278
Ophthalmol Ina 2016;42(3):278-282
ORIGINAL ARTICLE
Toxic Effect of Topical DLBS1425 Towards Proliferation Degree and Mucin Secretion in Rabbit’s Eye Amy Aurelian, Trilaksana Nugroho, Dina Novita Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Universitas Diponegoro Kariadi Hospital, Semarang, Central Java Email :
[email protected]
ABSTRACT Background: Phaleria macrocarpa (DLBS1425) is a medicinal plant that has the effects of anti-cancer, anti-inflammation, anti-angiogenesis, and antioxidants. The potency of its toxicity is low towards normal cell. DLBS1425 is expected to be useable for eye drop, but its toxic effect towards goblet cell proliferation and mucin secretion still remain unknown. Methods: This is experimental study with design of comparison test. Twenty four rabbits’ eyes divided into 4 groups were given placebo and topical DLBS1425 with concentration of 1×10-1 mg/ml, 1×100 mg/ml, and 1×101 mg/ml. Goblet cell proliferation degree and mucin secretion were evaluated using histopathology examination from rabits’ conjunctiva. Results: In the group of goblet cell proliferation, compared to control group, there was decreased proliferation degree with topical DLBS1425 of 1×10-1 mg/ml; but the concentration of 1×100 mg/ml and 1×101 mg/ml did not affect goblet cell proliferation. In the group of mucin secretion, DLBS1425 with any concentration level decreased mucin secretion significantly. Conclusion: There was significant difference in goblet cell proliferation with topical DLBS1425 of 1×10-1 mg/ml and placebo. There was also significant difference in mucin secretion with topical DLBS1425 in any concentration level and placebo. Keywords: DLBS1425, goblet cell, mucin secretion
P
enelitian uji toksisitas mahkota dewa pada kultur sel HT-29 (human colon adenocarcinoma cell line), MCF7 (human breast adenocarcinoma cell line, HeLa (human cervical cancer cell line), dan human hepatocytes (Chang liver cells) menunjukkan efek sitotoksik menurut tingkatan dosis; namun pada Chang liver cells, efek toksik terjadi pada konsentrasi yang lebih tinggi dibanding dengan kultur sel kanker yang lain.1
Berbagai obat topikal mata yang diberikan dalam jangka waktu lama sangat memungkinkan menyebabkan perubahan struktur bola mata sebagai efek toksiknya. 2 Berbagai efek toksik obat pada struktur permukaan bola mata dapat diidentifikasi secara klinis maupun patologi anatomi. Secara klinis, efek toksik akut terlihat dengan adanya iritasi lokal berupa hiperemia konjungtiva, edema palpebra dan konjungtiva, serta erosi kornea. Sedangkan efek toksik kronis dapat
Toxic effect of topical DLBS1425 towards proliferation degree and mucin secretion in rabbit’s eye
berupa inflamasi kronis yang menyebabkan gangguan fisiologis permukaan bola mata maupun perubahan struktur seluler.3 Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan terhadap organ-organ yang memiliki sel yang sama dengan sel permukaan bola mata, yaitu sel epitel dan sel skuamosa.4 Mahkota dewa memiliki efek terapeutik terhadap berbagai jenis penyakit (anti-tumor, anti-inflamasi, anti-angiogenesis, dan antioksidan) dan potensi toksisitasnya yang cukup rendah terhadap sel normal, maka mahkota dewa diharapkan dapat digunakan sebagai obat topikal pada penyakit-penyakit permukaan bola mata.1,5 Berbagai uji toksisitas, baik in vitro maupun in vivo dapat dilakukan untuk mengetahui toksisitas akut maupun kronis, efek toksik klinis maupun struktur jaringan dan seluler.3 Penelitian ini merupakan cabang penelitian dimana akan melihat efek toksik subakut mahkota dewa terhadap perubahan struktur konjungtiva (proliferasi sel goblet dan sekresi musin) akibat reaksi toksik obat topikal mata. Penelitian ini menggunakan obat Dexa Laboratories of Biomolecular Sciences 1425 (DLBS1425) pada permukaan bola mata kelinci yang diberikan secara topikal pada beberapa tingkat dosis.
