformasi Agrobacterium, maka tingkat keberhasilan transformasi menggunakan Rhizobium dipengaruhi oleh genotipe tanaman yang digunakan Analisis bioinformatik promoter OsHox6 mengindikasikan bahwa aktivitas promoter OsHox6 diregulasi oleh kekeringan dan ABA.
Pola ekspresi gen
GUSPlus, menunjukkan aktivitas promoter OsHOx6 meningkat pada saat ada cekaman kekeringan dan aktif pada jaringan meristem. Meskipun skenario utuh mekanisme molekuler toleran kekeringan yang disebabkan oleh OsHox6 masih belum sepenuhnya diketahui, tingkat survival rate pada fase vegetatif mengindikasikan bahwa OsHox6 bertanggung jawab dalam menentukan sifat toleran kekeringan pada tanaman padi.
SARAN Agar transformasi genetik menggunakan Rhizobium dapat lebih luas digunakan pada tanaman maka perlu menggunakan plasmid biner yang lebih kecil dan lebih mudah dimanipulasi secara in vitro. Evaluasi lebih lanjut ketahanan tanaman transgenik stabil (homozigot) yang mengoverekspresikan OsHox6 pada fase generatif terhadap kekeringan perlu dilakukan. Selanjutnya analisis fenotip tanaman padi yang tidak mengekspresikan gen OsHox6 perlu dilakukan untuk melengkapi data fungsi gen OsHox6 sehingga penjelasan tentang peranan gen OsHox6 pada tanaman padi lebih komprehensif. Identifikasi
gen-gen
yang
ekspresinya
berubah
pada
tanaman
yang
mengoverekspresikan OsHox6 membantu untuk menjelaskan mekanisme gen OsHox6 dalam mengendalikan sifat toleran kekeringan.
DAFTAR PUSTAKA Abe H, Urao T, Ito T, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2003. Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in absisic acid signaling. Plant Cell 15:63-78. Agalou A, Purwantomo S, Overnas E, Johannesson A, Zhu X, Estiati A, Kam RJ de, Engstrom P, Slamet-Loedin IH, Zhu Z, Wang M, Xiong L, Meijer AH, Ouwerkerk PBF. 2008. A genome-wide survey of HD-Zip genes in rice and analysis of drought-responsive family members. Plant Mol Biol 66:87-103. Aharoni A, Dixit S, Jetter R, Thoenes E, van Arkel G, Pereira A. 2004. The SHINE Clade of AP2 Domain transcription Factors Activates Wax Biosynthesis, Alters Cuticle Properties, and Confers Drought Tolerance when Overexpressed in Arabidopsis. Plant Cell 16:2463-2480. Al-Quraini F, Khan S. 2009. Mutagenic effects of sodium azide and its application in crop improvement. World Appl Sci J 6:1589-1601. Ariel FD, Manavella PA, Dezar CA, Chan RL. 2007. The true story of the HDZip family. Trends Plant Sci 12:419-426. Ariel FD, Diet A, Crespi M, Chan RL. 2010. The LOB-like transcription factor Mt LBD1 controls Medicago truncatula root architecture under salt stress. Plant Signal Behav 5:1666-1668. Aso K, Kato M, Banks JA, Hasebe M. 1999. Characterization of homeodomainleucine zipper genes in the fern Ceratopteris richardii and the evolution of the homeodomain-leucine zipper gene family in vascular plants. Mol Biol Evol 16:544-552. [BPS] Badan Pusat Statistik Republik Indonesia. 2009. Tanaman Pangan – Statistik Indonesia. http://www.bps.go.id/tnmn_pgn.php. [9 Desember 2011]. Baker SS, Wilhelm KS, Thomashow MF. 1994. The 5’-region of Arabidopsis thaliana cor15a has cis-acting elements that confer cold-, drought-, and ABA-regulated gene expression. Plant Mol Biol 24:701-713. Bartels D, Sunkar R. 2005. Drought and salt tolerance in plants. Crit Rev Plant Sci 24(1):23-58. Bhatnagar-Mathur P, Vadez V, Sharma KK. 2008. Transgenic approaches for abiotic stress tolerance in plants: retrospect and prospects. Plant Cell Rep 27:411-424.
82
Bhattachryya BA, Stermer BA, Dixon RA. 1994. Reduced variation in transgen expression from a binary vector with selectable markers at the right and left T-DNA borders. Plant J 6:957-968. Bohnert HJ, Nelson DF, Jenson RG. 1995. Adaptation to environmental stresses. Plant Cell 7:1099-1111. Boulin T, Etchberger JF, Hobert O, Hughes H. 2006. Reporter gene fusion. http://www.wormbook.org/chapters/www_reportergenefusions/reportergene fusions.pdf. [13 September 2011] Broothaerts W, Mitchell H, Weir B, Kaines S, Smith LMA, Mayer JE, RoaRodriguez C, Jefferson RA. 2005. Gene transfer to plants by diverse species of bacteria. Nature 433: 629-633. Capell T, Bassie L, Christou P. 2004. Modulation of the polyamine biosynthetic pathway in transgenic rice confers tolerance to drought stress. PNAS 101:9909-9914. Cellier F, Conejero G, Breitler JC, Casse F. 1998. Molecular and physiological response to water deficit in drought toleran and drought sensitive lines of sunflower. Plant Physiol 116:319-328. Chatzidimitriadou K, Nianiou-Obeidat I, Madesis P, Perl-Treves R, Tsaftaris A. 2009. Expression of SOD transgene in pepper confer stress tolerance and improve shoot regeneration. Electr J Biotechnol 12(4):1-9. Chavez MM, Maroco JP, Pereira JS. 2003. Understanding plant responses to drought-fom genes to the whole plant. Funct Plant Biol 30:239-264. Chen BJ, Wang Y, Hu YL, Wu Q, Lin ZP. 2005. Cloning and characterization of a drought inducible MYB gene from Boea crassifolia. Plant Sci 168:493-500. Chilton MD. 2005. 23:309-310.
Adding diversity to plant transformation.
Nat Biotech
Cho EK, Hong CB. 2006. Overexpression of tobacco NtHSP70-1 contributes to drought stress tolerance in plant. Plant Cell Rep. 25:349-358. Clemente TE, LaVallee BJ, Howe AR, Conner-Ward D, Rozman RJ, Hunter PE, Broyles DL, Kasten DS, Hinchee MA. 2000. Progeny analysis of glyphosate selected transgenic soybeans derived from Agrobacteriummadiated transformation. Crops Sci 40:797-803. Cominelli E, Galbiati M, Tonelli C. 2010. Transcription factors controlling stomatal movements and drought tolerance. Transcription 1:41-45.
