ISBN 979-98109-0-6
Prosiding Seminar Nasional Biologi I Surabaya, 30 Agustus 2003 ========================================================
Skrining Hasil Transformasi Gen β–1,3-endoglukanase ke dalam Tanaman Tembakau Besuki H382 dengan Perantara Agrobacterium tumefaciens Y. Sri wulan Manuhara1), Issirep Sumardi 2), Sismindari Sudjadi 3), Taryono4), Widodo5) 1) Fakultas MIPA Biologi Universitas Airlangga, 2) Fakultas Biologi Univesitas Gadjah Mada, 3) Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, 4) Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada, 5) Fakultas Pertanian Universitas Wijaya Kusuma ABSTRAK Karakteristik tanaman setelah proses transformasi adalah langkah yang sangat penting untuk membuktikan keberhasilan suatu proses tranformasi, oleh karena itu diperlukan metode skrining populasi tanaman transgenik secara akurat. Metode seleksi pada medium yang mengandung kanamisin adalah metode awal yang dapat digunakan untuk mengindentifikasi tanaman yang diduga membawa gen β-1,3-endoglukanase yang ditransformasikan ke dalam tanaman, karena gen tersebut dibawa oleh vector biner pROK1a-EG yang dilengkapi dengan gen nptll yang mengekspresikan enzim neomycin phosphotransferase untuk difat ketahanan tanaman terhadap antibiotika kanamisin. Konsentrasi kanamisin yang digunakan untuk skrining transforman ditentukan dengan cara menumbhkan eksplan daun tembakau Besuki H382 pada medium MS ditambah zat pengatur tumbuh NAA 1 mg/L, BA 3 mg/L, sukrosa 30 g/L serta berbagai konsenrasi kanamisin (0,50,100,200) mg/L. Konsentrasi kanamisin yang mampu menonaktifkan pertumbuhan eksplan daun tembakau selanjutnya digunakan untuk menyeleksi hasil transformasi gen β-1,3 endoglukanase ke dalam eksplan daun tembakau dengan perantara Agrobactorium tumefaciens LBA4404. Pada pemberian kanamisin 50 mg/L eksplan tembakau mampu tumbuh membentuk kalus maupun tunas, sedangkan pada pemberian kanamisin100 mg/L dan 200mg/L eksplan tidak mampu membentuk kalus maupun tunas dan menunjukan gejala kematian. Pada minggu ke 5 sebanyak 75,8% eksplan mati. Selanjutnya konsentrasi kanamisin 100 mg/L digunakan untuk skrining transforman. Dari hasil transformasi diperoleh 29 tunas yang mampu tumbuh pada medium seleksi dri 106 eksplan yang ditransformasi, sehingga diperoleh efesiensi transformasi sebesar 27,36%.
PENDAHULUAN Tanaman tembakau adalah tanaman model yang banyak digunakan oleh peneliti untuk berbagai macam percobaan karena tingginya kemampuan regenerasi tananman ini baik secara konvensional maupun secara in vitri. Kegunaan tanaman inipun juga tidak kalah pentingnya dengan tanaman budidaya lain karena peranannya dalam menunjang industri rokok. Tetapi dalam prosses budidayanya tanaman ini banyak mengalami gangguan baik berupa hama maupun penyakit. Salah satu penyakit yang banyak menimbulkan kerugian adalah penyakit lanas yang disebabkan oleh jamur Phytophtoranicotianae. Jamur ini menyerang bibit dan tanaman dewasa. Bagian tanaman yang diserang adalah leher akar
Y Sri Wulan Manuhara
sehingga menjadi hitam lalu kering, selanjutnya daun tembakau menjadi layu seperti disiram air panas. Akhibat penyakit ini dapat menurunkan produksi hingga 50%. Pengendalian secara kimiawi dirasakan kurang efektif, terlalu mahal bagi petani, dan residu yang tertinggal pada daun atau biji tanaman berbahaya bagi konsumen. Pemuliaan secara konvensional untuk mendapat varietas berdaya hasil tinggi dan tahan penyakit memerlukan waktu yang lama dan dapat membawa karakter tak diinginkan dari tetua donor. Salah satu alternatif pemecahan masalah tersebut adalah dengan rekayasa genetika untuk mengintroduksi gen anti jamur ke dalam genom tanaman sehingga dihasilkan tanaman yang toleran terhadap serangan jamur.
