TOXIKUS FÉMEK ÉS NANO TITÁN-DIOXID HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA TETRAHYMENA PYRIFORMIS

TOXIKUS FÉMEK ÉS NANO TITÁN-DIOXID HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA TETRAHYMENA PYRIFORMIS TESZTORGANIZMUSSAL

TDK dolgozat

Készítette: Farkas Éva Témavezető: Dr. Feigl Viktória egyetemi tanársegéd Konzulens: Dr. Molnár Mónika egyetemi adjunktus

Budapest 2014

Köszönetnyílvánítás Ezúton szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Feigl Viktóriának, aki rengeteget segített a kísérleteim kivitelezésében és kiértékelésében, és bármikor fordulhattam hozzá segítségért. Külön szeretnék köszönetet mondani konzulensemnek, Dr. Molnár Mónikának, aki értékes tanácsaival lehetővé tette a dolgozatom létrejöttét. Hálával tartozom a BME ABÉT Környezeti Mikrobiológia és Biotechnológia Csoport valamennyi dolgozójának segítőkészségükért, amelyet a laboratóriumi munkáim során nyújtottak. Emellett köszönöm Mucza Norbertnek és Takács Enikőnek a méréseim során nyújtott segítségüket.

2

Tartalomjegyzék 1.

Bevezetés és célkitűzés ................................................................................................................... 4

2.

Irodalmi áttekintés .......................................................................................................................... 6 2.1.

Környezettoxikológia ............................................................................................................... 6

2.2.

Tetrahymena pyriformis tesztorganizmus ............................................................................... 8

2.3.

Toxikus fémek a vizekben ...................................................................................................... 10

Kadmium ....................................................................................................................................... 10 Cink ................................................................................................................................................ 10 Arzén.............................................................................................................................................. 10 Ólom .............................................................................................................................................. 11 Réz ................................................................................................................................................. 11 2.4.

Nanoanyagok a környezetünkben és ökotoxikológiai hatásuk ............................................. 12

2.5.

Nano titán-dioxid és ökotoxikológiai hatása ......................................................................... 13

2.6.

Fémek és nanoanyagok hatásának vizsgálata környezettoxikológiai módszerekkel ............ 14

Anyagok és módszerek .................................................................................................................. 15

3.

3.1.

Alkalmazott fémoldatok ........................................................................................................ 15

3.2.

Alkalmazott nano titán-dioxid szuszpenzió ........................................................................... 16

3.3.

Tetrahymena pyriformis szaporodásgátlási teszt .................................................................. 16

3.4.

Aliivibrio fischeri biolumineszcencia-gátlási teszt ................................................................. 20

3.5.

Sinapis alba (fehér mustár) gyökér- és szárnövekedés gátlási teszt ..................................... 23

4.

Eredmények és értékelés .............................................................................................................. 24 4.1.

Toxikus fémek hatása különböző trófikus szintekről származó tesztorganizmusokra .......... 24

4.1.1.

Aliivibrio fischeri biolumineszcencia-gátlás teszt eredménye ....................................... 24

4.1.2. Sinapis alba gyökér- és szárnövekedés gátlás teszt eredménye ......................................... 25

5.

4.1.3.

Tetrahymena pyriformis szaporodásgátlási teszt eredményei...................................... 28

4.1.4.

Eredmények összefoglalása ........................................................................................... 33

Fémek és nano titán-dioxid együttes hatása Tetrahymena pyriformis tesztorganizmusra ...... 34 5.1.

A titán-dioxid nanoszuszpenzió típusának és koncentrációjának kísérleti meghatározása .. ........................................................................................................................................... 34

5.2. Fémek és nano titán-dioxid együttes hatásának vizsgálata Tetrahymena pyriformis tesztorganizmusra ......................................................................................................................... 38 6.

Összefoglalás ................................................................................................................................. 54

7.

Felhasznált irodalom ..................................................................................................................... 56

3

1. Bevezetés és célkitűzés Az elkövetkező években-évtizedekben az emberiségnek sok környezetszennyezéssel kapcsolatos problémával kell szembenéznie, azonban mindezek között a legsürgetőbb a tiszta ivóvíz biztosításának kérdése. Egyre több szennyezőanyag kerül mind a felszíni mind felszín alatti vizekbe, ezáltal közvetett módon pedig kapcsolatba kerülhetnek az ivóvízbázisokkal is. A megnövekedett ipari tevékenységek, nem megfelelő hulladékkezelés és a környezetvédelmi előírások nem betartásának következménye a nehézfémek nagy mennyiségének a vízbázisokba jutása. Az elmúlt évtizedekben szárnyat kapó nanotechnológia sem maradt hulladékok, melléktermékek nélkül, azonban hosszú távú környezeti hatásai nem teljesen tisztázottak. A nanoanyagok ökoszisztémára gyakorolt hatásáról a kutatások által egyre több információval rendelkezünk, de még mindig rengeteg megválaszolatlan kérdés áll előttünk. Például a nanovegyületek erősíthetik a jelenlevő egyéb szennyezőanyagok, például toxikus fémek az eredetileg is számottevő negatív hatását. Ezért kiemelten fontos, hogy környezettoxikológiai módszerekkel vizsgáljuk hatásukat az ökoszisztémára és az emberre. Kutatásom célja az volt, hogy egy, már jól bevált, környezettoxikológiában széles körűen alkalmazott modellorganizmussal vizsgáljam, hogy milyen káros hatása lehet a toxikus fémeknek akkor, ha nanoanyaggal együtt kerülnek a környezetbe. Kutatási munkám első lépcsőjében méréseket végeztem annak meghatározására, hogy az általam választott tesztorganizmus, a Tetrahymena pyriformis, milyen érzékenységgel rendelkezik az egyes fémekre. Célom volt öt kiválasztott toxikus fémre (arzén, cink, kadmium, ólom, réz) meghatározni szaporodásgátlási teszt alapján a gátlást okozó hatásos koncentrációkat (EC20 és EC50 értékek) és összevetni az irodalomban fellelhető adatokkal. Emellett a fémek toxikus hatását vizsgáltam két más trofikus szinten lévő organizmussal is: a Sinapis albával (fehér mustár) gyökér- és szárnövekedés gátlási tesztet, az Aliivibrio fischeri, tengeri mikroorganimussal

pedig

lumineszcencia

gátlási

tesztet

kiviteleztem.

Ez

utóbbi

tesztorganizmusokkal meghatározott hatásos koncentrációkat összevetettem a T. pyrifomis szaporodásgátlási teszttel kapott értékekkel és értékeltem a különböző tesztorganizmusok, módszerek érzékenységét a fémekre. Kísérleti munkám második fázisában a toxikus fémekre kapott eredményeket felhasználva léptem tovább, és teszteltem T. pyriformis-szal a már nano titán-dioxidot és fémeket is tartalmazó keverék modelloldatokat.

4

A kiterjedten alkalmazott nanovegyületek közül azért ezt választottam, mert szennyezőanyagként számos humán felhasználású forrásból (krémek, kozmetikumok stb.) és ipari alkalmazásból (textil-, festék- és műanyagipar stb.) is nagy mennyiségben kerülhet a vízi ökoszisztémákba. Komplex kísérletsorozatban, 72 órás kísérletekben vizsgáltam meg a fémek és a titándioxid nanorészecskék együttes hatását az állati egysejtű (protozoa) tesztorganizmus szaporodására. A protozoák az ökoszisztéma fontos szereplői, a természetben lévő viselkedésük és jelenlétük összefüggésben van a szennyezőanyagok jelenlétével, a levegő, víz és talaj minőségével. A Tetrahymena pyriformis vizes közegből veszi fel a táplálékát, így vízben oldódó szennyezőanyagok közvetlenül hatnak életműködésére. Mivel az irodalomban a nano TiO2 és toxikus fémek együttes hatását kimutató mérési eredmény állati egysejtűvel még nem található, újdonságként ezzel céloztam meg modellezni e két szennyezőanyag kollektív hatását az ökoszisztéma tagjaira, felhívva a figyelmet az ilyen jellegű szennyezések környezeti kockázatára.

5

2. Irodalmi áttekintés

2.1.

Környezettoxikológia

A környezettoxikológia a környezetbe került vegyi anyagoknak az ökoszisztéma tagjaira gyakorolt hatását méri és ebből törekszik előrejelzést adni a teljes ökoszisztémára Mivel a teljes ökoszisztéma vizsgálata nem megvalósítható, ezért a felmérés egy-egy kiválasztott jellemző faj, vagy laboratóriumi tesztorganizmusok válasza által történik. Ez alapján következtetünk a teljes ökoszisztémára (Gruiz et al., 2001). A környezetünkbe kerülő vegyi anyagok globális veszélyt jelentenek, mivel az ökoszisztéma szerkezetére, funkciójára, ezen keresztül az emberre is hatással vannak; a környezettoxikológia/ökotoxikológia pedig ezeknek a vegyi anyagoknak káros hatását hivatott kimutatni. Nem csak a xenobiotikumok (természetidegen anyagok) jelenléte, hanem természetes eredetű szerves és szervetlen anyagok előfordulása a megszokottól eltérő eloszlásban is terhelheti a környezetet, ha extrém nagy értékek kerülnek a földi anyagforgalomba. Az ökotoxikológiai tesztek eredményéből következtethetünk vegyi anyagoknak az emberre és az ökoszisztémára gyakorolt hatásaira, úgy, hogy az emberi anyagcserével hasonlóságot mutató, jól bevált tesztorganizmusokkal kivitelezett tesztek eredményét megkapva, extrapolációt végzünk.

A

környezettoxikológia

a

vegyi

anyagok

környezeti

kockázatának

meghatározásához szükséges alapvető adatokat szolgáltatja, vagyis a vegyi anyag hatására vonatkozó információkat. A vegyi anyag hatásán  a dózis-válasz, illetve a koncentrációválasz összefüggés ismerete alapján meghatározható károsan még nem ható környezeti koncentráción  kell alapulniuk a környezeti minőségi kritériumoknak, a határértékeknek is. A környezettoxikológia egy multidiszciplináris tudományágnak tekinthető, mivel számos tudományterület közreműködésére szüksége van a környezeti toxikológiának pl.: mikrobiológia, biokémia, biometria, szerves és szervetlen kémia, matematika, ökológia, biológia. A vegyi anyagok hatásának három fontos alapfolyamata van: 1. Miután a vegyi anyag bekerül a környezetbe, kölcsönhatásba lép a környezetével. A különböző fázisok között terjed, megoszlik, átalakul, degradálódik, stb. Ezek a folyamatok határozzák meg a vegyi anyag környezeti koncentrációját. 6

2. Molekuláris szinten is kölcsönhatásba lép a vegyi anyag az élőlénnyel és elérheti annak létfontosságú szerkezeti részét vagy valamely fontos feladatot ellátó molekuláját pl.: enzimfehérje, genom. 3. A hatás ebből következően magasabb szintekre is átterjedhet és megjelenik pl.: biokémiai vagy fiziológiai szinten, viselkedés szintjén, a populáció vagy akár az egész ökoszisztéma szintjén (Gruiz et al., 2001). A környezettoxikológiai mérések végpontja sokféleképpen megválasztható, a biokémiai végpontoktól az organizmus szintjén keresztül az ökoszisztéma szintjéig bárhol. A végpont eredményei alapján általában további származtatott értékeket is felhasználunk a kockázat mértékének megállapítására. A hagyományosan mért végpontok közé tartozik a tesztorganizmus mozgásképtelenné válása (immobilitás) és halála (letalitás). Az ökotoxikológiai teszteket időtartam szerint is csoportosíthatjuk: lehet akut (rövid expozíciós/ kitettség idejű) vagy krónikus (hosszú expozíciós/ kitettségi idejű) tesztek. Az akut teszteket elterjedtebben alkalmazzák, melynek időtartama, tesztorganizmustól függően 24–72 óra. A tesztek eredményeiből határozzuk meg a koncentráció-válasz összefüggést úgy, hogy a vizsgált vegyi anyag növekvő koncentrációinak függvényében mérjük a hatást. A koncentráció-hatás görbéről olvashatjuk le a 10, 20, 50 vagy 90%-os gátlást okozó koncentrációt, ennek megfelelően az alábbi vizsgálati végpontokat szokták, mint eredményt megadni (Gruiz et al., 2001): LC (letális koncentráció), EC (hatásos koncentráció), LD (letális dózis), ED (hatásos dózis). Sok esetben előfordulhat az, hogy a vegyi anyag hatása nem jelenik meg ilyen rövid idő alatt, csak az akut teszt lejárta után, ezért célszerű hosszabb idejű, krónikus tesztek elvégzése is. Ezeknél a koncentráció-hatás görbe alapján grafikusan vagy statisztikai módszerekkel megállapított értékek adhatók meg. Ezek a NOEC (No Observed Effects Concentration), a NOEL (No Observed Effects Level), a NOAEC (No Observed Adverse Effects Concentration), a NOAEL (No Observed Adverse Effects Level), a LOEC (Lowest Observed Effects Concentration), a LOEL (Lowest Observed Effects Level), és a MATC (Maximum Allowable Toxicant Concentration). A környezettoxikológia jelentős hatással bír manapság mind ipari, mind a környezetvédelmi területeken, így már sok ASTM (American Standards for Testing Materials), ISO (International Office of Standardisation) és OECD (Organisation for 7

Economic Cooperation and Development) szabvány foglakozik a vegyi anyagok hatásának, valamint a talajok és vizek minőségének értékeléséhez kapcsolódó biológiai vizsgálatokkal (ASTM, ISO, OECD). Az REACH (EU területén előállított vagy forgalmazott vegyi anyagokra vonatkozó új egységes szabályozás) is kiemelt hangsúly fektet az ökotoxikológiai tesztek által szolgáltatott eredményekre, információkra (Gruiz et al., 2001).