83
Cominelli E, Galbiati M, Vavasseur A, Conti L, Sala T, Vuylsteke M, Leonhardt N, Dellaporta SL, Tonelli C. 2005. A guard-cell-specific MYB transcription factor regulates stomatal movements and plant drought tolerance. Curr Biol 15:1196-2000. Cushman JC, Bohnert H. 2000. Genomic approaches to plant stress tolerance. Curr Opin Plant Biol 3:117-124. Dai M, Hu Y, Ma Q, Zhao Y, Zhou DX. 2008. Functional analysis of rice HOMEOBOX4 (Oshox4) gene reveals a negative function in gibberellin responses. Plant Mol Biol 66:289-301. Dai S, Zheng P, Marmey P, Zhang S, Tian W, Chen S, Beachy RN, Fauquet C. 2001. Comparative analysis of transgenic rice plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation and particle bombardment. Mol Breed 7:25-33. Darley CP, Wuytswinkel OCM van, Woude K van der, MAGER WH, Boer de. 2000. Arabidopsis thaliana and Saccharomyces cerevisiae NHX1 genes encode amiloride sensitive electroneutral Nau/Hu exchangers. Biochem J 351:241-249. Deng X, Phillips J, Meijer AH, Salamini F, Bartels D. 2002. Characterization of five novel dehydration-responsive homeodomain leucine zipper genes from the resurrection plant Craterostigma plantagineum. Plant Mol Biol 49:601610. Deng X, Phillips J, Brautigam A, Engstrom P, Johannesson H, Ouwerkerk PBF, Ruberti I, Salinas J, Vera P, Iannacone R, Meijer AH, Bartels D. 2006. A homeodomain leucine zipper gene from Craterostigma plantagineum regulates abscisic acid responsive gene expression and physiological responses. Plant Mol Biol 61:469-489. Deokar AA, Kondawar V, Jain PK, Karuppayil SM, Raju NL, Vadez V, Varsney RK, Srinivasan R. 2011. Comparative analysis of expressed sequence tags (ESTs) between drought-tolerant and -susceptible genotypes of chickpea under terminal drought stress. BMC Plant Biol 11:70. www. biomedcentral.com/1471-2229/11/70. [13 September 2011] Dezar CA, Gago GM, Gonzalez DH, Chan RL. 2005a. HAHB-4, a sunflower homeobox-leucine zipper gene, confers drought tolerance to Arabidopsis thaliana plants. Transgen Res. 14:429-440. Dezar CA, Fedrigo GV, Chan RL. 2005b. The promoter of the sunflower HDZip protein gene Hahb4 directs tissue-specific expression and is inducible by water stress, high salt concentrations and ABA. Plant Sci. 169: 447-456.
84
Eltayeb AE, Kawano N, Badawi GH, Kaminaka H, Sanekata T, Shibahara T, Inanaga S, Tanaka K. 2007. Overexpression of monodehydroascorbate reductase in transgenic tobacco confers enhanced tolerance to ozone, salt and polyethylene glycol stresses. Planta 225:1255-1264. [EFSA] European Food Safety Authority. 2004. Opinion of the Scientific Panel on Genetically Modified Organisms on the use of antibiotic resistance genes as marker genes in genetically modified plants. The EFSA J 48:1-18. [FAOSTAT] Food and Agricultural Organization Statistic. 2009. Food and agricultural production. faostat.fao. org/site/339/default.aspx. [9 Desember 2011] Fleury D, Jefferies S, Kuchel H, Langridge P. 2010. Genetic and genomic tools to improve drought tolerance in wheat. J Exp Bot 61: 3211-3222. Foyer C, Valadier M, Migge A, Becker T. 1998. Drought-Induced Effects on Nitrate Reductase Activity and mRNA and on the Coordination of Nitrogen and Carbon Metabolism in Maize Leaves. Plant Physiol 117: 283-292. Frank W, J Philips, F Salamini, D Bartels. 1998. Two dehidration inducible transcrip from the resurrection plant Craterostigma plantagineum encode interacting homeodomain leucin zipper protein. Plant J 15:413-421. Fukai S. Cooper M. 1995. Development of drought -resistant cultivars using physio-morfological traits in rice. Field Crops Res 40:67-86. Gao F H, Zhang H L, Wang H G, Gao H, Li ZC. 2009. Comparative transcriptional profiling under drought stress between upland and lowland rice (Oryza sativa L.) using cDNA-AFLP. Chin Sci Bull 54: 3555-3571. Gao SQ, Chen M, Xu ZS, Zhao CP, Li L, Xu HJ, Tang YM, Zhao X, Ma YZ. 2011. The soybean Gmbzip1 transcription factor enhances multiple abiotic stress tolerances in transgenic plants. Plant Mol Biol. 75:537-553. Garg AK, Kim JK, Owens TG, . Ranwala AP, Choi YD, Kochian LV, Wu RJ. 2002. Trehalose accumulation in rice plants confers high tolerance levels to different abiotic stresses. PNAS 9:15898-15903. Ge X, Chu Z, Lin Y, Wang S. 2006. A tissue culture system for different germplasms of indica rice. Plant Cell Rep 25:392-402. Gelvin SB. 2005. Gene exchange by design. Nature 433: 583-584.
85
Gepts P, Aragão FJL, de Barros E, Blair MW, Brondani R, Broughton W, Galasso I, Hernández G, Kami J, Lariguet P, et al. 2008. Genomics of Phaseolus beans, a major source of dietary protein and micronutrients in the tropics. In Moore PH & Ming R editors. Genomics of Tropical Crop Plants. USA: Sringer. p.113-143. Goff A, Ricke D, Lan TH, Presting G, Wang R, Dunn M, Glazebrook J, Sessions A, Oeller P, Varma H, et al. 2002. A Draft Sequence of the Rice Genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science 296: 92-100. Grace ML, Chandrasekharan MB, Hall TC, Crowe AJ. 2004. Sequence and spacing of TATA box elements are critical for accurate initiation from the beta-phaseolin promoter. J Biol Chem 279:8102-8110. Guo L, Wang ZY, Lin H, Cui WE, Chen J, Liu M, Chen ZL, Qu LJ, Gu H. 2006. Expression and functional analysis of the rice plasma membrane intrinsic protein gene family. Cell Res 16:277-286. Haake V, Cook D, Riechmann JL, Pineda O, Thomashow MF, Zhang JZ. 2002. Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis. Plant Physiol 130:639-648. Harris JC, Hrmova M, Lopato S, Langridge P. 2011. Modulation of plant growth by HD-Zip class I and II transcription factors in response to environmental stimuli. New Phytol 190:823-837. Harushima Y, Yano M, Shomura A, Sato M, Shimano T, Kuboki Y, Yamamoto T, Lin SY, Antonio BA, Parco A, et al. 1998. A high-density rice genetic linkage map with 2275 markers using a single F2 population. Genetics 148:479-494. Henriksson E, Olsson ASB, Johannesson H, Johansson H, Hanson J, Engstrom P, and Soderman E. 2005. Homeodomain leucine zipper class I genes in Arabidopsis: Expression patterns and phylogenetic relationships. Plant Physiol 139:509-518. Heusden WA van, Ooijen JW van, Ginkel RV van, Verbeek WHJ, Wietsma WA, and Kik C. 2000. A genetic map of an interspecific cross in Allium based on amplified fragment length polymophism (AFLPTM) markers. Theorr Appl Genet 100:118-126. Hiei Y, Komari T. 1996. Stable inheritance of transgenes in rice plants transformed by Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the Third Rice Genetic Symposium. Philippines: Manila 16-20 Oct. p. 131-142. Hiei Y, Komari T. 2006. Improved protocols for transformation of indica rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Tiss Org Cult 87: 233243.