279
digunakan sebagai pelarut tetes mata DLBS1425, selama 1 bulan. Kelompok perlakuan yaitu P1 (n=6), P2 (n=6), dan P3 (n=5), dimana masing-masing mendapat tetes mata DLBS1425 konsentrasi 1 x 10 -1 mg/ml, 1 x 100 mg/ml, 1 x 101 mg/ml, selama 1 bulan. Selama periode penelitian tidak dijumpai adanya tikus yang mati, tetapi pada hari ke-30 ditemukan infeksi pada 1 mata kelinci kelompok P3 Data hasil penelitian diolah dan disajikan dalam bentuk tabel dan grafik. Dilakukan uji normalitas dengan SaphiroWilk, dan uji homogenitas dengan Lavene’s test. Data yang ditemukan tidak normal dan tidak signifikan maka digunakan uji Kruskal-Wallis dan dilanjutkan MannWhitney. Analisis statistik tersebut dilakukan dengan menggunakan program komputer SPSS 13.0 for Windows. Nilai signifikansi penelitian ini adalah apabila variabel yang dianalisis memiliki nilai p < 0,05.7,8 Pengelolaan dan perlakuan terhadap hewan coba pada penelitian melalui konsultasi untuk mendapatkan persetujuan dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro. HASIL
MATERIAL DAN METODE Penelitian ini merupakan suatu uji eksperimental laboratorium dengan rancangan post-test only randomized controlled group design yang menggunakan hewan coba kelinci lokal yang dipajani ekstrak DLBS1425 dengan berbagai konsentrasi sebagai unit eksperimental dengan keluaran perubahan proliferasi sel goblet dan sekresi musin. Pada penelitian ini digunakan 24 mata kelinci. Kelinci kemudian dibagi secara random menjadi 4 kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari 6 mata kelinci. Kelompok kontrol (n=6) mendapat perlakuan tetes mata larutan Sodium Hyaluronat (hyalub®) yang
Hasil pembacaan histopatologi, derajat proliferasi sel goblet mata kelinci pada kelompok kontrol dan perlakuan ditampilkan pada tabel 1 dan 2. Tabel 1. Uji Beda Proliferasi Sel Goblet pada Kelompok Perlakuan Mean ± Median Kelompok p‡ SD (min-max) 2,43 ± 2,4 (2,2 – K 0,151 2,6) 1,73 ± 1,7 (1,4 – P1 0,242 2,0) 0,007* 2,37 ± 2,4 (1,8 – P2 0,367 2,8) 2,36 ± 2,4 (2,2 – P3 0,089 2,4) Keterangan : * Signifikan p < 0,05; ‡ Kruskal Wallis Test
280
Ophthalmol Ina 2016;42(3):278-282
Tabel 2. Uji Beda Proliferasi Sel Goblet pada masing-masing Kelompok Perlakuan Kelompok§
P1
P2
P3
K
0,004*
0,869
0,338
P1
–
0,012*
0,005*
–
0,850
P2 §
Keterangan : * Signifikan p < 0,05; Mann Whitney Test
Tabel 1 menunjukkan bahwa pada kelompok perlakuan (P1) proliferasi sel goblet mata kelinci paling rendah (1,7) dibandingkan dengan kelompok kontrol dan kelompok perlakuan lainnya (P2, P3). Setelah dilakukan uji normalitas dan homogenitas, terdapat sebaran data yang tidak normal dan tidak homogen (p<0,05), dilanjutkan uji Kruskal-Wallis, menunjukkan secara keseluruhan terdapat perbedaan yang signifikan antar kelompok. Analisis statistik dilanjutkan untuk mengetahui perbedaan antar kelompok, menggunakan uji Mann-Whitney (tabel 2). Hasil yang diperoleh, terdapat perbedaan yang signifikan (p<0,05) antara kelompok kontrol dengan kelompok P1, P1 dengan P2, dan P1 dengan P3. Pada kelompok P2 dengan P3 menunjukkan perbedaan yang tidak signifikan (p>0,05). Hasil pembacaan histopatologi sekresi musin mata kelinci pada kelompok kontrol dan perlakuan ditampilkan pada tabel 3 dan 4. Tabel 3. Uji Beda Jumlah Musin pada Kelompok Perlakuan Mean ± Median Kelompok p‡ SD (min-max) 2,00 ± K 2,0 (1,8 – 2,2) 0,179 1,63 ± P1 1,7 (1,4 – 1,8) 0,197 0,001* 1,37 ± P2 1,4 (1,0 – 1,6) 0,234 1,12 ± P3 1,2 (1,0 – 1,2) 0,110 Keterangan : * Signifikan p < 0,05; ‡ Kruskal Wallis Test
