Albumin oldatok kíméletes szárítása inert szemcsék felületén létrehozott filmrétegben Gentle drying of albumin solutions in a film-like coating on inert particles
Tóth Judit1, Pallai Varsányi Erzsébet2, Oravetz Dezső3 és Gyenis János2 1
MTA KK Anyag- és Környezetkémiai Intézet 1025 Budapest, Pusztaszeri út 59-67. Pannon Egyetem 2 MIK Műszaki Kémiai Kutató Intézet és 3MK Anyagmérnöki Intézet 8200 Veszprém, Egyetem u. 10. Summary The object of the research work was to investigate the drying conditions in a film-like coating on inert particles surfaces in a mechanically spouted bed (MSB) dryer using bovine and human serum albumin (BSA and HSA) solutions as model materials. The determining process parameters and their effect on the most important properties of the dried product (particle size and distribution, dv, final moisture content, Mvn and soluble protein content, OFT and morphology) were investigated. Owing to the recent advances in biotechnology the production of valuable macromolecules of high biological activity has been increased recently. There is an advanced demand on new methods and processes which assist the more effective application of these products, for example the administrations of protein type drugs. The protein structure is very labile owing to the relatively weak physical interactions [1], and as a consequence is easily disrupted during the formulation process (e.g. drying) resulting in reduction of bioactivity [2]. For producing dry powder-like proteins from solutions or suspensions generally freeze drying [3], spray drying [4], or freeze-spray drying combination are used. Gentle drying of such materials can be carried out in the so called MSB-dryer in which the special particle circulation is ensured by an inner vertical houseless conveyor screw [5] and the drying process is performed in a film-like thin coating formed on the surface of inert particles. Due to the large contact surface provided by the inert packing the drying takes place during a very short time (few seconds) even at relatively low bulb temperature. In this study the drying experiments were performed in an MSB-dryer of laboratory size (see Fig.1.). The influence of the primary process parameters (speed of the conveyor screw, ncs, feeding rate, q and the inlet temperature of drying air, Tbe) on the product quality are summarized in Tabl. 1. The feeding rate was in runs 1a-c 4 ml/min and 3 in the other cases. In runs 1a-k BSA and in runs 2a-b HSA solutions were dried. The solutions of 1h and 2a-b contained 0.9 % of NaCl. The thickness of the coating affects the final moisture content and the particle size of the product that’s why it is important to achieve its optimum value. It can be regulated by adjusting the speed of the conveyor screw and the feeding rate. The theoretical value of the thickness of the coating () and the drying time (d) were calculated and shown in Tabl. 2 in case of different process parameters. Optimum conditions resulted in coating thickness of ~ 6 m. This value is shown on the SEM image of dried product of 1h, on Fig. 1. Coating, drying and wearing off processes should be proceeded during one circulation of the inert particles. The inlet air temperature and the solution concentration provide further possibility to control the final moisture content and particle size. The data in Tabl. 1 show that the speed of the conveyor screw effects the final moisture content but the drying temperature has more influence on it, especially at inlet temperature of 100 and 130 C. It is surprising that the soluble protein content is higher at elevated temperatures. It needs further verifications if there are some structural changes in protein structure which can result in uncertain correlation in the calibration curve used for calculation of the protein content. The volume mean diameters of the dried product are represented on Fig. 3. The particle size of the dried HSA products are bigger than that of BSA. The SEM images of the powders are shown that the dried product generally consists of two type of particles: a splintered bigger plate-like and the ballast type smaller factions. The process parameters has remarkable influence on the ratios of the particles of different types and sizes.