86
Hiei Y, Komari T. 2008. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nat Protocols 5:824834. Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T. 1994. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J 6: 271-282. Hiwatashi Y, Fukuda H, 2000. Tissue-Specific Localization of RNA for Carrot Homeobox Genes, CHBs,in Carrot Somatic Embryos. Plant Cell Physiol. 41: 639-643. Hjellstrom M, Olsson ASB, Engstrom P, Soderma EM. 2003. Constitutive expression of the water deficit-inducible homeobox gene ATHB7 in transgenic Arabidopsis causes a suppression of stem elongation growth. Plant, Cell & Env 26:1127-1136. Hoekema A, Roelvink PW, Hooykaas PJJ, Schilperoort RA. 1984. Delivery of T-DNA from the Agrobacterium tumefaciens chromosome into plant cells. EMBO J 3(11):2485-2490. Hu H, Dai M, Yao J, Xiao B, Li X, Zhang Q, Xiong L. 2006. Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice. PNAS 103:12987-12992. Huang XY, Chao DY, Gao JP, Zhu MZ, Shi M, Lin HX. 2009. A previously unknown zinc finger protein,DST, regulates drought and salt tolerance in rice via stomatal aperture control. Genes Dev. 23: 1805-1817. Huang XS, Liu JH, Chen XJ. 2010. Overexpression of PtrABF gene, a bZIP transcription factor isolated from Poncirus trifoliata, enhances dehydration and drought tolerance in tobacco via scavenging ROS and modulating expression of stress-responsive genes. 10(1):230. http://www. biomedcentral.com/1471-2229/10/230. [8 Januari 2012]. Hudson ME, Quail PH. 2003. Identification of promoter motifs involved in the network of phytochrome A-regulated gene expression by combined analysis of genomic sequence and microarray data. Plant Physiol 113:1605-1616. Ito Y, Katsura K, Maruyama K, Taji T, Kobayashi M, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2006. Functional analysis of rice DREB1/CBFtype transcription factors involved in cold-responsive gene expression in transgenic rice. Plant Cell Physiol 47(1): 141-153. Itoh JI, Hibara KI, Sato Y, Nagato Y. 2008. Developmental Role and Auxin Responsiveness of Class III Homeodomain Leucine Zipper Gene Family Members in Rice. Plant Physiol 147:1960-1975.
87
Jaglo-Ottosen KR, Gilmor SJ, Zarka DG, Schabenberger O, Tomashow MF. 1998. Arabidopsis CBF1 over-expression induces COr genes and enhances freezing tolerance. Science 280:104-106. Jahne A, Becker D, Lorz H. 1995. Genetic engineering of cereal crop plants: a review. Euphytica 85(1-3):35-44. Jain M, Tyagi AK, Khurana JP. 2006. Molecular characterization and differential expression of cytokinin-responsive type-A response regulators in rice (Oryza sativa). BMC Plant Biol. 6:1. http://www.biomedcentral.com/ 1471-2229/6/1. [8 Januari 2012]. Jambresic S. 2005. Transbacter: gene transfer by open sourcery. Checkbiotech. http://www. checkbiotech.org. [15 Juli 2005]. Jeon JS, An G. 2001. Gene tagging in rice: a high throughput system for functional genomics. Plant Sci 161:211-219. Jiao Y, Ma L, Strickland E, Deng XW. 2005. Conservation and divergence of light-regulated genome expression patterns during seedling developmentin rice and Arabidopsis. Plant Cell 17:3239-3256. Johannesson H, Wang Y, Hanson J, Engstrom P. 2003. The Arabidospis thaliana homeobox gene ATHB5 is a potensial regulator of abscisic acid responsiveness in developing seedlings. Plant Mol Biol. 51:719-729. Kalsim DK. 2007. Kekeringan dan berbagai permasalahannya. dedikalsim.files.wordpress.com/2011/03/kekeringan-dan-berbagai-permasa lahannya.pdf. [13 September 2011] Kaplan B, Davydov O, Knight H, Galon Y, Knight MR, Fluhr R, Fromm H. 2006. Rapid transcriptome changes induced by cytosolic Ca2+ transients reveal ABRE-relatedsequences as Ca2+-responsive cis elements in Arabidopsis. Plant Cell 18:2733-2748. Karaba A, Dixit S, Greco R, Aharoni A, Trijatmiko KR, Marsch-Martinez N, Krishnan A, Nataraja KN, Udayakumar M, Pereira A. 2007. Improvement of water use efficiency in rice by expression of HARDY, an Arabidopsis drought and salt tolerance. AJB 9:8378-8391. Karakas B, Ozias-Akins P, Stushnoff C, Suefferheld M, Rieger M. 1997. Salinity and drought tolerance of mannitol-accumulating transgenic tobacco. Plant Cell Env 20:609-616. Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, and Shinozaki K. 1999. Improving plant drought, salt and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nat Biotech 17:287-291.
88
Kilstrup M, Kristiansen KN. 2000. Rapid genome walking: a simplified oligocasette mediated polymerase chain reaction using a single genome-spesific primer. Nucl Acids Res 28(11):1-3. Kim YS, Schumaker KS, Zhu JK. 2006. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. In Salinas J and Sanchez-Serrano JJ Editors. Methods in Molecular Biology, vol. 323: Arabidopsis Protocols. 2nd Ed. NJ: Humana Press Inc. p. 101-103. Ko J, Kim Y, Kim J, Yeom M, Lee IC, Nam HG. 2007. A GUS/Luciferase fusion reporter for plant gene trapping and for assay of promoter activity with Luciferin-dependent control of the reporter protein stability. Plant Cell Physiol 48: 1121-1131. Kohli A, Leech M, Vain P, Laurie DA, Christou P. 1998. Transgene organization in rice engineered through direct DNA transfer supports a two-phase integration mechanism mediated by the establishment of integration hot spots. PNAS 95:7203-7208. Kohli A, Twyman RM, Abranches R, Wegel E, Stoger E, Christou P. 2003. Transgene integration, organization and interaction in plants. Plant Mol Biol 52:247-258. Komari T, Hiei Y, Ishida Y, Kumashiro T, Kubo T. 1998. Advances in cereal gene transfer. Curr Opin Biotechnol. 1:161-165. Kusaba M. 2004. RNA interference in crop plants. Curr Opin Biotechnol. 15:139-143. Lang NT, Buu BC. 2010. Quantitative trait loci influencing drought tolerance in rice (Oryza sative L). Omonrice 17:22-28. Lee LY, Gelvin SB. 2008. Update on T-DNA binary vectors. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol 146:325-332. Lee YP, Kim SH, Bang JW, Lee HS, Kwak SS, Kwon SY. 2007. Enhanced tolerance to oxidative stress in transgenic tobacco plants expressing three antioxidant enzymes in chloroplasts. Plant Cell Rep 26:591-598. Levitt J. 1972. Responses of Plants to Environmental Stresses. New York: Academic Press. Levitt J. 1980. Responses of Plant to Environmental Stresses. Vol II: Water, radiation, salt and other stresses. New York: Academic Press. Li DD, Shi W, Deng XX. 2002. Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic calluses of Ponkan Mandarin and the regeneration of plants containing the chimeric ribonuclease gene. Plant Cell Rep 21: 153-156.