Prosiding Seminar Nasional Biologi I
ISBN 979-98109-0-6
Surabaya, 30 Agustus 2003 ======================================================== Gen β-1,3-endoglukanase terbukti Dalam penelitian ini digunakan bibit tanaman tembakau (Nicotiana tabacum var. Besuki memberikan ketahanan terhadap jamur patogen Botrytis cinerea, Sclerotinia H382) Nicotiana tabacum var. Besuki H382) sclerotiorium (Terakawa et al., 1997; yang memperoleh dari PTPN X Jember. Nakamura et al.1999), Phytopthora nicotianae Eksplan tembakau yang digunakan adalah (Yhosikawa, 1993), serta jamur Rhizoctonia daun hasil seedling yang berumur 30 hari. solani. Beberapa peneliti melaporkan Agrobacterium yang digunakan adalah Agrobacterium tumefaciens starin LBA4404 usahanya merakit tanaman toleran terhadap jamur menggunakan gen kitinase dan β-1,3yang membawa vector biner pROK1a-EG endoglukanase. Lin et al. (1995) (Yoshikawa et al., 1993) yang diperoleh dari mentransformasi tanaman padi menggunakan Dr. Yoji Takeuchi, Division of Biological gen kitinase dan padi transforman berpotensi Sciences, Hokaido University, Sapporo, meningkat resistensinya terhadap infeksi Jepang. jamur. Yoshikawa (1993), Ito et al. (1994) ito et al.(1995) dan Nakamura et al. (1999) telah Untuk uji resistensi digunakan jamur Phytophtora nicotianae yang diisolasi dari berhasil mentransfer gen β-1,3-endoglukanase kedalam tanaman terong (egg-plant) dan buah tanaman tembakau yang terinfeksi jamur kiwi, serta mampu mengekspresikan tersebut. ketahanan tanaman tersebut terhadap Prosedur Penelitian penyakit akhibat jamur patogen. Dasar keberhasilan transformasi genetik adalah Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap kemampuan sel target untuk berkembang sebagai berikut. menjadi tanaman utuh yang identik dengan Tahap 1. Optimasi konsentrasi kanamisin induknya, kecuali dalam hal sifat baru dari gen untuk seleksi transforman. yang disisipkan. Teknik kultur jaringan tanaman membuka peluang untuk Konsentrasi kanamisin yang akan digunakan menyediakan sel target yang terdapat dalam untuk seleksi transforman ditentukan terlebih organ tanaman (daun, batang, hipokotil dan dahulu dengan cara menumbuhkan daun kotiledon), kalus atau kultur suspensi sel dan tanaman tembakau dalam medium MS bahkan protoplas. Sel-sel ini dapat diinduksi ditambah zat pengatur NAA 1 mg/L, BAP3 untuk berkembang menjadi tanaman baru mg/L dan variasi kanamisin 0 mg/L, 50 mg/L, melalui inisiasi pembentukan tunas baru atau 100 mg/L dan 200 mg/L. melalui embriogenesis. Secara in vitro Tahap 2. Transformasi gen β-1,3tanaman tembakau telah banyak digunakan endoglukanase kedalam eksplan daun untuk berbagai keperluan pengujianaena tembakau tanaman tersebut dapat dengan mudah diregenerasi membentuk tanaman utuh sesuai a. Persiapan eksplan dengan induknya. Sebagai bahan transformasi digunakan daun Karakterisasi tanaman setelah transformasi tembakau yang di prekultur dalam medium PCM (Pre Cultur Medium) selama 2 hari. adalah langkah yang