Mono- és diszacharidok kemotaktikus hatásának vizsgálata Tetrahymena pyriformis GL modell-sejten
Diplomamunka
Szemes Judit Áfonya, Biológus Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar
Témavezetők: Dr. habil. Kőhidai László egyetemi docens Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Kemotaxis Munkacsoport Dr. Lajkó Eszter központi gyakornok Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Kemotaxis Munkacsoport Belső konzulens: Dr. habil. Kovács Mihály tudományos főmunkatárs Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Biokémiai Tanszék
2009. május 6.
I. TARTALOMJEGYZÉK
I. TARTALOMJEGYZÉK............................................................................................ 2 II. BEVEZETÉS .......................................................................................................... 4 III. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ..................................................................................... 5 III.1. Kemotaxis jelensége és szerepe ................................................................. 5 III.1.1. Alapfogalmak............................................................................................ 6 III.1.2. Kemotaktikus ligandumok......................................................................... 6 III.1.3. Receptorok és jelátviteli útvonalak ........................................................... 7 III.2. A modell-sejt.................................................................................................. 8 III.3. Szénhidrátok................................................................................................ 10 III.3.1. A szénhidrátok szerepe és a vizsgált mono- és diszacharidok jellemzői 10 III.3.2. Mono- és diszacharidok kemotaktikus hatásai ....................................... 11 III.4. A Tetrahymena pyriformis szénhidrát anyagcseréje ............................... 12 III.4.1. Szénhidrátok hasznosítása, anyagcseréje ............................................. 12 III.4.2. Szénhidrátok transzportja ....................................................................... 13 III.4.3. Szénhidrátok és a cAMP ........................................................................ 13 III.4.4. Szénhidrátok és az inzulin ...................................................................... 14 IV. CÉLKITŰZÉSEK................................................................................................. 15 V. ANYAG ÉS MÓDSZER........................................................................................ 16 V.1. Sejttenyészet és nyersanyagok.................................................................. 16 V.2. A kemotaxis assay....................................................................................... 16 V.3. A kemotaktikus szelekció ........................................................................... 17 V.4. A reciprok szelekció .................................................................................... 18 V.5. Friss táptalajjal történő vizsgálatok ........................................................... 20 V.6. Éheztetés...................................................................................................... 20 V.7. Inzulin kezelés.............................................................................................. 21 V.8. A kemotaxis assay-k statisztikai kiértékelése........................................... 21 VI. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK................................................................ 22 VI.1. Cukrok kemotaktikus hatása a koncentráció függvényében.................. 22 VI.1.1. Bevezetés .............................................................................................. 22 VI.1.2. Széles amplitúdóval ható ligandumok .................................................... 22 VI.1.3. Szignifikánsan repellens ligandumok ..................................................... 23 VI.1.4. Szignifikáns hatással nem rendelkező ligandumok ................................ 25 VI.1.5. A ligandumok hatásossága és kémiai karakterük közti összefüggés ..... 27 VI.1.6. Kemotaktikus range-fitting...................................................................... 29 VI.2. A kemotaktikus szelekció .......................................................................... 31 VI.2.1. A kemotaktikus szelekció jelentősége .................................................... 31 VI.2.2. Kemotaktikus szelekció .......................................................................... 31 VI.3. Reciprok szelekció ..................................................................................... 33 VI.3.1. Elővizsgálat ............................................................................................ 34 VI.3.2. Reciprok szelekció repellens ligandumokra ........................................... 35 VI.4. A glükóz kemotaxisát befolyásoló tényezők ............................................ 36 VI.4.1. Párhuzamos vizsgálatok elve................................................................. 36 VI.4.2. Éheztetés ............................................................................................... 37 VI.4.3. Inzulin kezelés........................................................................................ 38 VII. KÖVETKEZTETÉSEK ....................................................................................... 41 VII.1. A szénhidrátok kemotaktikus potenciálja, a három fő választípus ....... 41 VII.2. Receptoron, vagy specifikus anyagcserefolyamatokon át hatnak? ..... 43
2
VIII. ÖSSZEFOGLALÁS MAGYARUL ..................................................................... 46 IX. ÖSSZEFOGLALÁS ANGOLUL.......................................................................... 47 X. IRODALOMJEGYZÉK ......................................................................................... 48 XI. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ................................................................................ 51 XII. MELLÉKLETEK................................................................................................. 52
3
II. BEVEZETÉS Milyen táplálékairól,
lehetősége az
van
esetleges
egy
káros
egysejtű hatásokról
szervezetnek információt
a
környezetéről,
szerezni?
Hogyan
tájékozódhat egy hímivarsejt, hogyan találhatja meg egy immunsejt a gyulladás helyét, mi alapján kerülnek a szöveti differenciálódás során sejtjeink a megfelelő helyre? A sejtek szintjén az információ átadás módja meglehetősen korlátozott. Bár bizonyos sejtek képesek a fény, vagy mágneses tér érzékelésére, a komplex, specifikus információátadás fentieknél jobban meghatározható módja a kémiai ingerekkel való kommunikáció. Ezért egy igen finoman modulált rendszer fejlődött ki az evolúció során a kémiai ingerek kibocsátására és fogadására egyaránt. A kemotaxis (vagyis inger által irányított helyváltoztató mozgás) kifejezés kapcsán talán a legtöbb ember elsőként a táplálékmolekulák (szénhidrátok, peptidek, vagy a táplálék más, specifikusabb komponensei) által kiváltott vonzó hatásra asszociál. A szénhidrátok és származékaik kemotaktikus hatásával kapcsolatban meglehetősen átfogó kutatást végeztek a prokariótákon [Adler és mtsai, 1973; Hayakawa és mtsai, 1995], ugyanakkor eukarióta szervezetekkel kapcsolatban jóval kevesebb
információval
rendelkezünk,
és
jellemzően
csak
magas
cukorkoncentráción végzett kemotaxis vizsgálatok eredményeit ismerjük [Fan és mtsai, 2002; Vogel és mtsai, 1993]. E szakdolgozatban tehát ezeknek az általánosan táplálékforrásként ismert molekuláknak az alaposabb, széles koncentrációtartományban történő vizsgálatát, és az általuk kiváltott reakciók karakterizálását tűztük ki célul. Modellként egy eukarióta csillóst választottunk, amely már sok vizsgálatban bizonyította, hogy akár a magasabb rendűeknél is érzékenyebben reagál a kemotaktikus ingerekre: eltérő választ ad a peptidek enantiomer formáira, sőt, egyes esetekben azok fizikokémiai karaktereinek csekély változását is képes érzékelni, pl. a kristályos illetve amorf inzulinszármazékok eltérő kemotaktikus hatást váltanak ki [Csaba és mtsai, 1994]. Eredményeink egyrészt alátámasztják a szénhidrátok táplálékként betöltött szerepét (pl. glükóz), másrészt bizonyos ligandumok esetében (pl. fruktóz) arra utalnak, hogy jelenlétüket modell-sejtünk nem tápanyagként értelmezi, hanem a molekula feltehetően valamilyen többletinformációt közvetítő szignálként hat.
4
III. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
III.1. Kemotaxis jelensége és szerepe A kemotaxis a taxisok (azaz inger által irányított mozgások) egyik típusa, az a jelenség, amikor a környezet kémiai összetevői egysejtűek (prokarióták, eukarióták), vagy többsejtű szervezetek egyes sejtjeinek (pl. ivarsejtek, immunsejtek) a kémiai összetevők koncentráció gradiense által irányított mozgását váltják ki. A kemotaxis általánosan leírt folyamata három fő lépésre bontható: először a ligandum kötődik a membrán receptorához, majd aktiválódnak a jelátviteli útvonalak, melyek a szignált a receptortól a sejt belsejébe közvetítik, végül ennek hatására kialakul a sejtmozgás. Pozitív a kemotaxis (attraktáns a ligandum), ha a vizsgált anyag növekvő koncentráció gradiensének irányába történik a mozgás, negatív (repellens ligandum), ha ezzel ellentétes irányú. A szabadon úszó, vagy akár parazita életmódot folytató pro- és eukarióták számára
a
környezetükben
oldott
állapotban
lévő
anyagok
koncentráció
gradienseinek érzékelése fontos eszköz a táplálék felkutatásában (pl. glükóz), és a méreganyagok elkerülésében (pl. fenol) egyaránt. A magasabb rendűek esetében az embriogenezistől kezdve, az immunrendszer működésén át, bizonyos betegségek kialakulásáig számos folyamatban kap szerepet a kemotaxis. Maga a többsejtű élet is e folyamat révén kezdődhet el: a spermium kemotaxissal közelíti meg a petesejtet. Az immunrendszer működéséhez elengedhetetlen a professzionális kemotaktikus ligandumok, a kemokinek (kemotaxist kiváltó citokinek) jelenléte, melyek célsejtre specifikusan, kis koncentrációban képesek az immunrendszer elemeit aktiválni, és stimulálni az immunsejtek migrációját, extravazációját, és a killing folyamatok kialakulását. Ugyanakkor egyes betegségek hátterében is a kemotaktikus aktivitás megváltozása áll: a rheumatoid arthritis esetében az IL-8, és VEGF ligandumok magasabb szintje fokozott kemotaxist és gyulladást vált ki [Feldmann és Maini, 2001]. Tumorok áttétképzésének hátterében a kemotaxist befolyásoló folyamatok egyensúlyának felbomlása figyelhető meg. Ezen felül, bizonyos fertőzések esetén a fertőző
ágens
kemotaktikus
képessége
meghatározó
lehet,
a
motilitás
befolyásolásával ugyanis csökkenthető a fertőzés terjedése. Ennek kapcsán vizsgálták például a Listeria monocytogenes kemotaxisának hőmérsékletfüggését (normál testhőmérsékleten (37 Co) még igen, de 40 Co-on már nem mutat kemotaxist 5
glükóz irányában), illetve összefüggést mutattak ki a kemotaxisban szerepet játszó génekre mutáns fenotípusú törzsek csökkent mozgásképessége, és csökkent fertőzőképessége közt [Galsworthy és mtsai, 1990; Flanary és mtsai, 1999]. III.1.1. Alapfogalmak Bár a kemotaxis a leggyakrabban vizsgált sejtmigrációs jelenség, számos ezzel rokon folyamatot ismerünk. Fontos elkülöníteni a kemotaxist a kemokinezistől, amit szintén a sejtek környezetében oldott kemikáliák váltanak ki, ám ez utóbbi esetében a mozgás nem vektoriális, hanem random jellegű. A kemotaxis egy altípusa a haptotaxis, amikor a kemotaktikus molekulák egy felszínhez kötöttek, vagy azon expresszáltak, ellentétben a klasszikus kemotaxis jelenségével, amikor a molekulák gradiense a folyadéktérben alakul ki. Korábban a haptotaxis jelentőségét lebecsülték, ám mára bebizonyosodott, hogy legalább olyan gyakori, mint a klasszikus kemotaxis, többek közt alapvető szerepet kap a gyulladási folyamatokban, az új erek képződésében (angiogenezis), és a tumorok áttétképzése során is. III.1.2. Kemotaktikus ligandumok A kemotaktikusan aktív molekulák alapvetően két csoportra oszthatóak. Az első az ún. professzionális kemoattraktáns ligandumok, melyek elsődleges szerepe a kemotaxis befolyásolása. Ide tartoznak a formil-peptidek: bakteriális eredetű, formilált di-, tri- és tetrapeptidek,
melyek
a
baktériumok
anyagcseréje,
vagy
szétesése
során
szabadulnak fel. Legjellemzőbb képviselőjük az N-formil-metionil-leucil-fenilalanin (fMLF), amely erős attraktáns hatással bír a fertőzések elleni védelemben aktiválódó neutrofil granulociták, és monociták; illetőleg Tetrahymena pyriformis számára egyaránt [Kőhidai és mtsai, 2003c]. A komplemetrendszer három aktiválódási útvonalának csomópontjában találhatóak a C3a, és C5a peptidek, melyek célsejtjei szintén a monociták és granulociták. Végül, de nem utolsó sorban az első csoportba tartoznak a kemokinek, melyek neve is elsődleges funkciójukat jellemzi. Egyes osztályaik (C, CC, CXC, CX3C) jellemzően más immunsejtekre hatnak: a CC kemokinek (pl.: RANTES) főleg monocitákra, míg a CXC kemokinek (pl.: IL-8) neutrofil granulocitákra specifikusak.
6
A második csoportba tartoznak azok a molekulák, melyeknek elsődleges szerepe nem a kemotaxis befolyásolása, ennek ellenére képesek valamilyen kemotaktikus választ kiváltani. Itt kitüntetett szereppel bírnak az aminosavak, és a kevés aminosavból álló peptidek, melyek közül például a Tetrahymena pyriformis számára a kisebb oldalláncot hordozó, és önmagában is rövid láncú aminosavak (pl. Gly, Ala) vonzóak, az aromás gyűrűt tartalmazók (pl. Phe, Tyr) repellens hatásúak [Kőhidai és mtsai, 2003b]. Egy másik, gyakran vizsgált ligandum csoport, a mono- és szekszviterpének sajátos elegyéből álló illóolajok, melyek közül például a menta, és a zsálya illóolaja a Tetrahymena számára repellens hatású, míg a bazsalikom olaja már kis koncentrációban is attraktáns [Kőhidai és mtsai, 1995]. A kemotaktikusan aktív molekulák következő - a szignálmolekulák evolúciója szempontjából is fontos csoportja a lektineké. Ezek a szénhidrát kötésre képes proteinek alacsonyabbrendű többsejtűek (pl. zsákállat) esetében immunfunkciókat is betölthetnek (bevonják, megjelölik a bekebelezendő részecskéket). Tetrahymena esetében a membrán megfelelő szénhidrátjaival lépnek kapcsolatba (mannóz, glükóz, oligoszacharidok), és a lektin ligandum specifitására jellemző, pozitív kemotaktikus választ válthatnak ki [Kőhidai és Csaba, 1996]. Egyes hormonok, pl.: inzulin esetében is igazolták, hogy hormonhatásán felül - embrionális korban nemcsak növekedési faktorként tud hatni, hanem kemotaktikusan is aktív [Gammeltoft és mtsai, 1985] A két csoportot a Lenhoff-féle hipotézis kapcsolja össze [Lenhoff, 1974]. Az elmélet szerint az evolúció korai szakaszában megjelent sejteknek még csak táplálék receptoraik voltak, ekkor a ligandum-receptor kötés még nem volt nagyon specifikus. Egyes táplálék molekulák azonban receptorukhoz kötve, vagy a sejtbe jutva egyéb sejtélettani reakciókat is ki tudtak váltani, ám táplálékként való hasznosításuk kevésbé volt kifizetődő. Így az ezekre ható pozitív szelekcióval (jelmolekulákra és receptorokra együtt) kialakulhattak a szignálok: hormonok és más jelmolekulák. Ilyen evolúciós fejlődés során alakulhattak ki a kemotaxist közvetítő receptorok, szignálrendszerek is, melynek csúcsát a professzionális kemotaktikus molekulák (pl. kemokinek) jelentik.
III.1.3. Receptorok és jelátviteli útvonalak Egy sejt kemotaxisának három legfőbb feltétele (természetesen a kemikália gradiense mellett), hogy legyen a ligandumot érzékelő receptor, a jelet továbbító 7
másodlagos hírvivő rendszer, és a válaszreakciót - a mozgást - kivitelező apparátus. Az eukarióta sejtek jellegzetessége, hogy egy gradiens esetén nemcsak a kemikália koncentrációjának időbeli változását érzékelik (ahogy az a baktériumoknál általános), de nagyobb méretüknek (kb. 70 x 30 µm) köszönhetően a sejt különböző pólusai közti koncentrációkülönbséget is képesek detektálni. A tipikus kemotaxis receptor egy 7 transzmembrán domént tartalmazó forma, amely a Ras - Raf - MAP-kináz rendszerrel, vagy az IP3 - Ca2+ útvonallal tart kapcsolatot (pl.: IL-8 esetében, humán sejteken), a folyamat végeredménye pedig jellemzően az aktin polimerizáció, azaz mozgás, vagy sejtalak változás. Azonban számos kemotaktikusan aktív ligandum más típusú receptor - pl. tirozin kinázhoz kapcsolt receptor, receptor tirozin kináz, ioncsatornát működtető receptor, vagy intracelluláris receptor - közvetítésével hat. Az eukarióta szignáltranszdukció még korántsem tökéletesen ismert, azonban már számos résztvevő elem szerepét definiálták.