2.2.

Tetrahymena pyriformis tesztorganizmus

A Tetrahymena pyriformis (1. ábra) az Oligohymenophoreák osztályába, a Hymenostomiák alosztályába, a Hymenostomatidák rendjébe és a Tetrahymenina alrendbe tartozó csillós eukarióta egysejtű, vízi protozoa, mely az ökotoxikológiai tesztek és sejtfiziológiai kutatások közkedvelt tesztorganizmusa (Sauvant et al, 1999). Népszerűségét annak köszönheti, hogy könnyen fenntartható laboratóriumi körülmények között, rövid sejtciklus idővel rendelkezik, receptorai és jelátviteli útvonalai szempontjából nagymértékű hasonlóságot mutatnak fejlettebb gerinces modellekhez (Láng et al., 2004). Fejlettebb élőlényekhez hasonlóan a Tetrahymena pyriformis is termel bizonyos hormonokat, például inzulint és adrenalint (Sauvant et al, 1999). Könnyen vizsgálható emellett a kemotaxisa és a fagocitózisa is. Érzékenyen reagál a környezetben előforduló szerves- és szervetlen molekulák jelenlétére (Arndt et al., 1998). Ezek a tulajdonságok teszik alkalmassá arra, hogy a környezetben megtalálható gyógyszerhatóanyagok élettani hatásait vizsgáljuk rajta.

1. ábra: Lugollal megfestett Tetrahymena pyriformis

8

A sejtek általánosságban 50–60 μm hosszúak és 30 μm szélesek, alakjuk körtére emlékeztet, felszínüket csillók borítják. A Tetrahymena pyriformisra jellemző még a nevüket adó és a sejtszájat körülvevő négy hártyaszerű képlet. Tenyésztésük hőmérsékleti optimuma, ahol leggyorsabbak az életfunkcióik 28 °C. Generációs ideje 150–160 perc (Sauvant et al, 1999). Mivel édesvízi környezetben mindenhol megtalálható és érzékenyen reagál a környezeti változásokra, a csillós Tetrahymena pyriformis évtizedek óta a legkedveltebb tesztorganizmusok között volt különböző ökotoxikológiai, fizikológiai, biológiai és farmakológiai kutatásoknak. Tulajdonságai a tesztorganizmusok összes kritériumának megfelelnek, eukarióta, jól ismertek a biológiai válaszreakciói, könnyen fenntartható laboratóriumi körülmények között, és a generációs ideje is kellően rövid (Nicolau et al, 2001). Az ökotoxikológiai tesztek végpontjának sokszor választják a sejtszámot, a szaporodási képességet, illetve a sejtek méretét és mozgásképességét. A Tetrahymena pyriformis szaporodása a számára optimális körülmények között, korai (Lag), exponenciális (Log), és végső telítési stacioner (Stat) növekedési fázisokkal jellemezhető. Sejtszám-változás szempontjából a Log fázisban a sejtszám logaritmikusan növekszik, itt érdemes kísérleteket elvégezni (ez a fázis akár két napig is tarthat). A következő, stacioner fázisba a tápanyagszint csökkenése és a pH emelkedése miatt jutnak el. A sejtszámlálás többféle módon is történhet: manuálisan mikroszkóppal, automata sejtszámlálóval, vagy akár spektrofotometriás módszerrel is meg tudjuk számolni (Sauvant et al., 1999). A sejtszámból, mely a környezettoxikológiai tesztek gyakori végpontja, növekedési görbe készíthető, melyből a generációs idő (3–7 óra) is meghatározható. Ebből meg tudjuk határozni a szennyezőanyagnak azt a koncentrációját, amely a sejtek számát a kontrollhoz képest 50%-kal csökkenti, azaz az IC50 értéket. Ökotoxikológiai teszteknél végpont lehet a makronukleusz DNS tartalma is. A Tetrahymenák több törzsénél (pl. Tetrahymena termophila) a makronukleolusz mellett mikronukleolusz is előfordulhat. A makronukleusz a mikronukleusz DNS tartalmának 12–14-szeresét tartalmazza, így, hiába érzékeny mindkettő DNS állománya a külső behatásokra, gyakorlatilag, ha csak a makronukleusz DNS tartalmát vizsgáljuk, akkor jó közelítéssel, a sejt teljes DNS tartalmára következtethetünk ebből az értékből (Stefanidou et al., 2008).

9

2.3.

Toxikus fémek a vizekben

A kohászat, bányászat és az egyéb ipari tevékenységek melléktermékeiként nagy mennyiségű nehézfém és egyéb toxikus vegyület juthat a talajokba és felszíni élővizekbe. A talajokból a felszín alatti vizekbe mosódnak a szennyeződések, veszélyeztetve az ivóvízbázisokat és a felszíni vizeket, így még több élőlény számára is kockázatot jelentenek. A toxikus bekerülhetnek a táplálékláncba, ezáltal az emberhez is eljutva. Kadmium

A kadmium különböző természetes utakon, mint erózió, hévforrások stb. is a környezetbe juthat, de a legnagyobb hányad az ipari tevékenységek (acélgyártás, kohászat, festékgyártás) folytán jut a környezetbe. Ezen kívül ipari és háztartási hulladékkal, műtrágyázás folyamán is kijuthat (Fergusson, 1990; Pálné, 2003). Emberek számára főként azért toxikus a kadmium, mivel a cinkkel való nagyfokú kémiai rokonságot mutat. A szervezetbe elsősorban gabonanövények, zöldségek, diófélék, hüvelyesek, tengerből származó élelmiszer burgonya, húsok és hústermékek, vadon nőtt gombák fogyasztásával jut be. Károsítja a vesét, az idegrendszert, csontelváltozásokat, emésztőrendszeri és légzési zavarokat okoz (Sohárné, 2009; Feigl, 2011). Cink

A talajokba, talajvizekbe cink elsősorban ipari tevékenységek miatt juthat (bányászat, kohászat, fosszilis tüzelőanyagok elégetése) de a mezőgazdasági tevékenység során is kerülhet a talajokba, talajvizekbe (Adriano, 1986). Embereknél a cinkhiány csökkenti a termékenységet, gyengíti az immunrendszert, gátolja a gyermekek növekedését (Pálné, 2002), viszont a cink túladagolása hosszútávon emésztőrendszeri és szexuális problémákhoz vezethet, továbbá károsodik az immunrendszer és a reprodukciós szervek is (www.advance-health.com; Feigl, 2011). Arzén

Az arzén természetes úton (vulkáni tevékenység, kőzetek mállása) és mesterséges úton (ipari tevékenységek: kohászat, bányászat, vegyipar) is kikerülhet a környezetbe, az emberi szervezetbe pedig tengeri élőlények fogyasztásával, ivóvízzel és akár a levegőből is bekerülhet (www.epa.gov). A gyógyászatban is használták roborálószerként és pl. a szifilisz visszaszorítására alkalmas arzéntartalmú gyógyszerekben, ezen felül régóta ismert és használt méreg. Krónikus 10

mérgezés esetén raktározódhat a körömben, bőrben és a hajban, és nagyon lassan ürül ki a szervezetből a vizelettel, esetleg az epeváladékkal. Karcinogén, főként tüdő- és bőrrákot, de egyéb daganatos megbetegedéseket is okozhat (Pálné, 2002; Wagner és Hencsei, 2001; Feigl, 2011). Ólom

Mint a legtöbb nehézfém, az ólom környezetbe jutásáért is elsősorban a kohászat és a bányászat a felelős, de az ólom ezen felül a festékgyártásból, műanyagok égetéséből és közlekedés során korábban használt és elégetett ólmozott üzemanyagok elégetésével is a környezetbe kerülhetett (Adriano, 1986). Az emberi szervezetbe húsok és gabonafélék továbbá szennyezett ivóvíz fogyasztásával juthat: ólommérgezéskor vérszegénység lép fel, a krónikus ólommérgezés pedig idegrendszeri zavarokhoz vezet (Feigl, 2011). Az IARC az ólmot és szervetlen ólomvegyületeket a valószínűleg rákkeltő csoportba sorolta, míg a szerves ólomvegyületeket nem tekinti a rákkeltő vegyületek csoportjába sorolhatónak (www.inchem.org). Réz

Nagy adagú réztrágyázás, réztartalmú fungicidek ismételt alkalmazása, szennyvíziszap adagolása, illetve a bányászat, kohászat, fémelőállítás következében fellépő légköri ülepedés eredményezhet toxikus rézkoncentrációt a talajban. A talajban lévő réz legnagyobb része a szerves anyagokhoz kötött, de egy része a vasoxidokhoz és más talajkolloidokhoz kapcsolódik. A réz savanyú talajokban a legoldhatóbb, a pH-érték emelésével csökken az oldhatósága (Atkári, 2006). Kis mennyiségben esszenciális, nagyobb mennyiségben toxikus elem. A réz jelentős szerepet játszik a biokémiai folyamatokban (pl. a molekuláris oxigén rézfogyasztás 3–5 mg, melynek nagy része kiürül). Mivel a szervezetben a vas anyagcseréjét a réz befolyásolja, hiánya vérszegénységet okoz. Szembe kerülve a réz kalkózist okoz, amely vaksághoz vezet. A bordói lével permetezők között gyakori a tüdő- és májkárosodás (Fergusson, 1990).

11

2.4. A

Nanoanyagok a környezetünkben és ökotoxikológiai hatásuk nanotechnológiai

módszerekkel

előállított

nanorészecskék,

nanoszemcsék

elsősorban méret szempontjából sorolhatóak egy csoportba. Azokat az anyagokat nevezzük nanoanyagoknak, melyeknek legalább egy dimenziója kisebb 100 nm-nél. Szerzőnként változik a publikációkban megadott definícióban szereplő mérethatár. Vannak, akik 50 nm-t, vagy 1 μm-t adnak meg felső határként. Ennek oka, hogy anyagtípustól függően más tartományban kezdenek szignifikáns különbségek jelentkezni a nano, és normálméretű részecskék viselkedésében (Buzea et al., 2007; Pándics, 2008). Nanorészecskék lehetnek amorf, vagy kristályos elrendezésűek, felületük hordozóként szolgálhat más anyagok, gázok és folyadék cseppek számára. Különleges tulajdonságaik miatt – nagy fajlagos felület, kvantum kölcsönhatások – tekinthetnénk rájuk úgy is, mint az anyag egy sajátos új halmazállapotára (Buzea et al., 2007). A nanorészecskék kémiai összetételüket tekintve rendkívül széles skálán mozognak, lehetnek elemek, vegyületek vagy akár biológiai struktúrák is. Különböző

nanorészecskék

keletkezhetnek

természetes

úton,

vagy

emberi

(antropogén) tevékenység következtében. Ez történhet célzott előállítás során, vagy pedig nem

kívánatos

melléktermékként

(Pándics,

2008).

Természetes

folyamatok során

kőzetmállások, erdőtüzek, vulkánkitörések során kerülhetnek a környezetbe (Maros, 2011). Felhasználást tekintve legnagyobb előnye a méret csökkenésével egyenes arányban a fajlagos felület növekedése, ezt használják ki az iparban leginkább. Kozmetikumokban, napvédő krémekben nagy mennyiségben használják fel őket, mivel kis méretük révén a bőr mélyebb rétegeibe képesek behatolni, ezáltal különböző, akár regenerálódást serkentő anyagokat is be tud juttatni vivőanyagként (Maros, 2011). Ezen kívül adalékanyagként is felhasználhatjuk őket: festékeknél, vakolatokban vagy gumiabroncsokban.

Fontos

szerepük

van

az

elektronikában,

mikroelektronikában,

félvezetőkként. Egyéb gyorsan fejlődő alkalmazási területek az üzemanyagcellák fejlesztése, speciális bevonatok készítése és a katalitikus folyamatokban való alkalmazásuk. Ígéretes felhasználási területek vannak még az energia tárolás és átalakítás területén is. Nanoanyagok segítségével lehetséges öntisztuló bevonatok létrehozása, vagy szennyezőanyag taszító textilek fejlesztése (Gellein et al., 2009; Maros, 2011).