sangat penting untuk membutikan keberhasilan transformasi, oleh Medium PCM terdiri dari medium Murashige karena itu diperlukan penerapan metode and Skoog (MS) (Murashige & Skoog, 1962) skrining populasi tanaman transgenik secara ditambah BAP 3 mg/L, NAA 1 mg/L. akhurat. Metode seleksi kanamycin adalah b. Transformasi metode awal yang dapat digunakan untuk Sebelum dilakukan transformasi perlu disiapkan dahulu Agrobacterium tumefaciens mengidentifikasi tanaman yang diduga membawa gen β-1,3-endoglukanase yang yang membawa vector biner pROK1a-EG ditransformasikan ke dalam tanaman dengan cara menumbuhkannya dalam tembakau, karena gen β-1,3-endoglukanase medium LB cair yang mengandung kanamisin dibawa oleh vector biner pROK1a-EG yang 50 mg/L dan diinkubasi selama 24 jam. Daun dilengkapi dengan gen nptll yang tembakau yang telah dipre-kultur selama 2 mengekspresikan enzim neomycin hari, direndam (cocultur) dalam kultur A, phosphotrnasferase untuk sifat ketahanan tumefaciens pROK1a-EG yang diencerkan tanaman terhadap kanamycin. dengan medium MSO (MS tanpa zat pengatur tumbuh) dengan perbandingan 1:10. Setelah METODE PENELITIAN itu eksplan dipindahkan kedalam medium LSM (Low Selective Medium) dengan Bahan Penelitian komposisi medium MS ditambah BAP 3 mg/L, NAA 1 mg/L, kanamisin hasil uji optimasi dan
Y Sri Wulan Manuhara
ISBN 979-98109-0-6
Prosiding Seminar Nasional Biologi I Surabaya, 30 Agustus 2003
% Eksplan yang hidup
======================================================== cefotaxin 300 mg/L, kemudian diinkubasi 0 selama 2 hari pada suhu 25 C dengan HASIL DAN PEMBAHASAN cahaya lampu TL 20 Watt secara terus menerus. Setelah 2 hari dalam medium LSM eksplan dipindahkan kedalam medium SIM Uji optimasi konsentrasi kanamisin untuk (Shoot Induction Medium). Setiap 2 minggu seleksi keberhasilan transformasi gen β-1,3dilakukan sub-kultur. endoglukanase ke dalam eksplan daun Parameter yang diamati adalah pertumbuhan tembakau dilakukan dengan menghitung dan perkembangan eksplan membentuk persentase eksplan yang hidup pada planlet. Planlet yang tumbuh dalam medium berbagai konsentrasi kanamisin disajikan yang mengandung kanamisin 100 mg/L pada gambar 1 dan gambar 2. diduga transforman, sedangkan yang mati adalah non-tranforman.
120 100 0 mg/l
80
50 mg/l
60
100 mg/l
40
200 mg/l
20 0 1
2
3
4
5
Gambar 1. Persentase eksplan tembakau hidup pada berbagai konsentrasi kanamisin Umuryang (minggu)
A
C
B
D
Gambar 2. Pertumbuhan eksplan daun tembakau umur 8 minggu pada berbagai konsentrasi kanamisin. (A) tanpa kanamisin, (B) kanamisin 50 mg/L, (C) kanamisin 100 mg/L, (D) kanamisin 200 mg/L
Y Sri Wulan Manuhara
ISBN 979-98109-0-6
Prosiding Seminar Nasional Biologi I Surabaya, 30 Agustus 2003 ========================================================
Skrining hasil transformasi gen β-1,3endoglukanase kedalam daun tembakau H382 dengan perantara Agrobacterium tumefaciens dalam medium seleksi yang mengandung
kanamisin 100 mg/L disajikan pada tabel 1 dan gambar 2.