A
receptorokhoz
hasonlóan
jellemző
a
másodlagos
hírvivők
sokfélesége is: ciklikus nukleotidok, inozitol foszfátok, diacil-glicerin, vagy akár a NO is szerepelhet, mint hírvivő. Csillósok esetében főleg a Ca 2+-függő szignalizációs utak érvényesülnek, melyek a bazális testeken át a csillók mikrotubulusainak slidingját, ezáltal a csillók lecsapását váltják ki. A receptorok sokféleségének, és a jelátviteli útvonalak összetettségének köszönhetően az egyes ligandumok akár külön is hathatnak, vagy befolyásolhatják egymás hatását a jelátviteli útvonalak kapcsolódása révén. Így egy finoman szabályozott, a környezeti ingerekre összetetten reagáló rendszer válaszát figyelhetjük meg, amely a klasszikusan leírt receptorokon és hírvivőkön keresztül hat. Lehetséges azonban, hogy e - már viszonylag jól ismert - rendszer mellett, bizonyos
anyagok
(pl.:
szénhidrátok)
esetleg
más
úton,
a
metabolizáció
befolyásolásával, specifikus anyagcsereutak révén fejtik ki kemotaktikus hatásukat.
III.2. A modell-sejt Vizsgálatunkban
igyekeztünk
minél
többféle
szénhidrátot,
széles
koncentrációban megvizsgálni, ami azonban idő és eszközigényes feladat. Egy csillós, eukarióta sejt, a Tetrahymena pyriformis már számos kísérletben igazolta, hogy kitűnő alany az eukarióta (akár humán) sejtek génexpressziójának, jelátviteli útvonalainak, vagy kemotaktikus viselkedésének modellezésére. Ugyanakkor gyors,
8
szabadon úszó mozgása és érzékenysége révén viszonylag rövid inkubációs idő alatt, könnyen vizsgálható a kemotaktikus válaszkészsége. A Tetrahymena fajcsoport tagjai szabadon úszó, édesvízi egysejtűek, melyek baktériummal táplálkoznak. Tiszta tenyészetben (folyékony táptalajon) könnyen fenntarthatóak, aerofilek, mozgásukhoz nem igényelnek felszínt, osztódási ciklusuk mindössze 155 percet vesz igénybe. Igen sok elvi és gyakorlati érv szól amellett, hogy ezt a fajt használják, és használjuk mi is modell-sejtünkként. E csillós protozoon számos, a magasabb rendű gerincesekre jellemző sejtélettani folyamattal rendelkezik. Ismert, hogy a magasabb rendűekével homológ receptorokkal, pl. inzulin receptorral rendelkezik, amely képes a humán inzulin kötésére [Christopher és Sundermann, 1996]. Továbbá szintén rendelkezik a gerinceseknél leírt másodlagos hírvivőkkel: cAMP, cGMP, IP3, Ca 2+calmodulin rendszerrel [Csaba és Nagy, 1976; Kovács és Csaba, 1994; Kovács és Csaba, 1987]. Emellett több, a gerincesekre jellemző hormont és szabályozó anyagot termel (pl.: inzulin, ACTH, hisztamin, szerotonin, melatonin, citokinek: pl.: IL-6), melyek autokrin és parakrin hatása is a fejlettebb emlősökével homológ [Csaba és Kovács, 1995; Le Roith és mtsai, 1983; Hegyesi és mtsai, 1998; Janakidevi és mtsai, 1966; Kőhidai és mtsai, 2002a; Kőhidai és mtsai, 2000; Láng és Keresztesi, 2004]. Modell-sejtünk genomját feltérképezték, 30 000 gént tartalmaz; receptorai és jelátviteli rendszerei változatosságának tehát az emberi genomhoz hasonló méretű genetikai állománya adhat alapot. A kemotaxis során igen érzékenyen reagál a molekulák kis mértékű változásaira is, pl. oligopeptidek karboxil végződésének amidációjára, peptidek enantiomer
formáira;
illetve
másként
reagál
a
kristályos
és
amorf
inzulinszármazékokra is [Kőhidai és mtsai, 2003a; Csaba és mtsai, 1994]. A magasabb rendűekkel összehasonlítva az egyes ligandumokra adott kemotaktikus válaszát, nagyfokú konzerváltságot tapasztalhatunk: például IL-8 és RANTES esetében nemcsak a válasz jellege (itt is kemoattraktánsként hatnak), hanem még az effektív koncentrációtartomány is a gerincesekéhez hasonló volt: IL-8 esetében 1 ng/ml, RANTES esetében 75 ng/ml [Kőhidai és Csaba, 1998].
9
III.3. Szénhidrátok
III.3.1. A szénhidrátok szerepe és a vizsgált mono- és diszacharidok jellemzői A kemotaxis szemszögéből nézve a szénhidrátokra egy alapvető kettősség jellemző: egyrészt a legáltalánosabb táplálékmolekulák és energiaforrások minden sejt számára, másrészről glikoproteinek részeként az egyik legspecifikusabb reakcióban: az antigének és antitestek kapcsolatában vesznek részt (pl. A-B vércsoport
alkotóelemei).
Bár
viszonylag
kevés
olyan
eset
van,
ahol
monoszacharidok önmagukban funkcionálnak szignálként, erre is ismerünk példákat. Egyrészt már az ízlelés során képesek a cukrok (az ízlelőbimbók a G-proteinasszociált glükóz receptor
- cAMP -
Ca2+ szignalizációs úton, majd az
idegrendszeren keresztül) az inzulin szint emelkedését okozni. Másrészt a pancreas sejtekre jellemző az a specifikus anyagcsereút, amely során a pancreas B-sejtjeibe lép a glükóz a GLUT2 transzporteren át, majd a lebontása során keletkező ATP zárja a K+ csatornákat, így depolarizálja a sejtet. A depolarizáció hatására a feszültségfüggő Ca2+ csatornák kinyílnak, és Ca2+ áramlik a sejtbe, ez az inger pedig a sejtben tárolt inzulin szecernálását váltja ki. Tekintettel a szénhidrátok összetett szerepére, illetve arra a tényre, hogy egyes szöveteink sejtjei magát a glükózt is eltérő módon érzékelik, igyekeztünk minél több típusú mono- és diszacharidot megvizsgálni. Teszteltünk pentózt (arabinóz), glükózt, amely a legalapvetőbb táplálék, a glükóz epimerjeit: mannózt és galaktózt, hexóz származékokat: glükózamint, és N-acetil galaktózamint, melyek a gerincesek antigénjeinek fő alkotóelemei, és egy ketózt: a fruktózt. Ezen felül diszacharidokat is vizsgáltunk: szacharózt, amely az egyetlen vizsgált nem redukáló cukor volt; maltózt, amellyel - minthogy két glükózból áll - jól vizsgálható a dimerizáció szerepe, illetve laktózt. Ezen molekulák egyrészt biológiai szerepükben, másrészt kémiai jellegükben is diverz csoportot alkotnak. Az arabinóz - diszacharidok "tengely" mentén a molekulasúly és molekulafelszín növekedésének, valamint a hidrogén donorok és akceptorok számának hatása vizsgálható, az N-acetil galaktózamin - laktóz/maltóz tengely mentén pedig a polaritás (megoszlási hányados) hatása [PubChem Project]. A vizsgált szénhidrátok képletei, és a vizsgálatok szempontjából fontosnak ítélt kémiai változóik értékei a mellékletek közt tekinthetők meg (Melléklet: 24 ábra, 12. táblázat).
10
III.3.2. Mono- és diszacharidok kemotaktikus hatásai A szénhidrátok kemotaktikus hatását elsősorban prokariótákon tesztelték. Az enterális Escherichia colira nagy koncentrációban (10-1 M - 10-4 M) rendkívül erős attraktánsként hatnak a különböző szénhidrátok és származékaik. Adler és munkatársai több mint 80 szénhidrátot, illetve szénhidrát származékot vizsgáltak. Kísérleteik alatt foszfát puffert használtak médiumként, amely tápanyagként nem szolgálhatott, de a sejtek mozgását sem gátolta. Bizonyos cukrok együttesen adva kompetitíven gátolták egymás hatását (feltehetően közös receptoron át hatottak), e jelenség alapján kilenc fő szénhidrát receptort tudtak elkülöníteni (N-acetil glükózamin, fruktóz, galaktóz, glükóz, maltóz, mannitol, ribóz, szorbitol, trehalóz) [Adler és mtsai, 1973]. Hayakawa és munkatársai egy talajban élő actinomycetes (prokarióta) faj, a Catenuloplanes japonicus zoospórájának kemotaxisát vizsgálták bizonyos, a talajban gyakori komponensek irányában [Hayakawa és mtsai, 1995]. A kapilláris kemotaxis assay-t ők is foszfát pufferben végezték, amely tápanyagokat nem tartalmazott. A legtöbb vizsgált anyag (aminosavak, aromás vegyületek, köztük a vanillin) relatíve magas koncentráción (10-4 M - 10-1 M) pozitív választ váltott ki. A vizsgált cukrok (D-xilóz, L-arabinóz, D-glükóz, D-galaktóz) szintén attraktánsnak bizonyultak, de esetükben a hatás alacsonyabb koncentráción, általában 10-6 M és 10-4 M közt érvényesült. A vizsgálat érdekessége, hogy messze a legerősebb attraktáns molekula a vanillin volt, amely bár önmagában nem szolgál tápanyagként (míg a tesztelt cukrok bizonyítottan igen), de a vizsgált faj táplálékául szolgáló növények lebomlásakor felszabadul, és szignálként jelzi a táplálék hollétét. Az eukarióták közül tengeri zoospórák kemotaxisát vizsgálták. Három tengeri, mangrove erdő leveleinek lebontásából élő faj öt törzsének kemotaxisát nézték a levelek különböző komponensei, így a szénhidrátok irányában is. A megfigyelt hatásokat négy csoportra különítették: repellens, enyhén-, közepesen-, erősen attraktáns. A vizsgált szénhidrátok közül egyedül a maltóz volt közepesen attraktáns egyetlen törzs (a Schizochytrium mangrovei Raghuk. KF7) esetében, a galaktóz és glükóz minden esetben enyhén attraktáns volt, míg a fruktóz, mannóz, xylóz, cellobióz és szacharóz vagy enyhén attraktáns, vagy repellens hatást váltott ki. Összehasonlításképpen, a szénhidrátokkal ellentétben a glutaminsav 4 törzs esetében közepes attraktánsnak bizonyult, és a különböző levélkivonatok is jellemzően közepesen erős attraktáns hatással bírtak [Fan és mtsai 2002]. Így tehát 11
az eukarióták körében - a prokariótákkal ellentétben - feltehetően nem ritka eset, hogy a szénhidrátok csak enyhe attraktáns, vagy akár kifejezetten repellens hatásúak legyenek. Az említett vizsgálat hiányossága azonban, hogy csak egy koncentráción vizsgálták a szénhidrátok hatását, így nem szerezhetünk információt kemotaktikus válaszok koncentrációfüggéséről; valamint az alkalmazott koncentráció (100 mM) is igen magas, nem tekinthető fiziológiásnak a talajban szabadon élő fajok esetében. A szakirodalomban egyetlen cikket sikerült felkutatnunk, melyben gerincesek sejtjein vizsgálták a cukrok kemotaktikus hatását [Vogel és mtsai, 1993]. A vizsgált sejttípusok közül kizárólag a szarvasmarha cornea endotheliális sejtjei mutattak válaszkészséget, a humán melanoma, humán mellrák, szarvasmarha endothel sejtek és szarvasmarha mikrovaszkuláris endothel sejtek esetében nem tapasztaltak pozitív választ.
A
szarvasmarha
cornea
endotel
sejtek
fokozott
kemotaktikus és
kemokinetikus migrációval válaszoltak 10 mM feletti koncentrációban D-glükózra és szacharózra,
míg
az L-glükóz,
szorbitol,
laktóz és D-galaktóz ugyanilyen
töménységben nem rendelkezett migrációt fokozó hatással. Éheztetés hatására a D-glükóz és a 2-dezoxi-D-glükóz attraktáns hatása fokozódott. Ugyanakkor itt is meg kell említenünk, hogy ilyen magas (10 mM feletti) vércukorértéket csak cukorbetegek esetében mérhetünk, így a hatásos koncentráció értékek nem tekinthetőek a sejtek számára kifejezetten adekvát ingernek. III.4. A Tetrahymena pyriformis szénhidrát anyagcseréje
III.4.1. Szénhidrátok hasznosítása, anyagcseréje Szénizotópos jelöléssel kimutatták, hogy a glikolízis, glükoneogenezis, glikogén szintézis, Calvin-ciklus és glioxalát ciklus alapvető folyamatai modellsejtünkben is lezajlanak. Ezen belül, képes a glikogént, a glükózt, és a fruktózt lebontani a glikolízis során, bár a glükóz lebontásának intenzitása tízszerese a fruktózénak [Borowitz és mtsai, 1977; Stein és Blum, 1979, 1980a, 1980b]. Különböző monoszacharidokat adva a Tetrahymena geleii táptalajához, vizsgálták azok hasznosításának mértékét. A glükózt nagyobb, a galaktózt, mannózt és fruktózt kisebb mértékben hasznosította (vette fel a táptalajból), és ezzel együtt a glükóz esetében több oxigént használt fel, mint a másik három cukor esetében. Ugyanakkor
12
a táptalajhoz adva a mannóz stimulálta legjobban a növekedését, a glükóz és galaktóz kevésbé, míg a fruktóznak e paraméterre nem volt hatása [Seaman, 1951].
III.4.2. Szénhidrátok transzportja Kemotaxis vizsgálatakor fontos azt is figyelembe venni, hogy a vizsgált ligandumok a sejt mozgására nemcsak a receptorok indukciója révén hathatnak, de azok felvétele szintén hatással lehet a sejtek migrációs aktivitására. Modell-sejtünk a természetben baktériumokkal táplálkozik, azonban laboratóriumi körülmények közt, jól definiált táptalajban igazolták, hogy a növekedéshez szükséges anyagokat (cukrok, nukleozidok) képes alternatív módon felvenni akár fagocitózist gátló anyagok (pl.: cytochalasin) jelenlétében is [Hoffmann és mtsai, 1974]. Irodalmi adatok
jelzik
továbbá,
hogy
modell-sejtünk
képes
facilitált
diffúzióval,
sztereospecifikus karrier molekulák segítségével arabinózt felvenni, mely folyamatot a glükóz kompetitíven gátolja [Cirillo, 1962]. Rasmussen és Hoffmann különböző Na+ koncentrációjú tápoldatokat vizsgálva azt találta, hogy Na+-gradiens hiányában is képes a szükséges tápanyagok felvételére, vagyis Na +-független glükóz transzporter rendszerrel rendelkezik [Hoffmann és mtsai, 1978].
III.4.3. Szénhidrátok és a cAMP A glükózzal kiegészített táptalaj a Tetrahymena
pyriformis
sejtek
cAMP
szintjét eltérő módon befolyásolhatja, egyes adatok annak emelkedését [Voichick és mtsai, 1973], mások csökkenését írják le [Ramanathan és Chou, 1973]. Fontos azonban figyelembe venni, hogy míg az előbbi
esetben
(saját
kísérleteinkhez
hasonlóan) proteose-peptone táptalajon, a
1. ábra: Fordított kapcsolat a cAMP szintje és a glikogén szint közt a Tetrahymena sejttenyészet növekedése során. [Forrás: Voichick és mtsai, 1973].
második esetben aminosavakat, vitaminokat, guanozint, uracilt, nyomelemeket, sókat, antibiotikumot és az egyetlen tényleges energiaforrásként cukrot tartalmazó táptalajon végezték a kísérletet. Voichick és munkatársai azonban azt is igazolták, hogy a cAMP szintje nagymértékben függ a sejttenyészet korától: kezdetben magas, 48 órás sejttenyészetnél minimális, majd lassan újra emelkedik [Voichick és mtsai, 1973] (1. ábra). Ezen felül a glükóz rövid távú hatását is kimutatták a sejt cAMP 13
szintjére: stacioner fázisú sejtek médiumához 0,5% glükózt adva a sejtek cAMP szintje azonnal megemelkedett, egy óra múltán pedig az eredeti cAMP szint nyolcszorosát mérték [Nandini-Kishore és Thompson, 1979]. E két, cAMP szintet befolyásoló tényező egymástól függetlenül is kifejtheti a hatását, de ha feltételezzük, hogy a glükóz a cAMP koncentrációjának növelésén át hat, fontos befolyásoló tényező lehet a sejt aktuális (a sejttenyészet korától függő) cAMP szintje. Így a sejttenyészet korával változó cAMP szint a glükózra adott kemotaktikus válasz milyenségét is befolyásolhatja. III.4.4. Szénhidrátok és az inzulin Mint azt korábban leírtuk, modell-sejtünk érzékenyen reagál nemcsak az inzulinra, hanem annak kristályos, vagy amorf voltára is [Csaba és mtsai, 1994]. Igazolták továbbá, hogy önmaga is inzulint képes termelni, amely a patkány rekeszizom glükóz felvételét fokozza [Csaba és mtsai, 1999], és a sejttenyészet korától függően változik a hormon szintje [Csaba és Kovács, 1995]. Emellett leírták, hogy az inzulin kezelés hatására hosszabb távon (48 h) válaszképp fokozódik a sejt endogén inzulintermelése [Csaba és mtsai, 1999]. Az inzulin és a szénhidrát anyagcsere kapcsolatát modell-sejtünkben is igazolták: inzulin hatására nő a glükóz felvételének mértéke, emellett pedig a cAMP szintje a duplájára emelkedik [Csaba és Nagy, 1976]. Összefoglalva tehát látható, hogy a modellként választott csillós egysejtű glükóz-függő anyagcseréje több, egymással szinergisztikus és antagonisztikus sejtfiziológiai folyamat eredőjeként értelmezhető csak. Kísérleteinknél figyelembe kell vennünk, hogy mind a cAMP, mind az inzulin a glükóz anyagcsere befolyásolásával módosíthatja a szénhidrátok által kiváltott kemotaxist, illetve a sejt két fenti endogén terméke (cAMP és inzulin) egymás termelésének modulálása révén szintén potenciálisan befolyásolhatja a modell-sejt kemotaktikus válaszkészségét.