12

A humán egészségügyi alkalmazások fejlesztése a nanoanyagok alkalmazásának egyik legtöbbet kutatott és legígéretesebb területe. Egyre nagyobb mennyiségben használnak nanoanyagokat a diagnosztikában (képalkotó eljárások) is és a terápiás eljárásokban is (gyógyszerhatóanyagok célba juttatása) (Gellein et al., 2009; Maros, 2011). Környezettoxikológiai hatásuk még nem igazán ismert, csak az utóbbi időben kezdtek el foglalkozni a kutatók a kockázatuk felmérésével. Mivel speciális tulajdonságú anyagokról van szó, ezért nehéz megjósolni a hatásukat. Többek között szinte lehetetlen diszpergálószer használata nélkül oldatokat készíteni belőlük, ezért az várható, hogy természetes vizekben aggregálódni fognak. Ezen felül az, hogy egy adott nanoanyagnak nincsen akut toxicitása, nem feltétlenül jelenti azt, hogy hosszútávon sincs. Ezen felül különböző szinergista hatások léphetnek fel más szennyezőanyagokkal is (la Farré et al., 2008).

2.5.

Nano titán-dioxid és ökotoxikológiai hatása

Titán-dioxid nanorészecskéket széles körben használnak, mint fehér pigment anyagot, ételszínezéket, napvédő krémet, egyéb kozmetikai célú krémek, valamint fogkrémek összetevőjét. Legtöbb alkalmazása esetében UV elnyelő képességét aknázzák ki. Használják még textilek, papír és műanyagok előállításánál, ahol ugyancsak UV védelem a célja, valamint élelmiszerek és gyógyszerek alkotóelemeiként (Maros, 2011). Nano titán-dioxid hatásának leginkább a vízi ökoszisztémák vannak kitéve, és mivel aggregálódásra hajlamos, a fenéklakók ennek nagyobb mértékben áldozatul esnek, de a vízfelszínén élő növények és állatok is nagyobb expozíciónak vannak kitéve, mint a víztestben élők. Táplálékkal, légzéssel juthatnak a szervezetükbe, de abszorbeálódhatnak vagy aggregálódhatnak is az itt élő organizmusok felszínén. Szárazföldön leginkább a szállítás során sérülő tartályokkal kerülhetnek kölcsönhatásba az ott élő organizmusok. Szárazföldi növények felvehetnek nano titán-dioxidot tartalmazó vizet, vagy nőhetnek szennyezett talajon, például víztisztító üzem iszapjával kezelt területen (EPA 2009).

13

2.6.

Fémek és nanoanyagok hatásának vizsgálata környezettoxikológiai módszerekkel

A nanoanyagok újdonsága miatt nagyon kevés kutatást végeztek eddig fémek és nanovegyületek

együttes

hatásának

vizsgálatára,

ezért

indítottam

ezt

az

átfogó

kísérletsorozatot, melyben több fém hatását is tanulmányoztam nano titán–dioxiddal szuszpenzióval együttesen tesztelve. Tetrahymena thermophila-val végeztek már olyan kísérleteket, ahol nano-ZnO és nano-CuO toxikus hatását vizsgálták (Mortimer et al., 2010). Azt találták, hogy a toxikus hatás a részecske méretétől és koncentrációjától függ leginkább. A kitettség idejének hatása fontos tényezőnek bizonyult: a ZnO esetében 1,5-szer kisebb toxikus hatást mértek az adaptáció miatt 24 óra elteltével, mint 4 óra után, CuO-nál viszont egyáltalán nem volt változás az idő előrehaladtával. A BME-n is folytak kutatások nanoanyagokkal kapcsolatban (Maros, 2011). Ekkor nano titán-dioxid hatását vizsgálták meg különböző trófikus szintekről származó ökotoxikológiai tesztorganizmusokkal, így átfogóbb képet adva ennek a vegyületnek a környezetre gyakorolt hatásáról. Fémek, többek között alumínium hatását is vizsgálták már T. pyriformisra akut toxicitási tesztben (Sauvant et al., 2000). Ennek során egy 9 órás tesztet alkalmaztak, ahol három alumínium só IC50 értékeit határozták meg, de indult olyan tesztsorozat is ahol átfogóan határozták meg fémek egész sorára az IC50 értékeket (Sauvant, 1997). Nanovegyület és fémek kombinált hatását is tanulmányozták kutatók: arzén és nano vas(III)-oxid toxicitását figyelték meg Kínában Zou et al. (2013), és arra ez eredményre jutottak, hogy a nano-vas önmagában serkentette a T. pyriformis szaporodását, arzénnel kombinálva viszont gátló hatásuk lett. Ez a hatás az idő előrehaladtával csökkent.

14

3. Anyagok és módszerek Dolgozatom fő célkitűzése volt megvizsgálni fémek/félfémek (cink, kadmium, ólom, réz és arzén) hatását a Tetrahymena pyriformis tesztorganizmus szaporodására önmagában, továbbá a napjainkban kiterjedten alkalmazott nanoanyaggal, a nano titán-dioxiddal együttesen alkalmazva. Központi kérdés volt, hogy a nano titán-dioxid fokozza-e a kiválasztott fémek és arzén hatását, ha együtt vannak jelen a környezetben. Ehhez kapcsolódóan kutatásaim során toxikus fémek hatását vizsgáltam különböző tesztorganizmusokra. Kísérleti munkám fő részében a Tetrahymena pyriformis csillós egysejtűvel végeztem szaporodásgátlási teszteket. Azonban ezen túlmenően, más trófikus szintek képviselőivel is vizsgáltam a toxicitást, abból a célból, hogy az eredményeimet összevethessem velük, és információt kapjak az állati egysejtűt alkalmazó módszer érzékenységéről az adott szennyezőanyagok esetén. Ehhez kettő, az állati egysejtűtől különböző – egy alacsonyabb és egy magasabb - trófikus szintről származó tesztorganizmust alkalmaztam: a fehér mustár növényt (Sinapis alba) és egy tengeri baktériumot (Aliivibrio fischeri). Mindkét módszer rutinszerűen alkalmazott eljárás napjainkban környezeti minták toxicitásának jellemzésére. Munkám második részében pedig a nano titán-dioxid toxikus hatását vizsgáltam együtt a kiválasztott fémekkel 72 órás rázatott lombikos kísérletekben.

3.1.

Alkalmazott fémoldatok

Méréseim során különböző koncentrációjú fémoldatokkal dolgoztam, melyekhez a törzsoldatokat én készítettem el. Ezekből készítettem a megfelelő hígításokat a teszteléshez. Az összeállított törzsoldatok a következőek voltak: 5000 pppm-es és 1000 ppm-es Cd-ion tartalmú oldat CdCl2.2,5H2O-ból 5000 pppm-es és 1000 ppm-es Pb-ion tartalmú oldat Pb(NO3)2-ből 5000 pppm-es és 1000 ppm-es Zn-ion tartalmú oldat ZnCl2-ből 5000 pppm-es és 1000 ppm-es Cu-ion tartalmú oldat CuCl2.2H2O-ből 5000 pppm-es és 1000 ppm-es As-ion tartalmú oldat Na2HAsO4.7H2O-ból

15

3.2.

Alkalmazott nano titán-dioxid szuszpenzió

Neve: CYL 3039/2 (Forgalmazó: Evonik, korábban Degussa) •

Elsődleges kristályméret: 14 nm

•

A diszperzióban található halmazok 50%-ának összesített térfogata (tömege) az adott méret alatt, 50 %-a e feletti tartományban található: 89 nm.

•

A diszperzióban található halmazok 50%-a (szám szerint) az adott méret alatt, 50 %-a e feletti tartományban található: 73 nm

•

Szuszpenzió koncentrációja: 4,00 m/m %

•

Fajlagos felület: 90 m2/g.

3.3.

Tetrahymena pyriformis szaporodásgátlási teszt

A módszer alapja az, hogy a Tetrahymena pyriformis (2. ábra) mikroszkopikus állatka szaporodása nagyban gátolt toxikus anyagok jelenlétében. Az állatok számának, azaz a sejtszám változásának nyomon követésével a szennyezőanyagok toxikus hatása vizsgálható. Az eredeti módszert Gruiz és Leitgib (2006) fejlesztették ki talajok környezettoxikológiai tesztelésére, majd a BME ABÉT Környezeti Mikrobiológia és Biotechnológia Csoportban fejlesztették később tovább. Toxikus fémek vízmintákban való vizsgálatára a kísérleteim előtt a tesztrendszer összeállítását probléma-specifikusan módosítottam.

2. ábra: Tetrahymena pyriformis Bürker-kamrás számoláskor

16

A Tetrahymena pyriformis fenntartása: A Tetrahymena pyriformis fenntartása folyadékkultúrában, folyamatos heti átoltással történik, PP tápoldatban. Az átoltás során 30 ml PP tápoldatba 1,6–1,8 ml sejtszuszpenziót teszünk a szuszpenzió felső, oxigéndúsabb rétegéből, illetve 76 μl antibiotikum mix (AB mix: 0,2% penicillin, 2% sztreptomicin, 1% nisztatin) oldatot a befertőződés elkerülése érdekében. A tenyészetet sötét termosztátban, 22±1°C állandó hőmérsékleten tartjuk.

A PP tápoldat összetétele (fenntartáshoz és teszteléshez): 

10 g tripton



1 g élesztő kivonat



1000 ml csapvíz  ezután sterilezés autoklávban 121 °C-on, 10 percig.

A tesztrendszer összetétele: 100 ml-es Erlenmeyer lombikban indítottam a méréssorozatokat, melyhez egy napos, előzetesen meghatározott sejtszámú Tetrahymena pyriformis szuszpenziót használtam fel. 

300 µl steril fémoldat, megfelelő koncentrációban, steril desztillált vízzel hígítva. Szennyezetlen kontrollként steril csapvizet használtam.



200 µl antibiotikum mix oldat



14,5 ml steril csapvíz



Inokulum: előzetes sejtszámlálás alapján meghatározott T. pyriformis mennyiség, úgy, hogy a sejtek kiindulási koncentrációja a tesztrendszerben 2500 db/ml legyen



15-x ml PP tápoldat A tápoldat és a csapvíz aránya azért 1:1-hez, mert a fél tápoldat alkalmazásával

érzékenyíthetünk a teszten. Ha teljes tápoldatban dolgoztam volna, a T. pyriformis esetleges gátlási reakcióit kiegyenlítette volna a nagy feleslegben adott tápoldat serkentő hatása.

17

A mérés menete: Az egyes tesztrendszerekből két-két párhuzamos mérést indítottam. A különböző koncentrációjú és összetételű tesztelegyeket tartalmazó lombikokat (3. ábra) ezután rázógépbe helyeztem, ahol 150 rpm-en és 22±1°C hőmérsékleten rázattam 72 órán át, 24 óránként pedig steril körülmények között mintát vettem belőle.

3. ábra: Rázatásra előkészített tesztelegyek A sejtszámláláshoz a tesztkultúrából kivett 1 vagy 0,5 ml mintához 1,5%-os formalin oldatot mértem, rendre 30 µl-t ill. 15 µl-t. Ezután lombikonként 2 db 2 µl-es cseppben számláltam meg a sejteket Bürker-számlálókamra (4. ábra) segítségével.

4. ábra: Bürker-kamrás számolás mikroszkóppal

18

Eredmények kiértékelése: Az adatokat excel táblázatban rendeztem és kiszámoltam a gátlási százalékokat a következő módon:

Ahol: I% - a szaporodásgátlás %-ban kifejezett értéke; K – a kontrollként használt csapvizes tesztrendszerben mért sejtszámok átlaga F – a vizsgált fémtartalmú tesztrendszerben mért sejtszámok átlaga A kiértékelés ezután kétféle módon folytatódott. Azokban a mérési összeállításokban, ahol csak fémoldattal dolgoztam, azaz az adott fém gátló hatását vizsgáltam önmagában, koncentráció-válasz görbéket készítettem az OriginPro 8 program segítségével, és leolvastam a 20%-os és az 50%-os gátláshoz tartozó koncentráció értékeket. Ez a grafikus módszer látható az 5. ábrán.

5. ábra: Grafikus módszer az EC20 és EC50 értékeinek leolvasásához

19

Azokban az összeállításokban, ahol nano TiO2-fém keverékeket készítettem, a nanoanyag és fém együttes hatásának vizsgálatát célozva, STATISTICA12 szoftverrel határoztam meg, hogy melyek azok a fém-nano TiO2 keverékek, melyek szignifikánsan különböznek az adott csak fémet, illetve csak nano TiO2-t tartalmazó tesztrendszerektől.

Eredmények statisztikai kiértékelése A titán-dioxid nanorészecskéket és fémoldatot is tartalmazó keverékekből származó adatokat STATISTICA 12 szoftverrel értékeltem ki. ANOVA variancianalízist alkalmaztam 95% konfidencia intervallum megadásával. Az általam Post Hoc analízisként alkalmazott Duncan’s próba eredményeiből megbízhatóan meg tudtam állapítani, melyek azok a keverékek, melyek szignifikánsan különböznek az azonos koncentrációban vagy csak fémoldatot, vagy csak nano-titánt tartalmazó kontrolloktól. A Duncan próba az egyik leggyakrabban alkalmazott többszörös összehasonlító teszt napjainkban.

3.4.