Bevezetés A biotechnológia nagy mértékű fejlődése lehetővé tette a biológiai hatékonyságú makromolekulás anyagok ipari méretben és megfelelő tisztaságban történő előállítását. Ezzel egyidejűleg megnőtt az igény olyan új eljárások és módszerek kidolgozása iránt, melyek lehetővé teszik ezen anyagok hatékony felhasználását. A különböző fehérjékre jellemző másodlagos és harmadlagos szerkezetek viszonylag gyenge fizikai kölcsönhatások révén alakulnak ki [1]. A gyógyászati célt szolgáló fehérjék formázási műveletei során a legnagyobb gondot tehát a gyenge kötőerők, ezáltal a fehérje labilitása jelenti, aminek következtében a fehérjére jellemző harmadlagos szerkezet könnyen elbomolhat, maga után vonva a biológiai aktivitás csökkenését vagy akár megszűnését [2]. Igen fontos szerepe van tehát a szárított fehérje portermék minősége szempontjából a szárításnak, a szárítási műveletet megvalósító eljárás-, valamint a szárítási körülmények megválasztásának. Fehérjeporok előállítására leggyakrabban alkalmazott szárítási eljárások a liofilezés [3], a porlasztva- [4], illetve fagyasztással kombinált porlasztva szárítás. A fehérje szárítmány előírt minőségét nagymértékben meghatározza a gyógyszer bevitel módja. Számos módszer van a fehérjealapú gyógyszerek beadására, azonban sem a szájon-, sem a bőrön-, vagy az orron, stb. keresztül történő megoldások egyike sem potenciális helyettesítője az injekciós formátumnak. Mindezen gyógyszer beadási módokhoz, egyéb minőségi követelmények mellett meghatározott szemcseméret-eloszlással rendelkező fehérje portermék szükséges. A célnak megfelelő szárítási eljárás megválasztásánál tehát a fehérje biológiai aktivitásának megőrzése mellett, többek között igen fontos szempont a szemcseméret szabályozhatósága is. Szárítás inert szemcsék felületén, filmrétegben Nagy nedvességtartalmú, hőérzékeny anyagok szárítására, egyéb szárítási eljárások korlátainak kiküszöbölésére fejlesztették ki az ún. „inert töltetes szárítást. A hatékony nedvességelvonás, kíméletes szárítás összehangolása jól megvalósítható az inert töltetszemcsék felületén, filmrétegben végzett szárítási móddal. Az inert szemcsetöltetes szárítási eljárás lényegében a szárítóba betáplált (beporlasztott) oldatból, illetve szuszpenzióból az inert szemcsék felületén kialakuló nedves
filmbevonat pillanatszerű száradásán, a száraz bevonat lekopásán a szárítóban fellépő súrlódások és ütközések hatására, valamint a szárítóközeggel távozó finomszemcsés terméknek az áramló gázból a szokásos módszerekkel megvalósított kinyerésén alapszik. Intenzív hő,- és anyagátadás, mégis kíméletes, igen rövid idejű szárítás biztosítható az ún. belső szállítócsigával ellátott (mechanikus), inert töltetes gejzír szárítóban [5]. A szárító függőleges tengelye mentén beépített ház nélküli szállítócsiga biztosítja a gejzír típusú szárítókra jellemző cirkulációs rétegmozgást. A mechanikus gejzír szárító (MGSZ) legfőbb előnye, hogy a réteg cirkuláltatásához nem szükséges ventillációs energia, a levegő térfogati sebessége ezáltal a szárítás igénye szerint választható meg. Inert töltetes szárítás esetén a szállítócsiga forgássebességével szabályozható a filmbevonat vastagsága, a szárítási idő, illetve a koptatás intenzifikálásán keresztül a szárítmány szemcsemérete. A filmbevonat vastagságának döntő szerepe van a száradási idő alakulásában, ami néhány tíz másodperc is lehet, mivel a megfelelően vékony filmrétegben a diffúziós ellenállás elhanyagolhatónak tekinthető, vagyis a száradás mintegy állandó sebességgel megy végbe. A szállítócsiga mechanikus szabályzási lehetősége mellett, természetesen fontos szerepe van a nedvesanyag töménységének, a beadagolási sebességnek, a szárítólevegő hőmérsékletének és térfogati sebességének. Kísérleteink célja volt a modellanyagként alkalmazott albumin oldatok szárítási körülményeinek vizsgálata MGSZ szárítóban, inert szemcsék felületén létrehozott filmrétegben. Tanulmányoztuk a meghatározó műveleti paraméterek változtatásának hatását a keletkezett albumin szárítmányok tulajdonságaira. Kísérleti rész A szárítási kísérleteket laboratóriumi méretű inert töltetes mechanikus gejzírszárítóban végeztük. A szárítórendszer vázlata a 1. Ábrán látható. A szárítási kísérletek során a készülékaljba réseken keresztül, tangenciális irányítottsággal vezetjük be a szárítólevegőt. Az albumin oldatot a szárító két oldalán porlasztottuk be a csúszó rétegű tömörebb rétegzónába perisztaltikus szivattyú segítségével. A szárítóból a levegőárammal kilépő száraz, mikroszemcsés albumin porterméket ciklonon, majd sűrűszövésű porzsákon átvezetve nyertük ki. A szárító levegő térfogati sebességét és a belépő hőmérsékletét számítógépes program szabályozta, az
oldat adagolása és a csiga forgási sebessége kézi beállítással történt. Kilépő levegő Albumin oldat
Inert töltet
T ki
Eredmények és értékelésük
Csiga Belépő levegő Tbe
szárítással mértük. A szárítmány oldható fehérje tartalmának (OFT) meghatározásához adott mennyiségű szárítmányt oldottunk kétszer desztillált vízben, az oldhatatlan maradékot centrifugálással választottuk el. Az OFT értéket a felülúszó fázisból spektrofotometriás módszerrel, 280 nm-nél mért abszorbancia érték alapján határoztuk meg. A szárítmány átlagos szemcseméretét és a szemcseméret eloszlását Malvern-2600 típusú analizátorral határoztuk meg, diszpergáló közegnek diklór-metánt használtunk. A szemcseméret jellemzésére a térfogati átlagméretet, dv adtuk meg. A kísérletek jellemző mintáiról felvételeket készítettünk, Philips XL30 ESEM gyártmányú elektronmikroszkóppal.