14
IV. CÉLKITŰZÉSEK Tekintve, hogy viszonylag kevés előzetes adattal rendelkezünk a szénhidrátok protozoákon kifejtett kemotaktikus hatásáról, vizsgálatunk fő céljai voltak: (i) Széles koncentrációtartományban vizsgálni az eltérő kémiai jelleggel, és biológiai szereppel bíró cukormolekulák és származékaik kemotaxisra kifejtett hatását. (ii) Összefüggést keresni a kiváltott hatás, és az azt kiváltó molekula kémiai karaktere közt. (iii) A kemotaktikus szelekció eszközével vizsgálni, hogy a kiváltott hatásokat long-term dinamika jellemzi-e (amely "long-term" receptor jelenlétére utal), avagy a short-term dinamika (amely "short-term" receptort, vagy specifikus anyagcsere-úton keresztüli hatást feltételez). (iv) Egy kiemelt ligandum, a glükóz esetén megvizsgálni a kemotaxist befolyásoló hatásokat (hormon, éhezés).
15
V. ANYAG ÉS MÓDSZER
V.1. Sejttenyészet és nyersanyagok Tetrahymena pyriformis GL törzsből származó sejteket 1% Tryptone (Difco, Michigan, USA), és 1% élesztőkivonatot tartalmazó tápoldatban tenyésztettünk 28 oC-on. A logaritmikus növekedési fázisban lévő sejteken végeztük a méréseket. A méréshez használt cukrok D-arabinóz, D-glükóz, D-mannóz, D-galaktóz, szacharóz, laktóz, glükózamin, N-acetil-galaktózamin (Reanal), maltóz (Merck), D-fruktóz (gyógyszertári kiszerelés) voltak.
V.2. A kemotaxis assay A
sejtek
kemotaktikus
aktivitásának vizsgálatára egy kétkamrás kapilláris assay-t alkalmaztunk (2. ábra). Egy ELISA lemez (Sarstedt 82.1581) vályulatai szolgáltak alsó kamraként, melybe a sejteket (104 sejt/ml) helyeztük, míg egy 8-csatornás automata pipetta csőreibe kerültek a vizsgálandó cukrok megfelelő hígításai. A két kamra közötti kapilláris
nyílás
a
sejtek
számára
szabadon átjárható volt. A vizsgálatok
2. ábra: A kemotaxis assay felépítése. Az alsó kamrából (Elisa plate, zöld) futnak a sejtek a felső kamrába (pipetta csőr, sárga) a kemotaktikus ligandum irányába.
kontrolljaként az egyik pipetta csőrben cukor nélküli tápoldatot használtunk, ennek értékéhez viszonyítottuk a többi kapott eredményt (1. táblázat). Az assay-t szobahőmérsékleten végeztük, a vizsgálat ideje 20 perc volt. Ezután a felső kamrából a sejteket eltávolítottuk, és 4 % formalint tartalmazó foszfát puffer oldatban (PBS: NaCl, Na2HPO4, NaH2PO4; pH=7,2) fixáltuk. Az egyes minták sejtszámát Neubauer citométer segítségével határoztuk meg, minden mintából két számolást végeztünk. A kísérleti elrendezésből adódóan egy mérés során 7 koncentráción, 5-5 párhuzamos mintában mértük a válaszképességet; a szélesebb tartományok vizsgálatát több mérés ismétlésével oldottuk meg, ahol a két külön mérés minden esetben tartalmazott egy saját kontrollt, és egy közös vizsgált koncentrációt. Az öt párhuzamos mérés eredményét a kontrollhoz (100%) viszonyítva, százalékban kifejezve adtuk meg (kemotaxis index). 16
Az összes 1. csőr 2. csőr 3. csőr 4. csőr 5. csőr 6. csőr 7. csőr 8. csőr csőrben: FELSŐ médium / cukor 0M 10-12 M 10-11 M 10-10 M 10-9 M 10-8 M 10-7 M 10-6 M KAMRA: médiumban oldva (cont.) ALSÓ sejtek saját sejt sejt sejt sejt sejt sejt sejt sejt KAMRA: médiumukban 1. táblázat: Egy példa a kemotaxis assay kísérleti elrendezésére.
A szignifikánsan attraktáns és a szignifikánsan repellens koncentrációkat újra mértük. Ahol több szignifikáns koncentrációt is regisztráltunk, ott az alacsonyabb, azaz specifikusabb koncentráción ismételtük meg a mérést (az N-acetil glükózamin esetében mindkét koncentrációt újramértük, tekintettel arra, hogy az illesztési pontként kétszer lemért 10-12 M-os koncentráció csak egyik esetben volt szignifikáns az eredmény). Az ismételt mérések eredményeit külön fejezetben (Kemotaktikus range-fitting) mutatjuk be. V.3. A kemotaktikus szelekció Az
eljárás
lényege,
hogy
pozitívan,
vagy
negatívan
válaszoló
szubpopulációkat különítünk el, melyek kemotaktikus válaszkészségét bizonyos idő után újra teszteljük [Kőhidai és Csaba, 1998]. Szelekció esetén, első lépésben, a klasszikus kemotaxis assay segítségével meghatároztuk egy cukor hatásos kemoattraktáns koncentrációját. Ezután ismételten elvégeztük a kemotaxis assay-t, de csak a kontroll (jele: Tc/c), és a hatásos koncentráció (jele: Tc/s) esetén (2. táblázat). A felső kamrába futott (vagyis pozitívan reagáló) sejteket azonban nem fixáltuk, hanem az assay után friss tápoldatba oltottuk, és egy hétig tenyésztettük, amely kb. 70 generációnak felel meg.
Az összes csőrben: 1. csőr (Tc/c) médium / cukor FELSŐ KAMRA: 0 M, kontr. médiumban oldva sejtek saját ALSÓ KAMRA: sejt médiumukban 2. táblázat: Példa a szelekció első lépésének kísérleti elrendezésére.
2. csőr (Tc/s) hatásos koncentráció sejt
A hatodik napon friss tápoldatba oltottuk őket, és a hetedik napon a logaritmikus fázisban levő sejtekkel megismételtük a mérést,
a következő
kombinációkban:
17
(i) Tc/cC: az eredetileg kontrollal "szelektált" sejteket tartalmazta az alsó kamra, a felsőbe kontroll, vagyis üres tápoldat került; (ii) Tc/cS: az eredetileg kontrollhoz futtatott sejteket tettük az alsó, míg a hatásos cukoroldatot a felső kamrába (C=kontroll, S=sugar); (iii) Tc/sC: a korábban cukoroldattal szelektált sejteket helyeztük alulra, felülre kontroll került; (iv) Tc/sS: a cukoroldattal szelektált sejteket másodszor is cukoroldathoz futtattuk.
Az összes 1. csőr 2. csőr 3. csőr csőrben: (Tc/cC) (Tc/cS) (Tc/sC) FELSŐ médium / cukor hatásos 0 M, kontr. 0 M, kontr. KAMRA: médiumban oldva koncentráció ALSÓ sejtek saját kontrollal kontrollal cukorral KAMRA: médiumukban szelektált sejt szelektált sejt szelektált sejt 3. táblázat: Példa a szelekció második lépésének kísérleti elrendezésére.
4. csőr (Tc/sS) hatásos koncentráció cukorral szelektált sejt
A fent felsorolt kísérleti variációk mindegyike esetében 8-8 párhuzamos mérést végeztünk. Az egyes tenyészetek eltérő kiindulási sejtdenzitásaiból eredő eltérések elkerülése érdekében (Tc/c, Tc/s) az eredeti sejttenyészetekből mintát vettünk, megállapítottuk a sejtszámot és a kapott eredményeket erre normalizáltuk. A kemotaktikus szelekció mértékét egy szelekciós index-szel (Chsel) jellemezzük [Kőhidai és Csaba, 1998], amely a Ch sel
Tc/s S / Tc/s C Tc/c S / Tc/c C
hányadosból származik. Az index azt fejezi ki, hogy a szelektált populáció a ligandumra/kontrollra adott válasza közt nagyobb különbség van-e, mint a kontroll polpuláció ligandumra és kontrollra adott válasza között? Amennyiben az index értéke szignifikánsan nagyobb egynél (Chsel>1,15), úgy pozitív szelekció történt, és feltételezhető a folyamatért felelős, "long-term” receptorok jelenléte; az 1-hez közeli értékek (0,85
18
kerülő sejtekhez, közvetlenül a kísérlet előtt, az össztérfogat 1%-át kitevő cukoroldatot adtunk úgy, hogy a sejtszuszpenzió a hatásos cukorkoncentrációban legyen oldva; majd az alsó kamrákba helyeztük (Ts). Két másik esetben az eredeti sejttenyészet került az alsó kamrákba (Tc). Mindkét esetben kontroll, illetve cukor oldat volt a felső kamrákban (C, S) (4. táblázat).
Az összes csőrben: 1. csőr (Tc/c) 2. csőr (Tc/s) 3. csőr (Ts/c) 4. csőr (Ts/s) FELSŐ médium / cukor hatásos hatásos 0 M, kontr. 0 M, kontr. KAMRA: médiumban oldva koncentráció koncentráció ALSÓ sejtek saját / cukorral sejt sejt sejt sejt KAMRA: kiegészített médiumban cukoroldatban cukoroldatban 4. táblázat: Példa a reciprok szelekció első lépésének kísérleti elrendezésére.
Az így szelektált négy szubpopulációt a fent leírt módon tenyésztettük. A második futtatásnál a négy szelektált szubpopuláció (Tc/c, Tc/s, Ts/c, Ts/s) került az alsó kamrákba, mindegyikből 2-2 minta, ahol mindegyik esetében létrehoztuk az effektív cukorkoncentrációt az össztérfogat 1%-át kitevő cukoroldattal; ezek pedig rendre kontrollhoz, illetve a cukoroldathoz futottak a felső kamrába (5. táblázat). Így összesen 8 kísérleti felállásban végeztük e kísérletet, és mindegyik esetében 8-8 ismétlést végezve. Az eredményeket itt is a tenyészetből vett minták sejtszámának
ALSÓ FELSŐ KAMRA: KAMRA:
átlagára normáltuk.
Az összes csőrben:
1. csőr (Tc/cC)
2. csőr (Tc/cS)
3. csőr (Tc/sC)
4. csőr (Tc/sS)
5. csőr (Ts/cC)
6. csőr (Ts/cS)
7. csőr (Ts/sC)
8. csőr (Ts/sS)
médium / cukor médiumban oldva
0 M, kontr.
hatásos konc.
0 M, kontr.
hatásos konc.
0 M, kontr.
hatásos konc.
0 M, kontr.
hatásos konc.
sejtek cukorral cukoroldatból kontrollal cukorral kiegészített kontrollal szelektált sejt szelektált sejt médiumban szelektált sejt 5. táblázat: Példa a reciprok szelekció második lépésének kísérleti elrendezésére.
cukoroldatból cukorral szelektált sejt
A reciprok szelekciós vizsgálatok előtt előméréseket végeztünk annak ellenőrzésére, hogy a sejtek képesek-e a cukoroldatból a kontrollba úszni, vagyis hogy a cukrok megfigyelt repellens hatása nem a sejtek mozgásának gátlásából eredt-e, ez esetben ugyanis nem lehet elvégezni a fordított kísérletet. Ez a szelektálás első fázisával megegyező felállásban történt (4. táblázat), de ekkor a felső kamrába úszott sejteket a kemotaxis assay esetében leírt módon fixáltuk, és számoltuk. Ha a kontrolloldatból kontrollba (Tc/c), és a cukoroldatból cukorba (Ts/s) 19
futtatott sejtek száma nem tért el, akkor a fent leírt variációkat egyszerűsítettük, és csak a Ts/s (cukoroldatból cukoroldatba futott) és Ts/c (cukoroldatból kontrollhoz futott) elrendezéseket vizsgáltuk tovább. A reciprok szelekciót a reciprok szelekciós index-szel jellemeztük:
Ch rps
Ts / c C / Ts / c S Ts / s C / Ts / s S
itt kontrollként a szelekció során a cukoroldatból
cukoroldatba (Ts/s) futott sejteket használtuk, ezzel minimalizálva a ligandumok fiziológiás (nem szelekciós jellegű) hatásából eredő különbségeket. (A tört szelekciós indexhez képest fordítva történő felírásával elérhető volt, hogy ez esetben is az egynél nagyobb szám jelölje a fokozott válaszképességet.)
V.5. Friss táptalajjal történő vizsgálatok Bizonyos
kísérletekben
a
kondicionált
(sejtek
anyagcseréje/
anyagcseretermékei által módosított) táptalajt újra cseréltük, és párhuzamosan vizsgáltuk a kondicionált és friss médiumban a sejteket. Ekkor 12 párhuzamos mérést végeztünk, melyek közül hat esetben a sejteket friss táptalajjal kétszer átmostuk: 2000 rpm-en, 1 percen át centrifugáltuk, majd mindkét esetben friss táptalajjal töltöttük fel. Hat esetben a sejteket szintén hasonlóan centrifugáltuk, de a táptalajt nem cseréltük le. Mindkét mintát 5 különböző cukorkoncentrációhoz, és kontrollhoz futtattuk (6. táblázat). Minden esetben 5 párhuzamos mérést értékeltünk ki.
Egyes
kísérletekben
a
kondicionált
táptalajban
futtatott
sejteket
nem
centrifugáltuk, ezt a megfelelő helyen külön feltüntettük.
12. csőr 10-6 M
ALSÓ KAMRA:
FELSŐ KAMRA:
Az összes 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. csőrben: csőr csőr csőr csőr csőr csőr csőr csőr csőr csőr csőr médium / cukor 0 M, 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 0 M, 10-10 10-9 10-8 10-7 médiumban kontr M M M M M kontr M M M M oldva sejtek kondicionált/ sejt kondicionált médiumban sejt friss médiumban friss médiumban 6. táblázat: Friss táptalajjal történő vizsgálatok kísérleti elrendezése.
V.6. Éheztetés A logaritmikus fázisban lévő sejteket 1 percen át, 2000 rpm-en centrifugáltuk, majd 155 percre (egy osztódási ciklusidő) Losina-Losinsky (LL) oldatba (0,01g KCl,
20
0,01g MgCl2, 0,01g CaCl2, 0,1 g NaCl, és 0,2 g NaHCO3 1 ml oldatban) helyeztük. Ezután az LL oldatban oldott cukrokat tartalmazó oldatokkal végeztük el a kemotaxis assay-ket a már fent leírt módon. Öt ismétlést végeztünk. V.7. Inzulin kezelés A logaritmikus növekedési fázisban lévő sejttenyészetet kettéválasztottuk. A sejttenyészet egyik felét 10-6 M-os inzulinnal (Actrapid Penfill) kezeltük 60 percig, míg a másik csoport kontrollként szolgált. Az inkubációs idő lejártával mind a kontroll, mind az inzulinnal kezelt tenyészetet kétszer, 1 percen át, 2000 rpm-en centrifugáltuk, minkét centrifugálás után friss táptalajt adtunk a sejtekhez. Ezt követően a mintákat két módon kezeltük: az egyik esetben a sejteket 1:4 arányban friss médiummal hígítottuk, majd 12 órán át termosztátban pihentettük, ezután a logaritmikus fázisban lévő sejtekkel elvégeztük a kemotaxis assay-t. A másik esetben a kemotaxis assay-t azonnal elvégeztük. Az assay során mind a két esetben (inzulinnal kezelt, és kezeletlen csoportok) a sejtek kemotaxisát a felső kamrákba helyezett táptalaj (kontroll), glükóz (10 -10, 10-7 M), és inzulin (10-6 M) oldatok irányában vizsgáltuk. Öt ismétlést végeztünk.
Az összes 1. csőr 2. csőr 3. csőr 4. csőr csőrben: glükóz/ FELSŐ 10-10 M 10-7 M 10-6 M inzulin a kontr. KAMRA: glükóz glükóz inzulin médiumban ALSÓ sejtek friss sejt KAMRA: médiumban 7. táblázat: Inzulin kezelés során vizsgált kísérleti felállások.
5. csőr
6. csőr
7. csőr
8. csőr
kontr.