Aliivibrio fischeri biolumineszcencia-gátlási teszt

Az Aliivibrio fischeri biolumineszcencia-gátlási teszt egy fajt alkalmazó, in vitro bakteriális, akut toxicitási teszt, mely alkalmazható felszíni vizek, pórusvíz, üledék, talajkivonat és teljes talaj vizes szuszpenziója toxicitásának meghatározására. Az Aliivibrio fischeri érzékeny nehézfémekre, szerves makro- és mikroszennyezőkre. A módszer az Aliivibrio fischeri tengeri baktérium által emittált lumineszcens fény intenzitásának mérésén alapul. Gátló anyag jelenlétében a fényemisszió csökken, amelynek mértékét luminométerrel mérjük. Mivel az Aliivibrio fischeri tengeri organizmus, fontos, hogy a kísérlet során fenntartsuk a számára szükséges ozmózisnyomást. A biolumineszcencia élő rendszer általi lumineszcens fénykibocsátást jelent. A bakteriális lumineszcens fénykibocsátás alapegyenlete: FMNH2+O2+ RCHOFMN+RCOOH+H2O+fény ahol az FMNH2 a redukált, az FMN az oxidált flavin mononukleotid.

20

A minta hígítási sorából EC20, EC50 (hatásos koncentráció, mely a mérési végpont 20, ill. 50 %-os csökkenését okozza) határozható meg, melyekkel jellemezhető a vizsgált minta toxikussága. A módszer előnye, hogy jól reprodukálható, alkalmas előzetes és részletes állapotfelmérésre, kockázatfelmérésre, remediáció követésére, ellenőrzésére, utómonitoringra (Gruiz et al., 2001). Aliivibrio fisheri tápoldat összetétele: 1. táblázat: Aliivibrio fischeri tápoldat összetétele

30 g

NaCl

6,1 g

NaH2PO4.H2O

2,75 g

K2HPO4

0,204 g

MgSO4.7H2O

0,5 g

(NH)2HPO4

5g

pepton

0,5 g

élesztőkivonat

3 cm3

glicerin

7,2

pH

Aliivibrio fischeri biolumineszcencia-gátlási teszt menete: A vizsgálathoz használt baktérium-szuszpenzió előállítása két lépésben történt. Első lépésben 24 órán át, 28°C-on, lombikban rázatott inokulumot állítottam elő, majd ennek 1 cm3-ével 30 cm3 tápoldatot oltottam be. 24 órás, 28°C-on történő rázatás után használtam a sejtszuszpenziót mérésre. A mérés érzékenységének kezdeti beütésszámtól és hőmérséklettől való függése miatt egy standard réz-sort is készítettem. A standard sor készítéséhez felhasznált réz vegyület: CuSO4.5H2O. A hígításhoz 2%-os NaCl-oldatot használtam. Az alkalmazott Cu-sor tagjainak koncentrációja: 20, 40, 80, 120, 160, 200 és 400 ppm (6. ábra). A lumineszcencia mérését LUMAC Biocounter M1500 P luminométerrel végeztem. A mérés kontrolljaként 2%-os NaCl oldatot és desztillált vizet használtam.

21

6. ábra: Kontroll rézoldat-sor hígítási sorának elkészítése

A mérés első lépéseként meghatároztam az inokulum kezdeti beütésszámát, hogy szükség szerint hígíthassam. (Előzetes mérések szerint, ha a kezdeti beütésszám 600 000 felett van érdemes a sejtszuszpenziót hígítani). Második lépésként a készülék mintatartóiba 200– 200 µl sejtszuszpenziót pipettáztam, majd megmértem a lumineszcencia intenzitását (I0). Ezután a higított mintáimból 50–50 µl-t pipettáztam a sejtszuszpenziókhoz, minden esetben alaposan homogenizálva a kémcsövekben lévő mintákat. A rézsorból szintén 50–50 µl-t adtam a megfelelő sejtszuszpenziókhoz. A kontroll mintákhoz a mérési sorozat elején és végén 50µl NaCl-ot mértem be. 30 perces kontaktidő elteltével megmértem a lumineszcencia intenzitást (I30). Eredmények kiértékelése: A 3. táblázat szerint számoltam a mért intenzitások segítségével a vizsgált minta okozta %-os lumineszcencia- intenzitáscsökkenéseket (H%). 2. táblázat: táblázat az A. fischeri mérés kiértékeléséhez

Minta

I0

I30

f=I30k/I0k

NaCl kontroll 1

I0k1

I30k

f= (I30k1+I30k2)/ (I0k1+I0k2)

Cu1 Cu2 Cu3 Cu4 Cu5 minta1 minta2 NaCl kontroll 2

I0Cu1 I0Cu2 . .

I30Cu1 . . .

Iom1 Iom2 I0k2

I30m1 .

Iszám=f*Io H%=100%*(IszámI30)/Iszám

Ahol: I0 – a mintatartóba mért inokulum kezdeti lumineszcencia intenzitása; I30 – 30 perccel a minta hozzáadása után mért lumineszcencia intenzitás; f – a kontroll minta 30. illetve 0. percben mért lumineszcencia intenzitásának hányadosa; Iszám – azon lumineszcencia intenzitás, amelyet a vizsgált minta venne fel 30 perces behatási idő után, ha toxikus anyag nem lenne jelen; H% – a vizsgált minta okozta %-os lumineszcencia intenzitás-csökkenés.

22

Az eredmények interpretálásához, a számított adatokból az OriginPro 8 szoftver segítségével H% - fémkoncentráció görbét szerkesztettem, és erről leolvastam a 20%-os és az 50%-os gátláshoz tartozó koncentráció értékeket (EC20, EC50). Ez a grafikus módszer látható a 4. ábrán.

3.5.

Sinapis alba (fehér mustár) gyökér- és szárnövekedés gátlási teszt

A fehér mustár (Sinapis alba) egy, a szennyezőanyagokra igen érzékeny növény, ezek jelenlétében növekedése gátolt, így vizek, talajok szennyezettségének vizsgálatára alkalmas. A tesztmódszer az MSZ 22902-4:1990 és az MSZ 21976-17:1993 szabványokon alapul (Feigl, 2010). A módszer segítségével, a gyökér-, illetve a szár növekedése alapján becsülhető a toxikus hatás mértéke. A fehér mustármag vetőmagboltból, bioboltból származó friss mag, melynek csírázóképessége minimum 95%. Vizsgálat menete: A kiválasztott fémoldatból elkészítettem az általam vizsgálni kívánt hígítási sort, majd alapos vortexelés után 5 ml-t mértem 9 mm-es átmérőjű Petri csészébe helyezett szűrőpapír korongra és mindegyikre 25 db életképes mustármagot helyeztem el egyenletes elrendezésben. Két párhuzamos mérést végeztem, kontrollként desztillált vizes szűrőpapírt használtam. A mintákat ezután 72 órán át sötétben termosztáltam. Eredmények kiértékelése: A kiértékelés során vonalzóval mértem a gyökér- és szárhosszakat, majd a párhuzamosakat átlagoltam. A gyökér- és szárnövekedés-gátlást százalékában adtam meg, a kezeletlen kontrollhoz viszonyítva az alábbi módon:

Ahol: I – a gyökér-, illetve szárnövekedés gátlás %-ban kifejezett értéke; K – a kontrollként használt desztillált vizes szűrőpapíron csírázott magvak gyökér-, illetve szárhossza; M – a vizsgált fémoldattal átitatott szűrőpapíron csírázott magvak gyökér-, illetve szárhossza. Az eredmények kiértékeléséhez OriginPro 8 szoftver segítségével gátlási százalékfémkoncentráció görbét szerkesztettem, ahonnan leolvastam az EC20 és EC50 értékeket.

23

4. Eredmények és értékelés A nanotechnológia rohamos térhódításának köszönhetően, a széles körben alkalmazott nanoanyagok kikerülnek az ökoszisztémákba és kifejtik gyakran káros hatásaikat a benne élő szervezetekre, így az emberre is. Egyre nagyobb az igény ezeknek az anyagoknak önmagában és más szennyezőanyagokkal együtt fellépő hatásaiknak minél pontosabb megismerésére, kockázatuk előrejelzésére. Kutatási munkám fő célja a toxikus fémek és a nano titán-dioxid együttes hatásának vizsgálata volt Tetrahymena pyriformis tesztorganizmussal. Ezen felül az alkalmazott fémek káros hatásának feltérképezésére két másik módszert is használtam, hogy a módszer érzékenységét összehasonlítsam a kutatócsoportban és a környezettoxikológiában is rutinszerűen alkalmazott egyéb eljárások érzékenységével. Ez a két méréssorozat alacsonyabb és magasabb trófikus szintekről származó tesztorganizmusokkal, Aliivibrio fischerivel és Sinapis albával (fehér mustár) történt. Elsőként ezek eredményeit értékeltem ki, és ennek alapján végeztem el a nano TiO2 – fémoldat keverékekre vonatkozó kísérleteket.

4.1. Toxikus fémek hatása különböző trófikus szintekről származó tesztorganizmusokra 4.1.1. Aliivibrio fischeri biolumineszcencia-gátlás teszt eredménye Az Aliivibrio fischeri biolumineszcencia-gátlási módszer, egy akut toxicitási teszt, mely a baktérium fénykibocsátás-gátlásán alapul szennyezőanyag jelenlétében. Több mérési sorozatban

teszteltem

a

tengeri

baktérium

érzékenységét

a

kiválasztott

toxikus

fémekre/félfémre (Cu, Cd, As, Pb, Zn). Ugyanakkor csak a kadmiumra és a rézre sikerült meghatároznom EC20 és EC50 értékeket, míg arzén és ólom esetén azt tapasztaltam, hogy a tesztorganizmus adott mérési körülmények között nem érzékeny ezekre a fémekre, mivel az alkalmazott legnagyobb, 4000 ppm-es koncentráció sem váltott ki gátló hatást a fénykibocsátásban.

24

Az általam meghatározott hatásos koncentráció értékek a 3. táblázatban találhatóak: 3. táblázat: Lumineszcencia-gátlási tesztből származó EC értékek

Réz Kadmium

EC20 [ppm] 7,0 2277

EC50 [ppm] 7,3 4085

Határérték felszín alatti vízre* 0,2 0,005

*6/2009 (IV. 14.) KvVM-EüM-FVM együttes rendelet

Ugyanakkor a réz és főleg a kadmium esetén, a tengeri baktériummal meghatározott hatásos koncentráció értékek is jelentősen nagyobbak voltak, mint a magyarországi felszíni vízre vonatkozó határértékek.

4.1.2. Sinapis alba gyökér- és szárnövekedés gátlás teszt eredménye A teszt során 2×25 db mustár növény gyökér- és szárhosszát vizsgáltam meg különböző koncentrációjú fémoldatokkal átitatott szűrőpapíron, 72 óra inkubálás után, a magyar szabványnak megfelelően. A következő ábrákon láthatók a gyökér- illetve szárhosszak a különböző toxikus fémek koncentrációinak függvényében. Kadmium hatása a gyökér- és szárhosszra Gyökér- és szárhossz (mm)

35 30 25 20 15

gyökér

10

szár

5 0 0

20

40

60

80

100

120

Koncentráció (ppm)

7. ábra: Kadmium hatása a gyökér- és szárhosszra

A kadmiumra nem mutatott jelentős – környezetben előforduló koncentrációkkal egyező nagyságrendű - érzékenységet a mustár (7. ábra). 50 ppm-nyi kadmium hatására gyökér esetén 54%-os gátlás volt tapasztalható, szárra 29%. A felszín alatti vizekre vonatkozó határérték 0,001 ppm.

25

Arzén hatása a gyökér- és szárhosszra Gyökér- és szárhossz (mm)

30 25 20 15

gyökér

10

szár

5 0 0

20

40

60

80

100

120

Koncentráció (ppm)

8. ábra: Arzén hatása a gyökér- és szárhosszra

Az arzén hatásának vizsgálatánál azt tapasztaltuk, hogy míg 0,1 ppm-nél serkentette a növekedést, 0,5 ppm-nél már 40%-os volt a gátlás a gyökérre, 26% a szárra, viszont 10 ppm arzénkoncentrációnál ~95%-os gátlást tapasztaltam a gyökér- és szárnövekedésben (8. ábra).

Réz hatása a gyökér- és szárhosszra

Gyökér- és szárhossz (mm)

30 25 20 15

gyökér szár

10 5 0 0

20

40 60 Koncentráció (ppm)

80

100

9. ábra: Réz hatása a gyökér- és szárhosszra

A réz 1 ppm koncentrációban serkentette a gyökér és szár növekedését is, de a tesztelt nagyobb koncentrációk esetén már a koncentráció növekedésével nőtt a gátló hatás mértéke. Réz esetén a határérték felszín alatti vizekre 0,2 ppm; és ennek megfelelően 20 ppm rézkoncentrációnál majdnem teljes gátlás (>90%) alakult ki (9. ábra), viszont ez a határérték 26

100-szorosa, amely csak extrém esetekben fordulhat elő. A réz esetén a növények gyökérnövekedése érzékenyebb volt, mint a száré.