Termék
PC
1 Ábra: Az MGSZ szárító berendezés A szárítási kísérletekhez felhasznált bovine szérum albumint (BSA, szabványos minőség, 98%) a Sorachim cégtől szereztük be. A szárítási kísérletekhez a cBSA = 20, 30, 40 g/l koncentrációjú BSA-oldatok kétszer desztillált vízzel készültek. A 38 g/l-es töménységű humán szérum albumin (HSA) oldatokat izotóniás sóoldatban (0,9 % NaCl tartalom) a Trigon Biotechnológiai Rt. bocsátotta rendelkezésre. Felhasználása eredeti töménységben történt. A szárítási kísérletek során minden alkalommal 240 ml oldatot porlasztottunk a gejzír szárítóban cirkuláló inert szemcsék felületére q = 3 vagy 4 ml/perc adagolási sebességgel. A szemcsék cirkulációs idejét (a szárítóban egy teljes cirkulációs pálya megtételéhez szükséges időt), valamint a száradási időt is meghatározó szállítócsiga forgási sebességet ncs = 210, 280, és 520 ford/perc értékekre állítottuk be. A szárítást Tbe = 40, 60, 80, 100 és 130 °C belépő szárítólevegő hőmérsékleteken végeztük. A szárító levegő áramlási sebessége (15 m3/h) és az alkalmazott inert töltet mennyisége (1700 g/ Hostaform típus) a kísérletek során állandó volt. A szárítmányok minőségét a következő elemzések alapján hasonlítottuk össze: A végnedvességet (Mvn, m/m%) vákuumszárítóban, 30 °C hőmérsékleten, 6 órás
Hőérzékeny anyagok száradása esetén különös jelentősége van az alkalmazható szárítási hőmérsékletnek és a tartózkodási időnek a szárítóban. Az inert töltet szemcséinek felületén kialakított filmszerű, folyamatosan megújuló bevonat rétegben lehetővé válik a szárító levegő és nedves anyag intenzív érintkeztetése, amely egyrészről alacsonyabb hőmérsékleten (100 C) is lehetővé teszi a szárítást, másrészt magasabb hőmérsékleteken az inert töltetes gejzír eljárás által biztosított rövid (10 s) száradási idők biztosíthatják a termék hőkárosodás nélküli szárítását. Az MGSZ szárítóban a következő műveleti paraméterek változtatásával szabályozható a száradási folyamat, valamint a termék tulajdonságok: a filmréteg vastagsága: a szemcsék cirkulációs idejével, az oldat adagolási sebességével, a szárítási idő: a szárító levegő áramlási sebességével és hőmérsékletével a filmréteg vastagságával, a cirkuláció sebessége: a csiga forgási sebességével és az inert töltetetes gejzír réteg magasságának változtatásával. A szárítási hőmérséklet a száradásra gyakorolt hatásán túl jelentős befolyással van a keletkező albumin por szerkezetére, továbbá a filmréteg vastagságának változtatásával befolyásolható a termék szemcsemérete is. Ezen szempontok alapján a fent felsorolt szabályozási lehetőségek közül kísérleteinkben a szárító levegő hőmérsékletét, a csiga forgási sebességét és az albumin oldat adagolási sebességét változtattuk, a szárító levegő áramlási
sebessége és az alkalmazott inert töltet mennyisége minden kísérletben állandó volt. A fehérjék jellemzően különböző oldatok formájában állnak rendelkezésre. Stabilitásuk vagy előállításuk, ill. további felhasználásuk miatt tartalmazhatnak különböző stabilizáló anyagokat, pl. sókat. A humán szérum albumin oldat formájában állt rendelkezésre, izotóniás oldatban, mely 0,9% NaCl tartalmat jelent. Az 1h kísérletben a HSA oldathoz hasonlóan, NaCl bemérésével a BSA oldat só tartalmát 0,9 %-ra állítottuk be szárítás előtt. Az 1-es sorozat további BSA oldatai adalék hozzáadása nélkül készültek. Vizsgáltuk, hogy a különböző anyagi minőségű fehérjék ill. az alkalmazott adalékanyag hogyan befolyásolja a száradási folyamatot ill. a szárítmány minőségét. Az alkalmazott műveleti paramétereket és körülményeket az 1. Táblázatban rögzítettük. Az adagolási sebesség az 1a-c kíséretekben 4 ml/perc, a további esetekben pedig 3 ml/perc volt. Srsz. 1a 1b 1c 1d 1e 1f 1g 1h 1i 1j 1k 2a 2b