10-10 M glükóz
10-7 M glükóz
10-6 M inzulin
inzulinnal kezelt sejt
V.8. A kemotaxis assay-k statisztikai kiértékelése A kísérleteket a kemotaxis assay, a friss táptalajjal történő vizsgálat, az éheztetés és az inzulin kezelés során 5-ször, a szelekciók során 8-szor ismételve végeztük el. A nyert adatokat az Origin 8.0 Pro (OriginLab Corp, USA) statisztikai program segítségével elemeztük, a kontroll és egyes csoportok közötti eltérést tpróbával vizsgáltuk. Szignifikánsnak tekintettük az eltérést a p<0,05 értékek esetében, a bemutatott ábrák szórásai a ±S.E. (standard error) értékeket jelölik.
21
VI. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK
VI.1. Cukrok kemotaktikus hatása a koncentráció függvényében
VI.1.1. Bevezetés Mivel
kevés
irodalmi
adattal
rendelkeztünk
mono-
és
diszacharidok
protozoákra kifejtett kemotaktikus hatásáról, vizsgálatunk első célja az volt, hogy széles koncentráció-tartományban, esetlegesen több csúcsot is lefedő hatásgörbét állítsunk
fel.
A
ligandumok
mindegyikében
10-18 M-tól
10-6
M-ig
terjedő
koncentrációtartományban vizsgáltuk a kemotaktikus válaszkészséget. A glükóz és mannóz esetében ezt kiterjesztettünk 10 -18 M-tól 10-1 M-ig, tekintettel fontos biológiai szerepükre, és arra a tényre, hogy a mannózt, illetve glükózt kötő lektint már kimutatták modell-sejtünk membránjában [Csaba és Kovács, 1983; Kovács és Csaba, 1983]. Az eredmények kemotaxis indexének pontos számértékét minden mérés esetében a mellékletben közöljük (10. táblázat). VI.1.2. Széles amplitúdóval ható ligandumok során
csupán két ligandum volt képes modellsejtünk
Mannóz 200
számára
és a glükóz. Ugyanakkor már a kezdeti mérések során kiderült, hogy e szubsztrátok esetében eltérő (neutrális, vagy repellens) hatást
is
megfigyelhetünk
sejtek
fiziológiás
a
állapotának
(sejttenyészet kora, sejtszám) minimális eltérése esetén is. E csoportba sorolásuk kritériumául tehát
azt
bizonyos
állítottuk,
hogy
-
Kemotaxis index (%)
180
attraktánsként hatni: a mannóz
160
p=0,028 vs. 0,32
Vizsgálataink
140 120 100 80 60 40 20 0 contr-18-17-16-15-14-13-12-11-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1
LogC (mol/l) 3. ábra: Mannóz kemotaktikus hatása Tetrahymena pyriformison 10-18-tól 10-1 M-ig terjedő koncentrációtartományban. A szignifikáns hatásokat a szignifikancia (p) értékek feltűntetésével jelöltük.
sejtfiziológiás
22
állapotban - képesek szignifikánsan attraktánsként is hatni, az ettől eltérő hatások jellegét, és a jelenség lehetséges okait a glükóz részletesebb vizsgálata során tárgyaljuk. Az egyik, szignifikánsan attraktáns hatással bíró molekula tehát a mannóz volt, mely vonzó hatását viszonylag magas (10-6 M) koncentráción fejtette ki (121%, 160%), a kemotaxis index értékét azonban csak az utóbbi esetben találtuk szignifikánsnak (3. ábra).
szintén
mellett képes
szignifikánsan
a volt
pozitív
kemotaktikus válasz kiváltására (10-8, 10-7 M, illetve 10-10 M). E biológiailag esetében
jelentős
molekula
azonban
többször
megismételtük
a
mérést,
és
ekkor nem szignifikánsan pozitív -10
(10 , 10
-9
M), neutrális, és
szignifikánsan 10-6
M)
negatív
-10
(10 ,
eredményeket
is
regisztráltunk, még ugyanazon koncentráció
(10-10
M)
Glükóz
200
* *
180 160 140 120 100 80
*
60 40
*
20 0 -18 -17 -16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1
glükóz
mannóz
Kemotaxis index (%)
A
LogC (mol/l) 4. ábra: Glükóz kemotaktikus hatása Tetrahymena pyriformison 10-18-tól 10-1 M-ig terjedő koncentrációtartományban. A szignifikáns hatásokat csillaggal jelöltük. Az eltérések miatt több mérést tüntettünk fel.
vizsgálatakor is (4. ábra). Mind a glükóz, mind pedig a mannóz esetében láthattunk tehát eltéréseket a más-más alkalommal elvégzett kísérletek során. E hatások mértékét a fenti, koncentráció-függést leíró kemotaxis assay-ken túl az effektív koncentrációkon elvégzett többszöri mérésekkel jellemeztük (ld. "Kemotaktikus range-fitting" c. fejezet); feltételezhető okait, a módosító hatások jellegét pedig "A glükóz kemotaxisát befolyásoló tényezők" c. fejezetben szeretnénk részletesen tárgyalni. VI.1.3. Szignifikánsan repellens ligandumok Némileg a várakozással ellentétben, több egyszerű cukor is szignifikánsan repellensnek, azaz taszító hatásúnak bizonyult.
23
Az arabinóz esetében (5. ábra) a
szintén repellensként hatott. Az arabinózról fontos tudni, hogy bár ez az egyetlen
a
gyakoribb,
ezt
120 100 80 60 40 20 0
monoszacharid, amelynél a természetben az sztereoizomer
140
p=0,037
M között viszonylag széles tartományban
160 p=0,019
Kemotaxis index (%)
180
szignifikánsnak, de jól láthatóan a 10-11-10-6
"L"
Arabinóz
200
10-8 M és a 10-6 M koncentrációk bizonyultak
contr.-18 -17 -16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6
LogC (mol/l)
az
5. ábra: Arabinóz kemotaktikus hatása -18 -6 Tetrahymena pyriformison 10 M-tól 10 M-ig terjedő koncentrációtartományban.
irodalmi adatok szerint a Tetrahymena nem képes hasznosítani [Cirillo, 1962]. Ezért
kísérleteinkben a "D" sztereoizomert teszteltük; jelen eredmény azonban felveti a lehetőségét, hogy esetleg a "D" formát sem, vagy csak rossz hatékonysággal képes lebontani, ami magyarázhatja ennek a molekulának a relatíve magas koncentrációnál megfigyelhető elkerülését. A fruktóz is kifejezetten erős repellens Fruktóz
hatással bírt modell-sejtünk esetében (6.
180
120 100
p=0,047
140
A
ábra).
160 p=0,001
Kemotaxis index (%)
200
legerősebb
hatást
10-12
M
koncentráción regisztráltuk (p<0,001), az ettől kisebb és nagyobb koncentrációk esetén a
80 60
negatív
40
hatás
csökkenő
mértékben
volt
megfigyelhető, illetve a 10-9 M esetén szintén
20 0 contr-18 -17 -16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6
LogC (mol/l)
6. ábra: Fruktóz kemotaktikus hatása Tetrahymena pyriformison 10-18 M-tól 106 M-ig terjedő koncentrációtartományban.
szignifikáns
értéket
tapasztaltunk.
Bár
irodalmi adatok jelzik, hogy e molekulát a Tetrahymena képes a táptalajból felvenni, az oxigén
felhasználás
is
fokozott
fruktóz
jelenlétében [Seaman, 1951], illetve a szénizotópos jelölés igazolja, hogy be tud lépni a glikolízis folyamatába [Stein és Blum, 1979]. Fenti szerzők eredményei jelzik ugyanakkor, hogy a fruktóz hasznosítása meglehetősen rossz. A fruktózzal kiegészített táptalaj nem fokozza szignifikánsan a növekedést [Seaman, 1951], és a glikolízisbe csak tized akkora intenzitással lép be, mint a glükóz [Stein és Blum, 1979]. Tekintve, hogy az általunk használt táptalaj minden forrást tartalmazott a sejtnövekedés számára,
a
fruktóznak,
mint
energiaforrásnak használata
a
rendelkezésre álló egyéb forrásokhoz (aminosavak, glükóz) viszonyítva feltehetően nem lett volna optimális, és kellően hatékony. 24
A fruktóz és arabinóz mellett két monoszacharid származék bizonyult szignifikánsan repellensnek, a glükózamin 10-8 M, illetve az N-acetil galaktózamin 10-12 és 10-9 M-os koncentráción is ilyen hatást váltottak ki (7-8. ábra), bár ez utóbbi anyag esetében a 10-12 M koncentráción csak az egyik mérés esetén bizonyult szignifikánsnak a negatív hatás.
Kemotaxis index (%)
180
160 140 p=0,032
Kemotaxis index (%)
N-acetil galaktózamin
120 100 80 60 40 20
160 140 120
p=0,036
200
180
p=0,021 vs. 0,44
Glükózamin
200
100 80 60 40 20 0
0
contr-18-17 -16 -15 -14 -13-12 -11-10 -9 -8 -7 -6
Ctr -18-17 -16 -15-14 -13 -12 -11-10 -9 -8 -7 -6
Log C (mol/l)
Log C (mol/l)
7. ábra: Glükózamin kemotaktikus hatása Tetrahymena pyriformison 10-18 M-tól 10-6 Mig terjedő koncentrációtartományban.
8. ábra: N-acetil galaktózamin kemotaktikus hatása Tetrahymena pyriformison 10-18 M-tól 10-6 M-ig terjedő koncentrációtartományban.
Érdekes jelenség, és egyben modell-sejtünk érzékenységét is mutatja, hogy a glükóztól egy amino-funkciós csoportban eltérő molekula már egészen más hatást volt képes kifejteni. VI.1.4. Szignifikáns hatással nem rendelkező ligandumok vizsgált
esetében
anyagok
nem
közül
figyelhettünk
négy
szignifikáns hatást. Ugyanakkor jellegzetes tendenciákat
itt
is
200
meg
megállapíthatunk:
a
galaktóz esetében két pozitív optimumot kaptunk 10-17 M (138%) és 10-11 M (134%) csúcskoncentrációkkal, ez utóbbi esetében
Galaktóz
180
Kemotaxis index (%)
A
160 140 120 100 80 60 40 20 0 contr-18 -17 -16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6
a pozitív kemotaxisra jellemző haranggörbe is
jól
látható
(9.
ábra).
Ugyanakkor
szakirodalmi adatok jelzik, hogy a galaktóz
LogC (mol/l)
9. ábra: Galaktóz kemotaktikus hatása Tetrahymena pyriformison 10-18 M-tól 10-6 M-ig terjedő koncentrációtartományban.
is hasznosítható szénhidrátforrás a Tetrahymena számára: a táptalajhoz adva fokozza a sejttenyészet növekedését, így e kép egy táplálékforrásként másodlagos szerepet betöltő molekula gyenge attraktáns hatását tükrözheti [Seaman, 1951].
25
Figyelembe
Maltóz 200
egyrészt,
hogy
táplálékként is szolgálhat, másrészt azt a
180
Kemotaxis index (%)
véve
160
tényt, hogy a glükóz, illetve mannóz is a
140
fiziológiás állapottól függően eltérő hatást
120 100
fejtett ki (ld. "Kemotaktikus range-fitting" c.
80 60
fejezet)
40
nem
kizárt,
hogy
a
galaktóz
20
többszöri vizsgálata kimutatná, hogy ennél
0 contr -18 -17 -16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9
-8
-7
-6
LogC (mol/l)
erősebb (akár szignifikánsan) vonzó hatást
10. ábra: Maltóz kemotaktikus hatása Tetrahymena pyriformison 10-18 M-tól 10-6 M-ig terjedő koncentrációtartományban.
is képes kiváltani. E pontban azonban csak utalni kívántunk a galaktóz esetében a kérdés
attraktáns
hatások
hátterében
összetettségére.
Szacharóz
200
kísérlet többszöri ismétlése sem garantálná, Kemotaxis index (%)
180
hogy a ligandum - esetleges - szignifikánsan attraktáns jellege megnyilvánuljon, hiszen a széles amplitúdóval ható molekulák (glükóz, mannóz) esetében is a kísérletek jelentős
Ezt a problémát jól prezentálják a glükóz ismételt méréseinek eredményei, amit a kemotaxisát
160 140 120 100 80 60 40 20 0
hányadában semleges hatást tapasztaltunk.
glükóz
az
álló
mechanizmusok pontos tisztázása nélkül, e
"A
Azonban
contr.-18 -17-16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 6
LogC (mol/l)
11. ábra: Szacharóz kemotaktikus hatása Tetrahymena pyriformison 10-18 M-tól 10-6 M-ig terjedő koncentrációtartományban.
befolyásoló
tényezők" c. fejezetben részletesen be fogunk mutatni. A 200
Laktóz
maltózra
szintén
egy
gyenge
attraktáns hatás jellemző, 10-18 és 10-15 M
Kemotaxis index (%)
180
között,
160
illetve
a
10-9
M
koncentráción
140
figyelhetünk meg 138%-os kemotaxis indexet
120 100
(10. ábra).
80 60
A szacharóz gyenge repellensként
40 20
hat, igen széles (10-11-10-6 M) tartományban
0 contr- 18 -17 -16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6
LogC (mol/l)
12. ábra: Laktóz kemotaktikus hatása Tetrahymena pyriformison 10-18 M-tól 10-6 M-ig terjedő koncentrációtartományban.
(11. ábra). A maltóz és szacharóz hatása kapcsán érdemes megjegyezni, hogy (bár e diszacharidok
vízben
elhanyagolható
26
mértékben bomlanak) a Tetrahymena számos extracellulárisan ható szénhidrát bontó enzimet termel: alfa- és béta-glükozidáz, béta-N-acetil-glükózaminidáz szekrécióját is leírták [Müller, 1972]. Bár nincs tudomásunk róla, hogy modell-sejtünk maltáz és szacharáz enzim kibocsátására is képes lenne, ezek jelenléte nem zárható ki. Ekkor azonban a maltóz enyhe attraktáns hatása a bomlásakor keletkező glükóznak, míg a szacharóz repellens hatása a keletkezett fruktóznak tudható be. A laktóz esetében jellemző tendenciákat nem figyeltünk meg, a regisztrált ingadozás egy neutrális hatású anyag jelenlétére utal (12. ábra). VI.1.5. A ligandumok hatásossága és kémiai karakterük közti összefüggés A mono- és diszacharidok hatásossága jó összefüggést mutatott bizonyos kémiai karakterekkel. A szignifikáns hatást nem mutató, és a hatásos ligandumok legyenek azok repellensek vagy potenciálisan attraktánsok - elkülönítésére jó indexnek bizonyultak a megoszlási hányados, illetve a poláris felület értékek. A megoszlási hányados (XlogP) a ligandumnak az oktanol/víz oldószerek közti megoszlási arányára, és ezáltal
a
Megoszlási hányados és kemotaktikus aktivitás
molekulák
lipofil/hidrofil jellegére utal (a
a nullához közeli érték a lipofil molekulákra
jellemzőek).
E
paraméter alapján két csoportot lehetett felállítani: a maltóz, laktóz,
szacharóz
alacsony
(-4-nél
kisebb)
értékkel
rendelkezik, míg a mannóz, glükóz,
arabinóz,
glükózamin,
fruktóz, N-acetil-
180
Kemotaxis index (%)
negatívabb értékek hidrofil, míg
(LIPOFILEBB)
200 (HIDROFILEBB)
glükóz
160
mannóz
140 120 100
galaktóz
maltóz laktóz
arabinóz
80 60
szacharóz
N-acetil gal. fruktóz
40 20 -5,0
glükózamin -4,5
-4,0
-3,5
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
Megoszlási hányados (XlogP) 13. ábra: Mono- és diszacharidok maximális attraktáns ill. minimális repellens értékei a megoszlási hányados (XlogP) értékeik függvényében. [Forrás: PubChem Project]
galaktózamin és a galaktóz pozitívabb (-3-nál magasabb) megoszlási hányados értékkel jellemezhető (13. ábra, melléklet: 12. táblázat). A -4-nél alacsonyabb értékkel rendelkező, azaz hidrofilebb molekulák jellemzően nehezebben jutnak át a membránon, mint a lipofilek (pozitívabb értékkel rendelkezők). Ezzel összhangban az első csoport tagjai (diszacharidok) nem fejtettek ki szignifikáns hatást, míg a második csoport elemei vagy szignifikánsan repellens, vagy (legalább egy kemotaxis assay 27
során) szignifikánsan attraktáns hatással bírtak. Az egyetlen kivétel a galaktóz, amely bár a második csoportba tartozik, nem váltott ki szignifikáns hatást. Itt szeretnénk visszautalni a galaktóz esetében már tárgyalt problémára, miszerint az, hogy egy anyag esetében nem regisztráltunk szignifikánsan attraktáns hatást (a glükóz és mannóz esetén megfigyelhető változó válaszkészség alapján), nem feltétlen jelenti azt, hogy más korú, hormonok és bomlástermékek mennyiségében eltérő sejttenyészet esetén sem lehetne azt kimutatni. Kémiai jellemzői alapján tehát a galaktóz mindenképp az effektív molekulák csoportjában sorolandó. A poláris felület értékek
Poláris felület és kemotaktikus aktivitás
még jobb közelítést adhatnak. ún.