89
Li WX, Oono Y, Zhu J, He XJ, Wu JM, Iida K, Lu XY, Cui X, Jin H, Zhu JK. 2008. The Arabidopsis NFYA5 Transcription factor is regulated transcriptionally and posttranscriptionally to promote drought resistance. Plant Cell 20:2238-2251. Li YJ, Hai RL, Du XH, Jiang XN, Lu H. 2009. Over-expression of a Populus peroxisomal ascorbate peroxidase (PpAPX) gene in tobacco plants enhances stress tolerance. Plant Breed 128:404-410. Lin YJ, Zhang Q. 2005. Optimizing the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice. Plant Cell Rep 23: 250-547. Lloyd A. 2003. Vector construction for gene overexpression as a tool to elucidate gene function. In Grotewold E. editor. Methods in Molecular Biology: Plant Functional Genomic. Vol. 236. NJ Totowa: Humana Press Inc. p.239-334. Lodhi MA, Ye GN, Weeden NF, & Reisch BI. 1994. A simple and efficient methode for DNA extraction. Plant Mol Biol Rep 12: 6-13. Lopato S, Langridge P. 2011. New knowledge to make more drought resistant crops possible. http://greenbio.checkbiotech.org/news/new_knowledge _make_ more_drought_resistant_crops_possible. [13 September 2011]. Lorenz WW, Alba R, Yu YS, Bordeaux JM, Simões M, Dean JFD. 2011. Microarray analysis and scale-free gene networks identify candidate regulators in drought-stressed roots of loblolly pine (P. taeda L.). BMC Genomics 12:264. http://www.biomedcentral.com/1471-2164/12/264 [8 Januari 2012] Lu YY, Deng XP, Kwa SS. 2010. Over expression of CuZn superoxide dismutase (CuZnSOD) and ascorbate peroxidase (APX) in transgenic sweet potato enhances tolerance and recovery from drought stress. AJB 9:83788391. Ludlow MM. 1989. Strategies of responses to water stress. In Kreeb KH, Richter H, Hinckley TM Editors. Structural and Functional Responses to Environmental Stresses. The Haag: SPB Academic. P. 269-281 Manavella PA, Dezar CA, Ariel FD, Chan RL. 2008. Two ABREs, two redundant root-specific and one W-box cis-acting elements are functional in the sunflower HAHB4 promoter. Plant Physiol Biochem 46:860-867. Martineau B, Voelker TA, Sanders RA. 1994. On defining T-DNA. Plant Cell. 1032-1033
90
Mattana M, Biazzi E, Consonni R, Locatelli F, Vannini C, Provera S, Coraggio I. 2005. Overexpression of Osmyb4 enhances compatible solute accumulation and increases stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Physiol Plant 125(2):212-223. Matthew L. 2004. RNAi for plant functional genomics. Comp Funct Genom 5: 240-244. McClean P. 1998. Principles of Map-based or Positional Cloning. http://www.ndsu.edu/pubweb/~mcclean/plsc731/map-based/map-based1 .htm. [13 September 2011]. McCouch SR, Teytelman L, Xu Y, Lobos KB, Clare K, Walton M, Fu B, Maghirang R, Li Z, Xing Y, et al. 2002. Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice (Oryza sativa L.). DNA Res 9:199-207. Medini M, Baum M, Hamza S. 2009. Transcript accumulation of putative drought responsive genes in drought-stressed chickpea seedlings. AJB 8:4441-4449. Meijer AH, de Kam RJ, d’Erfurth I, Shen W, Hoge JHC. 2000. HD-Zip proteins of families I and II from rice: interactions and functional properties. Mol Gen Genet 263(1):12-21. Mitra J. 2001. Genetics and genetic improvement of drought resistance in crop plants. Curr Sci 80:758-763. Miyata S, Urao T, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. 1998. Characterization of genes for two-component phosphorelay mediator with a single HPt domain in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett 437:11-14. Mundree SG, Baker B, Mowla S, Peters S, Marais S, Willigen CV, Govender K, Maredza A, Muyanga S, Farrant JM, Thomson JA. 2002. Physiological and molecular insights into drought tolerance. AJB 1(2):28-38. Nakashima K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2005 Molecular studies on stressresponsive gene expression in Arabidopsis and improvement of stress tolerance in crops plants by regulon biotechnology. JARQ 39:221-229. Nakayama H, Yoshida K, Ono H, Murooka Y, Shin A. 2000. Ectoine, the compatible solute of Halomonas elongata, confers hyperosmotic tolerance in cultured tobacco cells. Plant Physiol 122:1239-1247. Naylor R, Battisti D, VimontsDJ, Falcon WP, Burke MB. 2007. Assessing risks of climate variability and climate change for Indonesian rice agriculture. PNAS 19: 7752-7757.