Calb g/l 40 40 40 40 20 30 40 40 40 40 40 38 38
Tbe ºC 40 40 40 40 60 60 60 60 80 100 130 60 100
Tki ºC 22 20 24 25 39 41 38 36 51 70 89 38 68
ncs 1/min 520 280 210 280 280 280 280 280 280 280 280 280 280
Mvn OFT m/m% m/m% 7,99 87 6,26 84 6,70 86 5,15 84 3,95 90 3,28 93 4,46 93 4,66 78 4,37 91 2,37 97 0,81 96 1,18 90 2,12 79
1. Táblázat: Kísérleti paraméterek és eredmények Az 1a-c kísérletekben a 40 g/l töménységű BSA oldatokat azonos adagolási sebességgel porlasztottuk az inert szemcsék felületére alacsony, 40 ºC-s hőmérsékleten, de változtattuk a csiga forgási sebességét. Az 1b és 1d kísérletek esetén pedig azonos értéken tartottuk a forgási sebességet, de változó adagolás mellett végeztük a szárítást. Az inert szemcsék felületén kialakult filmvastagság elméleti értéke a = q/Qcsω összefüggéssel számítható, ahol q az albumin oldat adagolási sebessége, Qcs a belső szállítócsiga szállítási sebessége, ω = 6/di az inert szemcsék fajlagos felülete, di. pedig az inert szemcsék átlagos átmérője. A csiga forgási sebessége meghatározza a szemcsék tartózkodási idejét a
szárítási zónában, mely fontos tényező a termék nedvesség tartalma szempontjából. A számított elméleti száradási időket (τd) és filmvastagságokat () a 2. Táblázatban tüntettük fel. Srsz. 1a 1b 1c 1d-k, 2a-b
ncs Qcs 1/min 10-6 m3/s 520 7,73 280 10,3 210 19,1 280 10,3
q ml/perc 4 4 4 3
τd s 8,8 9,8 11,0 9,8
m 11,51 8,63 4,65 6,47
2. Táblázat: Számított filmvastagság és száradási idő értékek Az előbbi két paraméteren kívül a termék nedvességtartalmát befolyásolja még a szárítandó oldat koncentrációja ill. a szárítási hőmérséklet is. Ennek vizsgálatára változó koncentrációjú BSA oldat beporlasztása mellett az 1e-g, ill. változó bemenő hőmérsékletek alkalmazásával az 1d, 1g és 1i-k kísérleteket végeztük el, egyéb paraméterek állandó értéken tartása mellett. A 40 C-os bemenő szárító levegő esetén a legmagasabb nedvességtartalmat (Mvn = 7,99 %), a várakozásnak megfelelően, az 1a mintánál kaptuk, ahol a száradási idő a legrövidebb ill. a filmvastagság a legnagyobb. A rétegvastagság csökkenése a nedvesség tartalom csökkenését eredményezi, amennyiben a műveleti paraméterek megfelelő megválasztásával a száradás részfolyamatai, a bevonatképzés, a száradás és a koptatás összehangolása megfelelő, vagyis a rétegmagasság egy állandósult értéket ér el. Az 1a-d kísérletek közül a részfolyamatok összehangolása az 1d sorozatban beállított csiga forgási sebesség/ adagolási sebességnél valósult meg, ezért a további kísérletekben az ncs = 280 ford/perc ill. q = 3 ml/perc adagolási sebességekkel dolgoztunk, ahol az ideálisnak mutatkozó filmvastagság ~ 6 m-nek adódott. Az 1h termék elektronmikroszkópos felvételén az inert töltet golyók felületéről lekopott lemezszerű szemcsét látjuk, melynek vastagsága jól közelíti a számított értéket.