"Topological
Polar
Surface Area" a poláris atomok, és azokhoz kapcsolódó hidrogén atomok
által
meghatározott
felületre
ad
egy
értéket.
Ezt
az
számszerű értéket
gyógyszerkémiában
a
annak
Kemotaxis index (%)
Az
200 180
glükóz
160
mannóz
140
maltóz
galaktóz
120 100 80
laktóz
arabinóz fruktóz
szacharóz
N-acetil gal.
60 40
glükózamin
20 80
100
120
140
160
180
200
2
becslésére használják, hogy a kérdéses
anyagra
mértékben membrán.
milyen
permeábilis A
140
a
A2–nél
Poláris felület (TPSA) (A ) 14. ábra: Mono- és diszacharidok maximális attraktáns, ill. minimális repellens értékei a poláris felület (Topological Polar Surface Area; TPSA) értékeik függvényében. [Forrás: PubChem Project]
nagyobb értékkel rendelkező molekulák jellemzően nem jutnak át a membránon. A fenti csoportosítással egybecsengően, az első csoport tagjai (maltóz, laktóz, szacharóz) 140 A2–nél nagyobb poláris felület értékkel bírnak, tehát feltehetően nem jutnak be a sejtbe. Az összes többi vizsgált anyag, mely - ismét a galaktóz kivételével - hatásos volt, 140 A2–nél kisebb poláris felülettel rendelkezik, tehát bejut a sejtbe (14. ábra, melléklet: 12. táblázat). Ez az összefüggés azonban okot ad arra a következtetésre, hogy a vizsgált anyagok kemotaktikus potenciáljának mértéke nem egy, a felszíni membránban expresszálódó receptor indukciójának egyedüli következménye, hanem részben vagy egészében e molekulák sejtbe történő bejutása, majd metabolizációja is befolyásolhatja a sejtek mozgásállapotának alakulását. Bár kemotaxis kapcsán nem tudunk olyan publikációról, amely ehhez hasonló mechanizmust feltételezett volna a kemotaktikus válasz hátterében, a (szénhidrátok szerepét bemutató 28
fejezetben tárgyalt) pancreatikus vércukorszint érzékelés jó példa arra, hogy egy specifikus anyagcsereút is finom és összetett érzékelést tesz lehetővé.
VI.1.6. Kemotaktikus range-fitting
tapasztaltunk
az
attraktáns és a repellens hatást
kiváltó
iránti
molekulák
válaszkészség
amplitúdójában:
míg
a
potenciálisan
attraktáns
ligandumok
esetében
tágabb
határok
közt
mozgott a kemotaxis index értéke
(attraktáns
semleges
-
-
enyhén
140 120 100
p=0,028
160
p=0,036
meghatározásakor jellemző
p=0,021 p=0,018
180
Kemotaxis index (%)
többszöri
eltérést
Kemotaktikus range-fitting
200
p=0,032
hatásainak
p=0,020 p=0,00059 p=0,0048
koncentrációk
p=0,0035
effektív
p=0,019
Az
80 60 40 20 0
) 2) 7) 8) 9) -8) 12) in (- min (-1 min (- nóz (-6 ükóz (óz ( któz (m n i a l a b n g za óz óz m a fru ar a glük galaktó galak t l i l i t t e ce N-ac N- a
--
15. ábra: A vizsgált cukrok szignifikánsan attraktánsan és szignifikánsan repellensen ható koncentrációinak ismételt mérései. A glükóz esetében a leghatásosabb attraktáns koncentráción, és csak a legjellemzőbb hatásokat mutattuk be.
repellens), a repellens ligandumok minden esetben megőrizték taszító hatásukat (15. ábra). A tapasztalt eltérés azért tűnik kifejezetten érdekesnek, mert az igen hasonlít több kemotaktikus ligandum (aminosavak, oligopeptidek) esetében már megfigyelt, és kemotaktikus range-fitting néven leírt jelenséghez [Kőhidai és mtsai, 2003b], amely szerint az attraktáns molekulákhoz a kemotaktikus válaszkészség viszonylag széles, míg a repellensekhez a válaszkészség keskeny amplitúdója kapcsolható. Az széles amplitúdóval ható molekulák esetében tehát a szignifikánsan attraktánstól a neutrális tartományon át akár az enyhén repellensig érő hatásamplitúdó jellemző. Ezt jól megfigyelhetjük a glükóz esetében, ahol a szignifikánsan attraktáns, 180 %-ot meghaladó kemotaxis mellett (10-7 M) még szignifikánsan repellens hatást is tapasztalhattunk (10 -6 M); vagy a mannóz esetében, ahol a szignifikánsan attraktáns hatást kifejtő koncentráción (10 -6 M) taszító hatást is mérhettünk. A galaktóz esetében szignifikánsan attraktáns koncentráció hiányában nem végeztünk ismétléseket, de a szelekció eredményei szintén arra utalnak, hogy e 29
molekula esetében is a sejt szükségleteitől függően eltérő válaszokat kaphatunk (ld. "Kemotaktikus szelekció"). Ezzel ellentétben a repellens hatást kifejtő ligandumok ha nem is mindig szignifikánsan, de konzekvensen taszító hatással bírtak. A hatásos koncentrációk újramérése során a legmagasabb kemotaxis index értéket az arabinóz esetében tapasztalhattunk, amely megközelítette a semleges hatást (96 %), minden más repellens ligandum az ismétlés során is repellens hatással bírt, amely több esetben, (fruktóz, N-acetil galaktózamin) újfent szignifikánsnak is bizonyult. A szénhidrátok esetében okkal feltételezhetjük, hogy ennek hátterében a vizsgált cukrok sejtélettani funkciója áll. A glükózról, mannózról (és emellett a galaktózról is) tudjuk, hogy táplálékforrást jelentenek modell-sejtünk számára, így nem meglepő, hogy a sejt szükségletétől függően eltérő (vonzó, vagy akár taszító) hatást is kifejthetnek. A repellensek azonban, úgy tűnik, nem képesek (kielégítő) táplálékforrásként szolgálni, hatásuk nem, vagy csak kis mértékben függ a fiziológiás állapottól, feltehetően jelmolekulákként, szignálként hathatnak a sejtre. Ez a szénhidrátok kemotaxisában megmutatkozó kettősség jól egybeillik a bevezetésben bemutatott Lenhoff-féle szignálevolúciós hipotézissel is [Lenhoff, 1974].
30
VI.2. A kemotaktikus szelekció
VI.2.1. A kemotaktikus szelekció jelentősége A kemotaktikus szelekció lényege, hogy pozitívan, vagy negatívan válaszoló szubpopulációkat különítünk el, amelyeket később (70 generáció múlva) újra tesztelünk. Ha a szelektáló ligandummal végzett második kemotaxis assay során fokozott válaszkészséget tapasztalunk, az egy ún. "long-term" receptor jelenlétére utalhat, amely genetikailag egy az egyben kódolt, állandó komponense a membránnak. Ha nem figyelhető meg fokozott válasz, az a "long-term" receptorok hiányát jelzi. Ez esetben két módon hathat a vizsgált anyag: egyrészt egy ún. "shortterm" receptoron át, amely több komponensből áll, és csak a ligandum jelenlétében, átmenetileg képez komplexet, ezért rosszul szelektálható. Másrészt előfordulhat, hogy
hatását
nem
egy
membrán-receptor
közvetíti,
hanem
a
ligandum
metabolizációja során, specifikus anyagcsereutak folyamán hat.
VI.2.2. Kemotaktikus szelekció A szignifikánsan pozitív választ is kiváltó anyagokon túl a gyengébb attraktáns hatást kiváltókat is teszteltük. Utóbbi esetben a populációnak csak egy kisebb hányada reagált a ligandumra, ezeket szelektálva azonban esély volt arra, hogy az adott anyagra specifikus, "long-term" receptor működését kimutassuk. A repellens anyagok esetében is végezhetünk pozitív szelekciót. Ennek alapja, hogy egy kevert populáció vizsgálatakor, ha a sejtek többsége elkerülő választ mutat is, nem zárható ki egy kisebb, de jellemző szubpopuláció jelenléte sem, mely karakterisztikusan, esetleg genetikailag is rögzült formában pozitív választ ad a ligandumra. Ezek szelektálásával meg van az esélyünk arra, hogy egy homogénebb viselkedésű, fokozottan pozitívan válaszoló szubpopulációt különíthessünk el, amely ugyanúgy igazolhatja egy "long-term" receptor jelenlétét. Az arabinóz és a fruktóz esetén (15. ábra, 8. táblázat, melléklet: 13. táblázat) alapvetően repellensen ható szubsztrátokat vizsgáltunk olyan koncentráción, ahol kis mértékben attraktánsként hatottak. A gyenge attraktáns hatás a kontrollal szelektált populáció esetén is megmutatkozott (Tc/cS), kemotaxis index értéke 114% az arabinóz, 135% a fruktóz esetében, de a szelekciós index értéke mindkét esetben 1-nél kisebb, tehát "long-term" receptorhoz köthető hatást nem figyelhettünk meg.
31
A glükóz és mannóz az ismételt mérés során nem váltott ki fokozott választ (15. ábra, 8. táblázat, melléklet: 13. táblázat), a szelekciós index értéke egyhez közeli, tehát esetükben sem feltételezhetünk "long-term" receptort.
9)
16
)
11
z tó al m
m
ga
al
la
tó
kt
z
(-
(-
(óz
(óz kt la
m
gl
ga
ük
an
óz
nó
z
(-
(-
7)
6)
) 17 (z tó uk fr
10
)
) 13 (óz in ab
160
ar
Kemotaxis index (%)
180
)
K e m o t a k tik u s s z e le k c ió
200
140 120 100 80 60 40 20 Tc/c-->C (contr.) Tc/c-->S Tc/s-->C Tc/s-->S ---
Tc/c-->C (contr.) Tc/c-->S Tc/s-->C Tc/s-->S
Tc/c-->C (contr.) Tc/c-->S Tc/s-->C Tc/s-->S
Tc/c-->C (contr.) Tc/c-->S Tc/s-->C Tc/s-->S
Tc/c-->C (contr.) Tc/c-->S Tc/s-->C Tc/s-->S
Tc/c-->C (contr.) Tc/c-->S Tc/s-->C Tc/s-->S
Tc/c-->C (contr.) Tc/c-->S Tc/s-->C Tc/s-->S
Tc/c-->C (contr.) Tc/c-->S Tc/s-->C Tc/s-->S
0
15. ábra: Szelekció hatása a Tetrahymena pyriformis kemotaxisára. A cukrok neve mögött a szelekciónál alkalmazott koncentrációk logC értékét tüntettük fel. A nyilak a szignifikancia fokát jelölik: fekete nyíl - p<0.05; rózsaszín nyíl - p<0,01. arabinóz
fruktóz
glükóz
mannóz
galaktóz
galaktóz
maltóz
maltóz
LogC (M)
-13
-17
-7
-6
-10
-11
-9
-16
Chsel
0,85
0,61
1,01
0,89
1,82
1,00
1,15
0,91
8. táblázat: A kemotaktikus szelekció során kapott szelekciós index értékek. A cukrok neve alatt a vizsgált koncentráció logC értékét tüntettük fel. (A Chsel számításánál közölt értékek egyszeri vizsgálat eredményét tükrözik, így tájékoztató jellegűek.)
A maltóz enyhe attraktáns hatással bírt a több koncentrációt felölelő vizsgálatok során, a szelekciós vizsgálatokban azonban enyhén repellensnek bizonyult (15. ábra, 8. táblázat, melléklet, 13. táblázat). Ebben szerepet játszhatott, hogy a szelekció első lépésében a friss táptalajjal, mint kontrollal szelektált sejtek (Tc/c) is átestek egyfajta, a későbbi válaszkészségben is megmutatkozó szelekción. A sejtek élettani folyamatai és az anyagcseretermékek környezetbe kerülése által módosított/kondícionált
táptalaj,
és
a
friss
táptalaj
között
a
hormonok,
bomlástermékek koncentrációjának fokozatos emelkedése, illetve a rendelkezésre álló tápanyagok szintjének csökkenése miatt is jelentős különbség lehet, így az első lépésben
kialakított
szubpopulációk
(Tc/c,
Tc/s)
egyike
sem
tekinthető
a
törzstenyészettel teljes mértékben megegyezőnek. Bár a maltózt két koncentráción is
32
vizsgáltuk, de a 10-10 M-os esetében nem, a 10-9 M-os esetében pedig csak enyhe szelekciós hatást figyelhettünk meg, ebből összességében arra következtettünk, hogy a maltóz esetében "short-term" receptor, vagy a specifikus anyagcsereút volt jellemző (amennyiben a (nem szignifikáns) hatást nem a véletlen ingadozás váltotta ki) (15. ábra, 8. táblázat). A galaktóz esetében is két koncentráción vizsgáltuk a szelekció hatását. Nagyobb koncentráción, 10-10 M-os töménységben tesztelve látszólag igen erősen megnőtt a sejtek válaszképessége (Chsel=1,82, azaz majdnem kétszeresére nőtt a pozitívan reagáló sejtek aránya) (15. ábra, 8. táblázat). Ugyanakkor a 10-11 M-os koncentráción a sejtek nem mutattak fokozott válaszkészséget, a szelekciós index értéke Chsel=1 volt. A szelekciós index azonban csak abban az esetben írja le korrekten a szelekció mértékét, ha a kontrollal és a cukorral szelektált populáció azonos módon válaszol - vagy két attraktáns, vagy két repellens hatást vetünk össze. A nagyobb koncentráción történő vizsgálat során azonban feltehetően a két vizsgált szubpopuláció (Tc/c, Tc/s) különbözött egymástól a sejtszám, médium összetétele terén, az azonos tenyésztési feltételek ellenére is, és (a szignifikánsan attraktáns molekulákhoz hasonló módon) eltérő választ indukált a két szubpopulációban. Míg a kontrollal szelektált csoport esetén a galaktózt a sejtek kifejezetten repellensként érzékelték,
addig
a
galaktózzal
szelektált
csoport
ugyanilyen
mértékben
attraktánsnak érzékelte azt, és e két ellentétes (és feltehetően a szelekció folyamatától független) hatás eredményeként kaptunk magas szelekciós indexet. A kisebb koncentráción végzett szelekció esetében a két szubpopuláció nem különbözött jelentősen, mindkettő számára közel semleges volt a galaktóz jelenléte; és mivel ekkor egyáltalán nem tapasztaltunk fokozott válaszkészséget (Ch sel=1), összességében azt mondhatjuk, hogy a "long-term" receptor a galaktózra sem jellemző. VI.3. Reciprok szelekció Bár a kemotaktikus szelekció is lehetővé teszi a repellens ligandumok tesztelését, e cukrok vizsgálatára sokkal alkalmasabbnak tűnt egy olyan módszer, ahol a repellens ligandumok szelekciós potenciálját azon a koncentráción vizsgáljuk, ahol kifejtették taszító hatásukat.
33
VI.3.1. Elővizsgálat A reciprok szelekció előtt egy elővizsgálatban ismételten igazoltuk, hogy a szubsztrát a kiválasztott koncentráción érvényesíti repellens hatását, ezzel együtt pedig megfigyeltük, hogy a fordított elrendezés során képesek-e a sejtek az alsó
(-
(-
ga ce -a N
fr
gl
uk
ük
tó
óz
z
ti l
(-
am
12
in
l.
)
8) (óz in ab
160
ar
Kemotaxis index (%)
180
8)
E lo v iz s g á la t
200
9)
kamrából a felsőbe vándorolni, azaz a repellens hatás nem a sejtek mozgásának
140 120 100 80 60 40 20 --
--
Ts/s
Ts/c
Tc/s
Tc/c (contr.)
Ts/s
Ts/c
Tc/s
Tc/c (contr.)
Ts/s
Ts/c
Tc/s
Tc/c (contr.)
Ts/s
Ts/c
Tc/s
Tc/c (contr.)