Ólom hatása a gyökér- és szárhosszra

Hosszúság (mm)

20 15 10

gyökér szár

5 0 0

50

100

150

200

250

300

Koncentráció (ppm)

10. ábra: Ólom hatása a gyökér- és szárhosszra

Még 250 ppm ólomkoncentrációnál is képes volt 14 mm-es szárat növeszteni a tesztnövény, azonban a gyökérnövekedést tekintve érzékenyebb volt az ólomra: 250 ppm ólom koncentrációnál 74% gátlást mértem a gyökérnövekedésben (10. ábra).

Cink hatása a gyökér- és szárhosszra 30

Hosszúság (mm)

25 20 15

gyökér

10

szár

5 0 0

100

200

300

400

Koncentráció (ppm)

11. ábra: Cink hatása a gyökér- és szárhosszra

27

500

Cinkre a Sinapis alba tesztnövény igen érzékeny, 1 ppm cink esetében a gyökérnél 20% a szárnál 37% gátlás figyelhető meg (11. ábra). A gyökér érzékenyebbnek bizonyult a cink toxikus hatására. A desztillált vizes kontrollhoz képest számított gátlási százalékokat felhasználva a koncentráció-válasz görbéről leolvastam az EC20 és EC50 értékeket, melyek a 4. táblázatban láthatóak. 4. táblázat: Sinapis alba gyökér- és szárnövekedés gátlási teszt alapján meghatározott EC értékek

Gyökér

Szár

Határérték felszín alatti vízre* [ppm]

EC20 [ppm] 2,3

EC50 EC20 EC50 [ppm] [ppm] [ppm] 0,2 Réz 3,7 2,6 5,0 0,01 Arzén 3,5 1,8 5,0 0,005 Kadmium 34,6 61,3 75,4 81,5 0,01 Ólom 124,3 226,0 0,2 Cink 37,6 80,1 0,8 204,6 *6/2009 (IV. 14.) KvVM-EüM-FVM együttes rendelet

Az általam meghatározott EC értékek mindegyik fém esetén jóval a felszín alatti vizekre érvényes határérték felett vannak. Réz estén a gyökér és a szár körülbelül egyforma érzékenységet mutatott, akárcsak az arzén esetében. Ezzel szemben a kadmiumnál a gyökér volt az érzékenyebb, az EC értékek a szárra vonatkozóénak kb. a fele. Ugyanez mondható el az ólom esetében is.

4.1.3. Tetrahymena pyriformis szaporodásgátlási teszt eredményei Átfogó kísérletsorozatommal az volt a célom, hogy megvizsgáljam azt, hogy a nano titán-dioxid befolyásolja-e a toxikus fémek hatását T. pyriformisra, és ha igen, milyen irányban és mértékben, fellép-e esetleg szinergista hatás, mely a környezeti kockázat szempontjából fontos lehet. Ehhez szükségem volt arra, hogy meghatározzam azokat a fémkoncentráció-tartományokat, ahol jól megfigyelhető a gátló hatás változása. A teszteléshez ideális koncentrációtartományok előzetes becslésénél irodalmi adatokra támaszkodtam. A kapott eredményekből ezután meghatároztam OriginPro 8 szoftver segítségével az ED20 és ED50 értékeket, melyeket összehasonlítottam az irodalmi adatokkal. A szaporodás-gátlási teszt során 24, 48 és 72 óránál meghatározott sejtszámokból fémoldatot nem tartalmazó kontrollhoz képest gátlási százalékokat számoltam, melyek a következő ábrákon láthatóak. 28

Koncentráció - válasz diagram arzénre T. pyriformis szaporodás gátlási tesztben 100

Gátlás [ %]

80 60 24 h 40

48 h

20

72 h

0 0,05 ppm

0,5 ppm

-20

5 ppm

50 ppm

500 ppm

Koncentráció

12. ábra: T. pyriformis szaporodásgátlása arzén hatására

Az 12. ábrán látható az arzén gátlási százalékának változása a koncentráció függvényében. 24 óránál még nem tapasztalható a koncentrációval arányos gátló hatás, de 48 és 72 óránál az arzén koncentrációjával arányosan nő a toxikus hatás. 5 ppm-től megfigyelhető a hatásos koncentráció növekedése az időben előrehaladva. Koncentráció - válasz diagram cinkre T. pyriformis szaporodás gátlási tesztben 100 80 60 Gátlás [ %]

40 20

24 h

0

48 h

-20

0,5 ppm Zn

5 ppm Zn

25 ppm Zn 50 ppm Zn 250 ppm Zn

72 h

-40 -60 -80

Koncentráció

13. ábra: T. pyriformis szaporodás gátlása cink hatására

Az 13. ábrán a gátlási százalék változása látható cink esetében a koncentráció függvényében. Jól látható, hogy kis (0,5–25 ppm) cink koncentráció alkalmazása serkentő hatású a T. pyriformis szaporodására, azonban a koncentrációt növelve a gátlás nő, 250 ppm29

nél már majdnem teljes gátlás alakul ki. Látható, hogy az idő előrehaladtával a gátló hatás nő, illetve a serkentő hatás csökken. 250 ppm-nél látható, hogy a hatásos koncentráció 48 óra elteltével növekedést mutat, viszont utána kismértékben csökken.

Koncentráció - válasz diagram rézre T. pyriformis szaporodás gátlási tesztben 100

Gátlás [ %]

80 60 24 h 40

48 h 72 h

20 0 0,5 ppm Cu 5 ppm Cu 20 ppm Cu 35 ppm Cu 50 ppm Cu Koncentráció

14. ábra: T. pyriformis szaporodásgátlása réz hatására

A fenti, 14. ábrán a réz hatását figyelhetjük meg a Tetrahymena pyriformis szaporodására. Jól látszik, hogy az idő előrehaladtával a gátlás növekszik, és már igen kis mennyiség (0,5 ppm) esetén is 20% fölött van a gátlás értéke már 24 óra elteltével, ami 72 órára majdnem a duplájára nő. Ugyanakkor két nagyságrenddel nagyobb, 50 ppm-es rézkoncentrációnál 50–90%-os gátlást tapasztaltam, tehát T. pyriformisra nézve a réz koncentráció-válasz diagramjának lineáris szakasza több mint két nagyságrendet ölel át.

30

Koncentráció - válasz diagram kadmiumra T. pyriformis szaporodás gátlási tesztben 100

Gátlás [ %]

80 60 24 h 40

48 h

20

72 h

0 0,5 ppm Cd 1,325 ppm Cd 2,75 ppm Cd 3,875 ppm Cd

-20

5 ppm Cd

Koncentráció

15. ábra: kadmium T. pyriformis szaporodás gátlása kadmium hatására

A kadmium gátló hatását szemlélteti a 15. ábra. . Már 0,5 ppm kadmium koncentrációnál is 40%-os a gátló hatás, ami 5 ppm-nél eléri a 100% közeli értéket. A kitettségi idő hatásának tekintetében látható, hogy mindegyik koncentráció tartományban létrejön egy adaptálódás a tesztorganizmus részéről, a 72 óra alatt a gátló hatás mindegyik összeállításban csökken, de az 5 ppm-es elegynél ez a hozzászokás a toxikus anyaghoz nem történik meg. A hatásos koncentráció pedig az időben előrehaladva csökken. Koncentráció - válasz diagram ólomra T. pyriformis szaporodás gátlási tesztben 100 80 60

Gátlás [ %]

40 20

24 h

0 -20

0,5 ppm Pb

5 ppm Pb

25 ppm Pb 50 ppm Pb 250 ppm Pb

72 h

-40 -60 -80 -100

48 h

Koncentráció

16. ábra: T. pyriformis szaporodásgátlása ólom hatására

31

Az ólomnál a tesztelt 0,5 és 5 ppm koncentráció között csaknem egy 100%-os „gátlásnövekedés” zajlik le (16. ábra), majd a hatás koncentráció növekedésével szinte teljesen változatlan marad. A kitettségi idő növekedésével kismértékű növekedést tapasztaltunk a gátló hatásban. A mért sejtszám értékekből ezután gátlási százalékokat határoztam meg fémet nem tartalmazó kontrollhoz hasonlítva, majd grafikus módszerrel meghatároztam az EC20 és EC50 értékeket. A táblázatokból hiányzó adatok abból erednek, hogy az általam kirajzolt koncentráció-hatás görbe nem minden esetben érte el a 20%-os gátlást, ezeket az eseteket kihúzással jelöltem. 5. táblázat: T. pyriformis 72 órás szaporodásgátlási tesztből meghatározott EC értékek

Arzén

Cink

Réz

Kadmium

Ólom

Saját mérés

Saját mérés

EC20

EC50

Sauvant et al. (1997) EC50

[ppm]

[ppm]

[ppm]

24h

4,1

5,9

48h

-

10,3

72h

13,0

20,2

24h

49,6

53,6

48h

46,4

49,2

72h

47,7

51,5

24h

13,2

31,6

48h

-

33,0

72h

-

17,9

24h

0,3

1,7

48h

0,3

1,7

72h

2,4

4,3

24h

-

3,2

48h

-

-

72h

-

3,3

Határérték felszín alatti vizekre* [ppm]

4

0,01

43

0,2

30

0,2

24,3

0,005

180

0,2

*6/2009 (IV. 14.) KvVM-EüM-FVM együttes rendelet

32

Az 5. táblázatból az látható, hogy az általam kimért EC50 értékek csak a réz és a cink esetében egyeznek meg közelítőleg az irodalomban megtalálható értékekkel, az arzénnál a 24 órás eredmény áll a legközelebb ehhez az értékhez. A kadmium és az ólom esetében az általam alkalmazott szaporodásgátlási teszt jóval érzékenyebb Sauvant et al. (1997) módszerénél. Az összes kimért érték körülbelül két nagyságrenddel a felszín alatti vizekre vonatkozó határérték felett van.

4.1.4. Eredmények összefoglalása A kísérleti munka első fázisában meghatározott EC20 és EC50 értékek jól szemléltetik az adott tesztorganizmusok érzékenységét az egyes fémekre. A rézre a legnagyobb EC értéket a T. pyriformisnál mértem, ez a legkevésbé érzékeny erre a fémre. Ezután következik az A. fischeri majd a S. alba. A legnagyobb EC értékeket kadmiumra mértem a tengeri baktériummal, ez a tesztorganizmus az ólomra és az arzénre nem volt érzékeny. A kadmiumra ennél kisebb volt az EC érték mustárnál és ennél egy nagyságrenddel kisebb az állati egysejtűnél, így ez a legérzékenyebb erre a félfémre. Cinkre a Tetrahymena pyriformis érzékenyebb, mint a mustár. Az ólomnál a protozoánál két nagyságrenddel kisebb EC-ket mértem, így ez az érzékenyebb organizmus erre a fémre, mint a mustár. Arzénre a két tesztorganizmus körülbelül azonos érzékenységet mutat.

33

5.

Fémek és nano titán-dioxid együttes hatása Tetrahymena pyriformis tesztorganizmusra A TDK dolgozatom központi célkitűzése az volt, hogy megvizsgáljam, hogy a nano

titán-dioxidnak van-e gerjesztő (szinergista) kihatása a fémek toxikus hatására. A kísérletsorozatot 72 órás rázatott lombikos teszttel kiviteleztem, melyben különböző összetételű fém-nano TiO2 keverékek sejtszám változását vizsgáltam és értékeltem.

5.1. A titán-dioxid nanoszuszpenzió koncentrációjának kísérleti meghatározása

típusának

és

A toxikus fémek és a nano titán-dioxid együttes vizsgálatához szükségem volt a méréshez ideális nano titán-dioxid típus és koncentrációtartomány kiválasztására. Három különböző típusú és tulajdonságú nano titán-dioxid állt rendelkezésemre, melyekkel az előzetes kísérletek alapján felvett koncentráció-sejtszám diagramokat lehet látni a következő három ábrán. (Megjegyzés: az előzetes összehasonlító kísérleteket még desztillált vízben végeztem, később csapvizes összeállításra tértem át.) CYL 3072/2 Degussa VP TiO2 P90 jelű nanoszuszpenzió koncentráció-sejtszám diagramja Sejtszám (*1000 db/ml)

1400 1200 1000 800

24 h

600

48 h

400

71 h

200 0 0

0,1

1

10

100

500

1000

Koncentráció (ppm)

17. ábra: CYL 3072/2 Degussa VP TiO2 P90 jelű nano titán-dioxid szuszpenzió koncentráció-sejtszám diagramja Tetrahymena pyriformis tesztorganizmussal

A CYL 3072/2 Degussa VP TiO2 P90 nano titán-dioxid szuszpenzió kristályformája 90% anatáz, 10% rutil, míg az elsődleges kristályméret 13 nm. A fajlagos felület 90 ± 20 m2/g. A diszperzióban található halmazok 50%-ának összesített térfogata (tömege) az adott méret alatt, 50%-a e feletti tartományban található, ami 73 nm. A diszperzióban található

34

halmazok 50%-a (szám szerint) az adott méret alatt, 50%-a e feletti tartományban található, ami 58 nm. A szuszpenzió alapkoncentrációja 5,00 m/m % (Maros, 2011). Jól látható a 17. ábrán, hogy a CYL 3072/2 termék jelentős mértékben gátolja az állati egysejtű szaporodását, de a hatás nem koncentrációfüggő. CYL 3006/1 jelű szuszpenzió koncentráció-sejtszám diagramja Sejtszám (*1000 db/ml)

1400 1200 1000 800

24 h

600

48 h

400

71 h

200 0 0

0,1

1

10

100

500

1000

Koncentráció (ppm)

18. ábra: CYL 3006/1 jelű szuszpenzió szuszpenzió koncentráció-sejtszám diagramja Tetrahymena pyriformis

A CYL 3006/1 jelű nano titán-dioxid szuszpenzió egy, a P90-es nano titán-dixidból készült származék. A termék csak 500 ppm nano-TiO2 koncentráció felett gátolja az egysejtű szaporodását a 48 órás mérési időpontban.