91
Nottenburg C, Rodriguez CR. 2007. Agrobacterium-mediated gene transfer: a lawyer’s perspective. Agrobacterium. http://patentmaze.cougarlaw.com/ linked_files/AMT%20a%20lawyers%20perspective.pdf. [13 September 2011]. Olsson ASB, Engstrom P, Soderman E. 2004. The homeobox genes ATHB12 and ATHB7 encode potential regulators of growth in response to water deficit in Arabidopsis. Plant Mol Biol 55: 663-677. Opabode JT. 2006. Agrobacterium-mediated transformation of plants: emerging factors that influence efficiency. Biotech Mol Biol Rev. 1: 12-20. Ouvrard O, Cellier F, Ferrare K, Tousch D, Lamaze T, Dupuis JM, Casse-Delbart F. 1996. Identification and expression of water stress- and abscisic acidregulated genes in a drought-tolerant sunflower genotype. Plant Mol Biol 31:819-829. Ouyang SQ, Liu YF, Liu P, Lei G, He SJ, Ma B, Zhang WK, Zhang JS, Chen SY. 2010. Receptor-like kinase OsSIK1 improves drought and salt stress tolerance in rice (Oryza sativa) plants. Plant J 62:316-329. Peters JL, Cnudde F, Gerats T. 2003. Forward genetics and map-based cloning approaches. Trends Plant Sci 8:484-491. Pino M, Skinner JS, Park E, Jeknic Z, Hayes PM, Thomashow MF, Chen TH. 2007. Use of a stress inducible promoter to drive ectopic AtCBF expression improves potato freezing tolerance while minimizing negative effects on tuber yield. Plant Biotechnol J 5:591-604. Price AH, Cairns JE, Horton P, Jones HG, Griffiths H. 2002. Linking drought resistance-mechanism to drought avoidance in upland rice using QTL approach: progress and new opportunities to integrate stomatal and mesophyll responses. J Exp Bot 371:989-1004. Prigge MJ, Otsuga D, Alonso JM, Ecker JR, Drews GN, Clarka SE. 2005. Class III homeodomain-leucine zipper gene family members have overlapping, antagonistic, and distinct roles in mitogen-activated protein kinase. Plant Cell 17:61-76. Purnamaningsih R. 2006. Induksi kalus dan optimasi regenerasi empat varietas padi melalui kultur in vitro. J Agrobiogen. 2:74-80. Purwantomo S. 2007. Faktor transkripsi HD-zip dan introduksi lintasan biosintesis asam salisilat asal mikrob untuk konstruksi padi transgenik [Disertasi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
92
Qiu P. 2003. Computational approaches for dechipering the transcriptional regulatory network by promoter anaysis. Biosilico 1:125-133. Rabbani MA, Maruyama K, Abe H, Khan MA, Katsura K, Ito Y, Yoshiwara K, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2003. Monitoring expression profiles of rice genes under cold, drought, and high-salinity stresses and abscisic acid application using cDNA Microarray and RNAGelBlot Analyses. Plant Physiol 133:1755-1767. Rai M, Datta K, Parkhi V, Tan J, Oliva N, Chawla HS, Datta SK. 2007. Variable T-DNA linkage conviguration affects inheritance of carotenogenic transgenes and carotenoid accumulation in transgenic indica rice. Plant Cell Rep. 26:1221-1231. Rai M, He C, Wu R. 2009. Comparative functional analysis of three abiotic stress-inducible promoters in transgenic rice. Transgenic Res 18:787-799. Ramachandran S, Sundaresan V. 2001. Transposons as tools for functional genomics. Plant Physiol Biochem. 39:243-252. Re DA, Dezar CA, Chan RL, Baldwin IT, Bonaventure G. 2010. Nicotiana attenuata NaHD20 plays a role in leaf ABA accumulation during water stress, benzylacetone emission from flowers, and the timing of bolting and flower transitions. J Exp Bot. http://jxb.oxfordjournals.org/content /early/2010/08/16/jxb.erq252.full. [4 Januari 2012]. Reddy MSS, Dinkins RD, Collins GB. 2003. Gene silencing in transgenic soybean plants transformed via particle bombardment. Plant Cell Rep 21:676-683. Rerie WG, Feldmann KA, Marks MD. 1994. The GLABRA2 gene encodes a homeo domain protein required for normal trichome development in Arabidopsis. Gene Dev 8:1388-1399. Rice Annotation Project. 2007. Curated genome annotation of Oryza sativa ssp. Japonica and comparative genome analysis with Arabidopsis thaliana. Genom Res. 17:175-183. Rice Full-Length cDNA Consortium. 2003. Collection, mapping, and annotation over 28,000 cDNA clones from Japonica rice. Science 301:376-379. Riva GA de la, Gonzalez-cabrera J, Vazquez-Padron R, Ayra-Pardo C. 1998. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation. Plant Biotech 1(3). http://www.scielo.cl/pdf/ejb/v1n3/a02.pdf. [13 September 2011].
93
Robischon M, Du J, Miura E, Groover A. 2011. The populus class III HD ZIP, popREVOLUTA, influences cambium initiation and patterning of woody stems. Plant Physiol 155:1214-1225. Rodriguez CR and Nottenburg C. 2003. Agrobacterium-mediated transformation of plants, CAMBIA Patent Lens. http://www.patentlens.net. [13 September 2011]. Roy M, Jain RK, Rohila JS, Wu R. 2000. Production of agronomically superior transgenic rice plants using Agrobacterium transformation methods:present status and future perspectives. Curr Sci 79:954-960. Saharan V, Yadav RC, Yadav NR, Ram K. 2004. Studies on improved agrobacterium-mediated transformation in two indica rice (Oryza sativa L.). AJB 3(11):572-575. Sakakibara K, Nishiyama T, Kato M, Hasebe M. 2001. Isolation of homeodomain-leucine zipper genes from the moss Physcomitrella patens and the evolution of homeodomain-leucine zipper genes in land plants. Mol Biol Evol 18:491-502. Sambrook J, Fritschi EF and Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratorymanual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Scarpella E, Rueb S, Boot KJM, and Meijer AH. 2000. A role for the rice homeobox gene oshox1 in provascular cell fate commitment. Development 127: 3655-3669. Seki M, Narusaka M, Abe H, Kasuga M, Yamaguchi-Shinozaki K. Carninci P, hayashizaki Y, Shinozaki K. 2001. Monitoring the expresion pattern of 1300 Arabidopsis genes under drought and cold stress by using a full-length cDNA microarray. Plant Cell 13:61-72. Seki M, Narusaka M, Ishida J, Nanjo T, Fujita M, Oono Y, Kamiya A, Nakajima M, Enju A, Sakurai T, et al. 2002. Monitoring the expression pro®les of 7000 Arabidopsis genes under drought, cold and high-salinity stresses using a full-length cDNA microarray. Plant J 31: 279-292. Seo PJ, Lee SB, Suh MC, Park MJ, Go YS, Park CM. 2011. The MYB96 Transcription Factor Regulates Cuticular Wax Biosynthesis under Drought Conditions in Arabidopsis. Plant Cell 23:1138-1152. Setter TL, Ingram KT, Tuong TP. 1995. Environmental characterization requirements for strategic research in rice grown under adverse conditions of drought, flooding, or salinity. In Ingram KT Ed. Rainfed Lowland Rice: Agricultural research for high risk environments. Philippines: International Rice Research Institute. p. 3-15.