0
16. ábra: Reciprok szelekció elővizsgálata Tetrahymena pyriformis modell-sejten. A cukrok neve mögött a vizsgált koncentrációk logC értékét tüntettük fel. A nyilak a szignifikancia fokát jelölik: fekete nyíl - p<0.05; rózsaszín nyíl - p<0,01.
gátlásából eredt. Az eredmények alapján (16. ábra, melléklet: 14. táblázat) elmondhatjuk, hogy a vizsgált anyagok nem gátolták a mozgást, a cukoroldatból médiumba (Ts/c) mindenhol legalább a kontrollal (Tc/c) összevethető mértékben úsztak fel a sejtek. Ezen felül, a fruktóz és a glükózamin esetében a fordított felállásban is jól látható a cukrok taszító hatása: a cukoroldatból kontrollhoz futó sejtek (Ts/c) kemotaxis index értéke jelentősen magasabb, mint a kontroll csoporté (Tc/c). Az elővizsgálat során a Tc/c és a Ts/s populációk (azaz a két potenciális kontroll, ahol nem feltételezhető gradiensek kialakulása) a fruktóz és glükózamin esetében nem különböztek jelentősen, így csak a Ts/c és Ts/s populáción végeztük el a reciprok szelekciót. Eltérést tapasztaltunk azonban az arabinóz és kis mértékben ugyan, de az N-acetil galaktózamin esetében is. Mivel ez utóbbinál (a glükózaminnal ellentétben) a cukor taszító hatását sem figyelhettük meg (Ts/c=108 %), mindkét ligandum esetében mind a négy (Tc/c, Tc/s, Ts/c, Ts/s) szubpopulációra elvégeztük a kísérletet. 34
VI.3.2. Reciprok szelekció repellens ligandumokra A reciprok szelekció eredményeiről összefoglalóan elmondhatjuk, hogy egyetlen
vizsgált
repellens
monoszacharid
vagy
monoszacharid
származék
irányában sem lehetett szelektálni (17. ábra, melléklet: 14. táblázat), a szelekciós index értékek nem haladják meg az 1-et (9. táblázat), tehát modell-sejtünk e ligandumokra nem rendelkezik "long-term" receptorral.
(-
8)
l.
(-
ga -a N
fr
gl
uk
ük
tó
ce
z
óz
t il
am
12 (-
(óz in ab ar
Kemotaxis index (%)
160
in
)
8)
180
140
9)
R e c ip r o k s z e le k c ó
200
120 100 80 60 40 20
--
Ts/s-->S
Ts/c--S
Ts/s--C
Ts/c--C
Tc/s--S
Tc/s--C
Tc/c--S
Tc/c--C
Ts/c-->S
Ts/c-->C
Ts/s-->S
Ts/s-->C (contr.)
Ts/c-->S
Ts/c-->C
Ts/s-->S
Ts/s-->C (contr.)
Ts/s--C
Ts/s-->S
Ts/c--S
Ts/c--C
Tc/s--S
Tc/s--C
Tc/c--S
Tc/c--C
0
17. ábra: Reciprok szelekció hatása a Tetrahymena pyriformis kemotaxisára. A cukrok neve mögött a szelekciónál alkalmazott koncentrációk logC értékét tüntettük fel. A nyilak a szignifikancia fokát jelölik: fekete nyíl - p<0.05; rózsaszín nyíl - p<0,01. arabinóz
fruktóz
glükózamin
N-acetil gal.
LogC (M)
-8
-12
-8
-9
Chrps
0,72
0,90
1,00
0,94
9. táblázat: A reciprok szelekció során kapott szelekciós index értékek. A cukrok neve alatt a vizsgált koncentráció logC értékét tüntettük fel. (A Chrps számításánál közölt értékek egyszeri vizsgálat eredményét tükrözik, így tájékoztató jellegűek.)
A tradicionális kemotaktikus szelekció, és a reciprok szelekció alkalmazásával tehát a "long-term" receptort egyetlen vizsgált anyag esetében sem tudtuk igazolni, a kísérletben résztvevő anyagok esetében vagy "short-term" receptor közvetítését, vagy specifikus anyagcsereút jeltovábbító szerepét feltételezhetjük.
35
VI.4. A glükóz kemotaxisát befolyásoló tényezők
a
eltért
a
különböző alkalmakkor végzett méréseknél.
Különösen
szerepét is figyelembe véve, ezt molekulát
választottuk
kemotaxist
a
befolyásoló
tényezők
felderítését
40 20 0
igaz
volt ez a glükózra, így biológiai
glükóz 6
60
-6, Új
attraktánsok hatása
glükóz 4
80
-7, Új
potenciálisan
glükóz 5
100
-8, Új
a
120
-9, Új
hatásukat,
kiváltják
140
-10, Új
konzekvensen
160
-6, Er
molekulák
180
-7, Er
repellens
míg
8, Er
hogy
200
-10, Er
tapasztaltuk,
a
Glükóz - kondicionált és friss tápú sejtetekkel
alkalommal Kemotaxis index (%)
számos
során
-9, Er
Vizsgálataink
LogC (mol/l) 18. ábra: Glükóz kemotaktikus hatása Tetrahymena pyriformis-on. Az ábra bal oldalán feltüntetett eredmények kondicionált ("Er"), a jobb oldalon láthatóak friss ("Új") táptajaba helyezett sejtektől származnak. Csak a friss tápba helyezett sejteket centrifugáltuk.
célzó
további kísérleteinkhez. VI.4.1. Párhuzamos vizsgálatok elve sejtek,
miután
médiumba
oltjuk
folyamatosan
módosítják
tápoldat
tartalmát.
új
a
Egyrészt
felhasználják a tápanyagokat, és extracelluláris enzimeikkel bontják a nagyobb molekulákat [Müller,
1972].
Glükóz - kondicionált és friss tápú sejtetekkel
őket
Másrészt
200 180
Kemotaxis index (%)
A
160
* glükóz 8
140
glükóz 7
120 100
glükóz 9
80
glükóz 10
60 40 20
szecernálnak a médiumba. Az így termelt anyagok egyrészt módosítják a sejt anyagcseréjét (pl.: cAMP [Voichick és mtsai,
-6, Új
-7, Új
-8, Új
-9, Új
-10, Új
is
-6, Er
hírvivőket
-7, Er
másodlagos
8, Er
és
-9, Er
termelnek,
-10, Er
0
hormonokat
LogC (mol/l) 19. ábra: Glükóz kemotaktikus hatása Tetrahymena pyriformis-on. Az ábra bal oldalán feltüntetett eredmények kondicionált ("Er"), a jobb oldalon láthatóak friss ("Új") táptalajba helyezett sejtektől származnak. A friss tápba helyezett, és a kondicionált tápban futtatott sejteket is centrifugáltuk előzőleg. A szignifikanciát csillaggal jelöltük (p<0,05)
1973] és inzulin [Csaba és Nagy, 1976]; másrészt önmagukban is kemotaktikus hatással bírnak. Például az 36
inzulin attraktáns [Csaba és Kovács, 1993], míg a melatonin repellens [Kőhidai és mtsai, 2002b]. Ezek alapján feltételeztük, hogy a kondicionált (sejtek által módosított) médium hatással van a kemotaktikus válaszra is. Ezért párhuzamos kísérleteket végeztünk, ahol friss tápoldatba és
médiumban
a
kondicionált
hagyott
sejtek
kemotaktikus válaszát vizsgáltuk glükóz irányában. A vizsgálat koncentrációtartományát 10-10 M - 10-6 M közt jelöltük ki, mivel korábban
ebben
a
Glükóz - kondicionált tápú sejtetekkel 200
sávban
figyelhettünk meg szignifikáns
*
180
Kemotaxis index (%)
helyezett,
*
160 glükóz 1
140 120 100
glükóz 2
80 60
glükóz 3
*
*
40 20
újabb
eredmények
során azonban azt tapasztaltuk, hogy
bár
a
glükóz
képes
attraktánsként hatni, az esetek többségében
neutrális
hatást
-6, Új
-7, Új
-8, Új
-9, Új
-6, Er
-7, Er
8, Er
-10, Új
Az
-9, Er
-10, Er
0
hatást (20. ábra).
LogC (mol/l) 20. ábra: Glükóz kemotaktikus hatása Tetrahymena pyriformis-on. A korábbi, kondicionált táptalajban mért ("Er"), szignifikáns eredmények az effektív tartományban, melyekhez még friss táptalajban mért párhuzamos eredmény nem tartozik. A szignifikanciát csillaggal jelöltük (p<0,05)
mutat. Így a legtöbb mérés során nem figyelhettünk meg különbséget a kondicionált, és a friss tápban mért kemotaxis közt (18 - 19. ábra, melléklet: 10 - 11. táblázat). Szeretnénk azonban kiemelni a "glükóz 10."-el jelölt mérést (19. ábra), ahol a kondicionált médiumban 10-10 M koncentráción szignifikánsan attraktáns hatást tapasztaltunk, míg a lecserélt táp esetén minden koncentráción csak neutrális jellegű hatást láthattunk. VI.4.2. Éheztetés Az
egyik,
a
glükóz
hatását
befolyásoló
tényező
a
sejtek
tápanyagellátottsága/igénye lehet. Ezért a következő kísérletünkben azt kívántuk tesztelni, hogy az éheztetés befolyásolja-e a glükózra adott kemotaktikus választ, vagyis a glükóz által kiváltott kemotaxis hátterében tényleg a táplálék felkutatása áll-e?
37
éheztetett
(szignifikánsan)
sejtekben
nagyon
pozitív,
erősen
ám
kevéssé
specifikus, széles koncentrációtartományban megnyilvánuló választ váltott ki (21. ábra). A
180
p=0,0086
200
p=0,0034
várakozásainkat: a táplálékmolekula jelenléte az
Glükóz
meg
p=0,034
cáfolták
p=0,0018
nem
Kemotaxis index (%)
Eredményeink
160 140 120 100 80 60 40 20 0 Contr.
glükóz kemotaxisra kifejtett hatása tehát szoros
összefüggést
mutat
e
molekula
táplálékként betöltött szerepével.
VI.4.3. Inzulin kezelés
10
9
8
7
6
LogC (mol/l)
21. ábra: Glükóz kemotaktikus hatása éheztetett Tetrahymena pyriformis sejteken. A szignifikáns hatásokat a szignifikancia (p) értékének feltűntetésével jeleztük.
Végül szerettük volna a szénhidrát anyagcserével szoros kapcsolatot mutató hormon, az inzulin hatását vizsgálni modell-sejtünkön. Az inzulin kezelés hosszú távú (1-21 nap) hatásai közt szerepel az inzulin termelésének kiváltása mellett [Csaba és Kovács, 1995] az inzulin receptor down-reguláció is [Csaba és Kőhidai, 1986]. Arról azonban nincs információnk, hogy a magasabb inzulinszint és a receptorok összességében Glükóz
200
milyen hatással van sejtek által termelt inzulin
válaszkészségét
vizsgáltuk
a
két
szignifikánsan attraktánsnak bizonyult glükóz koncentráció (10-10, 10-7 M), valamint inzulin (10-6
M)
jelenlétében;
ezzel
is
egy
p=0,017
60 40 20 0 Inz--> Inz -6
a kontroll, mind a kezelt sejtek kemotaktikus
80
Inz--> Gl. -7
hormonkezelési idő mellett döntöttünk. Mind
100
Inz--> Gl -10
Ezért elsőként egy rövidebb, 1 órás
120
Contr--> Gl. -7
növelheti azt.
140
Contr--> Gl. -10
végeredményben akár csökkentheti, akár
160
Contr--> Contr
érvényesülésére;
Kemotaxis index (%)
hatásainak
180
Inz--> Contr
csökkenése
Contr--> Inz -6
számának
LogC (mol/l)
22. ábra: Glükóz kemotaktikus hatása inzulinnal kezelt Tetrahymena pyriformis sejteken. A szignifikáns hatásokat a szignifikancia (p) értékének feltűntetésével jeleztük.
visszajelzést nyerve arról, hogy az inzulin hatása érvényesült-e. Eredményeink azt mutatják, hogy a glükóz által kiváltott kemotaxist nem befolyásolta a kezelés, enyhe repellens hatást láthatunk mind az inzulin előkezelés ellenére, és a kontroll csoportnál egyaránt (22. ábra). Ugyanakkor az inzulin, mint kemotaktikus ligandum másképp hatott a kezelt, és a nem kezelt sejtekre: míg a 38
kontroll számára szignifikánsan repellens volt, az inzulinnal kezelt sejtek esetében csak enyhe repellens hatást fejtett ki. Ennek egyik oka lehet, hogy az inzulin kezelés ténylegesen megváltoztatta a sejtek inzulin irányába mutatott kemotaxisát, ugyanakkor az is szerepet játszhatott, hogy a hormonkezelés inzulin termelést váltott ki a sejteknél, így a kezelt populáció esetében megváltozhatott (adott esetben csökkent) az inzulin gradiens. Tekintve, hogy egy óra alatt az inzulin nem fejtett ki hatást a glükóz kemotaxisára, megismételtük a kísérletet úgy, hogy az inzulin kezelés után 12 órával végeztük el a futtatást. Ekkor a kontroll csoport esetében a glükóz enyhén repellensnek bizonyult (10-10 M esetében 80% a kemotaxis index), míg az inzulinnal kezelt csoport esetében 10-10 M koncentráción szignifikánsan attraktáns (kemotaxis index: 144%), 10-7 M koncentráción pedig közel semleges hatást figyelhettünk meg 200
(23. ábra). Elmondhatjuk tehát, hogy az inzulin p=0,031
Glükóz
Kemotaxis index (%)
180 160
fokozva a glükóz metabolizációt feltehetően megnövelte a sejt energiaigényét, így fokozta
140 120
a glükóz irányába mutatott kemotaxist is.
100 80
Ennek a hormonnak tehát kulcsszerepe lehet
60 40
(szénhidrátok esetén) a sejttenyészet korától
20 Inz--> Inz -6
Inz--> Gl. -7
Inz--> Gl -10
Inz--> Contr
Contr--> Inz -6
Contr--> Gl. -7
Contr--> Gl. -10
Contr--> Contr
0
LogC (mol/l)
23. ábra: Glükóz kemotaktikus hatása inzulinnal kezelt, és további 12 órán át tenyésztett Tetrahymena pyriformis sejteken. A szignifikáns hatásokat a szignifikancia (p) értékének feltűntetésével jeleztük.
függő kemotaktikus válasz kialakításában. Emellett fontos kiemelni, hogy az éheztetéssel ellentétben, ahol a cukor attraktáns hatását lényegében
minden
megfigyelhettük, következtében specifikus
az
koncentráción inzulin
modellsejtünk
kemotaktikus
kezelés
koncentráció-
választ
adott
a
glükózra. Az inzulinra, mint kemotaktikus ligandumra adott válasz hasonló eltérést mutat a kezelt és kontroll populáció esetében, mint az egyórás kezelés, és azonnali futtatás után: míg a kontroll csoport repellensként reagál a hormonra (bár ez esetben a hatás nem volt szignifikáns), a hormonnal kezelt csoport esetében semleges hatást tapasztalhattunk. Az inzulinon kívül azonban más hormonoknak, mediátoroknak is szerepe lehet a fiziológiás állapottól függő válaszkészség kialakításában. Ezért számításba kell vegyük, hogy bár a kontroll és inzulinnal kezelt sejtek közös sejttenyészetből származtak, az inzulin kezelést követő 12 órában a két populációt külön 39
tenyésztettük, ezért (az inzulin által kiváltott hatásokon felül) bizonyos eltérések lehettek a két sejttenyészet közt hormonok, anyagcseretermékek terén. Figyelembe véve azonban hogy a kezelt és kezeletlen populációt csak a futtatás előtt 12 órával választottuk szét, e rendkívül nagymértékű eltérés (80% - 144% 10-10 M glükóz esetében) csak a hormonkezelésnek tudható be. Összefoglalva tehát kísérleteinket, elmondhatjuk, hogy az inzulin képes befolyásolni a szénhidrát anyagcserét, és ezáltal a glükózra adott kemotaktikus választ is. A hormon az általunk vizsgált időintervallumban, és koncentrációban semleges (azonnali futtatás), vagy kemotaxist fokozó (késleltetett futtatás) hatással bírt, nem zárható ki azonban, hogy kisebb vagy nagyobb koncentrációban ettől eltérő, akár a glükóz irányába mutatott kemotaxist csökkentő hatással is bírhat. Emellett valószínűsíthető, hogy az attraktánsok változó kemotaktikus potenciálja nem csak az inzulin, hanem más hormonok, vagy mediátorok (pl.: cAMP) szintjétől is függ. A hormonok és szénhidrátok kapcsolata, hatásuk a kemotaxisra azonban igen összetett téma, melynek részletes vizsgálata és megválaszolása már nem képezi e szakdolgozat tárgyát.