2. ábra: Az 1h termék szemcsevastagsága A szárító levegő hőmérsékletének növelése a termék nedvességtartalmának csökkenését eredményezi, mint azt az 1. Táblázat adatai mutatják. Különösen 100 C vagy a feletti bemenő hőmérsékleten jelentős mértékű a csökkenés. Ilyen mértékű nedvességtartalomnál már szerkezeti károsodással is számolni lehet fehérjék esetében. A HSA tartalmú oldatok szárításának termékei (2a-b) alacsonyabb nedvességtartalmúak voltak. A két 60 C-on szárított, azonos NaCl tartalmú oldat (1h és 2a) szárításánál kapott különbség a két fehérje anyagi minőségében levő különbségre vezethető vissza, mivel 4% körüli nedvesség tartalmat eredményezett az azonos töménységű, NaCl nélkül szárított BSA portermék (1g) elemzése is. Az oldható fehérje tartalom a 40 C-os szárításoknál 90 % alatti értékéknek adódott, de itt figyelembe kell venni, hogy a szárítmányoknak magasabb a nedvesség tartalma. A NaCl-t nem tartalmazó minták OFT értékei 90 %-nál nagyobbak, meglepően még a 130 C-os kísérletben is. További vizsgálatokat igényel azonban, hogy az esetleges szerkezetváltozás nem befolyásolja-e az alkalmazott uv spektrofotometriás módszernél a koncentrációabszorbancia között fennálló, kalibrációként használt összefüggést. A szárítmányok jellemző szemcseméret adatait a 3. Ábrán mutatjuk be. A 40 g/l koncentrációjú BSA oldatok (1a-d, 1g és 1i-j) szárítása esetén szemcseméret a 37,88,55 m tartományban változott. A várakozásnak megfelelően, a legnagyobb szemcseméretet az 1a kísérletben kaptuk, ahol a filmréteg vastagsága és a termék nedvességtartalma a legmagasabb. A minták elektronmikroszkópos
Átlagos szemcseméret, d (µm)
v
felvételei azt mutatják, hogy a termékek jellemzően kétféle szemcséből tevődnek össze: a megszáradt bevonatról lepattant, nagyobb felületű lapocskákból ill. az ezek aprózódásából keletkezett néhány mikronos szemcsékből, a 2. Ábrán látottakhoz hasonlóan. 80 60 40 20 0 1a 1b 1c 1d 1e 1f 1g 1h 1i 1j 1k 2a 2b Kísérlet sorszáma
3. Ábra: A termékek átlagos szemcseméret adatai Az adatokból látszik, hogy a nedvességtartalmat meghatározó filmvastagság csökkenése és a hőmérséklet emelése szemcseméret csökkenés irányába hat. Az 1g és 1h minták (tiszta BSA és NaCl tartalmú) átlagos szemcseméretében nincs különbség, de az adalékolt termék eloszlása egyenletesebb. A két vizsgált HSA oldat termékei jellemzően nagyobb és szélesebb szemcseméret eloszlásúak, mint a BSA porok szárítmányai. Köszönetnyilvánítás A kísérletek a GVOP-3.1.1.-2004-05-0031/3.1. pályázat támogatásával készültek. A kísérletek lelkiismeretes végzéséért köszönet illeti Dr. Szentmarjay Tibornét. Irodalomjegyzék [1] Crommelin, D.W., Winden, E., Mekking, A., Pharmaceutics, The Science of Dosage Form Design, Churchill Livingstone, Edinburg 544-553 (2002) [2] Quinn, E.A., Forbes, E.T., Williams, A.C., Oliver, M.J., McKenzie, L., Purewal, T., Int. J. Pharm., 186, 31-41 (1999) [3] Wang, W., Int. J. Pharm., 203, 1-60 (2000) [4] Maa, Y.–F.; Nguyen, P.–A.; Andya J. D.; Sweeney, T. D.; Shire, S. J.; Hsu, C. C., Pharm. Res., 15(5), 768-775 (1998) [5] Pallai, E., Németh, J. Mujumdar, A.S., Handbook of Industrial Drying, Marcel Dekker Inc., New York 419-460 (1995)