94
Shen Y, Tang MJ, Hu YL, Lin ZP. 2004. Isolation and characterization of a dehydrin-like gene from drought tolerant Boea crassifolia. Plant Sci 166:1167-1175. Sheng J, Citovsky V. 1996. Agrobacterium-plant cell DNA transport: have virulence proteins, will travel. Plant Cell 8:1600-1710. Sheveleva E, Chmara W, Bohnert HJ, Jensen RC. 1997. Increased salt and drought tolerance by D-ononitol production in transgenic Nicotiana tabacum. Plant Physiol 11:1211-1219. Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 1997. Gene expression and signal transduction in water-stress response. Plant Physiol 11: 327-334. Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, Seki M. 2003. Regulatory network of gene expression in the drought and cold stressresponses. Curr Opin in Plant Biol 6:410-417. Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2007. Gene networks involved in drought stress response and tolerance. J Exp Bot 58(2): 221-227. Shirasawa K, Takabe T, Takabe T, Kishitani S. 2006. Accumulation of glycinebetaine in rice plants that overexpress choline monooxygenase from spinach and evaluation of their tolerance to abiotic stress. Annals Bot 98: 565-571. Shou HX, Bordallo P, Wang K. 2004. Expression of the Nicotiana protein kinase (NPK1) enhanced drought tolerance in transgenic maize. J Exp Bot 55:1013 -1019. Sieburth LE and Meyerowitz EM. 1997. Molecular dissection of the AGAMOUS control region shows that cis elements for spatial regulation are located intragenically. Plant Cell 9:355-365. Simpson SD, Nakashima K, Narusaka Y, Seki M, Shinozaki K, YamaguchiShinozaki K. 2003. Two different novel cis-acting elements of erd1, a clpA homologous Arabidopsis gene functionin induction by dehydration stress and dark induced senescence. Plant J 33:259-270. Slamet-Loedin IH, Rahayu W, Prana MS. 1996. Transformation of Javanica rice using Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the Third Asia-Pacific Conference on Agricultural Biotechnology: Issues and Choices. p. 237-243. Small I. 2007. RNAi for revealing and engineering plant gene functions. Curr Opin Biotech 18:148-153. Souza CR de, Aragao FJ, Moreira ECO, Costa CNM, Nascimento SB, Carvalho LJ. 2009. Isolation and characterization of the promoter sequence of a
95
cassava gene coding for Pt2L4, a glutamic acid-rich protein differentially expressed in storage roots. Genet Mol Res 8:334-344. Suprasanna P, Patade VY, Vaidya ER, Patil VD. 2009. Radiation induced in vitro mutagenesis, selection for salt tolerance and characterization in sugarcane. In Shu QY Ed. Induced Plant Mutations in the Genomic Era. Rome: FAO/IAEA. p. 145-147. Temnykh S, DeClerck G, Lukashova A, Lipovich L, Cartinhour S, McCouch S. 2001. Computational and experimental analysis of microsatellites in rice (Oryza sativa L.): frequency, length variation, transposon associations, and genetic marker potential. Genome Res 11:1441-1452. Thorneycroft D, Sherson SM, Smith SM. 2001. Using gene knockouts to study plant metabolism. J Exp Bot 52:1593-1601. Tinland B. 1996. The integration of T-DNA into plant genomes. Trends Plant Sci 1:178-184. Tittarelli A, Milla L, Vargas F, Morales A, Neupert C, Meisel LA, Salvo-G H, Penaloza E, Munoz G, Corcuera LJ. Silva H. 2007. Isolation and comparative analysis of the wheat TaPT2 promoter: identification in silico of new putative regulatory motifs conserved between monocots and dicots. J Exp Bot 58(10):2573-2582. Toki S. 1997. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Mol Biol Rep 15:16-21. Tran LS, Nakashima K, Sakuma Y, Simpson SD, Fujita Y, Maruyama K, Fujita M, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2004. Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress inducible NAC transcription factors that bind to a drought responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter. Plant Cell 16:2481-2498. Turner NC. 1979. Drought resistance and adaptation to water deficits in crop plants. In: Mussell H, Staples CR, editors. Stress Physiology in Crop Plants. New York: John Wiley & Sons. p. 343–372. Tzfira T, Citovsky V. 2006. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Curr Opin Biotechnol. 17:147-154 Valliyodan B, Nguyen HT. 2006. Understanding regulatory networks and engineering for enhanced drought tolerance in plants. Curr Opin in Plant Biol 9:1-7. Vandenbusschea M, Zethofa J, Souer E, Koes R, Tornielli GB, Pezzotti M, Ferrario S, Angenent GC, Gerats T. 2003. Toward the analysis of the petunia MADS Box gene family by reverse and forward transposon insertion mutagenesis approaches: B, C, and D floral organ identity
96
functions require SEPALLATA-Like MADS Box genes in Petunia. Plant Cell 15:2680-2693. Vinocur B, Altman A. 2005. Recent advances in engineering plant tolerance to abiotic stress: achievements and limitations. Curr Opin Biotechnol 16:123132. Walden R. 2002. T-DNA tagging in the genomic era. Critic Rev Plant Sci 21:143-165. Wang YJ, Li YD, Luo GZ, Tian AG, Wang HW, Zhang JS, Chen SY. 2005. Cloning and characterization of an HDZip I gene GmHZ1 from soybean. Planta 221:831-843. Wang Z, Zhu Y, Wang L, Liu X, Liu Y, Phillips J, Deng X. 2009. A WRKY transcription factor participate in dehydration tolerance in Boea hygrometrica by binding to the W- box element of the galactinol synthase (BhGolS1) promoter. Planta 230:1155-1166. Weir BS. 2011. The current taxonomy of rhizobia. New Zealand rhizobia website. http://www.rhizobia.co.nz/taxonomy/rhizobia.html, [13 September 2011]. Wendt T, Doohan F, Winckelmann D, and Mullins E. 2010. Gene transfer into Solanum tuberosum via Rhizobium spp. Transgenik Res. 20:377-386. Whipple CJ, Kebrom TH, Weber AL, Yang F, Hall D, Meeley R, Schmidt R, Doebley J, Brutnell TP, Jackson DP. 2011. Grassy tillers1 promotes apical dominance in maize and responds to shade signals in the grasses. PNAS 108(33). http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1102819108. [13 September 2011]. Wiese A, Lalonde s, Kuhn C, Frommer WB, Ward JM. 2008. Introns control expression of sucrose transporter LeSUT1 in trichomes, companion cells and in guard cells. Plant Mol Biol 68:251-262. Wu X, Shiroto Y, Kishitani S, Ito Y, Toriyama K. 2009. Enhanced heat and drought tolerance in transgenic rice seedlings overexpressing OsWRKY11 under the control of HSP101 promoter. Plant Cell Rep 28(1):21-30. Xiang Y, Tang N, Du H, Ye H, Xiong L. 2008. Characterization of OsbZIP23 as a key player of the basic leucine zipper transcription factor family for conferring abscisic acid sensitivity and salinity and drought tolerance in rice. Plant physiol 148:1938-1952. Xiao B, Huang Y, Tang N, Xiong L. 2007. Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions. Theor Appl Genet 115:35-46.