40
VII. KÖVETKEZTETÉSEK
VII.1. A szénhidrátok kemotaktikus potenciálja, a három fő választípus A Tetrahymena pyriformis eukarióta csillóson, mint modell-sejten elvégzett vizsgálatok eredményeinek értékelése alapján elmondhatjuk, hogy a választott modell-sejt érzékeny alanynak bizonyult a szénhidrát ligandumok kemotaktikus karakterének vizsgálata során is. A ligandumok közti minimális eltérés is (pl. aminocsoport megléte, vagy hiánya a glükóz és glükózamin kapcsán, aldóz - ketóz forma eltérése a glükóz és a fruktóz esetében) eltérő hatást volt képes kiváltani. A vizsgált ligandumok jellemzően alacsony (10-12 - 10-6 M) tartományban voltak hatásosak, amely a reakció specifitását jelzi. A vizsgált cukrok kemotaktikus hatása, a hatás amplitúdója, és ezen jellemzők kémiai háttere alapján három csoportot tudtunk elkülöníteni:
Az első csoport: a széles amplitúdóval ható molekulák. Ide sorolható a glükóz és a mannóz, mely képes volt szignifikánsan attraktáns hatás kialakítására, illetve a galaktóz, amely bár szignifikáns hatást nem váltott ki, több jellemzője alapján is (kémiai karakter, széles amplitúdójú válaszkészség) e csoportba sorolandó. A
glükózra
és
mannózra
jellemző,
hogy
ismételt
vizsgálata
során
szignifikánsan attraktáns, semleges, sőt akár repellens hatást is mérhettünk, galaktóz esetében ehhez hasonló eltéréseket a szelekció során vizsgált szubpopulációk közt láthattunk. E tapasztalat jól összecseng a már korában kemotaktikus range-fitting néven leírt jelenséggel, amely az attraktáns molekulák kemotaktikus hatásához szélesebb, míg a repellensekhez keskenyebb amplitúdót rendel. A csoport mindhárom tagjáról tudjuk, hogy megfelelő tápanyagok Tetrahymena számára [Seaman, 1951], így az irányukban mutatott változó válaszkészség feltehetően a sejtek (hormonok és mediátorok által szabályozott) pillanatnyi tápanyagigényét tükrözi. Ezt igazolja a glükóz éheztetése során megmutatkozó igen erős válaszkészség, amely már a tápanyagok 155 perces megvonása után is jól detektálható volt, illetve konkrétan az inzulin szabályozó szerepét jelzi, hogy 12 órával az inzulin kezelés után szintén fokozott válaszkészséget tapasztalhattunk glükóz irányában. Kémiai tulajdonságaik (hidrofóbbak mint a diszacharidok, a membrán permeábilis
irányukban)
jól
elkülönítik
őket
a
nem
szignifikánsan
ható 41
diszacharidoktól, ám olyan kémiai jellemzőt nem találtunk, amely a repellens molekulák csoportjától is el tudná őket választani.
A
második,
szintén
effektív
molekulákat
összefoglaló
csoport,
a
szignifikánsan repellens szénhidrátoké. Ide sorolható a fruktóz és az arabinóz, illetve két monoszacharid származék: a glükózamin, és az N-acetil galaktózamin. Az idetartozó ligandumokra jellemző, hogy szignifikánsan repellens hatást képesek kifejteni, ami a sejt fiziológiás állapotával nem, vagy csak igen kis mértékben
változik.
Valószínűleg
egy
teljes
értékű
táptalajban
funkciójuk
elsődlegesen szignál-jellegű, míg tápanyagként való hasznosításuk nem megtérülő. A táplálékként (attraktánsok) és szignálként (repellensek) funkcionáló ligandumok közti ilyetén munkamegosztás nagyon hasonlít a Lenhoff által leírt szignálevolúciós hipotézis [Lenhoff, 1974] első két lépése közti átmenetre, ahol a táplálékmolekulák közül a kevésbé jól hasznosulók válnak jelmolekulákká, míg azok, melyek lebontása megfelelő többletenergiát termel, megmaradnak tápláléknak. Korábbi vizsgálatok bizonyították, hogy az aminosavak esetében szoros kapcsolat mutatható ki a kemotaktikus aktivitás és az őslevesben való feltételezett megjelenési sorrendjük között: a korai aminosavak (pl. glutaminsav) attraktánsok, míg a később megjelentek (pl. fenilalanin, tirozin, valin) repellensként hatnak [Kőhidai és mtsai, 2003b]. A fenti eredményeket és Lenhoff elméletét alapul véve, nem kizárt, hogy e repellens hatások egy korai evolúciós funkciómegosztás eredményét tükrözik.
A harmadik csoportba a diszacharidok kerültek (maltóz, laktóz és szacharóz), melyek nem fejtettek ki szignifikáns hatást. Bár két molekula esetében regisztrálhattunk enyhe kemotaktikus potenciált (maltóz - enyhén attraktáns, szacharóz - enyhén repellens), nem zárható ki az sem, hogy ez csak a diszacharidok bomlásakor megjelenő termékek (maltóz esetében glükóz, amely attraktáns, szacharóz esetében glükóz és fruktóz, mely utóbbi repellens) hatását tükrözte. Gyenge, vagy neutrális hatásuk hátterében egyaránt állhat, hogy a diszacharidokra specifikus receptort nem expresszál modell-sejtünk, vagy hogy e diszacharidok metabolizálása nem, vagy lényegesen lassabban történik Tetrahymenában, így a motilitás anyagcserefolyamatok útján történő indukciója nem valósul meg, vagy a vizsgálat 15-20 perces időintervallumán túlnyúlik. Ez utóbbi magyarázatot (vagyis a metabolizáció szerepét) támogatja az a tény is, hogy a 42
három diszacharid jól elkülönül a többi vizsgált anyagtól azokban a kémiai paraméterekben (megoszlási hányados, poláris felület), melyek a membránon való átjutás mértékét jelzik. A kisebb mértékű penetráció (mely a csoport tagjaira jellemző) együtt jár a lassabb, vagy csökkent mértékű metabolizációval, míg a receptor ligandum jellegű kapcsolatokat ez általában nem befolyásolja.
A receptorok dinamikáját és expresszálódásuk genetikai rögzülését vizsgáló kemotaktikus szelekció, illetve reciprok szelekció során egyik ligandum esetében sem tudtuk specifikus "long-term" receptorok jelenlétét igazolni. Bár a galaktóz esetében magasabb (Chsel=1,82) és alacsonyabb (Chsel=1,00) kemotaxis index értéket is mértünk, ez az eltérés feltehetően csak a két szubpopuláció eltérő fiziológiás állapotából adódó ellentétes kemotaktikus válasz következményeképp alakult ki. A vizsgált anyagok tehát hatásukat vagy "short-term" dinamikájú receptorok révén fejtik ki, mely esetben a receptor-komponensek átmeneti jelleggel, és csak a ligandum jelenlétében szerelődnek össze, a ligandum hiányában szétesnek, így szelekcióval nem váltható ki fokozott válasz; vagy specifikus anyagcsereutak közvetítésével váltják ki a válaszreakciót.
VII.2. Receptoron, vagy specifikus anyagcserefolyamatokon át hatnak? A diszacharidokat, és az effektív molekulákat elkülönítő kémiai paraméterek tárgyalása kapcsán felmerült a kérdés, hogy melyik hatásmechanizmus is a valószínűbb: a receptor, vagy a specifikus anyagcsereút közvetítő szerepe? Előre szeretnénk bocsátani, hogy a kemotaxis mérésének módszere nem alkalmas ennek a kérdésnek a minden kétséget kizáró eldöntésére, csupán olyan információkkal szolgálhat, amely a kemotaxis terén általánosan elfogadott és ismert mechanizmus helyett (ld. kemotaxis receptorok) inkább a specifikus anyagcsereút hipotézisét támogatják. Egyrészről egyes irodalmi adatok arra engednek következtetni, hogy a szénhidrátok kemotaxisa során modell-sejtünk esetében is tipikus receptor által közvetített jeltovábbítással találkozhatunk. Evolúciós szemszögből nézve azt láthatjuk, hogy a szénhidrátok receptor révén való érzékelése általánosan elterjedt jelenség. Az eukarióták (pl. emberek, állatok, növények) körében a lektinek (azaz szénhidrát kötő fehérjék) által közvetített szénhidrát felismerés jellemző, míg a prokarióták esetében jól karakterizált 43
szénhidrát kemotaxis receptorokat ismerünk [Adler és mtsai, 1973]. Ezen felül tudjuk, hogy a Tetrahymena pyriformis membránjában már kimutattak glükózra, mannózra és galaktózra specifikus lektineket [Csaba és Kovács, 1983; Kovács és Csaba, 1983], melyek egy "short-term" jellegű, több komponensből összetevődő receptor részeként képesek lehetnek a szénhidrátok specifikus felismerésére. E tények ismeretében azt feltételeztük, hogy eukarióta egysejtű modellünk is az általánosan elterjedt módját használja a cukrok felismerésének. Másrészről, arra is láthatunk példát, hogy specifikus anyagcsere utakon át hatnak a szénhidrátok: jó példa erre a bevezetésben említett humán pancreas sejtek glükóz érzékelése. E mechanizmusokról tudjuk, hogy a cukorszint igen érzékeny detektálását teszi lehetővé, hiszen a vércukorszint szabályozásának kulcsfontosságú eleme. Legfőbb érvünk a specifikus metabolizáció szerepe mellett, hogy a hatásos (akár attraktáns akár repellens) molekulák jól elkülöníthetőek azoktól, amelyek szignifikáns hatást nem fejtettek ki azon kémiai paramétereik alapján (megoszlási hányados, poláris felület), melyek a membránon való átjutás mértékét jelzik. A kisebb mértékű penetráció pedig (mely a harmadik csoport tagjaira jellemző) együtt jár a lassabb, vagy csökkent mértékű metabolizációval, míg a receptor - ligandum jellegű kapcsolatokat általában nem befolyásolja. Ez a különbség legjobban a maltóz és a glükóz kemotaxisában figyelhető meg: a maltóz két glükózból épülvén fel, a szőlőcukortól lényegében csak méretében és penetrációs képességében különbözik; és míg a glükóz kísérleteinkben attraktáns hatást fejtett ki, a maltóznál ezt nem tapasztalhattuk. A cukrok metabolikus hatásai és a kemotaktikus hatásuk közötti kapcsolat feltételezett szerepét támogatja továbbá a potenciálisan attraktáns ligandumoknál megfigyelhető
széles
amplitúdót
felölelő
válaszkészség,
amely
a
sejtek
energiaszükségletével is összefüggést mutatott (ld. éheztetés). Bár a receptor által közvetített szignálok esetében is lehetőség van az érzékenység és az adott válaszreakció szabályozására, a válaszok ilyen mértékű modulálása valószínűbb, ha a szubsztrát a sejt metabolizmusának szerves részét képezi. Összefoglalva tehát, az első két csoport - de kifejezetten a széles amplitúdóval ható molekulák esetében - eredményeink alapján valószínűbbnek tűnik, hogy Tetrahymena pyriformis csillós modell kemotaxisa hátterében egy még kevésbé jól karakterizált, az eddigi mintáktól elvben eltérő, a sejt lebontó anyagcseréjével 44
szoros kapcsolatot mutató mechanizmus áll, amit mind a kémiai jellemzők, mind a fent közölt kísérlet eredmények kapcsolata is alátámasztani látszik.
45
VIII. ÖSSZEFOGLALÁS MAGYARUL Kutatásunk célja volt felmérni a cukrok kemotaktikus potenciálját az eukarióta Tetrahymena modell-sejt esetében, amely jó összekötő kapocsnak tekinthető az - e szempontból már vizsgált - prokarióták és a többsejtű eukarióta szervezetek közt. Vizsgálatainkban arra kerestünk választ, hogy (i) van-e összefüggés egyes mono- és diszacharidok kemotaktikus hatása és eltérő kémiai tulajdonságaik között. (ii) E hatások “short-“, illetve “long-term” jellegét kemotaktikus szelekció technikájával elemeztük. (iii) A glükóz példáján vizsgáltuk a kemotaxist befolyásoló tényezőket. Modellként Tetrahymena pyriformis tenyészetek logaritmikus növekedési fázisban lévő sejtjeit alkalmaztuk, a mérések kapilláris kemotaxis assay-vel történtek. Eredményeink: (i) A vizsgált szacharidok mind szignifikánsan pozitív (D-glükóz, D-mannóz), mind szignifikánsan negatív (glükózamin, D-fruktóz, N-acetilgalaktózamin, D-arabinóz) hatást képesek voltak kiváltani, bizonyos anyagok esetében szignifikáns hatást nem mértünk (maltóz, laktóz, szacharóz, D-galaktóz). Fenti esetekben jó összefüggést találtunk a hatásosság és a cukrok internalizációját befolyásoló fizikokémiai állandók (TPSA, XlogP) mérőszámai között. (ii) A vizsgált ligandumok
“short-term”
receptor-dinamikára,
vagy
specifikus
metabolizáció
szerepére utaló alacsony szelekciós potenciállal bírtak. A glükóz kemotaxisát befolyásoló tényezők közül az éheztetés cukor koncentrációtól független erős (pozitív választ kiváltó) hatással bírt. Az 1 órás inzulin kezelés 12 óra múltán koncentráció specifikus kemotaxist fokozó hatást váltott ki. Összefoglalva: eredményeink azt jelzik, hogy modell-sejtünk esetében a vizsgált mono- és diszacharidok, illetve származékaik által kiváltott kemotaktikus hatás specifikus, a ligandum fizikokémiai karakterére érzékeny reakció, mely megvalósulásában
specifikus
anyagcsereutak
vagy
"short-term"
receptorok
indukciója feltételezhető.
46
IX. ÖSSZEFOGLALÁS ANGOLUL Our propose was to investigate the chemotactic effect of sugars on the eukaryotic model organism, Tetrahymena pyriformis, which is an adequate link between prokaryotic organisms (which are well characterized in respect chemotaxis induced by sugars) and multicellular eukaryotic organisms. The objectives of our work were: (i) is there any relationship between the chemotactic effect, and the chemical character of the examined mono- and disaccharides? (ii) whether "short-term" or "long-term" signaling mechanisms are in the background of the dynamic chemotactic responses elicited. (iii) the glucose was taken as a model to investigate effects influencing chemotaxis elicited by. Our model was Tetrahymena pyriformis strain in the logarithmic phase of growth, the experiments were tested in capillary chemotaxis assay. Our results were: (i) the tested sugars can trigger both significant attractant (Dglucose, D-mannose), and significant repellent (glucosamine, D-fructose, N-acety galactosamin, D-arabinose) effects. Some of the chemicals tested didn't elicit significant effects (maltose, lactose, sucrose, D-galactose). We find correlations between the effectiveness of the tested ligands and their physicochemical characters which can influence the internalization of the sugars (TPSA, XlogP). (ii) All of the ligands had low selection potential which refers to a "short-term" receptor, or a specific metabolizatison patchway. (iii) The modifying effect of starvation had strong effect (very attractant), however, independent of concentration. In contrast, in a 12 hour sequence following the 1 hour treatment with insulin the chemotactic effect of glucose was concentration dependent. In conclusion, our results predict, that the chemotaxis of Tetrahymena was elevated with mono- and disacharides and their derivatives in a specific way which has a good correlation to the physicochemical character of the ligand. In the background of responses elicited specific metabolic pathways or function of "shortterm" receptors are assumed.