35

CYL 3039/2 jelű szuszpenzió koncentráció-sejtszám diagramja Sejtszám (*1000 db/ml)

1400 1200 1000 800

24 h

600

48 h

400

71 h

200 0 0

0,1

1

10

100

500

1000

Koncentráció (ppm)

19. ábra: CYL 3039/2jelű szuszpenzió szuszpenzió koncentráció-sejtszám diagramja Tetrahymena pyriformis tesztorganizmussal

A CYL 3039/2 elnevezésű nano titán-dioxid szuszpenzió szintén a P90-es nano titándioxid származéka, leírása az anyagok és módszerek részben található. Az 17. 18. és 19. ábrákról látható, hogy a különböző titán-dioxid nanoszuszpenziók mindegyike gátolja a T. pyriformis szaporodását kisebb-nagyobb mértékben. Ezért úgy döntöttem, hogy az BME ABÉT tanszékének Környezeti Mikrobiológia és Biotechnológia Csoportjában Maros (2007) által is mérésekre felhasznált szuszpenzióval fogok dolgozni (CYL 3039/2). A nano titán-dioxidból a keverékekben 0,1, 1 és 10 ppm koncentrációt alkalmaztam. A kiválasztott koncentrációtartományra a teszt során kapott sejtszámokat és a belőlük számolt szaporodásgátlás értékeket az alábbi diagram mutatja. Azért döntöttem úgy, hogy ezt a koncentrációsort alkalmazom, mert három nagyságrendnyi koncentráció-tartományt ölel át, és tartalmaz olyan komponenst, melynek nem elhanyagolható (7-től 58%-ig) a gátlása a többihez képest (10 ppm). Emellett 100 ppm-nél mikroszkópos vizsgálattal alátámaszthatóan tele volt a sejt nano-titán aggregátumokkal (22. ábra) és attól tartottam, hogy ez esetleg zavarná a méréseimet. Az 500 és 1000 ppm pedig már 80–60%-os gátlást ad, ami önmagában is túlzottan számottevő, viszont 1 és 0,1 ppm nano titán-dioxid koncentráció olyan, ami nem gátolt, viszont reméltem, hogy a fém gátlása, és az esetleges együttes gátlás jól fog látszódni mellette.

36

Nano TiO2 (CYL 3039/2) hatása a Tetrahymena pyriformis szaporodására

Sejtszám (*1000 db/ml)

700 600 500 400

24 h

300

48 h

200

72h

100 0 kontroll

0,1 ppm

1 ppm

10 ppm

Koncentráció

20. ábra: Nano TiO2 (CYL 3039/2) hatása a Tetrahymena pyriformis szaporodására

Nano TiO2 (CYL 3039/2) által kifetett gátló hatás Tetrahymena pyriformisra 100 80 58

Gátlás (%)

60 40 20

15

9

13

24 h

18 7

0 -20 -40 -60

0,1 ppm

1 ppm

10 ppm

-14 -29 -42 Koncentráció

21. ábra: Nano TiO2 (CYL 3039/2) által kifejtett gátló hatás Tetrahymena pyriformisra

37

48 h 72h

22. ábra: Nanoszemcsék és aggregátumok a T. pyriformisban

5.2. Fémek és nano titán-dioxid együttes hatásának vizsgálata Tetrahymena pyriformis tesztorganizmusra A mérések során kapott eredményeket Excel és STATISTICA 12 szoftver segítségével elemeztem ki abból a célból, hogy kimutassam, van-e szignifikáns különbség a tiszta fémeket/nano titán-dioxidot tartalmazó tesztelegyek és a keverékek között, tehát hogy a nano TiO2 hozzáadása gerjesztette-e a fémek toxikus hatását. A továbbiakban fémenkénti összeállítások alapján mutatom be az eredményeket. Minden keverék elkészítésekor három különböző koncentrációjú fémoldatot kevertem szintén három különböző koncentrációjú nano titán-dioxid oldattal. Ezeket előzetes mérések alapján igyekeztem úgy megválasztani, hogy olyan tartományba essenek, hogy az általuk, önállóan kifejtett gátló hatás ne legyen túl nagy, és legyen közöttük olyan is, amelyiknek szinte elhanyagolható a gátló hatása a csapvizes kontrollhoz képest. Nano titán-dioxidra ez minden esetben a 0,1 1 és 10 ppm volt, a könnyebb összehasonlíthatóság érdekében. A fémoldatokból és a nano titán-dioxid oldatból is készítettem csak önmagát tartalmazó tesztösszeállítást is a keverékeken kívül.

38

5.2.1. Kadmium és nano titán-dioxid együttes hatása Az általam választott koncentrációk kadmiumra 1, 2 és 3 ppm voltak. A következő ábrán (23. ábra) a különböző összetételű tesztrendszerek sejtszámait ábrázoltam napi bontásban a koncentrációk függvényében. Varianciaanalízis alkalmazásával Statistica szoftverrel kiszámítottam melyek azok a keverékek, melyeknél a mért sejtszám értékek szignifikánsan eltérnek az egyedi fémes és a nano-titános alapelegytől Ezeket a diagram megfelelő oszlopán csillagozással jelöltem: *=a jelölt keverék sejtszáma szignifikánsan eltér az adott koncentrációban csak fémet tartalmazó tesztelegytől **= a jelölt keverék sejtszáma szignifikánsan eltér az adott koncentrációban csak nano titán-dioxidot tartalmazó tesztelegytől

39

Sejtszám-változás 72 óra alatt kadmium és nano titán-dioxid hatására 800

Sejtszám (*1000 db / ml)

700 600

*

500

* **

* 400

24 h

300 * **

** 200 * * ** **

100

* ** * * ** **

48 h 72 h

* ** * **

* * ** **

* * ** **

0 Kontroll 1 ppm 2 ppm 3 ppm Cd Cd Cd

0,1 ppm TiO2

1 ppm 10 ppm 1 ppm TiO2 TiO2 Cd+0,1 ppm TiO2

1 ppm 1 ppm 2 ppm Cd+1 Cd+10 Cd+0,1 ppm ppm ppm TiO2 TiO2 TiO2

2 ppm 2 ppm 3 ppm Cd+1 Cd+10 Cd+0,1 ppm ppm ppm TiO2 TiO2 TiO2

Tesztelt modelloldatok

23. ábra: Sejtszám-változás 72 óra alatt kadmium és nano titán-dioxid hatására

40

3 ppm 3 ppm Cd+1 Cd+10 ppm ppm TiO2 TiO2

A 24 órás vizsgálat esetében nem találtam olyan kadmium és nano titán-dioxid is tartalmazó keveréket (23. ábra), amely, amely szignifikánsan különbözne a csak kadmiumot, illetve csak nano titán-dioxidot tartalmazó tesztelegytől, azonban a kontrolltól az 1 ppm-es kadmium kivételével mindegyik tesztelegy eltér. 48 óránál már tapasztalhatóak szignifikáns különbségek: a kontrolltól a csak egyféle adalékot tartalmazó tesztelegyek közül az 1 és 3 ppm-es kadmium és a 10 ppm-es nano titán-dioxid tér el szignifikánsan. Az 1 ppm-es kadmium tesztelegytől, csak az 1 ppm TiO2-t tartalmazó elegy nem különbözik. A 2 és 3 ppm-es, csak kadmiumot tartalmazó tesztközegtől az összes, belőle készített keverék eltér. A 0,1 ppm nano TiO2-t tartalmazó tesztelegytől csak az a keverék nem tér el, amiben 1 ppm kadmium van, viszont az 1 és 10 ppm-es nano TiO2-os kontrollelegytől mindegyik kadmiumos keverék eltér. A 72 órás mintavételnél a kontrolltól szignifikánsan eltér a tiszta komponenseket tartalmazó kultúrák közül a 10 ppm TiO2 és az 1 és 3 ppm-es kadmium. Keverékek esetén az 1 ppm-es kadmium tesztelegytől csak az 10 ppm nano-titános keverék tér el, a 2 és 3 ppm-es kadmium alap tesztelegytől a 48 órás eredményekhez hasonlóan mindegyik eltér. Nano titándioxidra nézve a 0,1 ppm-es elegytől csak a legnagyobb koncentrációjú kadmiumos keverék mutat szignifikáns különbséget, az 1 ppm-estől pedig csak az 1 ppm-es kadmiumos keverék nem tér el. A 10 ppm-es oldattól az összes fémes keverék eltér.

41

Gátlási százalék a koncentráció függvényében kadmium - nano TiO2 elegyek esetében 99100100

100

100100100

99 99

100100100

94 90

90

83 80

80 70

70

69 61

59

60 Gátlás [ %]

50

50

45

38 29

30

10

50

43

40

20

52

30

30 25

24 h

32

48 h

23 18

16

18

16

19

11

10 6

3

4

0 -10 -20

1-5ppm 2 ppm 3 ppm 0,1 ppm 1 ppm 10 ppm 1 ppm 1 ppm 1 ppm 2 ppm 2 ppm 2 ppm 3 ppm 3 ppm 3 ppm -6 -9 Cd Cd Cd TiO2 TiO2 TiO2 Cd+0,1 Cd+1 Cd+10 Cd+0,1 Cd+1 Cd+10 Cd+0,1 Cd+1 Cd+10 -12 ppm ppm ppm ppm ppm ppm ppm ppm ppm TiO2 TiO2 TiO2 TiO2 TiO2 TiO2 TiO2 TiO2 TiO2 Tesztelt modelloldatok

24. ábra: Gátlási százalék a koncentráció függvényében kadmium - nano TiO2 elegyek esetében

42

72 h

Az így kapott eredményeket összehasonlítva a keverékekhez készített koncentráció – gátlás grafikonjával (24. ábra) jól látható, hogy a nano titán-dioxidot tartalmazó elegyek a legtöbb esetben jóval nagyobb szaporodásgátlást eredményeztek, mint a csak fémet tartalmazó tesztközeg: pl.: 2 ppm-es kadmiumnál 1 ppm hozzáadott nano titán-dioxid hatására a gátlás háromszorosára nőtt. Ezek alapján elmondható, hogy a kadmium toxikus hatását a hozzáadott nano TiO2 fokozza, főként nagyobb (1 és 10 ppm) titán-dioxid koncentrációk esetén. A toxikus hatás növekedése leginkább 48 óra után mutatható ki igazán statisztikai módszerekkel, de a koncentráció-gátlás diagramról már 24 óra elteltével is jól látható ez a szinergista hatás. Az ábráról jól látható, hogy a toxikus hatás a csak kadmiumot tartalmazó tesztrendszer közül egyik esetében sem túl nagy, csak a 3 ppm-es kadmium elegy esetében megy 50% fölé. Megdöbbentő, hogy a hozzáadott nano titán-dioxid milyen drasztikus változásokat vált ki a kadmiummal együtt, nagyobb titán és kadmium koncentráció esetén a gátlás elérheti a 100%-ot is. A szinergizmus oka feltehetően, hogy a titán-dioxid nanorészecskék felületükön megkötik a kadmiumot, felvehetőségét, hozzáférhetőségét növelik ezáltal.