97
Xiao FH, Xue GP. 2001. Analysis of the promoter activity of late embryogenesis abundant protein genes in barley seedlings under conditions of water deficit. Plant Cell Rep 20:667-673. Xiong L, Yang Y. 2003. Disease resistance and abiotic stress tolerance in rice are inversely modulated by an abscisic acid inducible mitogen-activated protein kinase. Plant Cell 15:745-759. Xue GP. 2002 An AP2 domain transcription factor HvCBF1 activates expression of cold-responsive genes in barley through interaction with a (G/a)(C/t)CGAC motif. Biochim Biophys Acta 19:63-67. Yamada M, Morishita H, Urano K, Shiozaki N, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K, Yoshiba Y. 2005. Effects of free proline accumulation in petunias under drought stress. J Exp Bot 56:1975-1981. Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. 1993a. Arabidopsis DNA encoding Two Desiccation-Responsive rd29 Genes. Plant Physiol 101:1119-1120. Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. 1993b. Characterization of the expression of a desiccation-responsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenic plants. Mol Gen Genet 236:331-340. Yang S, Vanderbeld B, Wan J, Huang Y. 2010. Narrowing down the targets: towards successful genetic engineering of drought tolerant crops. Mol Plant 3:469-490. Yang SH, Yu H, and Goh CJ. 2002. Isolation and characterization of the orchid cytokinin oxidase DSCKX1 promoter. J Exp Bot 53:1899-1907. Yang T, Poovaiah BW. 2002. A calmodulin binding/CGCG box DNA-binding protein family inolved in multiple signaling in plants. J Biol Chem 277:45049-45058. Yu J, Hu S, Wang J, Wong GK, Li S, Liu B, Deng Y, Dai L, Zhou Y, Zhang X, et al. 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. Indica). Science 296:79-92. Yue B, Xue W, Xiong L, Yu X, Luo L, Cui K, Jin D, Xing Y, Zhang Q. 2006. Genetic basis of drought reistance at reproductive stage in rice: separation of drought tolerance from drought avoidance . Genetics 172:1213-1228. Zhang G, Chen M, Li L, Xu Z, Chen X, Guo J, Ma Y. 2009. Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco. J Exp Bot 60:3781-3796.
98
Zhang H, Jin JP, Tang L, Zhao Y, Gu XC, Gao G, Luo JC. 2011. Plant TFDB 2.0: update and improvement of the comprehensive plant transcription factor database. Nucl Acids Res 39:D1114-D1117. Zhang JZ. 2003. Overexpression analysis of plant transcription factors. Curr Opin Plant Biol 6:430-440. Zhang SW, Li CH, Cao J, Zhang YC, Zhang SQ, Xia YF, Sun DY, Sun Y. 2009. altered architecture and enhanced drought tolerance in rice via the downregulation of indole-3-acetic acid by TLD1/OsGH3.13 activation. Plant Physiol 151:1889-1901. Zheng X, Chen B, Lu G, Han B. 2009. Overexpression of a NAC transcription factor enhances rice drought and salt tolerance. Biochem Biophys Res Comm 379:985-989. Zhou J, Wang X, Jiao Y, Qin Y, Liu X, He K, Chen C, Ma L, Wang J, Xiong L, Zhang Q, Fan L, Deng XW. 2007. Global genome expression analysis of rice in response to drought and high-salinity stresses in shoot, flag leaf, and panicle. Plant Mol Biol 63:591-608.
Lampiran 1
MEDIA KULTUR JARINGAN Media Dasar NB N6 Makro I N6 Makro II B5 Vitamin MS FeNaEDTA B5 Mikro Prolin Glutamin Casein Enzymatic Hydrolisat (CEH) Media Dasar R2 R2 Makro I R2 Makro II LS Vitamin R2 FeNaEDTA R2 Mikro Media Dasar LS MS Makro I MS Makro II LS Vitamin MS FeNaEDTA MS Mikro Media Dasar ½ MS MS Makro I MS Makro II B5 Vitamin MS FeNaEDTA MS Mikro Media Dasar N6 N6 Major 1 N6 Major 2 N6 Major 3 N6 Major 4 B5 Minor 1 B5 Minor 2 B5 Minor 3 B5 Minor 4 B5 Vitamin Media Dasar IK3 MS Makro I MS MakroII MS FeNaEDTA MS Mikro R2 Vitamin Media Induksi kalus Media Dasar NB Nipponbare + Sukrosa +2,4 –D + Phytagel
100 100 10 10 1 500 500 300
ml/L ml/L ml/L ml/L ml/L mg/L mg/L mg/L
100 100 25 10 1 100 100 10 10 1 50 50 5 5 0.5 20 10 10 10 10 10 10 10 5 100 100 10 1 12.5
ml/L ml/L ml/L ml/L ml/L ml/L ml/L ml/l ml/l ml/L ml/L ml/L ml/l ml/l ml/L ml/L ml/l ml/L ml/L ml/L ml/L ml/L ml/L ml/L ml/L ml/L ml/L ml/L ml/L
30 g/L 2.5 mg/L 2.5 g/L pH 5.8
Media Induksi Kalus Ciherang
Media Dasar N6 +CEH
500 mg/L
100
+Prolin +Sukrosa +Glukosa +2,4-D +NAA +BA Agarose Type I
500 20 10 2 1 1 5.5
mg/L g/L g/L mg/L mg/L mg/L g/L pH 5.8
Medis Induksi Kalus Rojolele
Media Dasar IK3 +Myo-inositol +Sukrosa +2,4-D +Phytagel
Media Kokultivasi Cair
Media Dasar R2 +Glukosa +2,4-D +asetosyringon
Media Kokultivasi Padat Nipponbare
Media Kokultivasi Cair Nipponbare + Phytagel Media Dasar IK3 +Myo-inositol +Sukrosa +Glukosa +2,4-D +Asetosyringone +Phytagel
100 30 2.5 3.75
mg/L g/L mg/L g/l pH 5.8
10 g/L 2.5 mg/L 500 µM pH 5.2
Media Kokultivasi Padat Rojolele
3.75 g/L pH 5.2 100 30 10 2.5 100 3.75
mg/L g/L g/L mg/L µM g/L pH 5.2
Media Kokultivasi Padat Ciherang Media Pra-seleksi NBM Ciherang