47
X. IRODALOMJEGYZÉK Adler J., Hazelbauer G. L., Dahl M. M. (1973) Chemotaxis toward sugars in Escherichia coli. J Bacteriol. 115:824-847 Borowitz M. J., Stein R. B., Blum J. J. (1977) Quantitative analysis of the change of metabolite fluxes along the pentose phosphate and glycolytic pathways in Tetrahymena in response to carbohydrates. J Biol Chem 252:1589-1605 Christopher G. K., Sundermann C. A. (1996) Intracellular insulin binding in Tetrahymena pyriformis. Tissue Cell. 28:427-437 Cirillo V. P. (1962) Mechanism of arabinose transport in Tetrahymena pyriformis. J Bacteriol. 84:754758 Csaba G., Gaál A., Kovács P., Simon G., Kőhidai L. (1999) Prolonged elevation of insulin content in the unicellular Tetrahymena after insulin treatment: induction of insulin production or storage? Cell Biochem. Funct. 17:165-173 Csaba G., Kovács P. (1983) Lectins in the unicellular Tetrahymena. I. Lectin detection with FITClabeled anti-lectins. Acta Histochem. 73:53-61 Csaba G., Kovács P. (1993) Pheromone and insulin induced chemotaxis in Tetrahymena. Microbios 76:35-39 Csaba G., Kovács P. (1995) Insulin treatment (hormonal imprinting) increases the insulin production of the unicellular Tetrahymena long term. Is there a simultaneous formation of hormone receptor and hormone? Cell Biol. Int. 19:1011-1014 Csaba G., Kovács P., Kőhidai L. (1994) Tetrahymena cells distinguish insulins according to their amorphous and crystalline condition or their bovine and porcine origin. Study of imprinting in aspects of hormone binding and chemotaxis. Microbios 80:215-221 Csaba G., Kőhidai L. (1986) Modeling the insulin receptor in the Tetrahymena. Time-dependence of receptor formation, down-regulation and imprinting. Acta Protozool. 25:331-338 Csaba G., Nagy S. U. (1976) Effect of vertebrate hormones on the cyclic AMP level in Tetrahymena. Acta Biol Med Ger. 35:1399-1401 Fan K. W., Vrijmoed L. L. P., Jones E. B. G. (2002) Zoospore chemotaxis of mangrove thraustochytrids from Hong Kong. Mycologia 94:569-578 Feldmann M., Maini R. N. (2001) Anti-TNF alpha therapy of rheumatoid arthritis: what have we learned? Annu Rev Immunol. 19:163-196 Flanary P. L., Allen R. D., Dons L., Kathariou S. (1999) Insertional inactivation of the Listeria monocytogenes cheYA operon abolishes response to oxygen gradients and reduces the number of flagella. Can. J. Microbiol. 45:646–652 Galsworthy S. B., Girdler S., Koval S. F. (1990) Chemotaxis in Listeria monocytogenes. Acta Microbiol Hung. 37:81-85 Gammeltoft S., Fehlmann M., Van Obberghen E. (1985) Insulin receptors in the mammalian central nervous system: binding characteristics and subunit structure. Biochimie. 67:1147-1153 Hayakawa M., Ariizumi M., Yamazaki T., Nonomura H. (1995) Chemotaxis in the Zoosporic Actinomycete Catenuloplanes japonicus. Actinomycetologica 9:152-163 Hegyesi H., Kovacs P., Falus A., Csaba G. (1998) Presence and localization of histidine decarboxylase enzyme (HDC) and histamine in Tetrahymena pyriformis. Cell Biology International 22:493-497 Hoffmann E. K., Rasmussen L., Jorgensen C. B. (1978) Na +-independent uptake of nutrients in Tetrahymena. J Comp Physiol B 125:97-99
48
Hoffmann E. K., Rasmussen L., Zeuthen E. (1974) Cytochalasin B: aspects of phagocytosis in nutrient uptake in Tetrahymena. J. Cell Sci 15:403-406 Janakidevi K., Dewey V. C., Kidder G. W. (1966) Serotonin in protozoa. Arch Biochem Biophys 113:758-759 Kovács P., Csaba G. (1983) Lectins in the unicellular Tetrahymena. II. Impact of nutrition and sugar treatment on anti-lectin binding. Acta Histochem. 73:181-192 Kovács P., Csaba G. (1987) The role of Ca2+ in hormonal imprinting of the Tetrahymena. Acta Physiol. Hung. 69:167-179 Kovács P., Csaba G. (1994) Effect of insulin on the incorporation of 3H-inositol into the inositol phospholipide (PI, PIP, PIP2) and glycosyl phosphatidyl inositides (GPIs) of Tetrahymena pyriformis. Microbios 81:231-239 Kőhidai L., Bősze S., Soós P., Illyés E., Láng O., Mák M., Sebestyén F., Hudecz F. (2003a) Chemotactic activity of oligopeptides containing EWS motif on Tetrahymena pyriformis. The effect of amidation of the C-terminal residue. Cell Biochem. Funct. 21:113-120 Kőhidai L., Csaba G. (1996) Different and selective chemotactic responses of Tetrahymena pyriformis to two families of signal molecules: lectins and peptide hormones. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 43:83-91 Kőhidai L., Csaba G. (1998) Chemotaxis and chemotactic selection induced with cytokines (IL-8, RANTES and TNFα) in the unicellular Tetrahymena pyriformis. Cytokine 10:481-486 Kőhidai L., Kovács P., Lázár-Molnár E., Csaba G. (2000) Presence, uptake and localization of the cytokine, interleukine 6 /IL-6/ in the unicellular Tetrahymena pyriformis. Cell Biol. Internat. 24:749-755 Kőhidai L., Láng O., Csaba G. (2003b) Chemotactic-range-fitting of amino acids and its correlations to physicochemical parameters in Tetrahymena pyriformis – Phylogenetical consequences. Cell Mol. Biol. 49:OL487-495 Kőhidai L., Lemberkovits É., Csaba G. (1995) Molecule dependent chemotactic responses of Tetrahymena pyriformis elicited by volatile oils. Acta Protozool. 34:181-185 Kőhidai L., Török K., Illyés E., Tamási J., Sebestyén F., Láng O., Csaba G., Hudecz F. (2003c) Characterization of chemotactic ability to peptides containing N-formyl-methionyl residue in Tetrahymena model – for-Met-Leu-Phe (f-MLP) as a targeting ligand. Cell. Biol. Int. 27:695-700 Kőhidai L., Vakkuri O., Keresztesi M., Pállinger É., Leppaluoto J., Csaba G. (2002a) Melatonin in the unicellular Tetrahymena: effects of different lighting conditions regarding possible functions of melatonin at this low level of evolution. Cell Biochem Funct. 20:269-272 Kőhidai L., Vakkuri O., Keresztesi M., Pállinger É., Leppaluoto J., Csaba G. (2002b) Impact of melatonin on the cell division, phagocytosis and chemotaxis of Tetrahymena pyriformis. Acta Protozool. 41:85-89 Láng O., Keresztesi M. (2004) Egy csillós modell-sejt karrierje. Természettudományi közlöny 135:282284 Le Roith D., Shiloach J., Berelowitz M., Frohman L. A., Liotta A. S., Krieger D. T., Roth J. (1983) Are messenger molecules in microbes the ancestors of the vertebrate hormones and tissue factors? Fed Proc 42:2602-2607 Lenhoff H. M. (1974) On the mechanism of action and evolution of receptors associated with feeding and digestion. 211-243 in Muscatine L., Lenhoff H. M. (eds) Coelenterate Biology. Acedemic press, New York, 238-239 Müller M. J. (1972) Secretion of acid hydrolases and its intracellular source in Tetrahymena pyriformis. Cell Biol 52:478-487
49
Nandini-Kishore S. G., Thompson G. A. J. (1979) Increased levels of adenosine 3',5'-cyclic 2+ monophosphate in Tetrahymena stimulated by glucose and mediated by Ca and epinephrine. Proc Natl Acad Sci U S A. 76:2708-2711 PubChem Project, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ Ramanathan S., Chou S. C. (1973) Cyclic 3',5'-adenosine monophosphate in Tetrahymena pyriformis. Experientia 29:814 Seaman G. R. (1951) Enzyme systems in Tetrahymena geleii S. III. Aerobic utilization of hexoses. J. Biol Chem 191:439-446 Stein R. B., Blum J. J. (1979) Quantitative analysis of intermediary metabolism in Tetrahymena. Cells grown in proteose-peptone and resuspended in a defined nutrient-rich medium. J Biol Chem 254:10385-10395 Stein R. B., Blum J. J. (1980a) Quantitative analysis of intermediary metabolism in Tetrahymena pyriformis. Cells kept under static conditions for four hours after growth in glucosesupplemented medium. J. Biol. Chem 256:2752-2760 Stein R. B., Blum J. J. (1980b) Quantitative analysis of intermediary metabolism in Tetrahymena. Cells grown in glucose-supplemented medium. J Biol Chem 255:4198-4205 Vogel T., Blake D. A., Whikehart D. R., Guo N. H., Zabrenetzky V. S., Roberts D. D. (1993) Specific simple sugars promote chemotaxis and chemokinesis of corneal endothelial cells. 157 2: Voichick J., Elson C., Granner D., Shrago E. (1973) Relationship of adenosin 3',5'-monophosphate to growth and metabolism of Tetrahymena pyriformis. J Bacteriol 115:68-72
50
XI. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Először
is
szeretném
megköszönni
témavezetőimnek
az
érdekes
szakdolgozati témát, kitartó segítségüket, és az ötleteim iránti nyitottságukat. Építő jellegű kritikáival, objektív tanácsaival nagy segítségemre volt Dr. Láng Orsolya, és belső konzulensem, Dr. Kovács Mihály. Továbbá szeretnék köszönetet mondani Dr. Török Júliának és Dr. Lengyel Józsefnek tanácsaikért, és a tőlük kapott könyvekért és cikkekért; illetve Dr. Perczel Andrásnak és Bai Katalin Boglárkának a vizsgált anyagok kémiai karaktereinek felderítésében nyújtott segítségükért.
51
XII. MELLÉKLETEK Kondicionált (eredeti) médiumban LogC (M) átlag
contr.
-17
-16
-15
-14
-13
-12
-12
-11
-10
-9
-8
-7
-6
100 113
95
106 112 115
LogC (M)
97
109
86
78
69
74
83
74
12
13
11
12
9
16
12
10
15
9
8
10
96 12
91 8
89 14
84 10
63 5
62 11
80 7
88 5
67 11
102 8
82 7
99 15
0,001 0,020 0,047 (-12) (-12) (-9)
98 16
72 10
77 12
108 114 17 22
85 15
71 9
103 104 14 25
80 9
52 10
77 10
65 10
0,032 (-8)
100 13 100 12
105 98 9 12 112 138 20 21
83 7 77 9
79 8 128 17
94 9 86 11
75 10 97 13
90 88 105 72 10 9 11 10 129 134 120 115 22 21 21 20
76 11 91 12
87 14 101 8
79 13 87 7
0,021 0,036 (-12) (-9)
átlag ±S.E.
100 14
105 104 11 11
97 15
93 11
81 8
84 9
83 9
81 12
73 13
85 13
laktóz
átlag ±S.E.
100 14
118 20
89 14
103 14
95 12
81 15
82 10
127 113 105 106 9 10 9 13
99 7
92 12
76 9
maltóz
átlag ±S.E.
100 12
136 127 133 129 13 17 24 20
86 14
111 17
94 18
116 113 10 13
138 103 123 25 7 12
83 8
mannóz
átlag ±S.E.
100 11
118 125 107 117 10 12 8 12
95 7
98 9
112 11
glükóz 1
átlag ±S.E.
100 14
glükóz 2
átlag ±S.E.
100 11
glükóz 3
átlag ±S.E.
100 14
glükóz 4
átlag ±S.E.
glükóz 5 glükóz 6
arabinóz
100
-18
szignifikancia (p)
±S.E.
10
fruktóz
átlag ±S.E.
100 8
glükózamin
átlag ±S.E.
100 11
átlag ±S.E. átlag ±S.E.
szacharóz
N-acetil galaktózamin galaktóz
glükóz 7 glükóz 8 glükóz 9 glükóz 10
mannóz glükóz 11
8
9
110 124 11 10 98 10
87 14
64 6 74 14
100 104 15 13
95 15
70 11
74 7
97 6
120 111 112 13 9 14
90 12
(-8)
(-6)
113 121 19 16
144 137 118 151 160 182 142 0,047 0,004 12 16 20 23 21 13 14 (-8) (-7) 107 103 9 9 74 5
96 11
90 9
87 13
94 17
76 12
89 18
100 8
97 7
91 6
95 6
96 6
93 5
átlag ±S.E.
100 19
86 13
104 127 17 19
93 10
94 14
átlag ±S.E.
100 15
122 136 13 24
átlag ±S.E. átlag ±S.E.
100 15 100 14
88 81 59 72 18 18 16 14 128 130 126 109 17 19 20 26
72 9 91 9
átlag ±S.E.
100 15
116 15
116 20
81 21
97 19
átlag ±S.E. LogC (M) átlag ±S.E.
100 13
156 125 119 14 14 14
87 12
88 7
contr.
átlag ±S.E.
90 17
-2
125 20
89 14
90 14
75 21
91 11
0,044 0,017 (-10) (-6)
125 117 15 8
0,008 (-10)
-1
160 123 120 126 123 135 25 14 14 21 25 21 86 11
79 12
132 118 17 18
70 11
-3
110 10
97 18
89 11
-4
78 9
80 12
82 11
-5
100 101 13 14
111 105 112 7 9 12
83 7
-6
78 13
97 8
77 8
100 13
0,019 0,037
0,028 (-6)
75 11 -18
-6
10. táblázat: Mono- és diszacharidok kemotaktikus hatása Tetrahymena pyriformison 10 M-tól 10 M-ig illetve 10-6 M-tól 10-1 M-ig terjedő koncentrációtartományban, kondicionált (eredeti) médiumban mérve. A kék háttér szignifikánsan repellens, a narancs szignifikánsan attraktáns hatást jelez. Ezek szignifikancia értékeit rendre a táblázat jobb oldalán tüntettük fel, a hatásos koncentráció megjelölésével. A glükóz 4-10 mérések friss tápban mért párjait a 11. táblázat tartalmazza.
52
Lecserélt, friss médiumban
szignifikancia (p)
LogC (M) átlag ±S.E.
contr. 100 9
-10 99 8
-9 116 11
-8 125 10
-7 92 10
-6 88 11
glükóz 5
átlag ±S.E.
100 15
112 19
93 18
112 22
126 17
104 17
glükóz 6
átlag ±S.E.
100 16
90 16
88 11
84 10
99 13
80 8
glükóz 7
átlag ±S.E.
100 12
125 25
141 18
96 16
117 23
123 12
glükóz 8
átlag ±S.E.
100 12
122 15
122 16
122 25
149 25
78 13
glükóz 9
átlag ±S.E.
100 21
136 12
132 27
109 25
105 20
77 18
glükóz 10
átlag ±S.E.
100 13
91 9
77 13
78 11
100 14
76 8
glükóz 4
LogC (M)
11. táblázat: Glükóz kemotaktikus hatása Tetrahymena pyriformison 10-10 M-tól 10-6 M-ig terjedő koncentrációtartományban, lecserélt, friss médiumban mérve. Szignifikáns hatást nem tapasztaltunk. anyag neve
kemotaxis index (%)
±S.E.
megoszlási hányados (XlogP)
Poláris felület (TPSA) (A2)
Molekulasúly (g/mól)
glükózamin
52
10
-2,8
116
179,17
fruktóz
62
11
-2,3
110
180,16
N-acetil galaktózamin
64
6
-1,7
119
221,21
arabinóz
74
9
-2,5
90
150,13
szacharóz
70
11
-3,7
190
342,30
laktóz
100
-
-4,7
190
342,30
galaktóz
138
21
-2,6
110
180,16
maltóz
138
25
-4,7
190
342,30
mannóz
160
25
-2,6
110
180,16
glükóz
182
13
-2,6
110
180,16
12. táblázat: A vizsgált cukrok legjellemzőbb kémiai paraméterei, és a maximális ill. minimális attraktáns és repellens hatások kemotaxis index értékei. A kék háttér szignifikánsan repellens, a narancs szignifikánsan attraktáns hatást jelez. [Forrás: PubChem Project]. arabinóz LogC (M)
fruktóz
-13
glükóz
-17
mannóz
-7
galaktóz
-6
galaktóz
-10
maltóz
-11
maltóz
-9
-16
átlag
±S.E.
átlag
±S.E.
átlag
±S.E.
átlag
±S.E.
átlag
±S.E.
átlag
±S.E.
átlag
±S.E.
átlag
±S.E.
Tc-->C (contr.)
100
16
100
13
100
9
100
6
100
10
100
9
100
9
100
9
Tc-->S
114
15
135
14
100
6
102
6
75
8
97
4
79
6
72
6
Ts-->C
120
11
141
11
71
6
91
6
51
5
96
7
98
6
176
15
Ts-->S
118
11
115
9
71
5
83
5
70
4
93
8
89
8
117
12
Chsel
0,85
0,61
1,01
0,89
1,82
1,00
1,15
0,91
13. táblázat: Kemotaktikus szelekció Tetrahymena pyriformison (színek: zöld: alacsony, sárga: magas szelekciós index érték).
53
ELŐVIZSGÁLAT SZELEKCIÓ
arabinóz
fruktóz
glükózamin
N-acetil galaktózamin
-8
-12
-8
-9
LogC (M) átlag
±S.E.
átlag
±S.E.
átlag
±S.E.
átlag
±S.E.
Tc-->C (contr.)
100
11
100
7
100
10
100
7
Tc-->S
89
9
70
7
89
9
89
8
Ts-->C
98
10
127
12
163
23
108
7
98
9
111
14
92
10
Ts-->S
135
14
Tc/c-->C (contr. 2.)
100
9
100
7
Tc/c-->S
90
8
96
7
Tc/s-->C
131
12
103
7
Tc/s-->S
103
9
129
9
Ts/c-->C
94
8
62
4
68
6
98
6
Ts/c-->S
106
11
56
5
66
6
102
8
Ts/s-->C (contr. 1.)
99
6
100
6
100
7
102
9
Ts/s-->S
81
8
81
9
97
6
100
Chrps
0,72
0,9
1
5 0,94
14. táblázat: Reciprok szelekció és elővizsgálata Tetrahymena pyriformison (kék: repellens hatás, zöld: alacsony szelekciós index érték).
54
24. ábra: A vizsgált cukrok képletei. [Forrás: PubChem Project]
55
NYILATKOZAT
Név: Szemes Áfonya ELTE Természettudományi Kar, Biológus szak ETR azonosító: SZJMADT.ELTE Diplomamunka címe: Mono- és diszacharidok kemotaktikus hatásának vizsgálata Tetrahymena pyriformis GL modell-sejten.
A diplomamunka szerzőjeként fegyelmi felelősségem tudatában kijelentem, hogy a dolgozatom önálló munkám eredménye, saját szellemi termékem, abban a hivatkozások és idézések standard szabályait következetesen alkalmaztam, mások által írt részeket a megfelelő idézés nélkül nem használtam fel.
Budapest, 2009. május 6. _______________________________ a hallgató aláírása
56