Tabel 1. Efisiensi transformasi gen β-1,3-endoglukanase kedalam daun tembakau H382 dengan perantara Agrobacterium tumefaciens Jenis kultivar tembakau
Jumlah eksplan yang membentuk tunas (%)
Jumlah tunas resisten kanamisin(%)
Besuki H382
98/106 (92,45)
29(27,360
B
A
A
C
D
Gambar 3. Transformasi gen β-1,3-endoglukanase kedalam daun tembakau, regenerasi tunas dan skrining transforman dalam medium seleksi yang mengandung kanamisin. A. Tanaman tembakau umur 8 minggu, B. Regenerasi tunas dari eksplan daun tembakau setelah transformasi, C. Regenerasi tunas daun tembakau tanpa transformasi, D. Tunas resisten kanamisin (tanda panah) Dari gambar 1 tersebut diatas terlihat bahwa konsentrasi kanamysin mempengaruhi pertumbuhan eksplan hipokotil kubis. Pada konsentrasi kanamycin 50 mg/l sedikit mempengaruhi pertumbuhan eksplan daun tembakau dibanding kontrol, karena pada hari ke 21 sebagian besar eksplan masih hidup. Pengalaman secara diskriptif menunjukan eksplan mampu tumbuh menjadi kalus dan tunas, tetapi tunas yang terbentuk tidak
Y Sri Wulan Manuhara
sebanyak pada kontrol. Bahkan pada satu eksplan dapat membentuk akar. Hal ini berarti bahwa eksplan mampu beradaptasi pada medium seleksi yang mengandung kanamisin 50 mg/l sehingga konsentrasi kanamisin 50 mg/l tidak dapat digunakan untuk menyeleksi hasil transformasi. Pada konsentrasi kanamycin 100 mg/l dan 200 mg/l semua eksplan masih hidup sampai hari ke 7, tetapi pada hari ke 14 beberapa ekspan menunjukan
Prosiding Seminar Nasional Biologi I
ISBN 979-98109-0-6
Surabaya, 30 Agustus 2003 ======================================================== gejalakematian yang ditandai dengan membentuk kalus maupun tunas, sedangkan perubahan warna pada daun yang semula pada pemberian kanamisin 100 mg/L dan 200 hijau berubah menjadi kuning. Pada kedua mg/L eksplan tidak mampu membentuk kalus konsentrasi kanamisin tersebut eksplan tidak maupun tunas dan menunjukan gejala sama sekali mampu tumbuh menjadi kalus kematian. Pada minggu ke 5 sebanyak 75,8% maupun tunas. Hal ini berarti bahwa tingginya eksplan mati. Selanjutnya konsentrasi konsentrasi kanamisinmenghambat terjadinya kanamisin 100 mg/L digunakan untukskrining pembelahan sel pada eksplan daun tembakau transforman. Dari hasil transformasi diperoleh sehingga sel tidak mampu berdiferensiasi 29 tunas yang mampu tumbuh pada medium membentuk kalus maupun tunas. Medium seleksi dari 106 eksplan yang ditransformasi, seleksi yang mengandung kanamisin 100 mg/l sehingga diperoleh efisiensi transformasi dan 200 mg/l dapat digunakan untuk sebesar 27,36%. menyeleksi hasil transformasi, tetapi menurut Gatehouse et al., 1992 menyatakan bahwa DAFTAR PUSTAKA beberapa faktor dapat mempengaruhi kemampuan atau efektifitas bahan kimia yang Chen, D.H., C.J. Liu, H.C. Ye, G.F. Li, B.Y. digunakan untuk seleksi. Bahan-bahan Liu, Y.L. Meng, X.Y. Chen, 1999. Ri penyeleksi tersebut bersifat toksik untuk sel mediated transformation of Ertemisia tanaman. Jadi toksin yang paling efektif adalah annua with a recombinant farbesyl toksin yang menghambat pertumbuhan sel-sel diphosphate synthase gene for nontransforman secara berlahan-lahan. artemisin production. Plant, Cell, tissue Tekanan seleksi akan optimal apabila and Organ Culture 57:157-162. menggunakan konsentrasi toksin yang paling Hartana, I. 1978. Budidaya Tembakau Cerutu. rendah yang mampu membunuh jaringan Balai Penelitian Perkebunan Jember. nontransforman. Berdasarkan hal tersebut Hiei, Y., S. Okta, T. Komari, T. Kumashiro, maka konsentrasi kanamisin yang digunakan 1994. Efficient