Tabel 3 menunjukkan bahwa pada kelompok P3 sekresi musin mata kelinci paling rendah (1,2) dibandingkan dengan kelompok kontrol dan kelompok perlakuan
P1 dan P2. Setelah dilakukan uji normalitas dan homogenitas, terdapat sebaran data yang tidak normal dan tidak homogen (p<0,05), dilanjutkan uji Kruskal-Wallis menunjukkan secara keseluruhan terdapat perbedaan yang signifikan antar kelompok. Tabel 4. Uji Beda Jumlah Musin pada masingmasing Kelompok Perlakuan Kelompok§
P1
P2
P3
K
0,012*
0,004*
0,005*
P1
–
0,069
0,005*
–
0,072
P2 §
Keterangan : * Signifikan p < 0,05; Mann Whitney Test
Analisis statistik dilanjutkan untuk mengetahui perbedaan antar kelompok, menggunakan uji Mann-Whitney (tabel 4). Hasil yang diperoleh, terdapat perbedaan yang signifikan (p<0,05) antara kelompok kontrol dengan kelompok P1,P2 dan P3, P1 dengan P3. Pada kelompok P1 dengan P2, P2 dengan P3 menunjukkan perbedaan yang tidak signifikan (p>0,05). DISKUSI Inflamasi merupakan suatu reaksi tubuh terhadap benda asing. Inflamasi mata yang kronis menyebabkan terjadinya perubahan struktur yang menetap pada epitelial dan subepitelial (substantia propia). Perubahan epitel meliputi (1) Peningkatan sel goblet (2) Epitel hiperplasi (3) Metaplasia dan (4) Keratinisasi. 8 Konjungtiva mengandung banyak kelenjar yang terdiri dari sekretors musin, seperti sel-sel goblet, dan kelenjar lakrimal aksesori dari Krause dan Wolfring. Gangguan inflamasi kronis dapat menyebabkan pembesaran sel-sel goblet serta menyebabkan peningkatan jumlah musin yang diproduksi.9,10 Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya DLBS1425 terbukti mempunyai efek sitotoksik dan efek antiproliferatif terhadap berbagai sel kanker
Toxic effect of topical DLBS1425 towards proliferation degree and mucin secretion in rabbit’s eye
dan sel normal dan juga mempunyai efek sebagai anti inflamasi.5 Penelitian ini bertujuan mengetahui efek DLBS1425 topikal berbagai tingkat konsentrasi terhadap derajat proliferasi sel goblet dan sekresi musin mata kelinci. Hasil pada kelompok proliferasi sel goblet, dibandingkan dengan kelompok kontrol menunjukkan bahwa pada pemberian DLBS1425 topikal konsentrasi 1 x 10-1 mg/mL menyebabkan penurunan derajat proliferasi sel goblet namun hal ini belum dapat dijelaskan penyebabnya karena pada peningkatan konsetrasi DLBS1425 ( 1 x 100 mg/mL, 1 x 101 mg/mL) tidak mempengaruhi derajat proliferasi sel goblet mata kelinci. Hasil pada kelompok sekresi musin mata kelinci, DLBS1425 konsentrasi 1 x 10-1 mg/mL (kelompok P1) cukup signifikan menurunkan jumlah sekresi musin mata kelinci, sehingga pada konsentrasi 1 x 10-1 mg/mL berpotensi menyebabkan terjadinya mata kering. Diketahui bahwa pada kondisi air mata normal, lapisan lemak dapat mengurangi penguapan sekitar 90-95%, namun lapisan lemak tidak dapat berfungsi dengan baik jika tidak ada interaksi antara lapisan akuous-musin. Ikatan antar lemak dan lapisan akuous-musin membentuk struktur