Media Induksi Kalus Ciherang + Asetosyringon Media Dasar N6 +CEH +Prolin +Glutamin +Mannitol +Maltose +2,4-D +NAA +BA +Cefotaxim +Timentin +Gelrite
100 µM pH 5.2 500 500 300 36 20 2 1 0.2 250 100 5
mg/L mg/L mg/L g/L g/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L g/L pH 5.8
101
Media Seleksi Nipponbare
Media Dasar R2 +Sukrosa +2,4-D +Cefotaxime +Timentin +Hygromisin +Phytagel
30 2.5 250 100 50 3.75
g/L mg/L mg/L mg/L mg/L g/L pH 6.0
Media Seleksi Rojolele
Media Dasar IK3 + Myo-inositol +Sukrosa +2,4-D +Cefotaxim +Timentin +Higromisin +Phytagel
100 30 2.5 250 100 100 3.75
mg/L g/L mg/L mg/L mg/L mg/L g/L pH 5.2
Media Seleksi NBMH Ciherang
Media Pra-seleksi NBM + Hygromisin
Media PraRegenerasi NBPR
Media Dasar N6 +CEH +Prolin +Glutamin +Maltose +2,4-D +NAA +BA +Gelrite
50 mg/L pH 5.8 500 500 300 30 2 1 0.2 7
mg/L mg/L mg/L g/L mg/L mg/L mg/L g/L pH 5.8
Media Regenerasi LS Nipponbare
Media Dasar LS +Sukrosa +IAA +BA +Phytagel
40 500 300 3.75
g/L mg/L mg/L g/L pH 5.8
Media Regenerasi R3B Rojolele
Media Dasar IK3 + Myo-inositol +Sukrosa +IAA +BAP +Phytagel
100 30 500 300 5
mg/L g/L mg/L mg/L g/L pH 5.8
102
Media Regenerasi RNM Ciherang
Media Dasar N6 +CEH +Prolin +Glutamin +Maltose +NAA +BA +Agarose Type I
500 500 300 30 1 3 4
mg/L mg/L mg/L g/L mg/L mg/L g/L pH 5.8
Media Pertumbuhan Media Dasar ½ MS Plantlet +Sukrosa +NAA +Hygromisin +Phytagel
10 1 30 2,5
g/L mg/L mg/L g/L pH 5.8
103
LARUTAN STOK MEDIA DASAR NB N6-Macro I
N6-Macro II B5-Vitamins
MS-FeNaEDTA B5-Micro
KNO 3 (NH4 ) 2 SO 4 KH 2 PO 4 MgSO 4 .7H2 O CaCl 2 .2H2 O Myo-inositol Thiamine-HCl Nicotinic Acid Pyridoxine HCl FeNaEDTA MnSO 4 .H2 O KI H3 BO 3 ZnSO 4 .7H 2 O CuSO 4 Na 2 MoO 4 .2H2 O CoCl 2 .6H2 O
28.3 4.63 4.00 1.85 1.66 10 1.00 0.100 0.100 3.67 1000 75 300 200 2.5 25 2.5
g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml
LARUTAN STOK MEDIA DASAR R2 R2-Macro I
R2-Macro II R2-Vitamins R2-FeNaEDTA R2-Micro
KNO 3 (NH4 ) 2 SO 4 NaH2 PO 4 .H2 O MgSO 4 .7H2 O CaCl 2 .2H2 O Thiamine-HCl FeSO 4 .7H2 O Na 2 EDTA.2H2 O MnSO 4 .H2 O H3 BO 3 ZnSO 4 .7H 2 O CuSO 4 .5H2 O Na 2 MoO 4 .2H2 O
40.0 3.30 3.12 2.46 1.46 0.040 1.25 0.177 160 283 220 19.5 12.5
g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml
104
LARUTAN STOK MEDIA DASAR LS MS-Macro I
MS-Macro II LS-Vitamins MS-FeNaEDTA MS-Micro
KNO 3 NH4 NO 3 KH 2 PO 4 MgSO 4 .7H2 O CaCl 2 .2H2 O Myo-inositol Thiamine-HCl FeNaEDTA MnSO 4 .H2 O KI H3 BO 3 ZnSO 4 .7H 2 O CuSO 4 .5H2 O Na 2 MoO 4 .2H2 O CoCl 2 .6H2 O
19.0 16.5 1.70 3.70 4.40 10 0.040 3.67 1690 83 620 860 2.5 25 2.5
g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml
LARUTAN STOK MEDIA DASAR MS MS-Macro I
MS-Macro II B5-Vitamins
MS-FeNaEDTA MS-Micro
KNO 3 NH4 NO 3 KH 2 PO 4 MgSO 4 .7H2 O CaCl 2 .2H2 O Myo-inositol Thiamine-HCl Nicotinic Acid Pyridoxine HCl FeNaEDTA MnSO 4 .H2 O KI H3 BO 3 ZnSO 4 .7H 2 O CuSO 4 .5H2 O Na 2 MoO 4 .2H2 O CoCl 2 .6H2 O
19.0 16.5 1.70 3.70 4.40 10 1.00 0.100 0.100 3.67 1690 83 620 860 2.5 25 2.5
g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml
105
LARUTAN STOK MEDIA DASAR N6 N6-Major 1 N6-Major 2 N6-Major 3 N6-Major 4 B5-Minor 1 B5-Minor 2
B5-Minor 3 B5-Minor 4
B5-Vitamins
KNO 3 MgSO 4 .7H2 O (NH4 ) 2 SO 4 KH 2 PO 4 CaCl 2 .2H2 O FeSO 4 .7H2 O Na 2 EDTA MnSO 4 .4H2 O ZnSO 4 .7H 2 O H3 BO 3 KI CuSO 4 .5H2 O Na 2 MoO 4 .2H2 O CoCl 2 .6H2 O Thiamine Pyridoxine Nicotinic Acid Myo-inositol
141.5 18.5 46.3 40 16.6 2.78 3.73 1 0.2 0.3 0.075 0.0025 0.025 0.0025 200 20 20 2000
g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/L mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml mg/100 ml
106
Lampiran 2 Media Bakteri YM
Mannitol Yeast Extract K2 HPO 4 KH 2 PO 4 NaCl MgSO 4 .7H2 O Bacto Agar
10 400 25 100 25 50 15
LB
Tryptone Yeast Extract NaCl Bacto Agar
10 5 5 15
g/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L g/L pH 6.8 g/L g/L g/L g/L pH 7.5
107
Lampiran 3
Larutan Yoshida (Modifikasi) Stock
Bahan
g 1L-1
g 10L-1
Original Yoshida
1 2 3 (a) (b) 4 5
NH4 NO 3 K2 SO 4 KH 2 PO 4 K2 HPO 4 CaCl 2 . 6H2 0 MgSO 4 .7H2 O
91.4 97.8 29.0 8.0 175 324
914 978 290 80 1750 3240
Same 714 g / 10L NaH2 PO 4 .2H2 O = 403 g /10L CaCl 2 = 886g/10L Same
6
Minor Nutrients MnCl 2 .4H2 0 (NH4 ) 6 . Mo 7 O 24 .4H2 O H3 BO 3 ZnSO 4 .7H 2 O CuSO 4 .5H2 O
1.5 0.074 0.93 0.035 0.03
15.0 0.74 9.34 0.35 0.31
Same Same Same Same Same
FeNaEDTA* FeSO 4 (made fresh)
10.5 2.5
25.0
(a) (b) (c) (d) (e) 7 or 8 9 10
--FeCl 3 .6H2 O = 77g/10L Citric acid (monohydrate) =119 g/10L
*to be replaced regularly 1.25ml each stock solution per 1 culture solution pH 4.5 with nitric acid For modified Yoshida : Stock no. 6 a, b, c, d, and e are dissolve separately (may be in dilute H 2 SO 4 ); then combine and make up the 10 litre volume with distilled water For Original Yoshida : Stock no. 6 a, b, c, d, e, 9 and 10 are dissolve separately ; then combine with 500 ml of Conc. H 2 SO 4 . Make up the 10 litre volume with distilled water