5.2.2. Arzén és nano titán-dioxid együttes hatása Az alkalmazott arzén koncentrációk: 0,5, 5 és 25 ppm. A kadmiumhoz hasonlóan az arzén esetére mért T. pyriformis sejtszámok sem mutatottak szignifikáns különbségeket a 24 órás mintavételnél a keverékek, és csak arzént, illetve csak nano titán-dioxidot tartalmazó összeállítások között (25. ábra). Ekkor a kontrolltól az 5 és 25 ppm-es arzén-, és a 10 ppm-es nano titán-dioxid tartalmú minták szignifikánsan eltérnek, míg 48 óránál az összes egyfajta fémet tartalmazó összeállítás eltér. A 0,5 ppm arzént tartalmazó tesztelegytől csak az a keverék tér el, amelyikben 10 ppm a TiO2 mennyisége. Az 5 ppm-es tesztelegytől mindegyik, a 25 ppm-estől viszont egyik keverék sem tér el szignifikánsan. Ezzel együtt elmondható, hogy az összes, nano TiO2-t tartalmazó tesztelegytől szignifikáns különbségeket mértem a keverékekben. A 72 órás eredményekből azt a következtetés vonható le, hogy a 0,5 ppm arzént tartalmazó mintától már nem különbözik szignifikánsan a legnagyobb nano-titán koncentrációjú elegy, viszont az 5 ppm-estől mindegyik, a 25 ppm-estől viszont egyik sem, 43

ugyanúgy, mint a 48 órás mérésnél. A nano-titános tesztelegytől esetében csak a 0,1 ppm-es keverékekben van eltérés a 48 órás eredményektől: az a keverék, mely 0,5 ppm arzént és 0,1 ppm nano-titánt tartalmazott már nem mutatott szignifikáns eltérést a titán tesztelegytől az összes többi koncentráció viszont igen. Az 5 ppm-es arzénből képzett keverékek mindegyikénél megvalósul az, hogy mindkét alkotótól szignifikánsan különbözik a keverék. Ez alatt, a 0,5 ppm-es töménységű keverékekben még nem alakul ki annyira toxikus hatásgerjesztés, hogy az elérje a szignifikáns mértéket, a 25 ppm-es arzén pedig már túl sokat gátol önmagában is, a nano titán-dioxid hozzáadása már nem tud szignifikáns változásokat létrehozni a gátlásban. A kontrolltól szignifikáns eltérést az önmagukban bekevert fémek közül csak a 25 ppm-es arzén tér el. Kevés kutatás irányult eddig a nanoanyagok és fémek kölcsönhatásának vizsgálatára, de arzén esetében hasonló toxicitás-növekedést figyeltek meg nano vas hozzáadására (Zou et al., 2003). Ha megnézzük a keverékekhez tartozó koncentráció-gátlás diagramot (26. ábra), a leginkább szembetűnő az, hogy a közepes, 5 ppm-es arzén toxikus hatását fokozza a legjobban hozzákevert nano TiO2, elsősorban hosszú távon (48 és 72 órás mérés). Azt, hogy nem látható különbség a 25 ppm-es arzén tesztelegy és a belőle készült keverékek között, elképzelhető hogy a 70–80%-os szaporodás gátlást nem tudja már a nano-titán látványosan megnövelni, ebben a koncentrációban az arzén önmagában is nagyon toxikus a T. pyriformis számára. Ebből kifolyólag a jövőben érdemes lenne megvizsgálni az 5 és 25 ppm közötti koncentrációtartományt is egy hasonló összeállításban.

44

Sejtszám-változás 72 óra alatt arzén és nano titán-dioxid hatására 900 800

Sejtszám (*1000 db / 1 ml)

700 **

600 500

**

* **

* ** * **

400 300

**

**

200

* **

* **

* **

* **

100

24 h ** ** **

48 h **

**

**

0 Kontroll 0,5 ppm 5 ppm 25 ppm 0,1 ppm 1 ppm 10 ppm 0,5 ppm 0,5 ppm 0,5 ppm 5 ppm 5 ppm As As As TiO2 TiO2 TiO2 As+0,1 As+1 As+10 As+0,1 As+1 ppm ppm ppm ppm ppm TiO2 TiO2 TiO2 TiO2 TiO2

5 ppm 25 ppm 25 ppm 25 ppm As+10 As+0,1 As+1 As+10 ppm ppm ppm ppm TiO2 TiO2 TiO2 TiO2

Tesztelt modelloldatok

25. ábra: Sejtszám-változás 72 óra alatt arzén és nano titán-dioxid hatására

*=a jelölt keverék sejtszáma szignifikánsan eltér az adott koncentrációban csak fémet tartalmazó tesztelegytől **= a jelölt keverék sejtszáma szignifikánsan eltér az adott koncentrációban csak nano titán-dioxidot tartalmazó tesztelegytől 45

72 h

Gátlási százalék a koncentráció függvényében arzén- nano TiO2 elegyek esetében 100 90

87

83 77 71

80

77

77 68

Gátlás [ %]

70 60 50

43

40

33

36 30

34

30 8 2

7

36

38

21

18

20 10

53

16

12 3

6

38

10

10

78 73

48

14

0 0,5 ppm 5 ppm 25 ppm 0,1 ppm 1 ppm 10 ppm 0,5 ppm 0,5 ppm 0,5 ppm 5 ppm As As As TiO2 TiO2 TiO2 As+0,1 As+1 As+10 As+0,1 ppm ppm ppm ppm TiO2 TiO2 TiO2 TiO2

5 ppm As+1 ppm TiO2

5 ppm 25 ppm 25 ppm 25 ppm As+10 As+0,1 As+1 As+10 ppm ppm ppm ppm TiO2 TiO2 TiO2 TiO2

Tesztelt modelloldatok

26. ábra: Gátlási százalék a koncentráció függvényében arzén- nano TiO2 elegyek esetében

46

24 h 48 h 72 h

37

35 33

19

16

89

59

58

57 51

84 76 73

5.2.3. Réz és nano titán-dioxid keverékek Az alkalmazott réz koncentrációk: 0,1, 1 és 25 ppm. Réz esetében a vizsgált koncentráció tartományban nem voltak olyan élesen elkülöníthető különbségek a különböző koncentrációjú, csak rezet, illetve nano titán-dioxidot tartalmazó elegyek és a keverékek között, mint a kadmium és az arzén esetében. A 24 órás mintavételnél egyik keverékeket tartalmazó tesztrendszer sem mutat szignifikáns eltéréseket a csak rezet, illetve nano titán-dioxidot tartalmazó elegyektől, de a kontrolltól sem különbözik egyik összeállítás sem (27. ábra). 48 óra elteltével azt tapasztaltam, hogy a 0,1 ppm-es réz tesztelegytől csak a legnagyobb TiO2 koncentrációjú keverék tér el, az 1 ppm-es réztől a 0,1 ppm és 10 ppm TiO2-t tartalmazó keverék, a 25 ppm rezet tartalmazó tesztelegytől viszont egyik, hozzá tartozó keverék sem tér el szignifikánsan. A 0,1 ppm nano titán-dioxidos tesztelegytől csak az 1 ppm rézzel alkotott keveréke tér el, az 1 és 10 ppm-es tesztelegytől viszont egyik sem. Összességében tehát csak a 1 ppm rezet és a 0,1 ppm nano titán-dioxidot tartalmazó keveréknél mért sejtszámok térnek el a csak rezet és titánt tartalmazó mintáktól, de itt a mért értékek a rézhez képest nagyobbak, a nano titánhoz képest kisebbek. Ekkor a kontrolltól az önállóan bekevert fémek közül csak a 25 ppm-es rezes és 10 ppm-es nano titán-dioxidos elegyek szignifikánsan különböznek. 72 óra elteltével már csak a 25 ppm-es rézoldat mutat szignifikáns különbséget a kontrolltól az önállóan bekevert fémek közül. A 0,1 ppm réztartalmú tesztelegytől csak az a keverék nem tér el, amiben 10 ppm a nano titán, míg az 1 ppm-es rezes tesztelegytől egyik keverék se mutat szignifikáns különbséget, a 25 ppm-estől is csak a 0,1 ppm nano titánt tartalmazó keverék. Az összes nano titán-dioxid tesztelegytől kizárólag azok a keverékek térnek el, amelyek 25 ppm rezet tartalmaznak. A 25 ppm-es keverékek esetében tapasztalható toxicitás valószínűleg a réz hatása, kivéve abban az elegyben, amelyik 0,1 ppm nano TiO2-t tartalmaz, mivel ott a szaporodás serkentése figyelhető meg.

47

Sejtszám-változás 72 óra alatt réz és nano titán-dioxid hatására 1100 *

1000

*

Sejtszám (*1000 db / 1 ml)

900 800 700

* **

600

**

500

** 24 h

400 300

*

* **

48 h *

72 h

200 100 0 kontroll 0,1 ppm 1 ppm 25 ppm 0,1 ppm 1 ppm 10 ppm 0,1 ppm 0,1 ppm 0,1 ppm Cu Cu Cu TiO2 TiO2 TiO2 Cu+0,1 Cu+1 Cu+10 ppm ppm ppm TiO2 TiO2 TiO2

1 ppm 1 ppm Cu+0,1 Cu+1 ppm ppm TiO2 TiO2

1 ppm 25 ppm 25 ppm 25 ppm Cu+10 Cu+0,1 Cu+1 Cu+10 ppm ppm ppm ppm TiO2 TiO2 TiO2 TiO2

Tesztelt modelloldatok

27. ábra: Sejtszám-változás 72 óra alatt réz és nano titán-dioxid hatására

*=a jelölt keverék sejtszáma szignifikánsan eltér az adott koncentrációban csak fémet tartalmazó tesztelegytől **= a jelölt keverék sejtszáma szignifikánsan eltér az adott koncentrációban csak nano titán-dioxidot tartalmazó tesztelegytől 48

Gátlási százalék a koncentráció függvényében réz - nano TiO2 elegyek esetében 100 90 80 70

63 55

60 48

Gátlás [% ]

50 40 30 20 10

24 12 14 4

16 30

14

31

2728 20

17

15

7

43 36

40 33

43 30 24

22

20

42

34 26

45 38

13

11

3

0 -10 -20 -30 -40 -50

0 0 10 ppm 0,1 ppm 0,1 ppm 0,1 ppm 1 ppm 0 1 ppm 0,1 ppm 1 ppm 25 ppm 0,1 ppm -4 Cu Cu Cu TiO2 TiO2 TiO2 Cu+0,1 Cu+1 Cu+10 Cu+0,1 -11 -12 ppm ppm ppm ppm TiO2 TiO2 TiO2 TiO2

10 ppm Cu+1 ppm TiO2

1 ppm 25 ppm 25 ppm 25 ppm Cu+10 Cu+0,1 Cu+1 Cu+10 ppm ppm ppm ppm TiO2 TiO2 TiO2 TiO2

-35 Tesztelt modellldatok

28. ábra: Gátlási százalék a koncentráció függvényében réz - nano TiO2 elegyek esetében

49

48 h 72 h

4

3

24 h

A koncentráció-gátlás diagramon (28. ábra) jól látható, hogy amikor kisebb koncentrációban (0,1 és 1 ppm) alkalmaztam ezt a fémet, csak 5–15%-os szaporodás gátlást okozott, 0,1 ppm vagy 1 ppm nano-titánnal keverve a 0,1 ppm rezet hosszú távon serkentette a T. pyriformis szaporodását. Viszont 25 ppm-es rézkoncentrációnál megfigyelhető a növekedett gátlás (48 és 72 óránál 24%, illetve 48%), mely nano-titánnal keverve rövid távon (24 és 48 óra) tovább nőtt, de hosszú távon nem maradt meg. Feltehetőleg azért, mivel a 72 órás mérés során ennél a koncentrációnál a réz önmagában is jelentős toxikus hatást okozott, 14%-ról 48%-ra nőtt a szaporodás gátlás mértéke 24 óráról 72 órára. Mivel az 1 ppm és 25 ppm-es, csak réztartalmú tesztrendszerek között nagy ugrás tapasztalható a gátlásban, a tesztet érdemes lenne megismételni más koncentrációkkal is a két szélsőérték között és akár a 25 ppm-nél is nagyobb nano titán-dioxid koncentrációt alkalmazva. Elképzelhetőnek tartom, hogy nagyobb bekevert nano titán-dioxid esetében a gátlás is nőne, akár kisebb rézkoncentrációk esetén is.

5.2.4. Ólom és nano titán-dioxid együttes hatása Alkalmazott ólom koncentrációk: 0,75, 1, 1,25 ppm. A 24 órás méréskor semmilyen szignifikáns eltérés nem volt tapasztalható a tiszta fémeket vagy nano titán-dioxidot tartalmazó lombikok és keverékek között, ráadásul a kontrolltól sem mutattak szignifikáns eltérést (29. ábra). 48 óránál az önállóan bekevert fémek közül csak a 0,1 ppm-es nano titán-dioxid mutat szignifikáns különbséget a kontrolltól. A 0,75 ppm ólmot tartalmazó tesztelegytől az összes vele készített keverék eltér, az 1 ppm-estől viszont egyik sem, és az 1,25 ppm-estől is csak az, amelyik 10 ppm-nyi nano titán-dioxidot tartalmazott. A nano titán-dioxidos tesztelegy közül a 0,1 és 10 ppm-estől az összes keveréke szignifikáns különbséget mutatott, viszont az egyestől csak az 1 ppm ólmot tartalmazó keverék nem tért el. 72 órára a szignifikáns különbségek jó része eltűnt, a kontrolltól csak a 0,1 ppm-es és a 10 ppm-es TiO2 tartalmú összeállítás tér el. Az ólom tesztelegyek közül csak a 1,25 ppm-estől különbözik az 1 ppm titán-dioxiddal alkotott keveréke. Az 0,1 ppm-es titándioxid tesztelegytől pedig csak az 1 ppm ólommal képzett elegye mutat szignifikáns különbséget.