yang berfungsi sebagai barrier dan bertanggung jawab untuk memperlambat penguapan.11 Penelitian ini banyak memiliki keterbatasan dan kekurangan dalam menjelaskan faktor-faktor yang berperan pada proliferasi sel goblet dan sekresi musin mata kelinci. Temuan efek toksisitas ini harus diikuti dengan uji toksisitas kronik pada permukaan bola mata, sebagai dasar penerapan uji preklinik dan klinik selanjutnya. KESIMPULAN Terdapat perbedaan yang signifikan antara derajat proliferasi sel goblet mata
281
kelinci yang mendapat DLBS1425 topikal konsentrasi 1x10 -1 mg/mL terhadap yang mendapat plasebo. Terdapat perbedaan yang signifikan antara jumlah sekresi musin mata kelinci yang mendapat DLBS1425 topikal berbagai konsentrasi terhadap yang mendapat plasebo. Dilakukan penelitian lanjutan untuk mengetahui efek toksik kronis (> 90 hari) dengan berbagai konsentrasi. Penelitian lebih lanjut untuk membandingkan efek DLBS1425 terhadap kualitas dan kuantitas dari musin. Dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efek terapi pada permukaan bola mata. Referensi 1. Hendra R, Ahmad S, Oskoueian E, Sukari A, Shukor MY. Antioxidant, Anti-inflammatory and Cytotoxicity of Phaleria macrocarpa (Boerl.) Scheff Fruit. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2011; 11: 1 – 10 2. Nuzzi R, Finazzo C, Cerruti A. Adverse effects of topical antiglaucomatous medications on the conjunctiva and the lachrymal response. Int Ophthalmol, 1998; 22(1): 31 – 5 3. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals no 405: Acute Eye Irritation/Corrosion. Paris, France: Organizaton for Economic Cooperation and Development; 2002: 1 – 14 4. J Eric Pepperl, Tom Ghuman, Kuljit S, Gill, James D and Stefan. Chapter 29. Conjungtiva. Duane's Ophthalmology. http://www.oculist.net/downaton502/prof/ebook/du anes/pages/v7/v7c029.html 5. Olivia M, Jason S Lee, Sung Hee Baek, Raymond. Induction of Cellular apoptosis in human breast cancer by DLBS 1425, a Phaleria macrocarpa compound extract, via downregulation of PI3Kinase/AKT pathway. Research Paper. Cancer Biology & therapy 10:8,1-11, 2010 6. P Aragona, et al. Sodium hyaluronate eye drops of different osmolarity for the treatment of dry eye in Sjögren’s syndrome patients. Br J Ophthalmol 2002;86:879–884. http://bjo.bmj.com/ on June 8, 2015 7. E-M Haller-Schober, et al. Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome. Eye (2006) 20, 927–933. www.nature.com/eye. 8. R R Hodges and D A Dartt. Conjunctival Goblet Cells. Ocular periphery and disorders. Elsevier, UK. 2011, 108-12. 9. Liang H, Baudouin C, Labbé A, Pauly A, Martin C, Warnet JM, et al. In vivo confocal microscopy and ex vivo flow cytometry: new tools for assessing ocular inflammation applied to rabbit lipopolysaccharide-induced conjunctivitis. Mol Vis 2006; 12:1392 – 402
282 10. Liesegang TJ, Deutsch TA, Grand MG eds. Basic and Clinical Science Course, Intraocular Inflammation and Uveitis, Section 9, 2010-2011. The Foundation of the American Academy of Ophthalmology. San Francisco, 2001:9 – 15, 30 – 1, 40 – 9, 73 – 85
Ophthalmol Ina 2016;42(3):278-282 11. Peters E, Colby K. Chapter 3. The Tear Film. http://www.oculist.net/downaton502/prof/ebook/du anes/pages/v8/v8c003.html