transformationof rice (Oryza sativa L.) mediated by untuk uji seleksi keberhasilan transformasi Agrobacterium and sequence analysis pada eksplan daun tembakau adalah 100 mg/l. of the boundaries of T-DNA. The plant Dari tabel 1. di atas diperoleh bahwa journal 6 (2):271-282. keberhasilan transformasi gen β-1,3endoglukanase kedalam eksplan daun Gatehouse, A.M.R, V.A. Hilder and D. Boulter, 1992. Plant Genetic manipulation for tembakau adalah 27,36 % dengan konsentrasi Crop Protection, C A B International, kanamisin 100 mg/l dalam medium MS sebagai medium seleksi transforman dapat United Kingdom. ditentukan tunas yang diduga transforman Ito, S., K. Inaba, T. Masumura, T. Tanaka, Y. dengan cara menghitung eksplan yang Takeuchi, M. Yoshikawa, 1994. mampu membentuk tunas hidup. Hal ini berarti Production of transgenic egg-plant with soybean β-1,3-endoglucanase. Breed bahwa tunas yang mampu tumbuh normal diduga telah tersisipi gen nptll yang Sci 44 (Suppl 2):43. menyebabkan tanaman mampu Ito, S., T. Fukhunisi, K. Inaba, T. Masumura, T. menonaktifkan antibiotika kanamisin. Efisiensi Tanaka, Y. Takeuchi, M. Yoshikawa, transformasi pada eksplan daun tembakau 1995. Disease resistance of transgenic yang diperoleh cukup tinggi (27,36)bila eggplant with soybean β-1,3endoglucanse. Breed Sci 45 (Suppl2): dibanding dengan transformasi pada tanaman lain dengan perantara Agrobacterium 106. tumefaciens, seperti pada gerbera 0,58% Lin, W., C.S. Anuratha, K. Datta, I Potrykus, (Elomaa et al.,1993),Oryza sativa 23% (Hiei et Muthukrishnan & S.K. Datta, 199. al., 1994), apel 5%(De Bondt et al., 1996), Genetic engineering of rice for Vigna unguiculata L. Walp 12% (Muthukumar, resistance to sheath bligth. 1996), Artemisia annua 10,7% (Chen et Biotechnology 13:686-691. al.,1999), Brassica campestris ssp. 3,64% Muthukumar, B., M. Mariama, K. Veluthambi, (Xianget al., 2000). A. Gnanam, 1996. Genetic transformtion of cotyledon explant of cowpea (Vigna KESIMPULAN unguiculata L. Walp) using Agrobacteriumtumefaciens. Plant Cell Reports 15:980-985. Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa pemberian kanamisin 50 mg/L pada Nakamura Y, sawada S, Kobayashi S, medium seleksi, eksplan tembakau mampu Nakajima l, Yoshikawa M, 1999.
Y Sri Wulan Manuhara
Page 69
Prosiding Seminar Nasional Biologi I
ISBN 979-98109-0-6
Surabaya, 30 Agustus 2003 ======================================================== transformation of Brassica campestris Expression of soybean β-1,3ssp. Parachinensis with synthetic endoglucanase cDNA and effect on Baccilus thuringiensis cry1AB and disease tolerance In kiwifruit plants. Plant Cell Report18:527-532. cry1Ac genes. Plant Cell Reports 19:251-256. Takeuchi, Y., M. Yoshikawa, G. Takeba, K. Tanaka, D. Shibata, O. Horino, 1990. Yoshikawa, M., N.T. Keen and M,C. Wang, Molecular cloning and ethilene Induction 1983. A receptor on soybean of mRNA encoding a phytoalexin membranes for a fungal elicitor of phitoalexin accumulation. Plant Physiol. elicitor-releasing factor, β-1,3endoglucanase, in soybean. Plant 73:49-52. Physiol 93:673-682. Yoshikawa, 1993. Resistance to fungal Terakawa, T., N. Takaya, H. Horiuchi, and M. disease in transgenic tobacco plants Koike, 1997. A fungalchitinase gene expressing tje phytoalexin elisitorfrom Rhizopusoligosporus confers releasing factor, β-1,3-endoglucanase, from soybean. Naturwissenschaften antifungal activity to transgenic tobacco. Plant Cell Rep. 16:439-443. 80:417-420. Xiang, Y., W.K.R. Wong, M.C. Ma, R.S.C. wong, 2000. Agrobacterium-mediated
Y Sri Wulan Manuhara
Page 69