50

Sejtszám (*1000 db/ 1 mll)

Sejtszám-változás 72 óra alatt ólom és nano titán-dioxid hatására 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

* **

* ** * **

* **

**

**

**

* **

* **

24 h 48 h 72 h

Tesztelt modelloldatok

29. ábra: Sejtszám-változás 72 óra alatt ólom és nano titán-dioxid hatására

*=a jelölt keverék sejtszáma szignifikánsan eltér az adott koncentrációban csak fémet tartalmazó tesztelegytől **= a jelölt keverék sejtszáma szignifikánsan eltér az adott koncentrációban csak nano titán-dioxidot tartalmazó tesztelegytől 51

Gátlási százalék a koncentráció függvényében ólom - nano TiO2 elegy esetében 100 90 80 24 h

Gátlás [%]

70

61

60

60

50

50

58

54

44 35 28

40

30

41

34

32

5

10

9

44 34

33 26

21

20

48 h 50 45

26 19

13

1111 2

1

4

0 0,75 ppm -3 1 ppm-1Pb 1,25 ppm 0,1 ppm 1 ppm -3 -6TiO2 Pb Pb TiO2 -14 -20 -10

-30 -40 -50

-25 -30

10 ppm 0,75 ppm 0,75 ppm 0,75 ppm 1 Pb ppm 1 ppm TiO2 Pb + -10 0,1 Pb + 1 Pb + -5 10 + 0,1 Pb+1 ppm ppm ppm ppm ppm -16 -18 TiO2 TiO2 TiO2 TiO2 TiO2 -24

-37 Tesztelt modelloldatok 30. ábra: Gátlási százalék a koncentráció függvényében ólom - nano TiO2 elegy esetében

52

1 ppm 1,25 ppm 1,25 ppm 1,25 ppm Pb+10 Pb+0,1 Pb+1 -9 Pb+10 ppm ppm ppm -14 ppm -15 TiO2 TiO2 TiO2 TiO2 -23

72 h

Az ólommal végzett kísérletek során azt tapasztaltam, hogy van egy olyan koncentráció érték (0,75 ppm Pb mennyiségnél), ahol ólom serkentő hatással bír a Tetrahymena pyriformisra. Ez a jelenség látható a gátlási százalék-koncentráció diagramon (30. ábra) a 0,75 ppm-es csak ólmot tartalmazó elegynél. Az összes ólom koncentrációnál a tiszta fémet tartalmazó tesztelegyben tapasztalható kismértékű (5–10%) a gátló hatást a hozzá kevert nano-titán látványosan fokozza (24 órás eredmények), azonban ez a hatás az idő előrehaladtával gyengül, 72 óra elteltével serkentő hatásba csap át. Azonban az itt található keverékeknél is megfigyelhető, hogy a nano TiO2-vel készített keverékekben ez a serkentő hatás sokkal kisebb, mint a hozzájuk tartozó kontrollokban.

53

6.

Összefoglalás A

környezettoxikológia,

mint

tudományág

az

elmúlt

évtizedekben

a

környezetszennyezés nagyléptékű növekedésével előtérbe került. Újabb és újabb technológiai újítás jeleik meg az iparban, olyan új anyagokat fejlesztenek, melynek nem jósolható meg sem a rövid, sem a hosszútávú hatása. Az újonnan kifejlesztett anyagok közül napjainkban – a nanotechnológia óriási fejlődésének köszönhetően – az egyre nagyobb mértékben alkalmazott, és ezzel együtt környezetünkbe kijutó nanoanyagok vizsgálata került a figyelem és a kutatások középpontjába. Ezek az anyagok elkerülhetetlenül kikerülnek környezetünkbe és kifejtik hatásaikat (gyakran káros hatásaikat) az ökoszisztémára, a benne élő szervezetekre, így az emberekre is. Ezért szükség van ezeknek az anyagoknak és más szennyezőanyagokkal együtt fellépő (kölcsön)hatásaiknak minél pontosabb feltérképezésére. A nanoanyagok hatásáról a környezetre (önmagában) számos irodalom számolt be az utóbbi években. Ugyanakkor, mivel gyakran vivőanyagként is alkalmazzák, számolni kell esetleges toxicitást erősítő (szinergista) hatásával

is,

mivel

környezetünkben

a

szennyezőanyagok

keverékével

kerülünk

kölcsönhatásba. Ezért kiemelten fontos az új vegyületek környezettoxikológiai tesztelése, új tesztek és tesztrendszerek kiépítése. Emiatt az általam választott és vizsgált téma naprakész, jelen idejű problémával foglalkozik. A

TDK

dolgozatomban

elsőként

különböző

trófikus

szintekről

származó

organizmusokkal, bakteriális, állati egysejtű és növényi tesztorganizmusokkal, végeztem a fémek

káros

hatására

méréseket.

Néhány

esetben

a

bakteriális

és

a

növényi

tesztorganizmussal szemben az állati egysejtű, Tetrahymena pyriformis sokkal érzékenyebb volt: kadmiumnál, ahol a fehér mustárnál (Sinapis alba, növényi tesztorganizmus) mértnél egy nagyságrenddel volt kisebb az EC (hatásos koncentráció), ólom esetében két nagyságrenddel volt kisebb a mért EC érték. A T. pyriformis esetében a kapott hatásos koncentráció értékeket összehasonlítottam az irodalmi adatokkal, és a cink és a réz esetében az irodalmi adatokhoz hasonló értékeket mértem, arzénre a 24 órás mérési adatok hasonlítottak az irodalmi értékekhez, míg az ólomra és a kadmiumra az általam alkalmazott tesztmódszer érzékenyebb volt, azaz kisebb hatásos koncentrációkat határoztam meg. Azt tapasztaltam, hogy a különböző tesztorganizmusok teljesen eltérő érzékenységgel rendelkeznek különböző fémekre, tehát nem lehet általánosan kijelenteni, hogy egy-egy tesztmódszerrel az összes fém/félfém toxikus hatása vizsgálható. 54

Kutatómunkám

további

fázisában

meghatároztam

azokat

a

fémkoncentráció-

tartományokat, ahol a későbbi kísérleteimet végeztem, melyekben a nano titán-dioxid hatásának vizsgálatát tűztem ki célul a fémek toxikus hatására. Az utolsó lépcsőben a TiO2fém keverékek hatásának tanulmányozására került sor, ahol a kadmium esetében kiugró eredményt tapasztaltam: ez volt az az összeállítás, ahol a T. pyrifomris szaporodásgátlás elérte a 100%-ot (teljes pusztulás) a kadmium és a nano titán-dioxid együttes jelenlétében, ami koncentrációtól függően 30–50%-os növekedést jelentett a csak kadmiumot tartalmazó mintához képest. Arzén esetében is jól megfigyelhető volt a nano-TiO2 toxicitást serkentő hatása, leginkább 5 ppm-es arzén koncentrációnál. Itt a hozzáadott 10 ppm nano-TiO2 esetén a gátlás az eredeti (csak arzént tartalmazó minta) duplájára nőtt. A rézoldattal készített tesztösszeállításoknál az látszik, hogy a két kisebb (0,1 és 1 ppm) rézkoncentrációjú minták hosszútávon serkentették a szaporodást, míg a 25 ppm-es rézoldatnál kb. 50% volt a gátlás 72 órára. A nano-TiO2-os keverékekben ettől eltérő értéket csak 24 óránál kaptam, és megfigyeltem, hogy a sejtek egy idő után adaptálódnak a szennyezőanyagokhoz. A tesztet érdemes lenne az 1–25 ppm közötti rézkoncentrációval megismételni. Az ólommal készített keverékekre is jellemző ez az adaptálódás: a nano TiO2 az első 24 órában a gátlást 2–3szorosra növeli, viszont ez a harmadik napra szaporodást serkentő hatásba csap át. Véleményem szerint, az általam elvégzett tesztek eredményei bizton alátámasztják azt a tényt, hogy a nano titán-dioxid a fémek toxikus hatását tovább növeli, illetve növelheti. Megtettem az első lépéseket a környezetünkbe, vízi ökoszisztémába kikerülő nanoanyag (nano TiO2) és kiemelt toxikus fémek (arzén, cink, kadmium, ólom, réz) együttes hatásának felmérése irányába, de a kérdéskör részleteinek feltárására további kísérletekre van szükség. Javasolt a jövőben a környezeti realitást célozva, kisebb koncentráció tartományokban is vizsgálni az együttes hatást, továbbá felderíteni a kollektív hatás mechanizmusát. Ehhez olyan úgynevezett

szubletális

végpont(ok)

alkalmazására

van

szükség,

melyek

nem

a

szaporodásgátlásra gyakorolt hatást vizsgálják, hanem a tesztorganizmus különböző életműködésein – úgy, mint mozgás, enzimaktivitások, fagocitózis – keresztül adnak információt a toxicitásról. Így magyarázatot kaphatunk a kitettség idejének függvényében kapott „adaptálódási” eredményekre is.

55

7.

Felhasznált irodalom

Adriano, D.C. (1986) Trace elements in the terrestial environment, Spinger-Verlag, New York Atkári Á. (2006) Toxikus fémekkel szennyezett Gyöngyösoroszi talajok stabilizációja Diplomamunka, BME MGKT, Budapest Arndt, K., Hofmann, D., Gehre, M., Krumbiegel, P. (1998) Investigation into the effect of a pollutant on the nitrogen metabolism of Tetrahymena pyriformis as a model for environmental medical research. Environmental Health Perspectives 106 (8) Buzea, C., Pacheco, I. I., Robbie, K. (2007) Nanomaterials and nanoparticles: sources and toxicity, Biointerphasis, 2, 17−65 EPA – (Environmental Protection Agency) Nanomaterial Case Studies (2009) Nanoscale Titanium Dioxide in Water Treatement and in Topical Sunscreen Feigl V. (2011) Toxikus fémekkel szennyezett talaj és bányászati hulladék remediációja kémiaival kombinált fitostabilizációval, PhD értekezés Fergusson, J.E. (1990) The heavy elements: chemistry, environmental impact and health effects, Pergamon Press, Nagy-Britannia Gellein, K., Syversen, T. (2009) Nanotoxicology – The toxicology of nanomaterials, General and Applied Toxicology, 6, 3381−3392 Gruiz K., Horváth, B. és Molnár, M. (2001) Környezettoxikológia, Műegyetemi Kiadó, Budapest la Farre, M., Pérez, S., Kantiani, L., Barcelo, D. (2008) Fate and toxicity of emerging pollutants, their metabolites and transformation products in the aquatic environment, Trends in Analytical Chemistry, 27, 991–1000 Láng, O., Kersztesi, M. (2004) Egy csillós modellsejt karrierje. Természet Világa 135 (6): 280–284 Maros G. (2011) Nano titán-dioxid hatásvizsgálata környezettoxikológiai tesztekkel, Diplomamunka Mortimer, M., Kasements, K., Kahru, A. (2010) Toxicity of ZnO and CuO nanoparticles to ciliated protozoa Tetrahymena thermophila. Toxicology 269, 182–189 Nicolau, A., Dias, N., Mota, M., Lima, N. (2001) Trends in use of protozoa in the assesment of wastewater treatment. Res. Microbiol. 152, 621–630 Stefanidou, M., Alevizopoulos, G., Spiliopoulou, C. (2008) DNA content of Tetrahymena pyriformis as a biomarker for different toxic agents. Chemosphere 74, 178–180 Pál K.-né (2002) Arzén a környezetben, Környezetvédelmi füzetek, BME OMIKK, Budapest, 2002. november 56

Pál K.-né (2002) Cink a környezetben, Környezetvédelmi füzetek, BME OMIKK, Budapest, 2000. október Pál K.-né (2003) Kadmium a környezetben, Környezetvédelmi füzetek, BME OMIKK, Budapest, 2003. április Pándics, T. (2008) A nanorészecskék környezetegészségügyi hatásainak elemzése, Egészségtudomány, LII. Évfolyam 3. szám Sauvant, M., Pepin, D., Piccinni, E. (1999) Tetrahymena pyriformis: a tool for toxicological studies. A review. Chemosphere, 38 (7), 1631−1669 Sauvant, M.; Pepin, D., Bohatier, J., Grolier, C. (2000) Effects of chelators on the acute toxicity and bioavailabilityof aluminium to Tetrahymena pyriformis. Aquatic Toxicology, 47, 259–275 Sauvant, M., Pepin, D., Bohatier, J., Grolier, C., Guillot, J. (1997) Toxicity Assessment of 16 Inorganic Environmental Pollutants by six Bioassays. Ecotoxicology and Environmental Safety, 37, 131–140 Sohár P.-né (2009) Az élelmiszerek kadmium tartalma. Előadás A kadmium környezetgeokémiája című ankéton. 2009. május 27., MTA Kutatóház, Budapest, Absztrakt füzet, 5 Szegedi L. (2011) Toxikus nehézfémszennyezés utóhatásának vizsgálata barna erdőtalajon, PhD értekezés Wagner Ö., Hencsei P. (2001) Bioszervetlen kémia, Műegyetemi Kiadó Zou, X., Xu, B., Yu, C., Zhang, H. (2013) Combined toxicity of ferroferric oxide nanoparticles and arsenic to the ciliated protozoa Tetrahymena pyriformis. Aquatic Toxicology, 134–135, 66–73

57